CN109355309A - 一种cd3e基因修饰人源化动物模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在BALB/c背景上，通过BAC转基因技术将人源CD3E及其完整的调控序列插入小鼠基因组中，建立hCD3E转基因小鼠模型。该模型适用于结直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及淋巴癌的药物筛选，极大拓展了双特异性抗体的筛选类型。通过优化步骤，极大提高了hCD3E转基因小鼠模型的制备成功率，目前已成功获得了稳定遗传的小鼠line。该line小鼠可实现人源CD3E(hCD3E)及鼠源CD3e(mCD3e)共表达；同时CD3E人源化的小鼠免疫系统健全，为国际及国内市场CD3E‑TCB临床用药物研发提供数据，填补了市场空白。

Description

一种CD3E基因修饰人源化动物模型的构建方法
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于显微注射和转基因技术的CD3E基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
复杂的生物过程通常需要进行体内分析，许多重要的研究进展已经使用小鼠作为研究各种生物系统的模型。由于体内人体生物学的研究受到道德和技术的严重限制，越来越需要动物模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究，而不会使个体处于危险之中。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠或人鼠嵌合体来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。
在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。
通过临床前评估的候选药，超过90％在临床I期失败，其中小鼠与人体内生理、病理等的差异是重要的因素：人鼠免疫系统的差异、许多致病因子和药物在人鼠之间的种系特异性、药物靶点与受体之间在人鼠之间的亲和力差异、人源肿瘤与鼠源肿瘤的差异等都将影响临床前与临床数据的一致性。因此构建具有人的功能性基因、细胞及组织的人源化小鼠模型具有重要意义。随着人源化小鼠的不断完善，可以更好的反应预期临床数据。
近年来，随着肿瘤免疫疗法的兴起，给癌症的治疗带来意想不到的效果。癌细胞在长期进化过程中，其通过表达“Don’t eat me”信号分子以逃避宿主的免疫杀伤，同时肿瘤内的微环境常处于免疫抑制状态。癌症免疫疗法(Cancer Immunotherapy)是通过激活病人体内的免疫应答来对抗癌细胞，重新活化免疫细胞，并通过各种形式的识别与杀伤达到肿瘤抑制的作用。目前免疫治疗抗体在多种肿瘤(黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等实体瘤)中展示出了强大的抗肿瘤活性，并且美国FDA(Food and Drug Administration,FDA)已经批准多个用于临床治疗的抗体药物。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和效应性淋巴细胞之间架起桥梁，激发靶向性免疫反应，这可以使它们在治疗复杂疾病时更加有效，已成为抗体工程领域的开发热点。目前，基于CD3靶点的双特异性抗体(CD3-TCB)在淋巴瘤的抗肿瘤活性方面大放异彩。CD3-TCB特异性识别T细胞上的靶分子CD3，同时又能够识别肿瘤特异性靶点，从而激发T细胞的靶向性免疫反应并带来特异性杀伤。多家制药巨头在跟进此类药物的开发，如安进的上市药物Blinatumomab和罗氏的临床中药物CEA-TCB(RO6958688；RG7802)。以CD19/CD3双特异性抗体blincyto为例，在NOD-SCID上进行hPBMC及人B淋巴瘤细胞(NALM-6B lymphoma)混合物注射，1h后进行bscCD19xCD3药物处理，来评价抗体的抗肿瘤活性。在早期肿瘤阶段给予bscCD19xCD3治疗，可防止B型淋巴细胞癌的生长，并以一种剂量依赖性的方式延长了小鼠的生存期。这种评价体系的缺点是hPBMC重建不充分，重建的免疫细胞多为T cell(＞90％)，这与临床患者往往免疫系统健全是不相符的；hPBMC因受供体差异影响，不同批次之间的稳定性亦较差。
为了克服上述评价系统的缺点，建立一个可直接评价用于临床治疗的双特异性抗体疗效的小鼠模型，我们在BALB/c背景上，通过BAC转基因技术将人源CD3E及其完整的调控序列插入小鼠基因组中，来建立hCD3E转基因小鼠模型。BALB/c小鼠是肿瘤与免疫研究领域中最常用的小鼠品系，可用的同源肿瘤细胞系较多，涵盖了结直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及淋巴癌，极大拓展了双特异性抗体的筛选类型。我们选择BALB/c背景小鼠进行CD3E人源化改造，通过优化改造步骤，极大提高了成功率，目前已成功获得了稳定遗传的小鼠line。该line小鼠可实现人源CD3E(hCD3E)及鼠源CD3e(mCD3e)共表达；同时CD3E人源化的小鼠免疫系统健全。因此，hCD3E小鼠模型可模拟双特异性抗体在复杂的免疫系统下的肿瘤杀伤效果，为国际及国内市场CD3E-TCB临床用药物研发提供数据。目前市场上尚没有适用于CD3E-TCB筛选及评价的小鼠模型，填补了市场空白。
