KR102174280B1 - 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 코일드 코일 스페이서 도메인; (iii) 경막 도메인; 및 (iv) 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 형성 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 복수의 CAR 형성 폴리펩티드가 그들의 코일드 코일 스페이서 도메인의 회합에 의해 회합됨으로써 형성된 다량체 CAR도 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체
본 발명은 세포 표면에서 다량체 키메라 항원 수용체(CAR) 분자의 형성을 야기하는 특정 스페이서 도메인을 포함하는 CAR에 관한 것이다. 다량체 CAR 분자는 "과민감성"을 나타낼 수 있고 표적 세포에서 저밀도로 발현되는 항원에의 결합에 반응하여 T 세포 활성화를 유도할 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
전통적으로, 항원 특이적 T 세포는 표적 항원에 천연적으로 특이적인 말초 혈액 T 세포의 선택적 증폭에 의해 생성되었다. 그러나, 대다수의 암 항원에 특이적인 다수의 T 세포를 선택하고 증폭하는 것은 어렵고 꽤 빈번히 불가능하다. 키메라 항원 수용체(CAR)의 일시적인 발현이 말초 혈액 T 세포의 큰 집단의 생체외 바이러스 벡터 형질도입에 의해 임의의 표면 항원에 특이적인 다수의 T 세포의 생성을 허용하기 때문에 삽입 벡터를 사용한 유전자 요법은 이 문제점에 대한 해법을 제공한다.
키메라 항원 수용체는 항원 결합제, 예컨대, 단일클론 항체(mAb)의 특이성을 T 세포의 이펙터 기능에 이식하는 단백질이다. 이들의 통상적인 형태는 T 세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 화합물 엔도도메인(endodomain)에 모두 연결된 항원 인식 아미노 말단, 스페이서 및 경막 도메인을 가진 I형 경막 도메인 단백질의 형태이다(도 1의 (a) 참조).
이들 분자의 가장 흔한 형태는 스페이서 및 경막 도메인을 통해 신호전달 엔도도메인에 융합된, 표적 항원을 인식하는 단일클론 항체로부터 유래한 단일-쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 이러한 분자는 scFv에 의한 그의 표적의 인식에 반응하여 T 세포의 활성화를 일으킨다. T 세포가 이러한 CAR을 발현할 때, T 세포는 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하고 사멸시킨다. 종양 관련 항원에 대한 여러 CAR이 개발되었고, 이러한 CAR 발현 T 세포를 사용한 입양 전달(adoptive transfer) 방법은 현재 다양한 암의 치료를 위해 임상시험되고 있다.
종종 CAR은 항원 결합 도메인과 세포막 사이에 적절한 거리를 제공하고 리간드와 맞물렸을 때 적합한 배향, 도달 거리 및 포스파타제(phosphatases)로부터의 분리를 가능하게 하기 위해 스페이서 도메인을 포함한다.
사용되는 통상의 스페이서는 IgG1의 Fc, CD8α 및 CD28로부터의 줄기이고, 항원에 따라 심지어 단지 IgG1 힌지 단독 또는 CD247의 엑토도메인(ectodomain)이 충분할 수 있다(도 2의 B).
이들 통상의 스페이서는 기능성 스페이서를 형성하기 위해 전체 도메인 구조물을 함유해야 하거나 과도하게 글리코실화되어 있고 아미노산 길이의 변화가 스페이서 크기의 예측불가능한 변화를 초래할 것이기 때문에 제한된다. 예를 들면, IgG 스페이서는 정수의 면역글로불린 도메인을 함유해야 한다. 정수의 구조적 도메인에 대한 이 요구는 스페이서에 가해질 수 있는 변경이 제한된다는 것을 의미한다.
추가로, 상기 나열된 스페이서는 전형적으로 요구된 이차 구조 및 삼차 구조를 형성하도록 폴딩되는 긴 일차 아미노산 서열이다. 따라서, 이들은 전형적으로 긴 핵산 서열에 의해 코딩된다. 긴 핵산 서열에 대한 이 요구는 CAR을 코딩하는 벡터의 구축에 있어서 문제점이다.
고전적인 CAR은 어느 정도의 디자인 구속을 가진다. 고전적인 CAR은 동종이량체이기 때문에, 통상적으로 2종의 (동일한) 결합 특이성, 및 1:1 비의 항원 결합 도메인 대 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 있다. 이것은 어느 정도의 화학양론을 부과하고 전체로서 시스템의 유연성을 제한한다.
따라서, 디자인의 관점에서 보다 더 큰 유연성을 제공하는 대안적인 CAR에 대한 필요성이 있다.
친화성 문제
CAR 결합 도메인은 통상적으로 라이브러리로부터 선택된 기존 항체 또는 항체의 가변 도메인으로부터 유래한다. 결과적으로, 대다수의 선택된 CAR은 나노몰 친화성으로 동족(cognate) 리간드에 결합한다. 대조적으로, TCR:펩티드:MHC (TCR-pMHC) 결합의 생체물리학적 성질은 통상적으로 10-1 μM(친화성에서 더 낮은 자릿수)이다. 보다 더 높은 친화성 상호작용이 소정의 수용체 농도에서 리간드에 대한 특이성을 증가시킬지라도, T 세포로 하여금 저밀도 동족 펩티드 MHC를 발현하는 표적 세포를 검출할 수 있도록 TCR이 보다 더 낮은 친화성을 갖게끔 진화되고 있다는 것을 입증하는 드러난 증거가 있다.
T 세포는 10개만큼 적은 동족 pMHC에 의해 활성화될 수 있고 1개의 pMHC는 최대 200개의 TCR 분자에서 생산적 신호를 유발할 수 있다는 것이 보고되어 있다. 이것은 연속 유발로서 공지되어 있는 과정을 통해 달성되는 것으로 생각되는데; 이때 표적 세포 상에 존재하는 1개의 동족 pMHC는 결합, 유발 및 이어서 TCR로부터의 해리로 구성된 주기를 다회 거쳐, 신호를 효과적으로 증폭할 수 있다. 결과적으로, 적은 수의 동족 pMHC만이 생산적 신호를 변환시키기 위해 요구된다.
CAR의 보다 더 높은 친화성은 상호작용의 분자 해리가 전형적으로 대략 수 초가 소요되는 TCR과 달리 수 분 내지 수 시간이 소요될 수 있다는 것을 의미한다. 이 이유로, CAR 신호전달이 효과적인 연속 유발 반응을 겪을 가능성은 거의 없지만, 그 대신에 보다 더 많은 수의 수용체의 라이게이션에 의존한다. 이것은 CAR을 고밀도로 표적 세포 상에서 발현되는 표적 리간드로 제한할 수 있다. 고친화성 CAR은 10k 초과의 리간드 분자를 발현시켜 효과적인 사멸 반응을 이끌어내기 위해 표적 세포를 요구한다고 추정되었다. 보다 구체적으로, 제임스와 그의 동료들(James et al.)은 제1 세대 CAR을 사용하여 최대 용해 활성을 유발하기 위한 ~30,000개 표적 분자/표적 세포(~20,000개 CAR 분자의 세포내이입(endocytosis) 유도)의 요구를 입증하였다(S. James et al., The Journal of Immunology, vol. 184 (8) 4284-4294, 2010). 동물 모델은 사멸에 대한 역치 미만으로 리간드를 발현하는 표적 세포가 검출을 회피할 수 있고 질환을 재확립할 수 있다는 것을 시사한다(U. Anurathapan et al., Molecular Therapy, vol. 22 (3) 623-633, 2014).
저밀도 리간드에 대한 CAR 민감성을 증가시키는 한 방법은 TCR-pMHC 연속 유발 반응을 모방할 수 있는 저친화성 결합제 도메인을 사용하는 것이다. 그러나, 이 방법에 대한 여러 한계가 있다. 저친화성 CAR의 사용은 보조자극, 슈도이량체 형성 및 부착 분자가 TCR-pMHC 연속 유발 반응에서 역할을 수행한다는 비공지된 기여로 인해 현재 예측불가능하다. CAR 요법에서, 이 분자 상호작용은 표적 세포에 따라 달라지므로, 강력한 연속 유발 반응을 수득하는 것은 어렵다. 나아가, TCR과 동등하도록 CAR의 친화성을 감소시키는 방법은 통상적으로 고친화성 CAR로 출발한 후 CDR을 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 이것은 예측불가능한 결과를 야기할 수 있고 표적 이탈 결합의 위험을 증가시킬 수 있는 길고 종종 성공적이지 못한 방법이다.
저밀도 리간드의 존재 하에서 유발할 수 있는 CAR의 조작은 상기 요법이 보다 더 많은 암을 표적화하게 할 수 있고 암 탈출의 기회도 감소시킬 것이다.
따라서, 상기 요약된 문제점과 관련되어 있지 않은 CAR에 대한 필요성이 존재한다.
제1 양태에서, 본 발명은
(i) 항원 결합 도메인;
(ii) 코일드 코일(coiled-coil) 스페이서 도메인;
(iii) 경막 도메인; 및
(iv) 엔도도메인
을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 형성 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은
(i) 코일드 코일 스페이서 도메인;
(iii) 경막 도메인; 및
(iv) 엔도도메인
을 포함하는 보조 폴리펩티드도 제공한다.
코일드 코일 도메인은 다량체 CAR을 형성하기 위한 복수의 CAR 형성 폴리펩티드 및/또는 보조 폴리펩티드, 예컨대, 적어도 3개의 CAR 형성 폴리펩티드/보조 폴리펩티드의 다량체화를 가능하게 한다.
코일드 코일 도메인은 연골-올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩티드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 리프레서(repressor) 및 아포지질단백질(apolipoprotein) E 중 임의의 분자로부터 유래할 수 있다.
코일드 코일 도메인은 서열번호 1로서 표시된 서열 또는 이의 단편, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.
엔도도메인은 CD3 제타 엔도도메인, CD28 엔도도메인, 41BB 엔도도메인 및 OX40 엔도도메인 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
엔도도메인은 서열번호 7로서 표시된 서열, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.
항원 결합 도메인은 표적 세포 상에서 저밀도로 발현되는 항원에 결합할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 도메인은 ROR-1, Typr-1 또는 BCMA에 결합할 수 있다.
CAR 형성 폴리펩티드는 또 다른 CAR과 가교를 형성할 수 있는 요소를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 요소는 이러한 요소를 함유하는 또 다른 CAR과 디설파이드 가교를 형성할 수 있다.
본 발명의 제2 양태는 코일드 코일 스페이서 도메인 또는 CAR 형성 폴리펩티드(들) 및/또는 보조 폴리펩티드(들) 사이의 상호작용으로 인해 형성되는 다량체 CAR에 관한 것이다.
제2 양태의 제1 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 복수의 CAR 형성 폴리펩티드를 포함하는 다량체 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
본 발명의 제2 양태의 제2 실시양태에서, 상기 정의된 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 하나 이상의 보조 폴리펩티드를 포함하는 다량체 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다.
다량체 CAR에서 CAR 형성 폴리펩티드(들) 및/또는 보조 폴리펩티드(들)은 상이한 엔도도메인을 포함할 수 있다.
다량체 CAR이 2개 이상의 CAR 형성 폴리펩티드를 형성하는 경우, 이들은 상이한 항원 결합 도메인, 예를 들면, 상이한 결합 특이성을 가진 항원 결합 도메인을 가질 수 있다.
CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 엔도도메인 중 하나는 CD3 제타 엔도도메인을 포함할 수 있고, CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 다른 엔도도메인은 41BB 엔도도메인을 포함할 수 있다. 2개의 보조 폴리펩티드가 있는 경우, 한 폴리펩티드는 41BB 엔도도메인을 포함할 수 있고, 나머지 한 폴리펩티드는 CD28 엔도도메인을 포함할 수 있다.
다량체 CAR은 예를 들면, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체 CAR일 수 있다.
오량체 CAR은 CAR 형성 폴리펩티드 쇄와 보조 폴리펩티드 쇄의 하기 조합 중 임의의 조합을 포함할 수 있다:
Figure 112017103958075-pct00001
다량체 CAR이 본 발명의 제1 양태에 따른 제1 CAR 형성 폴리펩티드 및 제2 CAR 형성 폴리펩티드를 포함하는 경우, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
이 실시양태에서, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 상이한 항원에 결합할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 적어도 2개의 다량체 CAR을 포함하는 맞물린 복합체도 제공하는데, 이때 제1 다량체 CAR 상의 제1 CAR은 제1 다량체 CAR과 제2 다량체 CAR이 맞물려 복합체를 형성하도록 제2 다량체 CAR 상의 제2 CAR과 가교를 형성한다.
가교는 디설파이드 가교 또는 추가 코일드 코일 구조물일 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은
(i) 제1 이종이량체화 도메인을 포함하는, 상기 정의된 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 폴리펩티드를 포함하는 다량체 CAR; 및
(ii) 신호전달 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 성분
을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 신호전달 시스템을 제공하는데, 이때 제1 이종이량체화 도메인과 제2 이종이량체화 도메인 사이의 이종이량체화는 다량체 CAR 및 신호전달 성분으로 하여금 기능성 CAR 복합체를 형성하게 한다.
