KR102646717B1 - 세포 침투성 펩타이드와 fkbp12를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아미노산을 삽입, 제거 또는 치환하여 변형시킨 10종의 PEP-1 변형 PTD(protein transduction domain)와 FKBP를 융합하여 제조한 PTD-FKBP 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은 눈물 분비량을 증가시키고 각막 손상을 효과적으로 완화시킬 수 있으므로 안구건조증 예방 또는 치료용 약물로서 효과적으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포 침투성 펩타이드 PEP-1과 FKBP12(12kDa의 FK506 결합 단백질)가 결합된 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
안구건조증(dry eye syndrome)이란 건성안 증후군 또는 눈 마름 증후군이라고 불리는 질환으로, 눈물을 분비하는데 관여하는 눈 구조물(각막, 결막, 배상 세포, 눈물샘 등)에 염증, 외상 등의 손상이 생겨 눈물층의 양이 감소하거나 그 성분에 변화가 생기는 상태를 말한다. 안구건조증의 대표적인 증상으로는 안구의 건조감, 눈시림, 눈의 피로감, 이물감 등이 있다.
안구건조증의 발병과 관련하여, 전신적인 요인으로는 연령, 성별, 호르몬 변화, 자가면역질환, 콘택트렌즈의 착용 등이 있으며, 환경적인 요인으로는 건조한 생활 환경, 연기나 먼지 자극, 미세먼지, 컴퓨터, 비디오, 독서, 스마트 기기 사용 등이 있다. 특히, 안구건조증의 발병은 연령과 밀접하게 관련되어 있으나, 콘택트렌즈의 사용, 컴퓨터 및 스마트 기기의 사용이 증가함에 따라 젊은 연령층에서도 발병이 급증하고 있다.
한편, 안구건조증에 대한 치료는 대부분 근본적인 원인 해결이 아닌 대증요법에 국한되어 있으며, 이마저도 그 치료 효율이 매우 낮은 편이다. 인공누액이 안구건조증 치료에 제일 먼저 선택되어 사용되고 있으나, 인공누액은 그 효과가 일시적이기 때문에 수시로 사용해야 하며 각막손상에 대한 보호 효과가 없는 단점이 있다. 또한, 염증반응 억제용 스테로이드 점안, 눈물 손실을 억제를 위한 눈물점 폐쇄 시술 등의 치료법이 있으나, 스테로이드 제제는 장기간 사용할 경우 녹내장 및 백내장과 같은 치명적인 부작용을 유발할 우려가 있고, 눈물점 폐쇄 시술은 눈물 흘림과 같은 부작용이 발생할 경우 원상회복이 어렵다는 단점이 있다.
최근에는 히알론산 나트륨 및 자가 혈청 유래의 점안제가 개발되어 안구건조증 환자에 사용되고 있다. 또한, 눈물 및 점액의 분비를 촉진하는 레바미피드(rebamipide) 또는 디쿠아포솔 나트륨(diquafosol sodium)과 같은 합성 화합물이 개발되어 이용되고 있다. 하지만, 이들 약물의 장기간 사용은 안구 충혈, 각막 석화화 같은 다양한 부작용을 초래하는 문제가 있다(Bernauer W et al., Br J Ophthalmol, 90:285-8, 2006). 따라서 보다 안전하고 효과적인 안구건조증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
Bernauer W et al., Br J Ophthalmol, 90:285-8, 2006
이에 본 발명자들은 안구건조증 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 세포 침투성 펩타이드인 PEP-1 또는 이의 변이체와 FK506 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이 안구건조증 치료에 안전하고 효과적인 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체와 FK506 결합 단백질이 결합된 융합 단백질을 제공한다.
상기 PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체는 하기 식 (I)로 표시될 수 있다:
(X)ETWWETWWTEW(W)nSQ-(Y)m (I)
이때, n, m은 서로 독립적으로 O 또는 1이고,
X는 K 또는 M이며,
Y는 P, K, R 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산으로 구성되는 1 내지 7개의 펩타이드이다.