发明内容
本发明提供了一种CD3E基因修饰人源化动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过PCR扩增制备FRT-Neo-FRT片段；
(2)将含有人源CD3E及其调控序列的BAC载体转入大肠杆菌，所述BAC载体中保留了人源CD3E基因的调控区域，保证了人源CD3E表达受人类自身启动子和调控序列控制；
(3)将步骤(1)制备的FRT-Neo-FRT片段电转化入含有步骤(2)所得的大肠杆菌，经鉴定获得含有人源CD3E基因和FRT-Neo-FRT片段的载体hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT；
(4)去除hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT上的Neo基因，进行鉴定确认，获得最终的打靶载体；
(5)采用DNA原核显微注射发法，将构建好的携带人源CD3E序列的打靶载体注射入小鼠受精卵中，移植入受体母鼠生产CD3E基因修饰人源化动物模型。
优选地，其中所述小鼠为BALB/c小鼠。
优选地，其中所述大肠杆菌为EL250或EL350。
优选地，其中步骤(1)具体为：以质粒PL451为模板，高保真酶PCR扩增FRT-Neo-FRT片段，回收定量。
优选地，其中PCR扩增FRT-Neo-FRT片段所使用的引物为：
F：
GCAACTAAAAGTATAGGAACCGCACATTTCAGACCAAGAATTAAATCAGTGGCTGTCCACTGTGGCAACGACGGTATCGATAAGCTTGA(SEQ ID NO：1)；
R：
TAACTGAAAGTAAAGAGAGGACTGCGGGAGTTTGGGACCTTTGTGCAGACGTGCTCATGCTCGTTCGATTATGTACCTGACTGATGAAG(SEQ ID NO：2)。
优选地，其中步骤(2)具体为：
a)将准备好的含有人源CD3E及其调控序列的BAC载体加入已经制备好的电转感受态大肠杆菌中，混匀后转移到预冷的电转杯中，准备另一组1.5ml离心管，作好标记并加入1ml预热的无抗性LB备用；
b)电转仪调至如下参数：1750V，将电转杯外侧擦拭干净，放入电击槽，按下电击按钮，听到轻微的声音响起即可放开，示数应该在5ms左右；
c)吸取准备好的LB将经过电转杯中的菌体冲洗出来，加入准备好的1.5ml离心管中的LB培养液内，30℃振摇1小时，同时将平板放入30℃恒温箱预热；
d)1小时后，直接吸取100μl涂在其中一块平板，将剩下的900μl 6000rpm离心1min后，倒掉多余的上清，留下约100μl重悬菌体，均匀地涂在另一个平板上，作好标记；
e)将平板倒放在30℃恒温箱内培养过夜，从过夜培养的平板中挑取单克隆并进行鉴定，得到含有hCD3E BAC的大肠杆菌备用。
优选地，步骤e)中鉴定克隆时使用的引物为：
1891-AMICA1-3R1 CTCAGCACCTATTTGCCTGGTGC(SEQ ID NO：8)
。
优选地，其中步骤(3)中鉴定时使用的引物为：
优选地，其中步骤(4)中鉴定时使用的引物为
优选地，其中步骤(5)中CD3E基因修饰人源化动物模型通过PCR进行鉴定，使用的引物如下：
本发明还提供上述任一种所述的方法在评估靶向CD3的药物有效性、CD3靶向药物筛选开发、或基于CD3靶点的双特异性抗体的筛选中的应用。
本发明具有以下积极效果：
(1)通过BAC转基因技术构建的CD3E人源化小鼠，其基因组中包含人源CD3E及其完整的调控序列。制作成功的人源化模型的T细胞表面拥有完整的人源CD3E蛋白，参与TCR复合体的组成，参与免疫反应。人源化蛋白可将外部刺激忠实地转化为胞内行为(免疫激活)。由于其蛋白为完全人源化，该小鼠模型忠实的保留了人源CD3E的抗原表位，将适用于人类CD3E靶向的抗体药物研究、筛选及评价。
(2)本小鼠品系的hCD3E是在人类本身启动子及调控序列的控制下表达，最大程度的模拟了人类CD3E蛋白表达及参与免疫系统活性作用，为CD3E-TCB药物筛选评价提供更接近临床的数据参考。
(3)本小鼠品系采用BALB/c小鼠背景。BALB/c小鼠是肿瘤与免疫研究领域中最常用的小鼠品系，可用的同源肿瘤细胞系较多，涵盖了结直肠癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及淋巴癌，极大拓展了可用于双特异性抗体的筛选的肿瘤类型。
(4)本品系小鼠的自身免疫系统健全，无需进行人免疫系统的移植重建，可直接评价用于临床治疗的双特异性抗体疗效的小鼠模型，克服了当前市场上使用模型需要进行免疫重建的障碍。目前无论国内国际，免疫健全的BALB/c-hCD3E模型小鼠为市场唯一。已知国内有一家公司在研，但其研发的CD3E人源化小鼠为C57BL/6背景，可用肿瘤细胞种类较少，且其尚无用于CD3E-TCB药效评价的案例。
