KR101156085B1 - ４－１ｂｂ리간드（４－１ｂｂｌ）오중합체 및 이의 용도 - Google Patents

４－１ｂｂ리간드（４－１ｂｂｌ）오중합체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체 에 관한 것으로, 보다 구체적으로, COMP (cartilage oligomeric matrix protein)에 연결된 4-1BB리간드 (4-1BBL)를 포함하여 이루어지고, 4-1BB리간드 (4-1BBL)가 COMP에 의하여 오중합체를 형성하는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체에 관한 것이다. 본 발명의 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체는 T 세포의 4-1BB 수용체에 결합하여 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식과 T 세포의 활성 증가 및 증식에 사용될 수 있다. 또한, 대량생산된 항원 특이적 CD8+ T 세포는 항바이러스 조성물, 항종양 조성물, 항-자가면역질환 조성물을 포함하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화 조성물로서 각종 바이러스 감염질환, 암질환 및 자가면역질환 치료제로 사용될 수 있다.

Description

４－１ＢＢ리간드（４－１ＢＢＬ）오중합체 및 이의 용도 {Pentamerized 4-1BB ligand protein and use thereof}
본 발명은 COMP (cartilage oligomeric matrix protein)를 포함하는 오중합체를 형성하는 단백질에 연결된 4-1BB리간드 (4-1BBL)를 포함하여 이루어지는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체 및 이의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식과 관련된 용도에 관한 것이다.
환자 자신의 면역체계를 이용하여 암을 치료하기 위한 시도는 오랫동안 연구되어 왔으며, 암의 면역치료를 위한 주요 대상은 수지상세포 (Dentritic Cell)와 CD8+ T 세포이다 (O'Neill DW, Adams S, Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004. 104:2235-2246.; Xu D, Gu P, Pan PY, Li Q, Sato AI, Chen SH. NK and CD8+ T cell-mediated eradication of poorly immunogenic B16-F10 melanoma by the combined action of IL-12 gene therapy and 4-1BB costimulation. Int J Cancer. 2004. 109:499-506.; Freeman GJ, Sharpe AH, Kuchroo VK. Protect the killer: CTLs need defenses against the tumor. Nat Med. 2002. 8:787-789.). 수지상 세포는 강력한 항원 제시세포로서 표지된 항원에 대한 면역반응을 높은 수준으로 유도한다는 장점으로 인해 유망한 면역치료제 후보로 연구되어 왔다 (O'Neill DW, Adams S, Bhardwaj N. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. Blood. 2004. 104:2235-2246.; Preynat-Seauve O, Schuler P, Contassot E, Beermann F, Huard B, French LE. Tumor-infiltrating dendritic cells are potent antigen-presenting cells able to activate T cells and mediate tumor rejection. J Immunol. 2006. 176:61-67.). 그러나 최근의 보고들은 수지상세포의 기능적 다양성으로 인해, 생체 내에서 기대했던 면역증진 효과뿐 아니라, 면역억제 효과를 나타내는 경우도 있음을 보고하고 있다 (Zhang X, Huang H, Yuan J, Sun D, Hou WS, Gordon J, Xiang J. CD4-8- dendritic cells prime CD4+ T regulatory 1 cells to suppress antitumor immunity. J Immunol. 2005. 175:2931-2937.; Munn DH, Sharma MD, Hou D, Baban B, Lee JR, Antonia SJ, Messina JL, Chandler P, Koni PA, Mellor AL. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by plasmacytoid dendritic cells in tumor-draining lymph nodes. J Clin Invest. 2004. 114:280-290.). 수지상세포를 이용한 암치료방법 역시 궁극적으로는 CD8+ T 세포의 강력한 활성을 목적으로 하며, 유도된 CD8+ T 세포 항암반응이 면역기억 세포 (memory T cells)를 형성함으로써 암세포의 재발을 억제하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로 MHC class I/펩타이드 멀티머 (peptide multimer)를 이용하여 항원 특이적인 CD8+ T 세포를 분리하지만 (Valmori D, Pittet MJ, Rimoldi D, LiD, Dunbar R, Cerundolo V, Lejeune F, Cerottini JC, Romero P. An antigen-targeted approach to adoptive transfer therapy of cancer. Cancer Res. 1999. 59:2167-73.), 이 방법의 경우 세포 분리 후 세포 자살에 의한 사멸률이 높아 충분한 양의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 생산하기 위해 장기간 배양을 해야 하는 단점이 있었다. 따라서 TCR을 자극하는 MHC 멀티머 (MHC multimer)를 대체하여 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리 할 수 있는 대리 표지자 (surrogate marker)가 필요하였다.
4-1BB는 유도성 공동자극 분자로 활성화된 T 세포에서 발현되며, 특히 CD8+ T 세포의 활성을 증진시킬 뿐 아니라, Bcl-2, Bcl-XL, Bfl-1 등과 같은 항세포 사멸 분자 (anti-apoptotic molecule)들의 발현을 증가시켜 활성 후 세포사멸 (AICD; activation-induced cell death)을 억제하는 기능을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다 (Kim YH, Seo SK, Choi BK, Kang WJ, Kim CH, Lee SK, Kwon BS. 4-1BB costimulation enhances HSV-1-specific CD8+ T cell responses by the induction of CD11c+CD8+ T cells. Cell Immunol. 2005. 238:76-86.; Shuford WW, Klussman K, Tritchler DD, Loo DT, Chalupny J, Siadak AW, Brown TJ, Emswiler J, Raecho H, Larsen CP, Pearson TC, Ledbetter JA, Aruffo A, Mittler RS. 4-1BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cell proliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cell responses. J Exp Med. 1997. 186:47-55.; Cannons JL, Lau P, Ghumman B, DeBenedette MA, Yagita H, Okumura K, Watts TH. 4-1BB ligand induces cell division, sustains survival, and enhances effector function of CD4 and CD8+ T cells with similar efficacy. J Immunol. 2001. 167:1313-1324.; Hurtado JC, Kim YJ, Kwon BS. Signals through 4-1BB are costimulatory to previously activated splenic T cells and inhibit activation-induced cell death. J Immunol. 1997. 158:2600-2609.).
이에 본 발명자는 한국공개특허 제2008-84308호에서 항원 특이적으로 활성화된 CD8+ T 세포의 사람 4-1BB(h4-1BB)의 발현을 이용하여 항-4-1BB 항체를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식 방법을 확립한 바 있다. 그러나 항체의 경우 in vitro 및 in vivo 반감기가 길고, Fc receptor에 부착하여 작용함으로써 항체의 효과가 나타나기 때문에 Fc receptor를 통한 신호전달과 항체가 인식하는 표적 단백질을 통한 신호전달의 효과가 통합되어 전체 결과가 나타나게 된다. 또한 동일한 항원에 대해 다양한 항체가 존재하는 경우가 많으며, 이들이 서로 조금씩 다른 효과가 나타나게 된다.