상기 PEP-1 펩타이드의 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 FK506 결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 안구건조증이 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증 및 알레르기성 결막염 수반 안구건조증을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 PEP-1 펩타이드의 변이체와 FK506 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질은 눈물 분비 대사와 관련하여 소포체로부터 칼슘이 고갈되는 것을 효과적으로 억제할 수 있고, 임상적으로 눈물 분비량 증가 및 각막 손상 완화에 우수한 효과가 있다. 따라서, 상기 융합 단백질은 안구건조증의 예방 또는 치료용 약물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 FK506 결합 단백질과 PEP-1 펩타이드가 결합된 융합 단백질의 소포체내 칼슘 방출 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 FK506 결합 단백질과 PEP-1 펩타이드가 결합된 융합 단백질의 농도에 따른 소포체내 칼슘 방출 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 체중 변화를 측정한 것이다.
도 4는 임상학적으로 각막손상을 평가하기 위한 NIE(National Institute of Eye) 가이드라인을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 형광염색된 각막을 촬영한 사진으로, 각각 시험군 분리 후 0일째, 5일째, 10일째에 촬영한 것이다.
도 6은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 NIE 가이드라인에 따른 각막 염색 점수를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군에 대하여 페놀레드검사(Zone-Quick; phenol-red thread tear test)로 눈물 양을 측정한 것이다.
도 8은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군에 대하여, 시험 10일째의 각막 상피를 H&E 염색한 사진이다.
도 2는 FK506 결합 단백질과 PEP-1 펩타이드가 결합된 융합 단백질의 농도에 따른 소포체내 칼슘 방출 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 체중 변화를 측정한 것이다.
도 4는 임상학적으로 각막손상을 평가하기 위한 NIE(National Institute of Eye) 가이드라인을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 형광염색된 각막을 촬영한 사진으로, 각각 시험군 분리 후 0일째, 5일째, 10일째에 촬영한 것이다.
도 6은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군의 NIE 가이드라인에 따른 각막 염색 점수를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군에 대하여 페놀레드검사(Zone-Quick; phenol-red thread tear test)로 눈물 양을 측정한 것이다.
도 8은 실험예 2의 시험군 G1 내지 G9군에 대하여, 시험 10일째의 각막 상피를 H&E 염색한 사진이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체와 FK506 결합 단백질이 결합된 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “PEP-1”은, 일반적으로 단백질 수송 도메인(Protein-Transduction Domain, PTD)이나 막-이동 시퀀스(Membrane-Translocating Sequence, MTS)로부터 유도될 수 있는 세포 침투성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)의 일종일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “FK506 결합 단백질”은, FKBP로도 지칭되며, 펩티딜-프롤릴-아이소머라제(peptidyl-prolyl-isomerase) 활성을 가진 풍부한 세포질 수용체 단백질(cytosolic receptor protein)일 수 있다. FK506 결합 단백질는 Ca2+ 신호 전달에도 관여하는 것으로 보고되고 있다.
본 발명자들은 상기 PEP-1 펩타이드의 아미노산 서열에 변이를 시켜본 결과, 이러한 변이체를 포함하는 융합 단백질이 안구건조증 치료에 매우 효과적인 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 FK506 결합 단백질과 상기 PEP-1 펩타이드의 변이체가 결합된 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 FK606 결합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체가 공유결합될 수 있다.
상기 PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체는 하기 식 (I)로 표시될 수 있다:
(X)ETWWETWWTEW(W)nSQ-(Y)m (I)
이때, n, m은 서로 독립적으로 O 또는 1이고, X는 K 또는 M이며, Y는 P, K, R 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산으로 구성되는 1 내지 7개의 펩타이드이다. 구체적으로 상기 X는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
상기 PEP-1 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 이때, n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PKKKRKV이다.
