CN109536613A - Linc01767在肝细胞癌中的应用 - Google Patents

Linc01767在肝细胞癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LINC01767在肝细胞癌中的应用，本发明通过高通量测序首次发现了LINC01767在肝细胞癌患者中的表达显著下调，QPCR进一步验证了LINC01767在肝细胞癌中表达显著下调，提示LINC01767可作为肝细胞癌的辅助诊断指标。

Description

LINC01767在肝细胞癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及LINC01767在肝细胞癌中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，在全球最常见的恶性肿瘤中排第五位，在亚洲尤其高发。肝癌的死亡率很高，每年全球有约60万人死于肝癌。由于肝癌往往起病隐匿，大多数患者被诊断时即为晚期，错失治疗的最佳时机，导致治疗效果不佳。因此，迫切需要更好地了解肝癌的分子发病机制，这对于及早发现肿瘤并发展有效的治疗策略至关重要。
肝癌的发病是一个涉及多种调控和分子通路的复杂过程，目前尚不十分清楚。以往对肝癌发病的分子机制研究主要集中在蛋白质编码基因上，因为一直以来蛋白质被认为是各种生物学过程的中心。相比之下，RNA被认为是蛋白质合成的中间环节(mRNA)或平台(tRNA和rRNA)。然而随着近年来高通量测序技术的发展，人们逐渐认识到过去被认为是转录组“噪音”的非编码RNA，无论在数量上还是功能上都比蛋白质编码基因要丰富和重要。事实上，蛋白质编码基因只占人类基因转录组的不到2％。而非编码RNA陆续被证明参与发育、分化、肿瘤等各种生理、病理过程。在肿瘤组织中，非编码RNA的表达往往会出现异常，表明非编码RNA在肿瘤发生的过程中发挥关键作用。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt且不具备蛋白编码能力的RNA。由于能在表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达，lncRNA在各种生理、病理过程中发挥重要作用。对肿瘤而言，lncRNA能以促癌或抑癌的角色参与到肿瘤的发生、发展过程中(201710522694.9、201710522693.4)，同时，lncRNA的异常表达也是表征肿瘤发病风险、预后、转归的重要分子标记，但是目前临床上尚缺乏有效的lncRNA标志物，寻找肝细胞癌发生发展相关的lncRNA对肿瘤的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的分子标志物，所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性诊断标志物，应用于肝细胞癌的早期发现；同时所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性分子靶标，应用于肝细胞癌的个性化治疗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测LINC01767表达的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。其中，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂或试剂盒。
进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01767的表达水平的试剂。
进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。
进一步，所述试剂选自：特异性识别LINC01767的探针；或特异性扩增LINC01767的引物。
本发明提供了一种诊断肝细胞癌的产品，所述产品包括检测LINC01767表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别LINC01767的探针；或
特异性扩增LINC01767的引物。
进一步，所述的特异性扩增LINC01767基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了LINC01767基因在筛选治疗肝细胞癌的候选物质中的应用。
进一步，筛选治疗肝细胞癌的潜在物质的步骤包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01767基因的体系；和
检测所述体系中LINC01767基因的表达水平；
其中，若所述候选物质可促进LINC01767基因的表达或活性，(优选显著提高，如高1以上，较佳的高2以上；更佳的高5倍以上)，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明提供了LINC01767在制备预测肝细胞癌的计算模型中的应用。
本发明提供了LINC01767的促进剂在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。其中，所述促进剂是指任何提高LINC01767基因或表达产物稳定性、上调LINC01767的表达、增加lncRNA LINC01767的有效作用时间或促进LINC01767基因转录的物质，这些物质均可用于本发明。
作为一种优选的实施方式，所述促进剂是一种含有LINC01767的表达载体。所述表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括LINC01767的促进剂。所述促进剂是指任何提高LINC01767基因或表达产物稳定性、上调LINC01767的表达、增加lncRNALINC01767的有效作用时间或促进LINC01767基因转录的物质，这些物质均可用于本发明。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01767基因在肝细胞癌组织中的表达情况图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，检测肝细胞癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系，从而为肝细胞癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝细胞癌中LINC01767显著性下调。
分子标志物
在本发明中，“基因标志物”、“分子标志物”和“生物标志物”可以相互替代，是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
LINC01767基因
LINC01767是位于人1号染色短臂3区2带上，一种代表性的人LINC01767基因的核苷酸序列如如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01767基因(NR_147163.1)所示。本发明中的LINC01767包括野生型、突变型或其片段。
本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。
或者，当核酸或其片段与另一核酸(或其互补链)、一条链或其互补序列在选择性杂交条件下杂交时，则其间存在基本同源或(相同性)。当杂交比特异性整体丧失发生更具选择性时，存在杂交选择性。典型地，当在至少大约14个核苷酸的一段序列存在至少大约55％相同性、优选至少大约65％、更优选至少大约75％及最优选至少大约90％相同性时，发生选择性杂交。如本文所述，同源对比的长度可以是较长的序列节段，在某些实施方案中通常为至少大约20个核苷酸，更通常为至少大约24个核苷酸，典型为至少大约28个核苷酸，更典型为至少大约32个核苷酸，及优选至少大约36或更多个核苷酸。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
芯片、试剂盒
