CN110862443B - 一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用。本发明采用基因修饰技术对小麦1Dx2基因进行了的人工改造，得到中部重复区缩短的突变基因1Dx2Rp113，并将其导入到小麦优良品种科农199的1Dx2亚基缺失突变体中，获得了稳定的转基因系TL1Dx2Rp113。通过品质分析实验证明，突变的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2Rp113能够显著提高小麦面粉的加工品质。本发明通过基因修饰HMW‑GS基因1Dx2和转基因方法改良了小麦加工品质，填补了国内外利用点突变基因提高小麦加工品质的空白，为小麦加工品质改良开辟了新途径。

Description

一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.，AABBDD，2n＝6x＝42)属禾本科(Poaceae)小麦属(Triticum)，是人类最主要的食粮作物。由于小麦面团具有独特的弹性和延展性，能够通过烘烤、蒸煮、烹炸等工艺加工成面包、饼干、面条、馒头、饺子、油条等多种多样的食品。这些食品质量的优劣与小麦本身的品质有密切关系。小麦品质是指小麦品种对某种特定最终用途的适应和满足程度，可分为营养品质和加工品质。营养品质是指小麦所含营养成分对人(畜)营养需要的满足程度，包括营养成分的多少、各营养成分是否平衡、蛋白质的含量、氨基酸的组成等。加工品质又分为一次加工品质和二次加工品质。一次加工品质又称磨粉品质，主要包括出粉率、面粉色泽、灰分含量等。二次加工品质也称食用品质，是指小麦粉对制作不同食品的适应和满足程度，主要与面团的理化特性有关。食用品质参数很多，主要包括面筋含量、沉降值、形成时间、稳定时间、抗延阻力、拉伸面积、以及针对各种烘焙、蒸煮、烹炸面食的具体指标。
目前，小麦的品质改良主要集中在加工品质方面，而在加工品质方面又主要集中在工业化加工的面包、饼干、糕点等的烘烤品质方面，而烘烤品质主要取决于面粉的面筋含量与质量。面粉与水混合并经过适当的揉混之后即形成面团，面团经适当浓度的淡盐水冲洗除去麸皮、淀粉和溶于水或稀盐的蛋白质后，剩余的具有粘弹性的网状结构的物质被称为面筋(gluten)，面筋由麦谷蛋白和麦醇溶蛋白组成。面筋的特性决定面团的流变学特性，进而决定小麦品种的食品加工品质。在许多研究中，经常使用面筋强度来描述小麦的食品加工品质，根据面筋强度的大小，小麦可划分为强筋小麦、中筋小麦和弱筋小麦。衡量和鉴定小麦品质的方法主要有理化检测(包括使用各种专用仪器和分析方法)与食品加工检测(包括烘烤，蒸煮等)。衡量小麦面粉加工品质的主要指标有面筋含量、沉降值、吸水率、形成时间、稳定时间、抗延阻力、拉伸面积、溶胀指数、各种揉混仪参数等。
SDS-沉降值(SDS sedimentation value，SDS-SV)是反映小麦面筋含量和质量的综合性指标，深受小麦品质育种工作者的重视。其原理是一定量的小麦粉在弱酸介质作用下吸水膨胀，形成絮状物并缓慢沉淀，沉降速度和体积反映面筋的含量和质量。在规定的标准时间内的沉降体积即为沉降值，以ml为单位。测定值越大，表示面筋含量越高，面筋强度越大，面粉的烘烤品质越好。麦谷蛋白溶胀指数(swelling index of glutenin，SIG)是小麦品质评价的一个重要指标，与SDS-沉降值呈显著正相关。SIG是以不同溶涨时间的谷蛋白溶涨能力为基础，间接反映麦谷蛋白的含量和质量。SIG测定具有快速、简便、样品用量少等特点，常被用于小麦品质育种早代材料的品质检测。
粉质仪(Farinograph)是应用最广泛的小麦品质检测仪器之一，可用于小麦育种、储存、面粉加工、食品生产等过程中小麦籽粒或面粉的品质检测与质量控制。粉质仪通过定量小麦粉加适量水揉和，由计算机软件绘制搅拌阻力随时间变化的坐标图，即粉质曲线。由加水量和粉质曲线来计算面粉品质特性参数，用以评价面粉筋力强度。粉质仪测定的主要参数有吸水率(water absorption，WA)、面团形成时间(development time，DT)、面团稳定时间(stability time，ST)、弱化度(degree of softening，DS)以及粉质质量指数(farinograph quality number，FQN)。WA受小麦粉中的蛋白质含量、淀粉粒破损率等因素的影响，蛋白质含量和淀粉粒破损率越高，吸水率就越高。DT和ST反映面团的稳定性和耐揉程度。面团的DT和ST越长，表明面筋的强度越大，一般烘烤加工特性也越好。DS代表面团在搅拌过程中的破坏速率，反映面筋的强度。DS越大，面筋越弱，面团越易流变，不易加工且烘焙质量不佳。FQN是反映面团流变学特性的一个重要指标，与面筋强度有密切关系，强筋粉的FQN较高，而弱筋粉的FQN较低。
揉混仪(Mixograph)是通过测定面团搅拌过程中流变学特性变化来检测小麦加工品质的重要仪器。在面团不断揉混过程中，揉混仪通过测定并记录面团的抗揉混阻力，并绘制出揉混曲线图谱，给出面团的最佳揉混时间、搅拌耐力以及其它面团流变特性及烘焙估计吸水值等指标。揉混仪具有检测速度快、面粉用量小、与烘焙特性相关性高等优点，对小麦品质改良、小麦品质化学研究以及专用面粉和面制品的研发有很好的指导作用。在揉混仪所获得的参数中，中线峰值时间(midline peak time，MPT)是一个非常重要的参数。通常认为MPT与实际和实验烘焙的揉混时间有着较高的相关性，是面包品质的重要预测指标。中线峰值高度(midline peak value，MPV)与面团的延展性和面包的烘烤体积相关，中线峰值宽度(midline peak width，MPW)与面团的抗拉伸特性相关，中线峰值面积(midline peakintegral，MPI)与面团的最大抗延阻力、拉伸面积以及面包体积等显著相关。抗衰落值(mreakdown resistance，RBD)与面团的耐揉混特性相关，RBD越大，面团的强度越弱、耐揉性越差。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种蛋白质，所述蛋白质是将1Dx2蛋白质氨基酸序列的第164-737位的氨基酸序列删除后得到的蛋白质，将其记作1Dx2Rp113蛋白质。
所述1Dx2蛋白质是如下a)或b)所示的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
b)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述1Dx2Rp113蛋白质是如下c)或d)所示的蛋白质：
c)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
d)在序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本发明的第二个目的是提供与1Dx2Rp113蛋白质相关的生物材料。
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码1Dx2Rp113蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列5所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有95％或95％以上同一性，且编码1Dx2Rp113蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码1Dx2Rp113蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码1Dx2Rp113的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码1Dx2Rp113的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码1Dx2Rp113且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体具体可为重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
本发明的第三个目的是提供上述1Dx2Rp113蛋白质或生物材料的新用途。
本发明提供了上述1Dx2Rp113蛋白质或生物材料在如下B1)-B10)中任一种中的应用：
B1)调控小麦面粉的加工品质；
B2)调控小麦面粉的烘烤品质；
B3)调控小麦面粉的面筋特性和/或面筋强度和/或面筋质量；
B4)调控小麦面粉的面团流变学特性和/或延展性和/或抗拉伸特性和/或耐揉混特性；
B5)调控小麦面粉的SDS-沉降值；
B6)调控小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数；
B7)调控小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间和/或面团稳定时间和/或弱化度；
B8)调控小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间和/或峰值面积和/或抗衰落值；
B9)培育面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量提高的转基因小麦；
B10)小麦育种。
上述应用中，所述调控小麦面粉的加工品质具体为提高小麦面粉的加工品质；
所述调控小麦面粉的烘烤品质具体为提高小麦面粉的烘烤品质；