이러한 항체의 문제점을 대체할 수 있는 방법으로 h4-1BBL 단백질을 이용한 방법이 제시되었다. 그러나 단량체 (monomer)형태의 재조합 h4-1BB 및 h4-1BBL 단백질은 낮은 친화력을 가지고 있으며, 이를 극복하기 위해 자연계의 h4-1BB 및 h4-1BBL 단백질은 삼중합체 (trimer) 형태로 결합하는 것으로 알려져 있다 (Idriss HT, Naismith JH. TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure-function relationship(s). Microsc Res Tech. 50(3):184-95. 2000.).
이에 본 발명자들은 효율적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리 및 증식시킬 수 있는 4-1BBL 단백질을 이용한 중합체를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 펜타머(pentamer)를 구성하는 human COMP (cartilage oligomeric matrix protein) (Malashkevich VN,Kammerer RA, Efimov VP, Schulthess T, Engel J. The crystal structure of a five- stranded coiled coil in COMP: a prototype ion channel Science. 274:761-5. 1996.) 일부 단백질의 C 말단에 h4-1BBL 단백질의 세포외 도메인 (extracellular domain)을 결합하여 발현시킨 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체가 이합체 (dimer) 및 삼중합체 (trimer) 형태의 h4-1BBL보다 우수한 T 세포 증식력을 가짐을 확인하고 생산된 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 이용하여 성공적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리 및 증식시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 하기에 기재된 논문 및 특허문헌이 참조되고 참조된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 한 목적은 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식과 T세포의 활성 증가 및 증식과 관련된 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적으로, 대량 생산된 상기의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 포함하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화 조성물로 사용되고, 상기 조성물은 항바이러스 조성물, 항종양 조성물, 항-자가면역질환 조성물을 포함하며 상기 조성물은 각종 바이러스 감염질환, 암질환 및 자가면역질환 치료제로 사용되는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 오중합체를 형성하는 단백질, 바람직하게는 COMP (cartilage oligomeric matrix protein)에 연결된 4-1BB리간드 (4-1BBL)를 포함하여 이루어지고, 4-1BB리간드 (4-1BBL)가 COMP에 의하여 오중합체를 형성하는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체에 관한 것이다.
본 발명의 오중합체를 구체적으로 설명한다. 본 발명의 오중합체를 형성하는 단백질은 연골 올리고머 기질 단백질 (cartilage oligomeric matrix protein)이며, 바람직하게는 COMP이다.
본 발명에 있어서 COMP 및 4-1BB리간드(4-1BBL)는 바람직하게는 인간 유래이며, 보다 바람직하게는 상기 COMP의 아미노산 서열은 COMP (GENBANK access No.BC110847) 의 전체 아미노산 서열 또는 그 서열 중 아미노산 잔기 29 내지 73과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열이고, 4-1BB리간드(4-1BBL)의 아미노산 서열은 4-1BB리간드 (GENBANK access No.BC104805)의 전체 아미노산 서열 또는 그 서열 중 아미노산 잔기 69 내지 245와 90% 이상의 동일성을 갖는 서열이다. 가장 바람직하게는 human COMP (cartilage oligomeric matrix protein)의 일부인 29번부터 73번(hCOMP29-73, 서열번호 11) 및 human 4-1BB리간드(h4-1BBL)의 일부인 69번부터 245번까지의 세포외 도메인을 포함(h4-1BBL69-245, 서열번호 5)하는 오중합체이다.
본 발명의 일 실시예의 오중합체에 있어서, 본 발명자는 이합체를 형성하는 GCN4 (eukaryotic transcriptional activator protein, Heuck A, Du TG, Jellbauer S, Richter K, Kruse C, Jaklin S, MM, Buchner J, Jansen RP, Niessing D. Monomeric myosin V uses two binding regions for the assembly of stable translocation complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:19778-83. 2007.), 삼중합체를 구성하는 MAT-1 (Matrilin-1, Wu JJ, Eyre DR. Matrilin-3 forms disulfide-linked oligomers with matrilin-1 in bovine epiphyseal cartilage. J Biol Chem. 273(28):17433-8. 1998.), 그리고 오중합체를 구성하는 COMP (cartilage oligomeric matrix protein, Malashkevich VN, Kammerer RA, Efimov VP, Schulthess T, Engel J. The crystal structure of a five-stranded coiled coil in COMP: a prototype ion channel Science. 274:761-5. 1996) 단백질 중 다중결합체를 매개하는 부위의 C-말단에 h4-1BBL69-245을 결합하여 발현시킴으로써 이합체, 삼중합체, 오중합체 형태의 h4-1BBL를 제작하여, 이들의 T 세포 활성율, 항원 특이적 CD8+ T 세포내 신호전달율, 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식율을 조사함으로써, 오중합체 형태인 4-1BBL가 항-4-1BB 항체와 유사하거나 더 높은 수준의 항원 특이적 CD8+ T 세포 증식율, Th1 타입 사이토카인 발현을 나타냄으로써 우수함을 갖는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 사람의 혈액 내 Cytomegalovirus (CMV) pp65 특이적 CD8+ T 세포를 분리 및 증식한 후, CMV pp65/MHC multimer를 이용하여 증식된 세포의 순도를 측정한 결과, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체가 항-4-1BB 항체보다 항원특이적인 세포가 증가하는 우수한 효과가 있음을 확인함으로써 항-4-1BB 항체를 대신하여 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 사용하여 다양한 항원 특이적 CD8+ T 세포 분리에 적용할 수 있음을 실험적으로 입증할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 항체가 아닌 재조합 단백질 다중합체(multimer)를 이용하여 효과적으로 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리할 수 있으며, 분리과정 동안 CD8+ T 세포에 4-1BB 신호를 전달하여 분리된 세포의 증식을 촉진할 수 있다.
본 발명의 관점은 상기 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식과 T세포의 활성 증가 및 증식과 관련된 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체와의 결합을 이용하여 혈액시료로부터 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리할 수 있다.
