CN116999470A - 一种治疗皮肤疾病的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及包含编码胶原α‑1(VII)链多肽，蛋白聚糖，金属蛋白酶抑制剂的一种或多种多核苷酸的药物组合物，所述药物组合物适于增强、增加、加强和/或强化受试者中的VII型胶原蛋白(type VII collagen，C7)、核心蛋白聚糖(decorin，DCN)和纤调蛋白聚糖(fibromodulin，FMOD)、金属蛋白酶抑制剂(例如金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase)3，TIMP3)的水平。本申请还涉及用于在受试者中提供皮肤的伤口、病症或疾病的预防性、缓和性或治疗性缓解的药物组合物和方法，所述受试者包括具有大疱性表皮松解症的一种或多种症状或有出现大疱性表皮松解症的一种或多种症状风险的受试者。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体地，本申请涉及用于在受试者中提供皮肤的伤口、病症或疾病的预防性、缓和性或治疗性缓解的组合物和方法，所述受试者包括具有大疱性表皮松解症的一种或多种症状或有出现大疱性表皮松解症的一种或多种症状风险的受试者。
背景技术
营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa，DEB)是一种遗传性皮肤疾病，患者的皮肤和粘膜组织极度脆弱，轻微摩擦或创伤都会引起水疱和撕裂，开放性伤口会导致皮肤感染和纤维化，可能使手指和脚趾融合，并最终增加发生鳞状细胞癌的风险。由于致病基因的突变位点，方式的不同DEB患者的症状个体差异很大，从轻度手，足，肘等局部到重度大范围起泡和皮肤及粘膜损伤不等。根据遗传方式可分为常染色体显性遗传型(DDEB)和常染色体隐性遗传型(RDEB)，RDEB由于致病基因的完全缺失病情更为严重，严重时威胁生命。全球有125，000以上的DEB患者。
DEB是由于编码胶原α-1(VII)链多肽的胶原蛋白COL7A1基因(约8.8kb长)发生突变所致。COL7A1基因mRNA大小约9kb，编码α-1(VII)链多肽，其中心区域为包含甘氨酸-X-Y重复序列的胶原片段，两端分别为约145KDa的N端非胶原区域NC1和约20KDa的C端非胶原区域NC2。VII型胶原蛋白(type VII collagen，C7)由角质形成细胞和成纤维细胞合成，在细胞内，3条α-1(VII)链多肽相连并折叠组合成三螺旋结构的VII型胶原蛋白(C7)单体，待分泌到细胞外后，两个VII型胶原蛋白单体进行C端重叠形成反向排列的二聚体，通过分子内的二硫键稳定二聚体结构。然后，VII型胶原蛋白二聚体横向组装成横纹状、中心对称的锚定纤维，从基底膜下部延伸至真皮上部，NC1端与基底膜致密层的大分子例如IV型胶原蛋白和层粘连蛋白5(1aminin 5)结合，同时捕获I、III和V型胶原蛋白等间质胶原蛋白纤维，锚定表皮基底膜和真皮。VII型胶原蛋白是锚定纤维中的一个主要成分，目前有超过320种不同的COL7A1基因致病突变被发现。在DEB患者中，COL7A1基因突变缺乏引起真皮层起泡，导致表皮与真皮分离。目前没有有效的治疗手段，主要以护理为主。由于许多DEB患者会有多处伤口，所以任何涉及皮内注射的治疗都会极具侵入性。针对大疱性表皮松解症患者的微创或非侵入性治疗来解决患者中的VII型胶原蛋白(C7)的缺失是一种有潜力的治疗方法。
发明内容
为了满足对DEB患者治疗的需求，本申请提供了一种包含编码胶原α-1(VII)链多肽，蛋白聚糖，例如核心蛋白聚糖(decorin，DCN)和纤调蛋白聚糖(fibromodulin，FMOD)，金属蛋白酶抑制剂(例如金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor ofmetalloproteinase)3，TIMP3)的一种或多种多核苷酸的药物组合物及其用途。本申请提供了一种分离的嵌合多肽，其中所述分离的嵌合多肽包含；a)胶原α-1(VII)链多肽；b)蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽；以及c)接头多肽；其中所述胶原α-1(VII)链多肽和所述蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽由所述接头多肽分开。本申请提供了一种病毒载体，所述病毒载体包含编码选自下组的转基因：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽和它们的嵌合多肽。本申请提供了一种包含上述药物组合物的药盒。
具体来说，本申请涉及以下内容：
1.一种药物组合物，其包含：
a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码选自下组的一种或多种多肽的转基因：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽和它们的功能性片段、嵌合多肽或变体；以及
b)药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，所述功能性片段为保留了胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂多肽功能域的蛋白片段。在一些实施方案中，所述嵌合多肽为包含胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂多肽功能域和额外的氨基酸序列，例如表位标签序列等的嵌合多肽。在一些实施方案中，所述变体为天然的胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂多肽氨基酸序列中插入、替换、和/或删除一个或多个，例如1-100、1-80、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2个氨基酸、同时仍保留天然蛋白功能的变体。在一些实施方案中，所述变体为天然的胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂多肽氨基酸序列中替换一个或多个，例如1-100、1-80、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2个氨基酸、同时仍保留天然蛋白功能的变体。在一些实施方案中，所述变体为天然的胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂多肽氨基酸序列中替换一个或多个，例如1-100、1-80、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2个氨基酸，优选用化学性质相同的氨基酸进行替换(例如酸性氨基酸群组中的氨基酸的互相替换、碱性氨基酸群组中的氨基酸的互相替换、芳香族氨基酸群组中的氨基酸的互相替换、疏水氨基酸群组中的氨基酸的互相替换、亲水氨基酸群组中的氨基酸的互相替换)、同时仍保留天然蛋白功能的变体(保守取代变体)。
2.如项1所述的药物组合物，其中所述胶原α-1(VII)链多肽为VII型胶原蛋白基因COL7A1编码。
3.如项1所述的药物组合物，其中所述蛋白聚糖多肽选自下组：核心蛋白聚糖(DCN)和纤调蛋白聚糖(FMOD)。
4.如项1所述的药物组合物，其中所述金属蛋白酶抑制剂为TIMP3。
5.如项1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒。
6.如项5所述的药物组合物，其中所述病毒是单纯疱疹病毒，优选所述单纯疱疹病毒是保藏编号为CCTCC NO.V201810的病毒株HL-1。
7.如项6所述的药物组合物，其中所述病毒是复制缺陷型或条件复制型的。
8.如项6所述的药物组合物，其中所述单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、2型单纯疱疹病毒(HSV-2)或它们的任何衍生物。
9.如项1所述的药物组合物，其中所述病毒是HSV-1扩增子。
10.如项1所述的药物组合物，其中所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。
11.如项10所述的药物组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
12.如项10或11所述的药物组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的删除或失活性突变。
13.如项12所述的药物组合物，其中所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组的一种或多种：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。
14.如项10或11所述的药物组合物，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的一种或多种基因的删除或失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。
15.如项1所述的药物组合物，其中所述一种或多种多肽的转基因还包含miRNA结合位点。
16.如项1所述的药物组合物，其中所述一种或多种多肽的转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接。
17.如项16所述的药物组合物，其中所述一种或多种真核启动子是选自下组：人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、CAG启动子、SV40启动子、RSV启动子以及它们的任何组合。
18.如项2所述的药物组合物，其中所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
19.如项2所述的药物组合物，其中所述胶原α-1(VII)链多肽是多肽片段，其中该片段包含SEQ ID NO：1的第1254-2784位氨基酸。
20.如项3所述的药物组合物，其中所述病毒包含编码核心蛋白聚糖(DCN)多肽的转基因。
21.如项3所述的药物组合物，其中所述核心蛋白聚糖(DCN)多肽与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述核心蛋白聚糖(DCN)多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性
22.如项3所述的药物组合物，其中所述核心蛋白聚糖(DCN)多肽是多肽片段，其中该片段包含SEQ ID NO：2的第73-359位氨基酸。
在一些实施方案的的药物组合物中，当所述核心蛋白聚糖DecorinDCN多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
23.如项3所述的药物组合物，其中所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖(FMOD)多肽的转基因。
