KR20230008153A - 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (i) CD19에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 세포 표면의 제1 키메라 항원 수용체(CAR); (ii) CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 세포 표면의 제2 CAR; (iii) 우성 음성 SHP2(dSHP2); 및 (iv) 우성 음성 TGFβ 수용체 II(dnTGFβRII)를 공-발현하는 세포에 관한 것이다.

Description

세포

본 발명은 하나 초과의 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 세포에 관한 것이다.

치료적 단일클론 항체(mAb), 면역접합된 mAb, 방사접합된 mAb 및 이중특이적 T-세포 인게이저(engager)를 비롯한, 암 치료에 사용되는 다수의 면역치료제들이 기재되었다.

전형적으로, 이 면역치료제들은 단일 항원을 표적화한다: 예를 들어, 리툭시맙(Rituximab)은 CD20을 표적화하고; 미엘로타르그(Myelotarg)는 CD33을 표적화하고; 알렘투주맙(Alemtuzumab)은 CD52를 표적화한다.

인간 CD19 항원은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 95 kDa 막횡단 당단백질이다. CD19는 B 세포 분화의 매우 초기에 발현되고 형질 세포로의 말기 B 세포 분화에서만 상실된다. 결과적으로, CD19는 다발성 골수종을 제외한 모든 B 세포 악성종양에서 발현된다. 정상적인 B 세포 구획의 상실은 허용될 수 있는 독성이기 때문에, CD19는 매력적인 CAR 표적이고 CAR로 CD19를 표적화하는 임상 연구는 기대되는 결과를 보여주었다.

종양학 분야의 구체적인 문제점은 단일 항원의 유일한 표적화가 대다수의 암에 내재하는 높은 돌연변이율로 인해 상기 항원의 조절에 의해 종양 탈출을 초래할 수 있다고 설명하는 골디-콜드만(Goldie-Coldman) 가설에 의해 제공된다. 항원 발현의 이 조절은 CD19를 표적화하는 면역치료제를 비롯한 공지된 면역치료제의 효능을 감소시킬 수 있다.

따라서, CD19를 표적화하는 면역치료제의 문제점은 B 세포 악성종양이 돌연변이되어 CD19 음성을 띠게 될 수 있다는 것이다. 이것은 CD19 표적화 치료제에 반응하지 않는 CD19 음성 암의 재발을 초래할 수 있다. 예를 들어, 한 소아과 연구에서, 그룹 연구진(Grupp et al.)은 B 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL)에 대한 CD19 표적화 키메라 항원 수용체 요법 후 모든 재발의 절반이 CD19 음성 질환으로 인한 것이라고 보고하였다(56^th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition).

따라서, CD19 양성 암을 비롯한 많은 암과 관련된 마커 발현의 복잡한 패턴을 반영하기 위해 하나 초과의 세포 표면 구조물을 표적화할 수 있는 면역치료제가 필요하다.

키메라 항원 수용체(CAR)

키메라 항원 수용체는 예를 들어, 단일클론 항체(mAb)의 특이성을 T 세포의 이펙터 기능에 접목하는 단백질이다. 이의 일반적인 형태는 T 세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 화합물 엔도도메인에 모두 연결된 항원 인식 아미노 말단, 스페이서, 막횡단 도메인을 가진 I형 막횡단 도메인 단백질의 형태이다(도 1a 참조).

이 분자의 가장 일반적인 형태는 스페이서 및 막횡단 도메인을 통해 신호전달 엔도도메인에 융합된, 표적 항원을 인식하는 단일클론 항체로부터 유래한 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 융합체이다. 이러한 분자는 scFv에 의한 그의 표적의 인식에 대한 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. T 세포는 이러한 CAR을 발현할 때, 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하고 사멸시킨다. 종양 관련 항원에 대한 여러 CAR이 개발되었고, 이러한 CAR 발현 T 세포를 사용한 입양 전달 접근법은 현재 다양한 암의 치료를 위해 임상 시험 중에 있다.

암 치료를 위해 CAR 접근법을 이용할 때 종양 불균질성 및 면역편집이 CAR 치료로부터의 탈출을 야기할 수 있다는 것이 관찰되었다. 예를 들어, 문헌[Grupp et al (2013; New Eng. J. Med 368:1509-1518, paper No 380, ASH 2014)]에 기재된 연구에서 CAR 변형 T 세포 접근법은 급성 B 림프구성 백혈병의 치료에 이용되었다. 그 임상 시험에서 1개월 후에 완전히 관해된 10명의 환자들이 재발하였고 이들 중 5명이 CD19 음성 질환으로 재발한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 암 탈출 및 종양 불균질성이라는 문제점을 해결하는 대안적 CAR 치료 접근법이 필요하다.

2개의 CAR 결합 특이성의 발현

탠덤 CAR 또는 TanCAR로서 알려진 이중특이적 CAR은 다수의 암 특이적 마커들을 동시에 표적화하려는 시도에서 개발되었다. TanCAR에서, 세포외 도메인은 링커에 의해 연결된 2개의 항원 결합 특이성을 나란히 포함한다. 따라서, 2개의 결합 특이성(scFv)은 둘 다 단일 막횡단 부분에 연결된다: 하나의 scFv는 막에 병치되고 다른 하나는 원위 위치에 있다.

문헌[Grada et al (2013, Mol Ther Nucleic Acids 2:e105)]은 CD19 특이적 scFv 다음에 Gly-Ser 링커 및 이어서 HER2 특이적 scFv를 포함하는 TanCAR을 기술한다. HER2-scFv는 막 근처 위치에 있었고, CD19-scFv는 원위 위치에 있었다. TanCAR은 2개의 종양 제한 항원 각각에 대해 상이한 T 세포 반응성을 유도하는 것으로 확인되었다. 이 배열은 HER2(632aa/125Å) 및 CD19(280aa, 65Å)의 각각의 길이가 그 특정 공간적 배열에 적합하기 때문에 선택되었다. 또한, HER2 scFv는 가장 원위에 있는 4개의 HER2 루프에 결합하는 것으로 알려졌다.