所述调控小麦面粉的面筋特性和/或面筋强度和/或面筋质量具体为改善小麦面粉的面筋特性和/或提高小麦面粉的面筋强度和/或提高小麦面粉的面筋质量；
所述调控小麦面粉的面团流变学特性和/或延展性和/或抗拉伸特性和/或耐揉混特性具体为改善小麦面粉的面团流变学特性和/或延展性和/或抗拉伸特性和/或耐揉混特性；
所述调控小麦面粉的SDS-沉降值具体为提高小麦面粉的SDS-沉降值；
所述调控小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数具体为提高小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数；
所述调控小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间和/或面团稳定时间和/或弱化度具体为提高小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间和/或提高小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团稳定时间和/或降低小麦面粉的粉质仪检测参数中的弱化度；
所述调控小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间和/或峰值面积和/或抗衰落值具体为提高小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间和/或提高小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值面积和/或降低小麦面粉的揉混仪检测参数中的抗衰落值；
所述小麦育种的目的为提高小麦面粉的加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量。
本发明的第四个目的是提供一种培育面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量提高的转基因小麦的方法。
本发明提供的培育面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量提高的转基因小麦的方法包括提高受体小麦中1Dx2Rp113蛋白质的含量和/或活性，得到转基因小麦的步骤；所述转基因小麦的面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量高于所述受体小麦。
上述方法中，所述转基因小麦的面粉加工品质高于所述受体小麦体现在如下C1)-C8)中任一种：
C1)转基因小麦面粉的SDS-沉降值高于受体小麦；
C2)转基因小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数高于受体小麦；
C3)转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间长于受体小麦；
C4)转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团稳定时间长于受体小麦；
C5)转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的弱化度低于受体小麦；
C6)转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间高于受体小麦；
C7)转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值面积高于受体小麦；
C8)转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的抗衰落值低于受体小麦。
进一步的，所述提高受体小麦中1Dx2Rp113蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体小麦中过表达1Dx2Rp113蛋白质。
更进一步的，所述在受体小麦中过表达1Dx2Rp113蛋白质的方法为将1Dx2Rp113蛋白质的编码基因导入受体小麦。所述1Dx2Rp113蛋白质的编码基因的核苷酸序列具体如序列5所示的DNA分子。
在本发明的具体实施例中，所述1Dx2Rp113蛋白质的编码基因通过重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113导入受体小麦。所述重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113为将序列表中的序列11替换载体pUBI::cas的Pst I和Kpn I酶切位点之间的DNA片段，且保持其它序列结构不变所得到的载体。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述1Dx2Rp113基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述方法中，所述受体小麦为小麦优良品种科农199的1Dx2亚基缺失突变体(kn2-突变体)。所述kn2-突变体为仅将普通小麦品种科农199(KN199)基因组序列中的1Dx2基因(序列3)缺失后得到的1Dx2缺失突变体。
本发明通过基因修饰技术人工改造了小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2基因，得到中部重复区缩短的突变基因1Dx2Rp113，突变基因1Dx2Rp113能够在体内翻译成突变的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2Rp113，并采用基因枪介导法将突变基因1Dx2Rp113导入到小麦优良品种科农199的1Dx2亚基缺失突变体中，获得了稳定的1Dx2Rp113转基因系TL1Dx2Rp113。通过品质分析实验证明，突变的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2Rp113能够显著提高小麦面粉的加工品质。本发明通过人工改造小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2基因和转基因方法改良了小麦加工品质，填补了国内外利用点突变基因提高小麦加工品质的空白，为小麦加工品质改良开辟了新途径。
附图说明
图1为1Dx2基因编码区全长序列的PCR扩增产物电泳图谱。注：M泳道为DNAmarker；KN 199泳道为以普通小麦品种科农199基因组DNA为模板，使用扩增1Dx2基因编码区全长序列的特异引物组合Dx2F和Dx2R进行PCR扩增的产物，1Dx2标示的条带即为1Dx2基因编码区全长序列的扩增片段。
图2为1Dx2Rp113突变基因结构示意图。其中：SP为信号肽序列；NT为氮端非重复区序列；CRD为中部重复区；CT为碳端非重复区序列，Deletion fragment为中部重复区的缺失区段，长度为1722bp。
图3为普通小麦品种科农199及其1Dx2亚基缺失系kn2-的麦谷蛋白SDS-PAGE图谱。注：kn2-为科农199的1Dx2亚基缺失系；KN199为野生型科农199；右侧标示的1Dx2等为相应的亚基。
图4为1Dx2Rp113基因转化载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113的构建流程。
图5为T0代1Dx2Rp113转基因小麦植株的PCR检测。注：M为DNAmarker；+代表阳性植株；-代表阴性植株；kn为转基因受体，即科农199的1Dx2亚基缺失突变体kn2-；KN为野生型科农199；B为空白对照。箭头所示的414bp条带为阳性植株的目标扩增片段。
图6为T3代1Dx2Rp113转基因系HMW-GS的SDS-PAGE检测。注：kn2-为转基因受体，即科农199的1Dx2亚基缺失突变体；KN199为野生型科农199；TL1Dx2Rp113为突变基因1Dx2Rp113的转基因系。
图7为1Dx2Rp113转基因系的粉质图。注：kn2-为转基因受体，即科农199的1Dx2亚基缺失突变体；KN199为野生型科农199；TL1Dx2为1Dx2的转基因系；TL1Dx2Rp113为突变基因1Dx2Rp113的转基因系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的粉质仪(Farinograph-E)为德国布拉本德公司(Brabender，OHGDuisburg，Germany)的产品。
下述实施例中的揉混仪(Mixograph)为美国National公司(National Mfg.Co.，Lincoln，USA)的产品。
下述实施例中的含有选择标记基因Bar的载体pAHC20为普如汀生物技术(北京)有限公司的产品。
下述实施例中的普通小麦品种科农199由中国科学院遗传与发育生物学研究所李俊明研究员等育成，品种审定号：国审麦2006017。
实施例1、小麦突变基因1Dx2Rp113的获得
1、小麦1Dx2基因编码区全长序列的PCR扩增
以普通小麦品种科农199的基因组DNA为模板，使用特异引物组合Dx2F和Dx2R、高保真的PrimeSTAR HS DNA聚合酶及2×PrimeSTAR GC Buffer(Takara，大连)进行PCR扩增。得到的PCR扩增片段1Dx2(图1)即为1Dx2基因的编码区全长序列。引物组合Dx2F和Dx2R的核苷酸序列分别为序列表中的序列1和序列2。
扩增1Dx2编码区全长序列的PCR程序为：98℃预变性3min；98℃变性30sec，72℃复性及延伸3min，循环38次；最后72℃延伸10min。
