KR20140123437A - 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 자극 물질 스크리 닝용 조성물 및 이를 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 PI3, CEBPA, SERP INB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1, PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7 유전자는 피부자극 물질로 일반적인 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현양이 증가하거나 감소함으로써, 상기 유전자를 이용하여 유해한 피부 자극 물질을 스크리닝할 수 있다. 따라서, 화장품 원료 물질의 동물실험이 금지되어 이를 대체할 수 있는 피부 자극 물질을 스크링하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
하이드로퀴논(hydroquinone;HQ)을 포함하는 국소 페놀계 물질 및 레티노이드(retinoid)를 포함하는 비-페놀계 물질은 과색소 침착 치료에 이용된다. 국소 하이드로퀴논은 가장 잘 알려진 치료제이고, 모든 트랜스-레티노산을 포함하는 국소 레티노이드 및 코르티코스테로이드와 조합하는 것과 같은 조합 치료에 친숙하게 이용되고 있다. HQ는 피부 색소침착에 대한 미백에 대하여 사용되고 있으나, 피부 자극은 부작용 중 하나이다. 국소 레티노산(RA)에서, 가장 일반적인 부작용은 건조함, 스케일링(scaling), 홍반, 마찰(burning) 또는/및 상처를 주는 것과 같은 다양한 강도의 자극에 대한 자극반응에 있다. 피부자극은 후기-염증 과색소침착(post-inflammatory hyperpigmentation)을 일으킬 수 있기 때문에, 레티노산의 약물로서 효율성을 잃지 않으면서, 잠재적인 자극 가능성을 줄이기 위한 노력들이 시도되고 있다.
피부 자극은 인간에게 유해한 환경적 위험에 대한 일반적인 부작용 중 하나이다. 반복적이고, 계속되는 하나의 자극제는 자극성 피부염을 유발한다. 상기 자극제의 가장 일반적인 것은 화합물이다. 모든 물질은 어느 정도 자극제의 성격을 갖고 있다. 피부 자극은 피부 방어벽 파괴, 사이토키닌 캐스캐이드의 유도 및 산화적 스트레스 네트워크와 관련성이 있는 다양한 기전을 통하여 유발될 수 있다. 다른 형(class)의 물질은 다른 기전을 통하여 피부 자극을 일으킨다. 잠재적인 자극제는 세포 생존율 감소와 관련이 있다. 그러나, 세포독성실험으로 반드시 자극제 또는 비-자극제를 예측할 수 있는 것은 아니다. 세포 외 실험에서는 자극성을 평가하는 표준화된 실험 프로토콜이 존재하지 않아, 자극제에 의하여 유도되는 분자적 반응 및 세포적 반응을 관찰하는 것이 필요하다.
이에 본 발명자들은 과색소 침착의 치료제로 가장 일반적으로 사용되는 레티노산 및 하이드로퀴논 및 대표적인 피부자극제인 SLS(sodium lauryl sulfate)를 각질형성세포, 멜라닌생성 세포 및 이들의 공-배양(co-culture)에서 처리하여, 상기 세포들의 유전자 발현을 마이크로어레이 방법을 통하여 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 자극 물질 스크리닝 키트를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 피부 자극 물질의 스크리닝 방법을 제공함에 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군 중 선택된 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 자극 물질 스크리닝 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 피부 자극 후보 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1)단계의 세포 또는 세포계로부터 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 처리한 대조군의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 피부 자극 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7 유전자는 피부자극 물질로 일반적인 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현양이 증가하거나 감소함으로써, 상기 유전자를 이용하여 유해한 피부 자극 물질을 스크리닝할 수 있다. 따라서, 화장품 원료물질의 동물실험이 금지되어 이를 대체할 수 있는 피부 자극 물질을 스크링하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 레티노산을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 2는 레티노산을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 3은 하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 4는 하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 5는 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 개수를 나타낸 도이다.
도 6은 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 개수를 나타낸 도이다.
도 7a는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 7c는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 (a) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, FLG의 real time-PCR의 결과, (b) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LOR의 real time-PCR의 결과, (c) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LCE3D의 real time-PCR의 결과, (d) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, SPRR1A의 real time-PCR의 결과, (e) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, SPRR1B의 real time-PCR의 결과, (f) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, IVL의 real time-PCR의 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 9c는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9d는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 10c는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10d는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11d는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 레티노산을 mice에 처리한 경우, 현미경을 통한 각질층의 두께를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 레티노산을 mice에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12c는 레티노산을 mice에 처리한 경우, 농도에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, 현미경을 통한 각질층의 두께를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13b는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13c는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, 농도에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 레티노산을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 3은 하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 4는 하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 나타낸 도이다.
도 5는 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 개수를 나타낸 도이다.
도 6은 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에 처리한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 개수를 나타낸 도이다.
도 7a는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 7b는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 7c는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, Manhattan plot analysis의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 (a) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, FLG의 real time-PCR의 결과, (b) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LOR의 real time-PCR의 결과, (c) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LCE3D의 real time-PCR의 결과, (d) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, SPRR1A의 real time-PCR의 결과, (e) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, SPRR1B의 real time-PCR의 결과, (f) 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, IVL의 real time-PCR의 결과를 나타낸 도이다.