본 발명에 있어서 바람직하게는, 상기 4-1BB 특이적 CD8+ T 세포의 분리는, 혈액으로부터 분리된 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)를 배양배지에서 항원 펩타이드를 첨가하여 함께 배양하여 상기 4-1BB에 특이적인 CTL (CD8+ T lymphocyte)을 형성하는 제 1 단계; 상기 제 1 단계의 배양물을 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체와 함께 배양하여 상기 항원 특이적 4-1BB+ CTL과 오중합체를 이룬 (pentamerized) h4-1BB 리간드를 결합시키는 제 2 단계; 및 상기 제 2 단계의 배양물로부터 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체와 특이적으로 결합한 세포만을 분리하는 제 3 단계;로 이루어짐을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 제 1 단계의 항원 펩타이드는 바이러스 또는 암항원에서 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 바이러스 유래 펩타이드는 CMV (Cytomegalovirus) 펩타이드, EBV (Epstein-barr Virus) 펩타이드, 및 hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 펩타이드 중에서 선택된다. 또한 바람직하게는 상기 암항원 유래 펩타이드는 WT-1 (Wilm's Tumor-associated gene) 펩타이드, MAGE 계열의 각종 Test 항원으로 알려진 항원유래 펩타이드, 서바이빈 (survivin) 및 NY-ES01유래 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 제 1 단계의 배양 배지는 자가 혈장 또는 자가 혈청 및 인간 IL-2가 포함된 배지인 것이 바람직하다. 또한, 상기 제 1 단계의 배양은 12일 내지 16일 동안 배양되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제 2 단계의 배양은 1 내지 3시간 배양함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 제 1 단계와 관련하여, CMV pp65 펜타머 양성인 자원자의 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후, 2x106 cells/ml 농도로 15ml 튜브에 분주한 후, 1ug/ml 농도로 CMV pp65 펩타이드 (NLVPMVATV)를 첨가하였다. 배양 48시간 후, 50IU/ml 재조합 인간 IL-2 (Proleukin)가 포함된 배지를 첨가하여 세포증식을 촉진하였다. 세포배양 7일째부터 1ml의 배지를 제거한 후, 다시 새로운 IL-2가 포함된 1ml의 배지를 첨가하였으며, 이틀 간격으로 이를 반복하였다. 배양 14일째, 세포를 수거하였으며, CMV pp65 펩타이드를 1ug/ml 농도로 첨가하여 배양함으로써 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포의 재활성화를 유도하고, 24시간 후, 세포를 수거하여 유세포 분석을 통해 4-1BB의 발현을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 제 2 단계 및 제 3 단계와 관련하여, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 10ug/ml 농도로 하루 동안 코팅한 배양 플레이트를 PBS로 5회 세척한 후, 4-1BB를 발현하는 세포를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양 플레이트를 PBS로 부드럽게 세척하여 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체와 특이적으로 결합한 세포만을 분리하였다.
상기 분리된 세포를 수거하여 항-4-1BB 항체에 의해 또는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체에 의해 분리된 세포의 CMV pp65 특이성을 유세포 분석하였으며, 양쪽 모두 95% 이상의 순도로 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포가 분리되었음을 확인하였다 (도 3A).
본 발명의 또 다른 양태는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체를 사용하여 항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량 증식을 통한 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체의 CD8+ T 세포 활성화 조성물로서의 용도를 제공한다. 본 발명의 항원 특이적 CD8+ T 세포는 바이러스 또는 암항원 유래의 항원 펩타이드에 특이적일 수 있으며, 바람직하게는 CMV (Cytomegalovirus) 펩타이드, EBV (Epstein-barr Virus) 펩타이드, 및 hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 펩타이드를 포함하는 바이러스 유래 펩타이드 및/또는 WT-1 (Wilm's Tumor-associated gene) 펩타이드, MAGE 계열의 각종 Test 항원으로 알려진 항원유래 펩타이드, 서바이빈 (survivin) 및 NY-ES01유래 펩타이드를 포함하는 암 항원 유래 펩타이드에 특이적인 CD8+ T 세포일 수 있다. 상기와 같이 본 발명의 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체는 바이러스 유래 펩타이드 및/또는 암 항원 유래 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포를 대량증식 시킬 수 있기 때문에 항바이러스 조성물 및 항종양 조성물로서 기능할 수 있으며, 자가면역질환의 발병을 억제하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화 조성물로서 항-자가면역질환 조성물로서 기능할 수 있다. 상기 조성물은 각종 바이러스 감염질환, 암질환 및 자가면역질환 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증식은 IL-2가 포함된 배지에서 배양함을 특징으로 한다. 또한, 상기 배양은 14일 내지 28일 배양함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 분리된 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포는 1000 IU/ml 농도의 IL-2 조건에서 2주간 대량 증식시켰다. 배양 28일째 증식된 CD8+ T 세포를 CMV pp65 펩타이드로 재활성화시켜 IFN-γ 발현수준을 측정하였을 때 두 가지 조건에서 분리 및 증식시킨 CD8+ T 세포의 80% 이상이 IFN-γ를 높은 수준으로 발현함을 확인하였다 (도 3B). 또한 CD8+ T 세포의 세포독성을 측정하기 위해 CMV pp65 펩타이드(peptide) 처리 후 세포 표면에 발현되는 CD107a (LAMP-1)의 발현비율을 측정하였으며, 그 결과 50% 이상의 세포에서 세포독성이 있는 것으로 나타났다 (도 3B).
본 발명의 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 단백질을 항-4-1BB 항체와 비교하기 위하여 본 발명의 일 실시예에서는, 최종 배양 후 30ml의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 이용하여 28일간 증식시킨 세포의 수를 계산하였을 때 약 5 - 6 x 107 세포 수준이었으며, 항-4-1BB 항체 및 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 모두 비슷한 비율이었다 (도 3C). 또한 증식된 세포의 수를 증가율로 환산할 경우, 양쪽 모두 약 1250배 정도의 증가율을 나타내었다. 즉, 이러한 결과들은 재조합 단백질인 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체가 항-4-1BB 항체를 대체하여 사용가능함을 증명하고 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 높은 수준의 항원 특이적 CD8+ T 세포를 증식할 수 있는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 얻을 수 있으며 상기 오중합체는 in vitro 에서는 T 세포의 4-1BB 수용체에 결합하여 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식에 사용될 수 있으며, T 세포의 활성 증가 및 증식에 사용될 수 있다. 그리고 대량생산된 항원 특이적 CD8+ T 세포는 in vivo 에서는 암세포 및 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 기능과 함께 자가면역질환의 발병 억제 기전을 나타내므로, 항바이러스 조성물 및 항종양 조성물을 포함하고 자가면역질환의 발병을 억제하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화 조성물로서 각종 바이러스 감염질환, 암질환 및 자가면역질환 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 h4-1BBL 멀티머의 생산을 나타낸 것으로, h4-1BBL 세포외 도메인과 GCN4, MAT-1, COMP를 결합하여 CHO 세포 발현 플라스미드 벡터인 pD18에 클로닝하여 수행하였다.
(A) 각 DNA 컨스트럭트의 유전자 배열 및 제한효소 위치 및 발현되는 단백질의 모식도. (B) CHO 세포 배양 상층액으로부터 분리 정제한 GCN4-h4-1BBL을 2-ME가 포함된 (+ 2-ME) 시료 완충액 또는 2-ME가 포함되지 않은 (2-ME) 시료 완충액을 이용하여 SDS-PAGE 수행 후, 항-h4-1BBL 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과. (C) MAT-1-h4-1BBL의 웨스턴블랏 결과. (D) 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체의 웨스턴블랏 결과.
도 2는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체에 의한 효과적인 CD8+ T 세포 증식 촉진 및 Th1 사이토카인 발현을 나타낸 것이다. PBMC로부터 분리한 CD8+ T 세포를 분리하여, 96 웰 플레이트에 2X105 농도로 분주하였다. CD8+ T 세포증식을 유도하기 위해 anti-CD3 항체 (OKT3)를 0.05ug/ml 농도로 처리하였다.
