JP2022551455A - 操作された免疫細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、以下を含む操作された免疫細胞に関する：（ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチド、および（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチド。標的結合ポリペプチドがその標的タンパク質に結合し、局在化ポリペプチドにも結合する場合、前述の標的タンパク質が細胞内区画中に保持されるので、細胞表面上での前述の標的タンパク質の発現が減少または消失する。

Description

発明の分野
本発明は、操作された免疫細胞中の標的タンパク質の発現を調節するためのアプローチに関する。特に、本発明は、細胞内区画中の保持によって少なくとも２つの標的タンパク質の発現を調節するためのアプローチに関する。

発明の背景
古典的には、表面に発現したタンパク質は、シグナルペプチド配列によって小胞体（ＥＲ）に方向づけられ、疎水性のらせん状膜貫通ドメインによってＥＲの膜に係留される。これらのタンパク質は、ＥＲ内で折りたたまれ、分泌経路を介して細胞表面に移動する。

ＥＲ内のいくつかのタンパク質は、分泌経路よりもむしろゴルジ装置に方向づけられ、それ故に、細胞表面上で発現されない。いくつかのモチーフは、タンパク質をゴルジ装置に方向づける。

かかるモチーフのうちで最も特徴づけられたものの１つは、「ＳＥＫＤＥＬ」モチーフである。タンパク質のカルボキシ末端の最末端上でこのモチーフが発現すると、タンパク質はＥＲからゴルジ装置に方向付けられるであろう。このモチーフは、通常はその場所を移動しないタンパク質をＥＲからゴルジに方向づけるために利用され得る。例えば、Ｐｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７，２７９－２８３（２０００））は、カルボキシ末端にｓｅｋｄｅｌを有する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が発現するとその同族標的をゴルジに方向づけることができ、それゆえに、同族標的の表面発現を減少させるかノックアウトすることができることを記載していていた（図１を参照のこと）。

単一ドメイン抗体断片（ｄＡｂ）は、その固有の安定性および簡潔さにより、「ＳＥＫＤＥＬノックダウン」に非常に適している。

いくつかの例では、複数のタンパク質の表面発現を減少させることが望ましい場合がある。これには、多数の異なるｄＡｂ－ｓｅｋｄｅｌ融合物が共発現する必要がある。複数のトランスジェニックタンパク質の共発現は困難であり、典型的には、複数の形質導入（挿入変異誘発のリスクがある）および／または複数の内部プロモーター（プロモーターの干渉およびサイレンシングが起こる）を必要とする。さらに、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）などのモチーフは、下流タンパク質（単数または複数）の発現が非常に低くする。

代替法の１つは、口蹄疫２Ａ配列または２Ａ様配列を使用することである。Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，１０２７－１０４１（２００１））は、非常に効率的に切断されるこれらの短いペプチド配列を記載していた。いくつかの設定について、２Ａペプチドを有する単一の読み取り枠は、複数のトランスジェニックタンパク質を発現させるための唯一の方法であり、それ故に、今日までのいくつかの設定では、２Ａペプチドを使用することは、ＳＥＫＤＥＬノックダウンを使用して複数の表面タンパク質をノックアウトすることができる唯一の方法である。

２Ａペプチドの切断が制限されると、トランスジェニックタンパク質のカルボキシ末端に２Ａペプチドの１５～２０個の残存塩基（最後のプロリンを除く）が保持される。これらの残存塩基は、例えば、ＳＥＫＤＥＬ細胞内保持シグナルのすぐＣ末端側に配置された場合にＳＥＫＤＥＬモチーフをマスキングすることによって、ｓｅｋｄｅｌ認識を阻害し得る。
したがって、複数の標的タンパク質を減少またはノックダウンすることができるアプローチが依然として必要である。

Ｐｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７，２７９－２８３（２０００） Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，１０２７－１０４１（２００１）

発明の概要
本発明者らは、１またはそれを超える標的タンパク質（単数または複数）の発現を減少またはノックダウンすることができるある範囲の操作されたタンパク質を開発した。

第１の態様では、本発明は、以下を含む操作された免疫細胞を提供する：
（ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチド、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチド。

前述の細胞は、以下を含み得る：
（ｉ）少なくとも２つの標的結合ポリペプチドであって、各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む、少なくとも２つの標的結合ポリペプチド、および
（ｉｉ）前述の標的結合ポリペプチドの各々の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチド。

少なくとも２つの標的結合ポリペプチドは、同一の標的タンパク質に結合し得る。例えば、少なくとも２つの標的結合ポリペプチドは、同一の標的タンパク質の異なるエピトープに結合し得る。これに関して、２つまたはそれを超える標的結合ポリペプチドは、細胞内区画中に標的タンパク質を保持するために協働し得る。

あるいは、少なくとも２つの標的結合ポリペプチドは、異なる標的タンパク質に結合し得る。これに関して、２つまたはそれを超える標的結合ポリペプチドは、細胞内区画中に２つまたはそれを超える標的タンパク質を保持するために独立して作用し得る。

細胞内保持シグナルは、以下の群から選択され得る：ゴルジ保持配列；トランスゴルジ網（ＴＧＮ）リサイクリングシグナル；小胞体（ＥＲ）保持配列；プロテアソーム局在化配列、またはリソソーム選別シグナル。

例えば、細胞内保持シグナルは、以下から選択され得る：
ａ）以下から選択されるアミノ酸配列を含むゴルジ保持配列：ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＤＥＬ（配列番号２）、ＫＫＸＸ（配列番号３）、ＫＸＫＸＸ（配列番号４）、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号５）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、配列ＭＨＲＲＲＳＲＳＣＲ（配列番号６）を含むＨＬＡインバリアント鎖の断片、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号７）、またはＹＱＲＬ（配列番号８）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；および／または
ｂ）以下から選択される小胞体保持ドメイン：リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、またはシトクロムｂ５；および／または
ｃ）表１～５に示した任意の配列を含む細胞内保持シグナル。

前述または各々の標的結合ドメインは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含み得る。

標的タンパク質は、例えば、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、免疫応答を下方制御する受容体、Ｔ細胞上に発現されるリガンド、または免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質であり得る。

標的タンパク質は、以下の群から選択され得る：
（ｉ）以下から選択されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の構成要素：ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζ；
（ｉｉ）以下から選択されるＨＬＡクラスＩ分子：Β２－ミクログロブリン、α１－ミクログロブリン、α２－ミクログロブリン、およびα３－ミクログロブリン；
（ｉｉｉ）以下から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲ；
（ｉｖ）以下から選択される免疫応答を下方制御する受容体：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ３）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、Ｆａｓ、ＴＢＲ２、ＬＡＧ３、およびタンパク質チロシンホスファターゼ；
（ｖ）以下から選択されるＴ細胞上に発現されるリガンド：ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ２
（ｖｉ）以下から選択される免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質：Ｃｓｋ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、Ｚａｐ－７０、ＳＬＰ７６、およびＡＫＴ。

細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含み得る。

第２の態様では、本発明は、以下を含む核酸構築物を提供する：
（ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする第２の核酸配列。

核酸構築物は、以下の一般構造を有し得る：
Ａ－ｃｏｅｘｐｒ－Ｃ
ここで、
「Ａ」は、標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として前述の標的ポリペプチドおよび局在化ポリペプチドを共発現することができる配列であり；
「Ｃ」は、局在化ポリペプチドをコードする核酸配列である。

核酸構築物は、以下を含み得る：
（ｉ）複数の核酸配列であって、各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする、複数の核酸配列、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列。

核酸構築物は、以下の一般構造を有し得る：
Ａ－ｃｏｅｘｐｒ１－Ｂ－ｃｏｅｘｐｒ２－Ｃ
ここで、
「Ａ」は、第１の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
「Ｂ」は、第２の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり、
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として３つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
「Ｃ」は、局在化ポリペプチドをコードする核酸配列である。
核酸構築物が３つの標的結合ポリペプチドをコードする場合、核酸構築物は、以下の一般構造を有し得る：
Ａ－ｃｏｅｘｐｒ１－Ｂ－ｃｏｅｘｐｒ２－Ｄ－ｃｏｅｘｐｒ３－Ｃ
ここで、
「Ａ」は、第１の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
「Ｂ」は、第２の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
「Ｄ」は、第３の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」、および「ｃｏｅｘｐｒ３」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として４つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
「Ｃ」は、局在化ポリペプチドをコードする核酸配列である。

全ての核酸構築物において、局在化ペプチドをコードする核酸配列は、Ｃ末端に発現されるように配置され得る。この方法では、細胞内保持シグナルは、共発現配列での切断後に残存するいかなる残基にも影響を受けない（例えば、共発現配列が自己切断ペプチド（２Ａペプチドなど）をコードする場合）。

第３の態様では、本発明は、以下を含む核酸配列のキットを提供する：
（ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする第２の核酸配列。

核酸配列のキットは、以下を含み得る：
（ｉ）複数の核酸配列であって、各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする、複数の核酸配列、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列。

第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様の核酸構築物を含むベクターを提供する。

第５の態様では、本発明は、以下を含むベクターのキットを提供する：
（ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクター。

ベクターのキットは、以下を含み得る：
（ｉ）複数のベクターであって、各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、複数のベクター、および
（ｉｉ）前述の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。

第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様にしたがって操作された免疫細胞を作製する方法であって、免疫細胞に、本発明の第２の態様の核酸構築物；本発明の第３の態様の核酸配列のキット；本発明の第４の態様のベクター；または本発明の第５の態様のベクターのキットをｅｘ ｖｉｖｏで細胞に導入するステップを含む、方法を提供する。

第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の複数の操作された免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。

第８の態様では、疾患の処置および／または予防に使用するための、本発明の第７の態様の医薬組成物。

第９の態様では、本発明の第７の態様の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、疾患を処置する方法を提供する。

第１０の態様では、疾患を処置するための医薬の製造における本発明の第１の態様の細胞の使用を提供する。

疾患は癌であり得る。

発明のさらなる態様
本発明のさらなる態様を、以下の番号をつけたパラグラフにまとめている。

１．少なくとも２つの標的結合ドメインを共にコードする１またはそれを超える核酸構築物を含む操作された免疫細胞であって、前述の１またはそれを超える核酸構築物が、細胞中で共発現された場合に、前述の標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列を共に含む、操作された免疫細胞。

２．前述の１またはそれを超える核酸構築物（単数または複数）が、前述の細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む少なくとも１つの操作されたタンパク質をコードする、パラグラフ１に記載の操作された免疫細胞。

３．前述の少なくとも２つの標的結合ドメインが、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して細胞内保持シグナルにカップリングされている、パラグラフ１または２に記載の操作された免疫細胞。

４．前述の少なくとも２つの標的結合ドメインが、少なくとも１つのヘテロ多量体タンパク質によって前述の細胞内保持シグナルにカップリングされている、パラグラフ１～３に記載の操作された免疫細胞。

５．前述の少なくとも１つのヘテロ多量体タンパク質が、ジスルフィド結合（単数または複数）によってカップリングされた少なくとも２つのポリペプチドを含む、パラグラフ４に記載の操作された免疫細胞。

６．前述の操作されたタンパク質が、第１の標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルを含む第１のペプチドサブユニットならびに少なくとも第２の標的結合ドメインを含む第２のペプチドサブユニットを含み；ここで、前述の第１および第２のペプチドサブユニットが、好ましくはペプチドリンカーまたは１またはそれを超えるジスルフィド結合によってカップリングされている、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

７．前述の少なくとも２つの標的結合ドメインの各々および前述の細胞内保持シグナルが、個別のポリペプチドとしてコードされ；前述の標的結合ドメインを含むポリペプチドの各々が第１のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、前述の細胞内保持シグナルを含むポリペプチドが第２のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、ここで、前述の第１および第２のタンパク質相互作用ドメインが相互に結合することができる、パラグラフ１に記載の操作された免疫細胞。

８．前述の操作されたタンパク質が、少なくとも３つの標的結合ドメインを含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

９．１つのポリペプチド鎖が少なくとも２つの標的結合ドメインを含み、１つのポリペプチド鎖が少なくとも１つの標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルを含む、パラグラフ８に記載の操作された免疫細胞。

１０．前述の細胞内保持シグナルが、前述のタンパク質をゴルジ区画、エンドソーム区画、またはリソソーム区画に方向づける、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

１１．前述の細胞内保持シグナルが、以下の群から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞：ゴルジ保持配列；トランスゴルジ網（ＴＧＮ）リサイクリングシグナル；小胞体（ＥＲ）保持配列；プロテアソーム局在化配列、またはリソソーム選別シグナル。