24.如项3所述的药物组合物，其中所述纤调蛋白聚糖(FMOD)多肽与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述纤调蛋白聚糖(FMOD)多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
25.如项3所述的药物组合物，其中所述纤调蛋白聚糖(FMOD)多肽是多肽片段，其中该片段包含SEQ ID NO：3的第67-365位氨基酸。
在一些实施方案的的药物组合物中，当所述纤调蛋白聚糖(FMOD)多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
26.如项4所述的药物组合物，其中所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因。
27.如项4所述的药物组合物，其中所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ IDNO：4的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
28.如项4所述的药物组合物，其中所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽是多肽片段，其中该片段包含SEQ ID NO：4的第24-188位氨基酸。
在一些实施方案的的药物组合物中，当所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
29.如项1所述的药物组合物，其中所述病毒包含至少第一转基因，任选地包含第二转基因，和/或第三转基因，和/或第四转基因。
30.如项29所述的药物组合物，其中所述第一转基因编码胶原α-1(VII)链多肽，并且所述第二/第三/第四转基因编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。
31.如项1所述的药物组合物，其中所述病毒包含多顺反子性的转基因。
32.如项31所述的药物组合物，其中所述多顺反子性转基因至少在第一开放阅读框(ORF)上编码胶原α-1(VII)链多肽，任选地在第二开放阅读框(ORF)，和/或第三开放阅读框(ORF)，和/或第四开放阅读框(ORF)上编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。
33.如项32所述的药物组合物，其中所述第一ORF和所述第二ORF、所述第二ORF和所述第三ORF、或所述第三ORF和所述第四ORF之间由内部核糖体进入位点(IRES)分开。
34.如项1所述的药物组合物，其中所述嵌合多肽包含在所述胶原α-1(VII)链多肽与任选的蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽之间的接头多肽。
35.如项34所述的药物组合物，其中所述胶原α-1(VII)链多肽为VII型胶原蛋白基因COL7A1编码。
36.如项35所述的药物组合物，其中所述蛋白聚糖多肽选自下组：核心蛋白聚糖和纤调蛋白聚糖。
37.如项35所述的药物组合物，其中所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。
38.如项35-37所述的药物组合物，其中所述接头多肽是T2A、P2A、E2A或F2A接头多肽。
39.如项34-38任一项所述的药物组合物，其中所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
40.项1-39中任一项所述的药物组合物在制备预防、缓解或治疗受试者的皮肤的伤口、病症或疾病、或改善皮肤外观状态的药物中的用途。
41.如项40所述的用途，其中所述皮肤的疾病或病症是大疱性表皮松解症、皮肤癌、牛皮癣、扁平苔癣、狼疮、红斑痤疮、湿疹、皮肤念珠菌病、蜂窝织炎、脓疱疮、褥疮、丹毒、寻常型鱼鳞病、皮肌炎、肢端皮炎、淤积性皮炎、内瑟顿综合征、单纯大疱性表皮松解症(LAMB3基因)、常染色体隐性先天性鱼鳞病、着色性干皮病、类天疱疮、慢性伤口和皮肤老化或不良状态中的一种或多种。
在一些实施方案中，本申请还包含预防、缓解或治疗受试者的皮肤的伤口、病症或疾病、或改善皮肤外观状态的方法，包括向所述受试者施用项1-39中任一项所述的药物组合物来预防、缓解或治疗受试者的皮肤的伤口、病症或疾病、或改善皮肤外观状态。
在一些实施方案中，所述皮肤的疾病或病症是大疱性表皮松解症、皮肤癌、牛皮癣、扁平苔癣、狼疮、红斑痤疮、湿疹、皮肤念珠菌病、蜂窝织炎、脓疱疮、褥疮、丹毒、寻常型鱼鳞病、皮肌炎、肢端皮炎、淤积性皮炎、内瑟顿综合征、单纯大疱性表皮松解症(LAMB3基因)、常染色体隐性先天性鱼鳞病、着色性干皮病、类天疱疮、慢性伤口和皮肤老化或不良状态中的一种或多种。
42.一种分离的嵌合多肽，其中所述分离的嵌合多肽包含；
a)胶原α-1(VII)链多肽；
b)蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽；以及
c)接头多肽；
其中所述胶原α-1(VII)链多肽和所述蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽由所述接头多肽分开。
43.如项42所述的嵌合多肽，其中所述胶原α-1(VII)链多肽为VII型胶原蛋白基因COL7A1编码。
44.如项42所述的嵌合多肽，其中所述蛋白聚糖多肽选自下组：核心蛋白聚糖和纤调蛋白聚糖。
45.如项42所述的嵌合多肽，其中所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。
46.如项43所述的分离的嵌合多肽，其中所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
47.如项44所述的分离的嵌合多肽，其中所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
48.如项44所述的分离的嵌合多肽，其中所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
49.如项45所述的分离的嵌合多肽，其中所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ IDNO：4的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
50.如项42-49中任一项所述的分离的嵌合多肽，其中所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
51.一种编码如项42-50任一项所述的嵌合多肽的多核苷酸。
52.一种包含如项51所述的多核苷酸的载体。
53.如项52所述的载体，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
54.如项53所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
在一些实施方案中，所述单纯疱疹病毒基因组来自保藏编号为CCTCC NO.V201810的病毒株HL-1或其后代。
55.如项53或54所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的删除或失活性突变。
56.如项55所述的载体，其中所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组的一种或多种：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。
57.如项53或54所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的一个或多个基因的删除或失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。
58.一种载体，其包含编码选自下组的多肽的多核苷酸：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽或它们的任何组合，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
59.如项58所述的载体，其中所述胶原α-1(VII)链多肽为VII型胶原蛋白基因COL7A1编码。
60.如项58所述的载体，其中所述蛋白聚糖多肽选自下组：核心蛋白聚糖和纤调蛋白聚糖。
61.如项58所述的载体，其中所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。
62.如项58-61任一项所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。
在一些实施方案中，所述单纯疱疹病毒基因组来自保藏编号为CCTCC NO.V201810的病毒株HL-1或其后代。
63.如项58-62任一项所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的删除或失活性突变。
64.如项63所述的载体，其中所述立即早期单纯疱疹病毒基因包含选自下组的一种或多种基因：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。
65.如项58-62任一项所述的载体，其中所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的删除或失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。
66.一种包含如项52-65中任一项所述的载体的宿主细胞。
67.如项66所述的宿主细胞，该细胞中包含能够支持所述载体复制的蛋白或基因。
在一些实施方案的中，当编码如项42-50任一项所述的嵌合多肽的多核苷酸在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
68.一种药盒，其包括：
a)如项1至48中任一项所述的药物组合物；以及
b)用于施用所述药物组合物的说明书。
69.如项68所述的药盒，其中所述说明书说明药物组合物以包括外用水凝胶或注射剂的方式施用。
发明效果
本申请提供的药物组合物通过例如局部或透皮方式施用于受试者，能够形成锚原纤维加强受试者的上皮基底层和真皮的锚定；改进胞外基质的组成，促进锚原纤维的形成和稳定，更加有效地锚定受试者的表皮层和真皮层，可以抑制TGF-β的水平，减少成纤维化，减轻DEB的症状；同时能够抑制降解胶原蛋白的基质金属蛋白酶MMPs(包括降解C7的MMP-1和MMP-2)，保护表达分泌的C7不被基质金属蛋白酶降解，同时也保护C7的交联胶原蛋白(包括纤维粘连蛋白和胶原蛋白IV)不被基质金属蛋白酶降解，从而增强表达的C7的锚定修复功能，从而更加有效地预防、缓解或治疗包括DEB等的皮肤疾病或病症或不良皮肤状况。
附图说明
图1显示出蛋白免疫印迹方法检测不同重组HSV-1载体表达的C7情况。M：蛋白分子量标准；1：HL1-COL7A1；2：HL1-COL7A1/DCN；3：HL1-COL7A1/FMOD；4：HL1-COL7A1/TIMP3；5：编码COL7A1的质粒；6：阴性对照。
图2显示治疗前后各组动物表型变化。
图3显示各组动物注射部位皮肤组织检查。备注：第一排：500μm；第二排：100μm；e：表皮；d：真皮；*：表皮真皮间隙。
