ES2851601T3 - Métodos para mejorar la proliferación y actividad de los linfocitos citolíticos naturales - Google Patents

Métodos para mejorar la proliferación y actividad de los linfocitos citolíticos naturales Download PDF

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Abstract

Un método de cultivo ex vivo de linfocitos citolíticos naturales (NK), comprendiendo el método cultivar una población de células empobrecidas en linfocitos T que comprenden linfocitos NK con IL-15 y exponer dichos linfocitos NK a nicotinamida de 1 a 10 mM durante una duración de exposición de 12-23 horas, en donde el cultivo de dichos linfocitos NK con IL-15 y dicha exposición a dicha nicotinamida da lugar a: (a) expresión elevada de CD62L en comparación con linfocitos NK empobrecidos en linfocitos T cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de dicha nicotinamida, y (b) mayor citotoxicidad en comparación con linfocitos NK empobrecidos en linfocitos T cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de dicha nicotinamida.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para mejorar la proliferación y actividad de los linfocitos citolíticos naturales
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a cultivo ex vivo de linfocitos citolíticos naturales (NK) y, más en particular, pero no de manera exclusiva, a composiciones y métodos para mejorar la propagación y/o funcionalidad de linfocitos NK tratando las células con nicotinamida en combinación con citocinas que dirigen la proliferación de linfocitos NK.
Los linfocitos citolíticos naturales (en lo sucesivo en el presente documento también abreviados como "NK") son células linfoides que participan en reacciones inmunitarias. Estas células tienen diversas funciones, especialmente la destrucción de células tumorales, células que experimentan transformación oncogénica y otras células anómalas en un cuerpo vivo y son componentes importantes de los mecanismos innatos de vigilancia inmunológica. La experiencia clínica con la inmunoterapia adoptiva con linfocitos NK ha enfatizado la necesidad de mejores métodos para expandir de manera eficaz y eficiente las poblaciones de linfocitos NK mientras se mantiene e incluso se mejora su funcionalidad in vivo (transporte de capacidad de destrucción, localización, persistencia y proliferación).
Los linfocitos NK representan una población definida de linfocitos en términos de fenotipo y función. Los linfocitos NK tienen una gran morfología granular de linfocitos y expresan receptores de superficie de linfocitos NK característicos y carecen tanto de reordenamiento de TCR como de marcadores de superficie celular de linfocitos T, linfocitos B, monocitos y/o macrófagos. Las células destruyen al liberar gránulos citoplasmáticos pequeños de proteínas (perforina y granzima) que provocan que la célula diana muera por apoptosis. Los linfocitos NK poseen mecanismos que distinguen entre células "diana" potenciales y células sanas a través de una multitud de receptores inhibidores y activadores que implican moléculas del MHC de clase I, moléculas del MHC de clase I y moléculas no relacionadas con MHC (Caliguiri Blood 2008 112: 461-69). Los receptores de linfocitos NK inhibidores incluyen HLA-E (CD94/NKG2A); HLA-C (grupo 1 o 2), KIR2DL; KIR3DL (HLA-B Bw4) y péptido HLA-A3 o A4 . Los receptores de linfocitos NK activadores incluyen HLA-E (CD94/NKG2C); KIR2DS (HLA-C) y KIR3DS (HLA-Bw4). Otros receptores incluyen la proteína 1 del receptor de linfocitos NK (denominada NK1.1 en ratones) y el receptor de baja afinidad por la parte Fc de IgG (FcyRIII; c D16). Activadores específicos de linfocitos NK, las proteínas de unión a UL (ULBP) y su uso terapéutico potencial se describen en detalle en la solicitud de patente de los Estados Unidos US20090234699 de Cosman et al. "Activating" and "inhibitory" surface receptors control the NK cell's cytotoxic activity. Es importante destacar que por consideraciones terapéuticas, es necesario que la inhibición de linfocitos NK prevenga la destrucción de tejidos hospedadores normales por linfocitos NK "activados", pero la señalización inhibidora en linfocitos NK parece ser más fuerte que las señales de activación.
La médula ósea intacta es necesaria para la generación de linfocitos NK. Los linfocitos NK procedentes de la médula ósea humana son linfocitos granulares grandes (LGL) del fenotipo CD2+CD16+CD56+, que carecen de CD3 pero contienen la cadena zeta del receptor de linfocitos T [zeta(Z)-TCR]. Se pueden encontrar linfocitos NK en diversos tejidos linfoides y no linfoides, incluyendo sangre, bazo, hígado, pulmones, intestinos y decidua. Se han encontrado linfocitos NK en números significativos en tumores, donde pueden ejercer actividad antitumoral.
Los linfocitos NK presentan actividad citotóxica espontánea no restringida por MHC contra células tumorales e infectadas por virus y median en la resistencia a infecciones víricas y desarrollo de cáncer in vivo. Por tanto, los linfocitos NK representan células efectoras importantes de la inmunidad innata. Además, los linfocitos NK poseen diversas otras funciones, incluyendo la capacidad de secretar citocinas y regular la respuesta inmunitaria adaptativa y la hematopoyesis. Los linfocitos NK proporcionan el interferón-gamma (IFN-gamma) necesario durante las primeras etapas de la infección en varios modelos animales experimentales.
La mayoría de los cánceres carecen de antígenos específicos de tumor identificables en el contexto de HLA y, por tanto, no pueden sucumbir a linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno. Ya que una amplia gama de células cancerosas son sensibles a la citotoxicidad de NK, se puede emplear trasplante de linfocitos citolíticos naturales (NK) contra células cancerosas en un entorno alogénico, sin riesgo de enfermedad de injerto contra hospedador.
Estudios recientes han enfatizado este potencial de la terapia con linfocitos NK. En modelos animales de trasplante, los linfocitos NK donantes lisan células leucémicas y células linfohematopoyéticas hospedadoras sin afectar a los tejidos no hematopoyéticos. Debido a que los linfocitos NK son inhibidos por moléculas de HLA propio que se unen a receptores de tipo inmunoglobulina citolítica (KIR), estos hallazgos han conducido a la práctica clínica de seleccionar donantes de trasplante de células madre hematopoyéticas con un tipo HLA y KIR que favorezca la activación de linfocitos NK (desapareamiento de HLA y KIR) y, por tanto, podría esperarse que promueva un efecto antileucémico. Sin embargo, la selección del "mejor" donante se limita a pacientes que tienen más de un donante potencial y la capacidad de linfocitos NK para lisar células linfoides es generalmente baja y difícil de predecir. Un estudio de la distribución y función de NK en afecciones autoinmunitarias ha indicado una cantidad y funcionalidad reducidos de la población de linfocitos NK en muchas enfermedades autoinmunitarias (p. ej., LES, síndrome de Sjogren, esclerosis, psoriasis, AR, colitis ulcerosa, etc.). Por tanto, el tratamiento con linfocitos NK puede suprimir activamente linfocitos T autoinmunitarios potencialmente patógenos que pueden mediar en las respuestas inflamatorias después del trasplante de médula ósea, regulando la activación de linfocitos T de memoria autoinmunitarios de una manera inespecífica de antígeno para mantener la remisión clínica y prevenir el efecto de GVH.
Para uso clínico, habitualmente se recogen linfocitos NK del paciente o del donante mediante leucocitaféresis. Sin embargo, la dosis máxima de linfocitos NK es limitada y solo se pueden obtener dosis altas de linfocitos NK en pacientes con bajo peso corporal, haciendo que los niños sean los mejores candidatos para la terapia con linfocitos NK. De manera significativa, la cantidad total y la actividad de linfocitos NK pueden disminuir sustancialmente en infección vírica y/o cáncer, haciendo ineficaz la inmunoterapia basada en la activación de linfocitos NK endógenos. Además, las recaídas refractarias son una complicación importante en las transfusiones de células y muchos protocolos clínicos requieren infusiones repetidas de poblaciones de linfocitos.
En este sentido, Verneris et al. (Brit J Hematol 2009; 147: 185-91), que revisa las perspectivas para el uso clínico de linfocitos NK de la sangre del cordón umbilical, ha indicado recientemente que las poblaciones nuevas de linfocitos NK de sangre del cordón umbilical pueden requerir manipulación adicional para expresar su potencial funcional completo (citotóxico, de movilidad). Tras el tratamiento sistémico con diversos modificadores de la respuesta biológica, en particular IL-2, se ha descubierto que el número de linfocitos NK activados y sus actividades antivíricas y antimetastásicas aumentan drásticamente en diversos tejidos. En función de estas pruebas, se han intentado estrategias terapéuticas que implican la activación y expansión de linfocitos NK junto con IL-2 (e IL-15), así como la coadministración de IL-2 al receptor de la transfusión. Sin embargo, hasta la fecha, los resultados han sido decepcionantes, lo que indica solo direccionamiento limitado e injerto transitorio de los linfocitos NK infundidos. Además, la IL-2 es tóxica y debe usarse con extrema precaución en el entorno clínico.
En un intento de desarrollar un protocolo clínico factible para el enriquecimiento y la proliferación de linfocitos NK ex vivo, se ha utilizado tecnología magnética de selección de células, utilizando microperlas CD56 paramagnéticas y columnas de selección de células, para aislar una población CD56+ que contiene tanto NK CD3V56+ (60,6 ± 10,8 %) como linfocitos T NK CD3+/56+ (30,4 ± 8,6 %) para iniciar los estudios de proliferación. Con la adición de IL-2 humana recombinante o IL-2 más IL-15 humana recombinante se observó variabilidad sustancial en la expansión celular, dependiendo del donante, e incluso cuando el mismo donante se analizó en diferentes ocasiones. La citotoxicidad de células CD56+ seleccionadas y propagadas en una relación E:T baja fue significativamente mayor que la población inicial, pero era comparable a PBMC no separadas cultivadas durante 2 semanas en las mismas condiciones. En cultivos de PBMC nuevas, no seleccionadas, IL-15 (en combinación con IL-2) indujo una mayor destrucción a la relación E:T 1:1 que la IL-2 sola. Notablemente, ya que las células CD3+ no se agotaron antes del cultivo, la proliferación de linfocitos NKT CD3+CD56+ eran 2-3 veces mayores que la de linfocitos NK CD3'CD56+. Solo se produjo proliferación moderada de células CD56+/CD3', siendo la mayoría de las células resultantes linfocitos n Kt CD56+/CD3+.
En un enfoque diferente, se cultivan linfocitos NK CD3-CD56+ humanos a partir de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) CD34+ derivadas de MO cultivadas en presencia de diversas citocinas producidas por células estromales de la médula ósea y/o células inmunitarias (tales como ligando c-kit, IL-2 e IL-15). La adición del factor de células madre a estos cultivos no tiene ningún efecto sobre la diferenciación de las células efectoras citotóxicas CD3-CD56+, pero aumenta en gran medida su proliferación en cultivo. La mayoría de estas células carecen de CD2 y CD16, pero expresan zeta-TCR. De forma similar a los linfocitos NK hallados en la sangre periférica, se descubrió que los linfocitos NK CD2-CD16-CD56+ derivados de la médula ósea cultivados en presencia de IL-15 eran productores potentes de IFN-gamma en respuesta a citocinas derivadas de monocitos. IL-15 puede inducir la diferenciación de HPC CD34+ en linfocitos NK CD3-CD56+ y KL puede amplificar sus números. Sin embargo, los rendimientos de linfocitos NK están limitados por la baja cantidad de progenitores potenciales de NK entre la población de células CD34+.
Se han descrito otros métodos para la propagación de linfocitos NK. Frias et al. (Exp Hematol 2008; 36: 61-68) cultivaron progenitores NK (CD7+CD34'Lin'CD56‘) seleccionados de sangre del cordón umbilical en capas de células estromales con un medio sin suero, induciendo la diferenciación de NK con SCF, IL-7, IL-15, FL e IL-2, produciendo una mayor cantidad de linfocitos NK cultivados citotóxicos. Harada et al. (Exp Hematol. 2004; 32: 614-21) cultivaron linfocitos NK en células de una línea de células tumorales de Wilm. Waldmann et al. (documento US20070160578) describe una mayor proliferación de linfocitos NK y T CD8- de sangre completa, células de médula ósea o bazo en cultivo utilizando complejos de activador de ligando IL-15/R, para reducir la producción de citocinas indeseables. Campana et al. (documento US20090011498) describe cultivo ex vivo y activación de linfocitos NK, para el trasplante, en presencia de células leucémicas que expresan IL-15 y 4-1BB, y que tienen expresión de MHC-I o II débil o ausente. Childs et al. (documento US20090104170) describe proliferación ex vivo y activación de linfocitos NK mediante cocultivo con células linfoblastoides transformadas con VEB irradiadas, en presencia de IL-2. Usando otro enfoque, Tsai (documento US20070048290) produjo líneas celulares NK continuas a partir de células madre hematopoyéticas mediante cultivo ex vivo de progenitores NK inmortalizados con células OP-9S derivadas de 3T3 irradiadas, para investigación y posibles aplicaciones terapéuticas.
Sin embargo, los métodos establecidos para el cultivo de linfocitos NK también apoyan la proliferación de linfocitos T e, incluso después de que se agoten los linfocitos T, los linfocitos T residuales aumentan normalmente en número después de la estimulación, impidiendo el uso clínico de las poblaciones de células expandidas debido a una posible enfermedad de injerto contra hospedador. Esto requiere además otra ronda de agotamiento de linfocitos T antes de la infusión, haciendo que el procedimiento preparatorio consuma mucho tiempo, sea caro y provoque invariablemente una pérdida sustancial de linfocitos NK.
Para reducir la contaminación de linfocitos T después de la expansión, los protocolos de expansión de NK utilizan células CD56+CD3- purificadas como población inicial para sembrar en cultivos de expansión. Para obtener una fracción muy purificada de células CD56+CD3-, se necesita un procedimiento de purificación de dos etapas: selección positiva de células CD56 seguida de agotamiento de células CD3+ o primero el agotamiento de células CD3 seguido de selección positiva de células CD56. Sin embargo, este procedimiento es caro e implica una pérdida sustancial de células durante los dos ciclos de purificación. Incluso en cultivos iniciados con células CD56+CD3- purificadas, todavía existen productos NK expandidos contaminados con linfocitos T.
Los protocolos que utilizan citocinas solo para la expansión de linfocitos NK indican un efecto bastante modesto y la necesidad de estímulos adicionales además de las citocinas para obtener una expansión sustancial (Korean J Lab Med 2009; 29: 89-96, Koehl U et al. Klin Padiatr 2005; 217: 345-350). Se utilizan habitualmente células alimentadoras irradiadas (p. ej., células mononucleares de sangre periférica, líneas linfoblastoides transformadas por virus de Epstein-Barr (ABV-LCL), línea celular de leucemia mieloide K562, modificadas genéticamente para expresar una forma unida a la membrana de interleucina-15 y el ligando de la molécula coestimulante 4-1BB) y otras para la expansión de linfocitos NK como estímulos adicionales. Aunque la mayoría de los protocolos de expansión de NK utilizan células CD56+CD3- purificadas como población inicial, algunos protocolos utilizan células mononucleares como población de siembra inicial en combinación con estroma irradiado o anticuerpo anti-CD3 (Blood, 15 marzo de 2008, Vol. 111, n.° 6, págs. 3155-3162). Después de la expansión, estos cultivos están muy contaminados con células CD3+ y CD3+ CD56+ y, por lo tanto, es necesario purificar células CD56+CD3- antes de la infusión.
Miller et al (Blood, 199280: 2221-2229) obtuvieron una expansión de 30 veces de linfocitos NK a los 18 días de cultivo utilizando una fracción enriquecida en progenitores NK y monocitos que comprenden células CD56+CD3- en combinación con células CD14+ purificadas o MNC con agotamiento de CD5 y CD8 mediante selección en matraces de plástico recubiertos de anticuerpos. Ve'ronique Decot et al. (Experimenta1Hematology 2010; 38: 351-362) informó de una expansión de aproximadamente 20 veces de linfocitos NK en linfocitos T y B irradiados mediante el agotamiento de células mononucleares de T y B y descubrió que la población contaminante después del agotamiento era principalmente de monocitos. Sin embargo, en este modelo de cultivo, fueron necesarias células alimentadoras y citocinas para obtener amplificación de linfocitos NK porque no se observó expansión en presencia de citocinas solas o células alimentadoras solas. Por lo tanto, en contraste con Miller, incluso aunque los monocitos se enriquecieron en la población de siembra, no se observó expansión de linfocitos NK en ausencia de células de estroma T y B irradiadas (Decot et al., Exper Hematology 2010; 38: 351-362).
Por otra parte, aunque los linfocitos NK ex vivo cultivados con frecuencia demuestran una actividad considerable (p. ej., citotoxicidad) contra células diana no relacionadas, la actividad contra células tumorales y cancerosas clínicamente más relevantes, tanto in vitro como in vivo, ha sido a menudo decepcionante y se han propuesto métodos para mejorar la activación. Zitvogel et al. (patente de los Estados Unidos n.° 6.849.452) enseña la activación ex vivo o in vivo de linfocitos NK al entrar en contacto con células dendríticas activadas. Otros han sugerido potenciar la activación cultivando linfocitos NK con células que carecen de moléculas de MHC-I y modificadas genéticamente para expresar IL-15 (Campana et al., solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2009011498) o pretratamiento de receptores de linfocitos NK con inhibidores del proteasoma (Berg et al., Cytotherapy 2009; 11: 341-55). Sin embargo, ninguno de los protocolos ha producido poblaciones de linfocitos NK significativamente expandidos capaces de sobrevivir y expandirse en órganos diana adecuados del hospedador después del trasplante (proliferación homeostática) y la inmunoterapia con linfocitos NK proliferados ex vivo todavía está limitada por la incapacidad de obtener una cantidad suficiente de linfocitos NK funcionalmente competentes, muy purificados, adecuados para su uso en protocolos clínicos (véase Bachanova et al., Canc Immunol. Immunother. 2010; 59: 739-44; Guven, Instituto Karolinska, 2005; Schuster et al., E.J. Immunology 2009; 34: 2981-90; Bernardini et al. Blood 2008; 111: 3626-34). Por tanto, existe la necesidad de métodos rentables simplificados para propagar preferentemente NK ex vivo, como linfocitos NK aislados, o de una población mixta de células mononucleares agotadas o no de células CD3+.
Se mostró que la nicotinamida puede modular el destino y la función de las células (véase, por ejemplo, documentos WO 2003/062369, WO 2005/007799, WO 2005/007073, WO 2006/030442, WO 2007/063545 y WO 2008/056368).
Sumario de la invención
En vista de la creciente necesidad de una mayor cantidad de linfocitos NK terapéuticamente competentes para aplicaciones clínicas tales como terapia celular para la leucemia y otros cánceres, existe la necesidad de métodos mejorados, simplificados y rentables para mejorar la proliferación y activación ex vivo de linfocitos citolíticos naturales adecuados para su uso en el entorno clínico.
Por tanto, la expansión de linfocitos NK en cultivos ex vivo y mejora de su funcionalidad después de la infusión es fundamental para su aplicabilidad clínica en la inmunoterapia adoptiva.
La presente invención proporciona materia objeto como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de cultivo ex vivo de linfocitos citolíticos naturales (NK) como se describe en las reivindicaciones, comprendiendo el método cultivar una población de células que comprenden linfocitos NK con al menos un factor de crecimiento y una concentración eficaz, tiempo de exposición eficaz y duración eficaz de la exposición a la nicotinamida, en donde el cultivo de los linfocitos NK con el al menos un factor de crecimiento y la concentración eficaz, el tiempo de exposición eficaz y la duración eficaz de la nicotinamida da lugar a al menos una de las siguientes:
(a) expresión elevada de CD62L en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida; y
(b) actividad citotóxica aumentada en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Además, se desvela una población de linfocitos NK cultivados según el método de la presente invención.
Por consiguiente, se desvela una población de linfocitos NK caracterizados por al menos uno de los siguientes: (a) expresión elevada de CD62L en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida
(b) respuesta de migración elevada en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida;
(c) direccionamiento y retención in vivo elevados en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida;
(d) mayor proliferación en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida;
(e) actividad citotóxica aumentada en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida;
(f) una relación reducida de células CD3+ con respecto a CD56+/CD3- en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de nicotinamida. Además, se desvela una población de linfocitos NK caracterizados por un mejor direccionamiento, injerto y retención cuando se trasplantan, en donde la infusión de al menos 15X106 de la población de linfocitos NK en un hospedador de ratón SCID irradiado, da lugar a al menos 25 % de linfocitos NK derivados de donantes en un tejido linfático hospedador, detectado por inmunodetección y citometría de flujo, a los 4 días después de la infusión.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la población de linfocitos NK se caracteriza además por la expresión de CD62L en al menos el 30 % de dicha población celular en el momento de la infusión, detectado por inmunodetección y citometría de flujo. Según otras realizaciones más desveladas en el presente documento, la población de linfocitos NK se caracteriza además por una relación de células CD3+ con respecto a CD56+/CD3- igual o menor que 1:100 en el momento de la infusión.
Según otro aspecto más de algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de linfocitos NK de la invención.
Según otro aspecto más de algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se proporciona un método para tratar o prevenir una infección vírica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población cultivada ex vivo de linfocitos NK de la invención.
Según otro aspecto de algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se proporciona un método para tratar o prevenir la enfermedad de injerto contra hospedador en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población cultivada ex vivo de linfocitos NK de la invención. Según otro aspecto de algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población cultivada ex vivo de linfocitos NK de la invención. Según otro aspecto de algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección leucémica en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población cultivada ex vivo de linfocitos NK de la invención.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la población de linfocitos NK es autóloga o alogénica del sujeto.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la administración se realiza mediante una única
infusión o infusiones repetidas de la población de linfocitos NK.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, el sujeto se trata con un factor de crecimiento de
forma conjunta con la administración de la población de linfocitos NK.