(5)本发明提供了优化的制备人源CD3E基因动物模型的具体操作方法，该方法中优化了多个条件，确保了动物模型制备的成功率。
附图说明
图1为hCD3E转基因小鼠打靶策略。
图2为1891-CD3E-BAC-TG final PCR鉴定结果。电泳条带大小：引物1，KI＝2241bp(含有Neo基因片段)引物2，Wt＝443bp(删除Neo基因片段后)。含有443bp条带为正确克隆。
图3为5#，6#克隆质粒酶切鉴定结果。
图4为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物1鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图5为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物2鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图6为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物3鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图7为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物4鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图8为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物5鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图9为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物6鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图10为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物7鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图11为hCD3E BAC TG Founder小鼠使用引物8鉴定结果。B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照。TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。
图12为hCD3E BAC TG小鼠line102#，line105#，line107#外周血mCD3e和hCD3E蛋白表达的检测结果。
图13为BALB/c-hCD3E小鼠体内T/B/NK细胞检测结果。
图14为使用Anti-mCD3e和Anti-hCD3E体外刺激BALB/c-hCD3E小鼠后淋巴细胞的活化指标CD25、CD69检测结果。
图15.BALB/c-hCD3E小鼠对抗体刺激的响应结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：hCD3E小鼠模型的建系
1.hCD3E小鼠模型的建系及评价
我们选取了BAC转基因的方式将人类CD3E基因及其完整的调控序列插入小鼠基因组，来建立hCD3E转基因小鼠模型。BALB/c小鼠是肿瘤与免疫研究领域中最常用的小鼠品系，可用的同源肿瘤细胞系较多。因此，我们以BALB/c为背景鼠，构建了hCD3E转基因小鼠模型并成功获得了2个稳定遗传的line，2个line的小鼠皆可实现人源CD3E(hCD3E)及鼠源CD3e(mCD3e)共表达。
2.方案设计
将包含humanCD3E基因的BAC进行修饰，去除距CD3E约40kb的其它基因，保留了human CD3E基因的调控区域，保证了human CD3E表达受人类自身启动子和调控序列控制。图1显示了hCD3E转基因小鼠打靶策略。
3.hCD3E小鼠转基因BAC的构建
(1)FRT-Neo-FRT片段制备
以PL451含有FRT-Neo-FRT序列，表现为Neo抗性，可作为正筛标记，用于筛选含有hCD3E BAC的阳性质粒。以PL451为模板，高保真酶PCR扩增FRT-Neo-FRT片段，回收定量。
表1.PCR扩增FRT-Neo-FRT序列引物：
(2)将含有hCD3E及其调控序列的RP11-1132M18BAC转入大肠杆菌EL250，具体电转化方法如下：
a)将准备好的RP11-1132M18BAC加入已经制备好的电转感受态中(1.5ml离心管)，混匀后转移到预冷的电转杯中。准备另一组1.5ml离心管，作好标记并加入1ml预热的无抗性LB备用；
b)BTX ECM399电转仪调至如下参数：1750V。将电转杯外侧擦拭干净，放入电击槽，按下电击按钮，听到轻微的声音响起即可放开，示数应该在5ms左右；
