CN107233574A

CN107233574A - Crebzf在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用

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Publication number: CN107233574A
Application number: CN201710423436.5A
Authority: CN
Inventors: 李于; 张菲菲; 胡志敏
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-06-07
Also published as: WO2018223364A1; CN107233574B

Abstract

本文通过构建肝脏特异性敲除CREBZF的小鼠模型，发现肝脏特异性敲除CREBZF显著地减缓高脂高糖饮食诱导的小鼠体重增加，降低血糖血脂，改善小鼠肝脏脂肪沉积，增加葡萄糖耐受性，减缓肝细胞脂质堆积。因此本文涉及CREBZF在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用。具体而言，本文提供以下试剂在制备减缓对象体重增加，降低对象血糖血脂，改善对象肝脏脂肪沉积，增加对象葡萄糖耐受性，和/或减缓对象肝细胞脂质堆积的药物中的用途：(1)减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂；和/或(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂。

Description

CREBZF在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用

技术领域

本发明涉及CREBZF在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用。

背景技术

随着现代人们生活水平的提高和膳食结构的改变，以肥胖、二型糖尿病、脂肪肝、高血糖、高血脂症等为代表的代谢综合征(metabolism syndrome，MS)发病率逐年升高并且呈现上升的趋势，由于脂肪代谢紊乱引起的高血脂是脂肪肝、肥胖、冠心病和动脉粥状硬化等其他慢性病的重要。因此寻找到有效预防和控制代谢紊乱的药物靶点，对于防治代谢病具有重要的现实意义，同时找到一种能够监测肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、高胰岛素、高血糖、高血脂等为代表的代谢综合征相关的分子指标，对于疾病的临床分子诊断和治疗以及预防将会起到积极地作用。

肥胖和二型糖尿病和一系列代谢综合征的发生发展紧密相关，其中包括胰岛素抵抗，脂肪肝，高血糖，血脂异常，同时肥胖和二型糖尿病的发生也会加速临床中与心血管相关疾病的进程。肝脏中过度累积甘油三酯是脂肪肝的显著特点，并且和胰岛素抵抗具有密切的相关性，肝脏中增加的脂肪酸从头合成和过多的甘油三酯累积所造成的代谢紊乱也会进一步的加速脂肪肝的发病进程。

CREBZF(也被称作为ZF、Zhangfei)属于Activation Transcription Factor/cAMPResponse Element-Binding protein(ATF/CREB)家族的碱性亮氨酸转录因子，最初对它的研究是发现它可以通过与单纯疱疹病毒中的HCF-1细胞因子发生相互作用来抑制单纯疱疹病毒复制〔Akhova,O.,M.Bainbridge和V.Misra，The Neuronal Host Cell Factor-Binding Protein Zhangfei Inhibits Herpes SimplexVirus Replication，Journal ofVirology,2005.79(23):p.14708-14718〕。CREBZF和其它ATF/CREB家族的转录因子不同的是，它并不以同源二聚体的形式直接结合DNA；在调控内质网应急的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)时，它可以作为一个共转录因子和ATF4形成异源二聚体来发挥调控作用〔Hogan,M.R.、G.P.Cockram和R.Lu,Cooperative interaction ofZhangfei andATF4in transactivation of the cyclic AMP response element，FEBSLetters,2006.580(1):p.58-62〕。之前已有人对CREBZF在生化分子功能进行了初步的研究〔Xie,Y.-B.、B.Nedumaran和H.-S.Choi，Molecular characterization of SMILEas anovel corepressor of nuclear receptors.Nucleic Acids Research,2009.37(12):p.4100-4115；Xie,Y.-B.等，Transcriptional Corepressor SMILE RecruitsSIRT1toInhibit Nuclear Receptor Estrogen Receptor-related ReceptorγTransactivation.Journal of Biological Chemistry,2009.284(42):p.28762-28774〕，但是对于CREBZF在营养过剩的情况下是如何调控代谢的机制研究还知之甚少。

发明内容

本文第一方面提供以下试剂在制备减缓对象体重增加，降低对象血糖血脂，改善对象肝脏脂肪沉积，增加对象葡萄糖耐受性，和/或减缓对象肝细胞脂质堆积的药物中的用途：

(1)减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂；和/或

(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述对象的体重增加、高血糖、高血脂、肝脏脂肪沉积、低葡萄糖耐受性和/或肝细胞脂质堆积由该对象的高脂高糖饮食所致。

在一个或多个实施方案中，所述药物用于降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的发病机率或治疗这些代谢性疾病。

在一个或多个实施方案中，减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂为抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂。

在一个或多个实施方案中，抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂选自：

(a)抑制该CREBZF基因转录活性的试剂；

(b)抑制该CREBZF mRNA的转录水平的试剂；

(c)促进该CREBZF mRNA降解的试剂；

(d)针对该CREBZF基因的siRNA；

(e)抑制CREBZF mRNA的翻译的试剂；

(f)特异性识别CREBZF基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平的试剂；和

(g)用于部分或全部敲除CREBZF基因的试剂

在一个或多个实施方案中，所述降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂为CREBZF蛋白的特异性抗体或具有抑制活性的小分子化合物。

本文第二方面提供一种核酸序列，选自：

(1)含有CREBZF基因、LoxP位点和Frt-Neo-Frt位点的核酸序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列还可进一步地含有同源臂序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点。

在一个或多个实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有同源臂、LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点、LoxP位点和同源臂。

在一个或多个实施方案中，所述同源臂与LoxP位点之间、LoxP位点与CREBZF基因、Frt位点与LoxP位点之间以及LoxP与同源臂位点之间可具有任选的连接序列。

在一个或多个实施方案中，所述各基因、位点和连接序列的序列如SEQ IDNO:9所示。

本文第三方面提供一种载体，其含有本文所述的核酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述载体用于同源重组。

本文第四方面还提供一种经基因工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞转入了本文所述的载体，并在其基因组中含有本文所述的从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点的核酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为非人哺乳动物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为啮齿类动物的细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为人的体细胞或非人哺乳动物的胚胎干细胞及体细胞。

本文第五方面还提供一种构建转基因小鼠的方法，所述方法包括：

(1)提供本文所述的载体；

(2)将所述载体转入小鼠胚胎干细胞中，筛选获得同源重组的胚胎干细胞克隆；

(3)将步骤(2)获得的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，并将该囊胚转入假孕母鼠中，获得雄性嵌合体小鼠；

(4)将步骤(3)获得的雄性嵌合体小鼠与野生型雌性小鼠交配，获得带有Flox位点的CREBZF等位基因小鼠；

(5)将步骤(4)获得的带有Flox位点CREBZF的等位基因小鼠与Albumin-Cre或EllaCre转基因小鼠杂交，得到第一代杂合子小鼠，然后采用杂合子小鼠进行第二代自交，从而获得纯合的敲除小鼠，即所述转基因小鼠。

在一个或多个实施方案中，该构建方法还包括使步骤(5)获得的纯合的敲除小鼠与该步骤获得的纯合的对照小鼠交配，从而扩大纯合的敲除小鼠的种群。

在一个或多个实施方案中，该转基因小鼠的特征是，全身或肝脏不表达CREBZF蛋白、或与对照动物相比CREBZF蛋白的表达量降低、或表达无活性的CREBZF蛋白或活性降低的CREBZF蛋白。

因此，本文第六方面也提供一种转基因小鼠，所述转基因小鼠的全身或肝脏不表达CREBZF蛋白、或与对照动物相比CREBZF蛋白的表达量降低、或表达无活性的CREBZF蛋白或活性降低的CREBZF蛋白。

本文第七方面还提供CREBZF基因或蛋白作为靶点在筛选治疗或预防代谢性疾病或症状的药物中的应用，或用作分子指标在临床上用诊断胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢综合征的病程发展。

本文第八方面提供检测CREBZF基因或蛋白的试剂在制备用于诊断代谢性疾病或判断代谢性疾病病程发展的试剂盒中的应用。

本文第九方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有检测CREBZF基因和/或蛋白的试剂。

附图说明

图1：CREBZF肝特异性敲除的小鼠的构建以及鉴定。(A)构建带有Flox位点CREBZF等位基因小鼠以及CREBZF肝特异性敲除的小鼠模式图(B)鉴定CREBZF Flox小鼠使用F1和R1PCR分别产生的目的片段是248bp；鉴定Alb-Cre的目标片段大小为100bp。

图2：CREBZF肝特异性敲除的小鼠的构建以及鉴定。(A)四个月实验处理后小鼠体重。*代表与chow diet组相比有显著性差异P<0.05，#代表与HFHS组的CREBZF LKO组和CREBZF WT组相比有显著性差异P<0.05，下同。(B)实验处理期间小鼠体重变化。Bar代表标准误(实验中小组中小鼠数量为n＝8，8，12，12)。(C)小鼠体成分分析，各组小鼠脂肪与瘦肉(Fat Mass，LeanMass)所占体重比。

图3：CREBZF LKO小鼠可以改善高脂高糖饮食诱导的小鼠肝脏脂肪沉积，降低小鼠血清和肝脏中甘油三酯水平。(A)不同处理组小鼠肝HE染色和油红O染色，所有的小鼠切片的染色都是观察大于8张的结果得出。(B)小鼠肝脏中甘油三酯和总胆固醇检测结果(P<0.05)。(C)小鼠血浆中甘油三酯和总胆固醇检测结果(P<0.05)。