상기 또는 각각의 CAR 형성 폴리펩티드(들) 또는 보조 폴리펩티드(들)은 단일 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 폴리펩티드가 복수의 신호전달 성분과 이종이량체화할 수 있도록 복수의 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다.
CAR 신호전달 시스템의 신호전달 성분은 복수의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드 및/또는 상기 정의된 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 제5 양태는 2개 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구축물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태의 제1 실시양태에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 2개 이상의 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물이 제공된다.
본 발명의 제5 양태의 제2 실시양태에서, 상기 정의된 적어도 1개의 CAR 형성 폴리펩티드 및 적어도 1개의 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물이 제공된다.
본 발명의 제5 양태의 제1 실시양태에서,
(i) 본 발명의 제2 양태에 따른 다량체 CAR을 형성하는, 본 발명의 제1 양태에 따른 적어도 1개의 CAR 형성 폴리펩티드; 및
(ii) 본 발명의 제5 양태와 관련하여 정의된 세포내 신호전달 성분
을 코딩하는 핵산 구축물이 제공된다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 핵산 서열 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 핵산 구축물을 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 예를 들면, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 또는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 또는 트랜스포존(transposon)일 수 있다.
제7 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 폴리펩티드, 본 발명의 제2 양태에 따른 다량체 CAR, 본 발명의 제3 양태에 따른 CAR 신호전달 시스템, 또는 상기 정의된 맞물린 복합체를 발현하는 세포를 제공한다.
상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
제8 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제7 양태에 따른 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 질환의 치료에 사용될 본 발명의 제7 양태에 따른 세포에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 제7 양태에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
제11 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제7 양태에 따른 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
질환은 암, 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 흑색종 또는 골수종일 수 있다.
제12 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 다른 핵산, 본 발명의 제5 양태에 따른 핵산 구축물 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.
제13 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제7 양태에 따른 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
제14 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양태에 따른 핵산, 본 발명의 제5 양태에 따른 핵산 구축물 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 벡터를 도입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제7 양태에 따른 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세포는 대상체로부터 단리된 샘플로부터 유래할 수 있다.
CAR에서 스페이서로서 코일드 코일 도메인의 사용은 종래 사용된 스페이서, 예컨대, IgG로부터 유래한 Fc 도메인에 비해 많은 장점을 제공한다.
예를 들면, 코일드 코일 도메인의 사용은 스페이서 치수가 0.15 nm씩 증가함으로써 변경될 수 있게 한다. 개별 아미노산 또는 다수의 아미노산의 추가 또는 제거는 코일드 코일 스페이서의 크기가 증가하여 변경될 수 있다는 것을 의미한다. 대조적으로, IgG 스페이서의 사용만이 전체 면역글로불린 도메인의 추가 또는 제거를 가능하게 한다. 이것은 변화의 최소 증가가 ~4 nm(즉, 폴딩된 면역글로불린 도메인의 크기)라는 것을 의미한다.
코일드 코일 도메인은 IgG로부터의 유래한 Fc 도메인(~700개 뉴클레오티드)에 비해 더 작은 DNA 단편(예를 들면, ~100개 뉴클레오티드)에 의해 코딩된다. 이것은 바이러스 역가 및 형질도입 효율을 개선하는 데 중요한 보다 더 작은 DNA 벡터를 허용한다.
코일드 코일 스페이서의 사용은 다른 코일드 코일 도메인과 교차-혼성화하지 않을 다수의 코일드 코일 스페이서로부터의 선택을 가능하게 한다. 이것은 더 제한된 수의 스페이서 선택권이 존재하는 경우 다른 스페이서와 대비된다.
코일드 코일 스페이서의 사용은 CAR 디자인의 관점에서 고전적인 CAR보다 훨씬 더 큰 유연성도 제공한다. 예를 들면, 이것은 동종-올리고머 또는 이종-올리고머 CAR 복합체의 형성을 가능하게 한다. 이종-올리고머 CAR 복합체는 각각의 엔도도메인이 막에 최적으로 인접하여 위치하고 원하는 비로 존재하는 것을 보장하기 위해 CD28/OX40/41BB 및 TCRz 엔도도메인으로 다중-쇄 CAR을 조작할 때 유용하다.
본 발명자들은 결합제 도메인의 생체물리학적 성질을 변화시키지 않으면서 과민감성 CAR을 조작하였다. 이것은 CAR 결합제의 친화성을 감소시키는 방법이 예측불가능하고 종종 특징규명되지 않은 특이성을 갖기 때문에 바람직하다.
과민감성 CAR은 CAR의 원자가를 증가시킴으로써 제공된다. 구체적으로, 상호작용하여 2개 초과의 CAR을 포함하는 다량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 스페이서 도메인의 사용은 ITAM의 증가 및 올리고머 CAR 복합체에 대한 친화력(avidity)으로 인해 저밀도 리간드를 발현하는 표적에 대한 민감성을 증가시킨다.
민감성은 각각의 scFv가 많은 신호전달 요소에 부착되도록 코일-신호 대 scFv-코일의 비를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(도 10c 참조). 민감성은 다량체 CAR의 복합체의 형성을 통해 증가될 수도 있다(도 10f).
본 발명의 다량체 CAR에서, 신호전달 엔도도메인은 막 인접 위치에서 트랜스로 제공되어, T 세포 신호전달 도메인 조합물의 정교한 조정을 가능하게 하고(도 10a 및 10b); 구조물이 제3 세대 CAR보다 더 많은 엔도도메인 신호를 포함하도록(도 1d) 3개 초과의 상이한 세포내 신호전달 도메인의 도입을 가능하게 한다(도 10d).
세포내에서 CAR과 이종이량체화하는 별개의 세포내 신호전달 성분 분자의 사용은 항원 결합 도메인당 엔도도메인의 수에 대한 추가 증폭을 가능하게 하여, "SuperCAR"을 생성할 수 있다(도 15).
본 발명의 다량체 CAR은 1종 초과의 항원 결합 특이성을 포함하여, 복수의 에피토프 또는 항원이 표적화되게 할 수 있다(도 10e).
복수의 결합 도메인을 가진 다량체 CAR은 고전적인 동종이량체 CAR보다 훨씬 더 큰 친화력을 가질 것이다. 이것은 예를 들면, 다중 친화성의 축적된 강도가 높은 특이성 결합을 제공하기 때문에 저친화성을 가진 결합 도메인의 경우 중요할 수 있다. 다량체 CAR은 오량체 또는 육량체 구조물을 형성하도록 공유연결된 다수의 면역글로불린을 포함하는 IgM과 유사한 방식으로 항원에 결합할 수 있다.
도 1 - (a) 고전적인 CAR을 보여주는 개략도. (b) 내지 (d): CAR 엔도도메인의 상이한 세대 및 순열: (b) 초기 디자인은 FcεR1-γ 또는 CD3ζ 엔도도메인을 통해 ITAM 신호만을 전달한 반면, 후기 디자인은 동일한 화합물 엔도도메인에서 추가 (c) 1개 또는 (d) 2개의 보조자극 신호를 전달하였다.
도 2 - A) 고전적인 CAR을 보여주는 개략도. B) 통상의 CAR 스페이서를 보여주는 개략도. "S"는 디설파이드 결합을 표시한다.
도 3 - 천연 발생 이량체 코일드 코일 구조물, 삼량체 코일드 코일 구조물 및 사량체 코일드 코일 구조물(문헌(Andrei N. Lupas and Markus Gruber; Adv Protein Chem. 2005;70:37-78)으로부터 변경됨).
도 4 - 콜라겐 올리고머 매트릭스 단백질(COMP) 및 인간 IgG1로부터의 오량체 코일드 코일 모티프의 결정 구조. 개별 쇄는 상이한 색채로 표시되어 있다. 코일드 코일 COMP 구조는 N-말단부터 화면 내로 확장되는 C-말단까지 표시되어 있고, C-말단 좌측부터 N-말단 우측까지 프로파일로부터 표시되어 있기도 하다. 인간 IgG1은 N-말단(상부)부터 C-말단(하부)까지 프로파일로부터 표시되어 있다.
도 5 - 코일드 코일 스페이서 CAR. a) COMP로부터 유래한 오량체 코일드 코일 스페이서를 가진 CAR을 보여주는 개략도. b) COMP CAR 및 대조군 CAR의 ORF를 표시하는 구축물 맵. c) 항-CD33 COMP CAR 및 항-ROR-1 COMP CAR의 ORF의 아미노산 서열. d) 항-CD33 COMP CAR 및 항-ROR-1 COMP CAR의 ORF의 DNA 서열.
도 6 - 코일드 코일 CAR 표면 발현 수준. a) 뮤린 T 세포주를 항-CD33 COMP CAR 또는 항-CD33 IgG1 CAR로 형질도입하였다. 그 다음, 이들 세포를 뮤린 Fc IgG2a에 융합된 키메라 가용성 CD33으로 염색한 후, 항-마우스 IgG PE로 이차 염색하였다. b) 뮤린 T 세포주를 항-ROR-1 COMP CAR 또는 항-ROR-1 IgG1 CAR로 형질도입하였다. 그 다음, 이들 세포를 가용성 His 태그 부착된 ROR-1로 염색한 후, 항-His-바이오틴으로 이차 염색한 다음, 스트렙타비딘-APC로 삼차 염색하였다.
도 7 - 고정된 리간드를 사용한 항-ROR-1 COMP CAR T 세포의 자극. 형질도입된 뮤린 T 세포를, 상이한 농도의 가용성 His 태그 부착된 ROR-1 상청액으로 미리 코팅된 항-His 비드와 함께 공배양하였다. 16시간 내지 24시간 후, 공배양 상청액 중의 IL-2의 양을 ELISA로 분석하였다.
도 8 - 표적 세포 상의 ROR-1의 발현 수준. SKW 세포주는 저수준의 ROR-1을 천연적으로 발현한다. 이들 세포를 ROR-1로 형질도입하여 발현 수준을 증가시켰다. 이들 세포를 항-ROR-1 APC로 염색하고 비-염색된 세포와 비교하였다.
도 9 - ROR-1 양성 SKW 세포를 사용한 항-ROR-1 COMP CAR T 세포의 자극. 형질도입된 뮤린 T 세포를, 저밀도 또는 고밀도로 ROR-1 리간드를 발현하는 SKW 표적 세포와 함께 공배양하였다. T 세포를 일정한 수로 유지하였고, 표적 세포의 수를 변경시켰다. 16시간 내지 24시간 후, 공배양 상청액 중의 IL-2의 양을 ELISA로 분석하였다. 회색 음영 영역은 그 실험에 대한 표준 곡선 범위를 표시한다. 청색 점선은 PMA 및 이노마이신(Ionomycin) 자극으로부터의 평균 IL-2 분비이다. 적색 점선은 단지 (비-자극된) T 세포의 배양물로부터 검출된 평균 IL-2이다.
도 10 - 코일드 코일 CAR 디자인. a) CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드로 구성된 CAR을 보여주는 개략도. CAR 형성 폴리펩티드는 신호 1을 T 세포에게 제공하고 N-말단 상의 scFv 결합제에 이어 COMP 스페이서, 경막 및 TCRz로 구성된다. 보조 폴리펩티드는 신호 3을 T 세포에게 제공하고 N-말단 리간드 결합제로 구성되어 있지 않으나, COMP 스페이서에 이어 41BB의 경막 및 신호 모티프로 시작되고; b) CAR 형성 폴리펩티드 및 2개의 보조 폴리펩티드를 포함하는 또 다른 코일드 코일 CAR 시스템을 보여주는 개략도. CAR 형성 폴리펩티드는 신호 1을 T 세포에게 제공하고 N-말단 상의 scFv 결합제에 이어 COMP 스페이서, 경막 및 TCRz로 구성된다. 제1 보조 폴리펩티드는 신호 2를 T 세포에게 제공하고 N-말단 리간드 결합제로 구성되어 있지 않으나, COMP 스페이서에 이어 CD28의 경막 및 신호 모티프로 시작된다. 제2 보조 폴리펩티드는 신호 3을 T 세포에게 제공하고 N-말단 리간드 결합제로 구성되어 있지 않으나, COMP 스페이서에 이어 41BB의 경막 및 신호 모티프로 시작된다. "S"는 디설파이드 결합을 표시한다. 이 배열은 신호전달 엔도도메인이 막 인접 위치에서 트랜스로 존재하게 하여, 보다 더 우수한 신호전달을 유발하고; c) 각각의 scFv가 많은 신호전달 요소에 부착되도록 scFv:코일의 비가 코일:신호의 비보다 훨씬 더 적은 또 다른 코일드 코일 CAR 시스템을 보여주는 개략도. 이것은 증폭 시스템이다: 각각의 맞물린 리간드는 scFv를 복합체당 1개로 제한함으로써 5개의 TCRz 쇄를 통해 신호를 전달한다(10개의 TCRz를 통해 2개의 리간드). 이것은 2개의 리간드가 2개의 TCRz 쇄를 통해 신호를 전달하는 전통적인 이량체 CAR과 대비된다. 이 시스템은 본질적으로 유발력을 5배까지 증가할 것이고; d) 제3 세대 CAR보다 더 많은 엔도도메인을 포함하는 또 다른 코일드 코일 CAR 시스템을 보여주는 개략도. 코일드 코일 스페이서는 전통적인 제3 세대 CAR에 비해 2개의 추가 신호전달 도메인("EXTRA")의 도입을 가능하게 하고; e) 다수의 표적을 포함하는 또 다른 코일드 코일 CAR 신호전달 시스템을 보여주는 개략도(이때, 2종의 표적 결합 특이성이 표시되어 있다: 리간드 A에 결합하는 표적 결합 특이성 및 리간드 B에 결합하는 표적 결합 특이성). 이 배열은 TanCAR에 대한 대안적인 구성이고; f) 또 다른 코일드 코일 스페이서 CAR과 연결, 예컨대, 가교 디설파이드를 형성하여, scFv:신호전달 도메인의 원자가를 더 증가시키는 맞물린 복합체를 제공하는 요소를 포함하는 또 다른 코일드 코일 CAR 시스템을 보여주는 개략도. 도 10c)에 표시된 배열처럼, 이것은 증폭 시스템이다. 각각의 맞물린 복합체는 10개의 TCRz 쇄를 통해 신호를 전달할 것이다. 2개의 TCRz 쇄를 통해 신호를 전달하는 전통적인 이량체 CAR과 대조적으로, 이 시스템은 본질적으로 유발력을 5배까지 증가시킬 것이다. 삼량체 코일드 코일 구조물에 의한 IgG 힌지의 대체는 이것을 단지 8배까지 증가시킬 것인 반면, 사량체 코일드 코일은 이것을 10배까지 증가시킬 것이다.