Según algunas realizaciones de la presente invención, el al menos un factor de crecimiento es IL-15.
Según otro aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de transducción ex
vivo de linfocitos NK cultivados con un gen exógeno como se define en las reivindicaciones, comprendiendo el método:
(a) cultivar ex vivo una población de linfocitos NK según el método de la invención; y
(b) transducir la población cultivada de linfocitos NK con el gen exógeno.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, el al menos un factor de crecimiento es IL-2, el
tiempo de exposición proviene de la siembra de la población de células que comprenden linfocitos NK, la duración de
la exposición es de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 semanas y la concentración de la nicotinamida es de
5 mM.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la concentración eficaz de la nicotinamida es de
aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 25 mM, o
de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 2,5 mM, de aproximadamente 5,0 mM
o aproximadamente 7,5 mM.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, el tiempo de exposición es desde la siembra hasta
aproximadamente 5 semanas después del cultivo, o desde aproximadamente 1 hora después de la si aproximadamente 3 semanas después del cultivo, o desde aproximadamente 24 horas después de la siembra ha aproximadamente 3 semanas después del cultivo, o desde aproximadamente 2 días después de la si aproximadamente 2 semanas después del cultivo,
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desde la siembra de la población de células que dichos linfocitos NK en dicho cultivo.
Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la duración de la exposición es de
aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 semanas, o de aproximadamente 30 horas a aproximadamente 4
semanas, o de aproximadamente 2 días a aproximadamente 3 semanas, o aproximadamente 1 semana,
aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente un día, aproximadamente dos días,
aproximadamente tres días, aproximadamente cinco días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 12 días,
aproximadamente 15 días, aproximadamente 17 días o aproximadamente 20 días.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la población de células que comprenden dichos linfocitos NK
se obtiene de una fuente seleccionada del grupo que consiste en sangre del cordón umbilical, médula ósea y sangre
periférica.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la población de células que comprenden los linfocitos NK es
una población de células heterogéneas que comprende una fracción de linfocitos NK y una fracción de células CD3+.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la fracción de células CD3+ es mayor que dicha fracción de
linfocitos NK.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la fracción de linfocitos NK es mayor que dicha fracción de
células CD3+.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la población de células que comprenden los linfocitos NK es
una población de células nucleares totales o mononucleares empobrecida en células CD3+.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la población de células que comprenden los linfocitos NK es
una población de células nucleares totales o mononucleares empobrecida en células CD3+ y CD19+.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la población de células que comprenden los linfocitos NK es
una población de linfocitos NK no seleccionados.
Según algunas realizaciones de la presente invención, los linfocitos NK comprenden células CD56+CD3-.
Según algunas realizaciones de la presente invención, los linfocitos NK comprenden células CD56+CD16+CD3-.
Según algunas realizaciones de la presente invención, el cultivo de la población de células que comprende los linfocitos
NK se efectúa sin una capa alimentadora ni células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la presente invención, el al menos un factor de crecimiento es IL-15.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la expresión de CD62L se determina mediante un método seleccionado del grupo que consiste en citometría de flujo, inmunodetección, amplificación e hibridación cuantitativa de ADNc.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la expresión de CD62L se determina mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Según algunas realizaciones de la presente invención, la expresión de CD62L se determina utilizando anticuerpos monoclonales fluorescentes anti-CD62L humano.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la respuesta de migración elevada se determina mediante un ensayo de transmigración o de cierre de huecos.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la respuesta de migración elevada se determina mediante un ensayo de transmigración.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la transmigración se analiza en respuesta a la estimulación con SDF1.
Según algunas realizaciones de la presente invención, el direccionamiento y la retención in vivo elevados está determinada por FACS, expresado como porcentaje de linfocitos NK injertados en órganos diana después de la infusión.
Según algunas realizaciones de la presente invención, el órgano diana se selecciona del grupo que consiste en bazo, médula ósea y ganglios linfáticos.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la localización y el injerto se determinan de aproximadamente 1 día a aproximadamente 2 semanas después de la infusión de linfocitos n K.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la tasa de proliferación se determina mediante ensayos clonogénicos, ensayos mecánicos, ensayos metabólicos y ensayos de proliferación directa.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la tasa de proliferación se determina mediante análisis de FACS del porcentaje de células CD56+CD3- y se expresa como factor de aumento a lo largo del tiempo.
Según algunas realizaciones de la presente invención, la actividad citotóxica se analiza utilizando un ensayo de destrucción celular.
Según algunas realizaciones de la presente invención, las células diana del ensayo de destrucción celular son una línea celular cancerosa, células cancerosas primarias, células tumorales sólidas, células leucémicas o células infectadas por virus.
Breve descripción de los dibujos
Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada junto con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica realizaciones de la invención.
En los dibujos:
Las figs. 1A y 1B son histogramas que muestran la proliferación dependiente de la dosis de derivados de la fracción de linfocitos NK de sangre del cordón umbilical, purificados, después de cultivar en ausencia (citocinas) o presencia de concentraciones crecientes ("NAM" de 0,5 a 5 mM, como se indica) de nicotinamida. Los cultivos se iniciaron con linfocitos NK de sangre del cordón umbilical purificados en perlas inmunomagnéticas para el fenotipo CD56+ y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) durante hasta 3 semanas. La fig. 1A muestra la proliferación (factor de aumento o "expansión celular', en relación con el día 0, inicio de los cultivos) de los linfocitos NK CD56+ a los 14 días de cultivo. La fig. 1B muestra el factor de aumento de los linfocitos NK CD56+ después de 3 semanas de cultivo. Obsérvese el aumento drástico dependiente de la dosis en el componente de células CD56+ de los cultivos tratados con nicotinamida, que continúa a lo largo del periodo de cultivo completo, en comparación con los controles (citocinas).
Las figs. 2A-2C son histogramas que muestran la proporción de diferentes subconjuntos de linfocitos, agrupados según los marcadores de superficie celular (CD56, CD45, CD3) en cultivos iniciados con la fracción completa de células mononucleares derivadas de sangre del cordón umbilical mantenida en ausencia (citocinas) o presencia de nicotinamida. Los cultivos se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-15 e IL-2), con o sin concentraciones crecientes (de 0,5 a 5 mM) de nicotinamida ("NAM") durante 3 semanas, se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para marcadores de superficie y después se analizaron mediante FACS para fenotipos específicos. Fig. 2A = células CD56+/CD45+; (linfocitos Nk y NK-T) Fig. 2B = células CD56+/c D3- (NK); Fig. 2C = células CD3+/CD56- (T). Obsérvese el aumento dependiente de la dosis en la población de linfocitos NK (fenotipo CD56+/CD45+ y CD56+/CD3-) y la disminución conjunta de la población de linfocitos T (fenotipo CD3+/CD56-) en los cultivos tratados con nicotinamida;
la fig. 3 es un histograma que muestra la proliferación de fracción de células CD56+ derivadas de médula ósea, purificadas después de cultivar en ausencia (citocinas) o presencia de nicotinamida 2,5 mM. Los cultivos se iniciaron con células CD56+ (NK y NK-T) purificadas de médula ósea en perlas inmunomagnéticas y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) durante hasta 3 semanas con (sombreado oscuro) o sin (citocinas, sombreado claro) nicotinamida 2,5 mM. Obsérvese el aumento drástico del componente de linfocitos NK CD56+CD3- de los cultivos tratados con nicotinamida, que continúa a lo largo del periodo de cultivo completo, en comparación con los controles (citocinas, sombreado claro);
las figs. 4A y 4B son histogramas que muestran la proliferación de linfocitos NK frente a NKT de médula ósea a partir de células CD56+ de médula ósea purificadas después del cultivo en ausencia (citocinas) o presencia de nicotinamida. Los cultivos se iniciaron con células CD56+ derivadas de médula ósea purificadas en perlas inmunomagnéticas y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) durante 3 semanas, con o sin nicotinamida 2,5 mM. Las figs. 4A y 4B representan los resultados de dos experimentos ilustrativos independientes. Obsérvese el aumento drástico en la proporción de células NK CD56+CD3-(sombreado oscuro) y la reducción del componente de linfocitos NKT CD56+CD3+ (sombreado claro) de los cultivos tratados con nicotinamida en comparación con los controles (citocinas), independientemente de la proporción inicial de linfocitos NK frente a NKT en las células sembradas;
La fig. 5 es un histograma que muestra un mayor porcentaje de células que presentan el fenotipo de linfocitos NK CD56+CD16+ de células CD56+ de médula ósea purificadas después de cultivar en ausencia (citocinas) o en presencia de nicotinamida. Los cultivos se iniciaron con células CD56+ purificadas inmunomagnéticamente derivadas de médula ósea como se describe en las figs. 4A y 4B y se mantienen con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) con o sin nicotinamida 2,5 mM durante hasta 3 semanas. Obsérvese el aumento de la proporción de NK CD56+CD16+ a los 14 días (sombreado claro), continuando todavía a los 21 días (sombreado oscuro) en los cultivos tratados con nicotinamida en comparación con la reducción de la fracción de células CD56+CD16+ en los controles (citocinas);
las figs. 6A-6C son histogramas que muestran el efecto del cultivo a corto plazo con nicotinamida sobre la proliferación de subconjuntos de linfocitos NK y NKT de la médula ósea. Los cultivos se iniciaron con células CD56+ purificadas inmunomagnéticamente derivadas de la médula ósea y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) durante 7 días en ausencia (citocinas) o presencia de concentraciones crecientes de nicotinamida ("NAM", 1 mM, 2,5 mM y 5 mM), y se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para marcadores de superficie y se analizaron mediante FACS para fenotipos específicos. La fig. 6A representa el porcentaje de la población de células NK CD56+CD3- en función de la nicotinamida; la fig. 6B representa la reducción en la población CD56+CD3+ de linfocitos NKT en función de la nicotinamida en cultivo y la fig. 6C representa la proliferación del subconjunto de linfocitos NK CD56+CD16+ en función de la nicotinamida, en comparación con los controles (citocinas);
la fig. 7 es un histograma que muestra la reducción en el subconjunto inhibidor de linfocitos NK CD56+/NKG2A+ de células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical purificadas cultivadas durante tres semanas en presencia de concentraciones crecientes (de 1,0 a 5 mM) de nicotinamida. Se cultivaron células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical inmunomagnéticamente purificadas con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) en presencia o ausencia (citocinas) de concentraciones crecientes (1,0 a 5 mM) de nicotinamida ("NAM"). Después de tres semanas, las células se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para marcadores de superficie y se analizaron mediante FACS para determinar los fenotipos CD56+/NKG2A+. Reducción drástica de células CD56+NKG2A+ en los cultivos tratados con nicotinamida, en comparación con los controles (citocinas), sugiere una mayor activación de linfocitos NK con la exposición a nicotinamida;
la fig. 8A es un histograma que muestra el potencial de migración mejorado de linfocitos NK derivadas de sangre del cordón umbilical purificadas cultivadas con concentraciones crecientes de nicotinamida. Se cultivaron células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical inmunomagnéticamente purificadas con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) en ausencia (citocinas) o presencia de nicotinamida 2,5 mM o 5 mM. Después de dos semanas, se analizaron las células para migración ex vivo en respuesta a SDF 250 ng/ml en un ensayo Transwell. Las células de la cámara inferior se contaron mediante FACS. La migración mejorada, en presencia (sombreado oscuro) y ausencia (sombreado claro) de SDF (250 ng/ml), en comparación con los controles (citocinas), sugiere movilidad mejorada y migración dirigida de linfocitos NK por nicotinamida;
la fig. 8B es una tabla que muestra el aumento de la expresión de receptores migratorios (CXCR4), de adhesión (CD49e) y de transporte (CD62L) en células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical cultivadas durante tres semanas en presencia de 2,5 o 5 mM de nicotinamida. Los cultivos se iniciaron con células CD56 derivadas de sangre del cordón umbilical purificadas con perlas inmunomagnéticas y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) o citocinas más nicotinamida (2,5 y 5 mM). Después de 3 semanas, las células cultivadas se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie especificados y después se supervisaron mediante FACS. Obsérvese la expresión drásticamente mejorada de CXCR4 y CD62L y la expresión elevada de CD49e en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas);
la fig. 9 es un histograma que muestra el potencial de destrucción mejorado de células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical cultivadas con concentraciones crecientes de nicotinamida. Se cultivaron células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical purificadas por perlas inmunomagnéticas con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15), con (sombreado oscuro) o sin (sombreado claro) nicotinamida 2,5 mM. Después de 2 semanas, el análisis de FACScalibur indicó que todas las células tenían un fenotipo CD56+/CD3-. Los linfocitos NK de sangre del cordón umbilical se analizaron para determinar el potencial de destrucción ex vivo con 5X103 células diana K562 por ensayo, a 5:1, 10:1 y 20:1 linfocitos NK por célula diana (E:T). La muerte celular de K562 se supervisó mediante FACS como un porcentaje de células marcadas con CFSE positivas para PI. La destrucción mejorada de células diana, en comparación con los controles (citocinas) y células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical nuevas, no cultivadas (sin sombreado), sugiere fuertemente una activación mejorada del potencial de destrucción de linfocitos NK por nicotinamida;
la fig. 10 es un histograma que ilustra la expansión de linfocitos NK de sangre periférica humana durante un cultivo de tres semanas con nicotinamida. Los linfocitos NK de sangre periférica preparados por agotamiento de linfocitos T (CD3+ o CD3+CD19+) de la fracción de células mononucleares de unidades nuevas [aislamiento MidiMACS (columna de separación MACS, cat. n.° 130-042-901) o el cóctel de agotamiento de células CD3+ humanas RosetteSep (Stem Cell Technologies, RosestteSep, cat. n.° 15661)] se caracterizaron por análisis de FACS y se cultivaron en bolsas VueLife en presencia de las concentraciones indicadas de nicotinamida (sombreado claro NAM 2,5 y sombreado oscuro nA m 5 mM). Control = solo citocinas (NAM 0, sin sombreado). El medio de cultivo contenía MEMa, suero humano (10 % v/v) y citocinas (20 ng/ml de IL-15 y 50 ng/ml de IL-2 o solo 50 ng/ml de IL-2). El volumen de cultivo se duplicó después de 1 y 2 semanas y las células se contaron y tiñeron para el análisis de FACS después de 7, 14 y 21 días. Obsérvese el gran aumento de la expansión (factor de aumento en relación con el día 0) en presencia de nicotinamida, mientras que los controles solo con citocinas (NAM 0) muestran tendencia a perder la capacidad de autorrenovación a lo largo del tiempo;
la fig. 11 es un histograma que muestra el efecto de la nicotinamida y la densidad de siembra en los linfocitos NK de sangre periférica humana durante un cultivo de tres semanas. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de linfocitos T (CD3+ o CD3+CD19+) de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se sembraron a 2, 5 o 10X105 células/ml con 10 ml en cada bolsa de cultivo. A continuación, las células se expandieron en presencia de las concentraciones indicadas (NAM 2,5, sombreado claro y NAM 5 mM, sombreado oscuro) de nicotinamida o citocinas solamente (citocinas, sin sombreado). La mejora de la proliferación de linfocitos NK por nicotinamida es evidente a todas las densidades de siembra;
la fig. 12 es un histograma que muestra los porcentajes de linfocitos NK CD56+CD3- en cultivos de 21 días de linfocitos NK de sangre periférica humana. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de linfocitos T (CD3+ o CD3+CD19+) de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se sembraron a 5X105 células/ml con 10 ml en cada bolsa de cultivo. A continuación, las células se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas (NAM 2,5 y NAM 5 mM) de nicotinamida o solo citocinas (citocinas). Obsérvese que aunque los porcentajes de linfocitos n K fueron mayores en todos los grupos después de 21 días en cultivo, en cultivos expuestos a nicotinamida los porcentajes de NK son incluso mayores que en cultivos de control;
las figs. 13A-13C son histogramas que muestran el aumento de la expresión del receptor migratorio CD62L en cultivos de linfocitos NK de sangre periférica humana expuestos a nicotinamida. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de linfocitos T (CD3+ o CD3+CD19+) de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se expandieron en presencia de las concentraciones indicadas (NAM 2,5 y NAM 5 mM) de nicotinamida o citocinas solamente (citocinas). Después de 7 (13A), 14 (13B) y 21 (13C) días, las células cultivadas se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie especificados y después se supervisaron mediante FACS. Obsérvese la expresión drásticamente mejorada de CD62L, que aumenta con la duración de la exposición, en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con controles (solo citocinas);
las figs. 14A-14B son histogramas que muestran la inhibición de la proliferación de monocitos y granulocitos en cultivos de linfocitos NK de sangre periférica humana expuestos a nicotinamida. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de linfocitos T (CD3+ o CD3+CD19+) de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se expandieron en presencia de las concentraciones indicadas (NAM 2,5 y NAM 5 mM) de nicotinamida o citocinas solamente (citocinas). Después de 2 semanas, las células cultivadas se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para el marcador de monocitos CD14 (fig. 14A) o el marcador de granulocitos CD15 (fig. 14B) y después se supervisan mediante FACS. Obsérvese la reducción drásticamente mejorada en células CD14+ o CD15+ en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas);
las figs. 15A-15D son histogramas que ilustran el potencial de destrucción mejorado de los linfocitos NK cultivados con nicotinamida de linfocitos NK de sangre periférica humana expuestos a nicotinamida. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de CD3+ o CD3+CD19+ de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se expandieron en presencia de las concentraciones indicadas (NAM 2,5, sombreado claro y NAM 5 mM, sombreado oscuro) o citocinas solamente (citocinas, sin sombreado). Los linfocitos NK de sangre periférica se analizaron para determinar el potencial de destrucción ex vivo con K562 o BL2(15A), leucemia bifenotípica primaria (15B y 15C) y células diana de cáncer de colon Colo205 (15D) en una relación E:T de 1:1, 2,5:1, 5:1 o 10:1 linfocitos NK por célula diana, como se indica. Se supervisó la muerte de células diana de las líneas celulares mediante FACS como porcentaje de células marcadas dobles, positivas para PI y positivas para CFSE. Se supervisó la muerte de células diana de la leucemia primaria mediante FACS como reducción en los porcentajes de células diana marcadas con CFSE. La destrucción mejorada de células diana, en comparación con los controles cultivados (solo citocinas, NAM 0, sin sombreado) y linfocitos NK no cultivados, nuevos, (control, sombreado) sugieren fuertemente una activación mejorada del potencial de destrucción de linfocitos NK por nicotinamida;
la fig. 16 es un histograma que muestra un aumento de la funcionalidad in vivo (direccionamiento e injerto) de linfocitos NK expandidos en presencia de nicotinamida. Se prepararon linfocitos NK de sangre periférica mediante el agotamiento de CD3+ o CD3+CD19+ de las células mononucleares como se detalla en la fig. 10 y se expandió en presencia de las concentraciones indicadas de nicotinamida (NAM 2,5 mM, sombreado claro; NAM 5 mM, sombreado oscuro) o solo citocinas (NAM 0, sin sombreado). Después de 2-3 semanas en cultivo, Se infundieron 15x106 linfocitos NK de cada grupo experimental en ratones n Od/SCID irradiados (350 Rad). Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infusión y las muestras de bazo, médula ósea y sangre periférica se analizaron para determinar el injerto de linfocitos Nk (CD45+CD56+) humanos. Obsérvese que el direccionamiento/la retención/el injerto in vivo de linfocitos NK cultivados con nicotinamida en comparación con el de linfocitos NK cultivados sin nicotinamida;
la fig. 17 es un histograma que muestra la proliferación dependiente de la dosis de fracción de linfocitos NK purificados CD56+ derivados de la sangre del cordón umbilical cuando se cultivan en ausencia (citocinas) o presencia de concentraciones crecientes (NAM, 1 a 7,5 mM) de nicotinamida. Los cultivos se iniciaron con linfocitos NK de sangre del cordón umbilical purificados en perlas inmunomagnéticas para el fenotipo CD56+ y se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) durante hasta 3 semanas. La fig. 17 muestra la proliferación (factor de aumento, en relación con el día 0, inicio de los cultivos) de los linfocitos NK CD56+ a los 7 (sin sombreado), 14 (sombreado claro) y 21 (sombreado oscuro) días en cultivo. Obsérvese el aumento drástico dependiente de la dosis en la expansión de los cultivos tratados con nicotinamida, que continúa a lo largo del periodo de cultivo completo, en comparación con los controles (citocinas);
las figs. 18A y 18B muestran la inhibición de la proliferación de linfocitos T (CD3+) y NKT (CD3+CD56+) en cultivos iniciados con sangre periférica parcialmente desprovista en CD3 y mantenidos en ausencia (citocinas, 0 NAM, sin sombreado) o presencia de nicotinamida. Los cultivos se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-15 e IL-2), con o sin concentraciones crecientes (2,5, sombreado oscuro; 5 mM, sombreado claro y 7,5 mM, sombreado muy claro) de nicotinamida durante 3 semanas, se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para marcadores de superficie (56FITC y 3APC) y se analizaron mediante FACS (18B) para fenotipos específicos. Obsérvese la reducción drástica de linfocitos T CD3+ y linfocitos NKT CD3+CD56+ en cultivos NK expuestos a nicotinamida;
las figs. 19A y 19B muestran la mejora de la expresión del receptor de transporte de CD62L con nicotinamida. La fig. 19A es un histograma que muestra los niveles de expresión del receptor de transporte de CD62L en células CD56+ purificadas de sangre periférica antes (sombreado muy claro) y después de la activación en cultivo con IL-2, expuestos durante 3 semanas en cultivo en nicotinamida 2,5 (sombreado claro) y 5 (sombreado oscuro) mM, en comparación con los controles solo de citocinas (0 "NAM", sin sombreado). La fig. 19B es un análisis de FACS de la expresión de CD62L, en células CD56+ de sangre periférica purificadas, cultivadas en nicotinamida (2,5 -7,5 mM), o controles (NAM 0), durante 3 semanas. Obsérvese la expresión drásticamente mejorada de CD62L en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas);
la fig. 20 es un histograma que muestra el efecto de la nicotinamida sobre la proliferación (factor de aumento) de células CD56+ purificadas a partir de fracciones de células mononucleares derivadas de sangre periférica mediante el agotamiento de CD3 seguido de la selección de células CD56+. Las células CD56+ purificadas se sembraron en cultivo (IL-2, IL-15 y Flt-3 con o sin nicotinamida 2,5 y 5 mM) y con estroma irradiado derivado de células mononucleares de sangre periférica de la misma unidad sanguínea (Cit+Irr, NAM 2,5+Irr y NAM 5+Irr). La relación entre las células sanguíneas periféricas irradiadas y las células seleccionadas CD56+ fue de 10:1. Obsérvese el aumento drástico de la proliferación en las tratadas con nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas);
la fig. 21 es un histograma que muestra el efecto de la nicotinamida en la expresión de CXCR4 en células CD56+ en cultivos tratados con citocinas y células de estroma irradiadas, como se describe en la fig. 20;
la fig. 22 es un histograma que muestra el efecto del cultivo con nicotinamida en la expresión de CD62L en células CD56+ en cultivos tratados con citocinas y células de estroma irradiadas, como se describe en la fig. 20;
la fig. 23 es un histograma que muestra el efecto del cultivo con nicotinamida en potencial de destrucción ex vivo por parte de células CD56+ de las células diana K562, a relaciones E:T de 1:1, 2,5:1 y 5:1 células CD56+ por célula diana. La muerte de células diana se supervisó mediante FACS como un porcentaje de células K562 marcadas con CFSE positivas para PI. La destrucción mejorada de células diana, con células cultivadas en las concentraciones indicadas de nicotinamida (NAM 2,5+Irr, sombreado claro; y NAM 5+Irr, sombreado oscuro), en comparación con el control (solo citocinas, NAM 0+Irr, sin sombreado) sugiere fuertemente una activación mejorada del potencial de destrucción de linfocitos NK por nicotinamida, no relacionado con los efectos de las células irradiadas.
