KR101966330B1 - Sod3를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SOD3 (superoxide dismutase 3) 를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연형 또는 재조합의 SOD3 단백질을 유효성분으로 포함하는 건성안의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 눈물 분비를 증가시키고 안표면 손상 정도를 호전시키는 효과와 결막의 술잔세포를 현저히 증가시키는 효과를 통하여 건성안을 유효하게 예방/치료할 수 있으므로 새로운 형태의 질환 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

SOD3를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating dry eye syndrome comprising SOD3}

본 발명은 SOD3 (superoxide dismutase 3) 를 함유하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연형 또는 재조합의 SOD3 단백질을 유효 성분으로 포함하는 건성안의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

활성산소를 제거할 뿐만 아니라 다른 항산화 효소가 작용할 수 있도록 하여 세포를 보호하는 기능을 가지는 SOD (superoxide dismutase)는 구리와 아연 원자를 가지고 있는 Cu/Zn SOD (SOD1), 망간 원자를 가지고 있는 Mn SOD (SOD2) 및 세포 표면 또는 세포 외액에 존재하는 EC SOD (extracellular superoxide dismutase, SOD3)로 구분된다. 특히, SOD3는 Cu/Zn SOD와 같이 구리 및 아연 원자를 가지고 있으나, C-말단 쪽에 헤파린 결합 도메인 (heparin binding domain)이 존재한다는 특징이 있다. SOD3는 헤파린 결합 도메인을 가지고 있기 때문에 세포막의 헤파린에 결합되어 세포막을 보호하는 역할을 할 것으로 추정되고 있다. 문헌에 따르면, SOD3는 혈장과 세포 외 기질 등에서 생체 방어 작용을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다 (Marklund et al, Biochem. J. 266, 213-219, 1990; Su et al., Am J Respir Cell Mol Biol., Feb 16(2), 162-70, 1997; Luoma et al., Thromb. Vasc. Bio. 18, 157-167,1998). SOD 3의 헤파린 결합 도메인이 핵 위치 신호 (nuclear localization signal)로 작용하여 흉선 (thymus)과 고환 세포 (testis cell)에서 핵 안에 위치하여 산화적 스트레스로부터 게놈 DNA를 보호하고 산화 환원 반응에 민감한 전사 작용을 조절한다고 보고된 바 있다 (Ookawara T et al., BBRC, 296, 54-61, 2002).

본 발명자들은 대한민국 특허 제10-0676502호에서 SOD3가 피부세포 내 활성산소종을 제거하며 표피세포의 과증식을 억제하여 건선 등의 피부질환을 치료하는 효과가 있음을 개시한 바 있다. 그러나 현재까지 안구에서의 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 3 (SOD3)의 발현정도와 역할에 대해서 알려진바 없다.

안과 질환 중 건성안 (안구건조증)은 우리나라 성인의 20%에서 발생되는 흔한 질환으로, 단순한 눈물부족이 아닌, 눈물과 안구 표면 (각막 및 결막)의 염증에 의해 안구의 불편감, 시력저하, 눈물층의 불안정성을 유발하여 안구표면에 손상을 줄 수 있는 질환으로 알려져 있다. 이 질환은 안구통증, 불규칙한 각막 표면, 흐리고 변동폭이 커진 시력 (blurred and fluctuating vision) 및 증가된 각막 궤양의 위험성과 같은 특징을 가진다고 알려져 있으나, 발병 과정에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않은 상태이다. 건성안 중 쇼그렌 증후군과 동반된 건성안은 심한 건조 증상과 안구표면 손상을 보인다. 쇼그렌 증후군은 눈물샘과 침샘에 T와 B 세포의 침윤으로 분비세포의 손상을 야기하여 건성안과 구강건조를 유발하며 임파종을 발생시킬 수 있는 전신면역질환이다.