도 11 - COMP 스페이서의 절두(truncation)
a) 항-ROR-1 COMP CAR을 보여주는 개략도: COMP 스페이서는 45개 아미노산부터 "x"개 아미노산까지 N-말단으로부터 절두되었다.
b) 293T 세포를 절두된 구축물로 형질감염시키고 FACS로 분석하였다.
도 12 - 실시예 6에서 시험된 다량체 CAR 및 고전적인 CAR을 보여주는 개략도.
A) 항-CD19 항원 결합 도메인, 코일드 코일 스페이서 도메인 및 CD3제타 엔도도메인을 가진 폴리펩티드; 및 코일드 코일 스페이서 도메인 및 41BB 엔도도메인을 가진 보조 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 CAR. 이 CAR은 구조 aCD19fmc63-COMP-CD28tmZ-2A-COMP-CD28tm-41BB를 가진 비시스트론성(bicistronic) 구축물에 의해 코딩된다. 이 CAR 구조에서, 41BB 및 TCR제타 신호전달 모티프는 병렬로 존재한다.
B) 항-CD19 항원 결합 도메인, 코일드 코일 스페이서 도메인 및 조합된 41BB/CD3제타 엔도도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 동종다량체 CAR. 이 CAR은 구조 aCD19fmc63-COMP-CD8TM-41BB-Z를 가진 구축물에 의해 코딩된다. 이 CAR 구조에서, 41BB 및 TCR제타 신호전달 모티프는 순차적인 순서로 존재한다.
C) 항-CD19 항원 결합 도메인, CD8 줄기 스페이서 도메인 및 조합된 41BB/CD3제타 엔도도메인을 가진 2개의 폴리펩티드를 포함하는 고전적인 제2 세대 동종이량체 CAR. 이 CAR은 자살 유전자 RQR8도 코딩하는 비시스트론성 구축물에 의해 코딩된다. 이 구축물은 구조 RQR8-2A-aCD19fmc63-CD8STK-41BBZ를 가진다.
도 13 - 2일째 날 도 12에 표시된 CAR에 의한 CD19+ SupT1 표적 세포의 사멸.
도 14 - 5일째 날 도 12에 표시된 CAR에 의한 CD19+ SupT1 표적 세포의 사멸.
도 15 - 실시예 7에서 시험된 코일드 코일 SuperCAR 구축물의 개략도:
aCD19-IgGFc-Z - fmc63 aCD19 결합제를 가진, 분자당 2개의 TCRz 분자를 포함하는 고전적인 동종이량체 CAR.
4개의 별개의 AD1 도메인을 각각 포함하는 5개의 폴리펩티드로 구성된 코일드 코일 SuperCAR. 따라서, 코일드 코일 SuperCAR은 20개의 AD1 도메인을 포함한다.
COMP_x4AD1 - 코일드 코일 SuperCAR은 0 카피의 TCR 제타 신호전달 도메인을 가진 신호전달 성분과 조합되어 시험되었다. 이것은 음성 대조군으로서 사용되었다.
COMP_x4AD1 + Z-DDD1-Z - 코일드 코일 SuperCAR은 2 카피의 TCR 제타 신호전달 도메인을 가진 신호전달 성분과 조합되어 시험되었다. DDD1이 2:1 화학양론으로 AD1에 결합하기 때문에, 이 신호전달 도메인은 각각의 5-폴리펩티드 코일드 코일 CAR 표적화 성분에 대해 80 카피의 TCR 제타 도메인을 제공한다.
도 16 - 상이한 농도, 즉 저농도, 중간 농도 및 고농도로 동족 항원(CD19)을 발현하는 표적 세포를 사용한 챌린지(challenge) 후 IL12 방출.
키메라 항원 수용체(CAR)
도 1에 도식적으로 표시되어 있는 고전적인 CAR은 세포외 항원 인식 도메인(결합제)을 세포내 신호전달 도메인(엔도도메인)에 연결하는 키메라 I형 경막 단백질이다. 상기 결합제는 전형적으로 단일클론 항체(mAb)로부터 유래한 단일-쇄 가변 단편(scFv)이지만, 항체 유사 또는 리간드 기반 항원 결합 부위를 포함하는 다른 포맷을 기반으로 할 수 있다. 경막 도메인은 단백질을 세포막에 고착시키고 스페이서를 엔도도메인에 연결한다.
초기 CAR 디자인은 FcεR1의 γ 쇄 또는 CD3ζ의 세포내 부분으로부터 유래한 엔도도메인을 가졌다. 결과적으로, 이들 제1 세대 수용체는 동족 표적 세포의 T 세포 사멸을 유발하기에 충분하였으나 T 세포를 완전히 활성화시켜 증식시키고 생존시키지 못한 면역학적 신호 1을 전달하였다. 이 한계를 극복하기 위해, 화합물 엔도도메인을 구축하였다: T 세포 보조자극 분자의 세포내 부분과 CD3ζ의 세포내 부분의 융합은 항원 인식 후 활성화 및 보조자극 신호를 동시에 전달할 수 있는 제2 세대 수용체를 생성하였다. 가장 흔히 사용되는 보조자극 도메인은 CD28의 보조자극 도메인이다. 이것은 T 세포 증식을 유발하는 가장 강력한 보조자극 신호, 즉 면역학적 신호 2를 공급한다. TNF 수용체 패밀리 엔도도메인, 예컨대, 생존 신호를 전달하는 밀접하게 관련된 OX40 및 41BB를 포함하는 일부 수용체들도 기재되어 있다. 활성화, 증식 및 생존 신호를 전달할 수 있는 엔도도메인을 가진 훨씬 더 강력한 제3 세대 CAR이 지금부터 기재된다.
예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 CAR 코딩 핵산을 T 세포에게 전달할 수 있다. 이 방식으로, 입양 세포 전달을 위해 다수의 항원 특이적 T 세포를 생성할 수 있다. CAR이 표적 항원에 결합할 때, 이것은 활성화 신호를, CAR이 발현되어 있는 T 세포에게 전달한다. 따라서, CAR은 T 세포의 특이성 및 세포독성이 표적화된 항원을 발현하는 세포로 향하게 한다.
본 CAR은 항원 결합 도메인, 코일드 코일 스페이서 도메인, 경막 도메인 및 엔도도메인을 포함한다. 코일드 코일 스페이서 도메인은 당분야에서 이미 기재되어 있는 스페이서에 비해 많은 장점을 제공한다.
코일드 코일 도메인
CAR은 전형적으로 항원 결합 도메인을 경막 도메인과 연결하기 위해 스페이서 서열을 포함한다. 스페이서는 항원 결합 도메인으로 하여금 적합한 배향 및 도달 거리를 갖게 한다. 스페이서는 리간드와 맞물렸을 때 포스파타제로부터의 분리도 제공한다.
본 발명의 CAR은 코일드 코일 스페이서 도메인을 포함한다.
코일드 코일은 2개 내지 7개의 알파 나선이 로프의 가닥처럼 함께 감겨있는 구조 모티프이다(도 3). 많은 내생성 단백질은 코일드 코일 도메인을 포함한다. 코일드 코일 도메인은 단백질 폴딩에 관여할 수 있거나(예를 들면, 동일한 단백질 쇄 내의 여러 알파 나선형 모티프와 상호작용하거나) 단백질-단백질 상호작용을 담당한다. 후자 경우, 코일드 코일은 동종올리고머 또는 이종올리고머 구조를 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 '다량체' 및 '다량체화'는 '올리고머' 및 '올리고머화'와 동의어이고 상호교환가능하다.
코일드 코일 도메인의 구조는 예를 들면, 문헌(Lupas & Gruber (Advances in Protein Chemistry; 2007; 70; 37-38))에 기재된 바와 같이 당분야에서 잘 공지되어 있다.
코일드 코일은 통상적으로 헵타드 반복부(heptad repeat)로서 지칭되는, 소수성(h) 아미노산 잔기 및 하전된(c) 아미노산 잔기의 반복된 패턴인 hxxhcxc를 함유한다. 헵타드 반복부 내의 위치는 통상적으로 abcdefg로 표지되어 있고, 이때 a 및 d는 종종 이소류신, 류신 또는 발린에 의해 점유되는 소수성 위치이다. 이 반복 패턴을 가진 서열이 알파 나선형 이차 구조로 폴딩됨으로써, 소수성 잔기가 좌측 방식으로 나선 주변을 완곡하게 감아 양친매성 구조를 형성하는 '줄무늬' 로서 제시되게 한다. 2개의 이러한 나선이 세포질에서 그들 자신을 배열하는 가장 유리한 방식은 소수성 가닥들을 친수성 아미노산들 사이에 끼워지도록 서로에 대해 감는 것이다. 따라서, 이것은 올리고머화에 대한 열역학적 추진력을 제공하는 소수성 표면의 매립이다. 코일드 코일 계면에서의 팩킹은 예상외로 단단하고, 이때 a 잔기 및 d 잔기의 측쇄들 사이의 반 데르 발스(van der Waals) 접촉은 거의 완전하다.
α-나선은 평행할 수 있거나 역평행할 수 있고, 통상적으로 좌측 수퍼-코일을 채택한다. 유리하지 않지만, 몇몇 우측 코일드 코일도 자연 및 디자인된 단백질에서 관찰되었다.
코일드 코일 도메인은 코일드 코일 도메인을 포함하는 CAR 또는 보조 폴리펩티드의 복합체가 형성되도록 코일드 코일 다량체를 형성할 수 있는 임의의 코일드 코일 도메인일 수 있다.
코일드 코일 도메인의 서열과 최종 폴딩된 구조 사이의 관계는 당분야에서 잘 이해되어 있다(Mahrenholz et al; Molecular & Cellular Proteomics; 2011; 10(5):M110.004994). 따라서, 코일드 코일 도메인은 합성에 의해 생성된 코일드 코일 도메인일 수 있다.
코일드 코일 도메인을 함유하는 단백질의 예로는 키네신(kinesin) 모터 단백질, 간염 D 델타 항원, 고세균 박스 C/D sRNP 코어 단백질, 연골-올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩티드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 리프레서 또는 아포지질단백질 E가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
다양한 코일드 코일 도메인의 서열이 하기 표시되어 있다:
키네신 모터 단백질: 평행 동종이량체(서열번호 30)
Figure 112017103958075-pct00002
간염 D 델타 항원: 평행 동종이량체(서열번호 31)
Figure 112017103958075-pct00003
고세균 박스 C/D sRNP 코어 단백질: 역평행 이종이량체(서열번호 32)
Figure 112017103958075-pct00004
만노스 결합 단백질 A: 평행 동종삼량체(서열번호 33)
Figure 112017103958075-pct00005
코일드 코일 세린 풍부 단백질 1: 평행 동종삼량체(서열번호 34)
Figure 112017103958075-pct00006
단백질 방출 인자 2: 역평행 이종삼량체
Figure 112017103958075-pct00007
SNAP-25 및 SNARE: 평행 이종사량체
Figure 112017103958075-pct00008
Lac 리프레서: 평행 동종사량체
Figure 112017103958075-pct00009
아포지질단백질 E: 역평행 이종사량체
Figure 112017103958075-pct00010
코일드 코일 도메인은 올리고머화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코일드 코일 도메인은 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체를 형성할 수 있다.