이 접근법의 이용 시 문제점은 특히 항원에 결합된 원위 scFv의 존재로 인해 막 근처의 scFv가 접근될 수 없다는 점이다. 표적 세포에서 항원의 공간적 배열을 고려하여 상기 2개의 scFv의 상대적 위치를 선택할 필요성에 비추어 볼 때, 모든 scFv 결합 쌍들에 대해 이 접근법을 이용하는 것은 불가능할 수 있다. 더욱이, 3개 이상의 scFv를 가진 TanCAR은 매우 큰 분자가 될 것이고 scFv가 서로 잘 접혀 항원 결합 부위를 가릴 수 있기 때문에, 2개 초과의 scFv에 대해 TanCar 접근법이 이용될 수 있을 가능성이 거의 없다. 2개 이상의 추가 scFv에 의해 막횡단 도메인으로부터 분리된, 가장 원위에 있는 scFv에 의한 항원 결합이 T 세포 활성화를 유발할 수 있는지도 의심스럽다.

따라서, T 세포와 같은 세포의 표면에서 2개의 CAR 결합 특이성을 발현하기 위한 대안적 접근법이 필요하다. 이 과제는 국제 특허출원 공개 제WO2016/102965호에서 본 발명자들에 의해 다루어졌다. 표면에서 2개의 CAR 결합 특이성을 발현하고 개선된 생존 및 지속성도 나타내는 세포를 제공할 필요가 남아 있다.

본 발명자들은 세포 표면에서 2개의 CAR, 즉 CD19에 특이적인 CAR 및 CD22에 특이적인 CAR을 발현하는 CAR T 세포를 개발하였다. 나아가, 본 발명의 CAR T 세포는 본원에 더 상세히 기재되어 있는 증강 모듈을 추가로 포함한다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 세포 표면에서 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR을 공-발현하는 세포를 제공하는 것으로, 이때 각각의 CAR은 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합하고 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22에 결합하고, 추가로 이 세포는 우성 음성 SHP2(dSHP2) 및 우성 음성 TGFβ 수용체 II(dnTGFβRII)를 발현한다.

하나의 CAR이 CD19에 결합하고 다른 CAR이 CD22에 결합한다는 사실은 일부 림프종 및 백혈병이 CD19 표적화 후에 CD19 음성을 갖게 되고(또는 가능하게는 CD22 표적화 후에 CD22 음성을 갖게 되고), 이것이 일어나면 "백업" 항원을 제공하기 때문에 유리하다. 추가로, 본 발명자들은 본원에 더 기재된 바와 같이 dSHP2 및 dnTGFβRII와의 특정 조합이 유리함을 확인하였다.

본 발명자들은 또한 세포내 신호전달 도메인의 특정 조합도 유리함을 보여주었다. 따라서, 각각의 CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 본 발명의 세포를 제공하는 것으로, 이때 제1 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하고; 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 엔도도메인을 포함한다.

보조자극 엔도도메인은 CD28 보조자극 엔도도메인일 수 있다. 적합한 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인의 예는 OX-40 및 4-1BB 엔도도메인을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.

제1 CAR 및 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 함유 엔도도메인도 포함할 수 있다.

세포는 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포 또는 NKT 세포와 같은 면역 이펙터 세포일 수 있다. T 세포와 관련하여 본원에서 언급된 특징은 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 면역 이펙터 세포에도 동일하게 적용된다.

각각의 CAR은 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서; 및 (iii) 막횡단 도메인을 포함할 수 있다.

각각의 CAR은 (i) 항원 결합 도메인; (ii) 스페이서; (iii) 막횡단 도메인; 및 (iv) 엔도도메인을 포함할 수 있다.

제1 CAR과 제2 CAR이 이종이량체를 형성하지 않도록, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이할 수 있다.

각각의 CAR이 그의 각각의 표적 항원의 인식에 알맞게 조정되도록, 제1 CAR의 스페이서는 제2 CAR의 스페이서와 상이한 길이 및/또는 입체구조를 가질 수 있다. 제2 CAR에 적합한 스페이서는 연골 올리고머 매트릭스 단백질(COMP) 코일드 코일 도메인을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다.

제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 막 원위 에피토프에 결합할 수 있다. 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 Ig 도메인 7, 6, 5 또는 4, 예를 들어, CD22의 Ig 도메인 5의 에피토프에 결합할 수 있다.

제1 CAR의 항원 결합 도메인은 엑손 1, 3 또는 4에 의해 코딩되는, CD19의 에피토프에 결합할 수 있다.

제1 CAR의 CD19 결합 도메인은

a) 하기 서열을 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH):

CDR1 - SYWMN(서열번호 1),

CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK(서열번호 2),

CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY(서열번호 3); 및

b) 하기 서열을 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL):

CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN(서열번호 4),

CDR2 - DASNLVS(서열번호 5),

CDR3 - QQSTEDPWT(서열번호 6)

을 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 서열번호 7 또는 서열번호 8로서 나타낸 서열을 가진 VH 도메인; 또는 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로서 나타낸 서열을 가진 VL 도메인, 또는 CD19에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14로서 나타낸 서열, 또는 CD19에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

제2 CAR의 CD22 결합 도메인은

a) 하기 서열을 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH):

CDR1 - NYWIN(서열번호 15),

CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD(서열번호 16),

CDR3 - DTQERSWYFDV(서열번호 17); 및

b) 하기 서열을 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL):

CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH(서열번호 18),

CDR2 - KVSNRFS(서열번호 19),

CDR3 - SQSTHVPWT(서열번호 20)

을 포함할 수 있다.