１２．以下の前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞：
ａ）以下から選択されるアミノ酸配列を含むゴルジ保持配列：ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＤＥＬ（配列番号２）、ＫＫＸＸ（配列番号３）、ＫＸＫＸＸ（配列番号４）、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号５）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、配列ＭＨＲＲＲＳＲＳＣＲ（配列番号６）を含むＨＬＡインバリアント鎖の断片、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号７）、またはＹＱＲＬ（配列番号８）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；および／または
ｂ）以下から選択される小胞体保持ドメイン：リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、またはシトクロムｂ５；および／または
ｃ）表１～５に示した任意の配列を含む細胞内保持シグナル。

１３．少なくとも１つの標的結合ドメインが、抗体、抗体断片もしくは抗原結合断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

１４．少なくとも１つの標的結合ドメインが、ドメイン抗体（ｄＡｂ）または単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

１５．少なくとも１つの標的が、以下から選択される、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞：サイトゾルタンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、および膜貫通タンパク質。

１６．少なくとも２つの標的が異なる細胞区画に局在している、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

１７．前述の少なくとも１つの操作されたタンパク質が、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１６に記載の操作された免疫細胞。

１８．少なくとも１つの標的が細胞外タンパク質であり、少なくとも１つの標的が細胞内タンパク質であり；または
少なくとも１つの標的がサイトゾルタンパク質であり、少なくとも１つの標的が小胞体内腔タンパク質である、パラグラフ１７に記載の操作された免疫細胞。

１９．少なくとも１つの標的結合ドメインが、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、免疫応答を下方制御する受容体、Ｔ細胞上に発現されるリガンド、または免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質に結合する、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

２０．前述のＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の構成要素が、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζである、パラグラフ１９に記載の操作された免疫細胞。

２１．前述のＨＬＡクラスＩ分子が、Β２－ミクログロブリン、α１－ミクログロブリン、α２－ミクログロブリン、またはα３－ミクログロブリンである、パラグラフ１９に記載の操作された免疫細胞。

２２．前述の免疫応答を下方制御する受容体が、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ３）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、Ｆａｓ、ＴＢＲ２、ＬＡＧ３、またはタンパク質チロシンホスファターゼから選択される、パラグラフ１９に記載の操作された免疫細胞。

２３．前述の免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質が、Ｃｓｋ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、Ｚａｐ－７０、ＳＬＰ７６、およびＡＫＴから選択される、パラグラフ１９に記載の操作された免疫細胞。

２４．前述のＴ細胞上に発現されるリガンドが、ＣＤ５、ＣＤ７、またはＣＤ２である、パラグラフ１９に記載の操作された免疫細胞。

２５．前述の細胞が、Ｔ細胞、α－βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ－δＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞である、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

２６．前述の細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

２７．前述の細胞が少なくとも１つのマーカーをさらに含み、好ましくは、前述のマーカーが、少なくとも１つのｍＡｂ特異的エピトープを含む細胞外結合ドメインである、前述のパラグラフのいずれかに記載の操作された免疫細胞。

２８．以下の構造を含む、核酸構築物：
Ａ－Ｘ－Ｂ－Ｃ
ここで、
ＡおよびＢは、パラグラフ１～２７のいずれか１つに定義の標的結合ドメインをコードする核酸配列であり；Ｘは、パラグラフ１～２７のいずれか１つに定義のリンカーであり；Ｃは、パラグラフ１～２７のいずれか１つに定義の細胞内保持シグナルである。

２９．パラグラフ１～２７のいずれか１つに定義のさらなる標的結合ドメイン（単数または複数）をコードする１またはそれを超えるさらなる核酸配列をさらに含む、パラグラフ２８に記載の核酸構築物。

３０．ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列をさらに含む、パラグラフ２８に記載の核酸構築物。

３１．少なくとも１つのマーカーをコードする核酸配列をさらに含み、好ましくは、前述のマーカーが、少なくとも１つのｍＡｂ特異的エピトープを含む細胞外結合ドメインである、パラグラフ２８～３０のいずれか１つに記載の核酸構築物。

３２．前述のＣＡＲ、トランスジェニックＴＣＲ、マーカーをコードする核酸配列が、自己切断ペプチドをコードする核酸配列に隣接している、パラグラフ３０または３１に記載の核酸構築物。

３３．前述の自己切断ペプチドが、口蹄疫ウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドである、パラグラフ３２に記載の核酸構築物。

３４．２Ａ自己切断ペプチドをコードする核酸配列が、前述のＣＡＲ、トランスジェニックＴＣＲ、またはマーカーをコードする核酸配列の３’末端側に隣接している、パラグラフ３２または３３に記載の核酸構築物。

３５．以下を含む核酸配列のキット：
（ｉ）細胞内保持シグナルに連結された少なくとも１つの標的結合ドメインを含むタンパク質をコードする核酸配列；および
（ｉｉ）（ｉ）によってコードされるタンパク質にカップリングすることができ、かつ少なくとも１つの標的結合ドメインを含むタンパク質をコードする核酸配列。

３６．（ｉ）に定義の核酸配列、（ｉｉ）に定義の核酸配列、またはさらなる核酸（単数または複数）が、１またはそれを超える以下：ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲおよび／またはマーカーをコードし、好ましくは前述のマーカーが、少なくとも１つのｍＡｂ特異的エピトープを含む細胞外結合ドメインである、パラグラフ３５に記載の核酸配列のキット。

３７．パラグラフ２８～３４のいずれか１つに記載の核酸構築物を含むベクター。

３８．パラグラフ１～２７のいずれかに記載の操作された免疫細胞を作製する方法であって、免疫細胞に、パラグラフ２８～３４のいずれか１つに記載の核酸構築物、パラグラフ３５または３６に定義の核酸配列の群、またはパラグラフ３７に記載のベクターに導入するステップを含む、方法。

３９．少なくとも２つの標的タンパク質の細胞局在化を調節する方法であって、細胞に、パラグラフ２８～３４のいずれか１つに記載の核酸構築物、パラグラフ３５または３６に定義の核酸配列の群；またはパラグラフ３７に記載のベクターを導入するステップを含む、方法。

４０．１またはそれを超える標的タンパク質の細胞表面上での発現が減少または消失し、そして／または前述の標的タンパク質が細胞内区画中に保持される、パラグラフ３９に記載の方法。

４１．パラグラフ１～２７のいずれか１つに記載の操作された免疫細胞、パラグラフ２８～３４のいずれか１つに記載の核酸構築物、パラグラフ３５または３６に定義の核酸配列の群、またはパラグラフ３７に記載のベクターを含む、医薬組成物。

４２．パラグラフ１～２７のいずれかに記載の細胞またはパラグラフ３８～４０のいずれかに記載の方法によって得ることができる細胞を含む、医薬組成物。

４３．疾患の処置および／または予防に使用するためのパラグラフ４１または４２に記載の医薬組成物。

４４．疾患を処置および／または予防する方法であって、パラグラフ４１または４２に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。

４５．以下のステップを含む、パラグラフ４４に記載の方法：
（ｉ）試料を含む細胞を単離するステップ；
（ｉｉ）パラグラフ２８～３４のいずれか１つに記載の核酸構築物、パラグラフ３５または３６に定義の核酸配列の群、またはパラグラフ３７に記載のベクターを導入するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。

４６．前述の核酸構築物またはベクターを、形質導入またはトランスフェクションによって導入する、パラグラフ４５に記載の方法。

４７．前述の細胞が自己由来である、パラグラフ４４～４６に記載の方法。

４８．前述の細胞が同種異系である、パラグラフ４４～４６に記載の方法。

４９．疾患の処置および／または予防のための医薬の製造におけるパラグラフ４１～４３に記載の医薬組成物の使用。

したがって、本発明は、１またはそれを超える標的タンパク質（単数または複数）の発現を減少またはノックダウンすることができるある範囲の操作されたタンパク質を開発した。本発明の操作されたタンパク質は、少なくとも２つの標的結合ドメインを単一の細胞内保持シグナルにカップリングすることによって複数の標的タンパク質を所望の細胞内区画に方向づけることができる構造に基づく。

本明細書中で使用される場合、用語「共にコードする」は、列挙した実体が全体として捉えた場合に１またはそれを超える核酸構築物によって提供される核酸配列によってコードされることを意味するために使用される。換言すれば、少なくとも２つの標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列が、１またはそれを超える核酸構築物中に存在する核酸配列の間でコードされる。例えば、少なくとも２つの標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列は、単一の核酸構築物上に提供され得る。あるいは、第１の標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルをコードするヌクレオチド配列は第１の核酸構築物（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）上に提供され得、第２の標的結合ドメインは第２の核酸構築物上に提供され得る。明らかなように、１またはそれを超える核酸構築物の間で、少なくとも２つの標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列がコードされる場合、本発明の範囲内である複数の変形および配置が想定され得る。

用語「細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列」は、１またはそれを超える核酸構築物が標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する１つの細胞内保持シグナルのみをコードすることを意味する。したがって、本発明の操作されたタンパク質は、少なくとも２つの標的結合ドメインを、１またはそれを超える核酸構築物（単数または複数）によって提供された単一の細胞内保持シグナルにカップリングすることによって、複数の標的タンパク質を所望の細胞内区画に方向づけることができる構造に基づく。

「細胞中に共発現する場合」は、少なくとも２つの標的結合ドメインを提供するアミノ酸配列および細胞内保持シグナルを提供するアミノ酸配列が、本発明の細胞中で同時に発現されことを意味するために本明細書中で使用される。関連アミノ酸配列は、本明細書中に定義するように、１つまたは複数のポリペプチドの一部として存在し得る。

用語「標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する」は、細胞内保持シグナルが、このシグナルを含むタンパク質を、細胞内保持シグナルの非存在下で方向づけられるであろう細胞区画以外の細胞区画に方向づけるか維持することを意味する。適切には、細胞内保持シグナルは、このシグナルを含むタンパク質を細胞表面膜以外の細胞区画または細胞の外側に方向づけるか維持する。

理論に拘束されることを望まないが、本発明の操作されたタンパク質は、様々な考えうる状況で有用である。例として、前述のタンパク質は、移植片対宿主病または宿主対移植片病を軽減または予防するために、ノックダウンのためにＭＨＣクラスＩ、β２ミクログロブリン、ＭＨＣクラスＩＩ、および／またはＴＣＲなどのタンパク質を標的にすることによって類似のＣＡＲ Ｔ細胞の生成を容易にし得る。また、前述の操作されたタンパク質は、表面タンパク質ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ｆａｓ、ＣＴＬＡ、ＴＢＲ２、およびＬＡＧ３、ならびにサイトゾルタンパク質ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、およびＣＳＫなどの阻害タンパク質のノックダウンによってＣＡＲ Ｔ細胞の抑制を軽減し、感受性を増加させるために使用され得る。さらに、本発明の操作されたタンパク質は、ＣＡＲ Ｔ細胞上にも発現するリガンド群（ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ２など）を標的にする場合に同胞殺しを軽減し得る。

Ａ）小胞体およびゴルジを介した細胞膜への表面発現タンパク質の輸送経路の図。Ｂ）ＫＤＥＬモチーフを含むｄＡｂによる細胞内区画中のＣＤ３δの保持の図。 単一のＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖の図解実施形態。 Ａ）単一の構築物上にコードされたＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる２つのポリペプチド鎖の図解実施形態。Ｂ）２つの個別の構築物上にコードされたＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる２つのポリペプチド鎖の図解実施形態。Ｃ）ＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる３つのポリペプチド鎖の図解実施形態。 Ａ）単一の構築物上にコードされたＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる２つのポリペプチド鎖の図解実施形態。Ｂ）２つの個別の構築物上にコードされたＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる２つのポリペプチド鎖の図解実施形態。Ｃ）ＫＤＥＬモチーフに連結された複数の標的結合ドメインからなる３つのポリペプチド鎖の図解実施形態。 各々が少なくとも１つの標的結合ドメインおよびタグを含むいくつかのポリペプチド鎖、それに続くタグ結合タンパク質に続いたＫＤＥＬモチーフからなる最後のポリペプチド鎖の図解実施形態。 各々が少なくとも１つの標的結合ドメインおよびタグを含むいくつかのポリペプチド鎖、それに続く少なくとも２つの膜貫通ドメイン、内腔常在タグ結合タンパク質、サイトゾル常在タグ結合タンパク質、および内腔に常在するＣ末端ＫＤＥＬを含む最後のポリペプチド鎖の図解実施形態。 ＫＤＥＬ駆動ＴＣＲノックダウンを、二重ポリペプチド鎖構築物によって媒介することができる。Ａ）ＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする単一のポリペプチド；または以下を有する２つのポリペプチド鎖：ＡＬＦＡ＿ペプチドに連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする第１のポリペプチド鎖およびＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＡＬＦＡ＿ペプチド＿ＶＨＨをコードする第２のポリペプチド鎖のいずれかを発現するように、ＰＢＭＣを形質導入した。２つのポリペプチドは、自己切断２Ａペプチドで分離されていた。負の対照として、ａＴＣＲ＿ＶＨＨを無関係のＶＨＨバインダーと置換した。全ての構築物は、形質導入用のＩＲＥＳ－ｅＢＦＰマーカーを含んでいた。Ｂ）形質導入後４日目に、ＰＢＭＣを表面ＣＤ３について染色した。結果は、独立した４ドナーに由来する。 ＫＤＥＬ駆動ＴＣＲノックダウンを、二重ポリペプチド鎖構築物によって媒介することができる。Ａ）ＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする単一のポリペプチド；または以下を有する２つのポリペプチド鎖：ＡＬＦＡ＿ペプチドに連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする第１のポリペプチド鎖およびＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＡＬＦＡ＿ペプチド＿ＶＨＨをコードする第２のポリペプチド鎖のいずれかを発現するように、ＰＢＭＣを形質導入した。２つのポリペプチドは、自己切断２Ａペプチドで分離されていた。負の対照として、ａＴＣＲ＿ＶＨＨを無関係のＶＨＨバインダーと置換した。全ての構築物は、形質導入用のＩＲＥＳ－ｅＢＦＰマーカーを含んでいた。Ｂ）形質導入後４日目に、ＰＢＭＣを表面ＣＤ３について染色した。結果は、独立した４ドナーに由来する。