图4：CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠对高脂高糖饮食诱导肥胖小鼠血糖以及葡萄糖的耐受性的影响。(A)不同处理组小鼠肝禁食血糖(P<0.05)。(B，C)正常饮食组和高脂高糖饮食诱导的小鼠组的葡糖糖耐受性测试(GTT)。

图5：CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠对高脂高糖饮食诱导肥胖小鼠脂质相关基因的影响。(A)正常饮食和高糖高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏中SREBP-1、FAS的表达水平。(B)高糖高脂饮食诱导肥胖小鼠肝中Ising-2a mRNA的表达水平(P<0.05)。(C)高糖高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏中SREBP-1c的mRNA的水平(P<0.05)。(D)高糖高脂饮食诱导肥胖小鼠肝脏中脂肪酸和甘油三酯合成相关的关键基因的mRNA的水平(P<0.05)。

具体实施方式

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本文通过构建肝脏特异性敲除CREBZF的小鼠模型，通过高脂肪高蔗糖饮食诱导的疾病模型来探究肝脏中CREBZF在营养过剩的情况下中所起的作用和生物学功能。本文发现，肝脏特异性敲除CREBZF显著的减缓高脂高糖饮食诱导的小鼠体重增加，降低血糖血脂，改善小鼠肝脏脂肪沉积，增加葡萄糖耐受性，减缓肝细胞脂质堆积。所以通过一定的技术或者药物手段，以CREBZF为靶点，敲减或者抑制其活性，将能够有效降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和脂肪肝的发病机率。

因此，本文涉及以CREBZF为靶点减缓对象高脂高糖饮食诱导的体重增加，降低对象血糖血脂，改善对象肝脏脂肪沉积，增加对象葡萄糖耐受性，和/或减缓对象肝细胞脂质堆积，以有效降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的发病机率或治疗这些代谢性疾病。

本文中，CREBZF是Activation Transcription Factor/cAMP ResponseElement-Binding protein(ATF/CREB)家族的碱性亮氨酸转录因子。本文包括各种被本领域定义为CREBZF的碱性亮氨酸拉链转录因子，例如来自不同物种的CREBZF。所述不同物种包括但不限于哺乳动物和啮齿类动物，例如鼠类。人CREBZF的编码基因位于人第11号染色体上，具体的染色体区段是11q14.1，在NCBI中的登陆号为AF 039942.1(基因序列)和AAD 28325.1(氨基酸序列)。小鼠(Mus musculus)CREBZF的编码基因位于其第7号染色体上，具体的染色体区段是7E1，其氨基酸序列在NCBI中的登陆号为NP_660133，基因编号是233490。

本文中，“对象”指各种需要包括但不限于哺乳动物和啮齿类动物，例如人和鼠。

本文通过抑制CREBZF蛋白的活性而实现上述目的。可通过如下方式实现CREBZF蛋白活性的抑制：

(1)减少对象CREBZF蛋白表达；和/或

(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性；

减少对象CREBZF蛋白表达包括但不限于抑制CREBZF蛋白的编码基因的表达或将其该基因的表达水平。例如，可给予抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂，这些试剂包括：抑制该CREBZF基因转录活性的试剂，抑制该CREBZF mRNA的转录水平的试剂，促进CREBZF mRNA降解的试剂，针对该CREBZF基因的siRNA，抑制CREBZF mRNA的翻译的试剂，和特异性识别CREBZF基因的导向核酸并进行剪切以降低其表达水平的试剂。在某些实施方案中，可通过给予CREBZF基因的siRNA来抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平。在其他实施方案中，可通过给予打靶载体将CREBZF全基因敲除，从而实现CREBZF基因表达的抑制或降低。降低CREBZF蛋白活性的试剂可以是例如CREBZF的特异性抗体或具有抑制活性的小分子化合物。

在某些实施方案中，也可通过在CREBZF蛋白中引入突变而使其活性降低。本文中，CREBZF蛋白的活性尤其是指其在本文中所述的介导代谢性疾病的活性。因此，在某些实施方案中，在CREBZF蛋白的功能域中引入致其相应活性减弱或丧失的突变。突变可以是1个或数个甚至更多(例如10个以上、20个以上、30个以上)个氨基酸的插入、缺失或取代。可通过给予作用于CREBZF基因的试剂，使其所编码的CREBZF蛋白的功能域中存在导致其相关生物学活性减弱或丧失的突变。这类试剂可改变CREBZF基因的序列，导致所编码的CREBZF蛋白存在相应的突变，从而具有减弱的活性，或活性丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的CREBZF基因替换野生型细胞中的CREBZF基因，从而导致其表达除弱活性或无活性的CREBZF蛋白。

因此，本文包括以下试剂的制药用途：

(1)减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂；和/或

(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂。

减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂包括前文所述的抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂，而降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂包括前文所述的降低CREBZF蛋白活性的试剂。

这类试剂可用于预防和/或治疗由CREBZF蛋白介导的代谢性疾病或症状。本文中，由CREBZF蛋白介导的代谢性疾病包括但不限于胰岛素抵抗、糖尿病(尤其是2型糖尿病)、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢综合征。所述症状可包括高脂高糖饮食诱导的体重增加，高血糖，高血脂，肝脏脂肪沉积，低葡萄糖耐受性，和/或肝细胞脂质堆积等。应理解的是，可采用本领域公认标准判断对象血糖是否为高血糖，血脂是否为高血脂，以及葡萄糖耐受是否为低葡萄糖耐受。在某些方面，所述代谢性疾病或症状是营养过剩引起。因此，可使用这些试剂制备降糖药、降血脂药、减肥药和/或降脂肪肝等预防和/或治疗代谢综合征或减轻其症状的药物，用于预防和/或治疗糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝，或用于降低体重、血糖、血脂、肝脏脂肪沉积、肝细胞脂质堆积和/或增加葡萄糖耐受性。

所述药物除含有治疗或预防有效量的所述试剂外，还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，本文所述的药物是肝靶向的药物。

本文中，降低CREBZF蛋白的活性包括使CREBZF蛋白的活性与其对应的野生型蛋白相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全无活性。

本文也包括治疗或预防本文所述的代谢性综合征或所述的症状的方法，所述方法包括给予有此需要的对象治疗或预防有效量的下述试剂：

(1)减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂；和/或

(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂。

本文也提供一种动物模型，该动物模型优选为啮齿类动物模型，尤其是鼠类。该动物模型的特征是，全身或肝脏中不表达CREBZF蛋白、或与对照动物相比CREBZF蛋白的表达量降低、或表达无活性的CREBZF蛋白或活性降低的CREBZF蛋白。在某些实施方案中，该动物模型是肝特异性敲除CREBZF的转基因小鼠。

可利用带有Flox位点的CREBZF等位基因小鼠和Albumin-Cre转基因小鼠(Alb-CreTG)杂交来构建所述肝特异性敲除CREBZF的转基因小鼠。具体而言，可如下构建所述肝特异性敲除CREBZF的转基因小鼠：

(1)构建带有CREBZF基因、LoxP位点、Frt-Neo-Frt位点和两侧同源臂的质粒；

(2)将步骤(1)的质粒转入小鼠胚胎干细胞中，筛选获得同源重组的胚胎干细胞克隆；

(5)将步骤(4)获得的带有Flox位点CREBZF的等位基因小鼠与Albumin-Cre转基因小鼠杂交，得到第一代杂合子小鼠，然后采用杂合子小鼠进行第二代自交，从而获得纯合的敲除小鼠，即所述小鼠模型。

在某些实施方案中，所述步骤(5)还获得纯合的对照小鼠，该构建方法还包括使步骤(5)获得的纯合的敲除小鼠与纯合的对照小鼠交配，从而扩大纯合的敲除小鼠的种群。

在某些实施方案中，利用Ella Cre(编号003724，名称B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J，来自Jackson公司)与所述带有Flox位点的CREBZF等位基因小鼠杂交，构建全身敲除CREBZF的小鼠(CREBZF KO)。

作为示范性的例子，CREBZF基因的序列可如SEQ ID NO:9的第5383－7516位碱基序列所示；同源臂区域可如SEQ ID NO:9第142－5312位和第9661－12661位碱基序列所示；LoxP位点可如SEQ ID NO:9第5329－5362位和第9598－9631位碱基序列所示；Frt-Neo-Frt位点可如SEQ ID NO:9第7517－7579位碱基序列所示，其中Neo盒子位于第7564－9545位。应理解，可利用本领域熟知的技术和序列来构建上述构建方法步骤(1)的质粒。质粒中还可含有其它本领域熟知的调控元件，以利于该CREBZF基因整合如胚胎干细胞的基因组中。另外，可利用本领域熟知的各种实验小鼠构建所述带有Flox位点的CREBZF等位基因小鼠，这类小鼠包括但不限于C57BL/6J小鼠。