또한, 상기 PEP-1 펩타이드의 변이체는 서열번호 2 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 구체적으로, n은 0, m은 0이고, X는 K일 수 있고(서열번호 2), n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PKKKRV일 수 있으며(서열번호 3), n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PKKKV일 수 있고(서열번호 4), n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PKKV일 수 있으며(서열번호 5), n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PKV일 수 있고(서열번호 6), n은 0, m은 1이고, X는 K이며, Y는 PV일 수 있으며(서열번호 7), n은 1, m은 0이고, X는 K일 수 있고(서열번호 8), n은 0, m은 1이고, X는 M이며, Y는 PKKKR일 수 있으며(서열번호 9), n은 0, m은 1이고, X는 M이며, Y는 PKK일 수 있고(서열번호 10), n은 0, m은 1이고, X는 M이며, Y는 PK일 수 있다(서열번호 11).
상기 FK506 결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 상기 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 FK506 결합 단백질의 N-말단에 서열번호 2 내지 11로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나인 PEP-1 펩타이드의 변이체가 공유결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 융합 단백질은 서열번호 14 내지 23으로 표시되는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 안구건조증이 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증 및 알레르기성 결막염 수반 안구건조증을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 조성물은, 용액, 현탁액, 유탁액(emulsion) 및 기타 국소 투여 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조성물을 투여하는 환자의 편이성뿐만 아니라 제형화의 용이성에 근거할 때, 수용액이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 상기 조성물은 또한 현탁액, 점성 또는 반점성 겔, 또는 다른 유형의 고체 또는 반고체 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 투여되는 조성물은 강장제, 완충제, 계면활성제, 안정화 중합체, 보존제, 보조용매 및 점도 증강제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 약학 조성물은 저해제를 강장제 및 완충제와 함께 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 계면활성제 및/또는 완화제 및/또는 안정화 중합체를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다.
또한, 상기 융합 단백질의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시에 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
안구건조 또는 안구 습윤이 필요한 다른 질병의 신호 또는 증상을 감소 또는 제거하기 위해서, 상기 약학 조성물에 포함되는 융합 단백질의 약제학적 유효량은 0.0001 ㎍/day 내지 100 ㎍/day일 수 있다. 이때, 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물에 포함되는 화합물 또는 융합 단백질의 농도는 1000 μM 내지 0.001 μM일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물에 포함되는 화합물 또는 펩타이드의 농도는 100 μM 내지 0.005 μM일 수 있으며, 50 μM 내지 0.02 μM일 수 있다. 또한, 필요에 따라 상기 약학 조성물에 포함되는 융합 단백질의 농도는 30 μM 내지 1 μM일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물에 포함되는 화합물 또는 펩타이드의 농도는 1 μM 내지 0.01 μM일 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질의 투여 대상은 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 바람직하게는 안구에 적절히 도포될 수 있도록 점안액으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
PEP-1-FKBP 융합 단백질의 발현벡터 제조 및 형질전환
PEP-1-FKBP 융합 단백질을 생산하기 위해 서열번호 1로 표시되는 PEP-1 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 PEP-1 벡터를 제조하였다. PEP-1 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 합성하여 NdeⅠ-XhoⅠ 제한효소(Biolabs, USA)로 자른 pET15b 벡터(Novagen, USA)에 연결(ligation)하여 삽입하였다. 이어 서열번호 12로 표시되는 FK506 결합 단백질(human FKBP)의 cDNA 서열을 기본으로 하여 두 종류의 프라이머를 합성하였다. Forward primer는 5'-CTCGAGATGGGCGTGCAAGTTGAAACCATC-3'(서열번호 24)로 XhoⅠ 제한 부위를 포함하고 있으며 Reverse primer는 5'-GGATCCTTATTCCAGCTTCAGCAGCTC-3'(서열번호 25)로 BamHⅠ 제한 부위를 가지고 있다. PCR을 통하여 얻은 결과물을 pGEM-T-easy 벡터(Promega, USA)에 삽입한 후에 XhoⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고 PEP-1 발현벡터에 연결하여 PEP-1-FKBP 발현벡터를 제조하였다.