発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも２つの標的結合ドメインを共にコードする１またはそれを超える核酸構築物を含む操作された免疫細胞に関し、ここで、１またはそれを超える核酸構築物は、細胞中で共発現した場合に、標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列を共に含む。本発明は、細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む少なくとも１つの操作されたタンパク質を含む操作された免疫細胞にまで及ぶ。操作されたタンパク質は、少なくとも２つのタンパク質の細胞局在化を調節することができる。また、本発明は、細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む少なくとも１つの操作されたタンパク質をコードする核酸構築物、核酸配列およびベクターのキットに関する。また、本発明は、本発明の細胞、核酸構築物、またはベクターを含む医薬組成物および疾患の処置または予防のための前述の医薬組成物の使用にまで及ぶ。

操作された免疫細胞
本発明は、少なくとも２つの標的結合ドメインを共にコードする１またはそれを超える核酸構築物を含む操作された免疫細胞に関し、ここで、１またはそれを超える核酸構築物は、細胞中で共発現した場合に、標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列を共に含む。

本明細書中で使用される「操作された免疫細胞」は、細胞によって天然にコードされない核酸配列を含むか発現するように改変された免疫細胞を意味する。細胞を操作する方法は当該分野で公知であり、例えば、形質導入（レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入など）、トランスフェクション（ＤＮＡまたはＲＮＡベースの一過性トランスフェクションなど）（リポフェクション、ポリエチレングリコール、リン酸カルシウム、およびエレクトロポレーションが含まれる）による細胞の遺伝子改変が含まれるが、これらに限定されない。核酸配列を細胞に導入するのに適切な任意の方法を使用することができる。

適切には、操作された細胞は、例えば、形質導入またはトランスフェクションによって改変されているか、そのゲノムが改変されている細胞である。適切には、操作された細胞は、レトロウイルス形質導入によって改変されているか、そのゲノムが改変されている細胞である。適切には、操作された細胞は、レンチウイルス形質導入によって改変されているか、そのゲノムが改変されている細胞である。

１つの態様では、操作された免疫細胞は、操作された細胞溶解性免疫細胞である。

本明細書中で使用される「細胞溶解性免疫細胞」は、他の細胞を直接死滅させる細胞である。細胞溶解性細胞は、がん性細胞；ウイルス感染細胞、または他の損傷細胞を死滅させることができる。細胞溶解性免疫細胞には、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。

細胞溶解性免疫細胞は、細胞性免疫において中心的役割を果たすあるタイプのリンパ球であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。Ｔ細胞を、細胞表面上のＴＣＲの存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびＮＫ細胞など）と区別することができる。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。ＣＴＬはＣＤ８＋Ｔ細胞として公知であり得る。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ－１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。

適切には、本発明の細胞はＴ細胞であり得る。適切には、Ｔ細胞はα－βＴ細胞であり得る。適切には、Ｔ細胞はγ－δＴ細胞であり得る。

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの先天性シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に進入することが公知である。

適切には、本発明の細胞は、野生型キラー（ＮＫ）細胞であり得る。適切には、本発明の細胞はサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。

細胞は、患者自身の末梢血（第１のパーティ）、または造血幹細胞移植の状況におけるドナー由来の末梢血（第２のパーティ）、または無関係のドナー由来の末梢血（第３のパーティ）に由来し得る。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（単数または複数）の形質導入前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、活性化および／または拡大増殖させることができる。

あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持している不死化Ｔ細胞株を使用することができる。

細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。移植のためのＨＳＣを、適切に適合したドナーの骨髄から、薬理学的用量のサイトカイン（Ｇ－ＣＳＦなど）の投与による動員後の末梢血の白血球搬出によって（末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ））、または出産後の胎盤から回収した臍帯血（ＵＣＢ）から得ることができる。骨髄、ＰＢＳＣ、またはＵＣＢを無処理で移植することができるか、ＨＳＣを、ＣＤ３４表面抗原に対するモノクローナル抗体での免疫選択によって富化することができる。

操作されたタンパク質
本明細書中で使用される場合、「操作されたタンパク質」は、免疫細胞が発現するように操作されているタンパク質を指す。操作されたタンパク質は、細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含み得る。

操作されたタンパク質は、１つのポリペプチド鎖または１つを超えるポリペプチド鎖、例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、またはそれを超えるポリペプチド鎖を含み得る。

操作されたタンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるポリペプチド鎖を含み得る。

適切には、少なくとも２つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに物理的にカップリングされ得る。

少なくとも２つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに接続または相互接続され得る。１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルにまたはそれと接続され得る。換言すれば、操作されたタンパク質は、少なくとも２つの標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルを含む１つのポリペプチド鎖を含み得る。

少なくとも２つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに直接または間接的に接続され得る。第１の標的結合ドメインは細胞内保持シグナルに直接接続され得、第２の標的結合ドメインは細胞内保持シグナルに間接的に接続され得る（例えば、第２の標的結合ドメインは、第１の標的結合ドメインまたはリンカーを介して細胞内保持シグナルに接続され得る）。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインのうちの少なくとも１つは、細胞内保持シグナルに直接接続される。適切には、少なくとも２つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに連続して連結され得、ここで、標的結合ドメインの１つは、細胞内保持シグナルに直接接続される。

例えば、少なくとも２つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－１、ｄＡｂ－２、およびｄＡｂ－３）がリンカーによって相互に接続され、１つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－３）が細胞内保持シグナルに直接接続されている図２を参照のこと。図２では、３つの標的結合ドメインが細胞内保持シグナルにカップリングされており、ここで、１つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－３）が細胞内保持シグナルに直接接続されており、２つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－１およびＡｂ－２）が、前述の細胞内保持シグナルにリンカーおよび標的結合ドメインによって間接的に接続されている。

別の態様では、標的結合ドメインの少なくとも２つは、細胞内保持シグナルに直接接続され得る。

標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに直接連結され得る。例えば、操作されたポリペプチドは、少なくとも２つの標的結合ドメインをコードする核酸配列によってコードされ得、ここで、少なくとも１つの標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルをコードする核酸配列にインフレームで（例えば、リンカーを用いずに）直接隣接している。

標的結合ドメインは、細胞内保持シグナルに間接的に連結され得る。例えば、少なくとも２つの標的結合ドメインをコードする核酸配列は、リンカー（本明細書中に記載のペプチドリンカーなど）を介して細胞内保持シグナルをコードする核酸配列に接続され得る。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインは、リンカー（ペプチドリンカーなど）によって相互に接続され得る。適切には、少なくとも２つの標的結合ドメインは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して細胞内保持シグナルにカップリングされ得る。

標的結合ドメインを細胞内保持シグナルに接続し、そして／または標的結合ドメインを相互に接続するのに適切な多数の適切なリンカーが当該分野で公知である。

例えば、天然に存在しないペプチド（種々の長さの親水性残基、すなわち、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号９）もしくはポリペプチドまたはそのバリアント（式中、ｎは、例えば、約３～約１２（両端を含む）の整数である）を含む（または、からなる）ポリペプチドなど）を本発明にしたがって使用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）またはそのバリアントを含む。特定の実施形態では、リンカーは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１）またはそのバリアントを含む。

適切には、長さ約５～約１００アミノ酸（両端含む）のペプチドリンカーが本発明で使用され得る。長さ約２０～約４０アミノ酸（両端含む）のペプチドリンカーが本発明で使用され得る。また、長さ少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、または少なくとも４０アミノ酸のペプチドリンカーが本発明で使用され得る。

当業者によって認識されるように、かかるリンカー配列およびかかるリンカー配列のバリアントは、当該分野で公知である。リンカー配列が組み込まれた構築物を設計する方法および機能性を評価する方法は、当業者が容易に利用できる。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインは、操作されたタンパク質の同一のポリペプチド鎖中の同一の細胞内保持シグナルにカップリングされる。適切には、少なくとも２つは、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つの標的結合ドメインであり得る。

１つの態様では、操作されたタンパク質は、同一の細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む１つのポリペプチド鎖からなる。

例えば、図２は、同一の細胞内保持シグナル（例えば、ＳＥＫＤＥＬ）にカップリングされた３つの標的結合ドメイン（例えば、ｄＡＢ－１、ｄＡｂ－２、およびｄＡｂ－３）を含む１つのポリペプチド鎖からなる操作されたタンパク質を示す。

適切には、操作されたタンパク質は、第１の標的結合ドメインおよび細胞内保持シグナルを含む第１のペプチドサブユニットならびに少なくとも第２の標的結合ドメインを含む第２のペプチドサブユニットを含み得；ここで、第１および第２のペプチドサブユニットが、好ましくはペプチドリンカーまたは１またはそれを超えるジスルフィド結合によってカップリングされている。

１つの態様では、前述の少なくとも２つの標的結合ドメインは、少なくとも１つのヘテロ多量体タンパク質によって細胞内保持シグナルにカップリングされている。ヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つのヘテロ多量体構成要素を含み得る。適切には、ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ二量体であり得る。適切には、ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ多量体（ｈｅｔｅｒｏｍｌｔｉｍｅｒｉｃ）構成要素の間がジスルフィド結合によって安定化され得る。

例えば、図３ｃは、少なくとも１つのヘテロ多量体タンパク質（（例えば、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂ）によって細胞内保持シグナルにカップリングされた２つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－３およびｄＡｂ－４）を含む操作されたタンパク質を示す。また、図３ｃは、ジスルフィド結合によって細胞内保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬ）にカップリングされた２つの標的結合ドメイン（ｄＡｂ－１およびｄＡｂ－２）を含む操作されたタンパク質を示す。

ヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも第１および第２のヘテロ多量体構成要素を含む安定なヘテロ多量体の複合体であり得る。適切には、ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ二量体対であり得る。

ヘテロ多量体タンパク質は、タンパク質間相互作用対（例えば、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメイン）を含み得る。第１および第２のタンパク質相互作用対は、会合して多量体の（例えば、二量体の）複合体を形成することができる。適切には、第１および第２のタンパク質相互作用対は、エピトープ－タグシステムに基づき得る。例えば、ヘテロ二量体対は、第１のタンパク質相互作用ドメイン（エピトープなど）および第２のタンパク質相互作用ドメイン（エピトープタグなど）を含み得る。

以下は、会合して安定なヘテロ多量体の複合体を形成する第１および第２のヘテロ多量体構成要素の例である。

適切には、少なくとも第１および第２のタンパク質相互作用対は、天然に存在する多量体のタンパク質またはタンパク質複合体に基づき得る。

ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ
ＣＤ７９（表面抗原分類７９）は、Ｂ細胞受容体と複合体を形成し、抗原認識後にシグナルを生成するタンパク質である。

ＣＤ７９は、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂ（以前はＩｇ－αおよびＩｇ－βとして公知）と呼ばれる２つの別個の鎖から構成され；これらは、典型的には、Ｂ細胞の表面上にジスルフィド結合によって安定化されたヘテロ二量体を形成する。ＣＤ７９ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１１９１２）およびＣＤ７９ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ４０２５９）の両方は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。

両方のＣＤ７９鎖は、その細胞内テール中に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、これらは、Ｔ細胞上でのＴ細胞受容体活性化中に認められるＣＤ３が生成するシグナル伝達に類似の様式で、Ｂ細胞中にシグナルを伝播するために使用される。

ヘテロ多量体タンパク質は、ＣＤ７９ａまたはＣＤ７９ｂ由来の外部ドメインを含み得る。これらのドメインの例示的な配列を以下に示し、ヘテロ多量体タンパク質は、以下の配列またはそのバリアントを含み得る：