코일드 코일 도메인은 류신 지퍼와 상이하다. 류신 지퍼는 이량체화 도메인으로서 작용하는 수퍼-이차 구조물이다. 이의 존재는 평행 알파 나선에서 부착력을 발생시킨다. 단일 류신 지퍼는 한쪽을 따라 걸쳐 있는 소수성 영역을 가진 양친매성 알파 나선을 형성하는, 대략 7개 잔기 간격으로 존재하는 다수의 류신 잔기로 구성된다. 이 소수성 영역은 모티프들이 함께 "맞물리게" 하는, 이량체화를 위한 영역을 제공한다. 류신 지퍼는 전형적으로 20개 내지 40개 아미노산, 예를 들면, 대략 30개 아미노산 길이를 가진다.
류신 지퍼는 전형적으로 2개의 상이한 서열에 의해 형성되고, 예를 들면, 산성 류신 지퍼는 염기성 류신 지퍼와 이종이량체화한다. 류신 지퍼의 일례는 이하에 더 상세히 기재되어 있는 도킹(docking) 도메인(DDD1) 및 고착 도메인(AD1)이다.
류신 지퍼는 이량체를 형성하는 반면, 본 발명의 코일드 코일 스페이서는 다량체(삼량체 이상)를 형성한다. 류신 지퍼는 서열의 이량체화 부분에서 이종이량체화하는 반면, 코일드 코일 도메인은 동종이량체화한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 과민감성 CAR을 제공한다.
과민감성 CAR은 CAR의 원자가를 증가시킴으로써 제공된다. 특히, 2개 초과의 코일드 코일 도메인을 포함함으로써 2개 초과의 CAR을 포함하는 다량체를 형성하기 위해 상호작용할 수 있는 코일드 코일 스페이서 도메인의 사용은 존재하는 ITAM의 수 및 올리고머 CAR 복합체의 친화력의 증가로 인해 저밀도 리간드를 발현하는 표적에 대한 민감성을 증가시킨다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 CAR 형성 폴리펩티드는 적어도 3개의 CAR 형성 폴리펩티드의 다량체화를 가능하게 하는 코일드 코일 스페이서 도메인을 포함한다. 다시 말해, CAR은 코일드 코일 도메인의 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 도메인을 포함한다.
2개 초과의 코일드 코일 도메인을 포함하는 다량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 도메인의 예로는 연골-올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩티드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 리프레서 또는 아포지질단백질 E로부터의 코일드 코일 도메인이 있으나, 이들로 한정되지 않는다(상기 서열번호 30 내지 42 참조).
코일드 코일 도메인은 COMP 코일드 코일 도메인일 수 있다.
COMP는 자연에서 가장 안정한 단백질 복합체들 중 하나이고(0℃ 내지 100℃ 및 광범위한 pH에서 안정하고) 4 내지 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 의해서만 변성될 수 있다. COMP 코일드 코일 도메인은 오량체를 형성할 수 있다. COMP는 세포외 공간에서 천연적으로 발현되는 내생적으로 발현되는 단백질이기도 하다. 이것은 합성 스페이서에 비해 면역원성의 위험을 감소시킨다. 나아가, COMP 코일드 코일 모티프의 결정 구조가 해석되었고, 이것은 스페이서 길이에 대한 정확한 추정을 제공한다(도 4). COMP 구조는 길이에서 (~8.1 nm인 인간 IgG로부터의 힌지 및 CH2CH3 도메인에 비해) ~5.6 nm이다.
코일드 코일 도메인은 서열번호 1로서 표시된 서열 또는 이의 단편으로 구성될 수 있거나 이러한 서열 또는 단편을 포함할 수 있다.
서열번호 1
Figure 112017103958075-pct00011
도 11에 나타낸 바와 같이, N-말단에서 COMP 코일드 코일 도메인을 절두하고 표면 발현을 보유할 수 있다. 따라서, 코일드 코일 도메인은 N-말단에서 절두되어 있는, 서열번호 1의 절두된 버전을 포함할 수 있거나 이러한 버전으로 구성될 수 있다. 절두된 COMP는 서열번호 1의 5개 C-말단 아미노산, 즉 서열 CDACG를 포함할 수 있다. 절두된 COMP는 5개 내지 44개의 아미노산, 예를 들면, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 아미노산을 포함할 수 있다. 절두된 COMP는 서열번호 1의 C-말단에 상응할 수 있다. 예를 들면, 20개의 아미노산을 포함하는 절두된 COMP는 서열 QQVREITFLKNTVMECDACG를 포함할 수 있다. 절두된 COMP는 다량체화에 관여하는 시스테인 잔기(들)을 보유할 수 있다. 절두된 COMP는 다량체를 형성할 능력을 보유할 수 있다.
육량체, 예컨대, HIV로부터 유래한 gp41을 형성하는 다양한 코일드 코일 도메인이 공지되어 있고, 인공 단백질 디자인된 육량체 코일드 코일은 문헌(N. Zaccai et al. (2011) Nature Chem. Bio., (7) 935-941)에 기재되어 있다. GCN4-p1 류신 지퍼의 돌연변이체 형태는 칠량체 코일드 코일 구조물을 형성한다(J. Liu. et al., (2006) PNAS (103) 15457-15462).
변이체 서열이 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 보유하는 한, 코일드 코일 도메인은 전술된 코일드 코일 도메인들 중 하나의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 변이체 서열이 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 보유하는 한, 코일드 코일 도메인은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 1 또는 30 내지 42로서 표시된 서열의 변이체를 포함할 수 있다.
2개의 폴리펩티드 서열 사이의 백분율 동일성은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 자유롭게 이용될 수 있는 BLAST와 같은 프로그램에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
항원 결합 도메인
항원 결합 도메인은 항원을 인식하는 고전적인 CAR의 부분이다.
항체, 항체 모방체(mimetics) 및 T 세포 수용체의 항원 결합 부위를 기반으로 한 항원 결합 도메인을 비롯한 다수의 항원 결합 도메인이 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 항원 결합 도메인은 단일클론 항체로부터 유래한 단일-쇄 가변 단편(scFv); 표적 항원의 천연 리간드; 표적에 대한 충분한 친화성을 가진 펩티드; 단일 도메인 결합제, 예컨대, 카멜리드(camelid); 인공 결합제, 예컨대, Darpin; 또는 T 세포 수용체로부터 유래한 단일-쇄를 포함할 수 있다.
하기 표 1에 표시된 바와 같이, 다양한 종양 관련 항원(TAA)이 공지되어 있다. 본 발명에서 사용된 항원 결합 도메인은 하기 표에서 표시된 바와 같은 TAA에 결합할 수 있는 도메인일 수 있다.
[표 1]
Figure 112017103958075-pct00012
일부 실시양태에서, 본 발명은 저밀도로 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 반응하여 세포 활성화를 자극할 수 있는 과민감성 CAR을 제공한다.
항원 결합 도메인은 세포, 예를 들면, 암세포 상에서 저밀도로 발현되는 TAA에 결합할 수 있다. 저밀도로 발현된 TAA는 예를 들면, 세포당 10s 내지 1000s 분자의 수준으로 발현된 TAA를 지칭할 수 있다.
일부 암에서 저밀도로 발현되는 것으로 공지되어 있는 TAA의 예로는 CLL에서의 ROR1, 흑색종에서의 Typr-1 및 골수종에서의 BCMA가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
이들 TAA에 결합하는 항원 결합 도메인(예컨대, scFv 또는 mAb)은 예를 들면, 하기 표에서 표시된 바와 같이 이미 기재되어 있다.
Figure 112017103958075-pct00013
경막 도메인
경막 도메인은 막에 걸쳐 있는 CAR의 서열이다. 이것은 소수성 알파 나선을 포함할 수 있다. 경막 도메인은 CD28로부터 유래하여, 우수한 수용체 안정성을 제공할 수 있다.
신호 펩티드
본 발명의 CAR 형성 폴리펩티드 및/또는 보조 폴리펩티드는 세포, 예컨대, T 세포에서 발현될 때 신생 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)로 향한 후 그 자신이 발현되는 세포 표면으로 향하도록 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
신호 펩티드의 코어는 단일 알파 나선을 형성하는 경향을 가진 긴 소수성 아미노산 스트레치를 함유할 수 있다. 신호 펩티드는 전위 동안 폴리펩티드의 적절한 위상을 강제하는 데 도움을 주는 짧은 양으로 하전된 아미노산 스트레치로 시작할 수 있다. 신호 펩티드의 말단에는 전형적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 스트레치가 존재한다. 신호 펩티다제는 전위 동안 또는 전위의 완료 후 절단하여 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 그 후, 유리 신호 펩티드는 특정 프로테아제에 의해 분해된다.
신호 펩티드는 분자의 아미노 말단에 존재할 수 있다.
신호 펩티드가 여전히 CAR의 세포 표면 발현을 야기하는 작용을 하는 한, 신호 펩티드는 서열번호 2, 3 또는 4로서 표시된 서열, 또는 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 돌연변이(삽입, 치환 또는 추가)를 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure 112017103958075-pct00014
서열번호 2의 신호 펩티드는 작고 매우 효율적이며 TCR 베타 쇄로부터 유래한다. 말단 글리신 다음에서 약 95% 절단을 제공하여, 신호 펩티다제에 의한 효율적인 제거를 제공할 것으로 예측된다.
Figure 112017103958075-pct00015
서열번호 3의 신호 펩티드는 IgG1로부터 유래한다.
Figure 112017103958075-pct00016
서열번호 4의 신호 펩티드는 CD8a로부터 유래한다.
엔도도메인
엔도도메인은 막의 세포내 쪽에 위치하는 고전적인 CAR의 부분이다.
엔도도메인은 고전적인 CAR의 신호 전달 부분이다. 항원 결합 도메인에 의한 항원 인식 후, 개별 CAR 분자는 모이고, 천연 CD45 및 CD148은 시냅스로부터 배제되고, 신호는 세포에게 전달된다.
코일드 코일 스페이서 CAR의 엔도도메인은 세포내 신호전달 도메인일 수 있거나 이러한 도메인을 포함할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 본 CAR의 엔도도메인은 세포질에 존재하는 세포내 신호전달 분자와 상호작용하여 신호전달을 유발할 수 있다.
세포내 신호전달 도메인 또는 별개의 세포내 신호전달 분자는 T 세포 신호전달 도메인일 수 있거나 이러한 도메인을 포함할 수 있다.
가장 흔히 사용되는 신호전달 도메인은 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타 엔도도메인의 신호전달 도메인이다. 이것은 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에게 전달한다. CD3-제타가 완전히 만족할만한 활성화 신호를 제공할 수 없고 추가 보조자극 신호전달이 요구될 수 있다. 예를 들면, 키메라 CD28 및 OX40은 CD3-제타와 함께 사용되어 증식/생존 신호를 전달할 수 있거나, 이들 셋 모두가 함께 사용될 수 있다(도 1의 (b)에 예시되어 있음).
본 CAR은 CD3-제타 엔도도메인 단독, CD28 또는 OX40의 엔도도메인과 함께 CD3-제타 엔도도메인, 또는 CD28 엔도도메인 및 OX40 및 CD3-제타 엔도도메인을 포함할 수 있다(도 1).
엔도도메인은 하기 엔도도메인 중 하나 이상의 엔도도메인을 포함할 수 있다: ICOS 엔도도메인, CD27 엔도도메인, BTLA 엔도도메인, CD30 엔도도메인, GITR 엔도도메인 및 HVEM 엔도도메인.
엔도도메인은 서열번호 5 내지 13으로서 표시된 서열, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.
Figure 112017103958075-pct00017
변이체 서열은, 이 서열이 효과적인 세포내 신호전달 도메인을 제공하는 한, 서열번호 5 내지 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드, 및 (i) 코일드 코일 스페이서 도메인; (ii) 경막 도메인; 및 (iii) 엔도도메인을 포함하는 보조 폴리펩티드를 포함하는 CAR을 제공하는데, 이때 상기 보조 폴리펩티드의 코일드 코일 스페이서 도메인은 CAR 형성 폴리펩티드의 코일드 코일 도메인과 상호작용할 수 있다.
CAR 형성 폴리펩티드는 항원 결합 도메인을 제공하므로, 항원 특이성을 제공한다.
보조 폴리펩티드는 원하는 신호전달 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가 엔도도메인을 제공한다. 이것은 각각의 신호전달 도메인이 다른 신호전달 도메인으로부터 방해받지 않는 상태를 유지하기 때문에 화합물 신호전달 도메인에 비해 유리하다. 추가로, 이것은 각각의 신호전달 도메인이 신호전달을 위해 막에 최적으로 인접하여 위치하게 한다.