2、1Dx2基因PCR扩增产物的回收及克隆测序
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切取含有目标条带1Dx2(约2500bp)的凝胶部分(图1)，置于1.5ml离心管中，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根，北京)对扩增片段1Dx2进行回收。回收片段连接到平末端克隆载体pEasy Blunt(全式金，北京)上，得到含有1Dx2基因的质粒并测序(华大基因，北京)。测序结果表明，上述克隆的DNA片段长度为2523bp，其核苷酸序列为序列表中的序列3，即为1Dx2基因的编码区全长序列。1Dx2为无内含子基因，其编码的1Dx2蛋白质，由839个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为序列表中的序列4。
3、1Dx2的长度突变基因1Dx2Rp113的获得
采用限制性内切酶酶切和连接的方法来构建1Dx2基因中部重复区缩短的突变基因1Dx2Rp113。具体操作步骤如下：
(1)用限制性内切酶BstXⅠ对步骤2中含有1Dx2基因的质粒进行完全酶切，回收连接在载体上的1Dx2基因两端的DNA片段(图1)。
(2)T4 DNA连接酶进行连接，获得大小为801bp的突变基因；对突变基因片段进行回收、克隆以及测序。得到1Dx2的长度突变基因1Dx2Rp113的编码区全长序列。1Dx2Rp113的编码区全长序列即为序列表中的序列5。
1Dx2Rp113基因的编码区全长序列(序列5)为将序列表中序列3所示的野生型1Dx2基因序列的第489-2210位长度为1722bp的片段删除，且保持1Dx2基因的其它序列不变所获得的长度为801bp的核苷酸序列。
1Dx2Rp113基因所编码的小麦高分子量麦谷蛋白亚基即为1Dx2Rp113蛋白质，1Dx2Rp113蛋白质的氨基酸序列为序列表中的序列6。1Dx2Rp113蛋白质的氨基酸序列即为将序列4所示的1Dx2蛋白质氨基酸序列的第164-737位长度为574个氨基酸残基删除，且保持1Dx2蛋白质的其它序列不变所得到的氨基酸序列。
实施例2、1Dx2Rp113转基因小麦的获得
1、转基因受体材料的创制
本发明使用的转基因受体材料为普通小麦品种科农199(KN199)的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx2缺失突变体，记为kn2-。kn2-突变体是通过EMS诱变方法获得的。具体过程如下：(1)选取1000粒饱满的野生型科农199种子用0.4％的EMS(Sigma，M0880)避光处理24小时后用流水冲洗24小时，这些种子记为M0；(2)M0种子经过正常萌发和春化处理(4℃)4周后种植在中国科学院遗传与发育生物学研究所的北京昌平实验基地，正常田间管理，收获的种子记为M1；利用SDS-PAGE方法从M1种子中筛选出1Dx2亚基缺失突变体，记为kn2-(图4)；M1代的kn2-种子经过连续两代回交和自交后获得足够量的M3代种子，作为突变基因1Dx2Rp113遗传转化的受体材料。经测序验证表明：kn2-突变体为仅将普通小麦品种科农199(KN199)基因组序列中的1Dx2基因(序列3)缺失后得到的1Dx2缺失突变体，其余序列均与普通小麦品种科农199(KN199)基因组序列相同。
2、1Dx2Rp113基因转化载体的构建
1Dx2Rp113基因转化载体的构建流程如图4所示。具体操作步骤如下：
(1)以普通小麦品种小偃54的基因组DNA为模板，采用引物组合Bx14proF和Bx14proR进行PCR扩增，获得1Bx14启动子序列。引物组合Bx14proF和Bx14proR的核苷酸序列分别为序列表中的序列7和序列8。获得的1Bx14启动子序列即为序列表中的序列9。
(2)将上述步骤(1)获得的1Bx14启动子序列(序列表中的序列9)插入载体pUBI::cas(序列表中的序列10)的Pst I与BamH I酶切位点之间，替换Ubiquitin启动子序列，且保持载体pUBI::cas的其它序列不变，得到中间载体p1Bx14PRO。
(3)将实施例1获得的长度突变基因1Dx2Rp113插入到中间载体p1Bx14PRO的BamHI和Kpn I酶切位点之间，且保持中间载体p1Bx14PRO的其它序列不变，得到重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113，即为1Dx2Rp113基因的转化载体。
(4)对重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113进行测序。
测序结果表明，重组载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113为将序列表中序列11的DNA分子替换载体pUBI::cas的Pst I和Kpn I酶切位点之间的DNA片段，且保持载体pUBI::cas的其它序列不变所得到的载体。
3、1Dx2Rp113基因的遗传转化
采用基因枪法进行遗传转化。转化受体材料为普通小麦品种科农199的1Dx2亚基缺失突变体系kn2-开花后14天左右的幼胚。将转化载体p1Bx14PRO-1Dx2Rp113与含有选择标记基因Bar的载体pAHC20进行共转化，得到转突变基因1Dx2Rp113的T0代植株。遗传转化在中国科学院遗传与发育生物学研究所遗传转化平台进行。野生型1Dx2基因的遗传转化与突变基因1Dx2Rp113的遗传转化方法相同，只是转化载体为p1Bx14PRO-1Dx2。
4、转1Dx2Rp113小麦的PCR鉴定
采用引物组合Fdx2nos和Rdx2nos对转1Dx2Rp113的小麦T0代植株进行PCR鉴定，以kn2-为阴性对照。若PCR扩增得到大小为414bp片段即为转1Dx2Rp113的阳性植株。将阳性的转1Dx2Rp113小麦种植并分单株收获种子。通过连续3代鉴定，获得2个表达稳定的T3代转1Dx2Rp113小麦纯合株系TL1Dx2Rp113-3和TL1Dx2Rp113-13。引物Fdx2nos和Rdx2nos的核苷酸序列分别为序列表中的序列12和序列13。野生型1Dx2基因转化株的鉴定采用SDS-PAGE检测T0代种子麦谷蛋白亚基的方法，表达1Dx2亚基的植株即为转1Dx2基因的阳性植株，否则即为阴性植株。
种植T0代的1Dx2Rp113转基因阳性植株并分单株收获种子。通过连续3至4代繁殖，并逐代对外源基因进行PCR鉴定(图5)，对HMW-GS进行SDS-PAGE鉴定(图6)，获得HMW-GS表达稳定的T3代(2016年)或T4代(2017年)1Dx2Rp113转基因纯合株系，用于加工品质性状的测定。同时，采用与1Dx2Rp113转基因植株同样的方法繁殖和鉴定1Dx2转基因系，并平行繁殖转基因受体kn2-和野生型科农199的种子，用作突变基因1Dx2Rp113转基因系加工品质分析的对照。
实施例3、1Dx2Rp113转基因系的加工品质性状测定及与受体、野生型科农199及1Dx2转基因系的比较分析
本发明分别在2016年和2017年对实施例2中获得的T3代1Dx2Rp113转基因系(混合系)1Dx2Rp113和2个T4代1Dx2Rp113转基因系TL1Dx2Rp113-3和TL1Dx2Rp113-13进行了加工品质性状测定，并与野生型基因1Dx2的转基因系TL1Dx2、转基因受体kn2-和野生型科农199进行比较分析。所有测定样品均设3次生物学重复。数据的采集、处理与比较分析使用Excel(Microsoft，USA)软件进行，单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较使用SPSS 19.0(IBM，USA)软件，多重比较使用单因素方差分析中的Duncon法进行。
1、SDS-沉降值的测定及比较分析
按照文献“Zhang L.,Chen Q.,Su M.,Yan B.,Zhang X.,Jiao Z.High-molecular-weight glutenin subunit-deficient mutants induced by ion beam andthe effects of Glu-1loci deletion on wheat quality properties.J.Sci.FoodAgr.,2016,96:1289-1296.”描述的方法于2016年和2017年分别测定了1Dx2Rp113转基因系的SDS-沉降值(SDS-SV)。具体操作步骤如下：称取1g面粉(14％含水量)置于35ml具塞刻度玻璃试管中，加入16.8ml溴酚蓝水溶液(4mg/L)，颠倒混合10-20sec；试管置于CAU-B沉降值分析仪(中国农业大学)上，40次/min震荡5min；再加入16.8ml SDS-乳酸溶液(2％SDS，0.19％乳酸)，颠倒混匀后再置于沉降值分析仪上，40次/min震荡5min；颠倒混匀10-20sec，静置5min后观察记录沉降值结果。本实验分别以1Dx2转基因系TL1Dx2、转基因受体kn2-和野生型科农199为对照，进行比较分析。
各1Dx2Rp113转基因系及其对照材料的SDS-沉降值测定结果如表1所示。从表1可以看出：2016年，1Dx2Rp113转基因株系TL1Dx2Rp113的SDS-沉降值显著大于1Dx2转基因系TL1Dx2、转基因受体kn2-和野生型科农199(KN199)。2017年测定的两个1Dx2Rp113转基因系TL1Dx2Rp113-3和TL1Dx2Rp113-13的SDS-沉降值也同样显著大于转基因受体kn2-、1Dx2转基因系TL1Dx2和野生型科农199。这些结果充分说明突变亚基1Dx2Rp113能够较野生型亚基1Dx2显著提高面粉的SDS-沉降值。