도 9a는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 9c는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9d는 레티노산을 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10a는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 10c는 하이드로퀴논을 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10d는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, MTT assay 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도를 통한 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11d는 SLS를 각질형성세포에 처리한 경우, 세포생존율 차이에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 레티노산을 mice에 처리한 경우, 현미경을 통한 각질층의 두께를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 12b는 레티노산을 mice에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12c는 레티노산을 mice에 처리한 경우, 농도에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, 현미경을 통한 각질층의 두께를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13b는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13c는 하이드로퀴논을 mice에 처리한 경우, 농도에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 PI3(peptidase inhibitor 3, skin-derived; 203691_at), CEBPA(CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP), apha; 204039_at), SERPINB3(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 3; 209719_X_at), HOPX(HOP homeobox; 211597_s_at), SPRRR1A(small proline-rich protein 1A;213796_at), NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2;220066_at), LCE3D(late cornified envelope 3D;224328_s_at), CNFN(cornifelin;224329_s_at), TMTC1(transmembrane and tetratricopeptide repeat containing 1;226322_at), KRTDAP(keratinocyte differentiation-associated protein; 230835_at), ANKRD35(ankyrin repeat domain 35; 231118_at), SBSN(suprabasin; 235272_at), BPIL2(bactericidal/permeability-increasing protein-like 2; 1555773_at), RDH12(retinol dehydrogenase 12(all-trans/9-cis/11-cis); 242998_at), FLG(filaggrin; 215704_at), H19(H19, imprinted maternally expressed transcript(non-protein coding); 224646_x_at), FLG2(filaggrin family member 2; 1569410_at), LOR(loricrin; 207720_at), IVL(involucrin; 214599_at), NLRX1(NLR family member X1; 1553695_a_at), ALDH1A3(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3; 203180_at), DSC2(desmocolin 2; 204750_S_at), RHCG(Rh family C glycoprotein; 219554_at), SCEL(sciellin; 232056_at), IL20(interleukin 20; 224071_at), S100A8(S100 calcium binding protein A8; 202917_s_at), S100A9(S100 calcium binding protein A9;203535_at), S100A12(S100 calcium binding protein A12; 205863_at), ANKRD35(ankyrin repeat domain 35; 231119_at), BNIPL(BCL2/adenovirus E1B 19kD interacting protein like; 236534_at), SPRR3(small proline-rich protein 3; 218990_s_at), TMEM79(transmembrane protein 79; 223544_at), FAM84A(family with sequence similarity 84, member A; 225667_s_at), GRHL1(qrainyhead-like 1(Drosophila); 1552685_a_at), SGPP2(sphingosine-1-phosphate phosphatase 2; 244780_at), AADACL2(arylacetamide deacetylase-like 2; 240420_at), TPRG1(tumor protein p63 regulated 1; 229764_at), PPP2R2C(protein phosphatase 2;228010_at), SPINK5(serine peptidase inhibitor, Kazal type 5;205185_at), ATP10B(ATPase, class V, type 10B; 214070_s_at), GPR110(G protein-coupled receptor 110; 235988_at), IL20RA(interleukin 20 receptor, alpha; 222829_s_at), DEFB1(defensin, beta 1; 210397_at), SLC28A3(solute carrier family 28(sodium-coupled nucleoside transporter), member 3;232277_at), AIF1L(allograft inflammatory factor 1-like; 223075_s_at), CLIC3(chloride intracellular channel 3, 219529_at), NEBL(neblulette; 203961_at), CARD18(caspase recruitment domain family, member 18), PLBD1(phospholipase B domain containing 1;218454_at), GLTP(glycolipid transfer protein; 219267_at), TGM1(transglutaminase 1(K polypeptide epidermal type 1, protein-glutamine-gamma-qlutamyltransferase); 206008_at), RDH12(retinol dehydrogenase 12(all-trans/9-cis/11-cis);242998_at), NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2; 220066_at), ZNF750(zinc finger protein 750; 219995_s_at), DSC1(desmocollin 1; 207324_s_at), SERPINB3(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 3; 209719_x_at), SERPINB13(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 13;211362_s_at), EMR2(egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 2; 207610_s_at), KLK10(kallikrein-related peptidase 10; 209792_s_at), COX7A1(cytochrome c oxidase subunit Ⅶa polypeptide 1(muscle);204570_at), KRTDAP(keratinocyte differentiation-associated protein; 230835_at), SULT2B1(sulfotransferase family, cytosolic, 2B, member 1; 205759_s_at), KLK7(kallikrein-related peptidase 7; 205778_at)로 이루어진 군 중 선택된 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 유전자는 피부자극 물질로 일반적인 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현양이 증가하거나 감소함으로써, 상기 유전자를 이용하여 유해한 피부 자극 물질을 스크리닝할 수 있다. 따라서, 화장품 원료물질의 동물실험이 금지되어 이를 대체할 수 있는 피부 자극 물질을 스크링하는 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논을 처리하는 경우 발현이 증가하고, 레티노산을 처리하는 경우, 발현이 감소한다(실시예 2-8).
또한, 본 발명의 상기 NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG 및 SCEL 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현이 증가한다(실시예 2-9).
또한, 본 발명의 IL20 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현이 감소한다(실시예 2-10).