可采用类似的方法构建其它动物模型。

在某些方面，本文也提供一种核酸序列，所述核酸序列含有CREBZF基因、LoxP位点和Frt-Neo-Frt位点。在某些实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点。所述核酸序列还可进一步地含有同源臂序列。在这些实施方案中，所述核酸序列从5’到3’依次含有同源臂、LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点、LoxP位点和同源臂。在某些实施方案中，同源臂与LoxP位点之间、LoxP位点与CREBZF基因、Frt位点与LoxP位点之间以及LoxP与同源臂位点之间可具有任选的连接序列。这些连接序列的序列可如本文SEQ ID NO:9第5313-5328位碱基序列、第5363-5382位碱基序列、第9580-9597位碱基序列或第9632-9660位碱基序列所示。

本文的核酸序列可包含于质粒或载体中。特别优选地，该质粒或载体为用于同源重组的质粒或载体。质粒或载体中还可含有其它利于在宿主细胞中同源重组的元件。可采用本领域周知的方法构建本文所述的质粒或载体。

可使用本文的质粒或载体转化宿主细胞，以获得经基因工程改造的宿主细胞，该宿主细胞转入了本文所述的载体，并在其基因组中有本文所述的从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点的核酸序列。所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞和啮齿类动物细胞，可以是胚胎干细胞、多能干细胞或体细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞不是人胚胎干细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞，包括其胚胎干细胞和体细胞，例如可以是啮齿类动物的胚胎干细胞和体细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是人的体细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是原代肝细胞、脂肪细胞或小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞。

本文还涉及CREBZF基因或蛋白作为靶点在筛选治疗或预防代谢性疾病或症状的药物中的应用，包括但不限于筛选用于预防和/或治疗糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的药物，或用于降低体重、血糖、血脂、肝脏脂肪沉积和/或肝细胞脂质堆积和或增加葡萄糖耐受性的药物。具体而言，可以CREBZF蛋白或基因作为分子靶标，筛选出能抑制其活性或者表达水平的分子，该分子可以是新的小分子化合物，也可以是已知的化合物。可利用表达或不表达CREBZF的细胞，如原代肝细胞、脂肪细胞或小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞通过荧光素酶报告基因实验、葡萄糖吸收实验或脂肪酸合成实验进行所述筛选。例如，可利用已经克隆成功的CREBZF启动子报告基因(CREBZF-Luc)，通过荧光素酶报告基因实验在转入了该启动子报告基因的原代肝细胞、脂肪细胞或者MEF细胞中进行高通量筛选，选择能够抑制CREBZF-Luc转录活性的试剂，作为抑制CREBZF基因表达的试剂。SEQ ID NO：10为本文将CREBZF启动子报告基因克隆到pGL3-basic中后获得的表达载体(pGL3-basic-mCREBZF-LUC)的核苷酸序列，其中，第27-2126位启动子序列。或者，可利用CREBZF⁺/⁺和CREBZF^-/^-小鼠的原代肝细胞、脂肪细胞或者MEF细胞，利用荧光标记的2-NBDG(2-[N-(7-硝基苯-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧-D-葡萄糖，Invitrogen)，通过葡萄糖吸收实验进行高通量筛选，选择能够在CREBZF⁺/⁺细胞中增加葡萄糖吸收，而在CREBZF^-/^-细胞中没有该作用的试剂，作为潜在的抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂。又或者，可利用CREBZF⁺/⁺和CREBZF^-/^-小鼠的原代肝细胞、脂肪细胞或者MEF细胞，通过BODIPY(D3922，MolecularProbes,Carlsbad,Calif,USA)荧光标记的脂肪酸合成实验进行高通量筛选，选择能够在CREBZF⁺/⁺细胞中抑制脂质合成或者积累，而在CREBZF^-/^-细胞中没有该作用的试剂，作为潜在的抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂。上述这类试剂包括但不限于小分子化合物、siRNA和多肽。应理解的是，CREBZF^-/^-小鼠的原代肝细胞可来自本文所述的肝特异性敲除CREBZF的转基因小鼠和全身敲除CREBZF的小鼠，而CREBZF^-/^-小鼠的脂肪细胞和MEF细胞则可来自全身敲除CREBZF的小鼠。

CREBZF基因或蛋白还可用作分子指标，在临床上用于诊断胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢性疾病的病程发展。因此，在某些实施方案中，本文涉及检测CREBZF基因或蛋白的试剂在制备用于诊断代谢性疾病或判断代谢性疾病病程发展的试剂盒中的应用。这类试剂包括但不限于用于检测CREBZF基因的各种引物和探针，和/或用于检测CREBZF蛋白的特异性抗体等，这类试剂和包括在制作含CREBZF基因或蛋白的样品以及实施检测过程中使用的其它试剂，如溶剂等，包括但不限于实施PCR等所需的各种试剂。

因此，本文也提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有前文所述的检测CREBZF基因和/或蛋白的试剂，包括但不限于扩增和检测CREBZF基因所需的引物和探针以及CREBZF蛋白的特异性抗体。通过试剂盒快速检测CREBZF的水平，衡量其水平的高低，可作为代谢性疾病判断的一个备选指标。通常，若检测到对象CREBZF基因的表达水平和/或CREBZF蛋白的活性高于正常人群CREBZF基因的表达水平和/或CREBZF蛋白的活性，则可初步判断该对象患有代谢性疾病的风险增加或可能患有代谢性疾病。

下文将以具体实施例的方式产生本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图用以限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。

一、材料与仪器

1、实验动物和食物

带有Flox位点CREBZF等位基因小鼠的产生：带有Flox位点的CREBZF等位基因小鼠是由赛业公司制作(Cyagen，China)。简而言之，在体外构建一个CREBZF基因1062bp个碱基的开放阅读框(ORF)序列以及一个LoxP位点和一个Frt-Neo-Frt位点和两侧的同源臂区域(SEQ ID NO:9：第142－5312位和第9661－12661位碱基序列为同源臂区域；第5329－5362位和第9598－9631位碱基序列为LoxP位点；第5383－7516位碱基序列为CKO区域；第7517－7579位碱基序列为Frt-Neo-Frt位点，其中Neo盒子位于第7564－9545位；其余为载体骨架的连接序列；外显子序列在第5383－7516位和第9661－12661位)，克隆到目标质粒上(基因敲除质粒ploxPFNeoFloxP由赛业公司构建保存，原始质粒来源于pGEM-T easy vector，购自Promega公司)，通过限制性内切酶Swal把质粒线性化，然后通过电穿孔仪把体外构建好的含有目的基因片段的序列导入到胚胎干细胞中(AB1，129/SvEv)，通过药物抗性筛选ES细胞克隆。使用以下Neo探针：

Neo probe-F：TCATCTCACCTTGCTCCTGC(SEQ ID NO:1)

Neo probe-R：AAGGCGATAGAAGGCGATGC(SEQ ID NO:2)

采用Southern blot技术对细胞的基因组进行检测，筛选出同源重组的ES细胞克隆，并将筛选出同源重组的ES细胞克隆注射到C57BL/6(B6)的囊胚中，将注射好的囊胚按照标准程序转移到假孕的母鼠(C57BL/6J)输卵管中，待嵌合体的小鼠出生之后，根据毛色判断是否为嵌合体以及嵌合体的程度大小，并把雄性嵌合体小鼠和野生型的雌性小鼠C57BL/6J交配。通过Flp介导的同源重组得到在CREBZF CKO(Conditional Knockout)两端含有Flox位点的目的小鼠，即所述带有Flox位点CREBZF等位基因小鼠。

肝特异性敲除CREBZF的小鼠的产生：肝特异性敲除CREBZF的小鼠(CREBZF LKO)是通过带有Flox位点CREBZF等位基因小鼠和Albumin-Cre转基因小鼠(Alb-Cre TG，获自美国Jackson公司，小鼠品名为B6.Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J，小鼠货号为：003574)杂交，得到第一代杂合子小鼠，然后采用杂合子小鼠进行第二代自交，得到少量纯合的敲除小鼠CREBZFLKO(CREBZF Flox^+/+Cre^+/-)和纯合的对照小鼠CREBZF WT(CREBZFFlox^+/+Cre^-/-)。通过得到的敲除小鼠和对照小鼠交配，扩大种群数量，得到足够数量的可供实验的小鼠。基因型鉴定CREBZF Flox的引物有两对，分别如下：

F1：GCTTGCAGTTTAGAGAGAAACAGC(SEQ ID NO:3)

R1：CAGCCAGAGTATCGCGAGATTC(SEQ ID NO:4)

F2：TTGACAATAAGTATTGAGGCATGCG(SEQ ID NO:5)

R2：TTTCCAACTTCTCAAGTGGTGAAC(SEQ ID NO:6)

使用F1和R1引物进行PCR，分别产生的目的片段是248bp(野生型)和318bp(含有Flox位点的CREBZF突变型)，使用F2和R2引物进行PCR，分别产生的目的片段是157bp(野生型)和285bp(含有Flox位点的CREBZF突变型)。用来检测Alb-Cre的引物是：

正向:GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC(SEQ ID NO:7)

反向：GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT(SEQ ID NO:8)

C57Bl/6背景的八周龄雄性肝特异性CREBZF敲除的小鼠(CREBZF LKO)被随机分为四组，其中两组给予正常饮食(Chow)诱导，另外对应两组分别给予高脂高糖(HFHS)饮食饲养。