表1、SDS-沉降值的测定分析
Figure BDA0002319554690000081
Figure BDA0002319554690000091
注：(1)2016年测定的TL1Dx2Rp113为T3代的1Dx2Rp113转基因系的混合样品，TL1Dx2样品为T3代的1Dx2转基因系的混合样品。2017年测定的TL1Dx2Rp113-3和TL1Dx2Rp113-13为两个T4代的TL1Dx2Rp113转基因单株系，TL1Dx2-2和TL1Dx-12为两个T4代的1Dx2转基因单株系。(2)表中数据为3次生物学重复的平均值，测定值后不同的字母代表在0.05水平上差异显著。
2、麦谷蛋白溶胀指数的测定及比较分析
按照文献“Wang,C.,and Kovacs,M.I.P.Swelling index of glutenintest.II.Application in prediction of dough properties and end-usequality.Cereal Chem.J.2002,79:190-196.”描述的方法于2016年和2017年分别测定1Dx2Rp113转基因系的麦谷蛋白溶胀指数(SIG)，并同样以转基因受体kn2-、1Dx2转基因系TL1Dx2和野生型科农199为对照。具体操作步骤如下：(1)取50ml离心管，逐一称重，记为M0。向每个离心管中加入1.0g待测样品的面粉，称重，记为M1。(2)向离心管中入15ml的蒸馏水，涡旋震荡10sec，于24℃下静置水化20min，期间涡旋震荡2次，每次10sec。(3)向每个离心管中加入15ml的SDS-乳酸液(3％SDS，0.19％乳酸)，涡旋震荡10sec，于24℃下静置水化20min，期间涡旋震荡2次，每次10sec。(4)450×g离心5min，取出离心管，在不触及界面的条件下用移液器吸去绝大部分上清液，沉淀物再在450×g离心3min，立即将离心管倒立在吸水滤纸上，而后逐一吸去管壁上的余水并称重，记为M2。(5)计算单位重量面粉所形成的湿面糊重(M2-M0)×100/(M1-M0)×(100-W)，即SIG值，其中W为样品含水量。
SIG测定结果如表2所示。从表2中可以看出：2016年，1Dx2Rp113转基因株系TL1Dx2Rp113的SIG值显著大于转基因受体kn2-、1Dx2转基因系TL1Dx2和野生型科农199(KN199)。2017年，2个1Dx2Rp113转基因系TL1Dx2Rp113-3和TL1Dx2Rp113-13的SIG值同样也显著大于转基因受体kn2-、1Dx2转基因系TL1Dx2和野生型科农199。说明表达突变亚基1Dx2Rp113能够较野生型的1Dx2亚基显著提高麦谷蛋白溶胀指数、改善面筋的质量。
表2、谷蛋白溶胀指数的测定分析
Figure BDA0002319554690000092
3、粉质仪参数测定及比较分析
依据美国谷物化学学会“AACC.Approved Methods of Analysis,10th edn.St.MN,USA:American Association of Cereal Chemistry,2000”的改进方法和程序“AACC 54-21”分别对表达突变基因1Dx2Rp113的转基因系及其对照材料的面粉进行粉质仪分析。实验使用50g揉面钵，重复3次。具体操作步骤如下：(1)根据面粉的水分含量，按照仪器软件给出的数据称取个待测样品的面粉50g(14％湿基，50g)。仪器开启并校零后将面粉放入粉质仪的50g揉面钵中，盖上揉面钵盖。(2)启动揉面器开关，搅拌揉混合1min后，迅速加水，盖上揉面钵盖。面团揉和曲线至形成峰后，观察曲线峰值是否在500±20FU之间。(3)若峰值在500±20FU之间，则继续揉面，并在曲线开始明显下降后继续柔和12min，完成粉质图谱，并进行数据采集和比较分析。
粉质仪检测结果如表3所示。从表中可以看出：TL1Dx2Rp113的面团形成时间、面团稳定时间和粉质质量指数均显著高于对照KN199和转基因受体kn2-，弱化度显著低于对照。说明突变基因1Dx2Rp113能够显著的改善小麦面团的流变学特性，提高小麦的面筋强度和面粉的加工品质。
表3、粉质仪参数的测定
Figure BDA0002319554690000101
4、揉混仪分析
按照文献“AACC 54-40A”和“Sun et al.(2015)(Sun,J.,Yang,W.,Liu,D.,Zhao,J.,Luo,G.,Li,X.,Liu,Y.,Guo,J.,and Zhang,A.(2015).Improvement on Mixographtest through water addition and parameter conversions.J.Integr.Agr.14:1715-1722.)”的方法，利用揉混仪分别于2016和2017年对1Dx2Rp113转基因系的面团峰值时间(MPT)、峰值高度(MPV)、峰值宽度(MPW)、峰值面积(MPI)以及抗衰落值(RBD)进行了测定。具体步骤如下：使用10g的揉混钵。标准的揉混仪揉混总时间为10min，面粉的称取量M＝(10g×86)/(100-W)，其中W为样品含水量。获得的数据用MixSmart软件(AEW Consulting，Lincoln，Nebraska，USA)进行分析。揉混仪曲线由计算机自动绘出，参数超过40个，分析时通常采用中线(Midline)参数，分为带高、带宽、面积和斜率4大类。揉混仪图谱的各项指标反应小麦面团的流变学特性和质量。
揉混仪测定的主要参数结果如表4所示。从表中可以看出：2016年和2017年，TL1Dx2Rp113的面团峰值时间、峰值面积均明显高于对照KN199和转基因受体kn2-，抗衰落值明显低于对照，峰值高度和峰值宽度与对照相比有所下降，说明TL1Dx2Rp113降低了面团的延展性，提高了面团的弹性及耐揉混特性，进而说明1Dx2Rp113基因具有提高面筋强度、改善面粉烘烤品质的功能。
表4、揉混仪各项指标的测定
Figure BDA0002319554690000111
SDS-沉降值(SDS-SV)和麦谷蛋白溶胀指数(SIG)均是评价小麦面筋质和量的综合性指标，与面筋强度高度正相关。揉混仪参数中峰值时间(MPT)、峰值面积(MPI)以及粉质仪参数中的形成时间和稳定时间(ST)、粉质质量指数(FQN)与面筋质量正相关，而揉混仪参数中的抗衰落值(RBD)、粉质仪参数中的弱化度(DS)与面筋质量负相关。
以上测定结果表明，1Dx2Rp113转基因系的SDS、SIG、MPT、MPI、FQN较对照均显著提高，面团形成时间和稳定时间较对照显著延长，而RBD和DS较对照显著降低，说明1Dx2Rp113转基因系具有更好的面筋质量和面团流变学特性，从而证明突变基因1Dx2Rp113能够显著提高小麦面粉的加工品质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用
<160>13
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg 30
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
ctatcactgg ctggccgaca atgcgtcgc 29
<210>3
<211>2523
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg gtagtcgtcg ccctcgtggc tctcaccgtc 60
gctgaaggtg aggcctctga gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gctccaggag 120
cgcgagctca aggcatgcca gcaggtcatg gaccagcagc tccgagacat tagccccgag 180
tgccaccccg tcgtcgtcag cccggtcgcg ggacaatacg agcagcaaat cgtggtgccg 240
cccaagggcg gatctttcta ccccggcgag accacgccac cgcagcaact ccaacaacgt 300
atattttggg gaatacctgc actactaaaa aggtattacc caagtgtaac ttctccgcag 360
caggtttcat actatccagg ccaagcttct ccgcaacggc caggacaagg tcagcagcca 420
ggacaagggc aacaatcagg acaaggacaa caagggtact acccaacttc tccgcaacag 480
ccaggacaat ggcaacaacc ggaacaaggg caaccagggt actacccaac ttctccgcag 540
cagccaggac aattgcaaca accagcacaa gggcagcaac caggacaagg acaacaaggt 600
cggcagccag gacaagggca accagggtac tacccaactt cttcgcagct gcagccagga 660
caattgcaac aaccagcaca agggcaacaa gggcagcaac caggacaagg gcaacaaggt 720
caacagccag gacaagggca acaaccagga caaggacaac aaggtcaaca gccaggacaa 780