(A) 동시에 GCN4-h4-1BBL (GCN4), MAT-1-h4-1BBL (cMAT), Pentamerized-h4-1BBL (COMP)를 120ng/ml 또는 240ng/ml로 처리하였으며, 대조군으로 항-4-1BB mAb인 4B4 또는 20.G4를 5ug/ml 농도로 처리하였다. (B) GCN4-h4-1BBL, MAT-1-h4-1BBL, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체의 4-1BBL를 중화시키기 위해 각각의 h4-1BBL multimer와 항-h4-1BBL 항체 (5G11; 5ug/ml)를 섞은 후, 항-CD3 항체로 활성화한 CD8+ T 세포에 처리하였다. 세포를 37℃ CO2 배양기에서 72시간동안 배양하였으며, 마지막 8시간동안 1uCi/well 농도의 [3H]-thymidine으로 표지하였다. 방사선 표지 정도는 liquid scintillation spectroscopy. (C) 배양 48시간째에 수거한 상층액으로부터 CBA kit를 이용하여 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5, TNF-α의 농도를 측정하였다.
도 3은 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포 분리 및 증식을 나타낸 것이다. 정상 자원자의 혈액 30ml로부터 Ficoll-hypaque을 이용하여 PBMC를 분리하였으며, 2x106 cells/ml 농도로 희석한 후, 15ml 튜브에 1ml씩 분주하였다. 동시에 CMV pp65 펩타이드를 1ug/ml 농도로 처리하여 배양하였다. 배양 48시간 후, 50IU/ml 재조합 인간 IL-2 (Proleukin)가 포함된 배지를 첨가하여 세포증식을 촉진하였다. 세포배양 7일째부터 1ml의 배지를 제거한 후, 다시 새로운 IL-2가 포함된 1ml의 배지를 첨가하였으며, 이틀 간격으로 이를 반복하였다. 배양 14일째, 세포를 수거하여 CMP pp65 펩타이드를 1ug/ml 농도로 첨가함으로써 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포의 재활성화를 유도하였다. 24시간 후, 세포를 수거하여 유세포 분석을 통해 4-1BB의 발현을 확인하였다. 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 또는 항-4-1BB 항체가 코팅된 배양플레이트에 4-1BB를 발현하는 세포를 분주하여 37℃ CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다.
(A) 배양플레이트에 부착된 4-1BB+ 세포를 수거하여 항-CD8-FITC와 CMV pp65 펜타머-Pe (pCMV)로 염색하여 유세포 분석하였다. (B) 분리된 세포를 1000IU/ml IL-2가 포함된 배지를 이용하여 증식시켰으며, 배양 28일째 CMV pp65 펩타이드 처리 후, 항-CD8-FITC와 항-IFN-γ-PE 또는 항-CD8-PE와 항-CD107a-biodm로 염색하여 각각의 발현을 유세포 분석하였다. (C) 배양 28일째 최종 증식된 세포의 수를 계수. (D) 증식된 세포의 증식율.
본 발명은 4-1BBL가 오중합체를 구성하는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체 및 이의 항원 특이적 CD8+ T세포의 분리 및 증식과 관련된 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유전자 컨스트럭트 및 클로닝
4-1BBL는 TNFSF (TNF superfamily)중 하나로, 삼중합체 (trimer)를 형성하여 수용체인 4-1BB와 결합하는 것으로 알려져 있다 (Rabu C, QuA, Jacques Y, Echasserieau K, Vusio P, Lang F. Production of recombinant human trimeric CD137L (4-1BBL). Cross-linking is essential to its T cell co-stimulation activity. J Biol Chem. 280:41472-81. 2005.). 따라서 본 실시예에서는 항-4-1BB 항체를 대체하기 위한 목적으로 4-1BBL 세포외 도메인을 다이머, 트라이머, 펜타머 형태로 제작함으로써 4-1BB 신호전달과 CD8+ T 세포의 분리에 적합한 형태의 4-1BBL 다중합체 제작을 수행하였다.
즉, 본 실시예에서는 CHO 세포주 단백질 발현용 플라스미드 벡터인 pD18 (CD5L-FLAG tag 포함)에 GCN4-h4-1BBL, MAT-1-h4-1BBL, COMP-h4-1BBL을 BamH I / Not I site로 클로닝하였다. GCN4는 다이머를, MAT-1은 트라이머를, COMP는 펜타머를 형성하기 때문에 이들 각각의 단백질과 결합한 형태로 발현되는 h4-1BBL 역시 다이머, 트라이머, 펜타머를 형성할 것으로 기대하였다 (도 1A). 각각의 DNA 컨스트럭트를 CHO 세포에 감염(transfection)시켰으며, MTX의 농도를 점차 증가시켜 높은 수준으로 h4-1BBL을 발현하는 CHO 세포주를 선별하였다. 대량배양을 통해 단백질을 생산하였으며, 항-h4-1BBL mAb를 고정(immobilization)한 친화 컬럼(affinity column)을 제작하여 각각의 단백질을 분리하였다.
1-1 유전자 컨스트럭트
먼저, pD18 vector에 신호 서열인 CD5L와 FLAG-tag을 가지고 있는 상태에서 h4-1BBL69-245와 효모 GCN4, human matrilin 1 (MAT-1), 또는 인간 cartilage oligomeric matrix protein (COMP)와 결합시켜 클로닝하였다 (표 1). FLAG-tag을 제거한 컨스트럭트 (construct)도 제작하였고, 효력이 FLAG-tag가 있을 때와 동등하였다.
CD51-24, FLAG, h4-1BBL69-245, GCN4250-280, hMAT-1454-496 및 hCOMP29-73 의 아미노산 서열 및 DNA 서열
유전자 아미노산 서열(서열번호) DNA 서열(서열번호)
CD5L MPMGSLQPLATLYLLGMLVASV
(서열번호 1)		 ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCGTG
(서열번호 2)
FLAG DYKDDDDK
(서열번호 3)		 GACTACAAGGACGACGATGACAAG
(서열번호 4)
h4-1BBL SPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIP
(서열번호 5)		 AGCCCGAGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCA
(서열번호 6)
GCN4 MKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGE
(서열번호 7)		 ATGAAACAACTTGAAGACAAGGTTGAAGAATTGCTTTCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAA
(서열번호 8)
hMAT-1 EEDPCACESLVKFQAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTVV
(서열번호 9)		 GAGGAAGACCCGTGTGCCTGCGAGTCCCTGGTGAAATTCCAAGCCAAAGTGGAGGGGCTGCTGCAGGCCCTGACCAGGAAACTGGAAGCTGTGAGTAAGCGGCTGGCCATCCTGGAGAACACAGTTGTC
(서열번호 10)
hCOMP DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG
(서열번호 11)		 GACCTGGGCCCGCAGATGCTTCGGGAACTGCAGGAAACCAACGCGGCGCTGCAGGACGTGCGGGAGCTGCTGCGGCAGCAGGTCAGGGAGATCACGTTCCTGAAAAACACGGTGATGGAGTGTGACGCGTGCGGG
(서열번호 12)
1-2 클로닝
1-2-1 PCR 반응
PCR 은 94℃에서 5분간 전 변성 (pre-denaturation), 94℃에서 30초간 변성 , 어닐링은 유전자에 따라 온도에 따라 변화는 있지만 기본 시간은 30초를 하였으며 신장 (elongation)은 72℃에서 30초 신장하였으며, 마지막으로 72℃에서 7분간 후-신장 (post-elongation) 조건으로 실시하였다.