기존의 건성안에 대한 치료 방법은 인공눈물 점안액을 보충해주거나 눈물길을 일시적 혹은 영구적으로 막아 주는 등의 보존적인 방법으로 일정량 이상의 눈물을 유지시켜주는데 초점을 두었던 것에서 최근 들어 건성안에 대한 항염증 치료가 활발히 시도되었고, 심한 건성안 환자의 증상 호전에 그 효과가 보고되고 있다. 안구표면의 염증 억제가 건성안 치료의 관심사가 되었고, 그러한 약물 중 하나가 사이클로스포린 A 0.05% 점안액 (레스타시스)과 스테로이드 제제이다. 그러나 사이클로스포린 A 0.05% 점안액의 가장 흔한 이상 반응은 눈의 작열감이고, 1-5%의 환자에게서는 결막충혈, 분비물, 유루증, 눈의 동통, 이물감, 소양감, 자통, 시력 장애, 시야혼탁 등이 보고되고 있다. 또한 사이클로스포린 A 0.05%는 농도가 낮아서 안 표면의 염증 호전 및 증상 개선에 최소 3-6개월의 시간이 소요되고 개선 효과도 스테로이드에 비해서 적다. 스테로이드 제제는 사이클로스포린 A 0.05%에 비해 빠른 작용 시간을 보이며 염증 호전 및 증상 개선 효과가 탁월하나 장기 사용시 안압상승 및 백내장 발생의 심각한 합병증이 발생할 수 있다. 따라서, 부작용이 적은 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 SOD3의 건성안에 대한 치료 유용성 탐색을 위한 연구를 하던 중에, SOD3의 투여가 결막에서 술잔세포 수를 증가시키고, 눈물 분비를 증가시키는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 SOD3 단백질을 유효성분으로 하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SOD3 단백질을 유효성분으로 하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 약학적 조성물은 SOD3 단백질을 유효성분으로 포함하는 건성안의 예방 또는 치료용 조성물이다.

본 발명의 SOD3 (슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 3, superoxide dismutase 3) 단백질은 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 단백질의 세 가지 종류 중 세포외로 분비되는 단백질을 일컬으며, 세포외 분비 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (extracellular superoxide dismutase, EC-SOD)로도 쓰인다.

본 발명의 SOD3 단백질은 천연형 또는 재조합 SOD3 단백질일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 SOD3 단백질은 인간 SOD3 단백질로, 인간 SOD3 단백질은 N-말단영역의 개시 메치오닌 아미노산을 포함하여 18번째의 알라닌까지는 시그날 펩타이드로 활성형 SOD3는 상기 시그날 펩타이드가 제거된 222개의 아미노산으로 구성되어 있으며, C-말단 영역(아미노산 잔기 210번~215번)에 헤파린 결합 도메인(heparin binding domain)을 가지고 있다. 인간 SOD3의 아미노산 서열은 서열번호 1 에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기에서 SOD3 는 시그날 펩타이드 (메치오닌~아미노산잔기 18번)와 C-말단 영역(아미노산 잔기 228 ~ 240번)이 제거된 것일 수 있다. 상기 시그날 펩타이드와 C-말단 영역이 제거된 SOD3(209E-SOD3)의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다. 인간 SOD3 서열의 다형성 (polymorphism)에 의한 아미노산 58번 잔기가 Thr 또한 보고되어 있어 58번 아미노산이 Thr 인 인간 SOD3의 서열(EC SOD:58 T)을 서열번호 3에 나타내었고, 58번 아미노산이 Thr 이면서 시그날 펩타이드와 C-말단 영역이 제거된 SOD3(209E-SOD3:58 T)의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타낸 바와 같다. 서열번호 1, 2, 3 및 4로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, Genbank Accession No. CAG46651.1, NP_003093.2, AAA62278.1, EAW92823.1, AAH14418.1, AAA66000.1, AAV40827.1 일 수 있다. 또한 본 발명의 SOD3 단백질은 인간 이외의 SOD3 단백질로 NCBI Genbank 싸이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 SOD3, EC-SOD 또는 EC SOD로 검색된 SOD3 단백질일 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질 (protein)은 화학적으로 합성된 단백질뿐 아니라 배양된 세포의 유전자에 의해 암호화되는 천연 합성된 단백질 및 세포에 의해 분비되는 재조합 단백질을 포함한다. 재조합 단백질은 분자 생물학 기법에 의해 세포 내로 도입된 전이유전자 (transgene)에 의해 암호화되는 단백질이다. 단백질은 번역 후 가공에서 화학적 방법에 의해 또는 효소에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에서의 SOD3 단백질은 바람직하게는 재조합 단백질이다.

