KR20090121694A - 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된자연살해세포, 및 이를 유효성분으로 포함하는 고형 종양치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 증폭이 어려운 자연살해세포를 체외에서 (ex vivo) 충분히 활성화시켜 고형 종양 살해능이 우수한 자연살해세포를 얻을 수 있으며, 이러한 방법으로 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경모세포종(neuroblastoma)을 비롯한 고형 종양의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

인터루킨-15, 자연살해세포, 고형 종양

Description

자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 이를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물 {METHOD OF PREPARING NATURAL KILLER CELLS, NATURAL KILLER CELLS PREPARED BY THE METHOD, AND COMPOSITION FOR TREATMENT OF SOLID CANCER CONTAINING SAME}

본 발명은 자연살해세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포, 및 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물에 관한 것이다.

종양 치료를 위해 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 발전해 왔으나, 종양에 따라서는 빈번한 재발이 심각한 문제가 되고 있다. 이에 따라 환자의 면역기능을 이용한 세포치료의 가능성을 제기하게 되었다.

종양을 제거하는 면역반응은 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 일어난다. 종양세포를 직접 제거하는 면역세포로는 자연살해세 포(Natural killer cell, NK cell)와 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 있으며, 이들 효력세포(Effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포로는 수지상세포(Dendritic cell, DC)나 B 세포가 있고, 그밖에 각종 사이토카인(Cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(Helper T cell, Th cell), 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell) 등이 함께 기여하게 된다. 이들 중 자연살해세포는 면역세포 치료법 중에서 가장 효과가 빠르고 효율적인 면역세포로 중요시되고 있다.

지금까지 개발되거나 시도된 자연살해세포 치료제는 백혈병과 같은 혈액 종양을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여해 줌으로써 그 효과를 확인한 바가 있다 (Blood cells, Molecules & Disease, 33: 261-266 (2004)). 그러나, 혈액 종양을 제외한 고형 종양에 대해 어느 임상연구에서도 이렇다 할 만한 치료효과를 입증하지 못하고 있다.

구체적으로, 자연살해세포를 종양이 생기기 전부터 투여하여 종양의 생착을 방해할 수 있다는 보고가 있으나(Cancer immunology, immunotherapy, 56(11): 1733-1742 (2007)) 치료모델로 보기 어려우며, 복강으로 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 실험도 있으나 자연살해세포에 의한 효과인지가 불분명하다 (Breast cancer research and treatment, 104(3): 267-275 (2007)).

자연살해세포는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하는데 시험관내에서 (in vitro) 대량 증식이 잘 되지 않아 유효한 양의 치료제로 사용하기에는 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 기능적으로 우수한 자연살해세포를 다량으로 배양하는 방법을 찾기 위해 연구를 계속한 결과, 체외에서 (ex vivo) IL-15를 이용하여 자연살해세포를 배양하고 이를 고형 종양이 유도된 동물 모델에 투여했을 때 종양 세포 살해능이 우수한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 고형 종양 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 1) 포유동물의 비장세포를 분리하는 단계; 2) 분리된 비장세포에 IL-15를 첨가하여 3 내지 14일간 배양하는 단계; 및 3) 비장세포로부터 CD5^- 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.

상기 목적에 따라, 또한 본 발명은 1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; 2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56⁺ 단구를 분리하는 단계; 및 3) 분리된 CD56⁺ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포를 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 자연살해세포를 유효성분으로 함유하고 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함하는, 고형 종양 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 증폭이 어려운 자연살해세포를 체외에서 (ex vivo) 충분히 활성화시켜 고형 종양 살해능이 우수한 자연살해세포를 얻을 수 있으며, 이러한 방법으로 얻어진 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경모세포종(neuroblastoma)을 비롯한 고형 종양의 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

본 발명에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용하였다. 또한, 본 명세서에 언 급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함시켰다.

본 발명에서, "고형 종양 (암)"은 혈액 종양 (암)을 제외한 덩어리로 이루어진 모든 종양 (암)을 가리키며, 그 대표적인 예로 흑색종, 신경모세포종 등을 들 수 있다.

"자연살해세포의 활성화"라는 표현은 자연살해세포 표면에 NKG2D 등의 발현이 증가하고, 종양 세포에 대한 살해능이 현저히 향상되는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인터루킨-15(Interleukin-15, IL-15)를 이용하여 자연살해세포(Natural Killer cells, NK cells)를 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의해 제조한 자연살해세포를 제공한다.