각각의 유전자 증폭에 사용한 primer의 서열은 다음과 같다.
GCN4 F: GGATCCATGAAACAACTTGAAGAC (24mer ) - BamHI (서열번호 13)
R: GAATTCTTCGCCAACTAATTTCTT (24mer ) - EcoRI (서열번호 14)
hMAT1 F: GGATTCGAGGAAGACCCGTGTGCC (24mer ) - bamHI (서열번호 15)
R: GAATTCGACAACTGTGTTCTCCAG (24mer ) - EcoRI (서열번호 16)
hCOMP F: GGATCCGACCTGGGCCCGCAGATG (24mer ) - BamHI (서열번호 17)
R: GAATTCCCCGCACGCGTCACACTC (24mer ) - EcoRI (서열번호 18)
h4-1BBL F: GAATTCAGCCCGAGACTCCGCGAG (24mer ) - EcoRI (서열번호 19)
R: GCGGCCGCTTATGGGATTTCGGGGGT (26mer ) - Not I (서열번호 20)
h4-1BBL을 포함하는 재조합 4-1BBL 유전자를 증폭하기 위해 위의 프라이머를 사용하여 56℃에서 35 사이클 동안 증폭하였으며, GCN4는 40℃ 어닐링 조건에서 30 사이클, MAT-1은 45℃ 어닐링 조건에서 30 사이클, hCOMP는 60℃ 어닐링 조건에서 30 사이클 동안 유전자를 증폭하였다.
1-2-2 T 벡터로 클로닝 (Cloning into T vector)
각각의 PCR 산물은 pGEM T easy vector (promega)에 라이게이션 (ligation)하기 위해 insert와 vector를 3:1 비율로 섞었으며, 리가아제 (promega)와 2X buffer를 첨가하여 16℃에서 2 시간동안 배양하였다. 리게이트를 DH5α competent cell에 형질전환 (standard molecular method를 이용)한 후 X-gal 과 IPTG 을 넣어 color selection하여 양성 콜로니 (positive colony) 만 선정하였다. 최종 선정된 클론을 시퀀싱 (sequencing)하여 염기서열을 확인함으로써 각각의 최종 클론을 선정하였다.
1-2-3 pD18 벡터로 클로닝 (Cloning into pD18 vector)
GCN4, MAT-1, COMP을 포함하고 있는 T 벡터 클론은 BamH I / EcoR I으로, h4-1BBL이 포함된 T 벡터 클론은 EcoR I / Not I으로 한시간 동안 절단 (digestion)하여 각각의 유전자 단편을 준비하였으며, 동시에 CD5L-FLAG이 포함된 pD18 벡터는 BamH I / Not I으로 한시간 동안 절단 (digestion)하여 벡터 단편을 준비하였다. 삽입(Insert)과 벡터를 3:1 비율로 섞었으며, 리가제 (promega)와 2X 버퍼를 첨가하여 16℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 리게이트를 DH5α competent cell에 형질전환 (standard molecular methods을 이용)한 후, 콜로니를 형성시켰으며, 각각의 콜로니를 LB-Amp 배지에 접종하여 각 클론을 배양하였다.
배양액으로부터 알카라인 라이시스 방법 (Alkalline lysis method)을 이용하여 (solution I, II, III 그리고 isopropanol, 70% ETOH, RNase 을 이용) 플라스미드 DNA를 분리한 후, BamH I / Not I으로 한시간 동안 digestion하여 예상되는 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 양성으로 선정된 클론을 시퀀싱(sequencing)하여 최종 클론을 선정하였으며, 각각을 pD18-GCN4-h4-1BBL, pD18-MAT1-h4-1BBL, pD18-COMP-h4-1BBL으로 명명하여 사용하였다.
<실시예 2> GCN4-h4-1BBL, MAT1-h4-1BBL, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체를 발현하는 CHO세포의 선택
2-1 감염 (Transfection)
Chinese hamster ovary (CHO) 세포주는 CHO 302 Medium (JRH, U.S.A.)에 1mM 소디움 피루베이트, 재조합 인슐린 (Recombulin. TM. Zn, Gibco-BRL) 0.5㎍/ml, 2mM L-글루타민, 1X HT을 첨가하여 사용하였으며, 5% CO2 / 37℃ 배양기에서 배양하였다.
pD18-GCN4-h4-1BBL, pD18-MAT1-h4-1BBL, pD18-pentamerized-h4-1BBL DNA를 5X106 DHFR-결핍 CHO (DHFR- CHO) 셀에 500V, 825㎌ (Bio-Rad)로 전기 천공(eletroporation)하였다. 20nM MTX를 포함하는 50ml CHO 세포 배지 (1mM 소디움 피루베이트, recombulin 0.5㎍/ml, 2mM L-글루타민)에 전기천공 (electroporation)한 세포를 현탁하였으며, 이를 96 웰 조직 배양 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. 37℃ CO2 배양기에서 10일 동안 배양한 후 20nM CHO 302 배지를 100 ㎕ 더 첨가하여 4일 동안 배양하였다.
2-2 스크리닝 (Screening)
CHO 세포를 이용한 4-1BBL 멀티머 단백질의 발현을 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하였다. 코팅 완충용액 (PBS, pH7.4)에 항-4-1BBL mAb (5G11; 이뮤노믹스 (주))을 2㎍/ml농도가 되도록 준비한 뒤에 ELISA 용 96 웰 플레이트 (Nunc Brand product)에 각 웰 당 100 ㎕ 씩 분주하고 4℃ 에서 하루 동안 코팅한다. 블록킹 완충용액 (4% BSA in PBS)을 100 ㎕ 씩 분주하고 37℃ 2시간동안 블록킹 하였다. PBS-T (0.05% Tween20 in PBS)으로 200 ㎕ 씩 분주하여 2번 세척하였다. h4-1BBL 멀티머 단백질이 포함된 배양 상층액을 100 ㎕/웰로 37℃ 1 시간 반응시켰다. PBS-T를 200 ㎕씩 분주하여 4번 세척한 후 항-4-1BBL mAb (4H3-biotin, 이뮤노믹스 (주))를 웰 당 100 ㎕ 분주하여 37℃, 1 시간 반응을 시켰다. PBS-T를 200 ㎕ 씩 분주하여 4회 세척한 후 1/2000로 PBS에 희석한 HRP-스트랍타비딘 (R&D systems)을 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 37℃ 에서 1 시간 반응을 시켰다. PBS-T를 200 ㎕/웰로 플레이트를 4회 세척한 후, ABTS system을 이용하여 30분 동안 발색하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도가 최대인 웰의 CHO 세포를 96 웰 플레이트에 대시 분주 한 후, MTX의 농도를 50 nM로 증가시켜 위와 동일한 과정을 수행하였으며, 그 후 MTX의 농도를 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM로 올려가며 계속적으로 반복하여 가장 높은 수준의 m4-1BBL 멀티머를 생산하는 클론을 스크리닝하였다.