小鼠食用的高脂高糖饲料(HFHS)购买于美国Research Diet公司。

2、主要试剂、仪器和设备

主要试剂：甘油三酯检测试剂盒(Infinity Triglycerides Reagent，TG)、胆固醇检测试剂盒(Infinity Cholesterol Reagent，TC)购自Thermo Scientific公司；Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA试剂盒(Mercodia)；血糖仪Freestyle和血糖试纸(Abbott)：重组人胰岛素注射液(Eli Lilly and Company)；葡萄糖(Sigma)。

使用仪器和设备：核磁共振(NMR)体成分分析(Bruker磁共振脂肪含量测量仪Mq7.5)；酶标仪(Tecan-200-酶标仪Infinite 200PRO)；4℃/-20℃冰箱购自海尔公司；超低温冰箱购自Thermo Scientific Forma公司；微量移液器购自Rainin或者Eppendorf公司；垂直电泳槽、湿转转膜仪和配套电源均购自Bio-Rad公司；冷冻离心机购自Eppendorf公司；PCR仪购自Bio-Rad公司；实时荧光定量PCR系统ABI 7500Fast Real-Time PCR System购自AppliedBiosystems公司。

3、动物分组

将八周龄的CREBZF LKO雄性小鼠和匹配的CREBZF WT雄性小鼠进行随机分组，分组情况如表1：

表1：小鼠分组情况及处理方式

4、实验小鼠模型构建

小鼠一直饲养在SPF级动物房中，在22天断奶后，依据小鼠雌雄进行分笼，小鼠可任意进食及饮水(上海实验动物中心提供的标准食物)。动物房保持温度22±3℃，湿度35±5％，12小时昼夜周期。所有实验都是选用8周龄小鼠进行实验。

5、小鼠指标测定和小鼠组织收集

(1)小鼠每周指标测定：每个星期测定小鼠的体重、进食量，并记录数据。

(2)小鼠实验处理三个月后测其空腹血糖。

(3)小鼠身体组分分析：利用核磁共振系统mini-spec nuclearmagneticresonance(NMR)spectrometer(Bruker Corp)测定小鼠在清醒、自由饮食状态下的的身体组分，包括脂肪量(Fat Mass)、瘦组织量(Lean Mass)和体液成分(Body Fluid)等。

(4)小鼠处死：实验四个月后将小鼠处死收取组织。

处死方法：采用异氟烷麻醉致小鼠深度昏迷，然后打开胸腔用1ml注射器进行心尖取血，血液放入含有抗凝剂的采血管中，4℃、3000rpm离心15min，取上清。取血后对小鼠腹侧面拍照。快速摘取其肝脏，拍照后称重。取肝脏肝大叶部分进行甲醛固定和冰冻(OCT)包埋，用于观察实验小鼠肝脏病理性变化，剩余肝脏组织用于Western Blot实验和RT-PCR实验。打开小鼠腹腔取出所有附睾脂肪，拍照称重。

二、实验结果

1、成功的构建了肝特异性CREBZF敲除的小鼠

肝特异性CREBZF敲除的小鼠的构建过程如前文和图1(A)所示。肝特异性敲除CREBZF的小鼠的鉴定结果如图1(B)所示。使用引物SEQ ID NO:3和4进行PCR，分别产生的目的片段是248bp(野生型)和318bp(含有Flox位点的CREBZF基因型小鼠)，鉴定Alb-Cre的目标片段大小为100bp。使用引物SEQ ID NO:5和6进行PCR分别产生的目的片段是157bp(野生型)和285bp(含有Flox位点的CREBZF基因型小鼠)。

2、CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠可以减缓饮食诱导的小鼠体重增加

采用年龄匹配的八周龄小鼠(CREBZF WT和CREBZF LKO)进行实验，按照分组分别给予普通正常饮食(Chow Diet)和高脂高蔗糖饲料饮食(HFHSDiet)喂养。实验四个月后测定各组小鼠的体重。结果发现实验组CREBZF肝特异性敲除小鼠可以减缓高脂高糖饮食诱导的体重增加(图2，A)。实验过程中，每周对小鼠体重进行测定，在正常饮食情况下，CREBZFLKO小鼠和CREBZF WT小鼠的体重没有明显区别；在HFHS喂养情况下CREBZF LKO小鼠的体重的生长曲线明显低于对照组(图2，B)。同时我们采用核磁共振体成分分析仪(NMR)对各组小鼠的每只小鼠的脂肪量，瘦组织量进行活体分析测试。结果发现CREBZF LKO小鼠在高脂高蔗糖饲料(HFHS Diet)喂养情况下可以显著地降低脂肪量所占的体重比(图2，C)。这说明肝脏特异性敲除的小鼠可以减缓饮食诱导的小鼠体重增加，同时也能减少体脂含量。同时我们在实验期间，每周对小鼠进食量进行测定和计算，结果显示实验组和对照组的小鼠进食量没有显著性差异(结果未显示在图中)，说明实验组小鼠体重的差异并不是由于进食量引起的。

3、CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠改善高脂高糖饮食诱导的小鼠肝脏脂肪沉积，降低小鼠血清和肝脏中甘油三酯和胆固醇水平

首先，我们把经过4％多聚甲醛48h固定的肝脏组织进行石蜡包埋切片，然后用苏木精-伊红染色(HE染色)观察小鼠肝脏病理变化。HE染色结果显示，在正常饮食喂养的情况下，小鼠肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布，且肝细胞细胞中无明显的脂肪堆积，细胞核清晰，胞浆均匀等，并且实验组和对照组没有显著性差别(图3，A)。在高脂喂养的情况下，对照组小鼠(CREBZF WT)的HE切片中肝脏肝索结构不明显，肝细胞中出现大量空泡(脂滴)，但是实验组小鼠(CREBZF LKO)肝细胞空泡明显少于对照组，肝细胞中脂滴堆积的情况得到明显改善(图3，A)。通过观察脂滴的数量与大小可以看出，实验组小鼠(CREBZF LKO)在高脂高糖饮食情况下可以显著的降低肝脏脂肪沉积。同时我们也通过对OCT包埋的肝组织进行肝脏冰冻切片，之后对切片进行油红染色(Oil Red staining)，得到了相同的实验结果(图3，A)。所有实验结果都是观察大于8只不同小鼠的切片得出。

其次，我们利用甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)检测试剂盒对小鼠肝脏和血清中的甘油三酯和总胆固醇进行测定。结果显示，在正常饮食(Chow Diet)喂养下，实验组小鼠和对照组小鼠肝脏和血清中甘油三酯和胆固醇水平没有显著性差异，但是在高脂高糖饮食诱导的小鼠模型中，CREBZF LKO组小鼠肝脏和血清中甘油三酯水平与对照组相比均显著降低(P<0.05)(图3，B、C)。同时我们也发现CREBZF LKO组小鼠肝脏和血清中总胆固醇水平与对照组相比均显著降低(P<0.05)(图3，B、C)。由此说明，在肝脏中特异性敲除CREBZF的情况下可以改善由高脂高糖饮食诱导的小鼠肝脏脂肪沉积，降低小鼠血清和肝脏中甘油三酯和胆固醇水平。

4、CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠对高脂高糖饮食诱导肥胖小鼠血糖以及葡萄糖的耐受性的影响

以上实验证明，CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠对高脂高糖饮食诱导的肥胖小鼠腹部和肝脏中脂肪沉积、肝脏和血清甘油三酯水平和胆固醇水平有显著的改善作用。同时我们也测定了各组小鼠对高脂高糖饮食诱导的肥胖的血糖以及葡萄糖的耐受性情况。

在饮食诱导实验处理三月后，我们对各组小鼠禁食16h，测定其空腹血糖。结果发现，在正常饮食情况下实验组和对照组小鼠血糖没有显著性变化(图4，A)。在HFHS饮食诱导的情况下实验组小鼠(CREBZF LKO)空腹血糖与对照组小鼠(CREBZF WT)相比显著降低(P<0.05)(图4，A)，同时通过对小鼠进行葡萄糖耐受实验(GTT)，实验结果表明在正常饮食情况下实验组和对照组小鼠葡萄糖耐受性没有显著性变化(图4，B)。在HFHS饮食诱导的情况下实验组小鼠葡萄糖耐受性相比对照组显著增加(P<0.05)(图4，B、C，这说明在肝脏中特异性敲除CREBZF可以显著改善由高脂高糖饮食诱导的葡萄糖耐受性降低的表型。这些结果证明，肝脏中特异性敲除CREBZF不仅可以改善高脂高糖饮食诱导的高血脂，而且也可以起到调节血糖稳态的作用。

5、CREBZF肝脏特异性敲除的小鼠对高脂高糖饮食诱导肥胖小鼠脂质相关基因的影响

为了研究CREBZF肝脏特异性敲除对改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠代谢的分子机制，我们提取小鼠肝脏组织蛋白进行Western Blot测试分析，同时提取肝组织RNA，反转得到cDNA，进行RT-PCR实验。如图5(A)所示，CREBZF肝脏特异性敲除组在喂养高脂高糖(HFHS)时激活形式的N-SREBP-1(SterolRegulatory Element Binding Proteins1)表达量显著降低，同时它调控脂肪生成的下游基因脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FAS)的表达也显著减少。该结果表明CREBZF肝脏特异性敲除之后可以通过降低脂肪酸合成而降低脂肪肝。另外，我们也通过RT-PCR检测发现，肝脏中CREBZF效率可以达到80％，在肝脏特异性敲除CREBZF之后，可以显著性的增加Insig-2a的mRNA的水平(P<0.05)(图5，B)，这也导致了SREBP-1c的mRNA的水平的显著减少(P<0.05)(图5，C)。同时我们也检测了脂肪酸和甘油三酯合成相关的关键基因的mRNA的水平，包括ACLY、ACC1、FAS、SCD1、GPAT1、DGAT和DGAT2，结果表明在肝脏特异性敲除CREBZF之后这些关键基因的mRNA的水平都显著性降低(P<0.05)(图5，D)。这些结果表明，在肝脏中特异性敲除CREBZF可以降低HFHS饮食诱导的脂肪肝以及降低脂肪酸合成相关基因的表达，这可能是通过增加Insig-2a的表达水平来抑制肝脂肪的生成。