상기 PEP-1-FKBP 발현벡터로 E.coli BL21(DE3) (Enzynomics, Korea)를 형질전환시키고, 형질전환된 콜로니를 선택하여 100ml LB배지에 접종하였다. 그 후, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Duchefa, Netherland)를 배지 내에 첨가하여 최종농도가 0.5mM 되게 한 다음 재조합된 PEP-1-FKBP 융합 단백질의 과발현을 유도하였다. 과발현된 PEP-1-FKBP 융합 단백질(LEC-111)을 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다.
위와 같은 방법을 이용하여 PEP-1의 변이체 서열로 PEP-1 변형 발현벡터를 제조하여 10종의 변형된 PEP-1-FKBP 융합 단백질(LEC-113, LEC-115, LEC-116, LEC-117, LEC-118, LEC-119, LEC-123, LEC-141, LEC-143 및 LEC-144)을 제조하였다. 제조된 융합 단백질의 서열을 하기 표 1에 표시하였다.
명칭 | 서열 | ||
PEP-1 펩타이드 또는 이의 변이체 | FK506 결합 단백질 또는 이의 변이체 | 융합 단백질 | |
LEC-111 | 서열번호 1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) |
서열번호 12 | 서열번호 13 |
LEC-113 | 서열번호 2(KETWWETWWTEWSQ) | 서열번호 12 | 서열번호 14 |
LEC-115 | 서열번호 3 (KETWWETWWTEWSQPKKKRV) |
서열번호 12 | 서열번호 15 |
LEC-116 | 서열번호 4 (KETWWETWWTEWSQPKKKV) |
서열번호 12 | 서열번호 16 |
LEC-117 | 서열번호 5(KETWWETWWTEWSQPKKV) | 서열번호 12 | 서열번호 17 |
LEC-118 | 서열번호 6 (KETWWETWWTEWSQPKV) |
서열번호 12 | 서열번호 18 |
LEC-119 | 서열번호 7 (KETWWETWWTEWSQPV) |
서열번호 12 | 서열번호 19 |
LEC-123 | 서열번호 8(KETWWETWWTEWWSQ) | 서열번호 12 | 서열번호 20 |
LEC-141 | 서열번호 9(METWWETWWTEWSQPKKKR) | 서열번호 12 | 서열번호 21 |
LEC-143 | 서열번호 10(METWWETWWTEWSQPKK) | 서열번호 12 | 서열번호 22 |
LEC-144 | 서열번호 11 (METWWETWWTEWSQPK) |
서열번호 12 | 서열번호 23 |
실시예 2. PEP-1-FKBP 융합 단백질 과발현 및 정제
상기 표 1에 기재된 11개의 융합 단백질을 다음의 방법으로 과발현 및 정제하였다. 형질전환된 E.coli BL21(DE3)를 앰피실린이 포함된 LB배지에 넣고 37℃에서 170 rpm으로 교반하며 배양하였다. 배양액 내의 박테리아 농도가 OD600에서 약 0.5~0.6을 나타낼 때 IPTG를 배지에 첨가하여 최종농도가 0.5 mM이 되게 한 다음 18℃에서 18시간을 더 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리하여 수집한 뒤 결합 완충용액(binding buffer; 5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)을 넣고 초음파처리(sonication)하였다.
원심분리 후 상청액을 2ml Ni2+-니트릴로트리아세트산 세파로즈 컬럼(nitrilotriacetic acid sepharose column)에 로딩하고, 10배 부피의 결합 완충용액과 12배 부피의 세척 완충액(washing buffer; 80 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음 용출 완충액(elution buffer; 250 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)로 융합 단백질을 용출하였다.