本发明提供了检测中LINC01767基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)制剂、芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01767所示的部分或全部序列。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LINC01767的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
药物筛选
本发明提供了一种筛选治疗肝细胞癌候选药物的方法，即：
在实验组中，向细胞培养体系中加入待测化合物，并测定LINC01767的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定LINC01767的表达水平；其中，如果实验组中LINC01767的表达水平大于对照组，则说明该待测化合物为LINC01767的候选药物。
在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选化合物进一步测试其抑制肝细胞癌癌的效果，若测试化合物对肝细胞癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗肝细胞癌的候选物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的LINC01767的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肝细胞癌。其中，所述促进剂是指任何提高LINC01767基因或表达产物稳定性、上调LINC01767的表达、增加lncRNA LINC01767的有效作用时间或促进LINC01767基因转录的物质，这些物质均可用于本发明。
作为一种优选的实施方式，所述促进剂是一种含有LINC01767的表达载体。作为更为优选的实施方式，所述表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。
所述药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集25例肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本，从中随机选取5例进行高通量测序，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。。
2、RNA样品的制备及质量分析
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
3、cDNA文库的构建
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；利用Illumina TruseqTM RNAsample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。
4、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。
5、高通量转录组测序数据分析
首先删除不易检测到的lncRNA，使用工具R-3.3.3中的DESeq2分析原始的count数据，根据参考基因组hg38，将Ensembl Gene ID转为Gene Symbol，差异表达lncRNA的筛选标准：FDR<0.05，abs(log2FC)>1。
6、结果
高通量测序结果显示，LINC01767基因在肝细胞癌组织中的表达量显著低于对癌旁组织(P<0.001)，提示LINC01767可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的早期诊断。
实施例2 QPCR测序验证LINC01767基因的差异表达
1、利用前面收集的25例患者癌组织样本和癌旁组织样本对LINC01767基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、QPCR检测
1)反应体系：
RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却；继续加入5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；
2)逆转录反应条件
25℃5min，42℃60min，70℃5min。
3)聚合酶链反应
引物设计：
根据Genebank中LINC01767基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列SEQ ID NO.1～4所示，其中，LINC01767的引物序列如SEQID NO.1～2所示；GAPDH的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
配制PCR反应体系：
2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH2O 8.0μl。
PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
QPCR结果如图1所示，与肝细胞癌癌旁组织相比，LINC01767在肝细胞癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中肝细胞癌组织样本中表达下调的有23例，非差异表达的有2例；提示LINC01767可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 临沂市人民医院
<120> LINC01767在肝细胞癌中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagccatat tacagatt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttgagaag tagaagta 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgggaaact gtggcgtgat gg 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggtggagga gtgggtgtcg ctgtt 25

Claims (10)

1.检测LINC01767的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01767基因的表达水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：特异性识别LINC01767的探针；或特异性扩增LINC01767的引物。
4.一种诊断肝细胞癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测LINC01767表达水平的试剂。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别LINC01767的探针；或
特异性扩增LINC01767的引物。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，特异性扩增LINC01767的引物序列如SEQID NO.1～2所示。
7.LINC01767在筛选治疗肝细胞癌的候选物质中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，筛选步骤包括：
用待筛选物质处理表达或含有LINC01767基因的体系；和
检测所述体系中LINC01767基因的表达水平；
其中，若所述待筛选物质可促进LINC01767的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选物质。
9.LINC01767在制备预测肝细胞癌的计算模型中的应用。
10.LINC01767的促进剂在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ESPOSTI DD等: "Identification of novel long non-coding RNAs deregulated in hepatocellular carcinoma using RNA-sequencing", 《ONCOTARGET》 *

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