三、讨论

本文首次成功构建了肝特异性敲除CREBZF的小鼠，这为之后更好的进行CREBZF在体内生物学功能研究起到了非常关键的作用，尤其是在研究胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢综合征模型的研究中起到非常重要的作用。利用该肝特异性敲除CREBZF的小鼠，本文发现了碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子CREBZF在营养过剩引起的代谢性疾病中的作用。在本文之前，关于CREBZF的研究主要集中在其转录调控方面的分子调控机制，及其在生长和增殖方面的作用，而本文通过首次构建得到的肝特异性敲除的CREBZF小鼠模型研究其在代谢调控方面的作用和机制，为其在代谢方面进行更加深入的研究提供了新的思路。

本文发现肝脏特异性敲除CREBZF显著的减缓高脂高糖饮食诱导的小鼠体重增加，降低血糖血脂，改善小鼠肝脏脂肪沉积，增加葡萄糖耐受性，同时肝脏病理切片也表明肝脏特异性敲除CREBZF显著的减缓肝细胞脂质堆积。并且还发现肝脏特异性敲除CREBZF可以通过增加Insig-2a的mRNA的水平和降低脂质合成相关基因SREBP-1的水平，同时CREBZF肝脏特异性敲除喂养高脂高糖(HFHS)组的激活形式是N-SREBP-1(Sterol Regulatory ElementBindingProteins1)表达量显著降低，它调控脂肪生成的下游基因脂肪酸合成酶(fattyacid synthase,FAS)的表达也显著减少，这说明敲除CREBZF可以通过抑制脂肪酸从头合成来降低脂肪肝。

在敲除肝脏CREBZF情况下，除了能够达到降糖的目的，同时它也附带其他改善代谢的作用。因而通过肝脏靶向抑制CREBZF有望获得具有“GlucosePlus”功效的降糖药。因此，可以CREBZF作为药物靶点，研究出降糖的药物，它将除了能够单纯的降糖之外，同时它还能够改善代谢，这种药物的应用前景会很大。另外，通过肝脏到脂肪组织的作用，具有高效减肥的效果。目前在肥胖的病人当中，单纯针对脂肪组织的降脂，效果并不明显。本文的实验结果表明，在在肝脏中特异性的敲低CREBZF，能够显著的降低小鼠体脂含量，这种通过肝脏进而靶向到脂肪的作用，从一定程度上来说，达到了高效降脂的作用。

根据本文的研究结果，可针对CREBZF设计出特异性的药物靶点，以CREBZF作为分子靶标，设计小分子药物来抑制其活性或者表达水平，从而使之成为预防和辅助治疗过量饮食引起的代谢性疾病的一种新药。另外也可以通过CREBZF的活性或表达水平作为分子靶标来筛选现有的药物，从众多未知分子机制的潜在治疗药物中筛选出一种能够更好的治疗胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢综合征的药物。在临床诊断方面，对待胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血脂症、肥胖和脂肪肝等代谢综合征的病人，肝脏中CREBZF的临床水平可以作为判断其病程发展的一个潜在分子指标，同时也可以开发出CREBZF相关的检测试剂盒，通过试剂盒快速检测CREBZF的水平，衡量其水平的高低，作为其病症判断的一个备选指标。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> CREBZF在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用

<130> 174385

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

tcatctcacc ttgctcctgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

aaggcgatag aaggcgatgc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gcttgcagtt tagagagaaa cagc 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

cagccagagt atcgcgagat tc 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ttgacaataa gtattgaggc atgcg 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

tttccaactt ctcaagtggt gaac 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gcggtctggc agtaaaaact atc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

gtgaaacagc attgctgtca ctt 23

<210> 9

<211> 12745

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 含CREBZF基因、LoxP位点和Frt-Neo-Frt位点和两侧同源臂的序列

<400> 9

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 60

taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtacgcggcc 120

gcattctggt accatttaaa tagtcttggc cccttctgat ctttctgccc ctcataattt 180

gtgggtcatt ggtaaatgga aaaacaaaca tgaaatgagc actttggtct ttgtaatata 240

tgcacccttc tttctgtact gaaaccgctt aagtgtgact cagctgcact ctctgctctc 300

tgggatctga ttacctgcct tagcaaatgc atcaatgtag ccactgtggt ctttatggac 360

gatctgctac attggcatta accattggcg tcaattcccc ttctaacctt gggggtcctg 420

cattgtaaat gtaaaagtga aagcaagcaa gcaagccaac acacccacaa aagcaaagtg 480

catttgccag attcctcgct ggctacagcg gtttggaagg ctcagtgaag taggggccct 540

aatagaacag tgttagagtg tcttcttgag tgccttactt ctccacctac atcataaatg 600

gctttgctgc atcctttctg gtcacttggg ccatttgctc tgggcactga aagccctatg 660

tcatataggt actcttgcaa ttatttggtg agtcccacaa tggggaagaa caagtgtctc 720

ctgacgccca gccggttggc ttatgagaat gaaccccctc acaggtgtac catcaagccc 780

cagtcaaacc tttgggtctt tccccatatc tgactaaact ccatgagaat accagagtca 840

tattgctgat ccccttacac acacacacac acacacacca tatttgggct tttcacatct 900

cacagtttta ccacatggct gctataatca gtgacaaaaa ctcagcttaa aacaacagaa 960

atgaattgcc tccattccag aagctaaact cagaaatcaa gctgtaggca aggctgtgct 1020

aactcccatg gctgctgggt agacttcttt ctagactcag tctcttcttg tttgctggca 1080

acttttagca cttttggctt acaaacacga tgccccagtt atctagtcag gttctcccca 1140

ctgtatttct gtattgcctc accatgtgtc tttttcactg tttgcctctg cttcctcctc 1200

tctcctactc tttcttctct ttttcttcct cttcctgccc cccgcccccc ctttctttga 1260

tagtcatgta gtctaggttg gctttaaatt tgctatataa ccaagtctgg tcctggagtt 1320

ttggtgtctc tgccttaagc ctttccatgc aggatttcag gtgtgcccta ccatgcccca 1380

tttatatgat tctgaagatc aaacaaaggg cgatgccgct gctagagaag ggctttacca 1440

gctaagtccc agatctcaaa agtgttttta tttttatttt catatttaaa gtttttatta 1500

caaatgaaag actttgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgat atgcatgggg 1560