또한, 본 발명의 PI3, SERPINB3, SPRR1A, IVL, NOD2, KRTDAP, ANKRD35 및 RDH12 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논 또는 SLS를 처리하는 경우 발현이 증가하고, 레티노산을 처리하는 경우, 발현이 감소한다(실시예 2-11).
또한, 본 발명의 IVL, S100A8, S100A9, S100A12, ANKRD35, BNIPL, SPRR1A, SPRR1B, SPRR3, TMEM79, PI3, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, RDH12, NOD2, ZNF750, DSC1, SERPINB3, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, KRTDAP, SULT2B1, KLK7 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논 또는 레티노산을 처리하는 경우, 발현이 증가한다.(실시예 2-12)
또한, Manhattan plot analysis를 통하여, 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS 처리에 따른 유전자의 상반된 발현을 염색체 1q21에서 확인을 하였으며(실시예 3-1), 염색체 1q21 구조 유전자의 발현(실시예 3-2), 각질형성세포내의 cornified envelope-associated protein 관련 유전자의 발현(실시예 3-3), 생체내의 cornified envelope-associated protein 관련 유전자의 발현(실시예 3-4)을 확인하였다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 각질형성세포, 멜라닌세포 및 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양 세포계에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란 피부 자극 후보 물질을 스크리닝하기 위하여 멜라닌 세포, 각질형성세포, 및 멜라닌세포 및 각질형성세포 공-배양 세포계에서 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 자극 물질 스크리닝 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 피부 자극 물질을 스크리닝을 할 수 있다. 본 발명의 키트에는 피부 자극 물질을 스크리닝을 위한 프라이머, 프로브, 항체 등뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일수 있다. RT-PCR 키트는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 피부 자극 후보 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1)단계의 세포 또는 세포계로부터 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 처리한 대조구의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 피부 자극 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 세포 배양 및 세포생존성 실험
1-1. 세포 배양
성인의 제왕절개 부위로부터 어른의 피부 시료를 수득하였고, 환상 절제술(circumcision)로 세포를 얻어 배양하였다.
각질형성세포를 배양하기 위하여, 각각의 상피세포를 소의 뇌하수체 추출물, 소의 인슐린, 히드로코르티손, 인간의 상피 성장 인자 및 소의 트랜스페린(HKGS; Invitrogen)을 첨가한 EpiLife Medium(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 부유시켰다.
멜라닌형성 세포를 배양하기 위하여, 소의 뇌하수체 추출물, 소 태아 혈청(FBS), 소의 인슐린 히드로코르티손, bFGF, 소의 트랜스페린, 헤파린 및 HMGS(phorbol 12-myristate 13-acetate; Invitrogen)을 첨가한 Medium 254 (Invitrogen)에서 부유시켰다. 수득한 세포를 각각의 배양배지에서 7.5 ⅹ 104 cells/mL로 재부유시키고, 6-웰 플레이트에 1.5 ⅹ 105 cells/well로 접종하였다. 접종 후 하루 지난 다음, 실험에서 사용할 하이드로퀴논, SLS 또는 레티노산을 첨가하였다.
각질형성세포-멜라닌세포 공-배양(co-culture)을 위하여, 각질형성세포를 수득하여, HKGS가 포함된 Epilife medium에서 5 ⅹ 104 cells/mL로 재부유시켰고, 살아있는 세포를 6-웰 플레이트에 1 ⅹ 105 cells/well로 접종하였다. 접종 하루 후, 멜라닌세포를 수집하여, HMGS가 포함된 Medium 254에 재부유시켰다. 살아있는 멜라닌세포(5 ⅹ 105 cell/100㎕)를 각질형성세포가 포함된 각각의 웰에 가하였고, 상기 공-배양을 100㎕의 Medium 254가 포함된 2 mL의 Epilife Medium에서 2일 배양을 수행하였다. 체내의 상피조건과 유사한 각질형성세포 및 멜라닌 형성세포의 비율은 10 대 1로 변화하기 때문에, 각질형성세포와 멜라닌세포의 초기 접종 비율은 10:1에서 2:1로 하였다. 하루 뒤, 적당한 농도의 하이드로퀴논, SLS 또는 레티노산을 가하고, 2일 후, 공-배양계를 수득하여, 세포 생존성 어세이(cell viability assay) 및 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
1-2. 세포 생존성 실험
세포 생존성은 MTT 환원 방법에 의하여 평가하였다. 세포는 MTT로 4시간동안 염색하였고, 침전된 포르마잔(formazan)을 DMSO에서 용해시켰고, 분광기를 이용하여 630nm에서 배경제거(background subtraction)과 더불어, 570nm에서 흡광도(optical density)를 측정하였다.
세포성장에서 레티노산의 효과는 DMSO를 처리한 경우의 세포 생존율에 대한 레티노산을 처리한 경우의 세포 생존율의 비율로부터 계산하였다. 자극농도를 2일 동안 처리한 경우, 세포 생존 비율이 대략 80%를 보이는 농도의 범위로 결정하였다. 상기 농도 범위는 각질형성 세포에서 0.5 내지 1.5μM, 멜라닌세포에서 3 내지 5μM, 공-배양 세포계에서 1.5 내지 5μM였다.
2.