CAR 형성 폴리펩티드의 엔도도메인은 적어도 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고; 보조 폴리펩티드의 엔도도메인은 적어도 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 엔도도메인 중 하나는 CD3 제타 엔도도메인을 포함할 수 있고, CAR 및 보조 폴리펩티드의 다른 엔도도메인은 41BB 엔도도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 코일드 코일 도메인; (ii) 경막 도메인; 및 (iii) 엔도도메인을 포함하는 제2 보조 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 본 발명의 제2 양태에 따른 CAR을 제공하는데, 이때 제2 보조 폴리펩티드의 코일드 코일 도메인은 CAR 형성 폴리펩티드 및 제1 보조 폴리펩티드의 코일드 코일 도메인과 상호작용할 수 있다.
CAR 형성 폴리펩티드의 엔도도메인은 적어도 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 제1 보조 폴리펩티드의 엔도도메인은 적어도 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 제2 보조 폴리펩티드의 엔도도메인은 적어도 제3 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들면, CAR, 제1 보조 폴리펩티드 및 제2 보조 폴리펩티드의 엔도도메인은 이들 사이에서 CD3 제타 엔도도메인; 41BB 엔도도메인; 및 CD28 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 CAR에서 사용되기에 적합한 보조 폴리펩티드도 제공한다.
다량체 CAR
본 발명은 코일드 코일 스페이서 도메인들 사이의 상호작용으로 인해 복합체를 형성하는 본 발명에 따른 복수의 CAR 형성 폴리펩티드 및 임의적으로 보조 폴리펩티드(들)을 포함하는 다량체 CAR을 제공한다.
다량체 CAR은 예를 들면, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체 CAR일 수 있다.
각각의 유형의 CAR에서 CAR 형성 폴리펩티드 대 보조 단백질의 수는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure 112017103958075-pct00018
세포 내에서의 CAR 형성 폴리펩티드와 보조 폴리펩티드의 회합은 상기 표들에서 제공된 선택권이 단일 다량체 CAR을 지칭할 수 있도록 무작위적일 것이고, 이때 CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 수, 또는 세포 상에서 발현된 다중체화된 CAR에서 CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 평균 수는 정확히 정의될 수 있다. 높은 보조 폴리펩티드:CAR 형성 폴리펩티드 비가 존재하는 시스템에서, 보조 폴리펩티드 단독의 일부 다중체들이 세포 표면 상에서 발현될 것이 가능하다. 세포 표면에서 발현된 다중체들 중 적어도 일부가 CAR 형성 폴리펩티드를 포함하는 한, 이것은 문제점이 아니다.
복수의 CAR 형성 폴리펩티드 및 임의적으로 보조 폴리펩티드(들)은 동일한 엔도도메인을 포함할 수 있다.
대안적으로, 복수의 CAR 형성 폴리펩티드 및 임의적으로 보조 폴리펩티드(들)은 상이한 엔도도메인을 포함할 수 있다. 이 방식으로, 다수의 상이한 엔도도메인이 동시에 활성화될 수 있다. 이것은 각각의 신호전달 도메인이 다른 신호전달 도메인으로부터 방해받지 않는 상태를 유지하기 때문에 화합물 신호전달 도메인에 비해 유리하다. 추가로, 이것은 각각의 신호전달 도메인이 신호전달을 위해 막에 최적으로 인접하여 위치하게 한다.
다량체 CAR이 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는 경우, 이것은 항원 결합의 친화력을 증가시킬 것이다. 다량체 CAR은 면역글로불린의 오량체 또는 육량체 배열을 포함하는 IgM에 의한 항원 결합을 모방할 수 있다.
CAR 신호전달 시스템
본 발명은
(i) 제1 이종이량체화 도메인을 포함하는, 상기 정의된 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 폴리펩티드를 포함하는 다량체 CAR; 및
(ii) 신호전달 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 성분
을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 신호전달 시스템도 제공하는데, 이때 제1 이종이량체화 도메인과 제2 이종이량체화 도메인 사이의 이종이량체화는 다량체 CAR 및 신호전달 성분이 기능성 CAR 복합체를 형성하게 한다.
각각의 CAR 형성 폴리펩티드(들) 또는 보조 폴리펩티드(들)은 단일 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 폴리펩티드가 복수의 신호전달 성분과 이종이량체화할 수 있도록 복수의 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 시스템의 일례는 도 15에 예시되어 있다.
신호전달 도메인:항원 결합 도메인을 훨씬 더 증가시키기 위해, 각각의 신호전달 성분은 복수의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
이종이량체화는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2016/030691호에 기재된 시스템과 같은 시스템을 사용함으로써 소분자의 존재 하에서만 일어날 수 있다.
대안적으로, 이종이량체화는 동시에 일어날 수 있다. 제1 이종이량체화 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인은 서로 자발적으로 이량체화할 수 있다. 이종이량체화는 이량체화의 "유도제"로서 작용하는 임의의 별개의 분자를 필요로 하지 않으면서 제1 이종이량체화 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인 단독에 의해 일어난다.
본 발명의 신호전달 시스템은 특정 쌍의 이종이량체화 도메인의 배열에 의해 제한되지 않는다. 신호전달 성분이 표적화 성분 및 신호전달 성분으로 하여금 세포막에서 함께 위치할 수 있게 하는 상응하는 상보적인 도메인을 포함하는 한, 표적화 성분(즉, 다량체 CAR)은 한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 어느 한 도메인을 포함할 수 있다.
본 CAR 시스템에서 사용될 이종이량체화 도메인은 1:1 비에서 상호작용하는 이종이량체화 도메인으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 이종이량체화 도메인은 상호작용하여 다량체(예를 들면, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다. 상기 도메인은 단일 제1 이종이량체화 도메인을 다수의(예를 들면, 2개 또는 3개의) 제2 이종이량체화 도메인과 함께 위치시키는 방식으로 상호작용할 수 있다. 여기서, 다수의 신호전달 성분이 단일 다량체 CAR과 함께 위치할 수 있도록 제2 이종이량체화 도메인을 포함하는 신호전달 도메인을 갖는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예를 들면, 고도의 신호전달이 항원과 다량체 CAR의 결합 시 요구될 때 유리할 수 있다.
다량체 CAR은 복수의 신호전달 성분과 상호작용하도록 복수의 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다량체 CAR은 2개 초과의 이종이량체화 도메인, 예컨대, 3개 내지 10개의 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 도 15는 CAR 형성 폴리펩티드/보조 폴리펩티드당 4개씩 20개의 이종이량체화 도메인을 포함하는 다량체 CAR을 보여준다.
편의를 위해, 용어 이종이량체화 도메인은 다량체 CAR과 신호전달 성분의 공존을 매개하는 모든 도메인에 대해 본원에서 사용된다.
매우 다양한 적절한 이종이량체화 도메인이 당분야에서 공지되어 있고, 이들의 예는 본원에서 제공되어 있다.
제1 이종이량체화 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인은 류신 지퍼일 수 있다.
류신 지퍼는 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Hakoshima; Encyclopedia of Life Sciences; 2005) 참조). 류신 지퍼는 이량체화 도메인으로서 작용하는 수퍼-이차 구조물이다. 그의 존재는 평행한 알파 나선들에서 부착력을 발생시킨다. 단일 류신 지퍼는 한쪽을 따라 걸쳐 있는 소수성 영역을 가진 양친매성 알파 나선을 형성하는, 대략 7개 잔기 간격으로 존재하는 다수의 류신 잔기로 구성된다. 이 소수성 영역은 모티프들이 함께 "맞물리게" 하는, 이량체화를 위한 영역을 제공한다. 류신 지퍼는 전형적으로 20개 내지 40개 아미노산, 예를 들면, 대략 30개 아미노산 길이를 가진다.
제1 이종이량체화 도메인 및/또는 제2 이종이량체화 도메인은 서열번호 43 또는 44로서 표시된 서열을 포함할 수 있다. 제1 이종이량체화 도메인은 서열번호 43으로서 표시된 서열을 포함할 수 있고 제2 이종이량체화 도메인은 서열번호 44로서 표시된 서열을 포함할 수 있거나, 역의 경우도 마찬가지이다.
Figure 112017103958075-pct00019
일부 실시양태에서, 제1 이종이량체화 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인은 산성(예를 들면, 서열번호 43) 또는 염기성(예를 들면, 서열번호 44) 류신 지퍼일 수 있다. 구체적으로, 제1 이종이량체화 도메인이 산성 류신 지퍼인 경우 제2 이종이량체화는 염기성 류신 지퍼이고, 역의 경우도 마찬가지이다.
제1 이종이량체화 도메인 및 제2 이종이량체화 도메인은 이량체화 및 도킹 도메인(DDD1) 및 고착 도메인(AD1)일 수 있다. 이들 도메인 및 이들 사이의 상호작용은 당분야에서 공지되어 있다(Rossi et al.; PNAS; 2006; 103(18); 6841-6846).
DDD1은 단백질 키나제(Kinase) A(PKA)로부터 유래한 짧은 알파 나선형 구조물이다. AD1은 A-키나제 고착제 단백질(AKAP)로부터 유래한 짧은 알파 나선형 구조물이다.
DDD1 도메인은 서열번호 45로서 표시된 서열을 포함할 수 있다.
Figure 112017103958075-pct00020
AD1 도메인은 서열번호 46으로서 표시된 서열을 포함할 수 있다.
Figure 112017103958075-pct00021
DDD1/AD1 상호작용이 삼량체이기 때문에, CAR 엔도도메인 상에 존재하는 AD1 도메인은 DDD1 도메인을 포함하는 3개의 신호전달 도메인을 동원할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, CAR 엔도도메인은 AD1 도메인을 포함하고, 세포내 신호전달 성분은 DDD1 도메인을 포함한다.
이종이량체화 도메인은 세균 리보뉴클레아제(바르나제(Barnase)) 및 바른스타(Barnstar) 펩티드로부터 유래할 수 있다.
바르나제는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 리보뉴클레아제 단백질이다. 이것은 110개의 아미노산으로 구성된다. 바른스타는 바르나제의 뉴클레아제 활성을 억제하는 작용을 하므로, 매우 높은 친화성(108 s-1M-1의 결합 속도)으로 바른스타에 결합한다.
이종이량체화 도메인은 인간 췌장 리보뉴클레아제 및 S-펩티드로부터 유래할 수 있다.
인간 췌장 리보뉴클레아제는 피리미딘 특이적 엔도뉴클레아제이다. S-펩티드는 RNA 결합 부위를 결여하는, 리보뉴클레아제 A의 효소 불활성 단백질분해성 단편이다.
본 발명은 상응하는 이종이량체화 도메인과 이량체화하는 능력을 보유하는, 본원에 기재된 이종이량체화 서열의 변이체도 포괄한다. 변이체가 CAR과 신호전달 성분 사이의 이종이량체화를 여전히 야기하는 한, 이종이량체화 도메인은 서열번호 43, 44, 45 또는 46으로서 표시된 서열에 비해 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 돌연변이(삽입, 치환 또는 추가) 또는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진 변이체일 수 있다.
핵산
본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 제1 양태에서 정의된 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산도 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 서로 동의어이다.
당업자는 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 유전 코드의 축퇴성의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 당업자는 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영하기 위해 상용적인 기법을 이용하여 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 합성 또는 변경된 뉴클레오티드를 그 내부에 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변경이 당분야에서 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 골격, 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서 아크리딘 또는 폴리라이신 쇄의 추가를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 사용을 목적으로, 폴리뉴클레오티드는 당분야에서 이용될 수 있는 임의의 방법에 의해 변경될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 변경은 관심 있는 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 용어 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"는 서열로부터의 또는 서열에의 하나 (이상의) 핵산의 임의의 치환, 변이, 변경, 대체, 결실 또는 추가를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 CAR에서 사용되기에 적합한 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열도 제공한다.
핵산 구축물
본 발명은 복수의 핵산 서열을 코딩하는 핵산 구축물도 제공한다.
예를 들면, 핵산 구축물은 본 발명의 제1 양태에서 정의된 2개 이상의 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
이 실시양태에서, 핵산 구축물은 적어도 2개의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
(i) 제1 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(ii) 제2 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열.
핵산 구축물은 본 발명의 제1 양태에서 정의된 적어도 1개의 CAR 형성 폴리펩티드 및 상기 정의된 적어도 1개의 보조 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
이 실시양태에서, 핵산 구축물은 적어도 2개의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
(i) CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(ii) 보조 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열.
핵산 구축물은
(i) 본 발명의 제2 양태에서 정의된 다량체 CAR을 형성하는 적어도 1개의 CAR 형성 폴리펩티드; 및
(ii) 상기 정의된 세포내 신호전달 성분
을 코딩할 수 있다.
이 실시양태에서, 핵산 구축물은 적어도 2개의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
(i) CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
(ii) 세포내 신호전달 성분을 코딩하는 제2 핵산 서열.
핵산 구축물은 보조 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 핵산 구축물은 절단 부위(들)에 의해 연결된 2개 이상의 폴리펩티드(들)을 생성할 수 있다. 절단 부위는 신생 번역 생성물이 생성될 때 임의의 외부 절단 활성을 필요로 하지 않으면서 개별 폴리펩티드로 즉시 절단되도록 자가-절단될 수 있다.