융합 단백질이 포함된 분획들을 모아 PD-10 컬럼(GE healthcare, USA) 크로마토그래피를 수행하여 분획 중에 포함된 염분을 제거하였다. 융합 단백질은 N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하고 있기 때문에 고정 금속-킬레이트 친화 크로마토그래피(immobilized metal-chelate affinity chromatography)의 단일 단계로 융합 단백질을 거의 순수하게(순도>90%) 정제하였다. 정제된 분획의 단백질 농도를 우혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 측정하였다[Bradford, M.A. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254].
정제된 융합 단백질의 농도 및 함량은 표 2에 기재된 바와 같다.
융합 단백질 | pI | M.W | 농도(mg/ml) | Qantity(mg) |
LEC-111 | 9.72 | 17.3 | 1.98 | 11.9 |
LEC-113 | 6.97 | 16.5 | 1.08 | 4.86 |
LEC-115 | 9.48 | 17.2 | 2.26 | 14.69 |
LEC-116 | 9.1 | 17 | 2.09 | 14.63 |
LEC-117 | 8.49 | 17 | 1.71 | 11.97 |
LEC-118 | 7.6 | 16.8 | 1.31 | 7.21 |
LEC-119 | 6.97 | 16.6 | 1.06 | 6.04 |
LEC-123 | 6.97 | 16.6 | 0.53 | 2.4 |
LEC-141 | 9.11 | 17 | 1.77 | 15.05 |
LEC-143 | 7.6 | 16.7 | 1.15 | 6.33 |
LEC-144 | 6.97 | 16.5 | 1.09 | 6.54 |
실험예 1. PEP-1 펩타이드 또는 FK506 단백질의 변이에 따른 칼슘 억제 효과 변화
세포 내 소포체에서 유리되는 칼슘이온을 타겟으로 한 유로텐신 수용체(Urotensin II receptor, UT) 과발현 세포주를 사용하여, 순간적으로 유리되는 칼슘이온의 농도를 측정하였다. 이때, 미토콘드리아 에쿼린을 통한 발광현상을 기초로 하는 세포기능 스크리닝 시스템을 이용하였다. 형질전환을 통해 UT 수용체 유전자가 삽입된 세포는 48 시간 배양이 끝난 후 PBS 10ml로 세척하고, 세포를 분리한 다음 1,000xg에서 5분간 원심분리 하였다. 침전된 세포는 기본 완충액(DMEM/HAM's F12 without phenol red, with L-Glutamate, 15 mM HEPES, pH 7.0, 0.1% BSA)으로 2X106 cells/ml의 농도가 되도록 코엘렌테라진(coelenterazine) h를 첨가한 다음 빛을 차단하고 상온에서 로테이터를 사용하여 세포와 코엘렌테라진 h를 반응시켰다. 4 시간 동안 반응시킨 후 기본 완충액으로 10 배 희석하여 2×105 cells/ml 농도로 맞춘 후 앞에서와 같은 조건으로 60 분간 방치하였다. 효능제 활성을 확인하기 위해서 50 μl/well의 효능제 (urotensin II, 3μM-1.37nM)가 담긴 96-well black plate(Corning 3915)에 미리 준비한 세포를 50 μl/well(5,000 cells/well)로 가한 후 결과 신호값을 측정하였다. 준비된 세포를 50 μl/well의 9개의 융합 단백질(LEC-111, LEC-113, LEC-115, LEC-116, LEC-117, LEC-118, LEC-119, LEC-123 및 LEC-144)이 담긴 96-well plate에 50 μl/well로 첨가한 후 30 분간 반응시키고 50 μl/well의 효능제(urotensin II, 100nM) 를 주입하여 반응을 확인하였다. 세포의 활성으로 인해 방출되는 빛은 Mithras 960 MultiLabel Reader를 사용하여 측정되는 수치로 기록되었다. 측정된 값(AUC integrated signal)은 relative light units (RLU)로 나타내었다. 실험데이터의 정확도를 위하여 최소한 8가지 농도의 각각 동일 단백질 샘플이 실험되었고 산출되는 IC50 수치는 적어도 3회 이상의 실험을 통해 얻어진 수치로 비교분석 하였다.