CD22 결합 도메인은 서열번호 21 또는 서열번호 22로서 나타낸 서열을 가진 VH 도메인; 또는 서열번호 23 또는 서열번호 24로서 나타낸 서열을 가진 VL 도메인, 또는 CD22에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

CD22 결합 도메인은 서열번호 25 또는 서열번호 26으로서 나타낸 서열, 또는 CD22에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

제2 CAR의 엔도도메인은 보조자극 도메인 및 ITAM 함유 도메인을 포함할 수 있고; 제1 CAR의 엔도도메인은 TNF 수용체 패밀리 도메인 및 ITAM 함유 도메인을 포함할 수 있다.

예를 들어, 제1 CAR(CD19 특이적임)은 하기 구조를 가질 수 있고:

AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM;

제2 CAR(CD22 특이적임)은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM;

상기 구조에서,

AgB1은 항원 결합 도메인이고;

스페이서1은 스페이서이고;

TM1은 막횡단 도메인이고;

TNF는 TNF 수용체 엔도도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이고;

AgB2는 항원 결합 도메인이고;

스페이서2는 스페이서이고;

TM2는 막횡단 도메인이고;

costim은 보조자극 도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이다.

제2 측면에서, 본 발명은 dSHP2 및 dnTGFβRII와 함께, 본 발명의 제1 측면에서 정의된 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR 둘 다를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

이 핵산 서열은 하기 구조를 가질 수 있고, 이 핵산 서열은 T 세포에서 발현될 때 제1 CAR 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공-발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩타이드를 코딩한다:

모듈1-coexpr-AgB1-스페이서1-TM1-coexpr-AgB2-스페이서2-TM2-coexpr-모듈2

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

coexpr은 공-발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

모듈1 및 모듈2는 우성 음성 SHP2(dSHP2) 또는 우성 음성 TGFβRII(dnTGFβRII)를 코딩하는 핵산 서열이고, 이때 모듈1이 dSHP2를 코딩할 때 모듈2는 dnTGFβRII를 코딩하고, 모듈2가 dnTGFβRII를 코딩할 때 모듈1은 dSHP2를 코딩한다.

이 핵산 서열은 하기 구조를 가질 수 있고, 이 핵산 서열은 T 세포에서 발현될 때 제1 CAR 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공-발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩타이드를 코딩한다:

모듈1-coexpr-AgB1-스페이서1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-스페이서2-TM2-endo2-coexpr-모듈2

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

coexpr은 공-발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

모듈1 및 모듈2는 우성 음성 SHP2(dSHP2) 또는 우성 음성 TGFβRII(dnTGFβRII)를 코딩하는 핵산 서열이고, 이때 모듈1이 dSHP2를 코딩할 때 모듈2는 dnTGFβRII를 코딩하고 모듈2가 dnTGFβRII를 코딩할 때 모듈1은 dSHP2를 코딩한다.

2개의 CAR의 공-발현을 허용하는 핵산 서열은 자가 절단 펩타이드를 코딩할 수 있거나, 2개의 CAR을 공-발현하는 대안적 수단, 예컨대, 내부 리보좀 진입 서열 또는 제2 프로모터 또는 당분야의 숙련된 자가 동일한 벡터로부터 2개의 단백질을 발현할 수 있게 하는 임의의 다른 수단을 허용하는 서열을 코딩할 수 있다.

상동 재조합을 피하기 위해, 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 영역, 예컨대, 막횡단 및/또는 세포내 T 세포 신호전달 도메인(엔도도메인)에서 대체 코돈을 사용할 수 있다. 예를 들어, 2개의 CAR이 이 부분 또는 이들 부분(들)에 대해 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖되, 상이한 핵산 서열에 의해 코딩되도록 스페이서, 막횡단 도메인, 및/또는 엔도도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열의 부분에서 대체 코돈을 사용될 수 있다.

제3 측면에서, 본 발명은

(i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 하기 구조를 가진 제1 핵산 서열:

AgB1-스페이서1-TM1;

(ii) 제2 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 하기 구조 2를 가진 제2 핵산 서열:

AgB2-스페이서2-TM2; 및

(iii) 본원에 기재된 dSHP2 및 dnTGFβRII를 코딩하는 제3 핵산 서열

을 포함하는 키트를 제공하고,

상기 구조에서,

AgB1은 CD19에 결합하는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

AgB2는 CD22에 결합하는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이다.

상기 키트는

(i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 하기 구조를 가진 제1 핵산 서열:

AgB1-스페이서1-TM1-endo1; 및

(ii) 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 하기 구조를 가진 제2 핵산 서열:

AgB2-스페이서2-TM2-endo2

을 포함할 수 있고,

상기 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

endo1은 제1 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

endo2는 제2 CAR의 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이다.

제4 측면에서, 본 발명은 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터; 및 제3 핵산 서열을 포함하는 제3 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.

벡터는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 트랜스포존 벡터일 수 있다. 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 트랜스포존 벡터일 수 있다.

제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 세포를 제조하는 방법으로서, 제1 CAR, 제2 CAR, dSHP2 및 dnTGFβRII를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(들); 또는 상기 정의된 하나 이상의 벡터(들)를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 세포는 T 세포일 수 있다.

세포는 환자, 혈연 또는 비혈연 조혈 이식 기증자, 완전히 관련 없는 기증자를 포함하나 이들로 제한되지 않는 대상체로부터 단리된 샘플로부터 유래할 수 있거나, 제대혈로부터 유래할 수 있거나, 배아 세포주로부터 분화될 수 있거나, 유도성 전구체 세포주로부터 분화될 수 있거나, 형질전환된 세포주로부터 유래할 수 있다.

제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 복수의 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

제8 측면에서, 본 발명은 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법으로서, 본 발명의 제7 측면에 따른 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

이 방법은

(i) 대상체로부터 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;

(ii) 제1 CAR, 제2 CAR, dSHP2 및 dnTGFβRII를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(들), 또는 이러한 핵산 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 벡터(들)로 세포를 형질도입하거나 형질감염시키는 단계; 및

(iii) (ii)의 세포를 대상체에게 투여하는 단계

를 포함할 수 있다.