본 발명의 자연살해세포는

1) 포유동물의 비장세포를 분리하는 단계;

2) 분리된 비장세포에 IL-15를 첨가하여 3 내지 14일간 배양하는 단계; 및

3) 비장세포로부터 CD5^- 단구(monocyte)를 분리하는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면, 단계 1)에서의 비장세포 분리는 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 마우스의 비장세포는, 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하고 원 침(cell down)하여 상층액과 적혈구를 제거하는 방식으로 얻어질 수 있다. 비장세포는 분리 후 자연살해세포 배양 즉시 사용하는 것이 가장 바람직하나, 적절한 동결배지에 넣어 액체 질소에서 동결보존 후 사용할 수도 있다.

단계 2)는 자연살해세포를 활성화시키는 단계로, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 내지 30 ng/ml, 가장 바람직하게는 25 ng/ml의 IL-15를 사용할 수 있고, 분리한 비장세포를 배양한 지 2일째에 IL-15를 첨가하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 비장세포에 IL-15를 첨가하여 6일간 배양할 수 있다.

단계 3)은 단계 2)에서 배양된 비장세포로부터 CD5^- 단구를 분리하는 단계로, CD5^- 단구만을 분리하기 위해 CD5⁺ 자기 비드(magnetic bead)를 이용한다.

본 발명의 자연살해세포는

1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계;

2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56⁺ 단구를 분리하는 단계; 및

3) 분리된 CD56⁺ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계

를 포함하는 방법에 의해서도 제조할 수 있다.

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면, 단계 1)에서는 건강한 공여자 또는 암환자의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계로 인체로부터 채취한 혈액을 이용하거나 혈액분반술(apheresis)을 이용하여 단핵구 농축액을 얻은 후 밀도구배 (density-gradient) 원심분리를 이용하여 단핵구만을 분리하며, 분리된 단핵구는 이후의 자연살해세포 배양에 사용하기 전까지 냉동저장하여 보관할 수 있다 (Fujiwara S et al., Journal of Immunol Methods 24:90(2); 265-273, 1986).

단계 2)는 단계 1)에서 분리된 말초혈액 단핵구로부터 자연살해세포 배양을 위한 CD56⁺ 단구를 분리하는 단계로, 단핵구 중 CD56⁺ 단구만을 분리하기 위해 CD56⁺ 자기 비드를 이용한다.

단계 3)은 분리된 CD56⁺ 단구에 IL-15를 첨가한 후 배양하여 자연살해세포를 활성화시키는 단계로, 바람직하게는 10 내지 100 ng/ml, 보다 바람직하게는 20 내지 30 ng/ml, 가장 바람직하게는 25 ng/ml의 IL-15를 사용할 수 있고, 14일 이상 배양하되 3-4일 간격으로 IL-15를 첨가해 줄 수 있다.

상기와 같이 제조된 자연살해세포의 종양 치유 효과를 조사한 결과, 본 발명의 자연살해세포는 신경모세포종, 흑색종 등에서 높은 종양살해능을 보였다 (도 8, 9 및 15b 참조).

상기 결과로부터, 본 발명의 자연살해세포는 포유동물에 투여시 강력한 고형 종양 특이적인 세포독성 면역반응을 유도할 수 있어 신경모세포종, 흑색종 등의 고형 종양 치료를 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 따라 자연살해세포를 유효성분으로 하는 고형 종양 치료용 조성물은 타겟 종양에 적절한 경로로 투여할 수 있으며, 종양 부위에 인접하여 주사하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제와 함께 본 발명의 자연살해세포를 포함하는데, 이러한 담체 또는 보조제는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체 또는 보조제인 것이 바람직하다.

본 발명의 자연살해세포 또는 조성물의 투여량은 치료되어야 할 개체의 건강과 물리적 상태, 목적하는 보호의 정도, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상하며, 예를 들어 신경모세포종의 치료를 위해서 성인 60 ㎏을 기준으로 1회 투여당 1.26×10⁸ 내지 1.32×10⁹ 세포의 양으로 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 질병 상태의 치료에 관련하여 본 발명의 자연살해세포를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 신경모세포종 또는 흑색종과 같은 고형암을 포함한다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 마우스 NK 세포, 종양세포주 및 마우스 종양모델의 제작

<1-1> 마우스 NK 세포의 제조

일본 SLC사로부터 구입한 6 주령된 A/J, C57BL/6 및 BALB/c 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 매시(mesh) 및 막자(pestle)를 이용하여 단일세포 현탁액을 제조하였다.