c)吸取准备好的LB将经过电转杯中的菌体冲洗出来，加入准备好的1.5ml离心管中的LB培养液内，30℃振摇1小时。同时将平板放入30℃恒温箱预热；
d)1小时后，直接吸取100μl涂在其中一块平板，将剩下的900μl 6000rpm离心1min后，倒掉多余的上清，留下约100μl重悬菌体，均匀地涂在另一个平板上，作好标记；
e)将平板倒放在30℃恒温箱内培养过夜。
从过夜培养的平板中挑取单克隆并进行鉴定，得到含有hCD3E BAC的EL250备用；鉴定方案如下：
表2.hCD3E BAC EL250鉴定引物
引物1扩增获得hCD3E基因5’片段，引物2扩增获得hCD3E基因3’片段，引物3扩增获得hCD3E BAC中AMICA1基因片段，用来鉴定转入CD3E BAC的完整性。扩增结果同时含有条带532bp和443bp为正确克隆。
(3)将(1)制备的FRT-Neo-FRT片段电转化入含有hCD3E BAC的大肠杆菌EL250感受态，电转化方法参照步骤(2)，鉴定方案如下：
表3.CD3E-BAC-FRT-Neo-FRT鉴定引物
引物1、引物2鉴定Neo片段是否正确插入，引物3鉴定是否将AMICA1基因替换完全。PCR鉴定有2241bp且不存443bp的编号为正确克隆。
表4.CD3E-BAC-FRT-Neo-FRT酶切鉴定方案
选取CD3E-BAC-FRT-Neo-FRT含有的酶切位点BamH I，EcoR V，Spe I，Sca I中的至少2个进行酶切验证。当克隆提取质粒进行酶切后，含有该酶对应的条带大小，则为正确克隆。如选用ScaI进行酶切验证时，克隆酶切产物中含有条带54587bp，10209bp，8871bp，5242bp，1082bp为阳性克隆。
(4)Ara250popout(阿拉伯糖诱导后的EL250)去除Neo并进行鉴定确认；
将上一步的CD3E-BAC-FRT-Neo-FRT-EL250菌液接种到新的4ml无抗性LB中，30℃振摇至OD600＝0.3，将10％的阿拉伯糖贮液按1:100的比例加入菌液，继续在30℃振摇1小时。直接吸取100μl涂在Chl抗性的平板上，30℃培养过夜，第二天挑单克隆，鉴定获得的正确去除抗性的载体，命名1891-CD3E-BAC-TG final。
对1891-CD3E-BAC-TG final载体进行PCR及酶切鉴定，经PCR鉴定，5#-6#克隆均为pop正确，选5#，6#克隆提取质粒进行酶切鉴定。结果显示，5#，6#质粒酶切鉴定正确。将5#，6#PCR产物送测序鉴定，结果显示序列正确，确定5#，6#为正确克隆。选6#用于该项目后续胚胎注射。
PCR鉴定及酶切鉴定方案及结果如下：
表5. 1891-CD3E-BAC-TG final载体PCR鉴定引物
图2为1891-CD3E-BAC-TG final PCR鉴定结果。电泳条带大小：引物1，KI＝2241bp(含有Neo基因片段),wt＝447bp(删除Neo基因片段后)；引物2为引物1的备选。引物1扩增后含有447bp条带为正确克隆。同时使用引物3鉴定是否将AMICA1基因完全敲除(保证只转入humam CD3E单基因)，条带为0的为正确克隆。
表6. 1891-CD3E-BAC-TG final酶切鉴定使用限制酶名称及条带大小
图3为5#，6#克隆质粒酶切鉴定结果。
4.CD3E转基因小鼠模型建立
采用DNA原核显微注射发法，将构建好的携带人源序列的1891-CD3E-BAC-TGfinal质粒注射入BALB/c小鼠0.5天受精卵中。将注射后的受精卵移植入0.5天假孕ICR受体鼠的体内，等待小鼠出生。对假孕受体鼠产生的小鼠采取PCR鉴定获得转基因阳性品系。
使用表7中8对引物对获得的Founder小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR扩增分析。引物1、2、3鉴定1891-CD3E-BAC-TG final的完整序列插入小鼠基因组，引物4、6鉴定CD3E基因内部区域完整，引物7、8为鉴定阳性的复核，引物5为内参基因鉴定鼠尾DNA质量。若鼠尾DNA鉴定的引物1、2、3、4、6、7、8鉴定阳性，则说明该小鼠为中靶阳性。PCR鉴定引物如下：
表7.hCD3E BAC TG Founder小鼠的鼠尾基因组PCR鉴定引物
使用表7鉴定引物进行PCR鉴定，经鉴定，102#，105#，107#为转基因阳性的Founder鼠。鉴定结果如图4-图11所示，图4-图11分别为利用引物1-8进行PCR鉴定的电泳图。
其中B6为阴性对照，是B6基因组DNA；P为质粒阳性对照；N为空白对照
TRANS2K PLUS II条带：
8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp
实施例2hCD3E BAC TG小鼠的hCD3E表达验证
我们使用流式细胞分选术(FACS)，检测hCD3E转基因小鼠不同line的外周血mCD3e和hCD3E蛋白表达的情况。