질환은 암일 수 있다. 암은 B 세포 악성종양일 수 있다.

제9 측면에서, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제7 측면에 따른 약학 조성물을 제공한다.

제10 측면에서, 본 발명은 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 제1 측면에 따른 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은

a) 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열;

b) 제2 CAR을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열; 및

c) 2개의 CAR이 별개의 물질로서 발현되도록 제1 뉴클레오타이드 서열과 제2 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치한 자가 절단 펩타이드를 코딩하는 서열

을 포함하는 핵산 서열도 제공하는 것으로, 이때 하나의 CAR은 CD19에 결합하고 다른 CAR은 CD22에 결합한다.

동일하거나 유사한 아미노산 서열(들)을 코딩하는 영역에서 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 하나 이상의 부분(들)에서 대체 코돈을 사용할 수 있다.

본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 세포도 제공한다.

벡터는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 트랜스포존 벡터일 수 있다.

본 발명자들은 또한 OR 게이트 시스템에서 보조자극 도메인과 생존 신호를 생성하는 도메인이 2개(또는 더 많은) CAR 사이에서 "분할"되는 경우 성능이 개선된다는 것을 발견하였다.

따라서, 제11 측면에서, CD19에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 세포 표면에서 공-발현하는 세포를 제공하는 것으로, 이때 각각의 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제1 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하고; 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 포함한다.

보조자극 도메인은 CD28 보조자극 도메인일 수 있다. TNF 수용체 패밀리 엔도도메인은 예를 들어, OX-40 또는 4-1BB 엔도도메인일 수 있다.

제1 CAR 및 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 함유 도메인, 예컨대, CD3 제타 엔도도메인도 포함할 수 있다.

제1 CAR은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인이고;

TNF는 TNF 수용체 엔도도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이다.

제2 CAR은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM

이 구조에서,

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인이고;

costim은 보조자극 도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이다.

제12 측면에서, 본 발명의 제11 측면에서 정의된 바와 같이 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR 둘 다를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

이 핵산 서열은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM1-coexpr-AbB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM2

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

TNF는 TNF 수용체 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

ITAM1은 제1 CAR의 ITAM 함유 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

coexpr은 공-발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

costim은 보조자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

ITAM2는 제2 CAR의 ITAM 함유 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이다.

상기 핵산 서열이 세포에서 발현될 때, 이 핵산 서열은 제1 CAR 및 제2 CAR이 세포 표면에서 공-발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다.

제13 측면에서,

(i) 본 발명의 제11 측면에서 정의된 바와 같이 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 하기 구조를 가진 제1 핵산 서열:

AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM1; 및

(ii) 본 발명의 제11 측면에서 정의된 바와 같이 제2 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 하기 구조를 가진 제2 핵산 서열:

AgB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM2

을 포함하는 키트를 제공하고,

상기 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

TNF는 TNF 수용체 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

ITAM1은 제1 CAR의 ITAM 함유 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

costim은 보조자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

ITAM2는 제2 CAR의 ITAM 함유 엔도도메인을 인코딩하는 핵산 서열이다.

제14 측면에서, 본 발명의 제11 측면에 따른 핵산 서열 또는 본 발명의 제12 측면에서 정의된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

제15 측면에서, 본 발명의 제11 측면에 따른 세포를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 제12 측면에 따른 핵산 서열; 본 발명의 제13 측면에서 정의된 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열; 또는 본 발명의 제14 측면에 따른 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

제16 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제11 측면에 따른 복수의 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법으로서, 본 발명의 제16 측면에 따른 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제16 측면에 따른 약학 조성물도 제공한다.

또한, 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 제11 측면에 따른 세포의 용도를 제공한다.

CD19를 표적화하는 하나의 CAR 및 CD22를 표적화하는 하나의 CAR을 제공하여, 이 마커들 각각을 표적화함으로써, 암 탈출이라는 문제점을 감소시킬 수 있다.

CAR은 세포의 표면에서 별개의 분자로서 발현되기 때문에, 이 접근법은 TanCAR과 관련된 공간적 문제 및 접근성 문제를 극복한다. 세포 활성화 효율도 개선된다. 각각의 CAR이 그 자신의 스페이서를 가진 경우, 스페이서를 조정하여, 결합 도메인이 세포 표면으로부터 돌출하는 거리 및 그의 유연성 등을 특정 표적 항원에 맞게 조정할 수 있다. 이 선택은 TanCAR과 관련된 설계 고려사항, 즉 하나의 CAR이 T 세포막에 병치될 필요가 있고 하나의 CAR이 제1 CAR과 나란히 원위 위치될 필요가 있다는 점에 의해 제약을 받지 않는다.

절단 부위에 의해 분리된 2개의 CAR을 코딩하는 단일 핵산을 제공함으로써, 간단한 단일 형질도입 절차를 이용하여 2개의 CAR을 공-발현하도록 세포를 조작할 수 있다. 이중 형질감염 절차는 별개의 구축물 내에 있는 CAR 코딩 서열들과 함께 이용될 수 있으나, 이것은 더 복잡하고 비용이 많이 들며 핵산에 대해 더 많은 통합 부위를 요구한다. 이중 형질감염 절차는 또한 CAR 코딩 핵산 둘 다가 효과적으로 형질도입되고 발현되었는지 여부에 대한 불확실성과 관련될 것이다.