ヘテロ多量体の配置図を図３ｃに示し、ここで、標的結合ドメインｄＡｂ－３およびｄＡｂ－４は、ＣＤ７９ａ外部ドメインおよびＣＤ７９ｂ外部ドメインを含むヘテロ多量体を介して細胞内保持配列（例えば、ＫＤＥＬ）にカップリングされている。

ＩｇＧ１／κ定常ドメインＩｇＧ１由来のＣＨ１
ＩｇＧ抗体は、ドメイン間で複雑に相互作用した多ドメインタンパク質である。ヒトＩｇＧ重鎖は軽鎖と会合して、抗原結合することができる成熟抗体を形成する。軽鎖は、κまたはγアイソタイプがあり得る。

重鎖および軽鎖定常ドメインが会合して安定なヘテロ二量体を形成する。ヘテロ多量体タンパク質は、重鎖または軽鎖定常領域を含み得る。ＩｇＧ１由来のκ鎖定常領域およびＣＨ１領域のアミノ酸配列を以下に示すが、当業者は、他の抗体由来の多数の他の好適な配列が公知であることを認識しているであろう。

ヘテロ多量体タンパク質の図は、配列番号１２～１５に示した配列または配列番号１２～１５のいずれかと少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％など）の同一性を有するそのバリアント（但し、バリアントタンパク質がヘテロ多量体の複合体を形成することができることを条件とする）を含み得る。

ヘテロ多量体の配置図を図３ｂに示し、ここで、標的結合ドメインｄＡｂ－１およびｄＡｂ－２は、κ含有ドメインおよびＣＨ１ドメインを含むヘテロ多量体を介して細胞内保持配列（例えば、ＫＤＥＬ）にカップリングされている。

以下の表は、第１および第２のヘテロ多量体構成要素の非限定的なリスト（上記にはないさらなる多量体対を含む）を提供する。以下の第１および第２のヘテロ多量体構成要素の対は、自発的に会合して、本発明で使用するためのヘテロ多量体を形成し得る：

ヘテロ多量体（ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｍｅｒｉｃ）タンパク質は、上記表に記載の任意の２つの自発的会合対から形成され得る。例えば、ヘテロ多量体タンパク質は、図３ｃに示すように、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ対およびκ含有ドメイン／ＣＨ１ドメインの両方を含み得る。

１つの態様では、少なくとも１つの操作されたタンパク質は、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む。適切には、操作されたタンパク質は、少なくとも２つの膜貫通ドメインを含み得る。少なくとも２つの標的結合ドメインは、膜貫通ドメインがまたがる膜の異なる面に配置され得る。適切には、膜貫通ドメインを含む操作されたタンパク質は、異なる細胞区画中に配置された標的に結合する標的結合ドメインを含み得る。例えば、図５は、膜貫通ドメインを含む操作されたタンパク質を示し、ここで、少なくとも２つの標的結合ドメインは、異なる細胞区画中に配置されている。適切には、標的結合ドメインの少なくとも１つは、サイトゾルタンパク質である標的に結合し得る。適切には、標的結合ドメインの少なくとも１つは、細胞外タンパク質である標的に結合し得る。適切には、標的結合ドメインの少なくとも１つは、膜貫通タンパク質である標的に結合し得る。適切には、標的結合ドメインの少なくとも１つは、細胞内タンパク質である標的に結合し得る。

膜貫通ドメインは、任意の膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通ドメインは、ヒトＴｙｒｐ－１またはヒトＣＤ２０に由来し得る。本発明で使用するための例示的な膜貫通ドメインには、以下の配列および配列番号１６～１７と少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９９％など）の同一性を有するそのバリアント（但し、前述のバリアントが膜貫通ドメインとして機能することを条件とする）が含まれる：

いくつかの態様では、操作されたタンパク質は、さらに、スペーサードメインを含む。スペーサードメインは、標的結合ドメインを膜から隔離し、適切に方向づけることが必要であり得る。スペーサードメインは、操作されたタンパク質が１またはそれを超える膜貫通ドメインを含む場合に必要であり得る。図５は、標的結合ドメインを配向することができるようにするためのスペーサードメインの使用方法を示す。

使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原に応じて、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみですら十分な場合がある。

例示的なスペーサードメインには、ＳＴＫおよびＣＤ２０のドメインが含まれる。本発明でスペーサードメインとして使用され得る配列には、以下の配列および以下の配列と少なくとも８０％（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９９％など）の同一性を有するそのバリアントが含まれる：

１つの態様では、少なくとも１つの標的は細胞外タンパク質であり、少なくとも１つの標的は細胞内タンパク質であり；または
少なくとも１つの標的はサイトゾルタンパク質であり、少なくとも１つの標的は小胞体内腔タンパク質である。

適切には、少なくとも第１および第２のタンパク質相互作用対は、タンパク質間相互作用ドメイン（エピトープ－タグシステムなど）に基づき得る。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインの各々および細胞内保持シグナルは、個別のポリペプチドとしてコードされ；標的結合ドメインを含むポリペプチドの各々が第１のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、細胞内保持シグナルを含むポリペプチドが第２のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、ここで、前述の第１および第２のタンパク質相互作用ドメインが、相互に結合することができる。

適切には、少なくとも１つの標的結合ドメインは第１のタンパク質相互作用ドメインに接続され、細胞内保持シグナルは第２のタンパク質相互作用ドメインに接続され、その結果、前述の第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは、細胞中で共発現した場合に相互に結合し、細胞内保持シグナルが標的結合ドメインおよびその標的の細胞局在化を調節する。

例えば、図４は、標的結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ－１）が第１のタンパク質相互作用ドメイン（例えば、タグ）に接続しており、細胞内保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬ）が第２のタンパク質相互作用ドメイン（抗タグ）に接続されている図解実施例を示す。細胞中で共発現した場合、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは相互に結合し（タグ－抗タグ相互作用）、標的ドメイン（例えば、ｄＡｂ－１）およびその標的（Ａｂ－１）の細胞局在化を調節する。

特に、図４は、少なくとも２つの標的結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ－１、ｄＡＢ－２、ｄＡｂ－３）および細胞内保持シグナル（例えば、ＳＥＫＤＥＬ）が個別のポリペプチドとしてコードされた図解実施例を示す。標的結合ドメイン（例えば、ｄＡｂ－１、ｄＡＢ－２、ｄＡｂ－３）を含むポリペプチドの各々は、第１のタンパク質相互作用ドメイン（タグ）をさらに含み、細胞内保持シグナル（例えば、ＳＥＫＤＥＬ）を含むポリペプチドは、第２のタンパク質相互作用ドメイン（例えば、抗タグ）をさらに含み、ここで、前述の第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは相互に結合することができる。

例示的なヘテロ二量体対（第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとも称される）は、ＡＬＦＡペプチドおよびナノボディＮｂＡＬＦＡである。

本発明で使用され得る例示的な配列には、以下のＡＦＬＡタグおよび抗ＡＬＦＡタグ、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントが含まれる：

１つの実施形態では、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは、エピトープタグシステムであり得る。認識されるように、特殊化されたエピトープタグは、タンパク質の検出、操作、および精製のために広く使用されている。

本発明で使用され得る例示的なエピトープタグシステムには、ＡＬＦＡ－タグ、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ－配列番号２３）、ポリＨｉｓ－タグ（Ｈｉｓ_３～１０）、ＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ－配列番号２４）、ＳＰＯＴ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ－配列番号２５）、ＥＰＥＡ／Ｃ－タグ（ＥＰＥＡ－配列番号２６）、およびｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ－配列番号２７）システムが含まれる。

ＡＬＦＡ－タグは、標的タンパク質の位置とは無関係に機能的な小型かつ安定なα－ヘリックスを形成する。ナノボディＮｂＡＬＦＡは、低ピコモルの親和性でＡＬＦＡタグ化タンパク質に結合する。

１つの実施形態では、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは、ＡＬＦＡ－タグシステムであり得る。１つの実施形態では、第１のタンパク質相互作用ドメインはＡＬＦＡペプチドであり得、第２のタンパク質相互作用ドメインは抗ＡＬＦＡ Ｄａｂであり得る。

本発明で使用され得る例示的な配列には、以下のＡＦＬＡタグおよび抗ＡＬＦＡタグ、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントが含まれる：

細胞内保持シグナル
タンパク質ターゲティングまたはタンパク質選別は、タンパク質が細胞中または細胞外の適切な目的地に輸送される生物学的機序である。タンパク質は、オルガネラの内部空間、異なる細胞内膜、原形質膜を、または分泌を介して細胞の外部に向かい得る。この送達プロセスは、タンパク質自体に含まれる配列情報に基づいて行われる。

真核細胞の粗面小胞体（ＥＲ）中で合成されたタンパク質は、その最終目的地への輸送のためにエキソサイトーシス経路を使用する。特殊な選別シグナルを欠くタンパク質は、ゴルジおよびトランスゴルジ網（ＴＧＮ）を介してＥＲから原形質膜に方向性をもって輸送される。他のタンパク質は、エキソサイトーシス経路の特定のオルガネラ（エンドソームおよびリソソームなど）に組み込むための標的シグナルを有する。

リソソームは酸性オルガネラであり、ここで内因性の内在化された高分子が内腔の加水分解酵素によって分解される。内因性高分子はＴＧＮ中で選別され、そこからエンドソームに輸送され、次いで、リソソームに輸送されることによってリソソームに到達する。

本発明は、タンパク質を正確な細胞内の位置に選別するために細胞によって使用されるターゲティングシグナルを利用し得る。シグナルは、以下のタイプに大きく分けられ得る：
ｉ）エンドサイトーシスシグナル
ｉｉ）ゴルジ保持シグナル
ｉｉｉ）ＴＧＮリサイクリングシグナル
ｉｖ）ＥＲ保持シグナル
ｖ）リソソーム選別シグナル

細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質をＥＲからの転位置中に分泌経路から離脱させるように方向づけ得る。

細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質を細胞内区画または細胞内複合体に方向づけ得る。細胞内保持シグナルは、膜貫通タンパク質を膜結合した細胞内区画に方向づけ得る。

例えば、細胞内保持シグナルは、タンパク質をリソソーム区画、エンドソーム区画、またはゴルジ区画（トランスゴルジ網、「ＴＧＮ」）に方向づけ得る。

正常細胞内で、バイオジェネシスまたはエンドサイトーシス経路から生じたタンパク質は、一連の選別による決定後に適切な細胞内区画に選別される。原形質膜では、タンパク質は、細胞表面上に残存するか、エンドソームに内在化され得る。ＴＧＮでは、原形質膜に向かうか、エンドソームに転送されるかのいずれかの選択がなされる。エンドソーム中で、タンパク質は、原形質膜へとリサイクルされるか、リソソームに向かい得る。これらの決定は、タンパク質自体からの選別シグナルによって制御される。

リソソームは、老廃物および細胞デブリを分解する酸性加水分解酵素を含む細胞オルガネラである。リソソーム周囲の膜により、消化酵素が必要とするｐＨで作用することが可能である。リソソームは、自己貪食液胞（ファゴソーム）と融合し、その酵素を自己貪食液胞内に分泌し、その内容物を消化する。

エンドソームは、真核細胞の内側の膜結合区画である。エンドソームは、原形質膜からリソソームまでのエンドサイトーシス膜輸送経路の一区画であり、物質が分解性リソソームに到達する前に物質を選別するための環境を提供する。エンドソームは、エンドサイトーシスされた物質の到達時間に応じて、初期エンドソーム、後期エンドソーム、またはリサイクリングエンドソームに分類され得る。本発明で使用される細胞内保持シグナルは、タンパク質を後期エンドソーム区画に方向づけ得る。

ゴルジ装置は細胞内膜系の一部であり、ゴルジ装置は、タンパク質をその目的地に輸送する前に細胞内部にタンパク質を囲い込む；ゴルジ装置は、タンパク質の分泌プロセスで特に重要である。

公知のタンパク質中に存在する選別シグナル、ならびにその配列および／または分子内の位置を変化させたときの影響を調査する研究によって得られた知識体系は相当なものである（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ａｎｄ Ｔｒａｕｂ（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：３９５－４４７；Ｂｒａｕｌｋｅ ａｎｄ Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７９３：６０５－６１４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：Ｒ２２６－Ｒ２２８；Ｍｅｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：８３３－８４５；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ ａｎｄ Ｐａｙｎｅ（２００１）Ｃｅｌｌ １０６：３９５－３９８；Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：２４２４－２４３５；Ｔｒｅｊｏ（２００５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７：１３８８－１３９０）。多くの研究から、目的のタンパク質の細胞内の位置を変化させるために、１またはそれを超える選別シグナルを目的のタンパク質に挿入することが可能であることが示されている（Ｐｅｌｈａｍ（２０００）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２７：２７９－２８３）。

エンドサイトーシスシグナルの例には、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体由来のものが含まれる。