gagttgcctg tgttacagtg tgcaggcaaa ggtcaaggaa caactttgca tggttggttc 1620

tctcctttta ccttcatgtg gttttggggg attggacagt cactcagctt gtacagcaag 1680

actctttacc tgctgagtga tgttgccatc cttacccttg caacttttta attatataag 1740

gacactagtc atacgtgttc accataacaa ccctatttca agtgtattag ctttgtaaaa 1800

ttcccatttt tcatgtaggg ttgagggatt agaaaggatg gagccacgtc cttaacaact 1860

attaccttcc tcataaccag ctgaagtctt cttagagtcc atcaagtttt gataccatct 1920

tcgtctttta gtttcccaaa tgaaaatttt atatatacat atctcagaga ggcattcaca 1980

gtcttctcca aactgagaag tctattgtta aaggactgaa tatctcacag gaaaaaaaaa 2040

aagaaaaaaa aaaagaaaga aaaagaaaag attgtgttat gggaaaacaa agaatgctaa 2100

caaagaaaat attgatctgc tgcctgccat tcattgattt tcatgttgta ttgcttgctt 2160

gctacaaact gaaaaggatt gtaatgacag tcagagtgcc catgatgttc ttgtgcatgt 2220

ataatcacat tcttagttcg tttgccgata tcacggatgc tgagatgtct gttgcacact 2280

atttctcttc tgtggctcat ttgtcttcct ttcagagtac ccactttgga tttcagctta 2340

aataactcct taggaaacac tttcctgatc atcctggtct tttatttgcc agatataatt 2400

cttgtttcag aagcttactg tttaataaac tcaccctttc taggtctttc tgaactctgg 2460

cttgctgttt aaatcccact gttctggccc aaactcttct ccaagctgac ggactagaac 2520

tggtttcttt cagcttctca ctgaattgct cttcttggct ttaaactaac tctggcaatc 2580

tgttctaatc ttctggttcc ttcccatttt ctggctcatc tgcaacctgt ctctctaaaa 2640

ctgtaccagc aaaactgcct cctctctttc gctctgtgct gctcttttac gttcctgtgc 2700

tattttcgtg agagttggag gtattctatc tctgacctac tctgtcagat attcctctga 2760

ttcatcactt tgtctgccac tcaattagac atcattttca aacatggcca cacaaaatta 2820

gtgtgtgttt atcctggaag agttaaaagt aattaaatgt gtaggaggca cggaaatcct 2880

tgtgctcaca gataagcatt agaggaacca gaaatattaa acacacattg ttgtctcttc 2940

aaagagacac cacccagaaa gctgggagca aaaatagcct ggtaacattt actctgtgtg 3000

gcagagacta caactgatcc tcctctagac ccttattttg agcttatttt tttctgtcaa 3060

tctataaaat ccatgtggtg gtttgaatgt gcttggatca gggattggta atattaggag 3120

atgtggcatt ggtagagtag gggtagcctt gttggaagag gcctgttgaa agaaaatgag 3180

attttgtatc ttgtgattca tgtaaaagag ttgtctatga gcccactgcc tggggccaag 3240

aacaaagcag aacagacagg gctgttgtta agacattcct aagaacagct tgattgtaca 3300

agcagggcta tcttgtctgg gccaacacca cctggccgga acctcccctc tgtctactgc 3360

cccttgatgc ctggtaaagt catacatcaa ctgactgcta tgtgaacaaa gataagcccc 3420

cagcccacag gaacaaggtc ctgatgccct tttgctgaca tgtaatcttt ctgttaatgt 3480

ttgaataagc caatagtgtg tcactatgct gaattccaca cccctaagcc ccttacccca 3540

taaaaacccc tagctttcaa gcctcgtggc cgacatctgt tatctcctgt gtgagataca 3600

tgtcggtcca gagctccgta attaaacgtc ctcatgtatt tacatcaaga tgatggtcct 3660

tcgtgatttt ttgggtgcac accgaatcgg gaattgggtg ggggtttccc cactaggtct 3720

aacactgtca gtgtcagagt gggctttgag acactccagc ctgcctgggg aactcggagt 3780

tccttccata gaggaaatgg accctgcctg gattctgctc tgcttctgtg atgataatgg 3840

actgaacctc tgaaagtgta agccagcccc agttaaatgt tgtccttata agagttgcct 3900

tggagctggg cggtggtggt gcatgccttt aatcccagca ctcaggaggc agagacaggc 3960

cagcctggtc tacaaagtga gtttcaggac agccagggct atacagagaa accttgtctt 4020

gaaaaacaaa acaaaacaaa acaaaacaaa acaaaacaaa acaaaacaaa acaagagttg 4080

ccttggtcat gctgtccctt cacagcaatg gaaaccctaa ttaagacatt tgtctttatg 4140

gaagatgtca tgcatacttt tacacagagt ttcatggtgg tcaggtcata ttgctgcata 4200

ctctcgatta tcagcaggaa actcttccac caaactgtgc tttgcttaaa aatgcctaaa 4260

attgggctgg tgagatggct cagtgggtaa gagcacccaa ctgctcttcc gaaggtcagg 4320

agttcaaatc ccagcaacca catggtggct cacaaccatc cgtaatgaga tctgactccc 4380

tcttctggag tgtctgagga cagctacagt gtacttacat ataataaata ataaataaat 4440

ctaaaaaaat aaaataaaat aaaatgattt aaaaaaaatg cctaaaatta agaactctgg 4500

gatcatactc ttgaagtttg aatcaacact ggctactcag tgtgttaaac tgaattacat 4560

tactttgttt gtcctggtgg ttgcagaagc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 4620

cccccccccc ccccgcacta ttggcccaat gtgtagtgag gcttaaaaga attcgttaca 4680

tcagtgctat gtgcatgaac tcattgaata aaaagtgaag tgttttgttc aagacttggt 4740

cttttcaaaa agctggtatt ttaaaaacgg aaaaagccta agtaactacc atgacttgac 4800

aaaagaaaaa aaaagcagaa aacaaacagc aaaacaagag accagtaaac aaaccaacca 4860

cccactcttg gcaaaggagc taattctgca agtgaccctt attgcaaaaa caaatgataa 4920

ataaaaatga tgtaataatg acaataatag cagtaatagt attatgaaag atcattttct 4980

gagactaagg acctctgaat gtcgcctggg gagttagtgt cagtacgtga ctgcgttccc 5040

cagaatttgg taacacttct gatttaaagt cttttgtttt aacggggact atttccttat 5100

gcgtgctgtt ttttgcttgc agtttagaga gaaacagcaa aaataaaagc gttcacaaaa 5160

acagtttttt tttaatatag ctacgtcaaa tatgtctaga tgtcatattg gatcgaggag 5220

agtggtaccg ggtagtaccg atgagtgggg ggggggtgga aactaggttt tattgtgttt 5280

tgcctgctgc tcctatgaca tcaccgcaaa gcgtgcacgt cgacacgtat aacttcgtat 5340

agcatacatt atacgaagtt attactgcgt acgagcatcg atcgaagtta ctgcacctcg 5400

aaagcactcg gaatctcgcg atactctggc tggagcgaag cgcgtttttg tgggcggggt 5460

gggcagagag taacttccgg ccaggccgct gtctgggtgg cgcggccgag tcctcccccg 5520

ggcctcgccg cttcgcgctt ccactgcctt ccccccgcct cgtgcggggg gttgggcggc 5580

cgccggaggc cactcggacc ttgccccgcg cctgcggtcg gcccggcgcc gtggctctgc 5640

gcgctggggg cccggggtcg gagtggctgc ggcctacccg ggcccgccgc tcagccccat 5700

gaggcacagc ctgaccaagc tgctggcagc ctcgggccgc gacttcccga gccgccgcga 5760

cagccgggag ccgcccgcca cgcgcgcgcc gccccgggag ccgagcgggg cagccgcggg 5820

ggcggagacc ccgaggcccg gatcgcctga ccgcgagcaa cctcacgggg acggggacgg 5880

gggcgagccg gaggcccgga gcgggagccg cggcagcgtg gccgtgcgcg cgcccgcgcc 5940

ctcgcccctg aagatggagg aggaggagga ggacgcgatc gccatggtcc ccaaggaaga 6000

gccggaggac atggactttc tctccgggct ggagctggcc gatctgctgg accctcggca 6060

accggactgg cacctggagc ccgggctcag ctcgcccggg cccctgtcct cgtccggcgg 6120

aggctcggag agcggcggcc tgttgagggg ggacgacgac gacgacaccg cggccgccga 6180

gatgcagcgc ttctccgact tgctgcagag gctgttgaac ggcatcggag gctgcagcag 6240

cggcggtgac cgcggcggcg gggagaagag gcggagaaag tccccgggag caggaggcgg 6300

tggcgccaac gacggcaacc aggcggcgac caagagtccc cggaaggcgg cggcggccgc 6360

tgcccgtctt aatcggctca agaagaagga gtacgtgatg gggctggaga gtcgggtccg 6420

gggactggca gccgagaacc aggagctgcg ggccgagaat cgggagctgg gcaagcgcgt 6480

gcaagcactg caggaggaga gtcgctacct acgggccgtc ctggccaacg agaccggact 6540

agctcgcctg ctgagccgac tgagcggcgt gggactgcgg ctgaccacct ccctcttcag 6600

agactcgccc gccggcgacc acgactacgc cctgccggtg gggaagcagc cgccggagcc 6660

gcgggaagag gacgacgcgg cgggaggagt gtgtctccat gtggacaagg ataaggtgtc 6720

ggtggagttc tgctcggcgt gcgctcggaa ggcgtcgtcg tctcttaaaa tgtagggtca 6780

agtaatctgc tctttatccg cgtttacccc tttctcctcc cttacaccat gtcaaacacc 6840

ttagtgggac atcgtcaccg gacgcatttc agaggcggaa aaaaaagtaa tattaaatct 6900

tttaagtgtt tagctaaaag catgaatgtg acactgtaac caactcctaa tgataacctg 6960

tgactattaa atctctctga cagtttcttt tttaggtgat ttccttcctg ccaggctccg 7020

ttgtaggggt tacagagcag tcgttcccgc ctcacaacct ggtaaggatc catctcttcc 7080

cgtaacgctc atgctcggct gcttaggcta ctttaatggg cagacatctc aatgtgtgtg 7140

tgtgtgtgat atctttttct gtttgttttt ctttttgaaa ggtggtggga ggggaatctt 7200

aatttgggcc ttgtccaccc tggaaacaga cttgtgctgg tcattaatgt acttaagttg 7260

cttctggttg aaatagctgt taaatgtgtc cccttgttca gagttgcgtg tacctagctc 7320

ttctgtcccc agtgtggaca tggccttgga tgacatcggt tccaactgta cacagaaacc 7380

tgctaataga gatacagttt ggagacagtc aaacaggtga agttgaatgg aagttccgag 7440

ttgtacaagg tgcaaattgg aattccaatt gtagagcaac ttttcagagg ttgacaataa 7500

gtattgaggc atgcgcgata tcgaattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 7560

ttcaggtctg aagaggagtt tacgtccagc caagctagct tggctgcagg tcgtcgaaat 7620

tctaccgggt aggggaggcg cttttcccaa ggcagtctgg agcatgcgct ttagcagccc 7680

cgctgggcac ttggcgctac acaagtggcc tctggcctcg cacacattcc acatccaccg 7740

gtaggcgcca accggctccg ttctttggtg gccccttcgc gccaccttct actcctcccc 7800

tagtcaggaa gttccccccc gccccgcagc tcgcgtcgtg caggacgtga caaatggaag 7860

tagcacgtct cactagtctc gtgcagatgg acagcaccgc tgagcaatgg aagcgggtag 7920

gcctttgggg cagcggccaa tagcagcttt gctccttcgc tttctgggct cagaggctgg 7980

gaaggggtgg gtccgggggc gggctcaggg gcgggctcag gggcggggcg ggcgcccgaa 8040

ggtcctccgg aggcccggca ttctgcacgc ttcaaaagcg cacgtctgcc gcgctgttct 8100

cctcttcctc atctccgggc ctttcgacct gcagcctgtt gacaattaat catcggcata 8160

gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatgggat cggccattga 8220

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 8280

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 8340

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 8400

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 8460

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 8520

gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 8580

gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 8640

agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 8700

ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgatga 8760

tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt 8820

ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 8880

ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 8940

ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 9000

cttctgaggg gatcaattct ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 9060

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 9120

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 9180

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 9240

gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 9300

gactagagct tgcggaaccc ttcccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 9360