生物材料的保藏
人疱疹病毒I型HL-1株，于2019年7月30日保藏至中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCCNO.V201810。该保藏细胞株记载在申请号为CN 202010145493.3的专利申请中，该申请全文引入本申请用作本申请的公开内容。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来详细说明本申请。应理解，以下实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文描述或引用的技术和程序是本领域技术人员通常熟知的且使用常规方法经常使用的。
本申请一方面提供了一种药物组合物，其包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码选自下组的转基因：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽和它们的嵌合多肽；以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和金属蛋白酶抑制剂TIMP3的嵌合多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在上述具体的实施方案中，所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒，优选地为单纯疱疹病毒(HSV)，更优选地为1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。所述病毒可以是复制缺陷型或条件复制型的。所述载体是HSV-1扩增子。所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的失活性突变。所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。所述一种或多种转基因包含miRNA结合位点。所述一种或多种转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接。所述一种或多种真核启动子是选自下组：人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、CAG启动子、SV40启动子、RSV启动子以及它们的任何组合。所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因。所述病毒包含两种转基因，其中每种转基因均编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：1的第1254-2784位氨基酸。当所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：2的第73-359位氨基酸。当所述核心蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQID NO：3的第67-365位氨基酸。当所述纤调蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：4的第24-188位氨基酸。当所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述载体可包含第一转基因。所述载体可包含第二转基因。所述载体可包含第三转基因。所述载体可包含第四转基因。所述载体可包含第一转基因和第二转基因。所述载体可包含第一转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因、第三转基因和第四转基因。所述第一转基因编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，并且所述第二/第三/第四转基因编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。所述病毒包含多顺反子性的转基因。多顺反子性转基因可以在第一开放阅读框(ORF)上编码胶原蛋白a-1(VII)链多肽，在第二开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第三开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第四开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。其中所述第一ORF和所述第二ORF、所述第二ORF和所述第三ORF、或所述第三ORF和所述第四ORF之间由内部核糖体进入位点(IRES)分开。所述嵌合多肽包含在所述胶原α-1(VII)链多肽与任选的蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽纤调蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在纤调蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。所述接头多肽是T2A、P2A、E2A或F2A接头多肽。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。当所述嵌合多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽可以是：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽可以是：金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、和TIMP4。复制缺陷型病毒是指，将野生型病毒的必需基因替换成外源基因或删除，失去感染复制能力，这种重组病毒称复制缺陷病毒。复制缺陷型重组单纯疱疹病毒包含病毒必需基因的突变失活，这些必需基因是ICP4和ICP27。条件复制型病毒是指进行了基因改造而仅在某种特定细胞中增殖的病毒。其不作用于正常细胞而仅在该种特定细胞中增殖。条件复制型重组单纯疱疹病毒包含病毒非必需基因的突变失活，这些非必需基因是ICP34.5、ICP0、ICP47、ICP6、TK等基因。病毒也可以是具有复制能力的。扩增子(amplicon)是指DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。立即早期基因对随后的来自其它病毒启动子元件的转录活化是必需的，在单纯疱疹病毒感染中，立即早期基因可确保在进入细胞后立即高效地转录病毒DNA基因组。许多病毒感染导致细胞蛋白编码基因转录抑制。但立即早期基因能够迅速表达，其表达产物后面跟着由早期和晚期基因编码的蛋白表达，包括结构蛋白以及对病毒繁殖必需的蛋白。miRNA结合位点是指5’和/或3’UTR包括可以增强特定细胞类型中的转基因表达的元件。可操作地连接是指当核酸与另一核酸序列处于功能关系时操作性地连接。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成使得便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的。转基因是指在引入细胞后能够转录成RNA并在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予其所引入的细胞所需的特性，或以其他方式产生所需的治疗或诊断结果。转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接是指真核启动子与编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码核心蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码纤调蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP1的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP2的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP4的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码光蛋白聚糖(lumican)的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码mimecan蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码上述多肽的嵌合多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，确保mRNA的正确产生。这些转基因可以在同一条DNA链上编码，或以反义取向在相反的DNA链上编码。将每种转基因与其自身的启动子和调控元件连接允许每个编码序列在单独的mRNA转录物上独立表达。从不同启动子表达转基因使得能够将编码序列可操作地连接至不同启动子类型，这可以驱动转基因在不同水平、在细胞周期中的不同时间、在不同细胞类型中或在不同诱导物或抑制物控制下的表达。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：2的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。多顺反子性的转基因是指一个mRNA分子编码多个多肽链的转基因。内部核糖体进入位点是指一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入，允许在同一启动子的控制下共同表达多个基因。合适的IRES的实例可包括但不限于病毒来源的IRES(例如，来源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒、劳氏肉瘤病毒、人体免疫缺陷病毒、蟋蟀麻痹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等的IRES)和细胞mRNA来源的IRES(例如，来源于生长因子mRNA，诸如成纤维细胞生长因子2、血小板来源生长因子B和血管内皮生长因子的IRES；来源于转录因子mRNA，诸如触角因子、ultrapithoraxm和NF-κB抑制因子的IRES；来源于致癌基因mRNA，诸如c-myc、pim-1和蛋白激酶p58PITSLRE的IRES等)。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。开放阅读框或ORF是指编码蛋白质或多肽的连续核酸序列，DNA或RNA。通常，核酸包含翻译启始信号或起始密码子(诸如ATG或AUG)和终止密码子。
本申请另一方面提供了一种药物组合物在制备预防性、缓和性或治疗性缓解受试者的皮肤的伤口、病症或疾病的药物的用途。