ＴＧＮ－エンドソームリサイクリングを引き起こすシグナルの例には、ＣＩ－およびＣＤ－ＭＰＲ、ソルチリン、ＬＤＬ－受容体関連タンパク質ＬＲＰ３およびＬＲＰ１０およびβ－セクレターゼ、ＧＧＡ１－３、ＬＩＭＰ－ＩＩ、ＮＣＰ１、ムコリピン－１、シアリン、ＧＬＵＴ８およびインバリアント鎖などのタンパク質由来のものが含まれる。

ＴＧＮ保持シグナルの例には、ＴＧＮに局在される以下のタンパク質由来のものが含まれる：プロホルモンプロセシング酵素フューリン、ＰＣ７、ＣＰＤ、およびＰＡＭ；ヘルペスウイルス３の糖タンパク質ＥおよびＴＧＮ３８。

ＥＲ保持シグナルの例には、Ｃ末端シグナル（ＫＤＥＬ、ＫＫＸＸ、またはＫＸＫＸＸなど）およびカリウムチャネルのＲＸＲ（Ｒ）モチーフが含まれる。公知のＥＲタンパク質には、アデノウイルスＥ１９タンパク質およびＥＲＧＩＣ５３が含まれる。

リソソーム選別シグナルの例には、リソソーム膜タンパク質中に見出されるもの（ＬＡＭＰ－１およびＬＡＭＰ－２など）、ＣＤ６３、ＣＤ６８、エンドリン、ＤＣ－ＬＡＭＰ、シスチノシン、糖リン酸交換輸送体２、および酸性ホスファターゼが含まれる。

本発明の操作された免疫細胞は、細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む少なくとも１つの操作されたタンパク質を含む。

細胞内保持シグナルは、当該分野で周知である（例えば、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ＆Ｔｒａｕｂ；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；２００３；７２；３９５－４４７を参照のこと）。

また、本発明は、以下の構造を含む核酸構築物を提供する：
Ａ－Ｘ－Ｂ－Ｃ
（式中、
ＡおよびＢは、本明細書中に定義の標的結合ドメインをコードする核酸配列であり；Ｘは、本明細書中に定義のリンカーであり；Ｃは、本明細書中に定義の細胞内保持シグナルである）。

適切には、「細胞内保持シグナル」は、このシグナルを含むタンパク質を、細胞内保持シグナルの非存在下で方向づけられるであろう細胞区画以外の細胞区画に方向づけるか維持するアミノ酸配列を指す。適切には、細胞内保持シグナルは、このシグナルを含むタンパク質を細胞表面膜以外の細胞区画または細胞の外側に方向づけるか維持する。

細胞内保持シグナルは、所与の細胞内区画に常在する任意のタンパク質またはタンパク質ドメインであり得る。これは、前述のタンパク質またはドメインの大部分が所与の区画に存在することを意味する。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の前述のタンパク質またはドメインが、細胞内の前述の区画に存在する。細胞内保持シグナルは、本発明の操作されたタンパク質の細胞からの分泌または原形質膜への転位置を防止する。

本明細書中で使用される場合、「区画」または「細胞内区画」は、細胞の所与のサブドメインを指す。区画は、オルガネラ（小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームなど）またはオルガネラのエレメント（エンドソームの多胞体、ゴルジ装置のシス槽、メディアル槽、またはトランス槽など）または原形質膜もしくは原形質膜のサブドメイン（頂端ドメイン、基底外側ドメイン、軸索ドメインなど）またはマイクロドメイン（接着斑または密着結合など）であり得る。

「細胞内区画」は、細胞内の一区画を指す。

本発明によれば、少なくとも２つの標的タンパク質は、細胞内保持シグナルにカップリングされた同族の標的結合ドメイン自体との相互作用によって細胞内または特定の細胞内区画内に保持され得る。少なくとも２つの標的タンパク質は、異なる細胞内区画内に保持され得る。

１つの態様では、細胞内保持シグナルは、タンパク質を、ゴルジ区画（トランスゴルジ網、「ＴＧＮ」）、エンドソーム区画、またはリソソーム区画に方向づけ得る。

１つの態様では、細胞内保持シグナルは、以下の群から選択される：ゴルジ保持配列；トランスゴルジ網（ＴＧＮ）リサイクリングシグナル；小胞体（ＥＲ）保持配列；プロテアソーム局在化配列、またはリソソーム選別シグナル。

細胞内保持シグナルは、ゴルジに常在するタンパク質またはドメインであり得る。適切には、ゴルジ保持ドメインは、以下を含む群から選択され得る：ギアンチン（ＧｏｌｇＢ１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＋００４４８７．３）、ＴＧＮ３８／４６、Ｍｅｎｋｅｓ受容体およびゴルジ酵素（ＭａｎＩＩ（α－１，３－１，６マンノシダーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００８５４９）など）、シアリルトランスフェラーゼ（β－ガラクトサミドα２，６－シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｅ）１、ＮＭ＿００３０３２）、ＧａｌＴ（β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ１、ＮＭ＿００１４９７）アデノウイルスＥ１９、ＨＬＡインバリアント鎖、または局在化ドメインを含むその断片。

１つの態様では、ゴルジ保持配列は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＤＥＬ（配列番号２）、ＫＫＸＸ（配列番号３）、ＫＸＫＸＸ（配列番号４）、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号５）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、配列ＭＨＲＲＲＳＲＳＣＲ（配列番号６）を含むＨＬＡインバリアント鎖の断片、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号７）、もしくはＹＱＲＬ（配列番号８）、またはゴルジ保持配列として機能する能力を保持している少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント（式中、Ｘが任意のアミノ酸である）。

適切には、保持シグナルは、ＳＥＫＥＤＬ（配列番号１）またはＫＤＥＬ（配列番号２）配列であり得る。ＫＤＥＬ受容体は、ＥＲ－ゴルジ中間区画、すなわち初期ゴルジでタンパク質に結合し、これらをＥＲに送り返す。タンパク質は、ＫＤＥＬ配列が切断された後はＥＲから遊離するのみである。したがって、ＥＲに常在するタンパク質は、ＫＤＥＬ配列を含む限り、ＥＲ内に保持されるであろう。一般的な哺乳動物シグナルはＫＤＥＬであるが、ＫＤＥＬ受容体は配列ＨＤＥＬにより強固に結合することが示されている（Ｓｃｈｅｅｌ ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８；７４６５（１９９３））。細胞内保持シグナルはＨＤＥＬであり得る。

適切には、保持ドメイン－特に、ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）またはＫＤＥＬ（配列番号２）などのゴルジ保持配列－は、特定の細胞内区画、特にゴルジに向けられるべき操作されたタンパク質のＣ末端に配置される。

適切には、保持ドメイン－特に、ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）またはＫＤＥＬ（配列番号２）などのゴルジ保持配列－は、本発明の核酸構築物中の自己切断ペプチド（２Ａまたは２Ａ様ペプチドなど）のすぐ上流／５’には配置されない。

ＫＫＸ’Ｘ’およびＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナルは、Ｉ型膜タンパク質の細胞質側に配置することができる回収シグナルである。これらのシグナルの配列要件は、Ｔｅａｓｄａｌｅ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．；１２；２７（１９９６））によって詳細に提供されている。

適切には、保持シグナルは、ＫＫＸＸ（配列番号３）モチーフであり得る。適切には、ＫＫＸＸドメインは、タンパク質のＣ末端に存在し得る。ＫＫＸＸは、コートタンパク質（ＣＯＰＩ）複合体との相互作用を介した逆行性輸送によって、ゴルジ装置のシス末端からのＥＲ膜タンパク質の回収を担う。

適切には、保持シグナルは、ＫＸＫＸＸ（配列番号４）モチーフであり得る。

細胞内保持シグナルは、アデノウイルスＥ１９タンパク質に由来し得る。細胞内保持シグナルは、タンパク質Ｅ３／１９Ｋ（Ｅ３ｇｐ １９ｋＤａ；Ｅ１９、またはＧＰ１９Ｋとしても公知）に由来し得る。細胞内保持シグナルは、Ｅ３／１９Ｋの完全なサイトゾル側テール（配列番号５として示す）；またはこのテールの最後の６アミノ酸（配列番号２８として示す）を含み得る。適切には、保持シグナルは、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号５）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテールであり得る。適切には、保持シグナルは、配列番号２８：ＤＥＫＫＭＰの配列を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテールであり得る。

適切には、保持ドメインは、配列ＭＨＲＲＲＳＲＳＣＲ（配列番号６）を含むＨＬＡのインバリアント鎖のＮ末端断片または少なくとも８０％の同一性を有し、かつ保持シグナルとして機能する能力を保持するそのバリアントであり得る。

保持シグナルは、ＥＲに常在するタンパク質またはドメインであり得る。

ＥＲ保持シグナルは、以下を含む群から選択され得る：ＥＲに常在するインバリアント鎖のイソ型（Ｉｉ３３）、リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、もしくはシトクロムｂ５、または局在化ドメインを含むその断片。ＥＲ局在化ドメインの例は、リボフォリンＩＩ（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＢＣ０６０５５６．１）のＥＲ局在化ドメインである。

１つの態様では、小胞体保持シグナルは、以下から選択される：リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、またはシトクロムｂ５。

細胞内保持シグナルは、チロシンベースの選別シグナル、ジロイシンベースの選別シグナル、酸性クラスターシグナル、リソソーム回避シグナル、ＮＰＦＸ’（１，２）Ｄ型シグナル、ＫＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’、またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’シグナル（式中、Ｘ’は任意のアミノ酸である）であり得る。

チロシンベースの選別シグナルは、原形質膜由来の膜貫通タンパク質の迅速な内在化およびタンパク質のリソソームへの方向付けを媒介する（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ＆Ｔｒａｕｂ；前出）。２つのタイプのチロシンベースの選別シグナルは、ＮＰＸ’ＹおよびＹＸ’Ｘ’Ｚ’コンセンサスモチーフ（式中、Ｚ’は、嵩高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である）で表される。

ＮＰＸ’Ｙシグナルは、Ｉ型膜貫通タンパク質の迅速な内在化を媒介することが示されており、前述のシグナルは、ＬＤＬ受容体、インテグリンβ、およびβ－アミロイド前駆体タンパク質ファミリーのメンバーなどのファミリーで生じる。

ＮＰＸ’Ｙシグナルの例を、表１に提供する。

ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルは、エンドサイトーシス受容体（トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体など）、細胞内選別受容体（ＣＩ－およびＣＤ－ＭＰＲなど）、リソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ－１およびＬＡＭＰ－２など）、およびＴＧＮタンパク質（ＴＧＮ３８およびフューリンなど）、ならびに特殊化されたエンドソーム－リソソームオルガネラ（抗原プロセシング区画（例えば、ＨＬＡ－ＤＭ）および細胞傷害性顆粒（例えば、ＧＭＰ－１７）など）に局在化されたタンパク質中に見出される。ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルは、原形質膜由来のタンパク質の迅速な内在化に関与する。しかしながら、同一のモチーフがリソソームおよびリソソーム関連オルガネラへの膜貫通タンパク質の方向付けに関わっているので、その機能はエンドサイトーシスに制限されない。

ＹＸ’Ｘ’Ｚ’型シグナルの例を、表２に提供する。

ジロイシンベースの選別シグナル（［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’ＬＬ［ＬＩ］）は、多数のＩ型、ＩＩ型、および複数回膜貫通型タンパク質の選別で重要な役割を果たす。ジロイシンベースの選別シグナルは、膜貫通タンパク質の迅速な内在化およびリソソーム分解ならびに後期エンドソーム－リソソーム区画へのタンパク質の方向付けに関与する。このシグナルの構成性に活性な形態を含む膜貫通タンパク質は、主に、後期エンドソームおよびリソソームに局在する。

［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’ＬＬ［ＬＩ］選別シグナルの例を、表３に提供する。

ＤＸ’Ｘ’ＬＬシグナルは、別個のタイプのジロイシンベースの選別シグナルを構成する。これらのシグナルは、いくつかの膜貫通受容体およびＴＧＮとエンドソームとの間を循環する他のタンパク質（ＣＩ－およびＣＤ－ＭＰＲ、ソルチリン、ＬＤＬ－受容体関連タンパク質ＬＲＰ３およびＬＲＰ１０、ならびにβ－セクレターゼなど）中に存在する。

ＤＸ’Ｘ’ＬＬ選別シグナルの例を、表４に提供する。

選別モチーフの別のファミリーは、ＣＫＩＩによるリン酸化のための部位を含む酸性残基のクラスターによって提供される。このタイプのモチーフは、定常状態でＴＧＮに局在される膜貫通タンパク質（プロホルモンプロセシング酵素フューリン、ＰＣ６Ｂ、ＰＣ７、ＣＰＤ、およびＰＡＭ、ならびにヘルペスウイルス３の糖タンパク質Ｅが含まれる）でしばしば見出される。