RNA
시료를 이용한 마이크로 어레이 및 발현의 차이를 보이는 유전자의 확인
2-1. 마이크로어레이를 위한 RNA 시료 제조 및 발현의 차이를 보이는 유전자 결정(differentially expressed gene; DEG)의 방법
정상각질형성세포 배양계, 정상멜라닌세포 배양계, 정상각질형성세포 및 멜라닌세포의 공동배양계에 레티노산(retinoic acid; RA), 하이드로퀴논(hydroquinone; HQ), 또는 SLS(sodium lauryl sulfate)를 처리한 후, 48시간 후,전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 분리하였다. Trizol을 이용하여 분리한 조직 전체의 RNA는 Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여, 정제도를 높인 후, 260 nm 흡광도를 측정하는 방법을 통해 RNA 농도를 결정하였다. Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 기기를 이용하여 RNA의 품질을 평가한 후, 이를 통과한 RNA에 대해 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 분리정제된 5μg의 RNA를 역전사중합효소를 이용하여 cDNA(complementary DNA)를 합성하였고, 합성된 cDNA를 기반으로 한 biotinylated cRNA 합성 후, 분절화한 cRNA를 Affymetrix GeneChip Human 133 2.0 Array에 반응시켰다. 원본데이터는 Affymetrix의 Expression Console 프로그램을 사용하여, 정규화하고, 유전자 발현 수준을 결정하였다. GeneChip 스캔을 통한 이미지 파일의 분석 및 정규화 과정의 품질 평가는 스캐너로 읽은 이미지파일의 결점 존재 여부를 우선적으로 평가한 후, Affymetrix에서 제공하는 Expression Console 프로그램의 MAS5 알고리즘을 통해 읽은 기본값 분석시 Scale Factor 값이 3 이하, 배경(background)값 20~100 범위, 5 이하의 노이즈(noise)값, 내부표준(spike control)의 P call 및 Affymetrix 보장 감도 등을 평가하였다. 정규화된 마이크로어레이 데이터를 이용하여, Affymetrix Human 133 2.0 Array에 존재하는 54,675개의 프로브 세트(probe set) 발현값 분포의 중간값(median value)이상의 값을 가진 유전자만을 우선 선택하였다. 그리고, 개별 프로브세트에 대한 MAS5 알고리즘의 분석값이 "present"를 동시에 충족한 유전자를 중심으로 "DEGs(differentially expressed genes)"를 선정하였다. 이 두 조건을 충족하는 프로브 세트의 수는 평균 26000~30000개에 해당하며, 실험군과 대조군의 발현값 비율을 구한 후, 실험군과 대조군의 유전자 발현값 비율을 기준으로 2 이상을 보이는 유전자를 증가한 DEG로, 0.5 이하를 보이는 유전자를 감소한 DEG로 선정하였다.
2-2. 레티노산(retinoic acid;RA)에 의하여 발현이 증가하는 유전자 확인
레티노산을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 수를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 233개의 유전자는 각질형성세포에서만 발현이 증가하였고, 140개의 유전자는 멜라닌세포에서 증가하였고, 280개의 유전자는 상기 세포를 공-배양하는 경우 증가하였다.
또한, 각질형성세포와 공-배양(keratinocyte-melanocyte co-culture)한 경우, 동시에 증가한 유전자는 34개, 멜라닌세포와 공-배양한 경우, 동시에 증가한 유전자는 16개, 각질형성세포와 멜라닌 세포에서 동시에 증가한 유전자는 1개, 각질형성세포, 멜라닌 세포 및 공-배양한 경우 동시에 증가한 유전자는 2개임을 확인하였다.
2-3.
레티노산에
의하여 발현이 감소하는 유전자 확인
레티노산을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 319개의 유전자는 각질형성세포에서만 발현이 감소하였고, 80개의 유전자는 멜라닌세포에서 발현이 감소하였고, 126개의 유전자가 상기 세포를 공-배양하는 경우 감소하였다.
또한, 각질형성세포와 공-배양한 경우, 동시에 감소한 유전자는 8개, 멜라닌세포와 공-배양한 경우, 동시에 감소한 유전자는 2개, 각질형성세포와 멜라닌 세포에서 동시에 감소한 유전자는 4개, 각질형성세포, 멜라닌 세포 및 공-배양한 경우 동시에 감소한 유전자는 0개임을 확인하였다.
2-4. 하이드로퀴논(HydroquinoneHQ)에 의하여 발현이 증가하는 유전자 확인
하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 발현이 증가하는 유전자의 수를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 252개의 유전자는 각질형성세포에서만 발현이 증가하였고, 192개의 유전자는 멜라닌세포에서 증가하였고, 170개의 유전자는 상기 세포를 공-배양하는 경우 증가하였다.
또한, 각질형성세포와 공-배양한 경우, 동시에 증가한 유전자는 21개, 멜라닌세포와 공-배양한 경우, 동시에 증가한 유전자는 4개, 각질형성세포와 멜라닌 세포에서 동시에 증가한 유전자는 11개, 각질형성세포, 멜라닌 세포 및 공-배양한 경우 동시에 증가한 유전자는 0개임을 확인하였다.