在一个具体的实施方案中，所述皮肤的疾病或病症是大疱性表皮松解症、皮肤癌、牛皮癣、扁平苔癣、狼疮、红斑痤疮、湿疹、皮肤念珠菌病、蜂窝织炎、脓疱疮、褥疮、丹毒、寻常型鱼鳞病、皮肌炎、肢端皮炎、淤积性皮炎、内瑟顿综合征、单纯大疱性表皮松解症(LAMB3基因)、常染色体隐性先天性鱼鳞病、着色性干皮病、类天疱疮、慢性伤口和皮肤老化或不良状态中的一种或多种。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和金属蛋白酶抑制剂TIMP3的嵌合多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在上述具体的实施方案中，所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒，优选地为单纯疱疹病毒(HSV)，更优选地为1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。所述病毒可以是复制缺陷型或条件复制型的。所述载体是HSV-1扩增子。所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的失活性突变。所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。所述一种或多种转基因包含miRNA结合位点。所述一种或多种转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接。所述一种或多种真核启动子是选自下组：人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、CAG启动子、SV40启动子、RSV启动子以及它们的任何组合。所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因。所述病毒包含两种转基因，其中每种转基因均编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：1的第1254-2784位氨基酸。当所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：2的第73-359位氨基酸。当所述核心蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQID NO：3的第67-365位氨基酸。当所述纤调蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：4的第24-188位氨基酸。当所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述载体可包含第一转基因。所述载体可包含第二转基因。所述载体可包含第三转基因。所述载体可包含第四转基因。所述载体可包含第一转基因和第二转基因。所述载体可包含第一转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因、第三转基因和第四转基因。所述第一转基因编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，并且所述第二/第三/第四转基因编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。所述病毒包含多顺反子性的转基因。多顺反子性转基因可以在在第一开放阅读框(ORF)上编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，在第二开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第三开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第四开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。其中所述第一ORF和所述第二ORF、所述第二ORF和所述第三ORF、或所述第三ORF和所述第四ORF之间由内部核糖体进入位点(IRES)分开。所述嵌合多肽包含在所述胶原α-1(VII)链多肽与任选的蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽纤调蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在纤调蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。所述接头多肽是T2A、P2A、E2A或F2A接头多肽。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。当所述嵌合多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽可以是：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽可以是：金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、和TIMP4。复制缺陷型病毒是指，将野生型病毒的必需基因替换成外源基因或删除，失去感染复制能力，这种重组病毒称复制缺陷型病毒。复制缺陷型重组单纯疱疹病毒包含病毒必需基因的突变失活，这些必需基因是ICP4和ICP27。条件复制型病毒是指进行了基因改造而仅在某种特定细胞中增殖的病毒。其不作用于正常细胞而仅该种特定细胞中增殖。条件复制型重组单纯疱疹病毒包含病毒非必需基因的突变失活，这些非必需基因是ICP34.5、ICP0、ICP47、ICP6、TK等基因。病毒也可以是具有复制能力的。扩增子(amplicon)是指DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。立即早期基因对随后的来自其它病毒启动子元件的转录活化是必需的，在单纯疱疹病毒感染中，立即早期基因可确保在进入细胞后立即高效地转录病毒DNA基因组。许多病毒感染导致细胞蛋白编码基因转录抑制。但立即早期基因能够迅速表达，其表达产物后面跟着由早期和晚期基因编码的蛋白表达，包括结构蛋白以及对病毒繁殖必需的蛋白。miRNA结合位点是指5’和/或3’UTR包括可以增强特定细胞类型中的转基因表达的元件。可操作地连接是指当核酸与另一核酸序列处于功能关系时操作性地连接。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成使得便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的。转基因是指在引入细胞后能够转录成RNA并在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予其所引入的细胞所需的特性，或以其他方式产生所需的治疗或诊断结果。转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接是指真核启动子与编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码核心蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码纤调蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP1的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP2的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP4的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码光蛋白聚糖(lumican)的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码mimecan蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码上述多肽的嵌合多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，确保mRNA的正确产生。这些转基因可以在同一条DNA链上编码，或以反义取向在相反的DNA链上编码。将每种转基因与其自身的启动子和调控元件连接允许每个编码序列在单独的mRNA转录物上独立表达。从不同启动子表达转基因使得能够将编码序列可操作地连接至不同启动子类型，这可以驱动转基因在不同水平、在细胞周期中的不同时间、在不同细胞类型中或在不同诱导物或抑制物控制下的表达。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。多顺反子性的转基因是指一个mRNA分子编码多个多肽链的转基因。内部核糖体进入位点是指一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入，允许在同一启动子的控制下共同表达多个基因。合适的IRES的实例可包括但不限于病毒来源的IRES(例如，来源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒、劳氏肉瘤病毒、人体免疫缺陷病毒、蟋蟀麻痹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等的IRES)和细胞mRNA来源的IRES(例如，来源于生长因子mRNA，诸如成纤维细胞生长因子2、血小板来源生长因子B和血管内皮生长因子的IRES；来源于转录因子mRNA，诸如触角因子、u1trapithoraxm和NF-κB抑制因子的IRES；来源于致癌基因mRNA，诸如c-myc、pim-1和蛋白激酶p 58PITSLRE的IRES等)。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。开放阅读框或ORF是指编码蛋白质或多肽的连续核酸序列，DNA或RNA。通常，核酸包含翻译启始信号或起始密码子(诸如ATG或AUG)和终止密码子。
在上述具体实施方案中，所述药学上可接受的载剂适于局部施用或透皮施用。所述药学上可接受的载剂还适于皮下施用或皮内施用。药学上可接受的载剂是足以用于局部和/或透皮施用/应用的载剂。药学上可接受的载剂是足以用于皮下和/或皮内施用/应用的载剂。药学上可接受的载剂是微创或非侵入性的。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒性，并且包括但不限于：凝胶辅料(阳离子型、阴离子型、中性、表面活性剂型等)；缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵(hexamethoniumchloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；多元醇，诸如甘油(例如，包含10％甘油的制剂)；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。