Descripción de realizaciones de la invención
La presente invención trata de métodos para propagar una población de linfocitos citolíticos naturales (NK), manteniendo o mejorando, al mismo tiempo, la función de las células ex vivo y/o in vivo. En una realización, el cultivo ex vivo de linfocitos NK con nicotinamida y factores de crecimiento de linfocitos NK facilita la producción de poblaciones de linfocitos NK para su uso como preparación terapéutica de células cultivadas ex vivo, que incluye una población propagada de linfocitos NK funcionales, en el que se inhibe la proliferación de células CD3+ mientras que se potencia preferentemente la proliferación de linfocitos Nk . Específicamente a este respecto, la presente invención se puede utilizar para proporcionar poblaciones robustas de linfocitos NK funcionales, que se pueden utilizar para aplicaciones en trasplantes de células para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades, y en la generación de linfocitos NK adecuados para manipulaciones genéticas, que pueden utilizarse para terapia génica celular. Las aplicaciones no limitantes, adicionales, pueden incluir el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedador (p. ej., en la reconstitución de la médula ósea), inmunoterapia adoptiva alogénica y autóloga, tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, terapia de combinación con agentes sensibilizantes y transferencia génica en linfocitos NK. La presente divulgación se refiere además a preparaciones de linfocitos NK útiles para transfusión y a artículos manufacturados para prepararlas.
Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor en referencia a los ejemplos y las descripciones adjuntas.
Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada necesariamente en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados mediante los ejemplos. La invención tiene capacidad para otras realizaciones o puede practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras.
Los linfocitos citolíticos naturales (en lo sucesivo en el presente documento también abreviados como "NK") son células linfoides que participan en reacciones inmunitarias. Estas células tienen diversas funciones, especialmente la destrucción de células tumorales, células que experimentan transformación oncogénica y otras células anómalas en un cuerpo vivo y son componentes importantes de los mecanismos innatos de vigilancia inmunológica. Los linfocitos NK presentan actividad citotóxica espontánea no restringida por MHC contra células tumorales e infectadas por virus y median en la resistencia a infecciones víricas y desarrollo de cáncer in vivo. Por tanto, los métodos para aumentar de manera eficaz la cantidad de linfocitos NK pueden ser útiles para el tratamiento de tumores y la eliminación de células infectadas por virus consideradas fuentes potenciales de generación de tumores.
Por tanto, el desarrollo de protocolos de uso clínico (p. ej., sin capa estromal, citocinas mínimas) para expandir de manera eficaz la cantidad de linfocitos NK viables y mejorar de manera eficaz su función y probabilidad de dirigirse a los ganglios linfáticos y su proliferación homeostática in vivo después de la infusión, podría mejorar el éxito de la inmunoterapia adoptiva con linfocitos NK para el tratamiento de tumores sólidos, neoplasias hematopoyéticas, trastornos víricos y autoinmunitarios y similares.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la exposición ex vivo de los linfocitos NK a la nicotinamida por encima de una concentración determinada, como se detalla adicionalmente en el presente documento, durante el cultivo mejora eficazmente la proliferación y/o funcionalidad de los linfocitos NK funcionalmente competentes y da lugar a una reducción significativa de la fracción de linfocitos T del cultivo. Como tal, en una realización de la misma, la presente invención proporciona condiciones de cultivo clínicamente adecuadas capaces de inducir eficazmente la proliferación y/o función de linfocitos NK funcionalmente maduros ex vivo e in vitro, sin inducción conjunta de la proliferación de células distintas de NK (p. ej., CD3+).
Por tanto, según un aspecto de una realización de la presente invención, se proporciona un método de cultivo ex vivo de linfocitos citolíticos naturales (NK), comprendiendo el método cultivar una población de células que comprenden linfocitos NK con al menos un factor de crecimiento y una concentración eficaz, tiempo de exposición eficaz y duración eficaz de la exposición a la nicotinamida, en donde el cultivo de los linfocitos Nk con el al menos un factor de crecimiento y la concentración eficaz, el tiempo de exposición eficaz y la duración eficaz de la nicotinamida da lugar a al menos una de las siguientes:
(a) expresión elevada de CD62L en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida; y
(b) actividad citotóxica aumentada en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Como se usa en el presente documento, la expresión linfocitos citolíticos naturales (NK) se refiere a linfocitos granulares grandes implicados en la respuesta inmunitaria innata. Funcionalmente, los linfocitos NK presentan actividad citolítica contra diversas dianas a través de la exocitosis de gránulos citoplasmáticos que contienen diversas proteínas, incluyendo perforina y granzima proteasas. La destrucción se desencadena en un proceso no fagocítico, dependiente del contacto, que no requiere sensibilización previa a un antígeno. Los linfocitos NK humanos se caracterizan por la presencia de los marcadores de superficie celular CD16 y CD56 y la ausencia del receptor de linfocitos T (CD3). Los linfocitos NK derivados de la médula ósea humana se caracterizan además por el fenotipo CD2+CD16+CD56+CD3-, que además contiene la cadena zeta del receptor de linfocitos T [zeta(Z)-TCR], y con frecuencia se caracterizan por NKp46, NKp30 o NKp44. Las células distintas de NK, tales como linfocitos NKT o CD8NKT, poseen características y marcadores de superficie celular tanto de linfocitos T como de linfocitos NK. En una realización, el método de la presente invención se emplea para propagación ex vivo de linfocitos NK maduros de una población de células. Como se usa en el presente documento, la expresión "linfocito NK maduro" se define como un linfocito NK comprometido, que tiene marcadores de superficie característicos y función de linfocitos NK, y que carece del potencial para una mayor diferenciación. Como se usa en el presente documento, los linfocitos NK maduros incluyen, pero sin limitación, células Cd56brillante, que pueden proliferar y producir citocinas abundantes, células CD56tenue, que presentan citotoxicidad robusta, células CD56brillanteCD94alt° y CD56tenueCD94alto En otra realización, se propagan células progenitoras NK o poblaciones mixtas de células progenitoras NK y linfocitos NK maduros. Se puede determinar la expresión de superficie celular de los marcadores CD56, CD3, CD16, CD94 y otros, por ejemplo, mediante análisis de FACS o técnicas de tinción inmunohistológica.
Como se usa en el presente documento, el término "progenitor" se refiere a una célula inmadura capaz de dividirse y/o experimentar diferenciación en una o más células efectoras maduras. Los progenitores de linfocitos incluyen, por ejemplo, células madre hematopoyéticas pluripotentes capaces de dar lugar a células maduras de los linajes de linfocitos B, linfocitos T y NK. En el linaje de linfocitos B (es decir, en la ruta de desarrollo que da lugar a linfocitos B maduros), las células progenitoras también incluyen linfocitos pro-B y linfocitos pre-B caracterizados por reordenamiento y expresión de genes de inmunoglobulina. En los linajes de linfocitos T y NK, las células progenitoras también incluyen progenitores de linfocitos T/NK bipotenciales derivados de médula ósea [p. ej., células CD34(+)CD45RA(alto)CD7(+) y CD34(+)CD45RA(alto)Lin(-)CD10(+)], así como células progenitoras intratímicas, incluyendo timocitos doble negativos (con respecto a CD4 y CD8) y doble positivos (linaje de linfocitos T) y progenitores de linfocitos NK comprometidos. Los progenitores hematopoyéticos incluyen células CD34+ y progenitores tempranos tales como células CD133+, CD34+CD38- y CD34+Lin-.
Como se usa en este documento, la expresión "ex-vivo" se refiere a un proceso en el que las células se eliminan de un organismo vivo y se propagan fuera del organismo (p. ej., en un tubo de ensayo). Como se usa en el presente documento, la expresión "in vitro" se refiere a un proceso mediante el cual se cultivan células que se sabe que se propagan solas in vitro, tales como diversas líneas celulares.
Se puede efectuar la expansión ex vivo de linfocitos NK, según este aspecto de la presente invención, proporcionando a linfocitos NK ex vivo condiciones para la proliferación celular y cultivando ex vivo los linfocitos NK con un resto de nicotinamida, propagando de este modo ex vivo la población de linfocitos NK.
Como se usa en el presente documento, "cultivar" incluye proporcionar las condiciones químicas y físicas (p. ej., temperatura, gas) que son necesarias para el mantenimiento de linfocitos NK y factores de crecimiento. En una realización, cultivar los linfocitos NK incluye proporcionar a los linfocitos NK condiciones para la proliferación. Los ejemplos de condiciones químicas que pueden favorecer la proliferación de linfocitos NK incluyen, pero sin limitación, tampones, nutrientes, suero, vitaminas y antibióticos así como citocinas y otros factores de crecimiento que se proporcionan normalmente en el medio de crecimiento (es decir, cultivo). En una realización, el medio de cultivo de NK incluye MEMa que comprende 10 % de FCS o CellGro SCGM (Cell Genix) que comprende suero humano al 5 %/reemplazo de FBS LiforCell® (Lifeblood Products). Otros medios adecuados para su uso con la invención incluyen, pero sin limitación, el medio de Glascow (Gibco Carlsbad CA), medio RPMI (Sigma-Aldrich, St Louis MO) o DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis MO). Se observará que muchos de los medios de cultivo contienen nicotinamida como complemento vitamínico, por ejemplo, MEMa (nicotinamida 8,19 j M), RPMI (nicotinamida 8,19 j M), DMEM (nicotinamida 32,78 j M) y medio de Glascow (nicotinamida 16,39 j M), sin embargo, los métodos de la presente invención se refieren a nicotinamida añadida de forma exógena que complementa cualquier nicotinamida incluida en la fórmula del medio o la resultante del ajuste global de las concentraciones de los componentes del medio.
Según algunas realizaciones de la presente invención, cultivar los linfocitos NK con factores de crecimiento comprende proporcionar a las células nutrientes y al menos un factor de crecimiento, en donde dicho al menos un factor de crecimiento es interleucina-15 (IL-15. Se contempla el uso de otras citocinas y factores de crecimiento, por ejemplo, la adición de IL-1, TNF-a, etc. Las citocinas y otros factores de crecimiento se proporcionan normalmente en concentraciones que varían entre 0,5 y 100 ng/ml o 1,0-80 ng/ml, más habitualmente 5-750 ng/ml, aún más habitualmente 5,0-50 ng/ml (se pueden contemplar hasta 10X dichas concentraciones) y están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NJ, Estados Unidos. En una realización, el al menos un factor de crecimiento es IL-2. En otra realización, el factor de crecimiento es IL-15. En otra realización más, los linfocitos NK se cultivan con IL-2 e IL-15.
Además, se apreciará a este respecto que se descubren continuamente nuevas citocinas, algunas de las cuales pueden encontrar usos en los métodos de proliferación de linfocitos NK de la presente invención. Para aplicaciones, en las que se introducen (o reintroducen) células en un sujeto humano, con frecuencia es preferible utilizar formulaciones sin suero, tales como medio sin suero AIM V.RTM para cultivo de linfocitos o medio de médula ósea MARROWMAX.rtm. Dichas formulaciones y complementos de medios están disponibles en fuentes comerciales tales como Invitrogen (GIBCO) (Carlsbad, Calif.). Los cultivos se pueden complementar con aminoácidos, antibióticos y/o con citocinas para promover una viabilidad óptima, proliferación, funcionalidad y/o supervivencia.
Según una realización, las células se cultivan con factores de crecimiento y nicotinamida. Como se usa en el presente documento, la expresión "resto de nicotinamida" se refiere a nicotinamida. Los derivados, análogos y metabolitos de nicotinamida pueden cribarse y evaluarse para determinar su efecto sobre la proliferación de NK ex vivo en cultivo mediante la adición de cultivos de NK mantenidos como se describe a continuación en el presente documento, además de ensayos funcionales tales como ensayos de destrucción y movilidad (véase la sección de ejemplos), o en protocolos de cribado automáticos diseñados para ensayos de alto rendimiento bien conocidos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la expresión "análogo de nicotinamida" se refiere a cualquier molécula que se sabe que actúa de manera similar a la nicotinamida en los ensayos antes mencionados o similares. Los ejemplos representativos de análogos de nicotinamida pueden incluir, sin limitación, benzamida, nicotinotioamida (el análogo tiol de la nicotinamida), ácido nicotínico y ácido a-amino-3-indolpropiónico.
La expresión "derivado de nicotinamida" se refiere además a cualquier derivado estructural de la propia nicotinamida o de un análogo de nicotinamida. Los ejemplos de dichos derivados incluyen, sin limitación, benzamidas sustituidas, nicotinamidas y nicotinatioamidas sustituidas y nicotinamidas y nicotintioamidas N-sustituidas, 3-acetilpiridina y nicotinato de sodio
El resto de nicotinamida de la invención es nicotinamida.
Como se usa en el presente documento, la expresión "concentración eficaz" de nicotinamida se define como la concentración de nicotinamida que, cuando se proporciona a la población de linfocitos NK en cultivo, para una duración eficaz de la exposición a la nicotinamida y en un tiempo eficaz de exposición a la nicotinamida en cultivo, da lugar a uno o más de expresión elevada de CD62L, respuesta de migración elevada, direccionamiento elevado y retención in vivo, mayor proliferación y actividad citotóxica aumentada de los linfocitos NK, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas pero con menos de 0,1 mM de la nicotinamida. Las concentraciones de nicotinamida adecuadas para su uso en algunas realizaciones desveladas en el presente documento se encuentran normalmente en el intervalo de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 2,5 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 5,0 mM a aproximadamente 10 mM. Los ejemplos I-VII a continuación demuestran concentraciones eficaces ilustrativas del resto de nicotinamida (nicotinamida) de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mM, normalmente 2,5 o 5,0 mM, en función del efecto de estas concentraciones de nicotinamida sobre la proliferación y la función de linfocitos NK. Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, se contemplan concentraciones de nicotinamida en el intervalo (mM) de aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,25, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,75, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,25, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,75, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,25, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,75, aproximadamente 5,0, aproximadamente 5,25, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,75, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,25, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,75, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,25, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,75, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,25, aproximadamente 8,5, aproximadamente 8,75, aproximadamente 9,0, aproximadamente 9,25, aproximadamente 9,5, aproximadamente 9,75, aproximadamente 10,0, aproximadamente 11,0, aproximadamente 12,0, aproximadamente 13,0, aproximadamente 14,0, aproximadamente 15,0, aproximadamente 16,0, aproximadamente 17,0, aproximadamente 18,0 y aproximadamente 20,0 mM, y todas las concentraciones intermedias eficaces.
Las concentraciones eficaces de nicotinamida se pueden determinar según cualquier ensayo de proliferación y/o actividad de NK, por ejemplo, protocolos de cultivo o función celular como se detalla en los ejemplos I-VI a continuación. Según una realización, una concentración eficaz de nicotinamida es una concentración cuyo uso en cultivo "potencia" o da lugar a un aumento neto de la proliferación y/o función de los linfocitos NK en cultivo, en comparación con cultivos de "control" que tienen menos de 0,1 mM de la nicotinamida y analizada a partir de la misma preparación de sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica, en el mismo ensayo y en condiciones de cultivo similares (duración de la exposición a la nicotinamida, tiempo de exposición a la nicotinamida).
Como se usa en el presente documento, la expresión "duración de tiempo eficaz" de exposición de los linfocitos NK a la nicotinamida se define como la duración de la exposición a la nicotinamida durante la cual, cuando la nicotinamida y/u otra nicotinamida se proporciona a la población de linfocitos NK en cultivo en una concentración eficaz y en un tiempo de exposición eficaz, da lugar a uno o más de expresión elevada de CD62L, respuesta de migración elevada, direccionamiento elevado y retención in vivo, mayor proliferación y actividad citotóxica aumentada de los linfocitos NK, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas pero con menos de 0,1 mM de nicotinamida. La duración de la exposición de las poblaciones de linfocitos NK a nicotinamida adecuada para su uso en algunas realizaciones desveladas en el presente documento está normalmente en el intervalo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 5 semanas, de aproximadamente 30 horas a aproximadamente 4 semanas, de aproximadamente 2 días a aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas. Los ejemplos I-VI a continuación demuestran duraciones eficaces ilustrativas de exposición a nicotinamida de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 3 semanas, en función del efecto de la exposición a nicotinamida sobre la proliferación y la función de linfocitos NK. Según algunas realizaciones desveladas en el presente documento, la duración de la exposición a nicotinamida es de aproximadamente 1,0, aproximadamente, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5,0, aproximadamente 6,0, aproximadamente 7,0, aproximadamente 8,0, aproximadamente 9,0, aproximadamente 10,0, aproximadamente 11,0, aproximadamente 12,0, aproximadamente 13,0, aproximadamente 14.0, aproximadamente 15,0, aproximadamente 16,0, aproximadamente 17,0, aproximadamente 18,0, aproximadamente 19,0, aproximadamente 20,0, aproximadamente 21,0 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 35 días y se contemplan todas las duraciones intermedias eficaces. Las duraciones eficaces del tiempo de exposición a nicotinamida se pueden determinar según cualquier ensayo de proliferación y/o actividad de NK, por ejemplo, protocolos de cultivo o función celular como se detalla en los ejemplos I-VI a continuación.
Se apreciará que la exposición de las poblaciones de linfocitos NK a la nicotinamida puede iniciarse con el establecimiento del cultivo celular, o en cualquier momento durante el cultivo celular, incluso durante un periodo breve justo antes de su uso (p. ej., infusión) de linfocitos NK. Como se usa en el presente documento, la expresión "tiempo de exposición eficaz" de la población de linfocitos NK a la nicotinamida se define como el momento en el que, durante el cultivo de la población de NK, la nicotinamida se proporciona a la población de linfocitos NK, en una concentración eficaz de la nicotinamida y durante una duración de tiempo eficaz, lo que da lugar a uno o más de expresión elevada de CD62L y aumento de la actividad citotóxica de los linfocitos NK, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas pero con menos de 0,1 mM de la nicotinamida. El tiempo de exposición de las poblaciones de linfocitos NK a la nicotinamida adecuada para algunas realizaciones de la presente invención es normalmente desde la siembra de los linfocitos NK hasta aproximadamente 5 semanas después del cultivo, desde aproximadamente 1 hora después de la siembra hasta aproximadamente 3 semanas después del cultivo, desde aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 3 semanas después del cultivo y desde el momento de la siembra de la población de linfocitos NK en cultivo. Según algunas realizaciones de la invención, el tiempo de exposición de los linfocitos NK a la nicotinamida es en el momento de la siembra, aproximadamente 2 horas después de la siembra de las células, aproximadamente 12 horas después de la siembra de las células, aproximadamente 24 horas después de la siembra de las células, aproximadamente 2 días después de la siembra de las células, aproximadamente 4 días después de la siembra de las células, aproximadamente 7 días después de la siembra de las células, aproximadamente 8,0, aproximadamente 9,0, aproximadamente 10,0, aproximadamente 11,0, aproximadamente 12,0, aproximadamente 13.0, aproximadamente 14,0, aproximadamente 15,0, aproximadamente 16,0, aproximadamente 17,0, aproximadamente 18,0, aproximadamente 19,0, aproximadamente 20,0, aproximadamente 21,0 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 35 días después de la siembra de las células y se contemplan todos los tiempos intermedios eficaces. Los tiempos eficaces de exposición a la nicotinamida se pueden determinar según cualquier ensayo de proliferación y/o actividad de NK, por ejemplo, protocolos de cultivo o función celular como se detalla en el presente documento, por ejemplo, en los ejemplos I-VI a continuación en el presente documento.