1x HBSS(Mediatech, Inc)를 이용하여 세포를 세척하고 20℃, 1200 rpm으로 6분간 원침(cell down)시킨 다음, 상층액을 제거하고 2 ml의 염화암모늄 용액으로 적혈구를 제거하였다.

1x HBSS로 2회 세척한 다음 70 ㎛의 세포 여과체(cell strainer, BD Falcon)에 통과시켜 통과한 용액을 6-웰 플레이트의 각 웰에 5 x 10⁶ 세포/ml가 되도록 웰당 2 ml의 양으로 분주하고 배양 2일째에 사이토카인 IL-15(R&D systems), IL-2(Calbiochem), IL-12(R&D systems) 및 IL-21(R&D systems)와 1 ml의 RPMI 배지(Gibco, 10% FBS, 0.055 mM 2-mercaptoethanol, 0.1mM sodium pyruvate, antibiotics, 2mM L-glutamine)를 첨가하였다.

4일간 추가로 배양한 후, CD5⁺ 자기 비드(Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD5⁺ 세포를 제거하였다. 구체적으로, 총 6일간 배양한 비장세포를 회수한 후 1x10⁷개의 세포 당 80 ㎕의 MACS 러닝 버퍼(running buffer, PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA)를 넣 어 펠릿(pellet)을 풀어주고, 1x10⁷개의 세포당 20 ㎕의 CD5⁺ 자기 비드를 넣어 4℃에서 15분간 반응시켰다. MACS 러닝 버퍼 35 ml로 세척한 후 1 ml의 MACS 러닝 버퍼로 펠릿을 풀어주고 AutoMACS 세포 분리기(AutoMACS cell sorter, Miltenyi Biotec)를 이용하여 CD5^- 세포를 회수하였다.

<1-2> 종양세포주의 제조

종양 세포주 Neuro-2a, CT26, YAC-1, EL-4 및 B16F10(ATCC)을 피펫팅(pipetting) 또는 트립신(trypsin)-EDTA 방법으로 회수하고 1200 rpm에서 5분간 원침시킨 후 상층액을 최대한 제거하였다.

1x10⁶개의 세포당 25 ㎕의 FBS와 100 ㎕의 크롬(⁵¹Cr, Sodium Chromate) 용액을 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 10 ml의 RPMI-1640 배지로 3회 세척하고 100 ㎕당 1x10⁴ 세포 수로 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하였다.

<1-3> 마우스 종양모델의 제작

100π 접시(Nunc, Denmark)에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양한 종양세포(신경모세포종, 흑색종 세포 (ATCC))를 1X PBS(Cambrex)로 세척하고, 트립신(trypsin)-EDTA를 이용하여 종양세포를 회수하였다. 1200 rpm, 20℃의 조건으로 6분간 원침(cell down)시키고 1X PBS로 3회 세척한 다음 1X PBS에 현탁시켰다. 이후, 30 게이지(gauge) 인슐린 주사기를 이용하여 마우스당 2x10⁵개의 세포(흑색종 세포주의 경우) 또는 3x10⁵개의 세포 (신경모세포종 세포주의 경우)의 양으로 마우스의 피하 또는 복강내로 주입하였다.

종양세포 도입 후 3일째에, 종양적하(tumor burden)가 형성된 것을 관찰하고 무작위적으로 그룹당 6~7마리씩 그룹화하였다.

실시예 2: 인간 NK 세포의 제조

먼저, 특별한 질환이 없는 건강한 성인 남녀로부터 혈액 100 ml씩을 채취하여 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 피콜-히스토파크 (Ficoll-Histopaque) 밀도 구배 방법(Sigma, St. Louis, Mo)으로 분리하였다.

분리한 PBMC를 자기비드 분리법(AutoMACS, Miltenyi Biotec)에 의해 4℃에서 15분간 반응시켜 NK 세포를 분리하였다.

분리된 NK 세포를 1.5x10⁶ 세포/ml의 양으로 10% FBS가 들어있는 RPMI1640 배지에서 희석시켜 12-웰 플레이트의 각 웰에 2 ml씩 분주하였다.

이후, 사이토카인 IL-2 및 IL-15를 3-4일 간격으로 처리하였다.