本申请另一方面提供了一种分离的嵌合多肽，其中所述分离的嵌合多肽包含；a)胶原α-1(VII)链多肽；b)蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽；以及c)接头多肽；其中所述胶原α-1(VII)链多肽和所述蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽由所述接头多肽分开。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖FMOD与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖FMOD与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：5的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：6的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为核心蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在一个具体实施方案中，所述胶原α-1(VII)链多肽为胶原蛋白COL7A1基因编码的。所述蛋白聚糖多肽为纤调蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为金属蛋白酶抑制剂TIMP3。所述胶原α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述接头多肽与SEQ ID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽还可以选自：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽为还可以是TIMP1、TIMP2、TIMP4。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在纤调蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。
本申请另一方面提供了一种载体，其包含编码选自下组的多肽的多核苷酸：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽或它们的任何组合，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
在一个具体的实施方案中，载体包含编码的胶原蛋白α-1(VII)链多肽的多核苷酸，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
在一个具体的实施方案中，载体包含编码的核心蛋白聚糖多肽的多核苷酸，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
在一个具体的实施方案中，载体包含编码的纤调蛋白聚糖多肽的多核苷酸，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
在一个具体的实施方案中，载体包含编码的金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的多核苷酸，其中所述载体是重组单纯疱疹病毒基因组。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽可以是：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽可以是：金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、和TIMP4。所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因中的失活性突变。所述立即早期单纯疱疹病毒基因包含选自下组的基因：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”可互换使用，并指多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，以及为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸主链的其他聚合物，条件是这些聚合物含有核碱基，所述核碱基的构型允许碱基配对和碱基堆积，如DNA和RNA中所见的。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如，以类似物对天然存在的核苷酸中的一个或多个进行的取代和核苷酸间修饰。载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或它们的任何杂合病毒载体。载体是单纯疱疹病毒载体。载体可以是HSV-1扩增子。载体包含在ICP34.5、ICP4基因座插入两个拷贝的真核启动子(人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、CMV，EF1，CAG、SV40、RSV)表达的人COL7A1基因。载体包含在ICP27，UL41，UL43基因处插入真核启动子(人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、CMV，EF1，CAG、SV40、RSV)表达的人Decorin基因或其它蛋白聚糖基因。载体包含在ICP27，UL41，UL43基因处插入真核启动子(人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、CMV，EF1，CAG、SV40、RSV)或角质细胞特异性启动子表达的TIMP3基因或其它金属蛋白酶抑制剂。
在上述具体实施方案中，立即早期基因对随后的来自其它病毒启动子元件的转录活化是必需的，在单纯疱疹病毒感染中，立即早期基因可确保在进入细胞后立即高效地转录病毒DNA基因组。许多病毒感染导致细胞蛋白编码基因转录抑制。但立即早期基因能够迅速表达，其表达产物后面跟着由早期和晚期基因编码的蛋白表达，包括结构蛋白以及对病毒繁殖必需的蛋白。载体是指用于将真核核酸引入细胞中以便于这些核酸的表达或复制的离散元件。表达载体包括能够表达与调控序列(诸如启动子区)操作性地连接的核酸的载体，所述调控序列能够影响此类核酸的表达。因此，表达载体可以指DNA或RNA构建体，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或在引入适当的宿主细胞中之后引起核酸表达的其他载体。载体能够在宿主细胞中自主复制。载体也可能不能在宿主细胞中自主复制。载体能够整合到宿主DNA中。
本申请另一方面提供了一种包含上述载体的宿主细胞。
在一个具体的实施方案中，宿主细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞等)；真菌细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞等)；昆虫细胞(例如，S2细胞等)；哺乳动物细胞。宿主细胞可以是来自细胞系的细胞。合适的宿主细胞或细胞系的实例可包括但不限于293、HeLa、SH-Sy5y、Hep G2、CACO-2、A549、L929、3T3、K562、CHOK1、MDCK、HUVEC、Vero、N20、COS-7、PSN1、VCaP、BHK、CHO细胞等。合适的宿主细胞或细胞系还包括对上述细胞进行基因工程改造后的补偿细胞或细胞系，其表达病毒复制必需基因以支持病毒载体的复制。载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或它们的任何杂合病毒载体。载体是单纯疱疹病毒载体。载体可以是HSV-1扩增子。
在上述具体实施方案中，使包含使宿主细胞与编码目标基因的单纯疱疹病毒载体接触，从接触的宿主细胞的上清液中收集由所述宿主细胞产生的所述单纯疱疹病毒。所述单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。
本申请另一方面提供了一种药盒，其包括：a)所述药物组合物；以及b)用于施用所述药物组合物的说明书。
在一个具体的实施方案中，所述说明书包含用于施用所述药物组合物以在受试者中提供皮肤的伤口、病症或疾病的预防性、缓和性或治疗性缓解的说明。所述说明书说明药物组合物以包括外用水凝胶或注射剂的方式施用。
在一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和金属蛋白酶抑制剂TIMP3的嵌合多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在上述具体实施方案中，所述药学上可接受的载剂适于局部施用或透皮施用。所述药物组合物每天施用一次、两次、三次、四次、五次或更多次。所述药物组合物施用于所述受试者的一个或多个受影响的区域和/或未受影响的区域。所述皮肤的所述疾病或病症是大疱性表皮松解症、皮肤癌、牛皮癣、扁平苔癣、狼疮、红斑痤疮、湿疹、皮肤念珠菌病、蜂窝织炎、脓疱疮、褥疮、丹毒、寻常型鱼鳞病、皮肌炎、肢端皮炎、淤积性皮炎、内瑟顿综合征、单纯大疱性表皮松解症(LAMB3基因)、常染色体隐性先天性鱼鳞病、着色性干皮病、类天疱疮、慢性伤口和皮肤老化或不良状态中的一种或多种。
在上述具体的实施方案中，所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒，优选地为单纯疱疹病毒(HSV)，更优选地为1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。所述病毒可以是复制缺陷型或条件复制型的。所述载体是HSV-1扩增子。所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的失活性突变。所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。所述一种或多种转基因包含miRNA结合位点。所述一种或多种转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接。所述一种或多种真核启动子是选自下组：人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、CAG启动子、SV40启动子、RSV启动子以及它们的任何组合。所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因。所述病毒包含两种转基因，其中每种转基因均编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：1的第1254-2784位氨基酸。当所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因。所述核心蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：2的第73-359位氨基酸。当所述核心蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：3的第67-365位氨基酸。当所述纤调蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：4的第24-188位氨基酸。当所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述载体可包含第一转基因。所述载体可包含第二转基因。所述载体可包含第三转基因。所述载体可包含第四转基因。所述载体可包含第一转基因和第二转基因。