酸性クラスターシグナルの例を、表５に提供する。

細胞内保持シグナルは、以下の群から選択され得る：ＮＰＸ’Ｙ、ＹＸ’Ｘ’Ｚ、［ＤＥ］Ｘ’Ｘ’Ｘ’Ｌ［ＬＩ］、ＤＸ’Ｘ’ＬＬ、ＤＰ［ＦＷ］、ＦＸ’ＤＸ’Ｆ、ＮＰＦ、ＬＺＸ’Ｚ［ＤＥ］、ＬＬＤＬＬ、ＰＷＤＬＷ、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＫＫＸ’Ｘ’、またはＫＸ’ＫＸ’Ｘ’；式中、Ｘ’は任意のアミノ酸であり、Ｚ’は嵩高い疎水性側鎖を有するアミノ酸である。

細胞内保持シグナルは、表１～５に示した任意の配列であり得る。

細胞内保持シグナルは、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ）－１細胞内保持シグナルを含み得る。細胞内保持シグナルは、ＴＹＲＰ－１細胞内ドメインを含み得る。細胞内保持シグナルは、配列ＮＱＰＬＬＴＤ（配列番号２９）またはそのバリアントを含み得る。

ＴＹＲＰ１は、十分に特徴づけられたメラノソームタンパク質であり、メラノソーム（特殊化されたリソソーム）中に９９％を超える有効性で保持されている。ＴＹＲＰ１は、内腔ドメイン（１～４７７ａａ）、膜貫通ドメイン（４７８～５０１）、および細胞質ドメイン（５０２～５３７）を有する５３７アミノ酸膜貫通タンパク質である。細胞質ドメイン上に常在するジ－ロイシンシグナルにより、タンパク質が保持される。このジ－ロイシンシグナルは、配列番号２９（ＮＱＰＬＬＴＤ）として示した配列を有する。

標的結合ドメイン
標的結合ドメインは、細胞局在化が調節されるべき特異的な標的分子（または標的タンパク質）に結合することができるタンパク質またはポリペプチド鎖であり得る。

１つの態様では、少なくとも１つの標的は、以下から選択される：サイトゾルタンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、および膜貫通タンパク質。

適切には、標的は、内因性タンパク質であり得る。例えば、標的は、細胞によって天然に発現されたタンパク質であり得る。換言すれば、細胞は、標的を発現するように操作されていなかった。

１つの態様では、標的結合ドメインは、タンパク質間相互作用ドメインであり得る。適切には、標的結合ドメインは、タンパク質相互作用ドメインであり得る。

１つの態様では、標的結合ドメインは、標的に結合する抗体、抗体断片もしくは抗原結合断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含む。

１つの態様では、少なくとも１つの標的結合ドメインは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。

１つの態様では、少なくとも１つの標的結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

１つの態様では、標的結合ドメインは、標的分子に結合する受容体またはリガンドであり得る。例えば、標的は、ＰＤ－１であり得、標的結合分子は、ＰＤ－１に結合するリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）であり得る。

標的は、その局在化を調節することが望まれる（例えば、その分泌を調節（例えば、軽減または阻害）することが望まれる）任意のタンパク質であり得る。腫瘍環境をモジュレートするタンパク質（例えば、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）などの免疫調節サイトカイン）、または炎症を引き起こすタンパク質の分泌を調節（例えば、軽減または阻害）することが望ましい場合がある。

あるいは、標的は、その細胞表面発現を調節することが望まれる任意のタンパク質であり得る。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞がＣＡＲ Ｔ細胞表面上にも発現するリガンド群（例えば、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ７）を標的にする場合に同胞殺しを軽減するために、細胞表面タンパク質の発現を調節（例えば、軽減または阻害）することが望ましい場合がある。

また、典型的には細胞表面に存在する阻害タンパク質（ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ｆａｓ、ＣＴＬＡ、ＴＢＲ２、またはＬＡＧ３など）の発現を調節（例えば、軽減または阻害）することが望ましい場合がある。

いくつかの場合、標的は、その細胞内細胞局在化の調節が望まれるタンパク質であり得る。タンパク質の機能を無効にするために特異的細胞区画中のタンパク質の局在化を調節することが望ましい場合がある。例えば、その機能が原形質膜局在化に依存するサイトゾルタンパク質（例えば、ＺＡＰ７０、ＳＬＰ７６、またはＡＫＴ）の細胞局在化。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインは、同一の標的の異なる領域に結合し得る。

あるいは、少なくとも２つの標的結合ドメインは、異なる標的に結合し得る。適切には、少なくとも２つの標的は、同一の細胞区画中に局在化され得る。適切には、少なくとも２つの標的は、異なる細胞区画中に局在化され得る。

１つの態様では、少なくとも１つの標的結合ドメインは、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、免疫応答を下方制御する受容体、Ｔ細胞上に発現されるリガンド、または免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質に結合する。

適切には、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の構成要素は、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、またはＣＤ３ζであり得る。

本発明で使用され得る例示的な標的結合ドメインは、抗ＣＤ３εＵＣＨＴ（図２中にＡｂ－１として示す）またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントである：

適切には、ＨＬＡクラスＩ分子は、Β２－ミクログロブリン、α１－ミクログロブリン、α２－ミクログロブリン、またはα３－ミクログロブリンであり得る。

本発明で使用され得る例示的な標的結合ドメインは、抗Ｂ２－ミクログロブリン＿ｄＮ６Ｂ２Ｍ（図２中にＡｂ－２として示す）またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントである：

適切には、標的タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子であり得る。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質複合体は、ヒト白血球抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）によってコードされる。ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲである。

ＨＬＡクラスＩＩ分子は、以下の２つのポリペプチド鎖として形成される：αおよびβ。これらは、典型的には、個体によって非常に多様であるが、ある特定の集団において、他の集団よりもはるかに多く見られるハプロタイプもある。

ハプロタイプまたはハプロタイプの任意の組み合わせのポリペプチドは、本発明で標的として使用され得る（ＨＬＡ－ＤＲＢ、ＨＬＡ－ＤＲＢ０３、ＨＬＡ－ＤＲＢ１５、ＨＬＡ－ＤＲＢ０４、ＨＬＡ－ＤＲＢ０７、ＨＬＡ－ＤＲＢ０１が含まれる）。

ＨＬＡ－ＤＲは非常に稀な多型を有するため、ＨＬＡ－ＤＲαおよび／またはＨＬＡ－ＤＲβは本発明で標的として使用するのに特に好適である。

ＨＬＡ－ＤＰおよびＨＬＡ－ＤＱは、多型性のαおよびβ鎖を有する。したがって、よく見られるＨＬＡ－ＤＰまたはＨＬＡ－ＤＱのαまたはβ鎖を選択することができ、そのハプロタイプを有するレシピエントのみから限定的に同種産生することができる。適切には、レシピエントは、そのハプロタイプがホモ接合性であり得る。レシピエントのそのハプロタイプがホモ接合性ではない場合、２つのＨＬＡ－ＤＰおよび２つのＨＬＡ－ＤＱ（必要に応じて、ＨＬＡ－ＤＲ（例えば、ＨＬＡ－ＤＲα）と組み合わせて）が使用され得る。

ＭＨＣポリペプチドの配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベースに提供されている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：２０９－２１２（１９９９）；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／２７．１．２０９）。

適切には、免疫応答を下方制御する受容体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ３）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、Ｆａｓ、ＴＢＲ２、ＬＡＧ３、またはタンパク質チロシンホスファターゼから選択され得る。

本発明で使用され得る例示的な標的結合ドメインは、抗ＰＤ１＿クローン１０（図２中にＡｂ－３として示す）またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントである：

適切には、免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質は、Ｃｓｋ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、Ｚａｐ－７０、ＳＬＰ７６、およびＡＫＴから選択され得る。

適切には、Ｔ細胞上に発現されるリガンドは、ＣＤ５、ＣＤ７、またはＣＤ２であり得る。

１つの態様では、本発明の操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む。

本発明で使用され得る例示的なＣＡＲ配列は、ＣＤ１９ＣＡＲまたはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントである：

マーカー
１つの態様では、１またはそれを超える核酸構築物（単数または複数）、または操作されたタンパク質は、少なくとも１つのマーカーをさらに含み得、好ましくは、前述のマーカーは、少なくとも１つのｍＡｂ特異的エピトープを含む細胞外結合ドメインである。エピトープは、抗体によって認識される細胞外ドメインであり得る。

マーカーは、形質導入された細胞の精製を可能にするために形質導入効率を測定し、そして／または操作された細胞の枯渇を容易にするために使用され得る。適切には、マーカーは、自殺遺伝子によってコードされ得、有毒な場合に操作された細胞の枯渇を容易にし得る。

本発明で使用され得る例示的なマーカーは、ＲＱＲ８またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントである：

リツキシマブは、ＲＱＲ８を発現する操作された細胞を枯渇させるために使用され得る。

シグナルペプチド
古典的なタンパク質分泌経路は、小胞体（ＥＲ）を介する。本明細書中に記載の操作されたタンパク質、マーカー、ＣＡＲ、およびトランスジェニックＴＣＲは、シグナル配列を含み得るため、タンパク質が細胞の内側で発現されるとき、新生タンパク質がＥＲに方向づけられる。

用語「シグナルペプチド」は、「シグナル配列」と同義である。

シグナルペプチドは、典型的には新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在し、分泌経路に向かう、一般に５～３０アミノ酸長の短いペプチドである。これらのタンパク質には、一定のオルガネラ（例えば、小胞体、ゴルジ、またはエンドソーム）のいずれかの内側に存在し、細胞から分泌されるタンパク質、および膜貫通タンパク質が含まれる。

シグナルペプチドは、一般に、一本鎖αヘリックスを形成する傾向がある長鎖疎水性アミノ酸であるコア配列を含む。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸鎖から始まる場合があり、これは、移動中のポリペプチドの適切なトポロジーを堅持するのに役立つ。シグナルペプチドの末端では、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸鎖が存在する。シグナルペプチダーゼは、移動中または移動完了後のいずれかにシグナルペプチドを切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、いくつかのカルボキシ末端シグナルペプチドが知られているが、一般に、分子のアミノ末端に存在する。

シグナル配列は、典型的には、疎水性コア領域（ｈ－領域）、これに隣接するｎ－領域およびｃ－領域からなる三部構造を有する。後者は、シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）コンセンサス切断部位を含む。通常は、シグナル配列は翻訳と同時に切断され、得られた切断シグナル配列はシグナルペプチドと名付けられている。

シグナル配列を、ソフトウェア技術（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／を参照のこと）を使用して検出するか予測することができる。

非常に多くのシグナル配列が公知であり、データベースから入手できる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ ｌｉｓｔｓ ２１０９では、そのデータベース内に哺乳動物シグナルペプチドが確認される。

１つの実施形態では、タンパク質は、タンパク質を小胞体（ＥＲ）内に移動させることができるシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。タンパク質は、タンパク質をＥＲ内に移動させることができるシグナルペプチドに作動可能に連結されるように操作され得る。適切には、タンパク質は、通常は天然では作動可能に連結されないシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。適切には、タンパク質とシグナルペプチドの組み合わせは合成であり得る（例えば、天然では見出されない）。

いくつかの実施形態では、変化したシグナルペプチド（効率性で劣るシグナルペプチドなど）を使用することができる。変化したシグナルペプチドを使用すると、臨床上の必要性に応じて系が調整される場合がある。タンパク質の比は、２つのタンパク質上の１またはそれを超えるシグナルペプチドの効率を調整することによって改変され得る。シグナルペプチドの効率を調整する方法は、ＷＯ２０１６／１７４４０９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

適切には、シグナルペプチドは、マウスＩｇκ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域シグナルペプチドまたはそのバリアントであり得る。マウスＩｇκ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３５に記載する。適切には、シグナルペプチドは、例示的な配列である配列番号３５またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントを含み得る。
METDTLILWVLLLLVPGSTG（配列番号３５）

適切には、シグナルペプチドは、例示的な配列である配列番号３６に記載の配列またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するそのバリアントを含み得る。
MGTSLLCWMALCLLGADHADA（配列番号３６）。

バリアント配列は、配列番３５～３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、シグナルペプチドとして機能できることを条件とする。バリアント配列は、新生タンパク質をＥＲに向かわせる能力を保持している。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式または標的抗原のリガンドに基づき得る。スペーサードメインは、バインダーを膜から隔離し、適切に配向するのに必要であり得る。一般に使用されるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、例えば、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみには、より小型のスペーサーで十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜中のタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。従って、これらの第１世代の受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞死滅を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞が増殖および生存するように完全に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、化合物エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分をＣＤ３ζの細胞内部分と融合することにより、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これにより、最も強力な共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫学的シグナル２）が供給される。ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４－１ＢＢなど）を含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナル、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより強力な第３世代のＣＡＲをここに記載している。

ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入することができる。このようにして、多数の抗原特異的Ｔ細胞を、養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する細胞に仕向ける。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的ＣＡＲの一部である。

多数の抗原結合ドメインが当該分野で公知であり、抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づいた抗原結合ドメインが含まれる。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の野生型リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；ラクダ科動物などの単鎖ドメイン結合剤；Ｄａｒｐｉｎなどの人工単一結合剤；またはＴ細胞受容体由来の単鎖。

以下の表１に示すように、種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明で使用される抗原結合ドメインは、本明細書中に記載のＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがる古典的ＣＡＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、受容体に良好な安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。

ＣＡＲまたはＴＣＲシグナルペプチド
本発明で使用するためのＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲは、シグナルペプチドを含み得るため、シグナルペプチドがＴ細胞などの細胞内で発現される場合、新生タンパク質は小胞体に向かい、その後に細胞表面に向かい、そこで発現される。

シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ－ヘリックスを形成する傾向がある長いストレッチの疎水性アミノ酸を含み得る。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸ストレッチから始まってよく、このストレッチは、転位置中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ。シグナルペプチドの最後に、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸ストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位置中または転位置の完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。

スペーサードメイン
受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するスペーサー配列を含み得る。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを結合が容易になるように異なる方向に配向することが可能である。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替リンカー配列を代替的に含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーを、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更することができる。

細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。

最も一般的に使用されているシグナル伝達ドメインの成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ゼータエンドドメインの成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するために、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３－ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。

細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、これを含み得る。

細胞内シグナル伝達ドメインは、１またはそれを超える免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは、免疫系の一定の細胞表面タンパク質の細胞質側尾部中に２回反復された４アミノ酸の保存配列である。このモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含み、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉが与えられる。これらのシグネチャーのうちの２つが、典型的には、分子の尾部中で６アミノ酸と８アミノ酸との間のアミノ酸によって分離されている（ＹｘｘＬ／Ｉ_{ｘ（６－８）}ＹｘｘＬ／Ｉ）。

ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達に重要である。それ故、ＩＴＡＭは、重要な細胞シグナル伝達分子（Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３およびζ鎖、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９アルファ鎖およびベータ鎖、ならびに一定のＦｃ受容体など）の尾部に見出される。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子のそのリガンドとの相互作用後にリン酸化されるようになり、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位を形成する。

細胞内シグナル伝達ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζエンドドメインを含み得るか、ＣＤ３－ζエンドドメインから本質的になり得るか、ＣＤ３－ζエンドドメインからなり得る。古典的には、ＣＤ３－ζエンドドメインは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。

細胞内シグナル伝達ドメインは、さらなる共刺激シグナル伝達を含み得る。例えば、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）をＣＤ３－ζと共に使用するか、ＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３－ζと共に使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができる。

適切には、ＣＡＲは、以下の一般的な形式を有し得る：抗原結合ドメイン－ＴＣＲエレメント。

本明細書中で使用される場合、「ＴＣＲエレメント」は、ＴＣＲ受容体複合体の成分のドメインまたはその一部を意味する。ＴＣＲエレメントは、細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメイン（例えば、ＴＣＲエレメントの細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み得る（例えば、有し得る）。

ＴＣＲエレメントを、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖から選択することができる。

適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞外ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の膜貫通ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞内ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖を含み得る。

トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原のフラグメントを主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして認識することを担うＴ細胞表面上に見出される分子である。

ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、９５％のＴ細胞において、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなるのに対して、５％のＴ細胞において、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。

ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合するとき、シグナル伝達を介してＴリンパ球が活性化される。

従来の抗体指向標的抗原と対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、プロセシングされてペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される潜在的な細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。

細胞中にＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を人為的に導入するか；細胞中にベクターを使用してＴＲＧ遺伝子およびＴＲＤ遺伝子を導入することによって異種（すなわち、非天然）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。例えば、操作したＴＣＲの遺伝子を自己由来Ｔ細胞に再導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に戻すことができる。かかる「異種」ＴＣＲを、本明細書中で「トランスジェニックＴＣＲ」と呼ぶこともできる。

核酸構築物／核酸配列のキット
本発明は、少なくとも２つの標的結合ドメインを共にコードする１またはそれを超える核酸構築物であって、前述の１またはそれを超える核酸構築物が、細胞中で共発現された場合に、前述の標的結合ドメインの各々の細胞局在化を調節する細胞内保持シグナルをコードする単一のヌクレオチド配列を共に含む、１またはそれを超える核酸構築物を提供する。

適切には、１またはそれを超えるは、１つ、２つ、３つ、または４つの核酸構築物を指し得る。

適切には、本発明は、本発明のエレメントを共にコードする１つまたは２つの核酸構築物を提供する。本発明のエレメントを提供するために必要な核酸構築物の総数を最小にすることは、１つの標的配列に複数の構築物を導入する必要がある場合に付随する不利益が軽減する。

１つの態様では、少なくとも２つの標的結合ドメインの各々および細胞内保持シグナルは、個別のポリペプチドとしてコードされ；標的結合ドメインを含むポリペプチドの各々が第１のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、細胞内保持シグナルを含むポリペプチドが第２のタンパク質相互作用ドメインをさらに含み、ここで、前述の第１および第２のタンパク質相互作用ドメインが、相互に結合することができる。

別の態様では、本発明は、以下の構造を含む核酸構築物を提供する：
Ａ－Ｘ－Ｂ－Ｃ
ここで、
ＡおよびＢは、本明細書中に定義の標的結合ドメインをコードする核酸配列であり；Ｘは、本明細書中に定義のリンカーであり；Ｃは、本明細書中に定義の細胞内保持シグナルである。

適切には、核酸構築物は、さらなる標的結合ドメイン（単数または複数）をコードする１またはそれを超えるさらなる核酸配列をさらに含み得る。さらなる標的結合ドメインは、好ましくは、細胞内保持シグナルにカップリングされている。

核酸（ｎｕｃｌｉｃ ａｃｉｄ）構築物は、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲまたは少なくとも１つのマーカー（細胞外結合ドメインなど）をコードする核酸配列をさらに含み得る。例示的なマーカーは、ＲＱＲ８またはそのバリアントである。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。

適切には、核酸構築物は、本発明の構成要素（少なくとも２つの標的結合タンパク質および細胞内保持シグナルなど、必要に応じて、さらなる標的結合ドメイン、ＣＡＲ、トランスジェニックＴＣＲ、マーカーをさらに含む）をコードする複数の核酸配列をさらに含み得る。例えば、核酸構築物は、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える、本発明の異なる構成要素をコードする核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列は、本明細書中に定義の共発現部位によって分離され得る。

当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることを理解する。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。適切には、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞、特に、本明細書中に記載の細胞溶解性免疫細胞中で発現できるようにコドン最適化される。

本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変を、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を向上させるように行うことができる。

ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」には、ヌクレオチド配列に対する１（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加が含まれる。

共発現部位
共発現部位は、本発明の操作された免疫細胞の標的結合タンパク質および他の操作された構成要素（ＣＡＲ、トランスジェニックＴＣＲ、およびヘテロ多量体ポリペプチド構成要素など）をコードする核酸配列を共発現することができる核酸配列を指すために本明細書中で使用される。

適切には、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に共発現部位が存在し得る。適切には、複数の共発現部位が操作されたポリヌクレオチド中に存在する実施形態では、同一の共発現部位を使用することができる。

好ましくは、共発現部位は切断部位である。切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されたときにいかなる外部の切断活性も必要とせずに個別のペプチドに直ちに切断されるように自己切断し得る。

用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解活性、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。

切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。

ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において融合タンパク質の切断を制御するために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、

である。哺乳動物細胞（ヒト細胞など）は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞中で発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼは哺乳動物細胞中でも発現されなければならない。

切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」か分離されるように機能するペプチドを指す。

自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体がＣ末端で「切断している」２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ（２００１））。

「２Ａ様」配列は、アフトウイルス（ａｐｔｈｏ－）またはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ内の反復配列および上記の細菌配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）で見出されている。

本発明で使用され得る例示的な２Ａ配列は、以下を含む：
EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号３７）または切断部位として機能する能力を保持している配列番号３７と少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント。

共発現配列列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列列は、内部プロモーターであり得る。

ベクター
本発明はまた、１またはそれを超える本発明の核酸配列（単数または複数）または核酸構築物（単数または複数）を含むベクターを提供する。かかるベクターは、宿主細胞が本明細書中に定義の細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む操作されたタンパク質を発現するように、宿主細胞中に核酸配列（単数または複数）または構築物（単数または複数）を導入するために使用され得る。

適切には、ベクターは、本発明が提供する異なる構成要素をコードする複数の核酸配列を含み得る。例えば、ベクターは、本発明の異なる構成要素（少なくとも２つの標的結合ドメイン、細胞内保持シグナルおよびマーカー、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲなど）をコードする２つ、３つ、４つ、またはそれを超える核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列は、本明細書中に定義の共発現部位によって分離され得る。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。

医薬組成物
本発明はまた、本発明の操作免疫細胞または本発明の方法によって得ることができる（例えば、得られた）細胞を含む医薬組成物に関する。

本発明はまた、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の核酸配列の群、または本発明のベクターを含む医薬組成物を提供する。特に、本発明は、本発明の細胞を含む医薬組成物に関する。

医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。

処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の操作された免疫細胞もしくは本発明の方法によって得ることができる（例えば、得られた）操作された免疫細胞、または本発明の核酸構築物、または本明細書中に定義の核酸配列の群；または本発明のベクターを被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。

適切には、本発明の疾患を処置および／または予防する方法は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の操作された免疫細胞を被験体に投与するステップを含み得る。

疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この態様では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、または改善し、そして／または疾患の進行を遅延、軽減、または遮断するために、既存の疾患または容態を有する被験体に細胞を投与することができる。

疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この態様では、未だ罹患しておらず、そして／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するために細胞を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。

方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の核酸配列の群、または本発明のベクターを細胞に導入するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。

方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の核酸配列の群、または本発明のベクターを細胞に導入するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。

適切には、核酸構築物、ベクター（単数または複数）または核酸は、形質導入によって導入され得る。適切には、核酸構築物、ベクター（単数または複数）または核酸は、トランスフェクションによって導入され得る。

適切には、細胞は自己由来であり得る。適切には、細胞は同種異系であり得る。

本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための、本発明の操作された免疫細胞、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の核酸配列の群、または本発明のベクターを提供する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の操作された免疫細胞を提供する。

また、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の操作された免疫細胞、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の核酸配列の群、または本発明のベクターに関する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の操作された免疫細胞の使用に関する。

本発明の方法によって処置および／または予防すべき疾患は、がんであり得る。

がんは、神経芽細胞腫、前立腺がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞癌）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、および甲状腺がんなどのがんであり得る。

本発明の細胞は、癌細胞などの標的細胞を死滅させることができる場合がある。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば、上記の表に列挙したＴＡＡの発現によって認識できる場合がある。

細胞の作製方法
本発明の操作された免疫細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが含まれる多数の手段のうちの１つによって、本明細書中に定義の細胞内保持シグナルにカップリングされた少なくとも２つの標的結合ドメインを含む操作されたタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成され得る。

本発明の細胞は、（例えば、形質導入またはトランスフェクションによって）細胞に、本発明の核酸構築物もしくはベクター、もしくは上記定義の核酸配列の群、または本発明のベクターを導入することによって作製され得る。

適切には、細胞は、被験体から単離した試料に由来し得る。

本明細書中で使用される場合、用語「導入された」または「導入している」は、外来のＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入する方法を指す。本明細書中で使用される場合、導入されたという用語には、形質導入法およびトランスフェクション法の両方が含まれる。トランスフェクションは、非ウイルス法によって細胞に核酸を導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞に外来のＤＮＡまたはＲＮＡを導入するプロセスである。

本発明の操作された細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが含まれる多数の手段のうちの１つによる放出性タンパク質および保持タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの導入によって生成され得る。

核酸配列の導入前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体または抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の両方での処置によって、細胞を活性化および／または拡大することができる。本明細書中で使用される場合、「活性化された」は、増殖するか、分化するか、エフェクター機能を開始するように細胞が刺激されていることを意味する。

細胞活性化を測定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、フローサイトメトリーによる活性化マーカーの発現（ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３８、またはＨＬＡ－ＤＲの発現など）の測定または細胞内サイトカインの測定が含まれる。

本明細書中で使用される場合、「拡大増殖された」は、細胞または細胞集団が増殖するように誘導されていることを意味する。

細胞集団の拡大増殖を、例えば、集団中に存在する細胞数のカウントによって測定することができる。細胞の表現型を、フローサイトメトリーなどの当該分野で公知の方法によって決定することができる。

図に記載の実例となる核酸構築物は、列挙した順序で種々の構成要素を含む以下のポリタンパク質をコードする。１またはそれを超える本発明の核酸構築物は、図に示したポリタンパク質（単数または複数）；または本明細書中に記載のそのバリアントをコードし得る。