2
-5. 하이드로퀴논(Hydroquinone;HQ)에 의하여 발현이 감소하는 유전자 확인
하이드로퀴논을 각질형성세포, 멜라닌세포, 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, 이 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 발현이 감소하는 유전자의 수를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 393개의 유전자는 각질형성세포에서만 발현이 감소하였고, 124개의 유전자는 멜라닌세포에서 발현이 감소하였고, 35개의 유전자가 상기 세포를 공-배양하는 경우 감소하였다. 또한, 각질형성세포와 공-배양한 경우, 동시에 감소한 유전자는 2개, 멜라닌세포와 공-배양한 경우, 동시에 감소한 유전자는 1개, 각질형성세포와 멜라닌 세포에서 동시에 감소한 유전자는 10개, 각질형성세포, 멜라닌 세포 및 공-배양한 경우 동시에 감소한 유전자는 0개임을 확인하였다.
2-6. 각질형성세포 및 멜라닌세포을 공-배양(co-culture)하는 경우, 하이드로퀴논,
레티노산
또는
SLS
처리시 발현이 증가하는 유전자 개수 확인
하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, 이 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우 발현이 증가하는 유전자의 개수를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 레티노산을 처리한 경우에만 발현이 증가한 유전자는 288개, 하이드로퀴논을 처리한 경우에만 발현이 증가한 유전자는 130개, SLS를 처리한 경우에만 발현이 증가한 유전자는 265개이고, 레티노산 또는 SLS를 처리한 경우에 동시에 발현이 증가한 유전자는 25개, 하이드로퀴논 또는 레티노산을 처리한 경우에 동시에 발현이 증가한 유전자는 14개, SLS 또는 하이드로퀴논을 처리한 경우에 동시에 발현이 증가한 유전자는 42개로 나타났으며, SLS, 레티노산 또는 하이드로퀴논을 처리한 경우 동시에 발현이 증가한 유전자는 5개로 나타남을 확인하였다.
2-7. 각질형성세포 및 멜라닌세포을 공-배양하는 경우, 하이드로퀴논, 레티노산 또는
SLS
처리시 발현이 감소하는 유전자 개수 확인
하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, 이 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우 발현이 감소하는 유전자의 개수를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 레티노산을 처리한 경우에만 발현이 감소한 유전자는 120개, 하이드로퀴논을 처리한 경우에만 발현이 감소한 유전자는 32개, SLS를 처리한 경우에만 발현이 감소한 유전자는 138개이고, 레티노산 또는 SLS를 처리한 경우에 동시에 발현이 감소한 유전자는 11개, 하이드로퀴논 또는 레티노산을 처리한 경우에 동시에 발현이 감소한 유전자는 4개, SLS 또는 하이드로퀴논을 처리한 경우에 동시에 발현이 감소한 유전자는 1개로 나타났으며, SLS, 레티노산 또는 하이드로퀴논을 처리한 경우 동시에 발현이 감소한 유전자는 1개로 나타남을 확인하였다.
2-8. 각질형성세포 및 멜라닌세포을 공-배양하는 경우, 하이드로퀴논 처리시 유전자 발현이 증가하고,
레티노산
처리시 유전자 발현이 감소하는 유전자 확인
하이드로퀴논 또는 레티노산을 각질형성세포 및 멜라닌세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 레티노산 처리시 유전자 발현이 감소하고, 하이드로퀴논 처리 시 유전자 발현이 증가한 유전자의 리스트를 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, PI3 (peptidase inhibitor 3, skin-derived; 203691_at), CEBPA(CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP), apha ; 204039_at), SERPINB3(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 3; 209719_X_at), HOPX( HOP homeobox; 211597_s_at), SPRRR1A(small proline-rich protein 1A;213796_at), NOD2(nucleotide-bindin g oligomerization domain containing 2;220066_at), LCE3D(late cornified envelope 3D;224328_s_at), CNF N(cornifelin;224329_s_at), TMTC1(transmembrane and tetratricopeptide repeat containing 1;226322_at), KRTDAP(keratinocyte differentiation-associated protein; 230835_at), ANKRD35(ankyrin repeat domain 35 ; 231118_at), SBSN(suprabasin; 235272_at), BPIL2(bactericidal/permeability-increasing protein-like 2 ; 1555773_at), RDH12(retinol dehydrogenase 12(all-trans/9-cis/11-cis); 242998_at), FLG(filaggrin; 21 5704_at), H19(H19, imprinted maternally expressed transcript(non-protein coding); 224646_x_at), FLG2 (filaggrin family member 2; 1569410_at), LOR(loricrin; 207720_at) 및 IVL(involucrin; 214599_at)는 레 티노산 처리시 유전자 발현이 감소하고, 하이드로퀴논 처리 시 유전자 발현이 증가하였다. 상기 유전자 중 SPRRR1A, LCE3D, ANKRD35, FLG, FLG2, LOR 및 IVL 유전자 7개는 염색체 1q21에 위치하여 피부 미백과 관련하 여 상당부분이 연관되어 있음을 시사한다.
2-9. 각질형성세포 및 멜라닌세포 을 공-배양하는 경우, 하이드로퀴논, 레티노산 및
SLS
(
sodium
lauryl
sulfate
) 처리시 유전자 발현이 증 가하는 유전자 확인
하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 를 공-배양한 후, 상기 세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 하이드로 퀴논, 레티노산 또는 SLS 처리시 유전자 발현이 유전자 발현이 증가한 유전자의 리스트를 표 2에 나타내었다 .