方法：于眼眶采集小鼠外周血100ul(预先加入EDTA.2K抗凝)，加入1×RBC，混匀后室温避光裂红，离心收集细胞沉淀。用FACS buffer洗涤后孵育Fc block(CD16/32抗体)抗体。封闭后分组分别加入mCD3抗体(biolegend，100314)，hCD3抗体(biolegend，317304)。孵育后FACS buffer洗两次，上流式细胞仪检测。机器上样前添加Sytoxblue，以区分死细胞和活细胞。FACS分析淋巴细胞中的mCD3e和hCD3E阳性细胞群分布比例，以筛选在T细胞表面，且hCD3E表达模式接近于mCD3e表达模式的转基因小鼠line。FACS分析结果如图12所示。
由FACS结果可以得出：
(1)hCD3E BAC TG(Balbc背景)小鼠能够成功表达hCD3E，且3个lineCD3+T细胞表面共表达mCD3e及hCD3E(其中line102#共表达比例达26.8％)。
(2)3个line的人源化CD3E比例均达到60％以上，其中line 102#最高为79.45％。
表8.hCD3E BAC TG小鼠蛋白表达分析
由于line102#的hCD3E表达水平在获得的三个line中最高，我们选择line102#作为候选line，推进后续的表型验证。后文中若无特殊标注，hCD3BAC TG小鼠均为line102#。
实施例3 hCD3E BAC TG小鼠的免疫系统指标评价
建系获得的hCD3E人源化小鼠应具有健全的免疫系统，且hCD3E蛋白的表达不会引起小鼠免疫系统的紊乱(T/NK细胞的严重缺陷等)，对于hCD3E靶点的药物评价有效性至关重要。以FACS检测小鼠的免疫指标(主要为T/B/NK细胞)，并与野生型小鼠对比，综合判定小鼠的免疫系统指标。可表达功能性hCD3E且免疫系统健全的人源化小鼠模型将是基于hCD3E靶点的抗体药效评价的重要临床前测评工具。
检测方法：脾脏处理取脾脏，称重，置于C型管。C型管中有预冷的酶消化液3ml(PBS含Ca,Mg+2％CS+10mM HEPES+30ug DNase+1.45mg胶原酶D)，运行spleen2，置于37℃水浴中消化30min。将消化完成的脾脏细胞运行spleen3，加300ul 0.1M的EDTA终止消化。用滤膜过滤，除去未消化完全的组织块。每管加3ml 1×RBC混匀，室温裂解红细胞3-5min，离心去上清，加2mlFACS buffer(PBS+2％FBS，10mM HEPES)清洗。8℃,400g,离心5min,去上清，加500ul FACS buffer混匀。根据实验需要，将细胞分到不同的流式管中100uL。根据样品管数目配置抗体进行孵育，单染管每管加0.5ul抗体，冰上避光孵育1h。FACS buffer洗两次，4℃290*g离心5min每管加500ul FACS buffer封口膜封好，上机检测。上样前5min添加Sytoxblue(终浓度1:10000稀释)，区分死细胞和活细胞。检测结果如图13所示。对图13进行统计分析的结果如表9所示。
表9.hCD3E BAC TG小鼠体内T/B/NK分析
统计结果显示，hCD3E BAC TG line102#小鼠的免疫系统健全，与对照鼠相比，hCD3E转基因小鼠T/B/NK没有明显差异。
为验证hCD3E是否参与到小鼠的免疫应答，我们在体外分离hCD3E人源化小鼠的脾脏细胞，分别用Anti-mCD3e和Anti-hCD3E体外刺激48h后，FACS检测淋巴细胞的活化指标CD25、CD69，结果如图14所示。还使用CBA检测试剂盒(Mouse,Th1/Th2/Th17Cytokine Kit,560485,BD)检测免疫淋巴因子(TNF、IFN-r、IL-2)，结果如图15所示。对图14进行统计分析的结果如表10所示。
表10使用Anti-mCD3e和Anti-hCD3E体外刺激BALB/c-hCD3E小鼠后淋巴细胞的活化指标CD25、CD69的统计分析
上述结果显示，hCD3E人源化小鼠脾脏单核细胞(mononuclear cells，MNC)被Anti-mCD3e和Anti-hCD3E抗体活化，CD25+CD69+双阳性细胞的比例近似95％，淋巴细胞活化显著。BALB/c-hCD3E小鼠对anti-hCD3E及anti-mCD3e抗体刺激均有响应，野生型BALB/c仅对anti-mCD3e抗体刺激有响应。BALB/c-hCD3E脾脏细胞经anti-hCD3E及anti-mCD3e抗体刺激后，细胞因子TNF,IL2及IFNγ水平升高且趋势类似，且与野生型BALB/c脾脏细胞经anti-mCD3e抗体刺激后，细胞因子水平升高程度类似。因此，我们可初步判定表达的hCD3E蛋白参与到了小鼠的免疫应答过程。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种CD3E基因修饰人源化动物模型的构建方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 89
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 1
gcaactaaaa gtataggaac cgcacatttc agaccaagaa ttaaatcagt ggctgtccac 60
tgtggcaacg acggtatcga taagcttga 89
<210> 2