図２ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

図３ａ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

図３ｂ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

図３ｂ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

図４ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

図５ Ｎ末端からＣ末端の方向での構築物のアミノ酸配列

本開示は、本明細書中に開示の例示的な方法および材料に制限されず、本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、範囲を定義する数字を含む。別段の指示がない限り、それぞれ、任意の核酸配列を、左から右に５’から３’への方向で記載し；アミノ酸配列を、左から右にアミノからカルボキシへの方向に記載する。

値の範囲を提供する場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、前述の範囲の上限と下限との間の各々の介在値も、最小単位の１０分の１まで具体的に開示されていると理解される。任意の所定の値または所定の範囲内の介在値と任意の他の所定の値またはその所定の範囲内の介在値との間の各々のより小さい範囲が本開示に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して前述の範囲内に含まれても除外されてもよく、限度のいずれかまたは両方がより小さな範囲に含まれるか、含まれない各範囲も本開示内に含まれ、但し、所定の範囲内に任意の具体的に除外される限度があるものとする。所定の範囲が限度の一方または両方を含む場合、含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。

本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。

本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「～から構成される」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義であり、包括的または非制限であり、さらなる列挙されていない部材、要素、方法のステップを排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「～から構成される」には、用語「～からなる」も含まれる。

本明細書中で考察した刊行物を、本発明の出願日より前の開示のみを目的として提供している。本明細書において、かかる刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを承認すると解釈されるべきではない。

本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

実施例１－「デイジーチェーン」方式で連結されたバインダー
ＣＤ３ｅ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１に方向づけられた標的結合ドメインを、順次連結し、それに続いてＣ末端にＫＤＥＬ配列を連結する。構築物は、ＲＱＲ８マーカーに２Ａ自己切断ペプチドが続き、これにデイジーチェーン方式で結合されたバインダーが続き、Ｃ末端にＫＤＥＬ配列を有する（図２を参照のこと）。構築物を、ＰＤ１陽性Ｊｕｒｋａｔおよび活性化ＰＢＭＣに形質導入し、ＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ１の表面発現レベルをフローサイトメトリーによって評価する。

実施例２－ヘテロ多量体でカップリングされたタンパク質
ＣＤ３ｅおよびＢ２Ｍに方向づけられた標的結合ドメインを、κドメインを含むポリペプチド鎖上に提供し、ＰＤ１に対するさらなる標的結合ドメインを、第２のＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖上に提供し、これにＣ末端のＫＤＥＬ配列が続く。これらの２つのポリペプチド鎖は、２Ａペプチドによって分離された同一のプラスミド上にコードされるか（図３ａを参照のこと）、２つの個別のプラスミド上にコードされ、二重形質導入で使用される（図３ｂを参照のこと）。他の実施形態では、ＣＤ７９ヘテロ二量体に加えて２つのさらなるバインダーを付加することができる（図３ｃを参照のこと）。これらの構築物を、ＰＤ１陽性Ｊｕｒｋａｔおよび活性化ＰＢＭＣに形質導入し、ＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ１の表面発現レベルをフローサイトメトリーによって評価する。

実施例３－「ペプチド－タグ」で連結したバインダー
ＣＤ３ｅ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ１に方向づけられた標的結合ドメインを、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかをＡＬＦＡペプチド（小型のαヘリックスペプチド構造）でタグ化し、２Ａ自己切断ペプチドによって分離する。最後のポリペプチド鎖は、抗ＡＬＦＡ Ｄａｂタグ結合タンパク質（ＮｂＡＬＦＡ）に続いてＣ末端にＫＤＥＬ配列を含む（図４を参照のこと）。この構築物を、ＰＤ１陽性Ｊｕｒｋａｔおよび活性化ＰＢＭＣに形質導入し、ＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ１の表面発現レベルをフローサイトメトリーによって評価する。

実施例４－細胞外および細胞内の標的タンパク質に対する連結されたバインダー
Ｂ２ＭおよびＳＨＰ２に方向づけられた標的結合ドメインを、ＡＬＦＡペプチドでタグ化し、２Ａ自己切断ペプチドによって分離する（ＳＨＰ２タグ化バインダーは、サイトゾル局在化を確実にするためのシグナル配列を含まないであろう）。最後のポリペプチド鎖は、シグナル配列；抗ＡＬＦＡ Ｄａｂに続くＣＤ８ストーク；膜貫通ドメイン、リンカー；第２のゆらぎのある抗ＡＬＦＡ Ｄａｂ；短縮ＣＤ２０（そのＮ末端、ＴＭ、および小型のループを含む）、これにＣ末端上のＫＤＥＬ配列が続く（図５を参照のこと）。構築物をＰＤ１陽性Ｊｕｒｋａｔおよび活性化ＰＢＭＣに形質導入し、ＨＬＡの表面発現レベルをフローサイトメトリーによって評価する。隔離ＳＨＰ２の機能的意義を、同族リガンド（ＣＤ１９）およびＰＤＬ１を発現する標的細胞を有する共培養物に対する死滅、サイトカイン分泌、および増殖応答によって評価する。

実施例５－「「ペプチド－タグ」で連結されたバインダーについての概念実証実験
ＫＤＥＬ駆動ＴＣＲノックダウンが二重ポリペプチド鎖構築物によって媒介され得ることを実証するために、ＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする単一のポリペプチド；または以下の２つのポリペプチド鎖：ＡＬＦＡ＿ペプチドに連結された抗ＴＣＲ＿ＶＨＨをコードする第１のポリペプチド鎖；およびＫＤＥＬ配列に直接連結された抗ＡＬＦＡ＿ペプチド＿ＶＨＨをコードする第２のポリペプチド鎖（図６Ａ）のいずれかを発現するようにＰＢＭＣを形質導入した。２つのポリペプチドは、自己切断２Ａペプチドで分離されていた。負の対照として、ａＴＣＲ＿ＶＨＨを無関係のＶＨＨバインダーと置換した。全ての構築物は、形質導入用のＩＲＥＳ－ｅＢＦＰマーカーを含んでいた。

形質導入後４日目に、ＰＢＭＣを表面ＣＤ３について染色し、フローサイトメトリーによって分析した。独立した４ドナー由来の結果を、図６Ｂに示す。細胞表面でのＴＣＲの発現は、いずれかの抗ＴＣＲ－ＫＤＥＬを発現する細胞または以下の２つのポリペプチド鎖：抗ＴＣＲ ＶＨＨ－ペプチド；および抗ペプチドＶＨＨ－ＫＤＥＬを発現する細胞において劇的に減少した。以下の２つのポリペプチド鎖：無関係のＶＨＨ－ペプチド；および抗ペプチドＶＨＨ－ＫＤＥＬを発現する細胞においては、細胞表面ＴＣＲ発現は有意に減少しなかった。これは、ペプチドタグで連結したバインダーを抗ペプチドＫＤＥＬと共に使用して、ＴＣＲなどの標的タンパク質の細胞表面発現を遮断することができることを実証している。類似のアプローチを使用して、ペプチドタグが同一であるが異なる標的結合ドメインを有するペプチドタグで連結したバインダーを使用することにより、２つまたはそれを超えるタンパク質の表面発現を遮断または減少させることができる。かかるペプチドタグで連結したバインダー（すなわち、標的結合ポリペプチド）の両方または全ては、同一の抗ペプチド結合ＫＤＥＬ（すなわち、同一の局在化ポリペプチド）によって細胞内区画の内側に保持される。

上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発現がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (23)

1. （ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチド、および
   （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチド
   を含む、操作された免疫細胞。
2. （ｉ）各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む、少なくとも２つの標的結合ポリペプチド、および
   （ｉｉ）前記標的結合ポリペプチドの各々の第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチド
   を含む、請求項１に記載の操作された免疫細胞。
3. 前記細胞内保持シグナルが、以下の群：ゴルジ保持配列；トランスゴルジ網（ＴＧＮ）リサイクリングシグナル；小胞体（ＥＲ）保持配列；プロテアソーム局在化配列、およびリソソーム選別シグナルから選択される、請求項１または２に記載の操作された免疫細胞。
4. 前記細胞内保持シグナルが、
   ａ）ＳＥＫＤＥＬ（配列番号１）、ＫＤＥＬ（配列番号２）、ＫＫＸＸ（配列番号３）、ＫＸＫＸＸ（配列番号４）、配列ＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号５）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、配列ＭＨＲＲＲＳＲＳＣＲ（配列番号６）を含むＨＬＡインバリアント鎖の断片、ＫＸＤ／Ｅ（配列番号７）、またはＹＱＲＬ（配列番号８）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含むゴルジ保持配列；および／または
   ｂ）リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、またはシトクロムｂ５から選択される小胞体保持ドメイン；および
   ｃ）表１～５に示した任意の配列を含む細胞内保持シグナル
   から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の操作された免疫細胞。
5. 前記または各々の標的結合ドメインが、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、先行する請求項のいずれかに記載の操作された免疫細胞。
6. 前記または各々の標的結合ドメインが、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の構成要素、サイトカイン、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、免疫応答を下方制御する受容体、Ｔ細胞上に発現されるリガンド、または前記免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質に結合する、先行する請求項のいずれかに記載の操作された免疫細胞。
7. 前記または各々の標的結合ドメインが、以下の群：
   （ｉ）以下から選択されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体中の構成要素：ＣＤ３ε、ＴＣＲα、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、およびＣＤ３ζ；
   （ｉｉ）以下から選択されるＨＬＡクラスＩ分子：Β２－ミクログロブリン、α１－ミクログロブリン、α２－ミクログロブリン、およびα３－ミクログロブリン；
   （ｉｉｉ）以下から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲ；
   （ｉｖ）以下から選択される免疫応答を下方制御する受容体：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（Ｔｉｍ３）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、Ｆａｓ、ＴＢＲ２、ＬＡＧ３、およびタンパク質チロシンホスファターゼ；
   （ｖ）以下から選択されるＴ細胞上に発現されるリガンド：ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ２
   （ｖｉ）以下から選択される免疫応答をモジュレートするサイトゾルタンパク質：Ｃｓｋ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、Ｚａｐ－７０、ＳＬＰ７６、およびＡＫＴ
   から選択される標的に結合する、請求項６に記載の操作された免疫細胞。
8. 前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の操作された免疫細胞。
9. （ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
   （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする第２の核酸配列
   を含む、核酸構築物。
10. 以下の一般構造：
    Ａ－ｃｏｅｘｐｒ－Ｃ
    （式中、
    「Ａ」は、標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
    「ｃｏｅｘｐｒ」は、個別の実体として前記標的ポリペプチドおよび局在化ポリペプチドを共発現することができる配列であり；
    「Ｃ」は、局在化ポリペプチドをコードする核酸配列である）
    を有する、請求項９に記載の核酸。
11. （ｉ）各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする、複数の核酸配列、および
    （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列
    を含む、請求項９に記載の核酸構築物。
12. 以下の一般構造：
    Ａ－ｃｏｅｘｐｒ１－Ｂ－ｃｏｅｘｐｒ２－Ｃ
    （式中、
    「Ａ」は、第１の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり；
    「Ｂ」は、第２の標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列であり、
    「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同一でも異なっていてもよく、個別の実体として３つのポリペプチドを共発現することができる核酸配列であり；
    「Ｃ」は、局在化ポリペプチドをコードする核酸配列である）
    を有する、請求項１１に記載の核酸構築物。
13. （ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
    （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする第２の核酸配列
    を含む核酸配列のキット。
14. （ｉ）各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする、複数の核酸配列、および
    （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列
    を含む、請求項１３に記載の核酸配列のキット。
15. 請求項９～１２のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
16. （ｉ）標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第１のベクター、および
    （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクター
    を含むベクターのキット。
17. （ｉ）各々が標的結合ドメインおよび第１のタンパク質相互作用ドメインを含む標的結合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、複数のベクター、および
    （ｉｉ）前記第１のタンパク質結合ドメインに結合する第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持シグナルを含む局在化ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター
    を含む、請求項１６に記載のベクターのキット。
18. 請求項１～８のいずれかに記載の操作された免疫細胞を作製する方法であって、免疫細胞に、請求項９～１２のいずれかに記載の核酸構築物；請求項１３または１４に記載の核酸配列のキット；請求項１５に記載のベクター；または請求項１６または１７に記載のベクターのキットを、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に導入するステップを含む、方法。
19. 請求項１～８のいずれかに記載の複数の操作された免疫細胞を含む医薬組成物。
20. 疾患の処置および／または予防に使用するための、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 請求項１９に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、疾患を処置する方法。
22. 疾患の処置のための医薬の製造における請求項１～８のいずれかに記載の細胞の使用。
23. 前記疾患が癌である、請求項２０に記載の使用のための医薬組成物、請求項２１に記載の方法、または請求項２２に記載の使用。

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