실시예 3: 사이토카인의 종류 및 첨가량에 따른 NK 세포의 함량 및 세포독성(cytotoxicity) 평가

실시예 <1-1>에 기재된 바와 같이 각종 사이토카인을 첨가하여 배양한 NK 세포의 증식 및 살해능을 평가하기 위해, NK 세포와 크롬(⁵¹Cr, Sodium Chromate)이 표지된 표적 세포(실시예 <1-2>에서 제조된 종양 세포주)(E:T = 20:1, 10:1, 5:1) 100 ㎕씩을 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 2000 rpm에서 3분간 원심분리하고 각 웰의 상층액 100 ㎕씩을 취하여 5 ml의 그린튜브에 분주하고, 암세포가 살해되어 배양액으로 유리된 크롬의 양을 감마 카운터(γ-counter)에서 분당 카운트 수(cpm)로 측정하였다. 암세포 살해능(lysis(%))은 하기 식에 의하여 계산하였다.

Lysis(%) = (ER-SR/MR-SR)x 100

상기 식에서, ER(experimental release)은 실험군으로부터 유리된 상층액의 분당 카운트 수이고, SR(spontaneous release)은 NK 세포가 들어있지 않은 표적 세포 대조군(RPMI-1640 배지)에서 자연적으로 유리된 상층액의 분당 카운트 수이며, MR(maximum release)은 표적 세포에 Triton X-100 4% 용액을 가하여 100% 방사능을 유리시킨 상층액의 분당 카운트 수이다.

그 결과, IL-2를 첨가한 경우 전체적인 세포 수는 증가하지만 종양세포 살해능은 낮고, IL-12 및 IL-21을 첨가한 경우 살해능은 증가하나 전체적으로 얻을 수 있는 NK 세포의 수가 매우 제한적인 반면에, IL-15를 첨가한 경우 NK 세포의 전체적인 수뿐만 아니라 종양세포 살해능 또한 우수하였다 (도 1 및 2). 특히, 25 ng/ml 농도의 IL-15을 첨가하였을 때 가장 효과적인 증식을 보여주었다 (도 3a 및 3b).

실시예 4: IL-15의 첨가시기에 따른 세포독성 평가 (1)

NK 세포는 NK 세포 마커로 익히 알려진 NK1.1, DX5가 결합된 자기 비드를 이용하여 양성적으로 분리(positive selection)하거나 CD3, CD5가 결합된 자기 비드를 이용하여 음성적으로 분리(negative selection)할 수도 있다. 본 실시예에서는 전자의 방법에 따라 NK 세포를 분리하였다.

구체적으로, 비장세포에서 NK 세포를 분리하고 배양하게 되면 6일 후에 높은 순도로 NK 세포 집단(NK cell population)이 잘 유지되고 있는 것을 볼 수 있으나, 실시예 3에서와 같은 방법으로 측정한 세포 살해능은 매우 저조하였다 (도 4의 (C)). 반면에, 실시예 <1-1>에서와 같이 비장세포를 6일간 배양한 후 분리한 NK 세포는 비교적 높은 순도의 NK 세포를 유지하면서 세포 살해능도 매우 높게 나타났다 (도 4의 (B)).

실시예 5: IL-15의 첨가시기에 따른 세포독성 평가 (2)

본 실시예에서는, 도 4의 (B)와 동일한 방법으로 NK 세포를 배양하되, IL-15의 첨가시기를 배양 2일째와 4일째로 달리하여 실험을 수행하였다. 그 결과 2일째 추가하는 조건이 NK 세포의 수적 증가면에서 보다 효율적인 것으로 나타났다 (도 5의 (A)).

또한, 종양세포주 Neuro-2a, B16F10 및 CT26에 대해서 배양 2일째 IL-15를 추가한 경우에 세포독성이 10~15% 가량 증가하는 것으로 나타났다 (도 5의 (B)).

실시예 6: NK 세포의 순도 평가

실시예 <1-1>의 방법에 따라 마우스 비장세포를 IL-15(25 ng/ml)을 이용해 6일간 배양하고 CD5⁺ 자기 비드를 이용하여 CD5^- 세포만을 최종적으로 분리하였다. 결과가 도 6에 도시되어 있다.