所述载体可包含第一转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因、第三转基因和第四转基因。所述第一转基因编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，并且所述第二/第三/第四转基因编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。所述病毒包含多顺反子性的转基因。多顺反子性转基因可以在在第一开放阅读框(ORF)上编码胶原蛋白a-1(VII)链多肽，在第二开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第三开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第四开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。其中所述第一ORF和所述第二ORF、所述第二ORF和所述第三ORF、或所述第三ORF和所述第四ORF之间由内部核糖体进入位点(IRES)分开。所述嵌合多肽包含在所述胶原α-1(VII)链多肽与任选的蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与核心蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在纤调蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。所述接头多肽是T2A、P2A、E2A或F2A接头多肽。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。当所述嵌合多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽可以是：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽可以是：金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、和TIMP4。复制缺陷型病毒是指，将野生型病毒的必需基因替换成外源基因或删除，失去感染复制能力，这种重组病毒称复制缺陷型病毒。复制缺陷型重组单纯疱疹病毒包含病毒必需基因的突变失活，这些必需基因是ICP4和ICP27。条件复制型病毒是指进行了基因改造而仅在某种特定细胞中增殖的病毒。其不作用于正常细胞而仅该种特定细胞中增殖。条件复制型重组单纯疱疹病毒包含病毒非必需基因的突变失活，这些非必需基因是ICP34.5、ICP0、ICP47、ICP6、TK等基因。病毒也可以是具有复制能力的。扩增子(amplicon)是指DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。立即早期基因对随后的来自其它病毒启动子元件的转录活化是必需的，在单纯疱疹病毒感染中，立即早期基因可确保在进入细胞后立即高效地转录病毒DNA基因组。许多病毒感染导致细胞蛋白编码基因转录抑制。但立即早期基因能够迅速表达，其表达产物后面跟着由早期和晚期基因编码的蛋白表达，包括结构蛋白以及对病毒繁殖必需的蛋白。miRNA结合位点是指5’和/或3’UTR包括可以增强特定细胞类型中的转基因表达的元件。可操作地连接是指当核酸与另一核酸序列处于功能关系时操作性地连接。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成使得便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的。转基因是指在引入细胞后能够转录成RNA并在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予其所引入的细胞所需的特性，或以其他方式产生所需的治疗或诊断结果。转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接是指真核启动子与编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码核心蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码纤调蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP1的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP2的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP4的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码光蛋白聚糖(lumican)的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码mimecan蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码上述多肽的嵌合多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，确保mRNA的正确产生。这些转基因可以在同一条DNA链上编码，或以反义取向在相反的DNA链上编码。将每种转基因与其自身的启动子和调控元件连接允许每个编码序列在单独的mRNA转录物上独立表达。从不同启动子表达转基因使得能够将编码序列可操作地连接至不同启动子类型，这可以驱动转基因在不同水平、在细胞周期中的不同时间、在不同细胞类型中或在不同诱导物或抑制物控制下的表达。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。多顺反子性的转基因是指一个mRNA分子编码多个多肽链的转基因。内部核糖体进入位点是指一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入，允许在同一启动子的控制下共同表达多个基因。合适的IRES的实例可包括但不限于病毒来源的IRES(例如，来源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒、劳氏肉瘤病毒、人体免疫缺陷病毒、蟋蟀麻痹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等的IRES)和细胞mRNA来源的IRES(例如，来源于生长因子mRNA，诸如成纤维细胞生长因子2、血小板来源生长因子B和血管内皮生长因子的IRES；来源于转录因子mRNA，诸如触角因子、ultrapithoraxm和NF-κB抑制因子的IRES；来源于致癌基因mRNA，诸如c-myc、pim-1和蛋白激酶p58PITSLRE的IRES等)。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。开放阅读框或ORF是指编码蛋白质或多肽的连续核酸序列，DNA或RNA。通常，核酸包含翻译启始信号或起始密码子(诸如ATG或AUG)和终止密码子。
本申请另一方面提供了一种在受试者中提供皮肤的伤口、病症或疾病的预防性、缓和性或治疗性缓解的方法，所述方法包括以局部方式或以透皮方式施用能够增强、增加、加强和/或强化所述受试者的一种或多种细胞中的胶原α-1(VII)链多肽和/或蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽的水平的药物组合物。
在一个具体的实施方式中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和核心蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和纤调蛋白聚糖多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含：a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽、核心蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和金属蛋白酶抑制剂TIMP3的嵌合多肽的转基因以及b)药学上可接受的载剂。
在上述具体实施方案中，所述药学上可接受的载剂适于局部施用或透皮施用。所述药物组合物每天施用一次、两次、三次、四次、五次或更多次。所述药物组合物施用于所述受试者的一个或多个受影响的区域和/或未受影响的区域。所述皮肤的所述疾病或病症是大疱性表皮松解症、皮肤癌、牛皮癣、扁平苔癣、狼疮、红斑痤疮、湿疹、皮肤念珠菌病、蜂窝织炎、脓疱疮、褥疮、丹毒、寻常型鱼鳞病、皮肌炎、肢端皮炎、淤积性皮炎、内瑟顿综合征、单纯大疱性表皮松解症(LAMB3基因)、常染色体隐性先天性鱼鳞病、着色性干皮病、类天疱疮、慢性伤口和皮肤老化或不良状态中的一种或多种。
在上述具体的实施方案中，所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒，优选地为单纯疱疹病毒(HSV)，更优选地为1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。所述病毒可以是复制缺陷型或条件复制型的。所述载体是HSV-1扩增子。所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。所述重组单纯疱疹病毒基因组是重组HSV-1基因组、重组HSV-2基因组或它们的任何衍生物。所述重组单纯疱疹病毒基因组包含立即早期单纯疱疹病毒基因的失活性突变。所述立即早期单纯疱疹病毒基因选自下组：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47。所述重组单纯疱疹病毒基因组还包含选自下组的基因的失活性突变：ICP34.5、VP16、UL41和UL43。所述一种或多种转基因包含miRNA结合位点。所述一种或多种转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接。所述一种或多种真核启动子是选自下组：人角质形成细胞特异性启动子、人成纤维细胞特异性启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、延伸因子-1(EF1)启动子、CAG启动子、SV40启动子、RSV启动子以及它们的任何组合。所述病毒包含编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的转基因。所述病毒包含两种转基因，其中每种转基因均编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％的序列同一性。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：1的第1254-2784位氨基酸。当所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码核心蛋白聚糖多肽的转基因。所述核心蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：2的第73-359位氨基酸。