CAR은 상동성이 높은 부분을 가질 것이고, 예를 들어, 막횡단 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인은 높은 상동성을 가질 가능성이 높다. 2개의 CAR에 대해 동일하거나 유사한 링커가 사용되는 경우, 이들도 높은 상동성을 가질 것이다. 이것은 CAR 둘 다가 단일 핵산 서열에 제공되는 접근법이 서열들 사이의 상동 재조합의 가능성 때문에 부적절할 것임을 암시할 것이다. 그러나, 본 발명자들은 높은 상동성을 가진 영역을 코딩하는 서열의 부분을 "코돈 워블링(codon wobbling)"함으로써, 고효율로 단일 구축물로부터 2개의 CAR을 발현시킬 수 있음을 발견하였다. 코돈 워블링은 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열의 영역에서 대체 코돈을 사용하는 단계를 포함한다.

도 1: a) 고전적인 CAR을 예시하는 개략도. (b) 내지 (d): CAR 엔도도메인의 상이한 세대 및 순열: (b) 초기 디자인은 FcεR1-γ 또는 CD3ζ 엔도도메인을 통해 ITAM 신호만을 전달한 반면, 후기 디자인은 동일한 화합물 엔도도메인에서 추가 (c) 1개 또는 (d) 2개의 보조자극 신호를 전달하였다.
도 2: B 세포 성숙 경로/B 세포 개체발생. DR=HLA-DR; cCD79 = 세포질 CD79; cCD22 = 세포질 CD22. CD19 및 CD22 항원 둘 다가 B 세포 성숙에서 초기 단계 동안 발현된다. 이 세포가 B 세포 급성 백혈병으로 발전하는 세포이다. CD19 및 CD22 둘 다를 동시에 표적화하는 것은 B 세포 급성 백혈병을 표적화하는 데 가장 적합하다.
도 3: CD19 구조 및 엑손.
도 4: 항-CD19 OR CD22 CAR 카세트의 설계를 위한 전략. CD19를 인식하는 결합제와 CD22를 인식하는 결합제를 선택한다. 각각의 CAR에 대한 최적 스페이서 도메인 및 신호전달 도메인을 선택한다. (a) CAR 둘 다가 공-발현되도록 FMD-2A 펩타이드를 사용하여 OR 게이트 카세트를 구축한다. 재조합을 피하기 위해 임의의 상동 서열을 코돈 워블링한다. (b) 2개의 CAR은 T 세포 표면에서 별개의 단백질로서 공-발현된다.
도 5: 레트로바이러스 벡터에서 동일한 펩타이드 서열의 공-발현을 허용하되, 상동 재조합을 피하기 위한 코돈 워블링의 예. 이때, 야생형 HCH2CH3-CD28tmZeta는 코돈 워블링된 HCH2CH3-CD28tmZeta와 정렬된다.
도 6: 본 발명의 CD19/CD22 OR 게이트의 개략도.
도 7: 천연 생성 이량체, 삼량체 및 사량체 코일드 코일 구조(문헌[Andrei N. Lupas and Markus Gruber; Adv Protein Chem. 2005;70:37-78]으로부터 변형됨)
도 8: 콜라겐 올리고머 매트릭스 단백질(COMP) 및 인간 IgG1의 오량체 코일드 코일 모티프의 결정 구조. 개별 쇄는 상이한 색상으로 도시되어 있다. 코일드 코일 COMP 구조는 N-말단으로부터 표시되어 있고, 이때 C-말단은 페이지 쪽으로 뻗어 있고, 좌측에 C-말단을 갖고 우측에 N-말단을 가진 프로파일로부터도 표시되어 있다. 인간 IgG1은 N-말단(상단) 내지 C-말단(하단)을 가진 프로파일로부터 표시되어 있다.
도 9: COMP 스페이서의 절단
a) 항-ROR-1 COMP CAR을 보여주는 개략도, COMP 스페이서는 N-말단으로부터 45개 아미노산 내지 "x"개 아미노산이 절단되었다.
b) 293T 세포를 절단된 구축물로 형질감염시키고 FACS로 분석하였다.
도 10: 생체내에서 a) T 세포 활성화 및 b) T 세포 억제의 기작을 예시하는 개략도.
도 11: CD19/CD22 OR 게이트 구축물의 요약. 상이한 분자로서 각각의 CAR의 발현을 달성하기 위해 CD19 및 CD22 CAR을 자가 절단 2A 서열로 분리하였다.
도 12: 다양한 CD19/CD22 OR 게이트 구축물들의 비교. 이 구축물들 중 하나를 발현하는 세포를 1:1 이펙터:표적(E:T) 세포 비(50,000개의 표적 세포)로 표적 세포와 72시간 동안 공-배양하였다. (도 12a) 남은 표적 세포; (도 12b) IL-2 생성; (도 12c) IFN-γ 생성; (도 12d) 증식. 청색 원: 형질도입되지 않은 세포; 적색 사각형: 구축물 1; 녹색 마름모: 구축물 3; 보라색 원: 구축물 4; 흑색 사각형; 구축물 5.
도 13: 다양한 CD19/CD22 OR 게이트 구축물들의 시험관내 시험. 이 구축물들 중 하나를 발현하는 세포를 1:1 및 1:10 이펙터:표적(E:T) 세포 비로 표적 세포와 72시간 동안 공-배양하였다. 청색 원: 형질도입되지 않은 세포; 적색 사각형: 구축물 1; 녹색 삼각형: 구축물 3; 보라색 삼각형: 구축물 5. (도 13a) 남은 표적 세포; (도 13b)
도 14: dnTGFβRII 모듈 시험. 청색 원: 배지 단독; 적색 원: +10 ng/㎖ rhTGF-β.
도 15: dSHP2 모듈 시험. 청색 원: 형질도입되지 않은 SupT1 세포; CD19+ SupT1 세포; CD19+PDL+ SupT1 세포.
도 16: 재자극 어세이. 적색 막대: 표적 세포; 청색 막대: T 세포. 상단 행: CD19+ SupT1 세포; 하단 행: CD22+ SupT1 세포.
도 17: 구축물 5 비교를 위한 출발점으로서 사용하기 위해 구축물 1을 발현하는 세포의 준최적 용량의 확인.
도 18: 구축물 1, 3 및 5의 생체내 비교. 구축물 1을 발현하는 세포는 이 용량 수준(2.5 x 10⁶개의 T 세포)에서 종양 부하(burden)를 제어할 수 없다. 구축물 3 또는 구축물 5를 발현하는 세포는 개선된 활성을 보여준다. 특히, 구축물 5는 모든 마우스에서 23일째 날까지 종양 부하의 제어를 보여준다. 플럭스(flux)의 차이는 구축물 1에 비해 통계적으로 유의미하다.
도 19: CD19 넉아웃 Nalm6 마우스에서 구축물 1, 3 및 5의 생체내 비교. 구축물 1을 발현하는 세포는 이 용량 수준(2.5 x 10⁶개의 T 세포)에서 종양 부하를 제어할 수 없다. 구축물 3 또는 구축물 5를 발현하는 세포는 개선된 활성을 보여준다. 특히, 구축물 5는 1마리를 제외한 모든 마우스에서 27일째 날까지 종양 부담의 제어를 보여준다.