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 9420

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 9480

gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tcgactagag cttgcggaac 9540

ccttcgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttca tcagtcaggt acataatata 9600

acttcgtata gcatacatta tacgaagtta ttaggtggat ccactaggcg cgcccctagg 9660

aaatgtggta tttttctgga gatgacaagt ctcctaaaat acttaatgaa tgccttatag 9720

ttttcagtag aaaatgcaga aatacagtct atttaaagac cctaatagtt caccacttga 9780

gaagttggaa attaacatac ccatcagatt tctgtgtttt aattagaaga cgataaatga 9840

aatgtttctt tgaggaccag cacagtaatt actaatcaat gagtatgaag aaattgttga 9900

aagtatttat ttttgttgta ttaaaattta ggctaaattt ctgtatgatt agatattgaa 9960

ggttgtgaaa tgtgaatgaa aacatgtaaa gtgaggcttc acaaagaatc ttttctccat 10020

atttctaaaa cttttgtcct atttaaaaat acttgtttaa attaatgaaa tgatcgatac 10080

tgtttttcca aagacggaaa agtctttcct taaaatactg tttttttgtc cacttgtctt 10140

aagtgtgtgt tctgatgctc tgaaatgcaa gagacattaa attctttgtg aaacatcact 10200

gtttgataaa ggatatacgt atttagcatc cttgtttttc tttgtgctaa agtggataca 10260

gctgttgggg cagaagagac gggaccagct gctggccaca tttcctgctt tattttaaaa 10320

ggtagtataa gaaataagga aacagaggta atatcagggc ttctgctgtc ttttattttt 10380

aaaatgttca taattaagta ttttccagca gtccaaagat gtaagttatc ctacacgtaa 10440

gatgttttat tttgttactt ggttatggaa atggaatctt gttcttgcac aactgtaaat 10500

gttttgttgc tagataatat gattttgaga cctaaattag tctctggttt ttcagtctat 10560

cacattttgt aaaaatctct actgcacttg agcatgaatg ggtagtagcc aaactcacaa 10620

cttggagtga cggacctgct tctacaaggg taggatacaa gccccacaat gcagctgcat 10680

ggatttcagt gcctatgaat tatatatata tatatataca tagatataga aaccaaaagt 10740

agttggaaat ttatttgaaa tgactaattt gtgctctttc tgaagtatgt taaatgtagc 10800

ttttgaaaca gaagccttga attgaaattt aatacttgaa catttttgta tatatttctt 10860

tgtatataat tttgtgcaga accaatgaca aacatatggt gtcataataa aatcaggttt 10920

gttgatcttt cagttatggg ctcaaagaat ttattcatct ctaacatgat attggaaagt 10980

aatggatgaa aataggaaaa atggttgtta atatagactt aatcgaaagg ttctggaagt 11040

agtaagtttg ttttcctaaa aactatacca tttctgtgga atattttctt aacctcagtg 11100

cttttcctgc atttgaagtg tgggcttggg gaaaattagt ttctgaattg ggatgttttg 11160

aaattccaag tacagagtct taggctgtca tttcataaat ggcagtttgg agaattagga 11220

attctcaaca gtggaagatc agagtgtcct gtttttaaag ctgctttctt aggttcctta 11280

tgtcttatta actgtgtttt tgtttccatt tcattgtttt tttctagttt tggtgacagt 11340

gatttttgtc attttttttg catcaactca tggtcttgtt tttacatggt aactgcatgt 11400

atgtaggatc tatcaggggc tttaaataaa ttttgctcat atttatgtgt aagcacattt 11460

tactgtaaat gtttgggttt aatttacagc agttgtttat ttcagtgtgt agtaaacagt 11520

atctagagtg ttctgttcac tacttgttaa ttaaaaaagt tatgattaat ataaaactgt 11580

tgtcttacta tttttagaaa acttttgtga ataattagta ttttgataga gagttctgaa 11640

atacaaaata gattgctttg aaaatttcag gtttgggtgt atttactgtg atgttgagaa 11700

caatttagta tttggggaac tgtttcaggt tttattcttg atttgtacct gtgtaaaaat 11760

gatagaaaac cttaaaatgt agcttttaaa tacctgtctt cctatggtag ttaatattca 11820

tacattaatt gactaacaca tattggcata gtatttctat catagtagct taagtttttg 11880

tccttttttt aaccatactt aaaagtatgt ttgttaaaaa atgtagtcac acctctgata 11940

tatccaacaa agtattcaaa atattttaaa tatctgtaca tttcatactc gctaaattaa 12000

tctctttctc ttctctttaa acagcttagc agtatctgca aaaacgaatc ttttcctaca 12060

acctgttaac tgactggact gatggtaaca gtaattgtgg gagccatgtc ggtcaaaaat 12120

ttggcatctg ctgaaagaca tgaatgccat ttccaaggtc ccaaattact tctatactga 12180

ttacactttc cagaaatgga gatatgaaaa gattctctgg aatgcttgaa agacttaata 12240

gaaacccatg agactaagtt aattttggaa caaaattaca cctctttttt ttcattcatg 12300

gcaattaaca ctaaatttat cgtatacttt aaaaaatggt aaccattgga gaagagaatt 12360

ctagagtttc atcaagaaac attaggtttt acacaatcaa ggacactttg tggaattaga 12420

cttagtgggt tagaatgaca caagtgagct agcagtgatc acaaacctca tgagtttgta 12480

ttctgggatg gaaagagctg ctttggaaga cagacacgtt gctgagtaga ataaagtcct 12540

taactaaaag attagtgtct taaaatagat gcattgattg tgtgttttga aaaggtgatt 12600

ctgataacgt gtgggtgcta attcagggca tcatgagcgt gtgagcaatc ctggggtttg 12660

gcctaggatc gcccgggttg attcgaggct gctaacaaat cgagcagtgt ggttttcaag 12720

aggaagcaaa aagcctctcc accca 12745

<210> 10

<211> 6892

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pGL3-basic-mCREBZF-LUC的序列

<400> 10

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcctcc cctctgtcta ctgccccttg atgcctggta 60

aagtcataca tcaactgact gctatgtgaa caaagataag cccccagccc acaggaacaa 120

ggtcctgatg cccttttgct gacatgtaat ctttctgtta atgtttgaat aagccaatag 180

tgtgtcacta tgctgaattc cacaccccta agccccttac cccataaaaa cccctagctt 240

tcaagcctcg tggccgacat ctgttatctc ctgtgtgaga tacatgtcgg tccagagctc 300

cgtaattaaa cgtcctcatg tatttacatc aagatgatgg tccttcgtga ttttttgggt 360

gcacaccgaa tcgggaattg ggtgggggtt tccccactag gtctaacact gtcagtgtca 420

gagtgggctt tgagacactc cagcctgcct ggggaactcg gagttccttc catagaggaa 480

atggaccctg cctggattct gctctgcttc tgtgatgata atggactgaa cctctgaaag 540

tgtaagccag ccccagttaa atgttgtcct tataagagtt gccttggagc tgggcggtgg 600

tggtgcatgc ctttaatccc agcactcagg aggcagagac aggccagcct ggtctacaaa 660

gtgagtttca ggacagccag ggctatacag agaaaccttg tcttgaaaaa caaaacaaaa 720

caaaacaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa caaaacaaga gttgccttgg tcatgctgtc 780

ccttcacagc aatggaaacc ctaattaaga catttgtctt tatggaagat gtcatgcata 840

cttttacaca gagtttcatg gtggtcaggt catattgctg catactctcg attatcagca 900

ggaaactctt ccaccaaact gtgctttgct taaaaatgcc taaaattggg ctggtgagat 960

ggctcagtgg gtaagagcac ccaactgctc ttccgaaggt caggagttca aatcccagca 1020

accacatggt ggctcacaac catccgtaat gagatctgac tccctcttct ggagtgtctg 1080

aggacagcta cagtgtactt acatataata aataataaat aaatctaaaa aaataaaata 1140

aaataaaatg atttaaaaaa aatgcctaaa attaagaact ctgggatcat actcttgaag 1200

tttgaatcaa cactggctac tcagtgtgtt aaactgaatt acattacttt gtttgtcctg 1260

gtggttgcag aagccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc ccccccccgc 1320