표 2에 나타난 바와 같이, NLR X1(NLR family member X1; 1553695_a_at), ALDH1A3(aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3; 203180_ at), DSC2(desmocolin 2; 204750_S_at), RHCG(Rh family C glycoprotein; 219554_at) 및 SCEL(sciellin; 23 2056_at)의 유전자 발현이 증가함을 확인하였다.
2-10. 각질형성세포 및 멜라닌세포 을 공-배양하는 경우, 하이드로퀴논, 레티노산 및
SLS
(
sodium
lauryl
sulfate
) 처리시 유전자 발현이 감소하는 유전자 확인
하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 를 공-배양한 후, 상기 세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 하이드로 퀴논, 레티노산 및 SLS 처리시 유전자 발현이 감소한 유전자의 리스트를 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타난 바와 같이, IL20(interleukin 20; 224071_at)가 상기 3가지 경우 모두에서 유전발현이 감소함을 확인하였다.
2-11. 각질형성세포 및 멜라닌세포을 공-배 양하는 경우, 하이드로퀴논 또는 SLS 처리시 유전자 발현이 증가하고, 레티노산 처리시 유전자 발현이 감소하는 유전자 확인
하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포 를 공-배양한 후, 상기 세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 하이드로 퀴논 또는 SLS 처리시 유전자 발현이 증가하고, 레티노산 처리시 유전자 발현이 감소한 유전자의 리스트를 표 4에 나타내었다.
표 4에 나타난 바와 같이, PI3(pepti dase inhibitor 3, skin-derived; 203691_at), SERPINB3(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin) , member 3;209719_x_at), IVL(involucrin; 214599_at), NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2, 220066_at), KRTDAP(keratinocyte differentiation-associated protein; 230835_at), ANKRD3 5(ankyrin repeat domain 35; 231118_at) 및 RDH12(retinol dehydrogenase 12(all-trans/9-cis/11-cis); 24 2998_at)가 상기 사항에 해당하는 유전자임을 확인하였다.
2-12. 각질형성세포 및
멜라닌세포을
공-배양하는 경우,
하이드로퀴논산
또는
SLS
처리시 유전자 발현이 증가하는 유전자 확인
하이드로퀴논 또는 SLS를 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 후, 상기 세포에 처리한 후, mRNA 시료를 채취하여, 마이크로어레이를 수행한 경우, 하이드로퀴논 또는 SLS 처리시 유전자 발현이 증가하는 유전자의 리스트를 표 5에 나타내었다.
표 5에 나타난 바와 같이, IVL(involucrin; 214599_at ), S100A8(S100 calcium binding protein A8; 202917_s_at), S100A9(S100 calcium binding protein A9;203 535_at), S100A12(S100 calcium binding protein A12; 205863_at), ANKRD35(ankyrin repeat domain 35; 231 119_at), BNIPL(BCL2/adenovirus E1B 19kD interacting protein like; 236534_at), SPRR1A(small proline-r ich protein 1A; 214549_x_at), SPRR1B(small proline-rich protein 1B; 205064_at), SPRR3(small proline- rich protein 3; 218990_s_at), TMEM79(transmembrane protein 79; 223544_at), PI3(peptidase inhibitor 3 , skin-derived; 203691_at), FAM84A(family with sequence similarity 84, member A; 225667_s_at), GRHL1 (qrainyhead-like 1(Drosophila); 1552685_a_at), SGPP2(sphingosine-1-phosphate phosphatase 2; 244780_a t), AADACL2(arylacetamide deacetylase-like 2; 240420_at), TPRG1(tumor protein p63 regulated 1; 22976 4_at), PPP2R2C(protein phosphatase 2;228010_at), SPINK5(serine peptidase inhibitor, Kazal type 5;205 185_at), ATP10B(ATPase, class V, type 10B; 214070_s_at), GPR110(G protein-coupled receptor 110; 2359 88_at), IL20RA(interleukin 20 receptor, alpha; 222829_s_at), DEFB1(defensin, beta 1; 210397_at), SLC 28A3(solute carrier family 28(sodium-coupled nucleoside transporter), member 3;232277_at), AIF1L(all ograft inflammatory factor 1-like; 223075_s_at), CLIC3(chloride intracellular channel 3, 219529_at), NEBL(neblulette; 203961_at), CARD18(caspase recruitment domain family, member 18), PLBD1(phospholipa se B domain containing 1;218454_at), GLTP(glycolipid transfer protein; 219267_at), TGM1(transglutami nase 1(K polypeptide epidermal type 1, protein-glutamine-gamma-qlutamyltransferase); 206008_at), RDH 12(retinol dehydrogenase 12(all-trans/9-cis/11-cis);242998_at), NOD2(nucleotide-binding oligomerizat ion domain containing 2; 220066_at), ZNF750(zinc finger protein 750; 219995_s_at), DSC1(desmocollin 1; 207324_s_at), SERPINB3(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 3; 209719_x_at), SE RPINB13(serpin peptidase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 13;211362_s_at), EMR2(egf-like module containing, mucin-like, hormone receptor-like 2; 207610_s_at), KLK10(kallikrein-related peptidase 10 ; 209792_s_at), COX7A1(cytochrome c oxidase subunit Ⅶa polypeptide 1(muscle);204570_at), KRTDAP(ker atinocyte differentiation-associated protein; 230835_at), SULT2B1(sulfotransferase family, cytosolic , 2B, member 1; 205759_s_at), KLK7(kallikrein-related peptidase 7; 205778_at)가 상기 사항에 해당하는 유전자임을 확인하였다.