키메라 항원 수용체(CAR)

도 1에 개략적으로 나타낸 CAR은 세포외 항원 인식 도메인(결합제)을 세포내 신호전달 도메인(엔도도메인)에 연결하는 키메라 I형 막횡단 단백질이다. 결합제는 전형적으로 단일클론 항체(mAb)로부터 유래한 단일 쇄 가변 단편(scFv)이지만, 항체 유사 항원 결합 부위를 포함하는 다른 포맷을 기반으로 한 것일 수 있다. 스페이서 도메인은 통상적으로 막으로부터 결합제를 단리하고 적합한 배향을 허용하는 데 필요하다. 사용되는 통상의 스페이서 도메인은 IgG1의 Fc이다. 항원에 따라 더 조밀한 스페이서, 예를 들어, CD8α의 줄기(stalk) 및 심지어 IgG1 힌지 단독으로도 충분할 수 있다. 막횡단 도메인은 단백질을 세포막에 고착시키고 스페이서를 엔도도메인에 연결한다.

초기 CAR 설계는 FcεR1 또는 CD3ζ의 γ 쇄의 세포내 부분으로부터 유래한 엔도도메인을 가졌다. 그 결과, 이 1세대 수용체는 면역학적 신호 1을 전달하였데, 이 신호는 동족 표적 세포의 T 세포 사멸을 유발하기에 충분하였으나 증식하고 생존할 정도로 T 세포를 완전히 활성화시키지는 못하였다. 이 한계를 극복하기 위해, 화합물 엔도도메인을 구축하였다: T 세포 보조자극 분자의 세포내 부분과 CD3ζ의 세포내 부분의 융합은 항원 인식 후 활성화 및 보조자극 신호를 동시에 전달할 수 있는 2세대 수용체를 생성한다. 가장 일반적으로 사용되는 보조자극 도메인은 CD28의 도메인이다. 이것은 가장 강력한 보조자극 신호, 즉 T 세포 증식을 유발하는 면역학적 신호 2를 공급한다. TNF 수용체 패밀리 엔도도메인, 예컨대, 생존 신호를 전달하는 밀접하게 관련된 OX40 및 41BB를 포함하는 일부 수용체들도 기재되었다. 활성화, 증식 및 생존 신호를 전달할 수 있는 엔도도메인을 가진 훨씬 더 강력한 3세대 CAR이 지금부터 기재된다.

CAR 코딩 핵산은 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 사용함으로써 T 세포에게 전달될 수 있다. 렌티바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이 방식으로, 입양 세포 전달을 위해 많은 수의 암 특이적 T 세포들을 생성할 수 있다. CAR이 표적 항원에 결합할 때, 이것은 그 자신이 발현되는 T 세포에게 활성화 신호를 전달한다. 따라서, CAR은 표적화된 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 T 세포의 특이성 및 세포독성을 유도한다.

본 발명의 제1 측면은 제1 CAR 및 제2 CAR을 공-발현하는 세포에 관한 것으로, 이때 하나의 CAR은 CD19에 결합하고 다른 CAR은 CD22에 결합하므로, T 세포는 이 마커들 중 어느 하나를 발현하는 표적 세포를 인식할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제1 CAR 및 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 상이한 항원에 결합하고, 두 CAR은 활성화 엔도도메인을 포함한다. 또한, 각각의 CAR은 상이한 세포내 신호전달 도메인을 사용한다. 2개의 CAR은 동일할 수 있는 스페이서 도메인, 또는 2개의 상이한 수용체의 교차페어링을 방지할 정도로 충분히 상이할 수 있는 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 세포는 CD19 및 CD22 중 어느 하나 또는 이들 둘 다의 인식 시 활성화되도록 조작될 수 있다. 이것은 골디-콜드만 가설, 즉 단일 항원의 유일한 표적화가 대다수의 암에 내재하는 높은 돌연변이율로 인해 상기 항원의 조절에 의해 종양 탈출을 초래할 수 있다는 가설에 의해 시사된 바와 같이 종양학 분야에서 유용하다. 2개의 항원을 동시에 표적화함으로써, 이러한 탈출 가능성은 기하급수적으로 감소된다.

2개의 CAR이 이종이량체화하지 않는다는 것은 중요하다.

본 발명의 T 세포의 제1 CAR 및 제2 CAR은 절단 부위와 함께 이들 CAR 둘 다를 포함하는 폴리펩타이드로서 생성될 수 있다.

신호 펩타이드

본 발명의 세포의 CAR은 CAR이 T-세포와 같은 세포의 내부에서 발현될 때, 신생 단백질이 소포체로 향한 후 세포 표면으로 향하여, 여기서 발현되도록 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.