도 6에 도시된 바와 같이, 배양 전에는 3~5%에 불과하던 NK 세포 (CD3^-DX5⁺)가 76% 가량 증가되었고, T 세포(CD3⁺DX5^-)는 배양 전 33%에서 배양 후 13%로 절반 가량으로 감소했으며, 최종적으로 70~88.5%의 NK 세포(CD3^-DX5⁺)를 얻을 수 있었다. 이는 본 발명의 방법에 따라 NK 세포가 선택적으로 증폭될 수 있고, 도 4의 (B)의 방법과 비교했을 때, DX5⁺ 분리방법보다 CD5^- 분리방법이 보다 바람직함을 알 수 있다.

실시예 7: 자가 (autologous) NK 세포 및 동종 (allogenic) NK 세포의 세포독성 비 교

MHC와 표적 세포(target cell)의 수용체가 매칭되지 않으면 비자기세포로 인식하여 NK 세포가 표적 세포를 더욱 잘 살해할 수 있다.

이러한 내용을 확인해보기 위해, 본 실시예에서는 시험관내에서 (in vitro) NK 세포의 세포독성을 평가해 보았다. 결과를 도 7a 및 7b에 도시하였다.

도 7a 및 7b에 도시된 바에 따르면, MHC-1 타입이 K^b인 C57BL/6 마우스에서 종양세포살해 능력은 neuro-2a (K^a), CT26 (K^d), B16F10 (K^b) 순서로 나타났고, K^d 타입인 BALB/c 마우스에서는 neuro-2a (K^a), B16F10 (K^b), CT26 (K^d) 순서로 나타났다. 이러한 결과는 NK 세포가 자가 유래의 표적세포보다 동종 표적세포를 살해하는데 있어 더욱 효과적임을 보여준다.

실시예 8: 마우스 종양모델에서의 세포독성 평가

본 실시예에서는 실제 종양 모델을 이용하여 종양 부피(tumor volume)를 측정하여 종양회귀(tumor regression) 정도를 평가하였다. 종양 부피는 종양 부피를 계산하는 일반적인 공식인 다음 공식에 따라 계산하였다:

(short length)² x (long length) x 0.523

(여기서, short length는 형성된 종양의 최단축 길이를 의미하고 long length는 종양의 최장축 길이를 의미한다.)

실시예 <1-3>에서 제작된 마우스 신경모세포종 및 흑색종 모델에 종양 접종 3일째부터 연속 6일간 매일 NK 세포를 3x10⁶의 양으로 주입하였다. 결과를 도 8 및 9에 도시하였다.

도 8 및 9에 나타낸 바에 따르면, 신경모세포종 모델에서는 자가 NK 세포 도입군이 PBS 도입군에 비해 80%의 종양 회귀를 보인 반면에, 동종 NK 세포 도입군은 90%의 종양 회귀를 나타내었다. 한편, 흑색종 모델에서는 자가 및 동종 NK 세포 도입군 모두 비슷한 수준의 종양 회귀 및 마우스 생존율을 나타내었다.

실시예 9: NK 세포가 처리된 마우스 신경모세포종 모델에서 T 세포 및 NK 세포의 변화

마우스 신경모세포종 모델에서 6회의 NK 요법 후 종양 크기를 추적해 NK 세포의 항암효과를 확인했고, 28일째 그룹별로 치료가 된 마우스와 되지 않은 마우스의 비장과 림프절(lymph node)에서 면역세포(immune cell)의 변화를 FACS (fluorescence activated cell sorter)를 통해 확인해 보았다. 결과를 도 10a, 10b 및 11에 도시하였다.

도 10a 및 10b에 도시된 바에 따르면, 종양을 주입하지 않은 정상 마우스군 에 비해 PBS 대조군은 비장과 림프절에서 CTL 세포(CD3⁺CD8⁺) 및 Th 세포(CD3⁺CD4⁺)의 수치가 떨어져 있었다. 그러나, NK 세포에 의해 치료된 마우스와 치료되지 않은 마우스를 비교했을 때, 치료된 마우스에서 CTL과 Th 세포의 수치가 정상보다 높게 나타났으며 이는 유효 T 세포가 활성화되어 있음을 알 수 있다 (도 10a의 (A), (B), (C) 및 (D)). 그러나, 비장과 림프절에서 NK 세포(CD3^-DX5⁺)의 변화는 관측되지 않았다 (도 10b의 (E) 및 (F)). 이러한 결과는 NK 세포에 의한 CTL의 증식과 활성화를 통해 종양을 치료할 수 있음을 보여준다.