gggcaacaac caggacaagg gcaacaaggt cagcagctcg gacaaggaca acaagggtac 840
tacccaactt ctctgcaaca gtcgggacaa gggcaaccag ggtactaccc aacttctctg 900
cagcagctag gacaagggca atcagggtac tacccaactt ctccgcagca accaggacaa 960
gggcagcagc caggacaatt gcaacaacca gcacaagggc agcaaccaga acaagggcaa 1020
caaggtcagc agccaggaca agggcaacaa ggccagcagc caggacaagg gcagcaaccg 1080
ggacaagggc aaccagggta ctacccaact tctccgcagc agtcaggaca agggcaacca 1140
gggtactacc caacttcttc gcagcagcca acacaatcgc agcaaccagg acaagggcaa 1200
caaggtcagc aggtaggaca agggcaacaa gctcagcagc caggacaagg gcagcaaccg 1260
ggacaagggc agccagggta ctacccaact tctccgctgc agtcaggaca agggcaacca 1320
gggtactacc taacttctcc gcagcagtca ggacaagggc agcagccagg acaattgcaa 1380
caatcagcac aagggcaaaa aggacagcaa ccaggacaag gtcaacagcc agggcaaggg 1440
caacaaggtc agcagccagg acaagggcaa caaggtcagc aaccggggca agggcagcca 1500
gggtactacc caacttctcc gcagcaatca ggacaagggc aacagccagg acaatggcaa 1560
caaccaggac aagggcaacc aggatactac ccaacttctc cgttgcagcc aggacaaggg 1620
caaccagggt acgacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcagca accaggacaa 1680
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caaccagcac aagtgcaaca agggcagcag ccagcacaag ggcaacaagg tcagcagcta 1800
ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga caagggcagc aaccagcaca agggcaacaa 1860
ggtcagcagc caggacaagg gcaacaaggt cagcagccag gacaagggca gcaaccggga 1920
caagggcagc catggtacta cccaacttct ccgcaggagt caggacaagg gcaacagcca 1980
ggacaatggc aacaaccagg acaatggcaa caaccaggac aagggcaacc agggtactac 2040
ctaacttctc cgttgcagct aggacaaggg caacaagggt actacccaac ttctctgcaa 2100
caaccaggac aagggcagca accaggacaa tggcaacaat cgggacaagg gcaacatggg 2160
tactacccaa cttctccgca gctgtcagga caagggcaac ggccaggaca atggctgcaa 2220
ccaggacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctccgc aacagtcagg acaagggcaa 2280
caactaggac aatggctgca accaggacaa gggcaacaag ggtactaccc aacttctctg 2340
caacagacag gacaagggca gcaatcagga caagggcaac aaggctacta cagctcatac 2400
catgttagcg tggagcacca ggcggccagc ctaaaggtgg caaaggcgca gcagctcgcg 2460
gcacagctgc cggcaatgtg ccggctggag ggcggcgacg cattgtcggc cagccagtga 2520
tag 2523
<210>4
<211>839
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<400>4
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Val Val Ala Leu Val
1 5 10 15
Ala Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu
20 25 30
Arg Glu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Gln Gln
35 40 45
Val Met Asp Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Pro Glu Cys His Pro Val
50 55 60
Val Val Ser Pro Val Ala Gly Gln Tyr Glu Gln Gln Ile Val Val Pro
65 70 75 80
Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr Thr Pro Pro Gln Gln
85 90 95
Leu Gln Gln Arg Ile Phe Trp Gly Ile Pro Ala Leu Leu Lys Arg Tyr
100 105 110
Tyr Pro Ser Val Thr Ser Pro Gln Gln Val Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln
115 120 125
Ala Ser Pro Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro
165 170 175
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln
180 185 190
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Arg Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro
195 200 205
Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Gln Leu Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln
210 215 220
Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly
225 230 235 240
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln
260 265 270
Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Ser
275 280 285
Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Leu Gly
290 295 300
Gln Gly Gln Ser Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln
305 310 315 320
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Pro
325 330 335
Glu Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln
340 345 350
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr
355 360 365
Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro
370 375 380
Thr Ser Ser Gln Gln Pro Thr Gln Ser Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln
385 390 395 400
Gln Gly Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln
405 410 415
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro
420 425 430
Leu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Gln