2-3 Wave Bioreactor를 이용한 대량생산
CHO 302 cell 배지 200 ml와 선택된 클론 (GCN4-, MAT-1-, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체) 7X105 cells/ml 를 cell bag 에 넣어 배양하였다 (rocking speed:17rpm, CO2:10%, angle:7, temperature:37℃). 배양 24 시간째 CO2를 5%로 줄였으며, 매일 샘플링하여 pH와 세포의 수를 측정하였다. 배양 2-3 일째 세포의 수가 2X106 cells/ml이 되어 배양 부피를 1L가 되도록 800 ml 의 CHO 302 배지을 넣어 준 후 다시 배양하였다 (rocking speed : 20rpm, angle : 7.5 나머지는 동일). 그리고 매일 샘플링하여 pH와 세포활성도 (cell viability)를 확인하였으며, 세포의 활성도가 40-50%로 감소되었을 때 세포를 수거하였다.
2-4 DSS (Disuccinimidyl suberate)을 이용한 항체 친화 겔 만들기
프로테인 G-아가로스 레진 2 ml를 컬럼에 옮긴 후, PBS 3 ml로 3번 세척하였다. 그리고 500㎍의 항-4-1BBL mAb (4H3-biotin, 이뮤노믹스 (주))를 PBS에 전체부피가 1 ml가 되도록 맞춘 뒤 프로테인 G-아가로스가 들어있는 컬럼에 채워 상온에서 한시간 동안 배양하였다. 그리고 결합되지 않은 항체(unbound Ab) 을 제거하기 위하여 PBS 3 ml를 첨가하여 조심스럽게 현탁하여 세척하였으며 이 과정을 2-3회 반복하였다. 마지막 세척 후 1ml PBS를 채워 부드럽게 현탁한 후, 13mg/ml DSS (sigma)를 50㎕ (0.625 mg)을 넣어 준 뒤 조심스럽게 현탁하여 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. DSS와 짝을 이루지 않은 Ab(uncoupled Ab)를 제거하기 위하여 3 ml의 0.1M 글리신 (pH 2.5)로 5회 세척하였다. 다시 3 ml PBS로 두 번 세척하여 단백질의 분리에 사용하였다.
2-5 친화 정제 (Affinity purification)
상기 실시예 3-4에서 제작된 4H3-프로테인 G 친화 겔을 이용하여 h4-1BBL 다중합체 단백질을 정제하였다. PBS로 친화 겔을 세척한 후, h4-1BBL 다중합체를 포함한 배양 상층액을 컬럼에 채워 통과시켰다. PBS로 컬럼을 세 번 세척한 후 0.1M glycine (pH2.5)을 넣어서 단백질을 용출하였다. 분리된 단백질은 PBS 투석한 후, 정량하여 다음실험에 사용하였다.
2-6 분리된 단백질의 확인
또한 상기 분리된 각각의 단백질의 크기와 다중합체화 (mutimerization)를 확인하기 위해 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol, 2-ME)이 포함된 시료 완충용액과 포함되지 않은 시료 완충용액으로 단백질을 전기 영동하여 항-4-1BBL 항체로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
다이머를 형성할 것으로 예상되는 GCN4-h4-1BBL의 경우, 2-ME를 첨가할 경우 26KDa 크기의 크기가 나타났으며, 2-ME를 첨가하지 않아 멀티머를 형성시킬 경우, 52KDa의 크기에서 4-1BBL가 검출되었다 (도 1B). 따라서 GCN4-h4-1BBL은 예상처럼 다이머를 형성하는 것으로 확인되었다.
MAT-1-h4-1BBL의 경우 모노머의 크기는 27.8KDa이었으며, 멀티머의 경우 83KDa의 크기에서 검출됨으로써, 트라이머가 형성되는 것으로 확인되었다 (도 1C).
COMP-h4-1BBL의 경우 모노머는 약 28KDa의 크기였으며, 멀티머의 경우 약 140KDa의 크기에서 검출되었다. 따라서 COMP-h4-1BBL은 펜타머를 형성하는 것으로 확인되었다 (도 1D).
이 결과들은 각 컨스트럭트가 다이머, 트라이머, 펜타머를 정상적으로 형성되었음을 증명한다.
<실시예 3> 증식 분석 (Proliferation assay)
본 실시예에서는 4-1BBL 다이머, 트라이머, 펜타머에 의한 인간 CD8+ T 세포의 증식율 증가여부를 조사하기 위해, 실시예 2에서 분리 정제한 h4-1BBL 다이머, 트라이머, 펜타머를, 분리한 CD8+ T 세포에 처리하여 CD8+ T 세포 증식율의 변화를 측정하였다.
3-1 CD8+ T세포의 분리
자원자로부터 혈액 30 ml을 채혈하였으며, 7 ml의 혈액을 7 ml의 Ficoll-hypaque이 들어있는 15 ml cornical tube 상층에 부드럽게 분주하였다. Tube를 2000 rpm, 상온에서 20분간 원심 분리하였으며, 중간층의 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)을 분리하였다. 분리된 PBMC는 PBS로 세 번 세척하였다. CD8+ T 세포를 분리하기 위해 PBMC와 CD8-microbead (Miltenyi Biotec)를 섞어 4℃에서 30분간 incubation 하였으며, LS column (Miltenyi Biotec)에 세포를 통과시켜 CD8+ T 세포만을 분리하였다.
3-2 CD8+ T 세포 증식율의 변화 측정
(1) 분리된 CD8+ T 세포를 2x105/well 농도로 96 웰 플레이트에 분주한 후, 0.05 ug/ml 농도의 항-CD3 항체를 처리하여 CD8+ T 세포를 활성화 하였으며, 동시에 GCN4-h4-1BBL, MAT-1-h4-1BBL, 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체을 120 ng/ml 또는 240 ng/ml로 처리하여 CD8+ T 세포 증식율의 변화를 측정하였다. 대조군으로 두 종류의 agonistic 항-4-1BB mAb (4B4, 20.G4)를 5ug/ml 농도로 사용하였다. 세포를 3 일간 배양하였으며, 배양 마지막 8시간 동안 1.0uCi/well 농도로 [3H]-thymidine을 처리하여 세포의 증식율을 조사하였다.
항-CD3 항체를 처리시 CD8+ T 세포는 약 10,000cpm의 증식을 나타내었으며, 항-4-1BB 항체인 4B4 처리시 1.5배, 20.G4 처리시 2.5의 증식율 증가가 나타났다. 그러나 GCN4-h4-1BBL 처리시 120ng/ml 농도에서는 아무런 변화가 없었으며, 240ng/ml 농도로 처리할 경우, 약 1.3배의 수준의 증식률이 나타났다. MAT-1-h4-1BBL 처리시에는 120ng/ml, 240ng/ml 농도 모두에서 큰 변화가 나타나지 않았다. 그러나 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 처리시 120ng/ml, 240ng/ml 농도에서 모두 약 2 ~ 2.5배의 세포 증식율 증가가 나타났다 (도 2A). 이 결과는 이합체 (dimer) 또는 삼합체 (trimer)에 비해 오합체 (pentamer) 형태의 h4-1BBL가 CD8+ T 세포를 효과적으로 증식시킨다는 것을 증명한다.