当所述核心蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码纤调蛋白聚糖多肽的转基因。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有至少80％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：3的第67-365位氨基酸。当所述纤调蛋白聚糖多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述病毒包含编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽的转基因。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有至少80％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽是片段，其中所述片段具有SEQ ID NO：4的第24-188位氨基酸。当所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。所述载体可包含第一转基因。所述载体可包含第二转基因。所述载体可包含第三转基因。所述载体可包含第四转基因。所述载体可包含第一转基因和第二转基因。所述载体可包含第一转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第三转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因和第四转基因。所述载体可包含第一转基因、第二转基因、第三转基因和第四转基因。所述第一转基因编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，并且所述第二/第三/第四转基因编码选自下组的多肽：核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽和金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。所述病毒包含多顺反子性的转基因。多顺反子性转基因可以在在第一开放阅读框(ORF)上编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽，在第二开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第三开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。在第四开放阅读框(ORF)上编码核心蛋白聚糖多肽、纤调蛋白聚糖多肽或金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽。其中所述第一ORF和所述第二ORF、所述第二ORF和所述第三ORF、或所述第三ORF和所述第四ORF之间由内部核糖体进入位点(IRES)分开。所述嵌合多肽包含在所述胶原α-1(VII)链多肽与任选的蛋白聚糖多肽和/或金属蛋白酶抑制剂多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与核心蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在胶原蛋白α-1(VII)链多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与纤调蛋白聚糖多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在核心蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。嵌合多肽可以包含在纤调蛋白聚糖多肽与金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽之间的接头多肽。所述接头多肽是T2A、P2A、E2A或F2A接头多肽。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQID NO：8的序列具有至少80％的序列同一性。当所述嵌合多肽在受试者的一种或多种靶细胞中表达时，所述多肽增强、增加、加强和/或强化所述受试者的锚原纤维形成、上皮基底层和真皮的锚定。
在上述具体实施方案中，所述蛋白聚糖多肽可以是：光蛋白聚糖(lumican)或mimecan蛋白聚糖等蛋白聚糖。所述金属蛋白酶抑制剂多肽可以是：金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2、和TIMP4。复制缺陷型病毒是指，将野生型病毒的必需基因替换成外源基因或删除，失去感染复制能力，这种重组病毒称复制缺陷型病毒。复制缺陷型重组单纯疱疹病毒包含病毒必需基因的突变失活，这些必需基因是ICP4和ICP27。条件复制型病毒是指进行了基因改造而仅在某种特定细胞中增殖的病毒。其不作用于正常细胞而仅该种特定细胞中增殖。条件复制型重组单纯疱疹病毒包含病毒非必需基因的突变失活，这些非必需基因是ICP34.5、ICP0、ICP47、ICP6、TK等基因。病毒也可以是具有复制能力的。扩增子(amplicon)是指DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。立即早期基因对随后的来自其它病毒启动子元件的转录活化是必需的，在单纯疱疹病毒感染中，立即早期基因可确保在进入细胞后立即高效地转录病毒DNA基因组。许多病毒感染导致细胞蛋白编码基因转录抑制。但立即早期基因能够迅速表达，其表达产物后面跟着由早期和晚期基因编码的蛋白表达，包括结构蛋白以及对病毒繁殖必需的蛋白。miRNA结合位点是指5’和/或3’UTR包括可以增强特定细胞类型中的转基因表达的元件。可操作地连接是指当核酸与另一核酸序列处于功能关系时操作性地连接。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成使得便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的。转基因是指在引入细胞后能够转录成RNA并在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予其所引入的细胞所需的特性，或以其他方式产生所需的治疗或诊断结果。转基因与一种或多种真核启动子可操作地连接是指真核启动子与编码胶原蛋白α-1(VII)链多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码核心蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码纤调蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP1的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP2的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP3的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码金属蛋白酶抑制剂TIMP4的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码光蛋白聚糖(lumican)的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码mimecan蛋白聚糖的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，和/或真核启动子与编码上述多肽的嵌合多肽的核酸序列以及下游调控元件可操作地连接，确保mRNA的正确产生。这些转基因可以在同一条DNA链上编码，或以反义取向在相反的DNA链上编码。将每种转基因与其自身的启动子和调控元件连接允许每个编码序列在单独的mRNA转录物上独立表达。从不同启动子表达转基因使得能够将编码序列可操作地连接至不同启动子类型，这可以驱动转基因在不同水平、在细胞周期中的不同时间、在不同细胞类型中或在不同诱导物或抑制物控制下的表达。所述胶原蛋白α-1(VII)链多肽与SEQ ID NO：1的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述核心蛋白聚糖多肽核心蛋白聚糖与SEQ ID NO：2的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述纤调蛋白聚糖多肽与SEQ ID NO：3的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。所述金属蛋白酶抑制剂TIMP3多肽与SEQ ID NO：4的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。多顺反子性的转基因是指一个mRNA分子编码多个多肽链的转基因。内部核糖体进入位点是指一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入，允许在同一启动子的控制下共同表达多个基因。合适的IRES的实例可包括但不限于病毒来源的IRES(例如，来源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒、劳氏肉瘤病毒、人体免疫缺陷病毒、蟋蟀麻痹病毒、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒等的IRES)和细胞mRNA来源的IRES(例如，来源于生长因子mRNA，诸如成纤维细胞生长因子2、血小板来源生长因子B和血管内皮生长因子的IRES；来源于转录因子mRNA，诸如触角因子、u1trapithoraxm和NF-κB抑制因子的IRES；来源于致癌基因mRNA，诸如c-myc、pim-1和蛋白激酶p 58PITSLRE的IRES等)。所述接头多肽与SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列具有例如80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的序列同一性。开放阅读框或ORF是指编码蛋白质或多肽的连续核酸序列，DNA或RNA。通常，核酸包含翻译启始信号或起始密码子(诸如ATG或AUG)和终止密码子。
在本申请以上实施方案中，所述α-1(VII)链多肽可以是天然形式的α-1(VII)链多肽，也可以是通过基因工程合成的α-1(VII)链多肽，可以是全长多肽，也可以是包含其功能结构域的片段或融合蛋白。天然形式的α-1(VII)链多肽包含与其功能直接相关的功能结构域，三螺旋结构域(Triple-helical domain)(参见例如：Christiano AM，Hoffman GG，Chung-Honet LC，Lee S，Cheng W，Uitto J，Greenspan DS.Structural organization ofthe human type VII collagen gene(COL7A1)，composed of more exons than anypreviously characterized gene.Genomics.1994May 1；21(1)：169-79)，位于本申请SEQID NO.1的第1254-2784位氨基酸的位置。