신호 펩타이드의 코어는 단일 알파 나선을 형성하는 경향이 있는 소수성 아미노산의 긴 스트레치를 함유할 수 있다. 신호 펩타이드는 전위 동안 폴리펩타이드의 적절한 토폴로지를 강제하는 데 도움을 주는 짧은 양으로 하전된 아미노산 스트레치로 시작될 수 있다. 신호 펩타이드의 말단에는 전형적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 스트레치가 있다. 신호 펩티다제는 전위 동안 또는 전위의 완료 후 절단되어 유리 신호 펩타이드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 그 다음, 유리 신호 펩타이드는 특정 프로테아제에 의해 분해된다.

신호 펩타이드는 분자의 아미노 말단에 있을 수 있다.

신호 펩타이드가 여전히 CAR의 세포 표면 발현을 야기하도록 작용하는 한, 신호 펩타이드는 서열번호 27, 28 또는 29, 또는 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 돌연변이(삽입, 치환 또는 추가)를 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

서열번호 27의 신호 펩타이드는 소형이고 매우 효율적이다. 이것은 말단 글리신 다음에 약 95% 절단을 제공하여, 신호 펩티다제에 의한 효율적인 제거를 제공할 것으로 예상된다.

서열번호 28의 신호 펩타이드는 IgG1로부터 유래한다.

서열번호 29의 신호 펩타이드는 CD8로부터 유래한다.

제1 CAR의 신호 펩타이드는 제2 CAR의 신호 펩타이드와 상이한 서열을 가질 수 있다.

CD19

인간 CD19 항원은 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 95 kDa 막횡단 당단백질이다. CD19는 단일 막횡단 도메인, 세포질 C-말단 및 세포외 N-말단을 가진 I형 막횡단 단백질로서 분류된다. CD19의 일반적인 구조는 도 3에 예시되어 있다.

CD19는 정상 B 세포 및 신생물성 B 세포에 대한 바이오마커일뿐만 아니라 여포성 수지상 세포에 대한 바이오마커이기도 하다. 실제로, 이것은 B 세포 모세포로 발달하는 동안 가장 먼저 인식될 수 있는 B-계통 세포로부터의 B 세포에 존재하지만, 형질 세포로 성숙되는 동안 상실된다. 이것은 주로 CD21 및 CD81과 함께 B 세포 보조수용체로서 작용한다. 활성화 시, CD19의 세포질 꼬리는 인산화되어, Src-패밀리 키나제에 의한 결합 및 PI-3 키나제의 동원을 유발한다. CD19는 B 세포 분화의 매우 초기에 발현되고 형질 세포로의 말기 B 세포 분화 시 상실된다. 결과적으로, CD19는 다발성 골수종을 제외한 모든 B 세포 악성종양에서 발현된다.

하기 표에 요약된 바와 같이, 여러 센터에서 CD19에 대해 다양한 CAR 설계가 시험되었다:

[표 1]

위에 나타낸 바와 같이, 지금까지 수행된 연구들 중 대다수는 CD19를 인식하기 위한 결합 도메인의 일부로서 하이브리도마 fmc63으로부터 유래한 scFv를 사용하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, CD19를 코딩하는 유전자는 10개의 엑손을 포함한다: 엑손 1 내지 4는 세포외 도메인을 코딩하고; 엑손 5는 막횡단 도메인을 코딩하고; 엑손 6 내지 10은 세포질 도메인을 코딩한다.

본 발명의 CD19/CD22 OR 게이트에서, 항-CD19 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19 유전자의 엑손 1에 의해 코딩된 CD19의 에피토프에 결합할 수 있다.

본 발명의 CD19/CD22 OR 게이트에서, 항-CD19 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19 유전자의 엑손 3에 의해 코딩된 CD19의 에피토프에 결합할 수 있다.

본 발명의 CD19/CD22 OR 게이트에서, 항-CD19 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19 유전자의 엑손 4에 의해 코딩된 CD19의 에피토프에 결합할 수 있다.

본 발명자들은 결합제 fmc63을 포함하는 공지된 항-CD19 CAR에 비해 개선된 특성을 가진 항-CD19 CAR을 개발하였다(국제 특허출원 공개 제WO2016/102965호의 실시예 2 및 3 참조, 이의 내용은 본원에 참고로 포함됨). CAR의 항원 결합 도메인은 아래에서 확인된 CDR 및 VH/VL 영역을 가진 CD19 결합제 CD19ALAb를 기반으로 한 것이다.

따라서, 본 개시내용은

a) 서열 CDR1 - SYWMN(서열번호 1), CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK(서열번호 2) 및 CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY(서열번호 3)를 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH); 및

b) 서열 CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN(서열번호 4), CDR2 - DASNLVS(서열번호 5), 및 CDR3 - QQSTEDPWT(서열번호 6)를 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함하는 CD19 결합 도메인을 포함하는 CAR도 제공한다.

CD19 결합 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 돌연변이(치환, 추가 또는 결실)를 특정 또는 각각의 CDR에 도입할 수 있다. 각각의 CDR은 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다.

본 개시내용의 CAR은 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

scFv는 VH-VL 배향(서열번호 12, 13 및 14로 표시됨) 또는 VL-VH 배향으로 존재할 수 있다.

본 개시내용의 CAR은 하기 VH 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

본 개시내용의 CAR은 하기 VL 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

본 발명의 CAR은

a) 서열 CDR1 - GYAFSSS(서열번호 30), CDR2 - YPGDED(서열번호 31), 및 CDR3 - SLLYGDYLDY(서열번호 32)를 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH); 및

b) 서열 CDR1 - SASSSVSYMH(서열번호 33), CDR2 - DTSKLAS(서열번호 34), 및 CDR3 - QQWNINPLT(서열번호 35)를 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함하는 CD19 결합 도메인을 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 인간 항체 프레임워크에 이식된 상기 정의된 6개의 CDR을 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 서열번호 36으로서 나타낸 서열을 가진 VH 도메인 및/또는 서열번호 37로서 나타낸 서열을 가진 VL 도메인, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 배향 VH-VL로 scFv를 포함할 수 있다.