IC50(M) | LEC-111 | LEC-113 | LEC-115 | LEC-116 | LEC-117 | LEC-118 | LEC-119 | LEC-123 | LEC-144 |
Mean | 7.368 x10-6 |
NA | 6.723 x10-6 |
3.712 x10-6 |
6.094 x10-6 |
5.051 x10-6 |
5.633 x10-6 |
3.285 x10-6 |
1.220 x10-6 |
SD | 5.397x10-7 | NA | 1.861 x10-6 |
9.233 x10-7 |
8.737 x10-7 |
6.868 x10-7 |
6.250 x10-7 |
3.906 x10-7 |
1.780 x10-7 |
LEC-115, LEC-116, LEC-117, LEC-118, LEC-119, LEC-123 및 LEC-144은 LEC-111에 비해 소포체 칼슘 방출 억제 효과가 증가되었다. 특히, LEC-116, LEC-123의 경우 LEC-111 보다 약 2배 이상 증가하였으며, LEC-144의 경우 소포체 칼슘 방출 억제 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, PKKKRKV 서열이 결실된 LEC-113과 PKKKRKV 서열이 결실되고 PEP-1에 트립토판(W)이 삽입된 LEC-123을 비교해보면, LEC-123이 LEC-113에 비하여 소포체 칼슘 방출 억제 효과가 현저히 증가한 것을 알 수 있다. 따라서 PKKKRKV 서열이 제거되었을 때(pI= 약 7) 추가된 트립토판(W)의 유무가 칼슘 방출 억제 효과에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 볼 수 있다.
실험예 2. 마우스 안구건조증 모델을 이용한 본 발명에 따른 융합 단백질의 유효성 평가 실험
실시예 2.1. 시험군 준비 및 통계학적 분석 방법
본 실험은 동물보호법(제정 1991 년 5 월 31 일 법률 제 4372 호, 일부 개정 2015 년 1 월 20 일 법률 제 13023 호)에 근거한 ㈜케이피씨의 동물실험윤리위원회의 승인 후 진행하였다.
먼저, 안구건조증 모델 제작 및 평가에 널리 사용되고 있는 C57BL/6 마우스(공급처: 오리엔트바이오; 입수 시 성별, 동물 수, 주령 및 체중범위: 숫컷 60마리, 6주령, 20 ± 2 g를/투여 개시 시 성별, 동물 수, 주령 및 체중범위: 숫컷 60마리, 7주령, 22 ± 3 g)에 식염수에 2.5 mg/ml의 농도로 조제한 스코폴라민 브롬화수소산염수화물(scopolamine hydrobromide)를 10 ml/kg의 용량으로 10 일간 1 일 3 회 눈물샘 부근에 피하 주사하여 안구건조증을 유도하였다. 각막 염색 지수(corneal fluorescein stain)를 통하여 각막 손상정도를 평가하고, 임상 점수에 따라 Z-배열법으로 시험군을 분리하여 실험을 진행하였다(표 4 참조).
시험군 | 투여 물질 |
안구건조증
유도 |
투여용량 및 횟수 |
각 군당
마릿수 |
G1 | PBS | X | - | 7 |
G2 | - | O | - | 5 |
G3 | PBS | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G4 | LEC-111 | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G5 | LEC-141 | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G6 | LEC-143 | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G7 | LEC-144 | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G8 | 디쿠아스 점안액 3% (Diquas®) | O | 1 drop q.i.d | 5 |
G9 | 레스타시스 점안액 0.05% (Restasis®) | O | 1 drop q.i.d | 5 |
q.i.d: 1일 4회 투여
한편, 실험에서 얻어진 모든 실험 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하고 SPSS(version 20, IBM SPSS Statistics, USA)를 사용하여 검정하였다. 모든 자료들에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하였으며, 분산이 동질성을 갖는 경우 ANOVA(one-way analysis of variance)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군(부형제군)과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Fisher's Least Significant Difference (LSD) Test를 실시하였고, 이분산인 경우는 Dunnett-T3 test로 사후검정을 실시하였다(유의수준: 양측 5% 및 1%).