절단 부위는 다수의 CAR 및/또는 보조 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로 하여금 분리되게 하는 임의의 서열일 수 있다.
용어 "절단"은 편의를 위해 본원에서 사용되지만, 절단 부위는 펩티드가 고전적인 절단 이외의 기작에 의해 개별 물질로 분리되게 할 수 있다. 예를 들면, 구제역 바이러스(FMDV) 2A 자가-절단 펩티드(하기 참조)의 경우, "절단" 활성을 설명하기 위해 다양한 모델이 제안되었다: 숙주 세포 프로테이나제(proteinase)에 의한 단백질분해, 자가단백질분해 또는 번역 효과(Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041). 절단 부위가 단백질을 코딩하는 핵산 서열들 사이에 위치할 때 단백질로 하여금 별개의 물질로서 발현되게 하는 한, 이러한 "절단"의 정확한 기작은 본 발명의 목적에 중요하지 않다.
절단 부위는 푸린(furin) 절단 부위일 수 있다.
푸린은 서브틸리신(subtilisin) 유사 전구단백질 컨버타제(convertase) 패밀리에 속하는 효소이다. 이 패밀리의 구성원은 잠재하는 전구체 단백질을 그의 생물학적 활성 생성물로 프로세싱하는 전구단백질 컨버타제이다. 푸린은 전구체 단백질들을 그들의 짝지어진 염기성 아미노산 프로세싱 부위에서 효율적으로 절단할 수 있는 칼슘 의존성 세린 엔도프로테아제(endoprotease)이다. 푸린 기질의 예로는 전구부갑상선 호르몬, 형질전이 성장인자 베타 1 전구체, 전구알부민, 전구-베타-세크레타제(secretase), 막 1형 매트릭스 메탈로프로테이나제, 전구-신경 성장인자의 베타 서브유닛 및 폰 빌레브란트 인자가 있다. 푸린은 염기성 아미노산 표적 서열(표준적으로, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')의 바로 다운스트림에서 단백질을 절단하고 골기체(Golgi apparatus)에 풍부하다.
절단 부위는 타바코 에치 바이러스(Tobacco Etch Virus)(TEV) 절단 부위일 수 있다.
TEV 프로테아제는 카이모트립신(chymotrypsin) 유사 프로테아제인 고도로 서열 특이적인 시스테인 프로테아제이다. 이것은 그의 표적 절단 부위에 매우 특이적이므로, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 융합 단백질의 조절된 절단을 위해 빈번히 사용된다. 컨센서스 TEV 절단 부위는 ENLYFQ＼S이다(이때, '＼'는 절단된 펩티드 결합을 표시한다). 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포는 TEV 프로테아제를 발현하지 않는다. 따라서, 본 핵산 구축물이 TEV 절단 부위를 포함하고 포유동물 세포에서 발현되는 실시양태에서, 외생성 TEV 프로테아제도 포유동물 세포에서 발현되어야 한다.
절단 부위는 자가-절단 펩티드를 코딩할 수 있다.
'자가-절단 펩티드'는 폴리펩티드 및 자가-절단 펩티드를 포함하는 신생 생성물이 생성될 때 임의의 외부 절단 활성을 필요로 하지 않으면서 상이한 별개의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드로 즉시 "절단되거나" 분리되도록 작용하는 펩티드를 지칭한다.
자가-절단 펩티드는 아프토바이러스(aphthovirus) 또는 카디오바이러스(cardiovirus)로부터의 2A 자가-절단 펩티드일 수 있다. 아프토바이러스 및 카디오바이러스의 일차 2A/2B 절단은 그 자신의 C-말단에서 2A "절단"에 의해 매개된다. 아프토바이러스, 예컨대, 구제역 바이러스(FMDV) 및 말 비염 A 바이러스에서, 2A 영역은 단백질 2B의 N-말단 잔기(보존된 프롤린 잔기)와 함께 그 자신의 C-말단에서 "절단"을 매개할 수 있는 자율적 요소를 나타내는 약 18개 아미노산의 짧은 구획이다(상기 문헌(Donelly et al (2001))).
"2A 유사" 서열은 아프토바이러스 또는 카디오바이러스 이외의 피코르나바이러스(picornaviruses), '피코르나바이러스 유사' 곤충 바이러스, C형 로타바이러스 및 트리파노소마(Trypanosoma) 종 내의 반복된 서열 및 세균 서열에서 발견된다(상기 문헌(Donnelly et al (2001))). 절단 부위는 이들 2A 유사 서열, 예컨대, 하기 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure 112017103958075-pct00022
절단 부위는 서열번호 19(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)로서 표시된 2A 유사 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제2 양태에 따른 CAR을 생성하기에 적합한 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드 및/또는 보조 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(들)을 포함하는 키트도 제공한다.
벡터
본 발명은 상기 정의된 하나 이상의 핵산 서열(들) 또는 핵산 구축물을 포함하는 벡터 또는 벡터의 키트도 제공한다. 이러한 벡터는 본 발명의 제1 양태에 따른 CAR 형성 폴리펩티드 또는 보조 펩티드 및/또는 본 발명의 제2 양태에 따른 CAR을 발현하도록 핵산 서열(들)을 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존 기반 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.
벡터는 면역 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포를 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있다.
세포
본 발명은 전술된 CAR 형성 폴리펩티드, CAR 또는 CAR 신호전달 시스템을 포함하는 세포, 예컨대, 면역 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 본 발명의 핵산, 핵산 구축물 또는 벡터를 포함할 수 있다.
세포는 면역 세포, 특히 세포용해성 면역 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포일 수 있다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포 매개 면역에서 중추적인 역할을 수행하는 림프구의 일종이다. 이들은 세포 표면 상에서의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구들, 예컨대, B 세포 및 천연 킬러 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다. 하기 요약된 바와 같이 다양한 유형의 T 세포가 존재한다.
헬퍼 T 헬퍼 세포(TH 세포)는 형질 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 보조한다. TH 세포는 그의 표면 상에서 CD4를 발현한다. TH 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원을 제공받을 때 활성화된다. 이 세포는 상이한 사이토카인을 분비하여 상이한 유형의 면역 반응을 용이하게 하는, TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 또는 TFH를 포함하는 여러 하위유형들 중 하나로 분화할 수 있다.
세포용해성 T 세포(TC 세포 또는 CTL)는 바이러스에 의해 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 이식 거부와도 관련되어 있다. CTL은 그의 표면에서 CD8을 발현한다. 이 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I과 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. CD8+ 세포는 조절 T 세포에 의해 분비된 IL-10, 아데노신 및 다른 분자를 통해 아네르기 상태로 불활성화될 수 있고, 이것은 자가면역 질환, 예컨대, 실험적 자가면역 뇌척수염을 예방한다.
기억 T 세포는 감염이 해결된 후 장기간 지속되는 항원 특이적 T 세포들의 서브세트이다. 이 세포는 그의 동족 항원에의 재노출 시 다수의 이펙터 T 세포들로 신속히 증폭함으로써, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역 시스템에게 제공한다. 기억 T 세포는 세 하위유형, 즉 중추 기억 T 세포(TCM 세포) 및 두 유형의 이펙터 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포)를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다.
이전에 억제제 T 세포로서 공지된 조절 T 세포(Treg 세포)는 면역학적 내성의 유지에 중요하다. 그의 주요 역할은 면역 반응의 말기쯤 T 세포 매개 면역을 멈추는 것, 및 흉선에서 음성 선택의 과정을 탈출한 자가-반응성 T 세포를 억제하는 것이다.
CD4+ Treg 세포의 두 주요 클래스, 즉 천연 발생 Treg 세포 및 적응 Treg 세포가 기재되어 있다.
천연 발생 Treg 세포(CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로서도 공지되어 있음)는 흉선에서 발생하고, 발생하는 T 세포와, TSLP에 의해 활성화되어 있는 골수성(CD11c+) 수지상세포 및 형질세포성(CD123+) 수지상세포 사이의 상호작용과 연관되어 있다. 천연 발생 Treg 세포는 FoxP3으로서 지칭되는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포들과 구별될 수 있다. FOXP3 유전자의 돌연변이는 조절 T 세포 발생을 방해하여, 치명적인 자가면역 질환인 IPEX를 야기할 수 있다.
적응 Treg 세포(Tr1 세포 또는 Th3 세포로서도 공지되어 있음)는 정상 면역 반응 동안 유래할 수 있다.
세포는 천연 킬러 세포(또는 NK 세포)일 수 있다. NK 세포는 선천성 면역 시스템의 부분을 형성한다. NK 세포는 바이러스에 의해 감염된 세포로부터의 선천성 신호에 대한 신속한 반응을 MHC 독립적 방식으로 제공한다.
(선천성 림프 세포의 군에 속하는) NK 세포는 큰 과립형 림프구(LGL)로서 정의되고 B 림프구 및 T 림프구를 발생시키는 공통된 림프 전구세포와 구별된 제3 종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도 및 흉선에서 분화하고 성숙하는 것으로 공지되어 있고, 여기서 이들은 순환계 내로 들어간다.
본 발명의 CAR 세포는 상기 언급된 세포 유형들 중 임의의 세포 유형일 수 있다.
본 발명에 따른 CAR 또는 이의 성분을 발현하는 T 또는 NK 세포는 환자 자신의 말초 혈액(제1군), 기증자 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포 이식의 환경(제2군) 또는 무관한 기증자로부터의 말초 혈액(제3군)으로부터 생체외에서 생성될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 CAR 또는 이의 성분을 발현하는 T 또는 NK 세포는 T 또는 NK 세포로의 유도성 전구세포 또는 배아 전구세포의 생체외 분화로부터 유래할 수 있다. 대안적으로, 그의 용해 기능을 보유하고 치료제로서 작용할 수 있는 불멸화된 T 세포주가 사용될 수 있다.
모든 이들 실시양태에서, CAR 세포는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입 및 DNA 또는 RNA를 사용한 형질감염을 포함하는 많은 수단 중 하나에 의해 본 발명의 CAR 또는 이의 성분(들) 또는 성분을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입함으로써 생성된다.
본 발명의 CAR 세포는 대상체로부터의 생체외 T 또는 NK 세포일 수 있다. T 또는 NK 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플로부터 유래할 수 있다. T 또는 NK 세포는 본 발명의 CAR 또는 CAR의 성분(들)을 제공하는 분자를 코딩하는 핵산으로 형질도입되기 전에 예를 들면, 항-CD3 단일클론 항체를 사용한 처리에 의해 활성화될 수 있고/있거나 증폭될 수 있다.
본 발명의 T 또는 NK 세포는 (i) 대상체 또는 상기 나열된 다른 공급원으로부터 T 또는 NK 세포 함유 샘플을 단리하고; (ii) 전술된 하나 이상의 핵산 서열(들) 또는 핵산 구축물(들)로 T 또는 NK 세포를 형질도입하거나 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다.
그 다음, 항원 결합 폴리펩티드의 항원 결합 도메인의 발현을 기준으로 T 또는 NK 세포를 정제할, 예를 들면, 선택할 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 본 발명에 따른 CAR 또는 이의 성분을 발현하는 복수의 세포를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가 약학적 활성 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 예를 들면, 정맥내 주입에 적합한 형태로 존재할 수 있다.
치료 방법
본 발명은 (예를 들면, 전술된 약학 조성물 중의) 본 발명의 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법을 제공한다.
질환을 치료하는 방법은 본 발명의 세포의 치료적 용도에 관한 것이다. 여기서, 세포는 질환과 관련된 적어도 1종의 증상을 경감시키거나, 감소시키거나 개선하고/하거나 질환의 진행을 늦추거나, 감소시키거나 차단하기 위해 기존 질환 또는 질병을 가진 대상체에게 투여될 수 있다.
질환을 예방하는 방법은 본 발명의 세포의 예방적 용도에 관한 것이다. 여기서, 이러한 세포는 질환의 원인을 예방하거나 손상시키기나 질환과 관련된 적어도 1종의 증상의 발생을 감소시키거나 예방하기 위해 질환에 아직 걸리지 않았고/않았거나 질환의 임의의 증상을 보이지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 질환에 대한 소인을 가질 수 있거나, 질환의 발생 위험에 있는 것으로 생각될 수 있다.
상기 방법은
(i) T 또는 NK 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;
(ii) 본 발명의 핵산 서열, 핵산 구축물 또는 벡터로 이러한 세포를 형질도입하거나 형질감염시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계
를 포함할 수 있다.
T 또는 NK 세포 함유 샘플은 예를 들면, 전술된 바와 같이 대상체 또는 다른 공급원으로부터 단리될 수 있다. T 또는 NK 세포는 대상체 자신의 말초 혈액(제1군), 기증자 말초 혈액으로부터의 조혈 줄기 세포 이식의 환경(제2군) 또는 무관한 기증자로부터의 말초 혈액(제3군)으로부터 단리될 수 있다.