在本申请以上实施方案中，所述DCN可以是天然形式的，也可以是通过基因工程合成的，可以是全长多肽，也可以是包含其功能结构域的片段或融合蛋白。天然形式的DCN包含与其功能直接相关的功能结构域，1-12个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat)(Krusius T，Ruoslahti E.Primary structure of an extracellular matrixproteoglycan core protein deduced from cloned cDNA.Proc Natl Acad Sci U SA.1986Oct；83(20)：7683-7)，位于本申请SEQ ID NO.2的第73-359位氨基酸的位置。
在本申请以上实施方案中，所述FMOD可以是天然形式的，也可以是通过基因工程合成的，可以是全长多肽，也可以是包含其功能结构域的片段或融合蛋白。天然形式的FMOD包含与其功能直接相关的功能结构域，即富含亮氨酸重复序列N-末端结构域(Leucine-rich repeat N-terminal domain)和1-11个富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat)(Antonsson P，D，Oldberg A.Structure and deduced amino acid sequenceof the human fibromodulin gene.Biochim Biophys Acta.1993Aug 19；1174(2)：204-6)，其中，富含亮氨酸重复序列N-末端结构域位于本申请SEQ ID NO.3的第67-105位氨基酸处，1-11个富含亮氨酸重复序列位于本申请SEQ ID NO.3的第106-365位氨基酸处。
在本申请以上实施方案中，所述TIMP3可以是天然形式的，也可以是通过基因工程合成的，可以是全长多肽，也可以是包含其功能结构域的片段或融合蛋白。天然形式的TIMP3包含与其功能直接相关的功能结构域，即：N末端区(N-terminal region，NTRdomain)和与含EGF纤维蛋白细胞外基质蛋白1(EGF Containing Fibulin ExtracellularMatrix Protein 1)相互作用区(Uría JA，Ferrando AA，Velasco G，Freije JM，López-Otín C.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member ofthe metalloproteinase inhibitor family.Cancer Res.1994Apr 15；54(8)：2091-4)，其中N末端区位于本申请SEQ ID NO.4的第24-143位氨基酸位置处，与含EGF纤维蛋白细胞外基质蛋白1相互作用区位于本申请SEQ ID NO.4的第105-188位氨基酸位置处。
本说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且落入所附权利要求的范围内。
制备例1
本制备例用于制备编码COL7A1、COL7A1/DCN、COL7A1/FMOD和COL7A1/TIMP3的复制缺陷型HSV-1载体。按照申请公布号CN113046331A的专利申请中记载的方法敲除了HSV-1病毒HL-1株(CCTCC保藏编号：V201810)的ICP34.5、ICP4和ICP27基因，获得HL1-mock。在HL1-mock的基础上，在ICP34.5基因删除位置插入COL7A1基因(NM_000094.4)，得到含有编码COL7A1基因的重组HSV-1载体HL1-COL7A1。进一步地，在HL1-COL7A1的ICP27基因删除位置分别插入核心蛋白聚糖DCN基因(NM_133503.4)、纤调蛋白聚糖FMOD基因(NM_002023.5)和金属蛋白酶抑制剂TIMP3基因(NM_003254.3)，获得编码COL7A1和DCN基因的重组HSV-1载体HL1-COL7A1/DCN、编码COL7A1和FMOD基因的重组HSV-1载体HL1-COL7A1/FMOD以及编码COL7A1和TIMP3基因的重组HSV-1载体HL1-COL7A1/TIMP3。ICP4和ICP27是HSV-1的必需基因，删除后HSV-1成为复制缺陷型病毒，无法在正常细胞中复制。同时删除ICP4、ICP27和非必需基因ICP34.5可以提高病毒载体的使用安全性。插入的治疗基因可以在ICP34.5、ICP27和ICP4的任何一处或者HSV-1基因组的其他位置。
实施例1
实施例1-1
将人永生化角质形成细胞HaCat(C6282，Beyotime)接种到六孔板中，在37℃、5％CO2条件下增殖培养。细胞培养2天后按MOI＝1加入不同的重组病毒载体。另外设置编码COL7A1基因的表达质粒瞬时转染对照孔，以及不加入病毒的细胞培养阴性对照孔。转染的HaCat细胞继续在37℃、5％CO2条件下培养3天后，取培养上清进行C7蛋白表达的蛋白免疫印迹检测。结果显示重组病毒转染上清中可以检测到与C7大小对应的条带，质粒瞬时转染上清中检测到的条带微弱，但是大小与预期一致，阴性对照孔未检测到条带，实验成立。实验结果表明构建的重组HSV-1载体可以在人角质形成细胞HaCat中成功表达C7蛋白。
实施例1-2
将人永生化角质形成细胞HaCat(C6282，Beyotime)接种到六孔板中，在37℃、5％CO2条件下增殖培养。细胞培养2天后按MOI＝1加入不同的重组病毒载体。继续培养3天后采用ELISA方法测定细胞培养上清中C7蛋白、核心蛋白聚糖DCN、纤调蛋白聚糖FMOD和金属蛋白酶抑制剂TIMP3的浓度。实验结果表明构建的重组HSV-1载体可以在人角质形成细胞HaCat中成功表达携带的目的基因，表达量达60ng/mL以上。
表1.不同重组HSV-1载体携带的目的基因表达量情况
实施例1-3
获得CRISPR-Cas9靶向小鼠COL7A1基因敲除的COL7A1-/-纯合小鼠(来源于集萃药康)。COL7A1-/-小鼠显示典型的DEB临床表型，在小鼠的脚趾，颈部和腹部可见水/血泡。从25只COL7A1-/-小鼠中选择24个伤口分成6组，每个病毒样品和安慰剂分别涂抹或者皮下注射4个伤口。病毒的用量为10E8 PFU，每2天给药一次，共给5次。开始给药后每2天测量伤口愈合情况，根据伤口的大小计算重组载体处理后的伤口愈合情况。结果显示，安慰剂对照给药组和HL1-mock给药组的伤口愈合速度极慢，HL1-COL7A1治疗组伤口愈合度较快，试验结束时伤口约60％的面积愈合。HL1-COL7A1/TIMP3、HL1-COL7A1/DCN、HL1-COL7A1/FMOD治疗组相比HL1-COL7A1治疗组的伤口愈合度更快，其中HL1-COL7A1/DCN愈合速度最快，试验结束时伤口面积超80％以上愈合。
| 伤口愈合面积(涂抹2只小鼠) | 伤口愈合面积(注射2只小鼠) | |
| HL1-COL7A1 | 60％ | 62％ |
| HL1-COL7A1/DCN | 80％ | 83％ |
| HL1-COL7A1/FMOD | 75％ | 79％ |
| HL1-COL7A1/TIMP3 | 82％ | 80％ |
| HL1-mock | 极慢 | 极慢 |
| 安慰剂组 | 极慢 | 极慢 |
制备例2
本制备例用于制备编码COL7A1和COL7A1/DCN的非复制型HSV-1载体。按照申请公布号CN113046331A的专利申请中记载的方法敲除了HSV-1病毒HL-1株的ICP34.5、ICP4基因，获得HL1-mock2。在HL1-m0ck2的基础上，在ICP4基因删除位置插入COL7A1基因(NM_000094.4)，得到含有编码COL7A1基因的重组HSV-1载体HL1-COL7A1/R。在HL1-Col7A1/R的ICP34.5基因处插入DCN基因(NM_133503.4)，得到含有编码COL7A1/DCN基因的HL1-COL7A1/DCN/R。
实施例2
实施例2-1
在DEB小鼠模型上开展药效实验，共设置4个实验组，分别为PBS、HL1-mock2、HL1-COL7A1/R、HL1-COL7A1/DCN/R、HL1-COL7A1/TIMP3和HL1-COL7A1/FMOD治疗组，每组3只小鼠。病毒滴度为10E8 PFU/mL，每2天给药一次，根据伤口大小给药，观察伤口愈合情况。结果显示，HL1-Col7A1/R、HL1-COL7A1/DCN/R、HL1-COL7A1/TIMP3和HL1-COL7A1/FMOD治疗后伤口均在3天左右愈合，而PBS和HL1-mock2对照组伤口愈合不明显，典型的小鼠愈合图片见图2。对各组小鼠注射部位皮肤进行组织切片检查，结果显示相比PBS和HL1-mock2对照组，HL1-COL7A1/R、HL1-COL7A1/DCN/R、HL1-COL7A1/TIMP3和HL1-COL7A1/FMOD治疗后皮肤表皮和真皮间的间隙均有缩小趋势(图3)。
Claims (10)
1.一种药物组合物，其包含：
a)含有基因改造的病毒，其中所述病毒包含编码选自下组的一种或多种多肽的转基因：胶原α-1(VII)链多肽、蛋白聚糖多肽、金属蛋白酶抑制剂多肽和它们的嵌合多肽；以及
b)药学上可接受的载剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述胶原α-1(VII)链多肽为VII型胶原蛋白基因COL7A1编码。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述蛋白聚糖多肽选自下组：核心蛋白聚糖(DCN)和纤调蛋白聚糖(FMOD)。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述金属蛋白酶抑制剂为TIMP3。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述病毒是腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒或它们的任何杂合病毒。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述病毒是单纯疱疹病毒，优选所述单纯疱疹病毒是保藏编号为CCTCC NO.V201810的病毒株HL-1。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述病毒是复制缺陷型或条件复制型的。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述单纯疱疹病毒是1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒或它们的任何衍生物。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述病毒是HSV-1扩增子。
10.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述病毒的基因组是重组单纯疱疹病毒基因组。
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