실시예 3. 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS 처리에 의한 cornified envelope-associated protein 관련 유전자 발현의 비교
3-1.Manhattan plot analysis를 통한 상반된 유전자 발현양상의 염색체 유전자 자리의 확인
세포독성수준이하 농도의 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS를 각질형성세포에 처리한 후, Manhattan plot analysis를 수행하여 유전자의 발현양상을 확인하였으며, 그 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다.
도 7a 내지 도 7c에 나타난 바와 같이 1q21, 2q12 및 19p13 염색체의 유전자 자리가 피부 질환과 관련이 있었다. 또한, FLG, loricrin, LCE3D, SPRR을 포함하는 염색체 1q21의 유전자군 발현은 레티노산 처리에 의하여 감소, 하이드로퀴논와 SLS 처리에 의하여 증가하였으며, 상반된 유전자 발현양상을 확인하였다. 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS 처리에 의한 유전자 발현 리스트를 표 6과 표 7에 나타내었다.
3-2. 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS 처리에 의한 1q21 의 구조 유전자의 발현양상의 확인
세포독성수준이하 농도의 하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS를 각질형성세포에 처리한 후, real time-PCR을 수행하여 염색체 1q21의 구조 유전자의 발현양상을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 레티노산 처리에 의하여 FLG, LCE3D, SPRR1A/1B 및 loricrin 발현이 감소하였으나(도8의 (a) 내지 도 8의 (e)), involucrin 발현은 감소하지 않았다(도 8의 (f)). 이와 반대로 하이드로퀴논 및 SLS 처리에 의하여 FLG, LCE3D, SPRR1A/1B, loricrin 및 involucrin의 발현은 증가하였다(도 8(a) 내지 도 8의 (f)).
3-3.
하이드로퀴논
,
레티노산
,
SLS
처리 의한
cornified
envelope
-
associated
protein 관련 유전자의 발현양상의 확인
하이드로퀴논, 레티노산 및 SLS를 각질형성세포에 처리한 후, 세포 생존율을 MTT assay로 측정하고, 세포독성을 분비된 LDH(Lactate dehydrogenase)의 농도로 평가하여 피부 자극의 강도가 다른 각각 물질의 세가지 농도를 결정한 후, Western blot analysis를 수행하여 농도에 따른 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인하였다.
① 레티노산 처리에 의한 유전자 발현의 확인
1) 77% 세포생존율, 1.04 fold 세포독성의 자극농도와 2) 50% 세포생존율, 1,63 fold 세포독성의 자극농도, 3) 37% 세포생존율, 2.27 fold 세포독성의 자극농도하에서 실시하였으며, 레티노산 농도에 따른 MTT assay의 결과는 도 9a, LDH 농도를 통한 세포독성평가 결과는 도 9b, western blot을 통한 단백질 발현은 도 9c, 세포생존율 차이에 따른 단백질 발현양상은 도 9d에 나타내었다.
도 9c 및 도 9d에 나타난 바와 같이, 모든 농도에서 FLG, SPRR1A/1B 및 TG1 단백질 발현이 감소된 반면, involucrin 단백질 발현에 큰 변화가 없었다.
② 하이드로퀴논 처리에 의한 유전자 발현의 확인
1) 74% 세포생존율, 1.04 fold 세포독성의 자극농도와 2) 51% 세포생존율, 1.28 fold 세포독성의 자극농도, 3) 32% 세포생존율, 2.23 fold 세포독성의 자극농도하에서 실시하였으며, 하이드로퀴논 농도에 따른 MTT assay의 결과는 도 10a, LDH 농도를 통한 세포독성평가 결과는 도 10b, western blot을 통한 단백질 발현은 도 10c, 세포생존율 차이에 따른 단백질 발현양상은 도 10d에 나타내었다.
도 10c 및 도 10d에 나타난 바와 같이, 74%, 51%, 세포생존율 농도에서 FLG, SPRR1A/1B, TG1 및 involucrin 단백질 발현이 증가하였으며, 32% 세포생존율 농도에서 단밸질 발현은 다른 농도에 비하여 감소하였으나, SPRR1A/1B, TG1 및 involucrin 단백질 발현은 대조군과 유사한 발현정도를 나타내었다.
③ SLS 처리에 의한 유전자 발현의 확인
1) 62% 세포생존율, 1.21 fold 세포독성의 자극농도와 2) 47% 세포생존율, 1.79 fold 세포독성의 자극농도, 3) 20% 세포생존율, 4.21 fold 세포독성의 자극농도하에서 실시하였으며, SLS 농도에 따른 MTT assay의 결과는 도 11a, LDH 농도를 통한 세포독성평가 결과는 도 11b, western blot을 통한 단백질 발현은 도 11c, 세포생존율 차이에 따른 단백질 발현양상은 도 11d에 나타내었다.