Como se detalla en la sección de ejemplos a continuación, el cultivo de poblaciones de linfocitos NK con al menos un factor de crecimiento y concentraciones eficaces de nicotinamida, proporcionadas a un tiempo de exposición eficaz para una duración eficaz del cultivo, da lugar a al menos una de proliferación mejorada y/o función mejorada de los linfocitos NK de las células cultivadas, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas en menos de 0,1 mM de nicotinamida.
Como se usa en el presente documento, el término "propagación" o "proliferación" se refiere al crecimiento, por ejemplo, crecimiento celular y multiplicación del número de células. La propagación y proliferación, como se usa en el presente documento se refieren a una mayor cantidad de linfocitos n K que se acumulan durante el periodo de incubación. La propagación in vitro o in vivo de células que presenta el fenotipo de linfocitos NK es un fenómeno conocido después de su estimulación, por ejemplo, con IL-2, líneas linfoblastoides transformadas por virus de Epstein-Barr y otras.
Ensayos de proliferación celular bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, ensayos clonogénicos, en los que las células se siembran y se cultivan en densidades bajas, y se cuentan las colonias, ensayos mecánicos [citometría de flujo (p. ej., FACS™), yoduro de propidio], que miden mecánicamente el número de células, ensayos metabólicos (tales como la incorporación de sales de tetrazolio, p. ej., XTT, MTT, etc.), que miden el número de células viables, ensayos de proliferación directa (tales como BUdR, incorporación de timidina y similares), que miden la síntesis de a Dn de poblaciones en crecimiento. En una realización, la proliferación celular de poblaciones de linfocitos NK cultivados con concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención se mide en un tiempo predeterminado después de sembrar linfocitos NK en cultivo (por ejemplo, aproximadamente 10 horas, 12 horas, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 semanas, 2 meses o más) se determina mediante análisis de FACS, utilizando marcadores anti-CD56 y anti-CD3 para identificar y cuantificar la fracción de linfocitos NK CD56+CD3- de la población. La proliferación de linfocitos NK se puede expresar como el factor de aumento, (p. ej., expansión o factor de expansión) de linfocitos NK, en comparación con la fracción de linfocitos NK original antes del cultivo. En algunas realizaciones, las poblaciones de linfocitos NK expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención tienen un factor de aumento de la población de linfocitos NK de al menos 2X, al menos 10X, al menos 20X, al menos 40X, al menos 50X, al menos 75X, al menos 100X, al menos 150X, al menos 250X y al menos 500X o más, después de aproximadamente 5, aproximadamente 7, aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente 18, aproximadamente 21, aproximadamente 25, aproximadamente 30 o más días de cultivo. En otra realización, el factor de expansión de las poblaciones de linfocitos NK, según lo determinado por FACS™, expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida es al menos aproximadamente 1,2X, aproximadamente 1,3X, aproximadamente 1,5X, aproximadamente 1,75X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2,25X, aproximadamente 2,5X, aproximadamente 2,75X, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4,5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X, mayor que el de los linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de nicotinamida.
Como se usa en el presente documento, la expresión "función" o "función de los linfocitos NK" se refiere a cualquier función biológica atribuida a los linfocitos NK. Una lista no limitante de funciones de linfocitos NK incluye, por ejemplo, citotoxicidad, inducción de la apoptosis, movilidad celular, migración dirigida, citocina y otra respuesta de señales celulares, producción y secreción de citocinas/quimiocinas, expresión de moléculas de superficie celular activadoras e inhibidoras in vitro, direccionamiento e injerto de células (retención in vivo) en un hospedador trasplantado y alteración de la enfermedad o procesos patológicos in vivo. En algunas realizaciones, las funciones de los linfocitos NK mejoradas por la exposición a la nicotinamida incluyen al menos una de expresión elevada del marcador de superficie CD62l , respuesta de migración elevada y mayor actividad citotóxica de los linfocitos NK, así como direccionamiento elevado y retención in vivo de linfocitos n K infundidos.
Se conocen bien en la técnica ensayos de moléculas de adhesión y migración tales como CD62L, CXCR-4, CD49e y similares, importantes para el direccionamiento/injerto y la retención de células en el trasplante. Se puede analizar la expresión de CD62L en una célula, por ejemplo, mediante citometría de flujo, inmunodetección, amplificación cuantitativa de ADNc, hibridación y similares. En una realización, la expresión de CD62L se detecta en diferentes poblaciones de linfocitos NK mediante la exposición de las células a un anticuerpo monoclonal anti-CD62L humano específico marcado con fluorescencia [p. ej., PE de CD62L, cat. n.° 304806 de BioLegend (San Diego, CA, Estados Unidos)] y clasificación de las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunas realizaciones, las poblaciones de linfocitos NK expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida tienen al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 % o más de las células detectadas que expresan CD62L, según lo determinado por FACS™. En otra realización, las poblaciones de linfocitos NK expuestas a nicotinamida según la presente invención tienen al menos aproximadamente 1,2X, aproximadamente 1,3X, aproximadamente 1,5X, aproximadamente 1,75X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2,25X, aproximadamente 2,5X, aproximadamente 2,75X, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4,5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X o más expresión de CD62L, según lo determinado por FACS™, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Los ensayos para la migración de células son bien conocidos en la técnica. Puede ensayarse la migración de células, por ejemplo, mediante ensayos de transmigración o ensayos de cierre de huecos. En ensayos de transmigración, tales como la técnica de dos cámaras, las células se separan de un estímulo mediante una barrera (p. ej., un filtro) y la migración de las células se detecta mediante recuento de la pérdida de células desde el origen, acumulación de células a través de la barrera, o ambas, a intervalos específicos. En el ensayo de cierre de huecos, las células se colocan en la periferia de un hueco visible (placa de agar ranurada, alrededor de un círculo, etc.) y se incuban con un estímulo. El cierre del espacio entre las células aplicado por movilidad celular, en respuesta a un estímulo, se visualiza utilizando citometría, inmunodetección, microscopia/morfometría, etc. En una realización, El potencial de migración de diferentes poblaciones de linfocitos NK se determina mediante el ensayo de transmigración "Transwell"™, en respuesta a SDF (250 ng/ml). En algunas realizaciones, las poblaciones de linfocitos NK expuestas a concentraciones eficaces de la nicotinamida según la presente invención tienen al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 % y al menos 80 % o más medida de migración mediante el ensayo Transwell descrito en el presente documento. En otra realización, las poblaciones de linfocitos NK expuestos a concentraciones eficaces de la nicotinamida tienen al menos aproximadamente 1,2X, aproximadamente 1,3X, aproximadamente 1,5X, aproximadamente 1,75X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2,25X, aproximadamente 2,5X, aproximadamente 2,75X, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4,5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X o más migración, según lo determinado por el ensayo transwell, en comparación con linfocitos n K cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Se conocen bien en la técnica ensayos para el direccionamiento y la retención in vivo de células transfundidas o trasplantadas. Como se usa en el presente documento, el término "direccionamiento" se refiere a la capacidad de una célula transfundida o trasplantada para alcanzar y sobrevivir en un órgano diana hospedador. Por ejemplo, los órganos diana de los linfocitos NK pueden ser el tejido linfoide, los órganos diana de los hepatocitos pueden ser el parénquima hepático, los órganos diana de las células alveolares pueden ser el parénquima pulmonar, etc. Como se usa en el presente documento, la expresión "retención in vivo" (también conocida como "injerto") se refiere a la capacidad de las células transfundidas o trasplantadas para proliferar y permanecer viables en los órganos diana. Los modelos animales para ensayar el direccionamiento y la retención in vivo de los linfocitos NK trasplantados incluyen, pero sin limitación mamíferos pequeños inmunodeficientes (tales como ratones SCID e IL2RYnul° y similares). El modelo de ratón SCID-Hu emplea ratones C.B-17 scid/scid (SCID) trasplantados con timo fetal humano y tejido hepático o tejido de MO fetal y proporciona un modelo adecuado para la evaluación de la retención y el potencial terapéutico de linfocitos NK humanos trasplantados. El direccionamiento y la retención in vivo de células trasplantadas también se puede evaluar en sujetos hospedadores humanos. En una realización, el direccionamiento y la retención in vivo se ensayan en ratones NOD/SCID irradiados (véase el ejemplo VI en el presente documento), transfundidos con, por ejemplo, aproximadamente 15X104, aproximadamente 15X105, aproximadamente 15X106, aproximadamente 15X107 o más linfocitos NK humanos cultivados con concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención y sacrificados en un tiempo predeterminado después de la transfusión (por ejemplo, aproximadamente 5 horas, 10 horas, 12 horas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, 1, 2, 3, 4, 5 semanas, 2, 3, 4 meses o más después de la transfusión). Tras el sacrificio de los ratones, se evalúan muestras de bazo, médula ósea, sangre periférica y otros órganos mediante FACS para determinar la presencia de linfocitos NK humanos (CD56+CD45+) utilizando Ab específicos humanos. El porcentaje de retención in vivo se expresa como el porcentaje de células del órgano que presentan el fenotipo del donante (p. ej., CD45 para células humanas). En algunas realizaciones, los órganos diana (p. ej., tejido linfoide tal como la médula ósea, el bazo, el timo, los ganglios linfáticos, el GALT) de ratones hospedadores transfundidos con poblaciones de linfocitos NK expuestas a concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención tienen al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 % y al menos 80 % o más direccionamiento y retención in vivo. En una realización específica, Se transfunden 15X106 linfocitos NK cultivados con una concentración eficaz de nicotinamida según la presente invención a ratones SCID irradiados y al menos el 25 % de los linfocitos NK que tienen un linaje específico del donante (p. ej., CD45+) se detectan en el bazo del hospedador, 4 días después de la transfusión. En otra realización, las poblaciones de linfocitos NK expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida tienen al menos aproximadamente 1,2X, aproximadamente 1,3X, aproximadamente 1,5X, aproximadamente 1,75X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2,25X, aproximadamente 2,5X, aproximadamente 2,75X, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4,5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X o más direccionamiento y retención in vivo, según lo determinado por FACs ™, en comparación con el direccionamiento y la retención in vivo de linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de nicotinamida.
Como se usa en el presente documento, la expresión "proliferación homeostática" se refiere a la proliferación dentro del órgano o tejido diana capaz de mantener un número estable de linfocitos NK infundidos a lo largo del tiempo, preferentemente meses o años.
En la actualidad se están llevando a cabo muchos ensayos clínicos que implican el trasplante de linfocitos NK en pacientes, para afecciones que incluyen, por ejemplo, pero no de manera exclusiva, leucemia (documentos NCT 00799799 y NCT 00303667), neoplasias hematológicas (documentos NCT 00697671, NCT 00354172 y 00640796), post-ASCT (documento NCT 00586703), neuroblastoma (documento NCT 00698009), melanoma maligno (documento NCT 00846833), terapia combinada con quimioterapia (documento NCT 00625729), tumores sólidos (documento NCT 00640796) y carcinoma nasofaríngeo (documento NCT 00717184) y para diversas neoplasias malignas (documento NCT01105650). Una lista completa, actual y detallada de los ensayos clínicos actuales y los protocolos detallados para la terapia con linfocitos NK está disponible en el sitio web de ensayos clínicos de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos.
Se conocen bien en la técnica ensayos de citotoxicidad ("destrucción de células"). Son ejemplos de células diana adecuadas para su uso en ensayos de destrucción redirigida la línea de células cancerosas, células de cáncer primario, células de tumor sólido, células leucémicas o células infectadas por virus. En particular, se pueden utilizar K562, BL-2, colo250 y células leucémicas primarias, pero se puede usar cualquiera de varios otros tipos celulares y son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med.
187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8: 1131­ 1135). La destrucción de células se evalúa mediante ensayos de viabilidad celular (p. ej., exclusión de colorante, liberación de cromo, CFSE), ensayos metabólicos (p. ej., sales de tetrazolio) y observación directa. En una realización, el potencial de citotoxicidad de diferentes poblaciones de linfocitos NK se determina mediante la retención de CFSE y la captación de PI en células expuestas a linfocitos NK a E:T de 1:1, 2,5:1, 5:1 o 10:1, y poblaciones de linfocitos n K expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención destruyen al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 % y al menos 80 % o más de las células diana, medido por el ensayo de exclusión de colorante descrito en el presente documento. En otra realización, las poblaciones de linfocitos Nk expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida tienen al menos aproximadamente 1,2X, aproximadamente 1,3X, aproximadamente 1,5X, aproximadamente 1,75X, aproximadamente 2X, aproximadamente 2,25X, aproximadamente 2,5X, aproximadamente 2,75X, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,5X, aproximadamente 4X, aproximadamente 4,5X, aproximadamente 5X, aproximadamente 6X, aproximadamente 7X, aproximadamente 8X, aproximadamente 9X, aproximadamente 10X o más potencial de destrucción, según lo determinado por el ensayo de exclusión de colorante, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 % mM de la nicotinamida.
El cultivo de los linfocitos NK puede efectuarse con o sin células alimentadoras o una capa de células alimentadoras. El cultivo ex vivo sin capa alimentadora es muy ventajoso para aplicaciones clínicas de células cultivadas, incluyendo linfocitos NK. Como se detalla en la sección de ejemplos a continuación, se observó mejora eficaz de la proliferación y función celular ex vivo de linfocitos NK en cultivos de linfocitos NK a corto y largo plazo sin células alimentadoras ni capa alimentadora derivados de células de médula ósea y sangre del cordón seleccionadas y no seleccionadas. Por tanto, según una realización, el cultivo de la población de linfocitos NK se efectúa sin capa alimentadora ni células alimentadoras.
Según algunas realizaciones de la presente invención, y como se detalla en la sección de ejemplos a continuación, la población de linfocitos NK se cultiva con IL-2 y nicotinamida 5 mM, el tiempo de exposición a la nicotinamida es desde la siembra de la población de células que comprenden linfocitos NK, y la duración de la exposición es de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, opcionalmente 2 semanas y opcionalmente 3 semanas.
En algunas realizaciones de la presente invención, las poblaciones de linfocitos NK expuestos a concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención pueden tener al menos dos cualesquiera, opcionalmente tres cualesquiera, opcionalmente cuatro cualesquiera y opcionalmente los cinco de expresión elevada del marcador de superficie CD62l , respuesta de migración elevada y mayor actividad citotóxica de los linfocitos NK, así como direccionamiento elevado y retención in vivo de linfocitos n K infundidos, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida. En una realización particular, las poblaciones de linfocitos NK expuestas a concentraciones eficaces de nicotinamida según la presente invención tienen mayor proliferación, expresión elevada de CD62L y direccionamiento elevado y retención in vivo de linfocitos NK infundidos, en comparación con linfocitos NK cultivados en condiciones idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Como se detalla en el presente documento, también se observa una mejora de la proliferación de linfocitos NK y la función celular por exposición a nicotinamida en presencia de células alimentadoras. Por tanto, en otra realización, los linfocitos NK se cultivan en presencia de células alimentadoras o una capa alimentadora. Normalmente, las capas alimentadoras comprenden células estromales irradiadas, células de líneas celulares inmortalizadas y similares. Se describen métodos para cultivar linfocitos NK en capas alimentadoras o con células alimentadoras en detalle en, por ejemplo, Frias et al. (Exp Hematol 2008; 36: 61-68), Harada et al. (Exp Hematol 2004; 32: 614-21), Campana et al. (documento US20090011498), Childs et al. (documento US20090104170) y Tsai (documento US20070048290).
Pueden obtenerse linfocitos NK de la presente invención de cualquier fuente que comprenda dichas células. Se encuentran linfocitos NK en muchos tejidos y se pueden obtener, por ejemplo, de ganglios linfáticos, bazo, hígado, pulmones, intestinos, deciduas y también se pueden obtener a partir de células iPS o células madre embrionarias (ESC). Normalmente, se utilizan sangre del cordón umbilical, sangre periférica, sangre periférica movilizada y médula ósea, que contienen poblaciones celulares heterogéneas de linfocitos, para proporcionar una gran cantidad de linfocitos NK para investigación y uso clínico. Por tanto, según un aspecto de una realización de la presente invención, el método comprende el cultivo de una población de linfocitos NK derivados de sangre del cordón umbilical, sangre periférica o médula ósea. Como se detalla en el presente documento, se ha descubierto que se encuentran diferencias significativas en las proporciones de tipos celulares de linfocitos entre preparaciones de linfocitos NK de diferentes fuentes. Por ejemplo, las células CD56+ aisladas (mediante aislamiento inmunomagnético) de la sangre del cordón umbilical incluyen normalmente una mayor proporción de linfocitos NK CD56+CD3- y menos linfocitos NKT que coexpresan el marcador de NK CD56 y el marcador de linfocitos T CD3 (CD56+CD3+) que la fracción CD56+ de la médula ósea o sangre periférica (véanse los ejemplos I-VI en el presente documento). Por tanto, en determinadas realizaciones, se cultivan linfocitos NK a partir de una población celular heterogénea que comprende linfocitos NK, células CD3- y células CD3+. En una realización, la fracción CD3+ es mayor que la fracción de linfocitos NK CD3-, como es habitual en la médula ósea, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica. En otra realización más, la población de linfocitos NK se selecciona o se enriquece con respecto a linfocitos NK. En algunas realizaciones, los linfocitos NK se pueden propagar a partir de poblaciones de células nuevas, mientras que otras realizaciones propagan linfocitos NK a partir de poblaciones de células almacenadas (tales como células crioconservadas y descongeladas) o poblaciones celulares cultivadas previamente.
Los linfocitos NK están asociados con la fracción de células mononucleares de la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica o la médula ósea. En una realización, la población de células que comprenden dichos linfocitos NK es una población de células nucleares totales o mononucleares empobrecida en células CD3+ o células CD3+ y CD19+. En otra realización, la población de células que comprenden los linfocitos NK es una población de linfocitos NK no seleccionada. En otra realización más, las células se seleccionan adicionalmente y los linfocitos NK comprenden células CD56+CD16+CD3- y/o CD56+CD16-CD3-. Se detallan métodos para la selección de linfocitos NK según el fenotipo (p. ej., inmunodetección y análisis de FACS) en el presente documento, por ejemplo, en la sección de métodos a continuación.
Más habitualmente, las muestras de sangre completa o médula ósea se procesan adicionalmente para obtener poblaciones de células antes de colocar los linfocitos en el medio de cultivo (o tampón). Por ejemplo, la muestra de sangre o médula ósea puede procesarse para enriquecer o purificar o aislar poblaciones definidas específicas de células. Los términos "purificar" y "aislar" no requieren pureza absoluta; en su lugar, estos se entienden como términos relativos. Por tanto, por ejemplo, una población de linfocitos purificada es una en la que las células especificadas están más enriquecidas que dichas células en su tejido de origen. Una preparación de linfocitos sustancialmente puros se puede enriquecer de modo que las células deseadas representen al menos el 50 % del total de células presentes en la preparación. En determinadas realizaciones, una población de células sustancialmente pura representa al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % o más de las células totales en la preparación.
Se conocen bien en la técnica métodos para enriquecer y aislar linfocitos y se pueden seleccionar métodos adecuados en función de la población deseada. Por ejemplo, en un enfoque, el material de origen se enriquece con respecto a linfocitos al eliminar glóbulos rojos. En su forma más sencilla, la eliminación de glóbulos rojos puede implicar la centrifugación de sangre completa sin coagular o médula ósea. En función de la densidad, los glóbulos rojos se separan de los linfocitos y otras células. Las fracciones ricas en linfocitos pueden después recuperarse selectivamente. Los linfocitos y sus progenitores también se pueden enriquecer mediante centrifugación utilizando medios de separación tales como el medio de separación de linfocitos (LSM) convencional disponible de diversas fuentes comerciales. Como alternativa, los linfocitos/progenitores se pueden enriquecer utilizando diversos procedimientos basados en afinidad. En la técnica se conocen numerosos métodos de preparación por afinidad mediada por anticuerpos, tales como perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. El enriquecimiento de linfocitos también se puede realizar utilizando preparaciones disponibles en el mercado para seleccionar negativamente células no deseadas, tales como FICOLL-HYPAQUE™ y otros medios de gradiente de densidad formulados para el enriquecimiento de linfocitos completos, linfocitos T o linfocitos NK.
Se conocen bien en la técnica métodos de selección de linfocitos NK de sangre, médula ósea o tejido (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 5.770.387 de Litwin et al.). Se utilizan más habitualmente protocolos basados en el aislamiento y la purificación de células CD56+, generalmente después del fraccionamiento de células mononucleares y el agotamiento de células distintas de NK tales como CD3+, CD34+, CD133+ y similares. Pueden emplearse combinaciones de dos o más protocolos para proporcionar poblaciones de linfocitos n K que tengan mayor pureza al respecto de contaminantes distintos de NK. La pureza de la preparación de linfocitos NK es de gran importancia para aplicaciones clínicas, ya que células distintas de NK, tales como linfocitos T y linfocitos NKT, contribuyen a reacciones específicas de antígenos tales como EICH, poniendo en peligro los beneficios potenciales del trasplante de linfocitos NK. Los equipos disponibles en el mercado para el aislamiento de linfocitos Nk incluyen procedimientos de un sola etapa (por ejemplo, microperlas CD56 y CD56+, equipos de aislamiento CD56+CD16+ de Miltenyi Biotec, Auburn CA) y procedimientos de múltiples etapas, incluyendo agotamiento, o agotamiento parcial, de CD3+ o agotamiento con anticuerpos de células distintas de NK que reconocen y eliminan linfocitos T (por ejemplo, OKT-3), linfocitos B, células madre, células dendríticas, monocitos, granulocitos y células eritroides. Por tanto, en algunas realizaciones, los linfocitos NK se seleccionan de poblaciones de linfocitos NK CD56+CD3-, CD56+CD16+CD3-, CD56+CD16-CD3- u otras purificadas. Se observará, sin embargo, que las aplicaciones clínicas favorecen normalmente menos manipulaciones de la población de células candidatas.