<211> 89
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 2
taactgaaag taaagagagg actgcgggag tttgggacct ttgtgcagac gtgctcatgc 60
tcgttcgatt atgtacctga ctgatgaag 89
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 3
ccatgccaga tccaccacac 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
gccagcagac ttactacttc tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
catcagtagt cacaccctca cag 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 6
cagagagtgc tcgcatctgg 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 7
ccaattcaac cagccttcag gac 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
ctcagcacct atttgcctgg tgc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 9
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 10
ggacatttca gactggcacc 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 11
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 12
acctcctctg gctgtttccg 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 13
ccaattcaac cagccttcag gac 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 14
ctcagcacct atttgcctgg tgc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 15
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 16
ggacatttca gactggcacc 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 17
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 18
acctcctctg gctgtttccg 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 19
ctgctgcctc tatctggaat gc 22
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 20
ctgtgaatag ccactgcgct c 21
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 21
ctccactgta ggccactgga tggt 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 22
ctctaaagag agcttcaggt aacgg 25
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 23
taatacgact cactataggg aga 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 24
ggacatttca gactggcacc 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 25
gagattgtgc cattgcactc cag 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 26
gtacagtggc acaatctttg ctc 23
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 27
ctaggccaca gaattgaaag atct 24
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 28
gtaggtggaa attctagcat catcc 25