본 발명의 재조합 단백질이란 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고단백질 및/또는 융합 단백질을 비롯하여, 아미노산을 코딩하는 재조합 유전 물질로부터 발현되는 임의의 단백질 또는 그 생물학적 활성 부분 (예를 들어, 전체 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 부분)을 의미한다. 재조합 단백질 생성물은 치료용, 예방용 또는 진단용 생성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 단백질은 SOD3 유전자가 포함된 플라스미드로 형질전환 된 세포에서 수득될 수 있다. 상기 플라스미드란 그가 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 나타내도록 의도된다. 즉, 플라스미드란 그 내부에 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 의미한다.

본 발명에서 상기 형질전환이란 유전 정보를 유기체, 특히 진균내로 전달함을 의미한다. 이는 상기 유전 정보, 특히 DNA를 도입시키는데 있어서 당업자에게 공지된 임의의 가능한 방법들, 예를 들어 DNA-충전된 입자들로의 포격, 원형질체를 이용한 형질전환, DNA의 미세주입, 전기천공, 컴피턴트 (competent) 세포의 접합 또는 형질전환, 화학물질 또는 아그로박테리아-매개된 형질전환을 포함한다. 유전 정보란 유전자 구역, 하나의 유전자 또는 다수의 유전자들을 의미한다. 유전 정보는, 예를 들어 벡터나 유리 핵산 (예를 들어, DNA, RNA)의 보조 하에 그리고 임의의 다른 방식에 의해 세포내로 도입될 수 있으며, 재조합에 의해 숙주 게놈내로 혼입되거나 세포에서 유리 형태로 존재할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물에 포함되는 SOD3 단백질은 천연형 또는 재조합 SOD3 단백질과 더불어, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형 또는 재조합 SOD3 단백질의 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivative)가 포함된다.

본 발명에서 기능적 동등물이란 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 SOD3와 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.

상기에서 동등한 생리활성이란 염증성 안과 질환을 억제하는 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (homology)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 SOD3의 SNP로 알려진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 기능적 동등물 이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 1 또는 서열번호 3의 펩타이드와 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 서열 상동성 (즉, 동일성)을 갖는 것으로 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭 (gaps)을 도입한 후 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭 (matching) 되도록 정렬한다 (하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라).

상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티 (default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티 (default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연개되어 사용될 수 있는 PAM250 (표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열 (indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬 (machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭 (gaps)의 수의 합으로 나눈다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 실시예에 따르면, C57BL/6 생쥐 건성안 동물모델에 SOD3 단백질을 처리하였을 때 눈물분비가 정상 대조군과 유사한 수준으로 증가되었고 (실시예 1-1) 결막 술잔 세포 (conjunctival goblet cell) 수를 증가시켰다 (실시예 1-2). 눈물은 점액층, 수성층 및 지방층의 3가지 성분으로 구성되는데, 이중 한 가지 성분이라도 부족하게 되면 눈물막이 불안정하여 건성안이 발생할 수 있다. 이 가운데 점액층은 결막의 술잔세포에서 분비되는 점액과 수성층이 혼합되어 있으며 눈물막의 95%를 차지한다. 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, C57BL/6 생쥐 건성안 동물모델에 SOD3 단백질을 처리하였을 때 형광염색으로 표현되는 안표면 손상 정도가 호전되었으며 (실시예 1-3) 안 표면의 염증성 싸이토카인의 발현을 억제하였다 (실시예 1-4). 하기 실시예 1-2에서 입증된 바와 같이, 건성안 동물모델에서 본 발명의 SOD3 단백질을 투여한 경우, 결막 술잔세포의 밀도와 수가 증가하였고 이는 결과적으로 눈물층의 생성을 촉진시킨다. 하기 실시예 1-4에서 입증된 바와 같이, 건성안 동물모델에서 본 발명의 SOD3 단백질을 투여한 경우 안표면 염증을 감소시키고 결과적으로 안표면 손상을 회복시킨다.

따라서, 본 발명의 SOD3는 건성안의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서 건성안은 쇼그렌 증후군을 포함하는 건성안일 수 있다. 한편, 쇼그렌 증후군은 눈물샘에 T와 B 세포의 침윤에 의해 유발될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 SOD3 단백질과 더불어 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액 형태와 같은 주사용 제형, 연고제 형태, 점안액 형태의 제형을 가질 수 있으며, 점안액 형태의 제형이 바람직하다.