En una realización, los linfocitos NK se propagan ex vivo por cultivo a corto o largo plazo. Como se detalla en el ejemplo I, el cultivo de linfocitos NK con factores de crecimiento y nicotinamida, según los métodos de la presente invención, durante tan poco como 7 días o tanto como 3 semanas dio lugar a una proliferación preferencial y/o funcionalidad mejorada de los linfocitos NK cultivados, en comparación con células cultivadas con citocinas pero con menos de 0,1 mM de nicotinamida. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente invención, el cultivo de la población de linfocitos NK es durante al menos 3, al menos 5, al menos 7, opcionalmente 10, opcionalmente 12, opcionalmente 14, opcionalmente 16, opcionalmente 18, opcionalmente 20 y opcionalmente 21 días, o 1, 2 o tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas o más. Son duraciones de cultivo no limitantes, ilustrativas, como se detalla en los ejemplos I a VI, 7 días (1 semana) y 21 días (3 semanas).
Las poblaciones de linfocitos NK se pueden cultivar utilizando diversos métodos y dispositivos. La selección del aparato de cultivo se basa habitualmente en la escala y la finalidad del cultivo. La ampliación del cultivo celular implica preferentemente el uso de dispositivos especializados. Se detalla un aparato para la producción a gran escala, de uso clínico, de linfocitos NK, por ejemplo, en Spanholtz et al. (PLoS ONE 2010;5:e9221) y Sutlu et al. (Cytotherapy 2010, publicación temprana en línea 1-12).
Peled et al. (documento WO 03/062369) han revelado recientemente un efecto notable del tratamiento con nicotinamida sobre el potencial de injerto de células CD34+. Este efecto de la nicotinamida se ha observado tanto con células que proliferan en cultivo como durante periodos breves de incubación, suficientes para una división celular mínima o nula. Por tanto, aunque la mejora de la proliferación de linfocitos NK en cultivo ex vivo es un objetivo importante de la presente invención, se prevé la exposición ex vivo a corto plazo de los linfocitos NK a la nicotinamida, durante periodos de minutos, horas, 1 día y similares. Dicha exposición a corto plazo de los linfocitos NK a la nicotinamida, durante periodos de tiempo insuficientes para la proliferación, puede mejorar potencialmente, por ejemplo, la funcionalidad de los linfocitos NK (citotoxicidad, potencial de migración, expresión de moléculas en superficie celular, potencial de injerto y similares). Se puede proporcionar tratamiento a corto plazo con nicotinamida a células nuevas, células crioconservadas y descongeladas, células en cultivo, células purificadas, poblaciones de células mixtas y similares. En una realización, dicho tratamiento con nicotinamida a corto plazo se proporciona inmediatamente antes del uso (trasplante, infusión, etc.) de los linfocitos NK.
Los inventores han observado sorprendentemente que el cultivo de una población de células mixtas que comprende linfocitos NK (CD56+) y células distintas de NK (p. ej., linfocitos T (CD3+), linfocitos NKT (CD56+CD3+) y similares) en presencia de una concentración eficaz de nicotinamida en el medio de cultivo no solo mejora la proliferación, el crecimiento y la funcionalidad de linfocitos NK, sino que también inhibe la proliferación y el crecimiento de células distintas de NK (p. ej., linfocitos T y NKT) en el mismo cultivo (véase el ejemplo V en el presente documento). Por tanto, en una realización de la invención, el cultivo de una población heterogénea de linfocitos NK y CD3+ con una concentración eficaz de nicotinamida da lugar a una población de linfocitos NK que tienen una proporción reducida de células CD3+ con respecto a CD56+CD3-, en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida. En otra realización más, el cultivo de una población heterogénea de linfocitos NK y CD3+ con una concentración eficaz de nicotinamida, según el método de la invención da lugar a una población de linfocitos NK que tienen una cantidad reducida de células CD14+ y CD15+, en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
Los métodos descritos anteriormente en el presente documento para el cultivo ex vivo de poblaciones de linfocitos NK puede dar lugar, entre otras cosas, a una población cultivada de linfocitos NK.
Por tanto, además, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una población de linfocitos NK caracterizados por al menos uno de expresión elevada de CD62L, respuesta de migración elevada, direccionamiento elevado y retención in vivo, mayor proliferación, aumento de la actividad citotóxica y una relación reducida de células CD3+ con respecto a células CD56+/CD3-, en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida. En algunas realizaciones, la población de linfocitos NK se caracteriza por al menos dos cualesquiera, al menos tres cualesquiera, al menos cuatro cualesquiera, al menos cinco cualesquiera o los seis de expresión elevada de CD62L, respuesta de migración elevada, direccionamiento elevado y retención in vivo, mayor proliferación, aumento de la actividad citotóxica y una relación reducida de células CD3+ con respecto a células CD56+/CD3-, en comparación con una población de linfocitos NK cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de la nicotinamida.
En el ejemplo VI, los inventores han mostrado que las poblaciones de NK preparadas según los métodos de la invención han aumentado el potencial funcional in vivo, como demuestra la localización y la retención in vivo en los órganos diana (p. ej., bazo, médula ósea y sangre periférica). Por tanto, en un aspecto particular de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una población de linfocitos NK caracterizados por un mejor direccionamiento, injerto y retención in vivo cuando se trasplantan, en donde la infusión de al menos 15X106 células de la población de linfocitos NK en un hospedador irradiado (p. ej., un ratón SCID) da lugar a al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % y al menos 90 % o más de linfocitos NK derivados del donante en el tejido linfoide hospedador, detectado por inmunodetección y citometría de flujo, a los 4 días después de la infusión. En una realización, la infusión de al menos 15X106 células de la población NK da lugar a al menos 25 % de linfocitos NK derivados del donante en el tejido linfoide hospedador, detectado por inmunodetección y citometría de flujo, a los 4 días después de la infusión.
Pueden aplicarse criterios relevantes adicionales para caracterizar la población de NK. Por tanto, en otra realización más, la población de NK de la invención se caracteriza además por la expresión de CD62L en al menos el 30 % de la población celular en el momento de la infusión en el hospedador, detectado por citometría de flujo e inmunodetección. En otra realización más, la población de linfocitos NK se puede caracterizar adicionalmente según el grado de pureza de la contaminación por células CD3+, p. ej., una población de linfocitos NK que tiene una relación de células CD3+ con respecto a CD56+/CD3- igual o inferior a 1:100 en el momento de la infusión.
Se apreciará, en el contexto de la presente invención, que se puede proporcionar una población terapéutica de linfocitos NK junto con el medio de cultivo que contiene nicotinamida, aislarse del medio de cultivo y combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, poblaciones celulares de la invención se pueden administrar en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina estéril y soluciones tamponantes acuosas. El uso de dichos vehículos y diluyentes es bien conocido en la técnica.
En una realización particular de este aspecto de la presente invención, la población de linfocitos NK comprende una población de linfocitos NK cultivados ex vivo en presencia de una cantidad eficaz de nicotinamida; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización más, la población cultivada ex vivo comprende linfocitos NK que están activados y tienen mayor capacidad citotóxica para una célula diana, en comparación con poblaciones de linfocitos NK cultivados con factores de crecimiento en menos de 0,1 mM de nicotinamida.
La capacidad de la nicotinamida para mantener la proliferación y funcionalidad de los linfocitos NK se puede utilizar además en diversas aplicaciones técnicas:
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para conservar linfocitos NK. En una realización, el método se efectúa manipulando los linfocitos NK en al menos una de las siguientes etapas: recogida, aislamiento y/o almacenamiento, en presencia de una cantidad eficaz de nicotinamida.
Según otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una bolsa de recogida/cultivo de linfocitos NK. La bolsa de recogida/cultivo de células de la presente invención se complementa con una cantidad eficaz de nicotinamida. Según la presente invención también se proporciona un tampón de separación y/o lavado de linfocitos NK. El tampón de separación y/o lavado se complementa con una cantidad eficaz de nicotinamida.
Como se detalla adicionalmente a continuación, los linfocitos NK pueden modificarse genéticamente.
En terapia génica ex vivo, se extraen células de un paciente y, mientras se cultivan, se tratan in vitro. En general, se introduce un gen de reemplazo funcional en las células a través de un vehículo/método de administración de genes adecuado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión según sea necesario y después las células modificadas se cultivan y se devuelven al hospedador/paciente. Se ha mostrado que estas células reimplantadas genéticamente expresan el material genético transfectado in situ.
Por lo tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de transducción de linfocitos NK cultivados ex vivo con un gen exógeno. El método, según este aspecto de la presente invención, se efectúa mediante: (a) cultivo ex vivo de una población de linfocitos NK cultivando la población de linfocitos NK según los métodos de cultivo de linfocitos NK de la presente invención y (b) transducción de células de la población cultivada de linfocitos NK con el gen exógeno. Se apreciará que el orden de las etapas (a) y (b) se puede invertir. Se conocen en la técnica métodos para la transducción de linfocitos NK cultivados, por ejemplo, se ha descrito el uso de linfocitos NK modificados ex vivo en Campana et al. (documento US20090011498).
Por consiguiente, las células cultivadas de la presente invención pueden modificarse para expresar un producto génico. Como se usa en el presente documento, la expresión "producto génico" se refiere a proteínas, péptidos y moléculas de ARN funcionales. En general, el producto génico codificado por la molécula de ácido nucleico es el producto génico que se desea suministrar a un sujeto. Los ejemplos de dichos productos génicos incluyen proteínas, péptidos, glucoproteínas y lipoproteínas normalmente producidas por una célula del sujeto receptor. Como alternativa, el producto génico codificado es uno, que induce la expresión del producto génico deseado por la célula (p. ej., el material genético introducido codifica un factor de transcripción, que induce la transcripción del producto génico que se va a suministrar al sujeto). Por ejemplo, los linfocitos NK se pueden modificar para expresar moléculas de la superficie celular o productos génicos intracelulares que pueden mejorar o modular la función de los linfocitos NK, tales como citocinas, moléculas de adhesión, receptores activadores y/o inhibidores y similares.
Se puede encontrar una descripción de vectores, construcciones y protocolos adecuados para la transfección de células eucariotas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates (1989), sección 9.2 y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), por ejemplo, secciones 16.41-l6.55, 9 u otros manuales de laboratorio convencionales.
Como se ha analizado en detalle anteriormente en el presente documento, la propagación ex vivo de linfocitos NK puede utilizarse provechosamente en el trasplante o la implantación de linfocitos n K. Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de trasplante o implantación de linfocitos NK en un receptor. El método según este aspecto de la presente invención se efectúa mediante (a) cultivo ex vivo de una población de linfocitos NK con factores de crecimiento y una concentración eficaz de nicotinamida según los métodos de la invención y administración de una cantidad terapéutica de dichos linfocitos NK cultivados a dicho sujeto.
El donante y el receptor pueden ser el mismo individuo o individuos diferentes, por ejemplo, individuos alogénicos. Por tanto, la población de linfocitos NK puede ser autóloga o alogénica del sujeto. Cuando se practica el trasplante alogénico, pueden llevarse a cabo regímenes para reducir el rechazo de implantes y/o la enfermedad del injerto contra el hospedador, como es bien sabido en la técnica. Dichos regímenes se practican en la actualidad en terapia humana. Se desvelan regímenes más avanzados en publicaciones de Slavin S. et al., p. ej., J Clin Immunol (2002) 22: 64 y J Hematother Stem Cell Res (2002) 11: 265), Gur H. et al. (Blood (2002) 99: 4174) y Martelli MF et al., (Semin Hematol (2002) 39: 48)
Según una realización, el trasplante de la población de linfocitos NK es para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en el sujeto.
Según otro aspecto más de una realización de la presente invención, se proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que lo necesite. El método según este aspecto de la presente invención se efectúa administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de linfocitos NK de la invención a dicho sujeto.
"Tratar" o "tratamiento" incluye, pero sin limitación, la administración de una composición o población de linfocitos NK enriquecidos, activados o cultivados de la presente invención para prevenir o retardar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicios bioquímicos de una enfermedad, aliviar los síntomas o detener o inhibir el desarrollo adicional de la enfermedad, afección o trastorno (p. ej., cáncer, cáncer metastásico o tumores sólidos metastásicos). El tratamiento puede ser profiláctico, es decir, adyuvante (para prevenir o retardar la aparición de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de síntomas clínicos o subclínicos de la misma) o supresión terapéutica o alivio de los síntomas después de la manifestación de la enfermedad.
En una realización, la población de linfocitos NK se administra en una cantidad eficaz para reducir o eliminar un cáncer, tal como un tumor sólido o una neoplasia maligna, o prevenir su aparición o recurrencia. "Una cantidad eficaz para reducir o eliminar el tumor sólido o para prevenir su aparición o recurrencia" o "una cantidad eficaz para reducir o eliminar el trastorno hiperproliferativo o para prevenir su aparición o recurrencia" se refiere a una cantidad de una composición terapéutica que mejora el resultado o la supervivencia de un paciente después del tratamiento para la patología tumoral o el trastorno hiperproliferativo según lo medido por los datos de prueba del paciente, datos de supervivencia, elevación o supresión de los niveles de marcadores tumorales, susceptibilidad reducida basada en el perfil genético o la exposición a factores ambientales. "Inhibir el crecimiento tumoral" se refiere a reducir el tamaño o la viabilidad o el número de células de un tumor. "Cáncer", "neoplasia maligna", "tumor sólido" o "trastorno hiperproliferativo" se usan como expresiones sinónimas y se refieren a cualquiera de varias enfermedades que se caracterizan por proliferación incontrolada y anómala de células, la capacidad de las células afectadas de propagarse de forma local o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del organismo (es decir, metastatizar), así como cualquiera de varios rasgos estructurales y/o moleculares característicos. Una "célula cancerosa" o "maligna" o "célula tumoral sólida" se entiende como una célula que tiene propiedades estructurales específicas, que carece de diferenciación y que tiene capacidad de invasión y metástasis. "Cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasias o tumores malignos hallados en mamíferos, incluyendo carcinomas y sarcomas. Son ejemplos los cánceres de mama, de pulmón, de pulmón no microcítico, de estómago, de cerebro, de cabeza y cuello, meduloblastoma, de hueso, de hígado, de colon, genitourinario, de vejiga, urinario, de riñón, de testículo, de útero, de ovario, de cuello del útero, de próstata, melanoma, mesotelioma, sarcoma, (véase DeVita, et al., (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa.).
"Asociado al cáncer" se refiere a la relación de un ácido nucleico y su expresión, o falta de la misma, o una proteína y su nivel o actividad, o falta de los mismos, al inicio de la neoplasia maligna en una célula objeto. Por ejemplo, el cáncer puede estar asociado con la expresión de un gen en particular que no se expresa o que se expresa a un nivel inferior, en una célula sana normal. Por el contrario, un gen asociado al cáncer puede ser uno que no se expresa en una célula maligna (o en una célula en proceso de transformación) o que se expresa a un nivel inferior en la célula maligna que al que se expresa en una célula sana normal.
"Enfermedad hiperproliferativa" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en el que las células proliferan más rápidamente que el crecimiento de tejido normal. Por tanto, una célula hiperproliferante es una célula que prolifera más rápidamente que las células normales.
"Cáncer avanzado" significa cáncer que ya no se localiza en el sitio del tumor primario o un cáncer que está en el estadio III o IV según el Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC).
"Bien tolerado" se refiere a la ausencia de cambios adversos en el estado de salud que se producen como resultado del tratamiento y que afectarían las decisiones de tratamiento.
"Metastásico" se refiere a células tumorales, p. ej., tumor sólido humano o neoplasia maligna genitourinaria, que son capaces de establecer lesiones tumorales secundarias en los pulmones, el hígado, el hueso o el cerebro de ratones inmunodeficientes tras la inyección en el cuerpo adiposo mamario y/o la circulación del ratón inmunodeficiente.
Un "tumor sólido" incluye, pero sin limitación, sarcoma, melanoma, carcinoma otro cáncer de tumor sólido. "Sarcoma" se refiere a un tumor que está compuesto por una sustancia análoga al tejido conjuntivo embrionario y que está compuesto, en general, por células bien compactadas incluidas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los sarcomas incluyen, pero sin limitación, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma amelobástico, sarcoma botrioide, cloroma sarcoma, coriocarcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma del tumor de Wilms, sarcoma endometrial, sarcoma estromal, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de linfocitos B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de linfocitos T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma perióstico, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquístico, sarcoma sinovial o sarcoma telangiectásico.
"Melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma lentiginoso acro, melanoma amelánico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma sobre lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal o melanoma de diseminación superficial.
"Carcinoma" se refiere a una neoplasia maligna compuesta por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dar lugar a metástasis. Los carcinomas ilustrativos incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de la corteza supradrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloidal, comedocarcinoma, carcinoma del cuerpo uterino, carcinoma cribiforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma con úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células granulosas, carcinoma de matriz del pelo, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma blando, carcinoma mucinoso, carcinoma mucoide, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatoide, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células en grano de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de células renales del riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma de Schnneider, carcinoma cirroso, carcinoma de escroto, carcinoma de células en anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoideas, carcinoma fusocelular, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma ganglionar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectoide, carcinoma de células transicionales, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma velloso.
"Leucemia" se refiere a enfermedades neoplásicas progresivas de los órganos formadores de la sangre y se caracteriza, en general, por una proliferación y desarrollo anómalo de leucocitos y de sus precursores en la sangre y médula ósea. En general, la leucemia se clasifica clínicamente dependiendo de (1) la duración y el carácter de la enfermedad, aguda o crónica; (2) el tipo de célula implicada; mieloide (mielógena), linfoide (linfógena) o monocítica; y (3) el aumento o la ausencia de aumento del número de células anómalas en la sangre, leucémica o aleucémica (subleucémica). La leucemia incluye, por ejemplo, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia de blastocitos, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutánea, leucemia embrionaria, leucemia eosinófila, leucemia de Gross, tricoleucemia, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia blastocítica, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mieloide granulocítica, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia blastocítica, leucemia subleucémica o leucemia de células indiferenciadas. Los cánceres adicionales incluyen, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón microcíticos, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoma maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas precancerosas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer esofágico, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de cuello uterino, cáncer de endometrio, cáncer cortical suprarrenal y cáncer de próstata.
En otra realización particular de este aspecto de la presente invención, el método se ve afectado conjuntamente con, después o antes del trasplante de células hematopoyéticas, progenitoras hematopoyéticas o madre hematopoyéticas en dicho sujeto. En otras realizaciones adicionales, el sujeto se trata conjuntamente con un agente sensibilizante o potenciador (p. ej., inhibidor de proteasoma, IL-2, IL-15, etc.) mejorando adicionalmente la función in vivo de los linfocitos NK transfundidos (para más detalles, véase, por ejemplo, solicitud de patente de los Estados Unidos 20090104170 de Childs et al.).
Se ha observado una disminución del número y la funcionalidad de los linfocitos NK en pacientes autoinmunes, que indica la posibilidad de la terapia con linfocitos NK en diversas enfermedades y afecciones autoinmunitarias (véase Schleinitz, et al., Immunology 2010; 131: 451-58, y French y Yokohama, Arthrit Res Ther 2004; 6: 8-14). Por tanto, en otra realización más de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o afección autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite. El método según este aspecto de la presente invención se efectúa administrando una cantidad terapéutica de una población de linfocitos NK de la invención a dicho sujeto.
Las enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse mediante el método de la invención incluyen, pero sin limitación, enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumáticas, enfermedades glandulares, gastroenteropatías, enfermedades cutáneas, enfermedades hepáticas, enfermedades neurológicas, enfermedades musculares, enfermedades nefríticas, enfermedades relacionadas con la reproducción, enfermedades del tejido conjuntivo y enfermedades sistémicas.
Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, ateroesclerosis, infarto de miocardio, trombosis, granulomatosis de Wegener, arteritis de Takayasu, síndrome de Kawasaki, enfermedad autoinmunitaria anti-factor VIII, vasculitis necrotizante de vasos pequeños, poliangitis microscópica, síndrome de Churg y Strauss, glomerulonefritis necrotizante y semilunar focal pauciinmunitaria, síndrome antifosfolipídico, insuficiencia cardíaca inducida por anticuerpos, púrpura tromobocitopénica, anemia hemolítica autoinmunitaria, autoinmunidad cardíaca en la enfermedad de Chagas y autoinmunidad anti-linfocitos T auxiliares.
Los ejemplos de enfermedades reumáticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide y espondilitis anquilosante.