(2) 또한, GCN4-, MAT-1-, 오중합된 (pentamerized) 4-1BBL에 의한 CD8+ T 세포증식 촉진효과가 4-1BBL 단백질 부분에 의해 유발된 것인지 좀더 정확히 검증하기 위해, anti-4-1BBL 항체로 각각의 4-1BBL 멀티머 (multimer)의 4-1BBL 부분을 중화시킨 후 동일한 실험을 진행하였다. Anti-CD3 항체 (0.05ug/ml)을 처리한 CD8+ T 세포에 240ng/ml의 GCN4-, MAT-1-, 오중합된 (pentamerized) 4-1BBL 또는 5ug/ml의 항-4-1BBL 항체와 pre-incubation한 GCN4-, MAT-1-, 오중합된( pentamerized) 4-1BBL을 각각 처리한 후 72시간동안 배양하였으며, 마지막 8시간동안 [3H]-thymidine으로 표지하여 세포 증식율을 측정하였다. 이 결과에서도 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체가 가장 효과적으로 CD8+ T 세포의 증식을 유도하였으며, 각각의 h4-1BBL 멀티머(multimer)는 anti-4-1BBL 항체와 전-인큐베이션(pre-incubation)하였을 때 CD8+ T 세포 증식율 촉진효과가 감소하였다 (도 2B). 따라서 이 결과들은 세종류의 h4-1BBL 멀티머 중 펜타머 형태인 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체가 가장 효과적으로 CD8+ T 세포를 증식시키며, 이러한 효과는 h4-1BBL에 의해 유발되었음을 증명한다.
<실시예 5> 사이토카인 분석 (Cytokine assay)
48시간 동안 배양한 세포배양 상층액으로부터 CBA kit을 사용하여 Th1/2 cytokine의 발현에 어떤 영향이 있는지 조사하였다. 항-CD3 항체 및 h4-1BBL multimer 또는 항-4-1BB 항체 (4B4)를 처리한 CD8+ T 세포의 상층액내 IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-4, IL-5, TNF-α의 농도를 유세포 분석을 통해 측정하였다.
즉, 상기 실시예 4와 동일한 과정을 통해 분리된 CD8+ T 세포를 2x105/well 농도로 96 웰 플레이트에 분주하였으며, anti-CD3 항체는 0.05ug/ml 농도로, anti-4-1BB 항체는 5ug/ml 농도로, 각종 h4-1BBL 다중합체 단백질은 120 또는 240 ng/ml 농도로 처리하였다. 세포를 이틀간 배양하여 배양 상층액을 준비하였으며, CBA kit (BD Bioscience)과 50 ul의 배양 상층액을 이용하여 각 사이토카인의 양을 유세포 분석을 통해 측정하였다.
실험결과 항-4-1BB 항체 처리시 TNF-α의 발현이 증가하였지만, 오중합된(pentamerized) 4-1BBL 처리시에는 IFN-γ의 발현이 크게 증가하였다. GCN4- 또는 MAT-1-h4-1BBL 처리시에는 항-4-1BB 항체와 유사하게 IFN-γ 보다는 TNF-α의 발현이 크게 증가하였다 (도 2C). 이 결과는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체 단백질이 대표적 Th1-타입 사이토카인인 IFN-γ의 발현을 증가시킴을 증명한다.
<실시예 6> 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리
6-1 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체을 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식
1) CMV 펩타이드 특이적 CTLs의 도입 및 증식
1. HLA-A*02 양성인 사람으로부터 헤파린을 이용하여 말초혈액을 채혈 (30ml)한다 (EDTA 또는 시트르산인 citric acid 사용금지).
2. 15ml cornical tube에 혈액을 7ml씩 분주한 후, 혈액 아래쪽에 7ml Ficoll (1.077)을 넣어 밀도에 따른 층분리를 유도한 후 900 x g에서 20분간 원심분리 한다.
3. 원심분리 후 형성된 자가 혈장(autoplasma)과 PBMC를 순서대로 수거한다. 자가 혈장은 사용 전까지 4℃에 보관한다.
4. 수거된 PBMC는 RPMI1640 배지를 50ml까지 채워 1200 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척한다. 이 과정을 두 번 반복한다.
5. 세포를 5% 자가 혈장이 포함된 RPMI1640 배지로 현탁하며, 세포의 수를 계산하여 2 x 106 cells/ml 농도로 조절한다.
6. 현탁된 PBMC에 CMV pp65 peptide (NLVPMVATV)를 1㎍/ml 농도로 첨가하며, 15ml tube에 1ml씩 분주하여 배양을 시작한다.
- CMV pp65 (495-504 amino acid, NLVPMVATV); HLA-A*0201-restricted
7. 배양 이틀째 (PI day 2), 5% 자가 혈장과, 50 IU/ml 인간 IL-2가 포함된 RPMI1640 배지 10ml을 첨가한다.
8. 배양 7일째 (PI day 7), 세포배양액 1ml을 제거한 후 5% 자가 혈장과 50 IU/ml 인간 IL-2가 포함된 RPMI1640 배지 1ml를 다시 첨가한다.
9. 이틀간격으로 1ml의 배양액을 덜어내고 5% 자가 혈장과 50 IU/ml 인간 IL-2가 포함된 RPMI1640 배지 1ml를 다시 첨가한다 (PI day 9, 11, 13).
10. 배양 14일째 CMV-특이적 CTL의 형성을 MHC 펜타머를 이용하여 확인한다.
- CMV pp65 NLVPMVATV (Proimmune, HLA-A*0201)
2) CMV 펩타이드 특이적 CD8+ T 세포의 재활성
1. 상기 과정에서 준비된 CTL에 1ug/ml 농도의 펩타이드를 첨가하여 T-25 플라스크에 배양한다. 배지는 50 IU/ml IL-2와 5% 자가 혈장을 포함한 X-VIVO 10 배지를 사용하며, 2 x 106 cells / 1ml / 웰 농도로 배양한다.
2. 37℃ CO2 배양기에서 24시간동안 배양한다.
3. 배양 이틀 후 PE-conjugated anti-4-1BB 항체를 이용하여 CD8+ T 세포 중 4-1BB 양성인 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석한다.
- PE-conjugated anti-4-1BB mAb; BD Pharmingen
- FITC-conjugated anti-CD8+ mAb; BD Pharmingen
즉, 상기한 바와 같이 CMV pp65 펜타머 양성인 자원자의 혈액으로부터 PBMC를 분리한 후, 2x106 cells/ml 농도로 15ml tube에 분주한 후, 1ug/ml 농도로 CMV pp65 peptide (NLVPMVATV)를 첨가하였다. 배양 48시간 후, 50IU/ml 재조합 인간 IL-2 (Proleukin)가 포함된 배지를 첨가하여 세포증식을 촉진하였다. 세포배양 7일째부터 1ml의 배지를 제거한 후, 다시 새로운 IL-2가 포함된 1ml의 배지를 첨가하였으며, 이틀 간격으로 이를 반복하였다. 배양 14일째, 세포를 수거하였으며, CMP pp65 펩타이드를 1ug/ml 농도로 첨가하여 배양함으로써 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포의 재활성화를 유도하였다. 24시간 후, 세포를 수거하여 유세포 분석을 통해 4-1BB의 발현을 확인하였다.