제형은 점안제, 눈 연고 등과 같이 안과 분야에서 사용되는 눈에 국소 투여하기 위한 제형 모두를 포함한다. 점안제는 활성 성분을 멸균 수용액 예를 들면, 식염수, 완충액 등에 용해시키거나, 사용하기 전 용해되도록 분말 조성물을 배합하여 제조한다. 눈 연고는 활성 성분을 베이스 (base)로 제조한다. 그러한 제제는 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 점안제 경우 일반적으로 사용되는 첨가제, 예를 들어 등장화제 (예를 들어, 염화 나트륨), 버퍼제 (예를들어, 붕산, 디소듐 하이드로겐포스페이트, 소듐 디하이드로겐포스페이트 등), 방부제 (예를들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈제토늄 클로라이드, 클로로부탄올 등), 점착부여제 (예를 들어, 당 (락토즈, 만니톨, 말토즈 등), 히알우론산 또는 그의 염 (소듐 히알우로네이트, 포타슘 히알우로네이트 등), 뮤코폴리사카라이드 (예를 들어 콘드로이틴 설페이트 등), 소듐 폴리아크릴레이트, 카복시 비닐 중합체, 가교결합된 폴리아크릴레이트 등)이 첨가될 수 있다. 눈 연고용으로 통상 사용되는 베이스내로 활성 성분을 혼합하고 통상의 방법에 따라 제형화하여 멸균적으로 눈 연고를 제조할 수 있다. 눈 연고용 베이스의 예는 바셀린, 셀렌 50, Plastibase, 마크로골 등을 포함하지만 그로 제한하지 않는다. 추가로, 친수성을 증가시키기 위하여 계면활성제를 첨가할 수 있다.

또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예 : 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제 (예 : 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 투여에 대한 제제의 형태에 의존하여 다양한 형태로 취할 수 있다. 국부 투여는 모든 안구의 경로, 즉, 국소 (topical) 및 주사가능한 투여, 및 이식시스템 (plantable systems)의 수단에 의한 투여로 이해될 수 있다. 국소 투여는 예를 든 형태일 수 있고, 점안제 (eye drops), 세안제 (collyrium) 또는 눈의 점적물 (ocular instillation), 스프레이 (sprays), 크림 (creams), 연고 (ointments), 젤 (gels), 하이드로젤 (hydrogels), 올레오젤 (oleogels), 친수성 렌즈 (hydrophilic lens), 삽입물 (inserts), 및 이식 (implants)의 비-제한적인 형태일 수 있다. 투약 형태는, 예를 들어, 용액, 현탁액, 콜로이드성 시스템 (colloidal systems) (예를 들어, 리포좀, 에멀전, 마이크로에멀전, 나노에멀전, 마이크로입자, 나노입자, 미소구체 (microspheres), 니오좀 (niosomes), 덴드리머 (dendrimers)), 미셀 (micelles), 혼합된 미셀 (mixed micelles), 복합 시스템, 예를 들어, 사이클로덱스트린 용액 (cyclodextrin solutions)뿐만 아니라, 예를 든 형태에서 비-이식성 삽입일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그리고 디스크 (discs), 필름 (films) 또는 스트립 (strips)의 비-제한적인 형태일 수 있다.

주사가능한 투여는 결막 밑 (subconjunctival), 서브 테논 (sub tenon's), 눈 뒤 (retrobulbar) 및 공막 내 (intrascleral) 투여를 포함하는 안구내 (intraocular) (유리체 내, IVT), 안구 주위 (periocular)에 비-제한적인 방법일 수 있다. 공막 내 투여는 주사가능한 또는 이식가능한 시스템으로 수행될 수 있다. 투여량 형태는 예를 든 형태에서 생분해 가능한 또는 비-생분해 가능한 이식뿐 아니라, 용액, 현탁액, 콜로이드성 시스템 (colloidal systems) (예를 들어, 리포좀, 에멀전, 마이크로에멀전, 나노에멀전, 마이크로입자, 나노입자, 미소구체 (microspheres), 니오좀 (niosomes), 덴드리머 (dendrimers)), 미셀 (micelles), 혼합된 미셀 (mixed micelles)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그리고 로드(rods), 네일 (nails), 펠렛 (pellet)의 비-제한적인 방법일 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.0000001 내지 100㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 0.01 내지 1mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다