Los ejemplos de enfermedades glandulares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedad pancreática, diabetes de tipo I, enfermedad de tiroides, enfermedad de Graves, tiroiditis, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides, prostatitis autoinmunitaria y síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I. Las enfermedades incluyen, pero sin limitación, enfermedades autoinmunitarias del páncreas, diabetes de tipo 1, enfermedades tiroideas autoinmunitarias, enfermedad de Graves, tiroiditis autoinmunitaria espontánea, tiroiditis de Hashimoto, mixedema idiopático, autoinmunidad ovárica, infertilidad autoinmunitaria anti-espermatozoides, prostatitis autoinmunitaria y síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I.
Los ejemplos de enfermedades gastrointestinales autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades intestinales inflamatorias crónicas, enfermedad celíaca, colitis, ileítis y enfermedad de Crohn.
Los ejemplos de enfermedades cutáneas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades cutáneas ampollosas autoinmunitarias, tales como, pero sin limitación, pénfigo vulgar, penfigoide ampolloso y pénfigo foliáceo. Los ejemplos de enfermedades hepáticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, hepatitis, hepatitis activa crónica autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y hepatitis autoinmunitaria.
Los ejemplos de enfermedades neurológicas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, miastenia grave, neuropatías, neuropatías motoras; síndrome de Guillain-Barré y neuropatías autoinmunitarias, miastenia, síndrome miasténico de Lambert-Eaton; enfermedades neurológicas paraneoplásicas, atrofia cerebelosa, atrofia cerebelosa paraneoplásica y síndrome de la persona rígida; síndrome de la persona rígida no paraneoplásico, atrofias cerebelosas progresivas, encefalitis, encefalitis de Rasmussen, esclerosis lateral amiotrófica, corea de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette y poliendocrinopatías autoinmunitarias; neuropatías disinmunitarias; neuromiotonía adquirida, artrogriposis múltiple congénita, neuritis, neuritis óptica y enfermedades neurodegenerativas.
Los ejemplos de enfermedades musculares autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, miositis, miositis autoinmunitaria y síndrome de Sjogren primario y enfermedad autoinmunitaria del músculo liso.
Los ejemplos de enfermedades nefríticas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, nefritis y nefritis intersticial autoinmunitaria.
Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la reproducción incluyen, pero sin limitación, pérdida fetal repetida.
Los ejemplos de enfermedades del tejido conjuntivo autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, enfermedades del oído, enfermedades autoinmunitarias del oído y enfermedades autoinmunitarias del oído interno.
Los ejemplos de enfermedades sistémicas autoinmunitarias incluyen, pero sin limitación, lupus eritematoso sistémico y esclerosis sistémica.
En otra realización más de la presente invención, se proporciona un método para inhibir una infección vírica en un sujeto que lo necesite. El método según este aspecto de la presente invención se efectúa mediante (a) cultivo ex vivo de una población de linfocitos NK con factores de crecimiento de linfocitos NK y una concentración eficaz de nicotinamida, en donde dicha concentración eficaz de nicotinamida potencian la proliferación de dichos linfocitos NK, en comparación con dicha población de células cultivadas con factores de crecimiento sin dicha concentración de nicotinamida; y (b) administración de una cantidad terapéutica de dichos linfocitos NK cultivados a dicho sujeto. Las infecciones víricas adecuadas para el tratamiento con linfocitos NK o composiciones de linfocitos NK de la invención incluyen, pero sin limitación, VIH, virus de la coriomeningitis linfática (LCMV), citomegalovirus (CMV), virus vaccinia, virus de la gripe y paragripal, hepatitis (incluyendo hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, no A no B, etc.), virus del herpes simple, virus del herpes zóster, virus de Theiler y VHS-1. Otras enfermedades infecciosas adecuadas para el tratamiento con linfocitos NK o preparaciones de linfocitos NK de la presente invención incluyen, pero sin limitación, infecciones parasitarias tales como infecciones por Plasmodium, Leishmania y Toxoplasma, e infecciones bacterianas tales como micobacterias y Listeria (para una revisión de los linfocitos NK en el tratamiento de enfermedades víricas, bacterianas y protozoarias véase Zucchini et al., Exp Rev Anti-Infect Ther 2008; 6: 867-85).
El trasplante de células hematopoyéticas se ha convertido en el tratamiento de elección para diversas enfermedades hereditarias o malignas. Sin embargo, las composiciones de células hematopoyéticas son con frecuencia ricas en linfocitos T, que contribuyen a la enfermedad del injerto contra el hospedador. Ya que los pacientes que padecen neoplasias hematológicas son con frecuencia deficientes en el número y la función de los linfocitos NK, la administración exógena de linfocitos NK junto con el trasplante de células hematopoyéticas se está investigando actualmente para mejorar el injerto a largo plazo y prevenir la enfermedad del injerto contra el hospedador. Por tanto, en otra realización más de la presente invención se proporciona un método para tratar o prevenir la enfermedad del injerto contra el hospedador en un sujeto que lo necesite. Por tanto, en otra realización más de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o afección autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite. El método según este aspecto de la presente invención se efectúa administrando una cantidad terapéutica de una población de linfocitos NK de la invención a dicho sujeto.
Se conocen bien en la técnica protocolos clínicos para el tratamiento con linfocitos NK y tratamientos combinados con poblaciones de linfocitos NK y HSC. Por ejemplo, informes recientes han establecido que las infusiones de linfocitos NK son seguras y no provocan EICH en el receptor. Un protocolo de este tipo implica la mieloablación, infusión de sangre del cordón umbilical activada por IL-2, enriquecida con NK (sin agotamiento de NK) con desapareamiento de HLA, seguido de una doble infusión de sangre del cordón umbilical para la repoblación de HSC [véase Miller et al., Blood 2006; 108: 3111 (resumen)]. Los autores informaron de que el trasplante de linfocitos NK, junto con HSC de sangre del cordón umbilical, dio lugar a un mejor injerto a largo plazo de las HSC.
Pautas de tratamiento
Según algunos aspectos de algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una población de linfocitos n K para el tratamiento de una enfermedad, p. ej., cáncer metastásico, tumores sólidos, enfermedad autoinmunitaria, trastorno hiperproliferativo o una infección vírica, formuladas junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Algunas composiciones incluyen una combinación de múltiples (p. ej., dos o más) poblaciones de linfocitos NK de la invención.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible a o en riesgo de padecer una enfermedad o afección (es decir, una enfermedad hiperproliferativa o un tumor sólido) en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de recaída de la enfermedad hiperproliferativa o del tumor sólido, disminuir la gravedad o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o los medicamentos se administran a un paciente que se sospecha que padece, o que ya padece, dicha enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad (bioquímicos, histológicos y/o conductuales), incluyendo sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Una cantidad adecuada para lograr un tratamiento terapéutico o profiláctico se define como una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz. En regímenes tanto profilácticos como terapéuticos, los agentes se administran habitualmente en varias dosis hasta que se ha logrado una respuesta antiproliferativa suficiente. Normalmente, se supervisa la respuesta antiproliferativa y se administran dosis repetidas si la respuesta antiproliferativa comienza a disminuir.
Dosificaciones eficaces
Las dosis eficaces de una composición de una población de linfocitos NK para el tratamiento de la enfermedad, p. ej., cáncer metastásico, tumores sólidos o un trastorno hiperproliferativo, descritos en el presente documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluyendo mamíferos transgénicos. Deben determinarse las dosificaciones de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia.
Para la administración con una población terapéutica de linfocitos NK, la dosis varía de aproximadamente 1X106 a aproximadamente 1X109 linfocitos NK por paciente. Para la administración con una población de linfocitos NK, la dosis varía de aproximadamente 1X105 a aproximadamente 1X109 linfocitos NK por kilogramo de peso del receptor o la dosis varía de aproximadamente 5X105 a aproximadamente 1X108 linfocitos NK por kilogramo de peso del receptor. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más poblaciones de linfocitos NK, en cuyo caso, la dosis de cada población de linfocitos NK administrada queda dentro de los intervalos indicados. Pueden realizarse múltiples administraciones de poblaciones de linfocitos NK. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, según se indique midiendo los niveles en sangre de la población de linfocitos NK en el paciente. Como alternativa, las poblaciones de linfocitos NK se pueden administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la semivida de las poblaciones de linfocitos NK en el paciente. La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones es necesaria una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine y preferentemente hasta que el paciente muestre un alivio parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. A continuación, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Vías de administración
Las composiciones de una población terapéutica de linfocitos NK para el tratamiento de una enfermedad, p. ej., cáncer metastásico, tumores sólidos o un trastorno hiperproliferativo, se puede administrar por medios intravenoso, intravesicular, intratecal, parenteral, tópico, subcutáneo, oral, intranasal, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal o intramuscular. Como profiláctico/adyuvante o para el tratamiento de una enfermedad, las poblaciones terapéuticas de linfocitos NK se dirigen a un trastorno hiperproliferativo o un tumor sólido, p. ej., una neoplasia maligna genitourinaria, y/o tratamiento terapéutico. La vía de administración más habitual de un agente inmunogénico es la subcutánea, aunque otras vías pueden ser igualmente eficaces. La siguiente vía más común es la inyección intramuscular. Este tipo de inyección se realiza más habitualmente en los músculos del brazo o de la pierna. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido en particular donde se han acumulado depósitos, por ejemplo, inyección intracraneal. Se prefiere la inyección intramuscular en infusión intravenosa para la administración de una población de linfocitos NK. En algunos métodos, una población terapéutica en particular de linfocitos NK se inyecta directamente en la vejiga.
Formulación
Las composiciones de una población de linfocitos NK para el tratamiento de una enfermedad, p. ej., cáncer metastásico, tumores sólidos, infección vírica o un trastorno hiperproliferativo.
Las composiciones de una población terapéutica de linfocitos NK para el tratamiento de una enfermedad, p. ej., cáncer metastásico, tumores sólidos o un trastorno hiperproliferativo, se administran con frecuencia como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo, es decir, y diversos componentes farmacéuticamente aceptables diferentes. Véase, p. ej., Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences) 20a ed., Lippincott, Williams y Wilkins, 2003. La forma preferida depende del modo previsto de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, vehículos o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que se definen como vehículos habitualmente usados para formular composiciones farmacéuticas para su administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de tal forma que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Un ejemplo de dicho diluyente es el medio X-vivo 20 (Cambrex Bio Science, Walkersville, Md.) que contiene suero AB humano inactivado por calor al 10 % o suero autólogo al 10 %. Son ejemplos adicionales de dichos diluyentes agua destilada, solución salina fisiológica tamponada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas, polisacáridos tales como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos y copolímeros (tales como Sepharose™ funcionalizada con látex, agarosa, celulosa y similares), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas). Adicionalmente, estos vehículos pueden actuar como agentes inmunoestimulantes (es decir, adyuvantes).
Para administración parenteral, las composiciones de la invención se pueden administrar como dosis inyectables de una solución o suspensión de la sustancia en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Adicionalmente, pueden estar presentes en las composiciones sustancias adyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes del pH y similares. Otros componentes de las composiciones farmacéuticas son los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja y aceite mineral. En general, son vehículos líquidos preferidos glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol, en particular para soluciones inyectables. Las poblaciones terapéuticas de linfocitos NK se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o de una preparación de implante que se puede formular de tal manera que permita una liberación sostenida del principio activo. Una composición ilustrativa comprende una población terapéutica de linfocitos NK a 5 mg/ml, formulada en tampón acuoso que consiste en L-histidina 50 mM, NaCl 150 mM, ajustado a pH 6,0 con HCl.
Normalmente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas o micropartículas tales como polilactida, poliglicólido o copolímero para un efecto adyuvante mejorado, como se ha analizado anteriormente. Langer, Science, 249: 1527, 1990; Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews, 28: 97-119, 1997. Los agentes de la presente invención se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que se puede formular de tal forma que permita una liberación sostenida o pulsátil del principio activo. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales, intranasales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas.
Para supositorios, los aglutinantes y vehículos incluyen, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de 0,5 % a 10 %, preferentemente 1 %-2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes, tales como usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10 %-95 % de principio activo, preferentemente 25 %-70 %.
Las composiciones farmacéuticas comprenden en general una composición de la población de linfocitos NK terapéuticos en una forma adecuada para la administración a un paciente. Las composiciones farmacéuticas se formulan en general como estériles, sustancialmente isotónicas y en total cumplimiento con todas las regulaciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos. Toxicidad
Preferentemente, una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de la población de linfocitos NK descrita en el presente documento proporcionará un beneficio terapéutico sin provocar una toxicidad sustancial.
La toxicidad de la población terapéutica de linfocitos NK descrita en el presente documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., determinando la DL.sub.50 (la dosis letal para el 50 % de la población) o la DL.sub.100 (la dosis letal para el 100 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación que no es tóxico para su uso en seres humanos. La dosis de la población terapéutica de linfocitos NK descrita en el presente documento se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual a la vista del estado del paciente. (Véase, p. ej., Fingl, et al., The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Cap. 1-1975).
Equipos
También dentro del alcance de la invención están los equipos que comprenden las composiciones (p. ej., una población terapéutica de linfocitos NK) de la invención e instrucciones para su uso. El equipo puede contener además al menos un reactivo adicional, uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (p. ej., un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno distinto del primer anticuerpo humano). Los equipos incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso pretendido de los contenidos del equipo. El término etiqueta incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el equipo, o que de otro modo acompaña al equipo.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ±10 %.
Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugaciones significan "que incluye pero sin limitación". Esta expresión abarca las expresiones "que consiste en" y "que consiste esencialmente en".
La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición o el método puede incluir ingredientes y/o etapas adicionales, pero solo si los ingredientes y/o etapas adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición o el método reivindicados.
Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una/o", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es únicamente por conveniencia y brevedad y no debería interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los posibles subintervalos así como valores numéricos individuales en ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las expresiones "que varía/varía entre" un primer número indicador y un segundo número indicador y "que varía/varía de" un primer número indicador "a" un segundo número indicador se usan indistintamente en el presente documento y se entiende que incluyen los números indicadores primero y segundo, y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.
Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a formas, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea dada, incluyendo, pero sin limitación, las formas, los medios, las técnicas y los procedimientos conocidos o fácilmente desarrollados a partir de formas, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar' incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Se aprecia que determinadas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que se describen, para mayor brevedad, en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica más adelante en la sección de reivindicaciones encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran algunas realizaciones de la invención de forma no limitante.
En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías expuestas en las patentes de los Estados Unidos n.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); se describen ampliamente inmunoensayos disponibles en la bibliografía científica y de patentes, véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" vol. 1, 2, 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo del presente documento. Se cree que los procedimientos de las mismas son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector.
Materiales y procedimientos experimentales
Muestras de sangre del cordón umbilical
Se obtuvieron células de la sangre del cordón umbilical después del parto normal a término (se proporcionó consentimiento informado). Las muestras se recogieron y congelaron en las 24 horas posteriores al parto. En resumen, se recogió sangre del cordón umbilical por gravedad de las placentas extraídas, la fracción rica en leucocitos se separó mediante centrifugación en gradiente de densidad, células mezcladas con DMSO (10 %) y después se congelan a -80 °C. Antes de su uso, las células se descongelaron en tampón de dextrano (Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos) que contenía 2,5 % de seroalbúmina humana (HSA) (Bayer Corp. Elkhart, IN, Estados Unidos) y se eliminó el crioprotector.
Muestras de MO y sangre periférica
Se colocaron células de médula ósea (MO) y sangre periférica (SP) sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml; Sigma) y se centrifugó a 800xg durante 30 min. Las células mononucleares de la capa de interfaz se recogieron y lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries, Israel) que contenía HSA al 0,5 %.
Enriquecimiento de células CD56+
Se colocaron células de sangre del cordón umbilical (SC), médula ósea (MO) o sangre periférica (SP) sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml; Sigma) y se centrifugaron a 800xg durante 30 minutos para la separación de las células mononucleares. Las células de la capa de interfaz se recogieron y lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries, Israel) que contenía h Sa al 0,5 %. Para purificar las células CD56+, la fracción de células mononucleares se sometió a dos ciclos de separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD56+, separadas y con un separador magnético, y se purifican de células no unidas mediante lavado. La pureza de la población CD56+ obtenida de este modo es de aproximadamente 92 %, evaluada por citometría de flujo.
Opcionalmente, las células no se separan en el gradiente Ficoll-Hypaque, sino que se lavan tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries) que contiene HSA al 0,5 % ("fracción mononuclear total"). En el último lavado, las células se incubaron con rHu-DNasa 50 pg/ml durante 10 minutos. Para purificar las células CD56+, las células se someten a dos ciclos de separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MidiMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. La pureza de la población CD56+ obtenida de este modo es de aproximadamente 92 %, evaluada por citometría de flujo.
Opcionalmente, las células de la médula ósea están empobrecidas en células CD133+ o CD34+ por separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células MidiMACS o CliniMACS CD133" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania) y después la fracción negativa de CD133 o CD34 se enriquece adicionalmente con respecto a linfocitos NK al someter las células a dos ciclos de separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MidiMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante.
Enriquecimiento de células CD56+CD3-Se colocaron células de sangre del cordón umbilical (SC), médula ósea (MO) o sangre periférica (SP) sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml; Sigma) y se centrifugaron a 800xg durante 30 minutos para la separación de las células mononucleares. Las células de la capa de interfaz se recogieron y lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries, Israel) que contenía h Sa al 0,5 %. Para purificar las células CD56+CD3-, la fracción de células mononucleares se sometió a separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD56+, separadas y con un separador magnético, y se purifican de células no unidas mediante lavado. La fracción de células CD56+ purificada se sometió a una separación de perlas inmunomagnéticas adicional, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD3" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD3+, separadas y con un separador magnético, y las células CD56+CD3- recuperadas en la fracción de células no unidas. La pureza de la población CD56+CD3- obtenida de este modo es de aproximadamente 85-97 %, evaluada por citometría de flujo.
Opcionalmente, las células no se separan en el gradiente Ficoll-Hypaque, sino que se lavan tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries) que contiene HSA al 0,5 % ("fracción mononuclear total"). En el último lavado, las células se incubaron con rHu-DNasa 50 pg/ml durante 10 minutos. Para purificar las células CD56+, las células se someten a dos ciclos de separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MidiMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. La pureza de la población CD56+ obtenida de este modo es de aproximadamente 92 %, evaluada por citometría de flujo. Para purificar las células CD56+CD3-, las células se someten a separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD56+, separadas y con un separador magnético, y se purifican de células no unidas mediante lavado. La fracción de células CD56+ purificada se sometió a una separación de perlas inmunomagnéticas adicional, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD3" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD3+, separadas y con un separador magnético, y las células CD56+CD3- se recuperan en la fracción de células no unidas. La pureza de la población CD56+CD3- obtenida de este modo es de aproximadamente 85-97 %, evaluada por citometría de flujo.
Opcionalmente, las células de la médula ósea están empobrecidas en células CD133+ o CD34+ por separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células MidiMACS o CliniMACS CD133" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania) y después la fracción negativa de CD133 o CD34 se enriquece adicionalmente con respecto a linfocitos NK al someter las células a dos ciclos de separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MidiMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. Para purificar las células CD56+CD3-, la fracción CD133- o CD34 negativa se sometió a separación de perlas inmunomagnéticas, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD56" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD56+, separadas y con un separador magnético, y se purifican de células no unidas mediante lavado. La fracción de células CD56+ purificada se sometió a una separación de perlas inmunomagnéticas adicional, utilizando un "equipo de aislamiento de células progenitoras MiniMACS o CliniMACS CD3" (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las células CD56+ se hacen reaccionar con inmunoperlas magnéticas específicas de CD3+, separadas y con un separador magnético, y las células CD56+CD3-se recuperan en la fracción de células no unidas. La pureza de la población CD56+CD3- obtenida de este modo es de aproximadamente 85-97 %, evaluada por citometría de flujo.
Agotamiento de células CD3+ o CD3+ CD19+ antes del cultivo
Para el procedimiento de agotamiento, se colocaron células nucleares totales de sangre del cordón umbilical (SC), médula ósea (MO) o sangre periférica (SP) en un gradiente de Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml; Sigma) y se centrifugaron a 800xg durante 30 minutos para la separación de las células mononucleares. Las células de la capa de interfaz se recogieron y lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries, Israel) que contenía h Sa al 0,5 %. Opcionalmente, las células no se separan en el gradiente Ficoll-Hypaque, sino que se lavan tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Biological Industries) que contiene HSA al 0,5 % ("fracción mononuclear total"). Las células CD3 se agotaron utilizando el equipo de aislamiento de células CD3 (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania) y se cultivó la fracción completa de células CD3 negativas. Opcionalmente, Las células CD19 también se agotaron utilizando el equipo de aislamiento de células CD19 (Miltenyi Biotec Bergisch, Gladbach, Alemania) y se cultivó la fracción de células CD3/CD19 negativas (empobrecidas en CD3/CD19). Opcionalmente, se utilizó cóctel de agotamiento de células CD3+ humanas RosetteSep (Stem Cell Technologies, RosestteSep, cat. n.° 15661)] para el agotamiento de CD3 y se cultivó la fracción de células CD3 negativas completa. Después de un agotamiento negativo, las células se contaron y se caracterizaron mediante análisis de FACS.