특히, CD5^- NK 세포 투여 후 비장에서 활성화된 CTL과 메모리 CTL의 증가를 확인할 수 있었다 (도 11).

실시예 10: 인간 PBMC에서 NK 세포의 함량 및 활성화 정도

실시예 2에 기재된 바와 같이 정상인의 혈액으로부터 PBMC를 분리하였다.

채혈 후 분리한 PBMC에는 약 10-20%의 NK 세포가 포함되어 있지만 (도 12의 (A)), NK 세포 활성화 마커인 NKp44는 거의 발현되지 않았다 (도 12의 (B)).

실시예 11: 인간 NK 세포의 종양세포 살해능 평가

실시예 2에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 분리된 CD56⁺ 세포에 IL-15 (50 ng/ml)를 처리하여 14일간 배양하고, 이렇게 배양된 인간 NK 세포를 이용하여 종양세포주에 대한 살해능을 비교하였다.

그 결과, CD56⁺ 자기 비드를 이용하여 분리한 NK 세포(도 13a)는 높은 수준의 종양살해능을 나타냈으나, T 세포(도 13b)는 매우 낮은 살해능을 나타냈다.

실시예 12: 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 미스매칭 정도에 따른 종양세포 살해능 평가

NK 세포는 세포의 표면에 자신과 동일한 MHC분자가 발현하는 경우 자기(self)로 인식하여 살해하지 않지만 MHC 발현이 낮은 종양세포나 타인의 MHC를 발현하는 경우 직접 살해할 수 있다.

이에, 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 차이에 따른 표적세포에 대한 살해능을 평가하기 위해, KIR 타입이 서로 다른 두 혈액제공자로부터 혈액을 제공받아 NK 세포를 실시예 2의 방법으로 14일간 배양하고, HLA와 미스매칭(mismatch)되는 정도에 따라 종양세포의 살해능을 비교하였다.

그 결과, 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입이 완전히 일치하는 경우보다 하나 또는 두 개의 KIR만 매치되는 경우에 종양세포 살해능이 우수한 것으로 나타났다 (도 14a 및 14b).

실시예 13: 인간 NK 세포의 분리에 따른 증식율 및 종양세포 살해능 평가

실시예 2의 방법에 따라 인간 NK 세포를 분리한 후 약 3주 (21일) 동안 배양하면서 증식율과 세포 살해능을 비교하였다.

그 결과, 전체적인 세포 수에 있어서, 분리하지 않고 배양한 경우 (약 11배 증가)가 분리하고 배양한 경우(약 3배 증가)에 비해 높지만 (도 15a), 실제 종양세포에 대한 살해능은 분리하고 배양한 NK 세포가 20~30% 높은 것으로 나타났다 (도 15b).

도 1은 사이토카인의 다양한 조합을 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 전체적인 세포 및 NK 세포의 수적 변화를 나타낸 것이고 (A: 총 세포수, B: NK 세포 수);

도 2는 사이토카인의 다양한 조합을 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 종양세포의 살해능을 나타낸 것이며 (YAC-1: 마우스 림프종 세포 (양성 대조군), EL-4: 백서 백혈병 세포 (음성 대조군), Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주);

도 3a 및 3b는 25 ng/ml의 IL-15를 이용하여 마우스 비장세포를 배양했을 때 NK 세포의 활성화가 가장 우수한 결과를 보여주는 것이며;

도 4는 비장세포에 IL-15를 처리한 후 6일간 배양한 경우와 비장세포로부터 DX5⁺ NK 세포를 분리한 후 IL-15를 처리하여 배양한 경우 세포독성 (cytotoxicity) 정도를 보여주는 것이며 (A: 벌크 NK 세포 배양액, B: 배양 후 분리된 DX5⁺ NK 세포, C: DX5⁺로 분리 후 배양한 NK 세포);

도 5는 비장세포를 배양한 지 2일째 및 4일째에 IL-15를 첨가하여 배양한 후 분리된 DX5⁺ NK 세포에 대한 세포독성 정도를 보여주는 것이며 (Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주);

도 6은 IL-15를 이용하여 6일간 배양한 벌크 (bulk) NK 세포와 CD5⁺ 자기 비드를 이 용하여 분리한 CD5^- NK 세포의 순도를 비교하여 나타낸 것이며;