실시예 2.2. 체중 측정
모든 동물에 대하여 군 분리 시점과 매 평가 시점(군 분리 후 5 일 및 10 일)마다 체중을 측정하고, 그 결과를 도 3 및 표 5에 나타내었다.
도 3 및 표 5에 나타난 바와 같이, 군 분리 시점인 Day 0과 Day 5의 체중은 정상 동물인 G1군(sham; 안구건조증이 유발되지 않은 PBS 투여 모의 대조군)과 안구건조증이 유발된 G2군부터 G9군까지의 체중은 시험군 간에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 한편, 시험종료 시점인 Day 10을 기준으로, 안구건조증을 유발한 모든 시험군의 체중이 G2군보다 통계적으로 유의하게 감소한 것이 확인되었으며(G3, G4, G6, G7, G8, G9: p<0.05 및 G5: p<0.01), G2군의 경우 군 분리 시점 이후부터 아무런 처치나 투여도 실시하지 않았던 점을 고려할 때, 안구건조증 유발군에서 확인된 체중 감소는 투여 및 보정 등에 의한 스트레스 때문인 것으로 사료된다.
[표 5]
실시예 2.3. 임상학적 각막손상 평가(Corneal fluorescein score)
군 분리 시점과 시험물질 투여 후 5일 및 10일에 마우스를 럼푼과 케타민으로 전신 마취를 유도한 후, 트로페린을 점안하여 산동을 유도하였다. 이후 마우스의 양 안에 남은 산동제를 제거하고, 0.2% Fluorescein sodium salt를 양 안에 각각 10 ㎕씩 점안하여 각막의 손상부위를 형광 염색하였다. 그리고 생리식염수로 가볍게 안구를 세척한 뒤 청색광에서 각막의 이미지를 촬영한 후, NIE(National Institute of Eye) 가이드라인(도 4)에 따라 각막의 영역을 5 영역으로 나누어 한 영역당 0-3으로 점수를 책정하고 그 값을 합산하여 결과값을 산출하였다. 그 결과를 도 5a 내지 도 5c, 도 6 및 표 6에 나타내었다.
[표 6]
군 분리 시점인 Day 0의 각막 염색 점수는 정상 동물인 G1군을 제외하고, 안구건조증이 유발된 G2군부터 G9군은 모두 유사한 수준을 나타내었다. Day 5에 측정된 각막 염색 점수는 Lec-144(G7)와 Diquas®(G8)를 투여한 시험군의 점수는 PBS를 투여한 군(G3)과 비교하여 통계적으로 유의한 점수 감소를 나타내었다(각각 p<0.05). Day 10에 측정한 각막 염색 점수는 정상 동물인 G1군의 경우 Day 0 및 Day 5와 유사한 수준을 나타낸 반면, 안구건조증을 유발한 G2군부터 G9군의 경우, 시험물질 Lec-141, Lec-143, Lec-144 및 대조약물 Diquas® 와 Restasis®을 투여한 모든 시험군에서 PBS를 투여한 대조군 G3보다 통계적으로 유의한 점수의 감소를 나타내었다(G5: p<0.01, G6: p<0.05, G7: p<0.01, G8: p<0.01, G9: p<0.01).
실시예 2.4. 눈물 양 측정(Phenol-red thread)
군 분리 시점과 시험물질 투여 후 10일에 럼푼과 케타민으로 전신 마취를 유도한 후, Zone-Quick(phenol-red thread tear test) strip 을 이용하여 눈물의 양을 측정하였다(mm). 그 결과를 도 7 및 표 7에 나타내었다.