따라서, 본 발명은 SOD3 단백질을 유효성분으로 건성안의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 건성안 동물 모델에서 눈물 분비를 증가시키고 안표면 손상 정도를 호전시키는 효과와 결막의 술잔세포를 현저히 증가시키는 효과를 통하여 건성안을 유효하게 예방 또는 치료할 수 있으므로 새로운 형태의 질환치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 건성안 생쥐 모델에서 SOD3 처리 후 눈물생성의 증가를 나타낸 것이다.
도 2은 건성안 생쥐 모델에서 SOD3 처리 후 결막의 PAS 염색에서 결막의 술잔세포 수 증가를 나타낸 것이다.
도 3은 건성안 생쥐 모델에서 SOD3 처리 후 각막을 형광 염색하여 세극등 현미경으로 촬영하여 나타낸 것이다.
도 4는 건성안 생쥐 모델에서 각결막의 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 양을 측정하여 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

1. 실험동물

C57BL/6과 SOD3 형질변환 생쥐모델을 사용했으며, 8주에서 10주된 BALB/c 암컷 생쥐를 Charles River Laboratories (Orient Co., 성남, 한국)에 구입하여 사용하였다. 모든 생쥐들은 카톨릭대학교 (서울, 한국)의 동물사육실의 무병원균 시설에서 멸균사료와 ad libitum 물로 사육되었다. 건성안 모델제작에 6주령의 C57/BL6 야생형 암컷 생쥐를 이용하였으며, zolazepam-tiletamine 마취를 생쥐에 복강 투여로 실시한 후 (한 마리당 100uL) 생쥐의 눈과 귀 사이에 위치해 있는 양쪽의 Lacrimal gland를 제거하였고, 대조군은 Sham 수술만 실시하였고, 수술 부위는 항생제 연고를 발라주었다.

2. 재조합 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 3 ( SOD3 ) 단백질

293 세포주에 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 3 (SOD3) 발현 벡터를 48시간동안 형질주입 후, 상층액을 수거하여 Ni-NTA agarose (Qiagen, Hilden, 독일) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 3 (SOD3)의 활성은 SOD 분석키트 (Dojindo, Rockville, MD) 를 이용하여 측정하였고, 동물 모델에 투여하기 전에는 내재하는 독소를 제거하였다.

3. 건성안 동물모델에서 SOD3 처리 조건

건성안이 lacrimal gland 제거 후 2주에 완성되는 것으로 확인하고, 실험 시작 제14일 째부터 SOD3를 결막낭에 처리하기 시작하였다. 대조군 그룹에는 Sham surgery과 PBS (5uL/per eye), 건성안 그룹에는 lacrimal gland 제거와 PBS (5uL/per eye), 건성안과 SOD3 처리 그룹에는 lacrimal gland 제거와 SOD3 1000U (5uL, PBS에 희석/per eye)를 처리하였다. PBS 또는 SOD3 처리는 하루에 한 번 24시간 주기로 처리했으며, 눈물량 측정과 겹칠 때에는 눈물량을 먼저 측정하고 SOD3 처리를 안구 결막낭에 점적하였다.

4. 임파상 세포 배양과 사이토카인 분석

경부임파절을 적출하여 RPMI 1640 배지에서 단세포 현탁 배양하였다. RPMI 1640 배지에 2 mM L-glutamine, 50 mM 2- mercaptoethanol, 10% heat-inactivated fetal calf serum (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 영양분들을 첨가하였다. 1mg/ml의 OVA가 첨가된 96-well 세포용기에 1 x 10⁶ cells/ml의 세포 밀도로 분주된 후에 상층액을 회수하여 ELISA 키트를 이용해 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13, IL-10) 정도를 측정하였다.

5. Phenol red Thread Test

건성안 동물모델에서 시작 전에 생쥐의 안구를 5번 깜박여주고, 5초 후, 측면 안구에 Phenol red thread (ZoneQuick)을 180초 꽂아 노란색 Phenol red가 붉게 변한 길이를 mm단위로 측정하였다. 편차를 줄이기 위해 한 눈당 2번의 눈물 측정을 시행하였고, 한 안구에 관한 눈물량은 평균을 내었다. 길이 측정은 iSTATION으로 사진을 찍어 실시하였고, 측정은 실험 시작 날로 부터 제 0, 4, 7, 10, 14, 18, 21일 째에 수행하였다.