435 440 445
Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Ser Ala Gln
450 455 460
Gly Gln Lys Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly
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Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly
485 490 495
Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln
500 505 510
Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly
515 520 525
Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr
530 535 540
Asp Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln
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Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Val Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala
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Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln
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Ala Ser Pro Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln
145 150 155 160
Pro Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro
165 170 175
Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Trp Leu
180 185 190
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln
195 200 205
Thr Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Ser
210 215 220
Ser Tyr His Val Ser Val Glu His Gln Ala Ala Ser Leu Lys Val Ala
225 230 235 240
Lys Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Met Cys Arg Leu Glu
245 250 255
Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln
260 265
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
aactgcagag ggaaagacaa tggacatgca aag 33
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
cgggatccct cggtgaactg tcagtgaatt gat 33
<210>9
<211>1147
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>9
agggaaagac aatggacatg caaagaggta ggggcaggga agaaacactt ggagatcata 60
gaagaacata agaggttaaa cataggagca gtggcggagc ttgggctgat tttatggagg 120
ggcaaatggg ctggaggggc aagaaatatg agtttgggct gattttaact gggcatatgg 180
gctgaatact aggggatata tgctagtttt ctcatgggct gggggggcaa tggcccaggt 240
tgctctccac taagctccgc cactgcatag gagggcataa tggacaatta aatctacatt 300
aattgaactc atttgggaag taaacaaaat ccatattctg gtgtaaatca aactatttga 360
tgcggattta ctaagatcct atgttaattt tagacatgac tggccaaagg tttcagttag 420
ttcatttgtc acggaaaggt gttttcataa gtccaaaact ctaccaactt ttttgcacgt 480
catagcatag atagatgttg tgagtcattg gatagatatt gtgagtcagc atggatttgt 540
gttgcctgga aatccaacta aatgacaagc aacaaaacct gaaatgggct ttaggagaga 600
tggtttatca atttacatgt tccatgcagg ctaccttcca ctactcgaca tggttagaag 660
ttttgagtgc cgcatatttg cggaagcaat ggcactactc gacatggtta gaagttttga 720
gtgccgcata tttgcggaag caatggctaa cagatacata ttctgccaaa ccccaagaag 780
gataatcact cctcttagat aaaaagaaca gaccaatgta caaacatcca cacttctgca 840
aacaatacac cagaactagg attaagccca ttacgtggct ttagcagacc gtccaaaaat 900
ctgttttgca agcaccaatt gctccttact tatccagctt cttttgtgtt ggcaaactgc 960
ccttttccaa ccgattttgt tcttctcacg ctttcttcat aggctaaact aacctcggcg 1020
tgcacacaac catgtcctga accttcacct cgtccctata aaagcccatc caaccttcac 1080
aatctcatca tcacccacaa caccgagcac cccaatctac agatcaattc actgacagtt 1140
caccgag 1147
<210>10
<211>4691
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>10
gaaccctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat 60
gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt 120
atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac 180
aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca 240
attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc 300
tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat 360
ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct 420
attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt 480
agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt 540
aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc 600
gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa 660
gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc 720
gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc 780
ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcacggca gctacggggg attcctttcc 840
caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc 900
ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa 960
tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc 1020
taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc 1080
atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg 1140
cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc 1200
ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt 1260
gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg 1320
ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc 1380
gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc 1440
tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg 1500
atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt 1560
tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg 1620
agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg 1680
tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 1740
acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat 1800
atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg 1860
atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg 1920
ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt 1980
tggtgttact tctgcaggtc gactctagag gatccccggg taccgagctc gaatttcccc 2040
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 2100
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 2160
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 2220
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 2280
atgttactag atcgggaatt catcgatgat atcagatctg ccggtctccc tatagtgagt 2340
cgtattaatt tcgataagcc aggttaacct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 2400
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 2460
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 2520
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 2580
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 2640
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 2700
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 2760
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 2820
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 2880
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 2940
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 3000
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 3060
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 3120
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 3180
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 3240
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 3300
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 3360
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 3420
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 3480
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 3540
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 3600
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 3660
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 3720
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 3780
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 3840
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 3900
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 3960
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 4020
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 4080
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 4140
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 4200
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 4260
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 4320
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 4380
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 4440
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 4500
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 4560
ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tggacatatt 4620
gtcgttagaa cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag 4680
gtgacactat a 4691
<210>11
<211>1954
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>11
agggaaagac aatggacatg caaagaggta ggggcaggga agaaacactt ggagatcata 60
gaagaacata agaggttaaa cataggagca gtggcggagc ttgggctgat tttatggagg 120
ggcaaatggg ctggaggggc aagaaatatg agtttgggct gattttaact gggcatatgg 180
gctgaatact aggggatata tgctagtttt ctcatgggct gggggggcaa tggcccaggt 240