[표 7]
도 7 및 표 7을 참조하면, 군 분리 시점인 Day 0에 페놀레드검사를 이용하여 측정한 눈물 분비량은 정상 동물인 G1군을 제외하고, 안구건조증이 유발된 G2군부터 G9군까지 모두 유사한 수준을 나타내었다. Day 5에 측정한 눈물 분비량은 정상동물인 G1군의 경우 Day 0와 유사한 수준을 나타낸 반면, 안구건조증이 유발된 G2군부터 G9군의 경우 모두 Day 0보다 눈물 양이 증가하는 경향을 나타내었다. 한편, Day 10에 측정한 눈물 분비량은 G1군의 경우 Day 0, Day 5와 유사한 수준을 나타낸 반면, 안구건조증이 유발된 시험군 중 특히 Lec-143, Lec-144, Diquas® 및 Restasis®를 투여한 시험군 G6, G7, G8, G9의 경우 눈물 분비량의 증가 폭이 다른 시험군 보다 큰 것을 확인하였다.
실시예 2.5. 안구적출 및 조직병리
최종 평가 직후에 안구를 적출하여 Davison's fixative에 담가 전 고정을 실시하고, 이를 다시 70% 에탄올에 담가 후고정을 실시하였다. 고정이 완료된 조직은 파라핀 슬라이드로 제작하고, H&E 염색 후 현미경으로 각막상피 부위를 검경하였다. 시험 종료시점에 마우스를 희생하여 안구를 조직 절편으로 만들고, H&E 염색 및 TUNEL 염색을 실시하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 각막 상피 박리(corneal epithelial detachment) 부분은 검은색 화살표로 표기하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, Lec-143, Lec-144, Diquas® 및 Restasis®를 투여한 시험군 G6, G7, G8, G9에서 PBS를 투여한 대조군 G3보다 각막 상피 박리가 감소하는 경향이 관찰되었다.
상기 실시예 3.1 내지 3.5에 따른 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 융합 단백질 Lec-141, Lec-143, Lec-144는 Lec-111보다 안구건조증 치료 효과가 월등하며, 특히 시중에 판매되는 약물인 Diquas®나 Restasis®와 동등 수준 또는 그 이상으로 안구건조증에 의하여 야기된 각막 손상을 회복시키는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
<110> HANLIM PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> FUSION PROTEIN COMPRISING CELL PENETRATING PEPTAIDE AND FKBP12
AND USE THEREOF
<130> FPD/202206-0040/C
<160> 25
<170> KoPatentIn 3.0
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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100 105 110
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Lys Lys Val Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
35 40 45
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Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
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Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro
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Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser
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Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro
100 105 110
His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
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Val Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr
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Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu
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Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe
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Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro
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Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His
100 105 110
Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
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Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
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Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
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Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
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<213> Artificial Sequence
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<223> fusion protein LEC-123
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Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
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Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
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Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fusion protein LEC-143
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Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu
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Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe
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Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly
65 70 75 80
Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro
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Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His
100 105 110
Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
115 120 125
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fusion protein LEC-144
<400> 23
Met Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe
20 25 30
Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
35 40 45
Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys
50 55 60
Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
85 90 95
Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala
100 105 110
Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
115 120
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 24
ctcgagatgg gcgtgcaagt tgaaaccatc 30
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 25
ggatccttat tccagcttca gcagctc 27
Claims (3)
- PEP-1 펩타이드의 변이체와 FK506 결합 단백질이 결합된 융합 단백질로서,
상기 PEP-1 펩타이드의 변이체는 서열번호 4 또는 8인 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 FK506 결합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진, 융합 단백질. - 제1항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 안구건조증이 무루증, 각막건조증, 쇼그렌 증후군, 건조 각막결막염, 스티븐-존슨 증후군, 눈 유사물집증, 안과 수술 후 안구건조증 및 알레르기성 결막염 수반 안구건조증을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 안구건조증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020220077379A KR102646717B1 (ko) | 2020-04-21 | 2022-06-24 | 세포 침투성 펩타이드와 fkbp12를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200047829A KR102433799B1 (ko) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 세포 침투성 펩타이드와 fkbp12를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 |
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