본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 본 발명의 CAR 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 CAR 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 치료되고/되거나 예방될 질환은 암성 질환, 예컨대, 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막암, 신장암(신암), 백혈병, 폐암, 흑색종, 비-호지킨 림프종, 췌장암, 전립선암 및 갑상선암일 수 있다.
본 발명의 CAR 세포는 표적 세포, 예컨대, 암세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포는 TAA의 발현, 예를 들면, 상기 표 1에서 제공된 TAA의 발현에 의해 인식될 수 있다.
본 발명의 CAR 세포는 저밀도의 TAA를 발현하는 표적 세포, 예컨대, 암세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 암에서 저밀도로 발현되는 것으로 공지되어 있는 TAA의 예로는 CLL에서의 ROR1, 흑색종에서의 Typr-1 및 골수종에서의 BCMA가 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 CAR 세포 및 약학 조성물은 전술된 질환들의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 CAR 세포 및 약학 조성물은 전술된 방법들 중 임의의 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명을 수행하는 데 있어서 당분야에서 통상의 기술을 가진 자를 보조하기 위한 것이고 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 한정하기 위한 것이 아닌 실시예에 의해 지금부터 더 기재될 것이다.
실시예
실시예 1 - 세포 표면에서의 COMP CAR의 발현
뮤린 T 세포주를 항-CD33 COMP CAR(도 5c에 표시된 아미노산 서열 및 도 5d에 표시된 핵산 서열) 또는 항-CD33 IgG1 CAR로 형질도입하였다.
그 다음, 이들 세포를 뮤린 Fc IgG2a에 융합된 키메라 가용성 CD33으로 염색한 후, 항-마우스 IgG PE로 이차 염색하였다(도 6a).
뮤린 T 세포주를 항-ROR-1 COMP CAR(도 5c에 표시된 아미노산 서열 및 도 5d에 표시된 핵산 서열) 또는 항-ROR-1 IgG1 CAR로 형질도입하였다.
그 다음, 이들 세포를 가용성 His 태그 부착된 ROR-1로 염색한 후, 항-His-바이오틴으로 이차 염색한 다음, 스트렙타비딘-APC로 삼차 염색하였다(도 6b).
모든 4개의 CAR은 세포 표면 상에서 성공적으로 발현되었다. 이들 데이터도 CAR 결합 도메인이 COMP 스페이서에 연결되어 있을 때 리간드 결합을 방해하지 않는 방식으로 배향된다는 것을 입증한다.
실시예 2 - 고정된 리간드를 사용한 COMP CAR T 세포의 자극
고정된 리간드로 코팅된 비드를 가진 T 세포를 사용하여 COMP ROR-1 CAR T 세포를 자극하였다. 이를 달성하기 위해, 가용성 His-태그 ROR-1을 구축하였고 발현시켰다. 그 다음, 이들 가용성 리간드를 함유하는 상청액을 다양한 농도에서 정해진 수의 항-His 비드와 함께 항온처리하였다. 그 후, 상기 비드를 세척하여 결합되지 않은 리간드를 제거하였고, 이들 비드를 사용하여, COMP CAR 플랫폼 또는 IgG 스페이서를 가진 동등한 CAR로 형질도입된 T 세포를 자극하였다.
형질도입된 뮤린 T 세포를, 상이한 농도의 가용성 His 태그 부착된 ROR-1 상청액으로 미리 코팅된 항-His 비드와 함께 공배양하였다. 16시간 내지 24시간 후, 공배양 상청액 중의 IL-2의 양을 ELISA로 분석하였다(도 7).
실시예 3 - ROR-1 표적 세포의 발현 수준
SKW 세포주는 저수준의 ROR-1을 천연적으로 발현한다. 이들 세포를 ROR-1로 형질도입하여 발현 수준을 증가시켰다. 이들 세포를 항-ROR-1 APC로 염색하였고 염색되지 않은 세포와 비교하였다(도 8).
실시예 4 - ROR-1 양성 SKW 세포를 사용한 항-ROR-1 COMP CAR T 세포의 자극
형질도입된 뮤린 T 세포(실시예 1 및 2에 기재됨)를, 저밀도 또는 고밀도로 ROR-1 리간드를 발현하는 SKW 표적 세포와 함께 공배양하였다. T 세포를 일정한 수로 유지하였고 표적 세포를 변경시켰다. 16시간 내지 24시간 후, 공배양 상청액 중의 IL-2의 양을 ELISA로 분석하였다(도 9).
항-ROR-1 COMP CAR T 세포가 항-ROR-1 IgG1 CAR에 비해 저밀도의 ROR-1 리간드를 발현하는 SKW 표적 세포와 함께 공배양되었을 때 보다 더 높은 수준의 IL-2가 검출되었다.
CAR들 둘 다가 SKW-높은 표적 세포로 활성화 반응을 시작할 수 있었다.
실시예 5 - COMP 스페이서의 절두
COMP 스페이서를 가진 aROR-1 CAR은 45개 아미노산인 그의 원래 길이로부터 절두되었다. 이들 COMP 절두된 구축물을 293T 세포 내로 형질감염시킨 후, CAR 표면 발현에 대해 sROR-1 His로 염색한 다음, 항-His-바이오틴에 이어 스트렙타비딘-PE.Cy7로 염색하였다. 이들 세포를 RQR8 마커에 대해 항-CD34-FITC 항체로도 염색하였다. 이들 FACS 도표는 코일드 코일 스페이서의 길이를 한 번에 1개 내지 수 개의 아미노산만큼 변경시키는 능력을 표시하는, COMP 스페이서의 다양한 절두된 형태의 안정한 표면 발현을 보여준다(도 11).
실시예 6 - 다량체 코일드 코일 스페이서 CAR과 고전적인 이량체 CAR의 비교
본 발명의 코일드 코일 스페이서 CAR의 기능을 보편적인 CAR의 기능과 비교하기 위해, 동일한 항원 결합 도메인 및 동등한 엔도도메인을 사용하되, 완전히 상이한 CAR 구축물을 이끌어내도록 상이한 스페이서를 사용하여 일련의 구축물을 제조하였다. 상이한 CAR은 도 12에 표시되어 있다.
모든 CAR은 fmc63을 기반으로 한 항-CD19 항원 결합 도메인, 및 41BB 및 CD3제타 엔도도메인을 포함하는 "제2 세대" 엔도도메인을 포함하였다. 하기 포맷들이 시험되었다:
a) 항-CD19 항원 결합 도메인, 코일드 코일 스페이서 도메인 및 CD3제타 엔도도메인을 가진 폴리펩티드; 및 코일드 코일 스페이서 도메인 및 41BB 엔도도메인을 가진 보조 폴리펩티드를 포함하는 이종다량체 CAR(도 12A);
b) 항-CD19 항원 결합 도메인, 코일드 코일 스페이서 도메인 및 조합된 41BB/CD3제타 엔도도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 동종다량체 CAR(도 12B); 및
c) 항-CD19 항원 결합 도메인, CD8 줄기 스페이서 도메인 및 조합된 41BB/CD3제타 엔도도메인을 가진 2개의 폴리펩티드를 포함하는 고전적인 제2 세대 동종이량체 CAR(도 12C).
도 12에 예시된 CAR을 코딩하는 벡터를 구축하였다.
다양한 CAR 구조물을 코딩하는 RD114-슈도타이핑된(pseudotyped) 레트로바이러스를 생성하였다.
CD56 발현 세포가 고갈된 T 세포를 동등한 수의 SupT1과 함께 공배양하여 1:1의 이펙터:표적 비를 달성하였다. 유동 세포측정(flow cytometry)에 의한 분석 전, 동등한 수의 형광 카운팅 비드를 각각의 공배양물에 첨가하여 세포 수의 표준화를 가능하게 하였고 흡수 부피에서의 임의의 차이를 설명하였다. CAR에 의해 매개된 세포독성을 다음과 같이 유동 세포측정으로 평가하였다: CD3 발현에 대한 염색 대 FCS로 종양 세포로부터 T 세포를 구별하였고, CD3의 결여 및 보다 더 높은 FCS 신호로 종양 세포를 확인하였다. 사멸 세포 배제 염료 7-AAD로 염색함으로써 생존력을 평가하였고 생존 세포는 상기 염료를 흡수하지 않은 세포로서 정의되었다. 각각의 공배양 조건에 대해 생존 종양 세포의 수를 세었고, 생존 종양 세포의 수를, 형질도입되지 않은 PBMC를 사용함으로써 수행된 공배양으로부터 회수된 생존 종양 세포의 수(100%)로 표준화함으로써 백분율 세포독성을 계산하였다. 표적 세포의 사멸을 2일째 날 및 5일째 날에 평가하였다.
결과는 도 13(2일째 날) 및 도 14(5일째 날)에 표시되어 있다. 2일 후, 3종의 CAR 구조물은 CD19+ SupT1 표적 세포의 사멸을 보였다. 2종의 다량체 CAR은 동등한 고전적인 동종이량체 CAR보다 더 우수한 사멸을 보였다. 동종다량체 CAR(Fmc63-COMP-41BBz)은 가장 우수한 사멸을 보였다. 5일째 날, 고전적인 동종이량체 CAR(Fmc63-CD8STK-41BBz)의 사용 시 일부 잔류 표적 세포가 남아있었으나, 상기 다량체 CAR들 둘 다의 경우 생존 표적 세포가 사실상 검출될 수 없었다.
실시예 7 - 코일드 코일 SuperCAR의 생성 및 시험
CAR 기술에 대한 주요 도전과제는 표적 세포에 저밀도로 존재하는 항원의 검출이다. 이 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 각각의 항원 상호작용을 위해 다수의 TCR제타 쇄를 동원하는 코일드 코일 스페이서 포맷을 기반으로 한 "SuperCAR"을 디자인하였다.
코일드 코일 CAR 구조물을 구성하는 폴리펩티드의 세포내 부분은 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 하나 이상의 세포내 신호전달 성분과 각각 상호작용할 수 있는 복수의 이종이량체화 도메인을 포함한다.
도 15에 예시된 구축물에서, 세포내 이량체화는 이량체화 및 도킹 도메인(DDD1)과 고착 도메인(AD1) 사이의 세포내 이량체화이다. 코일드 코일 스페이서 CAR을 구성하는 각각의 폴리펩티드는 4개의 별개의 AD1 도메인을 포함한다. 따라서, 5개의 폴리펩티드를 포함하는 코일드 코일 CAR은 20개의 AD1 도메인을 포함할 것이다.
0 또는 2 카피의 TCR제타 신호전달 도메인을 가진 상이한 신호전달 성분들과 조합하여 코일드 코일 SuperCAR을 시험하였다. DDD1이 2:1 화학양론으로 AD1에 결합하기 때문에, 이들 신호전달 도메인은 각각의 5-폴리펩티드 코일드 코일 CAR 표적화 성분에 대해 각각 0 및 80 카피의 TCR제타 도메인을 제공한다.
대조군으로서, 동일한 항원 결합 도메인을 가진 고전적인 동종이량체 항-CD19 CAR을 사용하였다(도 15; aCD19-IgGFc-Z).
뮤린 T 세포주 BW5를 각각의 CAR로 형질도입하였고 상이한 농도, 즉 저농도, 중간 농도 및 고농도로 동족 항원(CD19)을 발현하는 SupT1 세포로 챌린징하였다. 준최적 신호 펩티드를 사용하고/하거나 Tyrp-1로 유래한 세포질 체류 모티프(막에 인접하여 삽입됨) 또는 아데노바이러스로부터의 당단백질 E3-19k(C-말단 상에서 삽입됨)를 도입함으로써 상이한 수준으로 CD19를 발현하도록 이들 SupT1 세포를 조작하였다. 항원 챌린지 후 IL-2 방출을 측정하였다.
결과는 도 16에 표시되어 있다. 5-머 코일드 코일 CAR당 80 카피의 TCR제타를 포함하는 코일드 코일 SuperCAR은 분자당 2 카피의 TCR제타를 포함하는 동등한 고전적인 CAR보다 항원에 대한 훨씬 더 큰 반응을 제공한다는 것을 확인하였다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들은 본원에 참고로 도입된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변이는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기술되어 있지만, 청구된 본 발명이 이러한 특정 실시양태로 과도하게 한정되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 사실상, 분자생물학, 세포생물학 또는 관련 분야에서 숙련된 자에게 자명할, 본 발명을 수행하는 기재된 방식의 다양한 변경은 하기 청구범위 내에 있다.