tgctctccac taagctccgc cactgcatag gagggcataa tggacaatta aatctacatt 300
aattgaactc atttgggaag taaacaaaat ccatattctg gtgtaaatca aactatttga 360
tgcggattta ctaagatcct atgttaattt tagacatgac tggccaaagg tttcagttag 420
ttcatttgtc acggaaaggt gttttcataa gtccaaaact ctaccaactt ttttgcacgt 480
catagcatag atagatgttg tgagtcattg gatagatatt gtgagtcagc atggatttgt 540
gttgcctgga aatccaacta aatgacaagc aacaaaacct gaaatgggct ttaggagaga 600
tggtttatca atttacatgt tccatgcagg ctaccttcca ctactcgaca tggttagaag 660
ttttgagtgc cgcatatttg cggaagcaat ggcactactc gacatggtta gaagttttga 720
gtgccgcata tttgcggaag caatggctaa cagatacata ttctgccaaa ccccaagaag 780
gataatcact cctcttagat aaaaagaaca gaccaatgta caaacatcca cacttctgca 840
aacaatacac cagaactagg attaagccca ttacgtggct ttagcagacc gtccaaaaat 900
ctgttttgca agcaccaatt gctccttact tatccagctt cttttgtgtt ggcaaactgc 960
ccttttccaa ccgattttgt tcttctcacg ctttcttcat aggctaaact aacctcggcg 1020
tgcacacaac catgtcctga accttcacct cgtccctata aaagcccatc caaccttcac 1080
aatctcatca tcacccacaa caccgagcac cccaatctac agatcaattc actgacagtt 1140
caccgaggga tccatggcta agcggttagt cctctttgtg gcggtagtcg tcgccctcgt 1200
ggctctcacc gtcgctgaag gtgaggcctc tgagcaacta cagtgtgagc gcgagctcca 1260
ggagctccag gagcgcgagc tcaaggcatg ccagcaggtc atggaccagc agctccgaga 1320
cattagcccc gagtgccacc ccgtcgtcgt cagcccggtc gcgggacaat acgagcagca 1380
aatcgtggtg ccgcccaagg gcggatcttt ctaccccggc gagaccacgc caccgcagca 1440
actccaacaa cgtatatttt ggggaatacc tgcactacta aaaaggtatt acccaagtgt 1500
aacttctccg cagcaggttt catactatcc aggccaagct tctccgcaac ggccaggaca 1560
aggtcagcag ccaggacaag ggcaacaatc aggacaagga caacaagggt actacccaac 1620
ttctccgcaa cagccaggac aatggctgca accaggacaa gggcaacaag ggtactaccc 1680
aacttctccg caacagtcag gacaagggca acaactagga caatggctgc aaccaggaca 1740
agggcaacaa gggtactacc caacttctct gcaacagaca ggacaagggc agcaatcagg 1800
acaagggcaa caaggctact acagctcata ccatgttagc gtggagcacc aggcggccag 1860
cctaaaggtg gcaaaggcgc agcagctcgc ggcacagctg ccggcaatgt gccggctgga 1920
gggcggcgac gcattgtcgg ccagccagtg atag 1954
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>12
tcggccagcc agtgataggg 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>13
tacgcaaacc gcctctcccc 20

Claims (9)

1.1Dx2Rp113蛋白质，是如下a）或b）所示的蛋白质：
a）氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
b）在序列6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：
A1）编码权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：
1）其编码序列是序列5所示的cDNA分子或DNA分子；
2）与1）限定的核苷酸序列具有95%或95%以上同一性，且编码权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在如下B1）-B10）中任一种中的应用：
B1）调控小麦面粉的加工品质；
B2）调控小麦面粉的烘烤品质；
B3）调控小麦面粉的面筋特性和/或面筋强度和/或面筋质量；
B4）调控小麦面粉的面团流变学特性和/或延展性和/或抗拉伸特性和/或耐揉混特性；
B5）调控小麦面粉的SDS-沉降值；
B6）调控小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数；
B7）调控小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间和/或面团稳定时间和/或弱化度；
B8）调控小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间和/或峰值面积和/或抗衰落值；
B9）培育面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量提高的转基因小麦；
B10）小麦育种。
5.一种培育面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量提高的转基因小麦的方法，包括提高受体小麦中权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的含量和/或活性，得到转基因小麦的步骤；所述转基因小麦的面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量高于所述受体小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转基因小麦的面粉加工品质和/或烘烤品质和/或面筋质量高于所述受体小麦体现在如下C1）-C8）中任一种：
C1）转基因小麦面粉的SDS-沉降值高于受体小麦；
C2）转基因小麦面粉的麦谷蛋白溶胀指数高于受体小麦；
C3）转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团形成时间长于受体小麦；
C4）转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的面团稳定时间长于受体小麦；
C5）转基因小麦面粉的粉质仪检测参数中的弱化度低于受体小麦；
C6）转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值时间高于受体小麦；
C7）转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的峰值面积高于受体小麦；
C8）转基因小麦面粉的揉混仪检测参数中的抗衰落值低于受体小麦。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体小麦中权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体小麦中过表达权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述在受体小麦中过表达权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的方法为将权利要求1所述的1Dx2Rp113蛋白质的编码基因导入受体小麦。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述1Dx2Rp113蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列5所示的DNA分子。
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