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 29
gagaacaatg gggtttgcca ttc 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 30
catggttgtg gaagccatgc ag 22
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 31
ggactgggta aatgttgaca gagg 24
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 32
gctgtggaaa cagagagtgc tcg 23
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 33
gaccagcagc ctccacatac tg 22
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 34
tggctgctag ttccagctct gc 22

Claims (11)

1.一种CD3E基因修饰人源化动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过PCR扩增制备FRT-Neo-FRT片段；
(2)将含有人源CD3E及其调控序列的BAC载体转入大肠杆菌，所述BAC载体中保留了人源CD3E基因的调控区域，保证了人源CD3E表达受人类自身启动子和调控序列控制；
(3)将步骤(1)制备的FRT-Neo-FRT片段电转化入含有步骤(2)所得的大肠杆菌，经鉴定获得含有人源CD3E基因和FRT-Neo-FRT片段的载体hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT；
(4)去除hCD3E-BAC-FRT-Neo-FRT上的Neo基因，进行鉴定确认，获得最终的打靶载体；
(5)采用DNA原核显微注射发法，将构建好的携带人源CD3E序列的打靶载体注射入小鼠受精卵中，移植入受体母鼠生产CD3E基因修饰人源化动物模型。
2.如权利要求1所述的构建方法，其中所述小鼠为BALB/c小鼠。
3.如权利要求1所述的构建方法，其中所述大肠杆菌为EL250。
4.如权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中步骤(1)具体为：以质粒PL451为模板，高保真酶PCR扩增FRT-Neo-FRT片段，回收定量。
5.如权利要求4所述的方法，其中PCR扩增FRT-Neo-FRT片段所使用的引物为：
F：
GCAACTAAAAGTATAGGAACCGCACATTTCAGACCAAGAATTAAATCAGTGGCTGTCCACTGTGGCAACGACGGTATCGATAAGCTTGA(SEQ ID NO：1)；
R：
TAACTGAAAGTAAAGAGAGGACTGCGGGAGTTTGGGACCTTTGTGCAGACGTGCTCATGCTCGTTCGATTATGTACCTGACTGATGAAG(SEQ ID NO：2)。
6.如权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中步骤(2)具体为：
a)将准备好的含有人源CD3E及其调控序列的BAC载体加入已经制备好的电转感受态大肠杆菌中，混匀后转移到预冷的电转杯中，准备另一组1.5ml离心管，作好标记并加入1ml预热的无抗性LB备用；
b)电转仪调至如下参数：1750V，将电转杯外侧擦拭干净，放入电击槽，按下电击按钮，听到轻微的声音响起即可放开，示数应该在5ms左右；
c)吸取准备好的LB将经过电转杯中的菌体冲洗出来，加入准备好的1.5ml离心管中的LB培养液内，30℃振摇1小时，同时将平板放入30℃恒温箱预热；
d)1小时后，直接吸取100μl涂在其中一块平板，将剩下的900μl 6000rpm离心1min后，倒掉多余的上清，留下约100μl重悬菌体，均匀地涂在另一个平板上，作好标记；
e)将平板倒放在30℃恒温箱内培养过夜，从过夜培养的平板中挑取单克隆并进行鉴定，得到含有hCD3E BAC的大肠杆菌备用。
7.如权利要求6所述的构建方法，步骤e)中鉴定克隆时使用的引物为：
8.如权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中步骤(3)中鉴定时使用的引物为：
9.如权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中步骤(4)中鉴定时使用的引物为
10.如权利要求1-3任一项所述的构建方法，其中步骤(5)中CD3E基因修饰人源化动物模型通过PCR进行鉴定，使用的引物如下：
11.权利要求1-10任一种所述的方法在评估靶向CD3的药物有效性、CD3靶向药物筛选开发、或基于CD3靶点的双特异性抗体的筛选中的应用。
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