6. 형광염색과 PAS (Periodic Acid Schiff ) 염색

각막 형광 염색은 건성안 2주 후, PBS 또는 SOD3 4일 처리하여 실험 시작 18일차에 촬영하였다. Fluorescein 막대 끝을 PBS로 적신 후, 파이펫 팁으로 5uL를 각막에 떨어뜨리고 1분 뒤에 cobalt blue light로 각막 표면을 촬영하였다. 마우스 안구를 총 4구역으로 십자 등분하여 각 구역에 따라 염색 된 정도를 0~3점으로 매겨 최소 0~최대 12점이 되도록 임상 지표 측정을 하였다. PAS 염색은 마우스 안구 전체를 4% paraformaldehyde에 over night 4℃고정 후 파라핀 블록으로 제작 후, 상부와 하부의 결막이 모두 포함되도록 4um의 두께로 슬라이드 섹션을 만들었다. 과요오드산 용액으로 상온에서 5분간 산화시키고, 이어 상온에서 15분간 Schiff 시약 처리, Hematoxylin으로 상온에서 2분간 처리하는 순으로 염색하였고, goblet cell은 생쥐 결막을 따라 염색된 것을 세었으며 100um단위로 측정하였다.

7. Real time PCR

RNA는 생쥐의 전체 안구에서 뽑았으며, TRIzol (Ambion) 시약을 이용하였으며, cDNA 합성에는 Promega AMV reverse Transcriptase, Random hexamer를, real time PCR은 SYBRgreen PCR master mixture (TAKARA)의 매뉴얼을 따라 수행하였으며 GAPDH로 양적 보정을 실시하였다.

8. 통계분석

각 집단 간의 통계적 유의성은 SPSS (version 17.0) 이용한 일원분산분석(one-way ANOVA)을 통해 조사되었다. p 값이 p < 0.05 일 때 유의, p < 0.01 일 때 매우 유의, p <0.001 일 때 극도의 매우 유의로 평가하였다. 각 실험값은 한집단 내 6마리의 생쥐들에 대한 독립적인 세 번의 각각의 실험들을 대표하는 값이다.

< 실시예 1>

마우스 건성안 모델에서 SOD3의 완화 효과

1-1. phenol red thread test

한 마리당 100uL의 zolazepam-tiletamine 마취액을 생쥐에 복강 투여로 실시한 후, 생쥐의 눈과 귀 사이에 위치해 있는 Lacrimal gland를 제거하였다. 이어 시작 날로 부터 0, 4, 7, 10, 14, 18, 21일 째에 노란색 Phenol red가 붉게 변한 길이를 mm단위로 측정하였고, 마우스의 눈물량 측정할 때 편차를 줄이기 위해 한 눈당 2번의 눈물 측정을 시행하였고, 한 안구에 관한 눈물량은 평균값을 사용하였다. 측정 결과, 건성안이 lacrimal gland 제거 후 2주에 완성되는 것으로 확인하였다. C57BL/6 생쥐 건성안 동물모델에 SOD3 단백질 처리했을 때 눈물 분비가 정상 대조군과 유사한 수준으로 증가되었음을 확인하였다.

1-2. PAS staining

건성안이 lacrimal gland 제거 후 2주에 완성되는 것으로 확인하고, 실험 시작 제14일째부터 상기 실험 방법에서 언급한대로 SOD3를 처리하기 시작하였다. PAS 염색을 실시한 후, 생쥐 결막을 따라 염색된 술잔세포수를 세었으며, SOD3를 처리한 경우 술잔세포의 수가 거의 정상군 수준으로 회복되는 것으로 나타났다.

1-3. Fluorescein staining

각막 fluorescein staining은 실험 시작 18일차에 Fluorescein 염색 후에 cobalt blue light로 각막 표면을 촬영하였다. 세극등 현미경으로 촬영한 결과 건성안에서는 각막상피결손이 관찰되었으나 SOD3 안약 처리 후 각막상피 결손이 회복되는 것으로 나타났다.