Cultivos ex vivo:
1. La fracción de células mononucleares totales se cultivó en bolsas de cultivo (American Fluoroseal Co. Gaithersburg, MD, Estados Unidos), matraces en T o placas de 24 pocillos a una concentración de 0,5-2x106 células/ml en MEMa que comprendía FCS al 10 % o CellGro SCGM (Cell Genix) que comprendía suero humano al 5-10 %/reemplazo de FBS LiforCell® (Lifeblood Products) que contenía las siguientes citocinas recombinantes humanas: interleucina-2 (IL-2) (5-50 ng/ml), interleucina-15 (IL-15), interleucina-7 (IL-7), interleucina-21 (IL-21), FLT-3 o SCF o FLT3 y SCF (Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NJ, Estados Unidos), con o sin OKT-3 (10-50 ng/ml), con o sin nicotinamida (0.5-10 mM), y se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % en aire. Cuando se utilizó OKT-3 en el cultivo, los cultivos se centrifugaron después de 5-7 días y las células se resuspendieron con el mismo medio excluyendo el OKT-3. Todos los cultivos se cubren semanalmente o dos veces por semana con el mismo volumen de medio nuevo que contiene los factores de crecimiento con o sin nicotinamida. Para contar, las células se tiñeron con azul de tripano. En diversos puntos temporales, se tomaron muestras para analizar las fracciones relativas de linfocitos NK, linfocitos CD56+CD3-, CD56+CD3+, CD34+CD56+, CD56+CD16+ y/o CD56+NKG2A. La morfología celular se determinó en frotis preparados en citocentrífuga (Shandon, Pittsburgh, PA, Estados Unidos) teñidos con soluciones de May-Grunwald/Giemsa.
2. Se cultivaron células CD56+ o CD56+CD3- purificadas de células nucleares o mononucleares totales o de la fracción empobrecida en células CD34+ o CD133+ en bolsas de cultivo, matraces en T o placas de 24 pocillos a una concentración de 1-100x104 células/ml en MEMa/FCS al 10 % o CellGro SCGM (Cell Genix)/suero humano al 5 %/reemplazo de FBS LiforCell® (Lifeblood Products) que contenía las siguientes citocinas recombinantes humanas: interleucina-2 (IL-2) (5-50 ng/ml), interleucina-15 (IL-15), FLT-3 o SCF o FLT3 y SCF o IL-2 e IL-15 o IL-2 solamente (Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NJ, Estados Unidos), con o sin nicotinamida, y se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % en aire. Los cultivos se rellenaron semanalmente una o dos veces por semana con el mismo volumen de medio nuevo que contenía los factores de crecimiento con o sin nicotinamida. Con el tiempo, los cultivos se pueden complementar una o varias veces a la semana con IL-2 y/o IL-2 e IL-15. Para estimar el número de células en cultivo, las muestras de células se tiñeron con azul de tripano para el recuento. En diversos puntos temporales, se tomaron muestras para análisis de FACS para analizar las fracciones relativas de linfocitos NK, linfocitos CD56+CD3-, CD56+CD3+, CD34+CD56+, CD56+CD16+ y/o CD56+NKG2A.
3. Se cultivó una fracción de células mononucleares empobrecidas en CD3+ o CD3+/CD19+ de SP, MO y SC en bolsas de cultivo, matraces en T o placas de 24 pocillos a una concentración de 1-1000x104 células/ml en MEMa/FCS al 10 % o CellGro SCGM (Cell Genix)/suero humano al 5 %/reemplazo de FBS LiforCell® (Lifeblood Products) que contenía las siguientes citocinas recombinantes humanas: interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15), con o sin FLT-3 o SCF o FLT3 y SCF (5-50 ng/ml) (Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NJ, Estados Unidos), todas las combinaciones, con o sin nicotinamida y se incubó a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 % en aire. Los cultivos se rellenaron semanalmente o dos veces por semana con el mismo volumen de medio nuevo que contenía los factores de crecimiento con o sin nicotinamida. Posteriormente, los cultivos se complementaron una o varias veces a la semana con IL-2 y/o IL-2 e IL-15. Para estimar el número de células en cultivo, las muestras de células se contaron después de la tinción con azul de tripano. En diversos puntos temporales, se toman muestras para análisis de FACS para analizar las fracciones relativas de linfocitos NK, linfocitos CD56+CD3-, CD56+CD3+, CD34+CD56+, CD56+CD16+ y/o CD56+NKG2A.
4. También se puede cultivar una fracción total de células mononucleares, células CD56+ o CD56+CD3- purificadas de células nucleares o mononucleares totales o de la fracción empobrecida en CD34+ o CD133+, y fracción de células mononucleares empobrecidas en CD3+ o empobrecidas en CD3+/CD19+ de células de SP, MO y SC en un biorreactor tal como una bolsa de biorreactor GE Wave o matraces de material de cultivo permeable al gas (Wilson Wolf) a 1-10000x104 células/ml). El medio de cultivo contenía MEMa, suero humano (10 % v/v), IL-2 20 ng/ml, y opcionalmente IL-2 50 ng/ml y opcionalmente IL-15, con nicotinamida. Los cultivos se rellenaron semanalmente o dos veces por semana con el mismo volumen de medio nuevo que contenía los factores de crecimiento con o sin nicotinamida. Posteriormente, los cultivos se complementaron una o varias veces por semana con IL-2 y/o IL-2 e IL-15 y las células se contaron y tiñeron para análisis de FACS después de 1, 2 y 3 semanas. Cultivo de linfocitos NK con estroma irradiado
Se pueden cultivar linfocitos NK de la fracción total de células mononucleares, células CD56+ o CD56+CD3-purificadas de células nucleares o mononucleares totales o de la fracción empobrecida en células CD34+ o CD133+, o fracción de células mononucleares empobrecidas en CD3+ o CD3+/CD19+ de SP, MO y SC con estroma irradiado. Para la preparación de estroma irradiado (células alimentadoras), las células mononucleares se irradiaron con 3000 rad. Después de la selección de CD56 o CD56+CD3- o el agotamiento de CD3, las células se contaron y se caracterizaron mediante análisis de FACS como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron como se ha descrito anteriormente en el presente documento, con y sin nicotinamida, con y sin estroma irradiado a una concentración de células irradiadas de 20x105 células/ml.
Análisis de FACS
Para el análisis de FACS, las células se tiñeron con los siguientes anticuerpos fluorescentes: FITC de CD15, cat. n.° 332778, FITC de CD14, cat. n.° 345784, APC de CD3, cat. n.° 345767, todos de Becton Dickinson (San José, CA, Estados Unidos), PE de CD62L, cat. n.° 304806 de BioLegend (San Diego, CA, Estados Unidos), FITC de CD56, cat. n.° 11-0569-42 de eBioscience (San Diego, CA, Estados Unidos) y PE de CD45, cat. n.° R7807 de Dako (Glostrup, Dinamarca)
Los linfocitos NK también se caracterizaron por CXCR4, KIR3, DL1/2, DL2/2, DL1, NKG2A, NKG2C, NKG2D, TRAIL, receptor IIIb de Fc-gamma, NKp44, NKp30, NKp46, Fas-L, L-selectina, ficoeritrina, cadena y del receptor de IL-2 (CD16), cadena VLA-5a y CD8.
Cálculo del número de linfocitos NK sembrados el día 0
Para calcular el número de linfocitos NK el día 0, se multiplicó el número total de células sembradas el día 0 por el porcentaje de células CD56+/CD3- medido por el FACS el día 0.
Cálculo del número de linfocitos NK en cultivo y factor de aumento 7, 14 y 21 días después de la siembra
Para determinar el número total de células los días 7, 14 y 21, el recuento de células/ml se multiplicó por el volumen del medio de cultivo. Para determinar el número de linfocitos NK en cultivo, el número total de células en cultivo se multiplicó por el porcentaje de células CD56+/CD3- medido con el FACS los días 7, 14 o 21. Para medir el factor de expansión, se dividió el número total de linfocitos NK los días 7, 14 y 21 por el número total de linfocitos NK sembrados en cultivo el día 0.
Análisis de antígenos de superficie
Las células se lavaron con una solución de PBS que contenía BSA al 1 % y se tiñeron (a 4 °C durante 30 min) con anticuerpos conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o aloficocianina (APC). A continuación, las células se lavaron en el tampón anterior y se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACScalibur® (Becton Dickinson, San José, CA, Estados Unidos). Las células se pasaron a una velocidad de hasta 1000 células/segundo, utilizando un rayo láser de argón de 488 nm o 661 nm como fuente de luz para la excitación. Se midió la emisión de 104 células usando amplificación logarítmica y se analizó utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson). Se utilizaron células teñidas con anticuerpos de control de isotipo conjugados con FITC, PE y APC para determinar la fluorescencia de fondo.
Determinación de la funcionalidad de los linfocitos NK
Ensayo de "destrucción": Se combinan linfocitos NK (células efectoras = E) con K562 o BL2 (células diana = T) o células de leucemia bifenotípicas en diferentes relaciones de E con respecto a T (E:T). Se marcaron células diana BL2 o K562, o de leucemia bifenotípica en PBS con CFSE 1 ng/ml (Invitrogen) durante 15 min a 37 °C. Se añadió suero de ternera a las células durante 15 minutos, y a continuación las células se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI. Se colocaron 100 pl de células de leucemia bifenotípica, BL2 o K562 en una placa de fondo redondo de 96 a una concentración de 5X103 células por pocillo. Se añadieron 100 pl de linfocitos NK no teñidos a las células de leucemia bifenotípica, BL2 o K562 en una relación E:T de 1:1, 2,5:1, 5:1, 10:1 o 20:1 (5X103, 1,25x104, 2,5X104, 5X104 y 1X105 células/pocillo, respectivamente, como se indica). Entre 2 y 48 horas después. La destrucción de células diana en líneas celulares tales como K562 y BL-2 se determinó mediante FACS como un porcentaje de células marcadas con CFSE (muertas) positivas para yoduro de propidio (PI). La destrucción de las células de leucemia primaria se determinó contando con el FACS el número de células teñidas con CFSE que permanecieron en el cultivo después de su cultivo con los linfocitos NK. Un número menor de células CFSE+ es indicativo de un mayor nivel de destrucción. Ensayo de quimiotaxis ("migración"): Se analizó la respuesta de migración (quimiotaxis) de los linfocitos NK humanos mediante el ensayo de migración de Transwell (Costar, Cambridge, MA; 6,5 mm de diámetro, tamaño de poro de 5 pm). En resumen, se añadieron 100 pl de tampón de quimiotaxis (RPMI 1640, FCS al 1 %) que contenía 2x105 linfocitos NK a la cámara superior y se añadieron 0,5 ml de tampón de quimiotaxis con o sin factor CXCL12 derivado del estroma 250 ng/ml ("SDF-1") (R&D Systems) a la cámara inferior. Se contaron las células que migraron en 4 horas a la cámara inferior del "transwell" durante 60 segundos usando FACScalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).
Direccionamiento "in vivo" e injerto:
Los linfocitos NK se expandieron con o sin nicotinamida 2,5 mM o 5,0 mM, como se ha descrito anteriormente. Después de 2-3 semanas en cultivo, se infundieron números similares (15x106) de células en ratones NOD/SCID irradiados (350 Rad). Los ratones se sacrificaron 4 días después de la infusión. Se analizaron el bazo, la médula ósea y la sangre periférica para determinar el direccionamiento y el injerto de linfocitos NK humanos (CD45+CD56+) utilizando perlas inmunomagnéticas, para distinguirlos de las células endógenas. El injerto se expresa como el % de linfocitos Nk que tienen el linaje trasplantado (CD45+CD56+) utilizando anticuerpos específicos antihumanos del número total de células endógenas de ratón identificadas en el tejido.
Ensayo de expresión de CD62L en la superficie de linfocitos NK
Los cultivos se iniciaron con células CD56+ derivadas de sangre periférica purificadas con perlas inmunomagnéticas y activadas con citocinas (incluyendo IL-2 e IL-15) con o sin nicotinamida (2,5, 5 y 7,5 mM). Los linfocitos NK se tiñeron con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie especificados (p. ej., CD62L) antes de la activación en cultivo y después de 3 semanas de incubación con nicotinamida y después se supervisaron mediante FACS.
Resultados
EJEMPLO I: La nicotinamida potencia la propagación ex vivo de los linfocitos NK
Para evaluar el efecto de la adición de nicotinamida en el crecimiento ex vivo de linfocitos NK, se incubaron células de sangre del cordón umbilical o de la médula ósea con factores de crecimiento (citocinas) y concentraciones crecientes de nicotinamida, sin células alimentadoras o capa alimentadora, y fracciones de linfocitos NK y distintos de NK (p. ej., CD3+) medidas en diferentes puntos temporales.
Se descubrió que las células CD56+ derivadas de la sangre del cordón umbilical son ricas en la población de linfocitos NK CD56+CD3- y contienen relativamente pocos linfocitos NKT CD56+CD3+. Cuando se incubaron linfocitos NK de sangre del cordón umbilical purificados (CD56+) con nicotinamida, en presencia de IL-2 e IL-15, una proliferación significativamente mejorada de linfocitos NK fue evidente desde los 14 días de cultivo y a todas las concentraciones ensayadas. La fig. 1A muestra que la proliferación de linfocitos NK con nicotinamida 2,5 mM a los 14 días fue mayor de 4 veces la de las células incubadas con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo IL-2 e IL-15) solos e incluso mayor con nicotinamida 5 mM. Cuando se probó un intervalo más amplio de concentraciones de nicotinamida (fig. 1B), se descubrió que el cultivo de tres semanas con todas las concentraciones de nicotinamida de 0,5 mM a 5 mM potenció la proliferación de linfocitos NK, hasta 2,5 veces la de las mismas células incubadas con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo IL-2 e IL-15) solo.
La nicotinamida también pudo potenciar la proliferación de linfocitos NK de una población mixta no seleccionada de células mononucleares de sangre del cordón umbilical. Los cultivos no seleccionados de células mononucleares de sangre del cordón umbilical se complementaron con 10 ng/ml de Flt-3, 20 ng/ml de interleucina-15 (IL-15), 5 ng/ml de interleucina-2 (IL-2), con o sin nicotinamida 0,5, 1, 2,5 y 5 mM. Para evaluar adicionalmente el efecto específico de la nicotinamida sobre la proliferación de linfocitos NK ex vivo, se realizó análisis de las células propagadas después de tres semanas en cultivo, con y sin concentraciones crecientes de nicotinamida. Las figs. 2A y 2B muestran la mejora inducida por nicotinamida claramente dependiente de la dosis de la proliferación en cultivo de células CD56+/CD45+ y de linfocitos NK CD56+/CD3- de la fracción mononuclear. La fig. 2C indica claramente la inhibición del crecimiento de linfocitos T CD3+CD56- en cultivos tratados con nicotinamida, también de forma dependiente de la dosis, mientras que las células CD3+ cultivadas en cultivos de control sin nicotinamida predominaron sobre los linfocitos NK. Por tanto, el cultivo de una población de células mixtas de linfocitos NK y CD3+ (p. ej., T y NKT) con nicotinamida da lugar a un mayor enriquecimiento del compartimento de linfocitos NK, mientras que el cultivo solo con citocinas, sin nicotinamida, apenas mantiene la proliferación de linfocitos NK pero potencia la proliferación de células CD3+.
Se descubrió que las células de la médula ósea y de la sangre periférica contienen poblaciones heterogéneas de células CD56+ que contienen poblaciones de linfocitos tanto NKT CD56+CD3+ como n K CD56+CD3-. La proliferación de linfocitos NK derivados de la médula ósea aumentó de manera similar mediante la incubación con nicotinamida. La caracterización de las células CD56+ purificadas de médula ósea inoculadas muestra que aproximadamente el 20­ 60 % de las células presentan el fenotipo de linfocitos NKT (CD56+CD3+) y el 40-80 % presenta el fenotipo de linfocitos NK (CD56+CD3-) (variable entre diferentes muestras de MO). Por lo tanto, las células CD56+ derivadas de MO comprenden una población mixta de linfocitos NK y NKT. Aunque la proliferación de linfocitos NK en células CD56+ derivadas de médula ósea incubadas con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo FLT3, IL-2 e IL-15) solos apenas aumentó después de 14 días en cultivo, la proliferación de linfocitos NK en células CD56+ incubadas con factores de crecimiento y nicotinamida 2,5 mM aumentó un 50 % entre 14 días (factor de aumento = 8) y 21 días (factor de aumento = 12) de cultivo (fig. 3). Un análisis adicional de los subconjuntos de CD56+CD3- y CD56+CD3+ de las células cultivadas a los 21 días reveló un dominio abrumador (más del 80 %) de los linfocitos NK CD56+CD3- sobre los linfocitos NKT CD56+CD3+ en los cultivos tratados con nicotinamida, mientras que las células CD56+ de la médula ósea incubadas solo con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo FLT3, IL-2 e IL-15) eran predominantemente linfocitos NKT (CD56+CD3+) y no NK (CD56+CD3-) (figs. 4A y 4B). Por tanto, el cultivo de poblaciones heterogéneas de linfocitos NK NKT con nicotinamida da lugar a una mayor propagación y enriquecimiento del compartimento de linfocitos NK, con mínima proliferación de linfocitos NKT, mientras que el cultivo solo con citocinas sin nicotinamida no apoya la proliferación preferente de linfocitos NK.
Se ha demostrado que la población de linfocitos NK citotóxicos CD56+CD16+ tiene capacidad para citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). El análisis de células CD56+CD16+ de células CD56+ de la médula ósea cultivadas con factores de crecimiento, con y sin nicotinamida 2,5 mM después de 14 y 21 días en cultivo reveló un aumento significativo de la fracción de linfocitos NK que presentan el fenotipo CD56+CD16+ sobre las células CD56+ derivadas de la médula ósea incubadas solo con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo FLT3, IL-2 e IL-15) (véase la fig. 5).
Cuando se cultivaron células CD56+ derivadas de la médula ósea ex vivo con factores de crecimiento ("citocinas") (incluyendo FLT3, IL-2 e IL-15) y nicotinamida durante 7 días, una mejora de la proliferación del subconjunto de linfocitos NK CD56+CD3-(fig. 6A) y disminución de la proliferación de linfocitos NKT CD56+CD3+ (fig. 6B) fue evidente a nicotinamida 1 mM, 2,5 mM y 5 mM. La proliferación de linfocitos NK CD56+CD16+ a los 7 días fue más potenciada con nicotinamida 2,5 mM y 5 mM (fig. 6C).
Nicotinamida y la capacidad de autorrenovación de linfocitos NK de sangre periférica cultivados:
Cuando las células mononucleares de sangre periférica se empobrecen con respecto a las poblaciones CD3+ o CD3+/CD19+, se obtiene una población enriquecida en linfocitos NK, que comprende 2-10 % de linfocitos NK, perteneciendo la mayoría de las células sembradas a los linajes de células mieloides. Después de 2-3 semanas en cultivo con nicotinamida, sin embargo, más del 90 % de las células en cultivo eran linfocitos NK (CD56+CD3-).
La figura 10 ilustra la expansión de linfocitos NK (empobrecidos en linfocitos T) de sangre periférica durante un periodo de cultivo de tres semanas, en presencia de citocinas (IL-2 o IL-2+IL-15), en cultivos a mayor escala (volúmenes de 10 ml en bolsas de cultivo). La expansión fue más lenta en todos los grupos durante los primeros 7 días de cultivo. Después de 14 y 21 días, La expansión de NK fue significativamente mayor en cultivos tratados con nicotinamida tanto 2,5 mM como 5 mM en relación con los cultivos de control cultivados sin nicotinamida (NAM 0). Curiosamente, los linfocitos NK cultivados con nicotinamida continúan proliferando desde el día 14 hasta el día 21 mientras que los linfocitos NK tratados sin NAM dejaron de proliferar.
Cuando se iniciaron cultivos con un intervalo de densidades de siembra (2, 5 y 10X105 células sembradas), se observó una mejora profunda de la proliferación de linfocitos NK CD56+CD3- tanto a 2,5 mM como a 5 mM después de 21 días (figura 11). El análisis de FACS de los cultivos de linfocitos NK 21 días después de la siembra muestra la clara ventaja, para la población de NK (CD56+/CD3-), de cultivo con nicotinamida tanto a 2,5 como a 5 mM. Obsérvese que, aunque el porcentaje de linfocitos NK aumentó en todos los grupos, la fracción de células distintas de NK en cultivos tratados con nicotinamida es más pequeña, en comparación con los cultivos de control sin nicotinamida (figura 12).
Concentración de nicotinamida y expansión de derivados de la sangre del cordón umbilical. Linfocitos NK CD56+ purificados
Cuando se cultivó una fracción de linfocitos NK derivados de sangre del cordón umbilical, que había sido purificada en perlas inmunomagnéticas para el fenotipo CD56+ solo con citocinas (incluyendo Flt-3, IL-2 e IL-15) (citocinas) o en presencia de concentraciones crecientes (NAM 1 a 7,5 mM) de nicotinamida durante hasta 3 semanas, se observó que todas las concentraciones de nicotinamida probadas son eficaces para mejorar la proliferación de NK en los linfocitos NK derivados de sangre del cordón umbilical (véase la figura 17), en comparación con los controles solo con citocina. Obsérvese el aumento dependiente de la dosis en la expansión de los cultivos expuestos a nicotinamida, que continúa a lo largo del periodo de cultivo completo, en comparación con los controles (citocinas). Por tanto, la mejora por la nicotinamida de la proliferación de linfocitos NK es eficaz para cultivo de NK ex vivo a corto plazo así como a largo plazo, no requiere una capa alimentadora o células alimentadoras, es evidente a lo largo de una serie de concentraciones de nicotinamida y puede usar poblaciones de células mononucleares ricas en NK, una mezcla de linfocitos NK y no NK (CD3+, linfocitos T, linfocitos NKT, etc.) o altamente heterogéneas como fuente, de diversas poblaciones de células iniciales (p. ej., sangre periférica, sangre del cordón umbilical), todos importantes para proporcionar un gran número de linfocitos NK para su uso terapéutico.