도 11c 및 도 11d에 나타난 바와 같이, 62%, 47% 세포생존율 농도에서 FLG, SPRR1A/1B, TG1 및 involucrin 단백질 발현이 증가하였으며, 47% 세포생존율 농도에 FLG 및 SPRR1A/1B 단백질 발현은 62% 세포생존율 농도와 비교하여 감소하였으나, 대조군에 비해서는 증가하였다. 또한 20% 세포생존율 농도에서 FLG, SPRR1A/1B, TG1 단백질 발현은 대조군과 유사한 발현정도를 나타내었으며, involucrin 단백질 발현은 증가하였다.
3-4. 생체내 하이드로퀴논 및 레티노산 처리 의한 cornified envelope-associated protein 관련 유전자의 발현양상의 확인
생쥐 피부에서 mild erythema, definite erythema, severe erythema를 유발하는 하이드로퀴논 및 레티노산의 농도를 결정한 후, 농도에 따른 각질층의 두께를 비교하고, Western blot analysis를 수행하여 cornified envelope-associated protein의 발현양상을 확인하였다.
① 레티노산 처리에 의한 생체내 유전자 발현의 확인
0.1%(mild), 0.5%(definite), 1%(severe)의 레티노산 농도하에서 실시하였으며, 농도에 따른 현미경을 통한 관찰 결과는 도 12a, Western blot analysis을 통한 단백질 발현은 도 12b, 농도에 따른 단백질 발현양상은 도 12c에 나타내었다.
도 12a 내지 도 12c에 나타난 바와 같이, 현미경을 통해 관찰한 결과, 레티노산 농도가 증가함에 따라 각질층의 두께가 감소하였다. 또한, 레티노산 농도가 증가함에 따라 FLG, SPRR1A/1B 단백질 발현은 감소한 반면, TG1 단백질 발현은 증가하였으며, involucrin 단백질 발현에는 큰 차이가 없었다.
② 하이드로퀴논 처리에 의한 생체내 유전자 발현의 확인
10%(mild), 20%(definite), 40%(severe)의 하이드로퀴논 농도하에서 실시하였으며, 농도에 따른 현미경을 통한 관찰 결과는 도 13a, Western blot analysis을 통한 단백질 발현은 도 13b, 농도에 따른 단백질 발현양상은 도 13c에 나타내었다.
도 13a 내지 도 13c에 나타난 바와 같이, 현미경을 통해 관찰한 결과, 하이드로퀴논 20%농도까지, 각질층의 두께가 증가한 반면, 40%농도에서는 각질층의 두께가 감소하였으나, 대조군에 비해서는 두꺼웠다. 또한, 하이드로퀴논 20%농도까지, loricrn, FLG, SPRR1A/1B, involucrin 및 TG-1 단백질 발현이 증가한 반면, 40%농도에서는 단백질 발현이 감소하였으나, 대조군에 비해서는 증가하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (13)
- PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1 , KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군 중 선택된 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG 및 SCEL 유 전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 IL20 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세 포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 처리하는 경우, 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 PI3, SERPINB3, SPRR1A, IVL, NOD2, KRTDAP, ANKRD35 및 RDH12 유전자는 각질 형성세포 및 멜라닌세포 공-배양(co-culture)한 세포계에 하이드로퀴논 또는 SLS를 처리하는 경우 발현이 증가하고, 레티노산을 처리하는 경우 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논을 처리하는 경우, 발현이 증가하고, 레티노산을 처리하는 경우, 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 IVL, S100A8, S100A9, S100A12, ANKRD35, BNIPL, SPRR1A, SPRR1B, SPRR3, TMEM79, PI3, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1 PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, RDH12, NOD2, ZNF750, DSC1, SERPINB3, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, KRTDAP, SULT2B1, KLK7 유전자는 각질형성세포 및 멜라닌세포 공-배양한 세포계에 하이드로퀴논 또는 레티노산을 처리하는 경우, 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1,PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEF B1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL, NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1,PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 피부 자극물질 스크리닝용 키트.
- 제9항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질 스크리닝용 키트.
- 1) 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 피부 자극 후보 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 1)단계의 세포 또는 세포계로부터 PI3, CEBPA, SERPINB3, HOPX, SPRR1A, NOD2, LCE3D, CNFN, TMTC1, KRTDAP, ANKRD35, SBSN, BPIL2, RDH12, FLG, H19, FLG2, LOR, IVL , NLRX1, ALDH1A3, DSC2, RHCG, SCEL, IL20, S100A8, S100A9, S100A12, BNIPL, SPRR3, TMEM79, FAM84A, GRHL1, SGPP2, AADACL2, TPRG1, PPP2R2C, SPINK5, ATP10B, GPR110, IL20RA, DEFB1, SLC28A3, AIF1L, CLIC3, NEBL, CARD18, PLBD1, GLTP, TGM1, ZNF750, DSC1, SERPINB13, EMR2, KLK10, COX7A1, SULT2B1 및 KLK7로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
3)상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 하이드로퀴논, 레티노산 또는 SLS를 각질형성세포, 멜라닌세포 또는 각질형 성세포 및 멜라닌세포를 공-배양한 세포계에 처리한 대조군의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 피부 자극 물질의 스크리닝 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질의 스크리닝 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 피부 자극 물질의 스크리닝 방법.
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