1-4. Inflammatory cytokine

RT PCR & real time PCR 을 통하여 각결막에서 IL-1 b, IL-6, MMP-9 과 TNF-a 의 발현 수준을 확인한 결과, SOD3를 처리한 집단에서 사이토카인의 발현 수준이 정상군에서의 발현 수준과 비슷하며, 건성안일 때 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 눈물 분비를 증가시키고 안표면 손상 정도를 호전시키는 효과와 결막의 술잔 세포를 현저히 증가시키는 효과를 통하여 건성안을 유효하게 예방/치료할 수 있으므로 새로운 형태의 질환치료제로 유용하게 이용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating dry eye syndrome <130> NP16-0118 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human SOD3 <400> 1 Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala 20 25 30 Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu 35 40 45 Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Ala Leu His Ala Ala Cys Gln 50 55 60 Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly 65 70 75 80 Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe 85 90 95 Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala 100 105 110 Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr 115 120 125 Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly 130 135 140 Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg 145 150 155 160 Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg 165 170 175 Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn 180 185 190 Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys 195 200 205 Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu 210 215 220 His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala 225 230 235 240 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 209E-SOD3(EC-SOD) <400> 2 Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp 1 5 10 15 Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met 20 25 30 Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Ala Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln 35 40 45 Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val 50 55 60 Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala 65 70 75 80 Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His 85 90 95 Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro 100 105 110 His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe 115 120 125 Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly 130 135 140 Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val 145 150 155 160 Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala 165 170 175 Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val 180 185 190 Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser 195 200 205 Glu <210> 3 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human SOD3:58T <400> 3 Met Leu Ala Leu Leu Cys Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Asp Ala Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala 20 25 30 Glu Trp Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu 35 40 45 Val Met Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln 50 55 60 Val Gln Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly 65 70 75 80 Val Val Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe 85 90 95 Phe Ala Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala 100 105 110 Ile His Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr 115 120 125 Gly Pro His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly 130 135 140 Asp Phe Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg 145 150 155 160 Ala Gly Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg 165 170 175 Ala Val Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn 180 185 190 Gln Ala Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys 195 200 205 Val Val Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu 210 215 220 His Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Glu Cys Lys Ala Ala 225 230 235 240 <210> 4 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 209E-SOD3 :58T <400> 4 Trp Thr Gly Glu Asp Ser Ala Glu Pro Asn Ser Asp Ser Ala Glu Trp 1 5 10 15 Ile Arg Asp Met Tyr Ala Lys Val Thr Glu Ile Trp Gln Glu Val Met 20 25 30 Gln Arg Arg Asp Asp Asp Gly Thr Leu His Ala Ala Cys Gln Val Gln 35 40 45 Pro Ser Ala Thr Leu Asp Ala Ala Gln Pro Arg Val Thr Gly Val Val 50 55 60 Leu Phe Arg Gln Leu Ala Pro Arg Ala Lys Leu Asp Ala Phe Phe Ala 65 70 75 80 Leu Glu Gly Phe Pro Thr Glu Pro Asn Ser Ser Ser Arg Ala Ile His 85 90 95 Val His Gln Phe Gly Asp Leu Ser Gln Gly Cys Glu Ser Thr Gly Pro 100 105 110 His Tyr Asn Pro Leu Ala Val Pro His Pro Gln His Pro Gly Asp Phe 115 120 125 Gly Asn Phe Ala Val Arg Asp Gly Ser Leu Trp Arg Tyr Arg Ala Gly 130 135 140 Leu Ala Ala Ser Leu Ala Gly Pro His Ser Ile Val Gly Arg Ala Val 145 150 155 160 Val Val His Ala Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Gln Ala 165 170 175 Ser Val Glu Asn Gly Asn Ala Gly Arg Arg Leu Ala Cys Cys Val Val 180 185 190 Gly Val Cys Gly Pro Gly Leu Trp Glu Arg Gln Ala Arg Glu His Ser 195 200 205 Glu

Claims (4)

1. SOD3 단백질을 단독 유효성분으로 포함하는 건성안의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 SOD3 단백질은 천연형 또는 재조합 SOD3 단백질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 SOD3 단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 건성안은 쇼그렌 증후군에 의해 동반되는 안구 건조를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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