도 7a 및 7b는 동종 NK 세포와 자가 NK 세포의 활성도와 세포독성 정도를 비교하여 나타낸 것이며 (Neuro-2a: 신경모세포종 세포주, B16F10: 흑색종 세포주, CT26: 대장암종 세포주);

도 8은 마우스 신경모세포종 모델에서 CD5^- NK 세포에 의한 종양회귀(tumor regression) 정도를 보여주는 것이며;

도 9는 마우스 흑색종 모델에서 CD5^- NK 세포에 의한 종양회귀 정도를 보여주는 것이며;

도 10a 및 10b는 마우스 신경모세포종 모델에 CD5^- NK 세포를 처리한 후 비장 및 림프절에서 T 세포 및 NK 세포의 변화를 보여주는 것이며;

도 11은 마우스 신경모세포종 모델에 CD5^- NK 세포를 처리한 후 비장에서 활성화된 CTL (A), Th 세포 (B), 메모리 CTL (C) 및 메모리 Th 세포 (D)의 함량을 비교하여 보여주는 것이며;

도 12는 인간 PBMC에서 NK세포의 함량 및 활성화 정도를 보여주는 것이며;

도 13a 및 13b는 본 발명의 방법에 따라 인간 PBMC에서 분리된 CD56⁺ 세포에 IL-15를 처리하여 14일간 배양하여 얻어진 NK 세포의 종양세포 살해능을 보여주는 것이며 (도 13a: 정제된 CD56⁺NK 세포, 도 13b: CD3⁺ T 세포, K562: 흉선종 세포주, SK- N-SH: 혈액제공자의 KIR 타입과 2개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-BE (2): 혈액 제공자의 KIR 타입과 완전 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-DZ (G1): 혈액 제공자의 KIR 타입과 1 개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주);

도 14a 및 14b는 혈액제공자의 KIR 타입과 종양세포의 HLA 타입의 차이에 따른 종양세포 살해능을 보여주는 것이며 (녹색 막대: NK 세포, 노란색 막대: T 세포, K562: 흉선종 세포주, SK-N-SH: 혈액제공자의 KIR 타입과 2개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-BE(2): 혈액 제공자의 KIR 타입과 완전 매칭되는 신경모세포종 세포주, SK-N-DZ(G1): 혈액 제공자의 KIR 타입과 1개 HLA이 매칭되는 신경모세포종 세포주);

도 15a 및 15b는 인간 PBMC에서 IL-15를 처리하여 NK 세포를 21일간 배양하여 얻어진 PBMC와 본 발명의 방법에 따라 인간 PBMC로부터 분리된 CD56⁺ 세포에 IL-15를 처리하여 21일간 배양된 NK 세포에 대한 세포 증식율 (도 15a) 및 종양세포 살해능 (도 15b)을 보여주는 것이다.

Claims (14)

1) 포유동물의 비장세포를 분리하는 단계;

2) 분리된 비장세포에 IL-15를 첨가하여 3 내지 14일간 배양하는 단계; 및

3) 비장세포로부터 CD5^- 세포를 분리하는 단계

를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법.

제 1 항에 있어서,

단계 2)에서, IL-15를 10 내지 100 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 2)에서, IL-15를 20 내지 30 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 2)에서, IL-15를 25 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 2)에서, 비장세포에 IL-15를 첨가하여 6일간 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

1) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계;

2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD56⁺ 단구를 분리하는 단계; 및

3) 분리된 CD56⁺ 단구에 IL-15를 첨가하여 2 내지 30일간 배양하는 단계

를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법.

제 6 항에 있어서,

단계 3)에서, IL-15를 10 내지 100 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 6 항에 있어서,

단계 3)에서, IL-15를 20 내지 30 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 6 항에 있어서,

단계 3)에서, IL-15를 25 ng/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 6 항에 있어서,

단계 3)에서, 분리된 CD56⁺ 단구에 IL-15를 첨가하여 14일 이상 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항 또는 제 6 항의 방법에 의해 제조되고 고형 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 자연살해세포.

제 11 항에 있어서,

자연살해세포가 동종(allogenic) 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 자연살해세포.

제 11 항의 자연살해세포를 유효성분으로 함유하고 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함하는, 고형 종양 치료용 조성물.

제 13 항에 있어서,

고형 종양이 흑색종, 신경모세포종 (neuroblastoma) 또는 대장암종인 것을 특징으로 하는 조성물.

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