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Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 225 230 235 240 Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala 245 250 255 Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val 260 265 270 Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 275 280 285 Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly 290 295 300 Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 305 310 315 320 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro 325 330 335 Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln 340 345 350 Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro 355 360 365 Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 370 375 380 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 405 410 415 Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly 420 425 430 Thr Glu Val Val Val Lys Arg Ser Asp Pro Ala Gly Ser Asp Leu Gly 435 440 445 Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp 450 455 460 Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys 465 470 475 480 Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Ser Gly Lys Lys Asp Pro 485 490 495 Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 500 505 510 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Arg Val 515 520 525 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 530 535 540 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 545 550 555 560 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 565 570 575 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 580 585 590 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 595 600 605 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 610 615 620 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 625 630 635 <210> 28 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the ORF of the anti-CD33 COMP CAR <400> 28 atgggcacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat 60 gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc 120 cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc 180 tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct 240 cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc 300 ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc 360 tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420 tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag 480 ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggccgtg 540 cccactcagg tcctggggtt gttgctactg tggcttacag atgccagatg tgacatccag 600 atgacacagt ctccatcttc cctgtctgca tctgtcggag atcgcgtcac catcacctgt 660 cgagcaagtg aggacattta ttttaattta gtgtggtatc agcagaaacc aggaaaggcc 720 cctaagctcc tgatctatga tacaaatcgc ttggcagatg gggtcccatc acggttcagt 780 ggctctggat ctggcacaca gtatactcta accataagta gcctgcaacc cgaagatttc 840 gcaacctatt attgtcaaca ctataagaat tatccgctca cgttcggtca ggggaccaag 900 ctggaaatca aaagatctgg tggcggaggg tcaggaggcg gaggcagcgg aggcggtggc 960 tcgggaggcg gaggctcgag atctgaggtg cagttggtgg agtctggggg cggcttggtg 1020 cagcctggag ggtccctgag gctctcctgt gcagcctcag gattcactct cagtaattat 1080 ggcatgcact ggatcaggca ggctccaggg aagggtctgg agtgggtctc gtctattagt 1140 cttaatggtg gtagcactta ctatcgagac tccgtgaagg gccgattcac tatctccagg 1200 gacaatgcaa aaagcaccct ctaccttcaa atgaatagtc tgagggccga ggacacggcc 1260 gtctattact gtgcagcaca ggacgcttat acgggaggtt actttgatta ctggggccaa 1320 ggaacgctgg tcacagtctc gtctatggat cccgccggga gcgacctggg ccctcagatg 1380 ctgcgggagc tgcaggagac aaatgccgcc ctgcaggacg tgcgcgagct gctgagacag 1440 caggtgcggg agattacatt cctgaagaac accgtgatgg agtgcgatgc ctgcggatct 1500 gggaagaagg accccaagtt ctgggtcctg gtggtggtgg gaggcgtgct ggcctgttac 1560 tctctcctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttttgggtgc gctcccgggt gaagttttct 1620 cgctctgccg atgccccagc ctatcagcag ggccagaatc agctgtacaa tgaactgaac 1680 ctgggcaggc gggaggagta cgacgtgctg gataagcgga gaggcagaga ccccgagatg 1740 ggcggcaaac cacggcgcaa aaatccccag gagggactct ataacgagct gcagaaggac 1800 aaaatggccg aggcctattc cgagatcggc atgaagggag agagaagacg cggaaagggc 1860 cacgacggcc tgtatcaggg attgtccacc gctacaaaag atacatatga tgccctgcac 1920 atgcaggccc tgccacccag atga 1944 <210> 29 <211> 1914 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of the ORF of the anti-ROR-1 COMP CAR <400> 29 atgggcacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat 60 gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc 120 cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc 180 tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct 240 cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc 300 ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc 360 tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420 tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag 480 ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggagacc 540 gacaccctgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgcccg gcagcaccgg ccagagcgtg 600 aaggagagcg agggcgacct ggtgacccca gccggcaacc tgaccctgac ctgcaccgcc 660 agcggcagcg acatcaacga ctaccccatc agctgggtgc ggcaggcccc aggcaagggc 720 ctggagtgga tcggcttcat caacagcggc ggcagcacct ggtacgccag ctgggtgaag 780 ggccggttca ccatcagccg gaccagcacc accgtggacc tgaagatgac cagcctgacc 840 accgacgaca ccgccaccta cttctgcgcc agaggctaca gcacctacta cggcgacttc 900 aacatctggg gacccggcac cctggtgacc atcagcagcg gaggcggagg gtctgggggc 960 ggcggtagcg gcggaggagg gagcgagctg gtgatgaccc agaccccaag cagcaccagc 1020 ggcgccgtgg gcggcaccgt gaccatcaac tgccaggcca gccagagcat cgacagcaac 1080 ctggcctggt tccagcagaa gcctggccag ccacccaccc tgctgatcta ccgggccagc 1140 aacctggcca gcggcgtgcc cagccggttc agcggcagcc ggagcggcac cgagtacacc 1200 ctgaccatca gcggcgtgca gcgggaggac gccgccacct actactgcct gggcggagtg 1260 ggcaacgtga gctaccggac cagcttcggc ggaggcaccg aggtggtggt gaagcggtcg 1320 gatcccgccg ggagcgacct gggccctcag atgctgcggg agctgcagga gacaaatgcc 1380 gccctgcagg acgtgcgcga gctgctgaga cagcaggtgc gggagattac attcctgaag 1440 aacaccgtga tggagtgcga tgcctgcgga tctgggaaga aggaccccaa gttctgggtc 1500 ctggtggtgg tgggaggcgt gctggcctgt tactctctcc tggtgaccgt ggccttcatc 1560 atcttttggg tgcgctcccg ggtgaagttt tctcgctctg ccgatgcccc agcctatcag 1620 cagggccaga atcagctgta caatgaactg aacctgggca ggcgggagga gtacgacgtg 1680 ctggataagc ggagaggcag agaccccgag atgggcggca aaccacggcg caaaaatccc 1740 caggagggac tctataacga gctgcagaag gacaaaatgg ccgaggccta ttccgagatc 1800 ggcatgaagg gagagagaag acgcggaaag ggccacgacg gcctgtatca gggattgtcc 1860 accgctacaa aagatacata tgatgccctg cacatgcagg ccctgccacc caga 1914 <210> 30 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kinesin motor protein: parallel homodimer <400> 30 Met His Ala Ala Leu Ser Thr Glu Val Val His Leu Arg Gln Arg Thr 1 5 10 15 Glu Glu Leu Leu Arg Cys Asn Glu Gln Gln Ala Ala Glu Leu Glu Thr 20 25 30 Cys Lys Glu Gln Leu Phe Gln Ser Asn Met Glu Arg Lys Glu Leu His 35 40 45 Asn Thr Val Met Asp Leu Arg Gly Asn 50 55 <210> 31 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis D delta antigen: parallel homodimer <400> 31 Gly Arg Glu Asp Ile Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu 1 5 10 15 Glu Glu Leu Glu Arg Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys 20 25 30 Leu Glu Glu Asp Asn Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly 35 40 45 Lys Tyr 50 <210> 32 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Archaeal box C/D sRNP core protein: anti-parallel heterodimer <400> 32 Arg Tyr Val Val Ala Leu Val Lys Ala Leu Glu Glu Ile Asp Glu Ser 1 5 10 15 Ile Asn Met Leu Asn Glu Lys Leu Glu Asp Ile Arg Ala Val Lys Glu 20 25 30 Ser Glu Ile Thr Glu Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Arg Glu 35 40 45 Leu Arg Arg Asp Val Glu Arg Glu Ile Glu Glu Val Met 50 55 60 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mannose-binding protein A: parallel homotrimer <400> 33 Ala Ile Glu Val Lys Leu Ala Asn Met Glu Ala Glu Ile Asn Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ser Lys Leu Glu Leu Thr Asn Lys Leu His Ala Phe Ser Met 20 25 30 <210> 34 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Coiled-coil serine-rich protein 1: parallel homotrimer <400> 34 Glu Trp Glu Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Ala Leu Glu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Leu Glu His Gly 20 25 <210> 35 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide release factor 2: anti-parallel heterotrimer Chain A <400> 35 Ile Asn Pro Val Asn Asn Arg Ile Gln Asp Leu Thr Glu Arg Ser Asp 1 5 10 15 Val Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr 20 <210> 36 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide release factor 2: anti-parallel heterotrimer Chain B <400> 36 Val Val Asp Thr Leu Asp Gln Met Lys Gln Gly Leu Glu Asp Val Ser 1 5 10 15 Gly Leu Leu Glu Leu Ala Val Glu Ala Asp Asp Glu Glu Thr Phe Asn 20 25 30 Glu Ala Val Ala Glu Leu Asp Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ala Gln Leu 35 40 45 Glu Phe Arg 50 <210> 37 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 and SNARE: parallel heterotetramer Chain A <400> 37 Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg 1 5 10 15 Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln 20 25 30 Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp 35 40 45 Tyr Val Glu 50 <210> 38 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 and SNARE: parallel heterotetramer Chain B <400> 38 Ala Leu Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu 1 5 10 15 Asn Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu 20 25 30 Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu 35 40 45 His Ala Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Val Lys Tyr 65 <210> 39 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 and SNARE: parallel heterotetramer Chain C <400> 39 Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp 20 25 30 Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu 35 40 45 Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Asn Leu 65 <210> 40 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SNAP-25 and SNARE: parallel heterotetramer Chain D <400> 40 Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg 1 5 10 15 Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln 20 25 30 Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp 35 40 45 Tyr Val Glu 50 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac repressor: parallel homotetramer <400> 41 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln Val 1 5 10 15 Ser Arg Leu Glu 20 <210> 42 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein E: anti-parallel heterotetramer <400> 42 Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu 1 5 10 15 Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser 20 25 30 Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met Asp Glu Thr Met Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Ala Arg 50 55 60 Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met 65 70 75 80 Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala 85 90 95 Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 100 105 110 Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln 115 120 125 Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala 130 135 <210> 43 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heterodimerization domain <400> 43 Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu 1 5 10 15 Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln 20 25 <210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heterodimerization domain <400> 44 Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu 1 5 10 15 Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln 20 25 <210> 45 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> dimerization and docking domain (DDD1) <400> 45 Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr 1 5 10 15 Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala 20 25 30 Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala 35 40 <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anchoring domain (AD1) <400> 46 Val Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln 1 5 10 15 Gln Ala <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated COMP <400> 47 Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys 1 5 10 15 Asp Ala Cys Gly 20 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus Tobacco Etch Virus (TEV) cleavage site <400> 48 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser 1 5

Claims (38)

  1. 적어도 3개의 키메라 항원 수용체(CAR) 형성 폴리펩티드를 포함하는 다량체 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 각각의 CAR 형성 폴리펩티드는
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 코일드 코일(coiled-coil) 스페이서 도메인;
    (iii) 경막 도메인; 및
    (iv) 엔도도메인(endodomain)
    을 포함하는 것인 다량체 CAR.
  2. 제1항에 있어서, 코일드 코일 스페이서 도메인은 연골-올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩티드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 리프레서(repressor) 또는 아포지질단백질(apolipoprotein) E로부터 선택되는 것인 다량체 CAR.
  3. 제2항에 있어서, 코일드 코일 스페이서 도메인은 서열번호 1 또는 30 내지 42로서 표시된 서열들 중 하나 또는 이의 단편, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 유지하는 이의 변이체를 포함하는 것인 다량체 CAR.
  4. 하나 이상의 보조 폴리펩티드(들) 및 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR) 형성 폴리펩티드(들)를 포함하는 다량체 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 또는 각각의 보조 폴리펩티드는
    (i) 코일드 코일 스페이서 도메인;
    (ii) 경막 도메인; 및
    (iii) 엔도도메인
    을 포함하며,
    각각의 CAR 형성 폴리펩티드는
    (i) 항원 결합 도메인;
    (ii) 코일드 코일 스페이서 도메인;
    (iii) 경막 도메인; 및
    (iv) 엔도도메인
    을 포함하고,
    여기에서 다량체 CAR 내의, CAR 형성 폴리펩티드 및 보조 폴리펩티드의 총 수는 적어도 3인 다량체 CAR.
  5. 제4항에 있어서, 코일드 코일 스페이서 도메인은 연골-올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩티드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 리프레서(repressor) 또는 아포지질단백질(apolipoprotein) E로부터 선택되는 것인 다량체 CAR.
  6. 제5항에 있어서, 코일드 코일 스페이서 도메인은 서열번호 1 또는 30 내지 42로서 표시된 서열들 중 하나 또는 이의 단편, 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가지며 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 유지하는 이의 변이체를 포함하는 것인 다량체 CAR.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  8. 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 하나 이상의 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물로서, 상기 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 보조 폴리펩티드는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 것인 핵산 구축물.
  9. 제7항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  10. 제8항에 따른 핵산 구축물을 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 다량체 CAR를 발현하는 세포.
  12. 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 하나 이상의 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 포함하고, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 다량체 CAR을 발현하는 세포로서, 상기 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 보조 폴리펩티드는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 것인 세포.
  13. 제11항에 따른 세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  14. 제12항에 따른 세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 다량체 CAR를 발현하는 세포의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 CAR 형성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 생체외에서 세포 내로 도입하는 단계
    를 포함하는 세포의 제조 방법.
  16. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 다량체 CAR를 발현하는 세포의 제조 방법으로서,
    하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 하나 이상의 보조 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 구축물 또는 상기 핵산 구축물을 포함하는 벡터를 생체외에서 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며,
    상기 하나 이상의 CAR 형성 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 보조 폴리펩티드는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 것인 세포의 제조 방법.
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