4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 또는 항-4-1BB 항체를 10ug/ml 농도로 하루 동안 코팅한 배양 플레이트를 PBS로 5회 세척한 후, 4-1BB를 발현하는 세포를 첨가하여 37℃ CO2 배양기에서 한 시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양 플레이트를 PBS로 부드럽게 세척하여 항-4-1BB 항체 또는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체와 특이적으로 결합한 세포만을 분리하였다.
분리된 세포를 수거하여 항-4-1BB 항체에 의해 또는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체에 의해 분리된 세포의 CMV pp65 특이성을 유세포 분석하였으며, 양쪽 모두 >95% 이상의 순도로 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포가 분리되었다 (도 3A).
분리된 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포는 1000IU/ml 농도의 IL-2 조건에서 2주간 대량증식 시켰다. 배양 28일째 증식된 CD8+ T 세포를 CMV pp65 펩타이드로 재활성화시켜 IFN-γ 발현수준을 측정하였을 때 두 가지 조건에서 분리 및 증식시킨 CD8+ T 세포의 80% 이상이 IFN-γ를 높은 수준으로 발현하였다 (도 3B).
또한 CD8+ T 세포의 세포독성을 측정하기 위해 CMV pp65 peptide 처리 후 세포 표면에 발현되는 CD107a (LAMP-1)의 발현비율을 측정하였으며, 그 결과 50% 이상의 세포에서 세포독성이 있는 것으로 나타났다 (도 3B).
6-2 항4-1BB 항체를 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 분리 및 증식
한편, 상기 6-1 실시예에 대한 비교실험으로서, 항-4-1BB항체에 대하여 동일한 과정을 수행하였다. 비교실험의 과정을 순서대로 나타내면 다음과 같다.
1) 4-1BB+CD8+ T 세포의 분리 및 대량 증식
1. 10ug/ml 농도로 PBS에 희석된 anti-4-1BB 항체 (4B4) 또는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체 단백질을 10ml/플라스크로 분주하여 4℃에서 20-24시간 보관한다.
2. 보관 후 항체가 포함된 상층액을 제거하며, 세척 없이 PBS에 2.5% 농도로 용해된 BSA 용액을 10ml/플라스크로 분주하여 4℃에서 20-24시간 보관한다.
3. BSA 용액을 제거한 후 15ml PBS로 각 flask를 두 번 세척한다.
4. 위의 과정에서 준비된 세포를 X-VIVO 10 배지에 현탁하여 인간화 anti-4-1BB 항체가 코팅된 각 플라스크에 분주하여 37℃ CO2 배양기에 1시간동안 배양한다.
5. 한시간 배양 후 상층액을 제거하며, 10ml RPMI1640 배지로 두 번 세척한다.
6. 2% 자가혈장과 1000 IU/ml IL-2가 포함된 X-VIVO 10 배지를 각 플라스크에 첨가하여 14일간 배양한다.
2) 유세포분석
Fc 부위를 통한 염색항체들의 비 특이적인 결합을 막기 위해 1mg/ml 인간 IgG 용액 10ul와 세포를 섞어 4℃에서 10분 동안 반응하였으며, 이후 표면 분자에 특이적인 항체를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응함으로써 염색하였다. 각각의 항체로 염색된 세포는 0.1% BSA가 포함된 PBS로 두 번 세척하였으며, 준비된 시료들은 유세포 분석기 (BD Bioscience, San Diego, CA)를 사용하여 표면 분자 표현형을 분석하였다.
항원 특이적인 CTL 기능을 조사하기 위해 CD107α의 세포표면 노출정도를 측정하였다. CTL 능력을 시험할 세포를 2x106 cells/웰 농도로 96 웰 플레이트에 분주한 후, CMV 펩타이드를 5 ug/ml 농도로 처리하였다. 동시에 각 웰에 1㎕의 2 mM 모넨신 (monensin, Sigma) 및 항-CD107a-biotin 항체를 첨가하였다. 이 세포들은 다중채널 피펫 (multichannel pipette)으로 혼합되었으며, 플레이트를 300 x g로 1분 동안 원심분리한 후 세포들을 가라앉혀서 37℃에서 5시간동안 배양하였다. 배양 후에 각 웰로부터 세포를 수거하였으며, 0.02% 아지드 (azide)와 0.5mM EDTA가 들어있는 PBS로 세포들을 세척함으로서 세포와 세포간의 결합을 파괴하였다. 시료들을 스트렙타비딘-FITC, 항-CD8-PE-Cy5 및 펩타머-PE로 30분간 염색하였다. 모든 염색된 세포는 유세포 분석기로 분석하였다.
상기 비교실험 결과와 비교하여 보면, 최종 배양 후, 30ml의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 이용하여 28일간 증식시킨 세포의 수를 계산하였을 때 약 5 - 6x107 세포 수준이었으며, 항-4-1BB 항체 및 COMP-h4-1BBL 모두 비슷한 비율이었다 (도 3C). 또한 증식된 세포의 수를 증가율로 환산할 경우, 양쪽 모두 약 1250배 정도의 증가율을 나타내었다.
즉, 이러한 결과들은 재조합 단백질인 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체가 항-4-1BB 항체를 대체하여 사용가능함을 증명하고 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. COMP (cartilage oligomeric matrix protein) 에 연결된 4-1BB리간드 (4-1BBL)를 포함하는, 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 COMP의 아미노산 서열은 서열번호 11인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 4-1BB리간드(4-1BBL)의 세포외 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 4-1BB리간드(4-1BBL)의 아미노산 서열은 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 COMP는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  9. 제1항, 제4항, 제5항, 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BB리간드(4-1BBL)는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  10. 제1항, 제4항, 제5항, 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 결합하는 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 또는 암항원에서 유래된 펩타이드를 통하여 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 결합하는 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 바이러스 유래 펩타이드는 CMV (Cytomegalovirus) 펩타이드, EBV (Epstein-barr Virus) 펩타이드 또는 hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 펩타이드인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드(4-1BBL) 오중합체.
  13. 제11항에 있어서, 상기 암항원 유래 펩타이드는 WT-1 (Wilm's Tumor-associated gene) 펩타이드, MAGE 등 암항원 (cancer antigen) 계열 항원 유래 펩타이드, 서바이빈 (survivin) 유래 펩타이드 또는 NY-ES01 유래 펩타이드인 것을 특징으로 하는 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체.
  14. 제10항에 따른 4-1BB리간드 (4-1BBL) 오중합체를 포함하는 CD8+ T 세포 활성화 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 항바이러스 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 항종양 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 항-자가면역질환 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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