actattggcc caatgtgtag tgaggcttaa aagaattcgt tacatcagtg ctatgtgcat 1380

gaactcattg aataaaaagt gaagtgtttt gttcaagact tggtcttttc aaaaagctgg 1440

tattttaaaa acggaaaaag cctaagtaac taccatgact tgacaaaaga aaaaaaaagc 1500

agaaaacaaa cagcaaaaca agagaccagt aaacaaacca accacccact cttggcaaag 1560

gagctaattc tgcaagtgac ccttattgca aaaacaaatg ataaataaaa atgatgtaat 1620

aatgacaata atagcagtaa tagtattatg aaagatcatt ttctgagact aaggacctct 1680

gaatgtcgcc tggggagtta gtgtcagtac gtgactgcgt tccccagaat ttggtaacac 1740

ttctgattta aagtcttttg ttttaacggg gactatttcc ttatgcgtgc tgttttttgc 1800

ttgcagttta gagagaaaca gcaaaaataa aagcgttcac aaaaacagtt tttttttaat 1860

atagctacgt caaatatgtc tagatgtcat attggatcga ggagagtggt accgggtagt 1920

accgatgagt gggggggggg tggaaactag gttttattgt gttttgcctg ctgctcctat 1980

gacatcaccg caaagccgaa gttactgcac ctcgaaagca ctcggaatct cgcgatactc 2040

tggctggagc gaagcgcgtt tttgtgggcg gggtgggcag agagtaactt ccggccaggc 2100

cgctgtctgg gtggcgcggc cgagtcaagc ttggcattcc ggtactgttg gtaaagccac 2160

catggaagac gccaaaaaca taaagaaagg cccggcgcca ttctatccgc tggaagatgg 2220

aaccgctgga gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc ctggaacaat 2280

tgcttttaca gatgcacata tcgaggtgga catcacttac gctgagtact tcgaaatgtc 2340

cgttcggttg gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca gaatcgtcgt 2400

atgcagtgaa aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat ttatcggagt 2460

tgcagttgcg cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca gtatgggcat 2520

ttcgcagcct accgtggtgt tcgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt tgaacgtgca 2580

aaaaaagctc ccaatcatcc aaaaaattat tatcatggat tctaaaacgg attaccaggg 2640

atttcagtcg atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta atgaatacga 2700

ttttgtgcca gagtccttcg atagggacaa gacaattgca ctgatcatga actcctctgg 2760

atctactggt ctgcctaaag gtgtcgctct gcctcataga actgcctgcg tgagattctc 2820

gcatgccaga gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga ttttaagtgt 2880

tgttccattc catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga tatgtggatt 2940

tcgagtcgtc ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ctgaggagcc ttcaggatta 3000

caagattcaa agtgcgctgc tggtgccaac cctattctcc ttcttcgcca aaagcactct 3060

gattgacaaa tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctggtggcg ctcccctctc 3120

taaggaagtc ggggaagcgg ttgccaagag gttccatctg ccaggtatca ggcaaggata 3180

tgggctcact gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg ataaaccggg 3240

cgcggtcggt aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg ataccgggaa 3300

aacgctgggc gttaatcaaa gaggcgaact gtgtgtgaga ggtcctatga ttatgtccgg 3360

ttatgtaaac aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat ggctacattc 3420

tggagacata gcttactggg acgaagacga acacttcttc atcgttgacc gcctgaagtc 3480

tctgattaag tacaaaggct atcaggtggc tcccgctgaa ttggaatcca tcttgctcca 3540

acaccccaac atcttcgacg caggtgtcgc aggtcttccc gacgatgacg ccggtgaact 3600

tcccgccgcc gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag agatcgtgga 3660

ttacgtcgcc agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg tgtttgtgga 3720

cgaagtaccg aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag agatcctcat 3780

aaaggccaag aagggcggaa agatcgccgt gtaattctag agtcggggcg gccggccgct 3840

tcgagcagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 3900

aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 3960

ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga 4020

ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtaaaa tcgataagga 4080

tccgtcgacc gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg 4140

gcatgactat cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg 4200

tgccggcagc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 4260

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 4320

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 4380

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4440

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4500

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4560

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 4620

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4680

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4740

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 4800

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 4860

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 4920

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 4980

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5040

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 5100

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 5160

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 5220

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 5280

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 5340

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 5400

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 5460

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 5520

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 5580

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 5640

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 5700

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 5760

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 5820

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 5880

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 5940

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 6000

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 6060

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 6120

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 6180

gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 6240

gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 6300

gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 6360

tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 6420

ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 6480

atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 6540

aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 6600

tgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 6660

ctattacgcc agcccaagct accatgataa gtaagtaata ttaaggtacg ggaggtactt 6720

ggagcggccg caataaaata tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg 6780

aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa 6840

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Claims

1.以下试剂在制备减缓对象体重增加，降低对象血糖血脂，改善对象肝脏脂肪沉积，增加对象葡萄糖耐受性，和/或减缓对象肝细胞脂质堆积的药物中的用途：

(1)减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂；和/或

(2)降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述对象的体重增加、高血糖、高血脂、肝脏脂肪沉积、低葡萄糖耐受性和/或肝细胞脂质堆积由该对象的高脂高糖饮食所致；和/或

所述药物用于降低糖尿病、心血管疾病、肥胖和/或脂肪肝的发病机率或治疗这些代谢性疾病。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述减少对象CREBZF蛋白的表达的试剂为抑制CREBZF基因表达或降低其表达水平的试剂，优选选自：

(a)抑制该CREBZF基因转录活性的试剂；

(b)抑制该CREBZF mRNA的转录水平的试剂；

(c)促进该CREBZF mRNA降解的试剂；

(d)针对该CREBZF基因的siRNA；

(e)抑制CREBZF mRNA的翻译的试剂；

(g)用于部分或全部敲除CREBZF基因的试剂；和

所述降低对象所表达的CREBZF蛋白的活性的试剂为CREBZF蛋白的特异性抗体或具有抑制该CREBZF蛋白的活性的小分子化合物。

4.一种核酸序列，选自：

(1)含有CREBZF基因、LoxP位点和Frt-Neo-Frt位点的核酸序列；和

(2)(1)所述序列的互补序列。

5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，

所述核酸序列从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点；或

所述核酸序列还含有同源臂，从5’到3’依次含有同源臂、LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点、LoxP位点和同源臂；

任选地，所述同源臂与LoxP位点之间、LoxP位点与CREBZF基因、Frt位点与LoxP位点之间以及LoxP与同源臂位点之间具有连接序列；

优选地，所述CREBZF基因的序列如SEQ ID NO:9的第5383－7516位碱基序列所示；所述同源臂区域分别如SEQ ID NO:9第142－5312位和第9661－12661位碱基序列所示；所述LoxP位点如SEQ ID NO:9第5329－5362位所示；Frt-Neo-Frt位点如SEQ ID NO:9第7517－7579位碱基序列所示；

优选地，所述核酸序列如SEQ ID NO:9所示，或者为SEQ ID NO:9的互补序列。

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4或5所述的核酸序列；优选地，所述载体为用于同源重组的载体。

7.一种经基因工程改造的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转入了权利要求6所述的载体，并在其基因组中同源重组有从5’到3’依次含有LoxP位点、CREBZF基因、Frt-Neo-Frt位点和LoxP位点的核酸序列。

8.一种构建转基因小鼠的方法，所述方法包括：

(1)提供权利要求6所述的载体；

(3)将步骤(2)获得的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，并将该囊胚转入假孕母鼠，获得雄性嵌合体小鼠；

(5)将步骤(4)获得的带有Flox位点CREBZF的等位基因小鼠与Albumin-Cre或Ella Cre转基因小鼠杂交，得到第一代杂合子小鼠，然后采用杂合子小鼠进行第二代自交，从而获得纯合的敲除小鼠，即所述转基因小鼠；

任选地，所述构建方法还包括使步骤(5)获得的纯合的敲除小鼠与该步骤获得的纯合的对照小鼠交配，从而扩大纯合的敲除小鼠的种群；

其中，所述转基因小鼠的特征是，全身或肝脏不表达CREBZF蛋白、或与对照小鼠相比CREBZF蛋白的表达量降低、或表达无活性的CREBZF蛋白或活性降低的CREBZF蛋白。

9.CREBZF基因或蛋白作为靶点在筛选治疗或预防代谢性疾病的药物中的应用，或在筛选减缓对象体重增加，降低对象血糖血脂，改善对象肝脏脂肪沉积，增加对象葡萄糖耐受性，和/或减缓对象肝细胞脂质堆积的药物中的应用；或

检测CREBZF基因或蛋白的试剂在制备用于诊断代谢性疾病或判断代谢性疾病病程发展的试剂盒中的应用；任选地，所述试剂包括用于检测CREBZF基因的引物和探针，和/或用于检测CREBZF蛋白的特异性抗体。

10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有检测CREBZF基因和/或蛋白的试剂；

任选地，所述试剂包括用于检测CREBZF基因的引物和探针，和/或用于检测CREBZF蛋白的特异性抗体。