EJEMPLO II: La exposición ex vivo a nicotinamida mejora la función de los linfocitos NK
Los linfocitos NK se caracterizan por la respuesta a estímulos tanto inhibidores como activadores, y la producción de linfocitos NK funcionales con citotoxicidad eficaz pero específica es fundamental para cualquier consideración de cultivo de linfocitos NK ex vivo. El efecto de la nicotinamida sobre la función de los linfocitos NK se evaluó por su efecto sobre los marcadores celulares y se probó utilizando los ensayos de migración quimiotáctica "Transwell" y "destrucción" de células diana. Para detectar cambios en la prevalencia de fracciones de linfocitos NK inhibidoras y activadoras, se cultivaron células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical purificada en pocillos con factores de crecimiento [10 ng/ml de Flt-3, 20 ng/ml de interleucina-15 (IL-15) y 5 ng/ml de interleucina-2 (IL-2)], con o sin nicotinamida 1, 2,5 y 5 mM. Después de 3 semanas de cultivo, se detectó una reducción significativa y dependiente de la dosis en la prevalencia de la fracción de células inhibidoras CD56+NKG2A entre los linfocitos n K en todas las concentraciones de nicotinamida, en comparación con los linfocitos NK derivados de la sangre del cordón umbilical incubados solo con factores de crecimiento (incluyendo FLT3, IL-2 e IL-15) (fig. 7), lo que sugiere una activación mejorada de los linfocitos NK con nicotinamida.
los linfocitos NK funcionalmente competentes pueden caracterizarse por su potencial de quimiotaxis y citotoxicidad. Para evaluar el efecto de la nicotinamida en la función de los linfocitos NK, se realizaron ensayos in vitro de migración (quimiotaxis) y destrucción (citotoxicidad).
La migración de células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical purificadas de forma inmunomagnética cultivadas con factores de crecimiento y nicotinamida 2,5 o 5 mM, en respuesta a un estímulo SDF de 250 ng/ml, se mejoró en gran medida, en comparación con la migración de células CD56+ cultivadas solo con factores de crecimiento (fig. 8A). Además, las células CD56+ cultivadas con nicotinamida mostraron mayor movilidad en ausencia de estímulo de SDF.
Se investigó el efecto de la nicotinamida sobre los receptores de superficie celular relacionados funcionalmente. Cuando se analizó la expresión de los receptores migratorios (CXCR4), de adhesión (CD49e) y de transporte (CD62L) en los linfocitos NK cultivados derivados de sangre del cordón umbilical utilizando anticuerpos específicos y análisis de FACS, la expresión muy mejorada de CXCR4 y CD62L y la expresión elevada de CD49e (fig. 8B) en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas) sugiere en gran medida una mayor capacidad de las células tratadas con nicotinamida para migrar y dirigirse a la médula ósea, órganos linfoides y otros órganos, y podría predecir direccionamiento y actividad in vivo superiores de los linfocitos NK cultivados con nicotinamida.
Cuando se analizó la expresión del receptor de transporte (CD62L) en la superficie de poblaciones de linfocitos NK de sangre periférica empobrecidas en linfocitos T (empobrecidas en CD3 o CD3/CD19) cultivadas en presencia de nicotinamida, se observó expresión elevada de este receptor, en comparación con las células de control (citocinas). En nicotinamida tanto 2,5 como 5,0 mM, se observó un aumento del porcentaje de células positivas para CD62L entre los linfocitos NK después de 7 (figura 13A), 14 (figura 13B) y 21 (figura 13C) días en cultivo, mientras que el porcentaje de linfocitos NK que expresan CD62L en los controles solo con citocinas disminuyó del 20 % después de 7 días a menos del 10 % después de 21 días en cultivo.
La figura 20 muestra el nivel de expresión del receptor de transporte de CD62L en células CD56+ purificadas con inmunoperlas derivadas de sangre periférica antes de la activación en cultivo con IL-2, la disminución drástica del nivel de expresión de CD62L después de la activación con IL-2 y el notable aumento de la expresión de CD62L tras la activación en cultivo con IL-2 y concentraciones crecientes de nicotinamida (2,5 - 7,5 mM). Los cultivos se iniciaron con células CD56+ derivadas de sangre periférica purificadas con perlas inmunomagnéticas y se mantuvieron solo en presencia de citocinas (incluyendo IL-2 e IL-15) (véase figura 20, columna "0") o citocinas más nicotinamida (2,5, 5 y 7,5 mM). Antes del cultivo y después de 3 semanas en cultivo, los linfocitos NK se tiñeron con anticuerpos específicos de CD62L y después se supervisaron mediante FACS. Obsérvese la expresión drásticamente mejorada de CD62L en células cultivadas en presencia de nicotinamida en comparación con los controles (solo citocinas, "0"). Se insertan los datos de FACS, que muestran la distribución de CD62L representada frente a la de CD56.
Se evaluó el potencial de destrucción de los linfocitos NK, ensayado utilizando células diana K562 marcadas con CFSE, para células CD56+ derivadas de sangre del cordón umbilical cultivadas con factores de crecimiento con y sin nicotinamida. En relaciones E:T de 1:5, 1:10 y 1:20 linfocitos NK por diana, el potencial de destrucción (citotóxico) de los linfocitos NK derivados de sangre del cordón umbilical cultivados con factores de crecimiento y nicotinamida fue mucho mayor que el del mismo número de células cultivadas solo en factores de crecimiento (fig. 9). Las células nuevas, sin cultivar, apenas presentaron potencial de destrucción.
El potencial de destrucción de los linfocitos NK de sangre periférica se evaluó utilizando células diana K562 y BL2 marcadas con CFSE, y se evaluó para determinar la presencia de células CD56+ derivadas de sangre periférica cultivadas con factores de crecimiento con y sin nicotinamida 2,5 mM o 5,0 mM durante 3 semanas. La muerte de células diana se supervisó mediante FACS como un porcentaje de células marcadas con CFSE positivas para PI. En relaciones E:T de 1:1 a 10:1 linfocitos NK por diana, el potencial de destrucción (citotóxico) de los linfocitos NK derivados de sangre periférica expandidos cultivados con factores de crecimiento y nicotinamida fue mucho mayor que el del mismo número de células cultivadas solo en factores de crecimiento (figura 15A).
También se demostró el potencial citotóxico de los linfocitos NK expandidos de sangre periférica utilizando células de leucemia bifenotípica primaria humana (en las que >90 % de las células son linfocitos T CD3+) como células diana. Las figuras 15B y 15C muestran los resultados, después de 24 horas, utilizando linfocitos NK de 2 donantes separados (donante A y donante B), lo que indica una mayor activación del potencial de destrucción de los linfocitos NK mediante el cultivo con nicotinamida. La ausencia de potencial de destrucción en los linfocitos de control NK cultivados del donante A es una indicación adicional del fuerte efecto activador de la nicotinamida sobre los linfocitos NK.
El potencial citotóxico de los linfocitos NK de sangre periférica expandidos con nicotinamida hacia células tumorales sólidas, una diana terapéutica importante, se demostró utilizando células de la línea celular de adenocarcinoma colorrectal colo205 como células diana. La figura 15D muestra mayor potencial de destrucción por cultivo de linfocitos NK con nicotinamida 5 mM en todas las relaciones E:T probadas (1:1 a 10:1).
Tomados en conjunto, estos resultados indican que la exposición de las células CD56+ a la nicotinamida no solo aumenta la proliferación de linfocitos NK, y específicamente la proliferación de la población de células CD56+CD62L, sino que las células que se propagan en presencia de nicotinamida tienen mayor movilidad, migración dirigida y potencial citotóxico que células similares cultivadas solo con factores de crecimiento, sin nicotinamida. Además, los resultados mostrados en el presente documento indican que la nicotinamida es eficaz para mejorar la proliferación y la funcionalidad de los linfocitos NK, ya sean purificados o de la fracción de células mononucleares totales, y de diversas fuentes, tales como sangre periférica, médula ósea o sangre del cordón umbilical.
Ejemplo III- Efecto de la nicotinamida sobre la proliferación de linfocitos NK cultivados con células alimentadoras
Los linfocitos NK también se pueden cultivar con células alimentadoras. El efecto de la nicotinamida sobre la proliferación y la funcionalidad de los linfocitos NK se evaluó en cocultivo con células alimentadoras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En general, el cultivo con células alimentadoras se lleva a cabo de la siguiente manera: Las poblaciones de células que contienen NK (p. ej., sangre del cordón umbilical, sangre periférica, médula ósea) se cultivan en presencia de células alimentadoras de PBMC autólogas o alogénicas irradiadas en una relación de 10:1 - 100:1 de células alimentadoras:cultivadas, con una combinación de citocinas que incluyen FLT3, IL-2 y/o IL-15 y concentraciones crecientes de nicotinamida (0,5-10 mM). Los cultivos se mantienen durante 2-5 semanas y se evalúa el efecto de la nicotinamida en los cultivos de células alimentadoras basándose en la distribución de linfocitos NK y no NK y subconjuntos (p. ej., CD56+, CD3+, CD56+CD3-, CD56+CD16+) y la función de los linfocitos NK (p. ej., quimiotaxis, citotoxicidad). El aumento de la proliferación y funcionalidad de los linfocitos NK cultivados con nicotinamida en cultivos de células alimentadoras indica mayor utilidad de la nicotinamida para la propagación de linfocitos NK en cultivo.
Para evaluar el efecto de la nicotinamida en el cultivo de linfocitos NK con células alimentadoras, las fracciones de linfocitos NK de sangre periférica se expandieron en cocultivo con células de estroma irradiadas, con y sin nicotinamida, y se evaluaron para determinar el factor de expansión, marcadores de superficie CD56, CXCR4 y el rendimiento funcional.
Las fracciones de células mononucleares derivadas de sangre periférica se empobrecieron en CD3 y después se seleccionaron para células CD56+ mediante purificación por inmunoperlas. Una parte de las células mononucleares de la misma unidad de sangre siempre se retuvo y se irradió a 3000 rad, para proporcionar células mononucleares irradiadas. Los linfocitos NK CD56+ se sembraron con fracciones de células mononucleares derivadas de sangre periférica irradiadas, a una relación de células mononucleares de sangre periférica irradiadas con respecto a células seleccionadas CD56 de 10:1. Los cultivos se complementaron con IL-2, IL-15 y Flt-3 con o sin nicotinamida (2,5 y 5 mM).
Después de 21 días en cultivo con las células alimentadoras irradiadas, se percibió una clara ventaja de los cultivos complementados con nicotinamida. El factor de aumento, el día 21, de los linfocitos NK cultivados en presencia de nicotinamida tanto 2,5 mM como 5 mM fue al menos 4 veces mayor que el del control (citocinas células mononucleares irradiadas), en relación con el día 0 (véase figura 20). El cocultivo de los linfocitos NK con células mononucleares irradiadas, en presencia de nicotinamida, también produjo un aumento notable de la expresión de los marcadores de superficie CXCR4 (véase figura 21) y CD62L (véase figura 22). Por tanto, los linfocitos NK expandidos con nicotinamida, en presencia de células mononucleares irradiadas y citocinas, demostraron mayor potencial migratorio (CXCR4) y de transporte (CD62L).
Cuando se ensayaron los linfocitos NK expandidos para determinar el potencial de destrucción ex vivo de las células diana K562, se observó un aumento de la capacidad citotóxica a 5:1, 2,5:1 y 1:1 linfocitos NK por célula diana (véase figura 23). La muerte de células diana se supervisó mediante FACS como un porcentaje de células marcadas con CFSE positivas para PI. El mayor potencial de destrucción de las células diana, en comparación con el control (solo citocinas) sugiere en gran medida una activación mejorada del potencial de destrucción de los linfocitos NK por cultivo con nicotinamida y células mononucleares irradiadas. Por tanto, se observó la misma mejora de la proliferación y funcionalidad cuando se cultivaron linfocitos NK en presencia de nicotinamida, con o sin células alimentadoras adicionales.
Tomados en conjunto, estos resultados indican que los efectos observados en el cultivo de linfocitos NK tratado con nicotinamida son distintos y mayores que los efectos del cultivo de linfocitos NK con células alimentadoras. El cultivo de linfocitos NK con nicotinamida, con o sin células alimentadoras, no solo dio lugar a un aumento de su proliferación ex vivo, sino también a mejora del potencial funcional (p. ej., expresión de CD62L y CXCR4) de los linfocitos NK expandidos, importante para el trasplante y la eficacia clínica del tratamiento de inmunoterapia adoptiva con linfocitos NK.
Ejemplo IV- Efecto de la nicotinamida sobre la proliferación de células distintas de NK en cultivos de linfocitos NK iniciados con MNC empobrecidas en CD3 o CD3CD19
Los métodos para la expansión de linfocitos NK en cultivo, para su uso en el entorno clínico, deben ser algo específicos para la población de linfocitos NK, para evitar que también proliferen células contaminantes distintas de NK debido a las condiciones de cultivo celular. El efecto de la nicotinamida en las células distintas de NK se evaluó supervisando las poblaciones de monocitos y granulocitos en cultivos de linfocitos NK expuestos a nicotinamida 2,5, 5 y 7,5 mM. Las figuras 14A y 14B ilustran el efecto de la nicotinamida en la reducción de los porcentajes de células contaminantes monocíticas (CD14+, figura 14A) y granulocíticas (CD15+, figura 14B) en cultivos de linfocitos NK de 14 días tratados con nicotinamida en comparación con sus porcentajes en cultivos no tratados con NAM. Sorprendentemente, el cultivo de los linfocitos NK con nicotinamida dio lugar a una supresión de más del 50 % de la proliferación de CD14 y CD16 a los 14 días de cultivo.
Cuando la proporción de diferentes subconjuntos de linfocitos, agrupados según los marcadores de superficie celular (CD56, CD3) presentes en cultivos iniciados con linfocitos NK de sangre periférica purificados CD56+ y mantenidos en ausencia (citocinas, "NAM 0") o presencia de nicotinamida (NAM 2,5, NAM 5,0) se ensayó tres semanas después del inicio, se observó una reducción de la fracción de células distintas de NK, tales como linfocitos T CD3+ y linfocitos NKT CD3+CD56+, con una concentración creciente de nicotinamida (véase figura 18 y figura 18B, recuadro). Los linfocitos NK cultivados con nicotinamida inhibieron las células CD3+ con mayor eficacia que los linfocitos NK no expuestos a nicotinamida. Los cultivos se mantuvieron con citocinas (incluyendo Flt-3, iL-15 e IL-2), con o sin concentraciones crecientes (de 2,5 a 7,5 mM) de nicotinamida durante 3 semanas, se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos para marcadores de superficie y después se analizaron mediante FACS para determinar los fenotipos específicos.
Esta reducción de la contaminación de células CD14 y CD15, que se asocian con frecuencia con la enfermedad del injerto contra el hospedador, linfocitos NKT y T, puede ser un aspecto importante de cualquier protocolo clínicamente útil para la expansión de linfocitos NK en cultivo, ya que puede reducir la necesidad del agotamiento extenso de linfocitos T, monocitos y granulocitos, antes de la implantación, y reducir adicionalmente la enfermedad del injerto contra el hospedador y las complicaciones relacionadas en el hospedador.
Ejemplo V- Efecto de la nicotinamida sobre la proliferación y función de NK en cultivo iniciado con células madre/progenitoras hematopoyéticas purificadas
El aumento por nicotinamida de la proliferación y funcionalidad de linfocitos NK en células de origen hematopoyético se puede evaluar mediante una exposición adicional de poblaciones de células hematopoyéticas tratadas con nicotinamida a nicotinamida y factores de crecimiento adecuados en cultivo.
Los cultivos se inician con células madre y/o progenitoras hematopoyéticas purificadas (p. ej., células CD34+ o CD133+) y se complementan con una combinación de citocinas que incluye TPO, FLT3, SCF y/o IL7 y/o IL15 durante una o dos semanas, con o sin concentraciones crecientes de nicotinamida (0,5-10 mM). Después de este periodo, los cultivos se complementan durante un periodo adicional (p. ej., 2-3 semanas) con una combinación de citocinas que incluye FLT3, IL7, IL15, IL21 y/o IL-2, con y sin concentraciones crecientes de nicotinamida (0,5-10 mM). Para evaluar el efecto de la nicotinamida sobre la proliferación y la funcionalidad de los linfocitos NK de origen hematopoyético cultivados, la distribución de linfocitos NK y no NK y subconjuntos (p. ej., CD56+, CD3+, CD56+CD3-, CD56+c D16+) y la función de los linfocitos NK (p. ej., quimiotaxis, citotoxicidad) se supervisan en las poblaciones de células cultivadas.
EJEMPLO VI- Injerto y potencial terapéutico de linfocitos NK cultivados con nicotinamida
Se probaron los linfocitos NK expandidos en presencia de nicotinamida para determinar su localización en órganos diana y su injerto en los órganos in vivo tras el trasplante de linfocitos NK en hospedadores vivos.
Los ratones NOD/SCID irradiados (350 Rad) recibieron 15X106 células de cultivos de NK (empobrecidos en linfocitos T) de sangre periférica humana mantenidos durante hasta 3 semanas con (NAM 2,5 mM y NAM 5 mM) o sin (NAM 0) nicotinamida. Tras el sacrificio de los ratones 4 días después de la infusión, se evaluaron muestras de bazo, médula ósea y sangre periférica mediante FACS para determinar la presencia de linfocitos NK humanos (CD56+CD45+) utilizando Ab específicos humanos. La figura 16 muestra el aumento de la localización y el injerto en los tejidos diana adecuados de los linfocitos NK expandidos con nicotinamida, expresado como porcentaje del total de linfocitos NK del órgano indicado, demostrando la concentración más alta de nicotinamida un efecto más fuerte. Por tanto, el cultivo de los linfocitos NK con nicotinamida no solo aumenta el número de linfocitos NK, sino que sirve para aumentar su potencial funcional in vivo, como lo demuestra la localización y el injerto en los órganos diana (p. ej., bazo, médula ósea y sangre periférica).
En estudios adicionales, se puede realizar transfusión de cultivos, así como linfocitos NK o CD56+ humanos nuevos, sin cultivar, en un intervalo de dosis destinadas a lograr un trasplante subóptimo y la posterior ausencia de injerto en una fracción de ratones o su descendencia. El direccionamiento y la retención de linfocitos NK humanos se pueden evaluar 4 horas y hasta 4 semanas después del trasplante, por ejemplo, según los antígenos CD45 o CD45CD56 humanos. Usando la dosis subóptima, se pueden administrar linfocitos NK cultivados con nicotinamida y el efecto sobre el direccionamiento y la retención en la SP, la MO y los órganos linfáticos de los receptores se puede registrar y comparar con el direccionamiento y la retención de linfocitos NK cultivados sin nicotinamida (solo citocinas) o linfocitos NK nuevos.
El potencial antitumoral in vivo de los linfocitos NK cultivados con nicotinamida se puede evaluar utilizando varios modelos de tumores animales, tales como leucemia mielógena (K562), linfoma de Burkitt (BL-2), cáncer de páncreas humano (BxPC-3 y Panc-1), cáncer de mama humano y xenotrasplantes de cáncer colorrectal - el crecimiento de tumores sólidos xenotrasplantados se supervisa en diferentes puntos temporales después de la infusión de la población de linfocitos NK de la invención. También se evalúa el potencial metastásico de los tumores xenotrasplantados después de la infusión de linfocitos NK. El efecto de los linfocitos NK en modelos de leucemia y síndrome mielodisplásico se puede evaluar directamente, utilizando infusión de 1X103, 1X104, 1X105, 1X106, 1X107, 1X108 o más linfocitos NK cultivados por kg de ratón, o evaluar para mejorar la eficacia de la repoblación de la médula ósea postablación cuando se infunden junto con progenitores hematopoyéticos, médula ósea, células madre y similares.
Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debería interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención. En la medida en que se usan encabezamientos de sección, no deberían interpretarse como necesariamente limitantes.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método de cultivo ex vivo de linfocitos citolíticos naturales (NK), comprendiendo el método cultivar una población de células empobrecidas en linfocitos T que comprenden linfocitos NK con IL-15 y exponer dichos linfocitos NK a nicotinamida de 1 a 10 mM durante una duración de exposición de 12-23 horas, en donde el cultivo de dichos linfocitos NK con IL-15 y dicha exposición a dicha nicotinamida da lugar a: (a) expresión elevada de CD62L en comparación con linfocitos Nk empobrecidos en linfocitos T cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de dicha nicotinamida, y
(b) mayor citotoxicidad en comparación con linfocitos NK empobrecidos en linfocitos T cultivados en condiciones de cultivo por lo demás idénticas con menos de 0,1 mM de dicha nicotinamida.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho al menos un factor de crecimiento es IL-15, dicho cultivo con IL-15 es durante 14 días desde la siembra y dicha concentración de dicha nicotinamida es de 5-10 mM.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha exposición a dicha nicotinamida es desde la siembra.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichos linfocitos NK se exponen a dicha nicotinamida durante una noche.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha población de células que comprenden dichos linfocitos NK se obtiene de una fuente seleccionada del grupo que consiste en sangre del cordón umbilical, médula ósea y sangre periférica.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha población de células empobrecidas en linfocitos T que comprenden dichos linfocitos NK es una población de células nucleares totales o mononucleares empobrecida en células CD3+ y opcionalmente células CD3+ y CD19+.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho cultivo es sin células alimentadoras.
8. Un método de transducción de linfocitos NK cultivados ex vivo con un gen exógeno, comprendiendo el método: (a) cultivar ex vivo una población de linfocitos NK según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y
(b) transducir dicha población cultivada de linfocitos NK con el gen exógeno.
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