CD19 결합 도메인은 서열번호 38로서 나타낸 서열 또는 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

변이체 서열이 (적절한 경우, 상보적 VL 또는 VH 도메인과 함께 사용될 때) CD19에 결합하는 능력을 보유하는 한, 본 개시내용의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 21, 13, 7, 8, 9, 10, 14, 11, 26, 37 또는 38로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

2개의 폴리펩타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 무료로 입수될 수 있는 BLAST와 같은 프로그램에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

CD22

인간 CD22 항원은 렉틴의 SIGLEC 패밀리에 속하는 분자이다. 이 항원은 성숙 B 세포의 표면과 일부 미성숙 B 세포에서 발견된다. 일반적으로 말해서, CD22는 면역 시스템의 과활성화 및 자가면역 질환의 발생을 예방하는 조절 분자이다.

CD22는 그의 N-말단에 위치한 면역글로불린(Ig) 도메인으로 시알산에 특이적으로 결합하는 당 결합 막횡단 단백질이다. Ig 도메인의 존재는 CD22를 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원으로 만든다. CD22는 B 세포 수용체(BCR) 신호전달에 대한 억제 수용체로서 작용한다.

CD22는 2개의 이소형(isoform), 즉 7개의 도메인, 및 3개의 ITIM(면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프)과 ITAM으로 구성된 세포질내 꼬리를 가진 이소형; 및 5개의 세포외 도메인, 및 1개의 ITIM을 가진 세포질내 꼬리로 구성된 스플라이싱 변이체로 존재할 수 있는 IgSF의 분자이다. CD22는 항원에 대한 B 세포 반응의 제어에 관여하는 억제 수용체인 것으로 생각된다. CD19와 마찬가지로, CD22는 일부 비-림프성 조직에서의 발현이 기재되어 있지만, 범-B 항원인 것으로 널리 간주된다. 치료적 단일클론 항체 및 면역접합체를 사용한 CD22의 표적화는 임상 시험에 들어갔다.

항-CD22 CAR의 예는 문헌[Haso et al. (Blood; 2013; 121(7))]에 기재되어 있다. 구체적으로, m971, HA22 및 BL22 scFv로부터 유래한 항원 결합 도메인을 가진 항-CD22 CAR이 기재되어 있다.

항-CD22 CAR의 항원 결합 도메인은 30 내지 50 nM, 예를 들어, 30 내지 40 nM 범위 내의 K_D로 CD22에 결합할 수 있다. K_D는 약 32 nM일 수 있다.

CD-22는 일반적으로 Ig 도메인 1 내지 Ig 도메인 7로서 확인된 7개의 세포외 IgG 유사 도메인을 갖고, 이때 Ig 도메인 7은 B 세포막에 가장 가깝고 Ig 도메인 7은 Ig 세포막으로부터 가장 멀리 있다(상기 문헌[Haso et al 2013]의 도 2b 참조).

CD22의 아미노산 서열(http://www.uniprot.org/uniprot/P20273)의 관점에서 Ig 도메인의 위치는 하기 표에 요약되어 있다.

제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 막 원위 에피토프에 결합할 수 있다. 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 Ig 도메인 7, 6, 5 또는 4, 예를 들어, CD22의 Ig 도메인 5의 에피토프에 결합할 수 있다. 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 아미노산 20과 416 사이, 예를 들어, CD22의 아미노산 242와 326 사이에 위치한 에피토프에 결합할 수 있다.

이하에 기재된 항-CD22 항체 HA22와 BL22(상기 문헌[Haso et al 2013]) 및 CD22ALAb는 CD22의 Ig 도메인 5의 에피토프에 결합한다.

제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 막 근위 에피토프에 결합할 수 없다. 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 Ig 도메인 3, 2 또는 1의 에피토프에 결합할 수 없다. 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22의 아미노산 419와 676 사이, 예컨대, CD22의 505와 676 사이에 위치한 에피토프에 결합할 수 없다.

본 발명자들은 결합제 m971을 포함하는 공지된 항-CD22 CAR(국제 특허출원 공개 제WO2016/102965호의 실시예 2와 3, 및 상기 문헌[Haso et al (2013)] 참조, 이들의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 비해 개선된 특성을 가진 항-CD22 CAR을 개발하였다. CAR의 항원 결합 도메인은 이하에 확인된 CDR 및 VH/VL 영역을 가진 CD22 결합제 CD22ALAb를 기반으로 한 것이다.

따라서, 본 개시내용은

a) 서열 CDR1 - NYWIN(서열번호 15), CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD(서열번호 16), 및 CDR3 - DTQERSWYFDV(서열번호 17)를 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH); 및

b) 서열 CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH(서열번호 18), CDR2 - KVSNRFS(서열번호 19), 및 CDR3 - SQSTHVPWT(서열번호 20)를 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함하는 CD22 결합 도메인을 포함하는 CAR도 제공한다.

CD22 결합 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 돌연변이(치환, 추가 또는 결실)를 특정 또는 각각의 CDR 내로 도입할 수 있다. 각각의 CDR은 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다.

본 개시내용의 CAR은 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

scFv는 VH-VL 배향(서열번호 25 및 26으로 표시됨) 또는 VL-VH 배향으로 존재할 수 있다.

본 개시내용의 CAR은 하기 VH 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

본 개시내용의 CAR은 하기 VL 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:

변이체 서열이 (적절한 경우, 상보적 VL 또는 VH 도메인과 함께 사용될 때) CD22에 결합하는 능력을 보유하는 한, 본 개시내용의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 25, 26, 21, 22, 23 또는 24로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

다른 항-CD22 항체, 예컨대, 마우스 항-인간 CD22 항체 1D9-3, 3B4-13, 7G6-6, 6C4-6, 4D9-12, 5H4-9, 10C1-D9, 15G7-2, 2B12-8, 2C4-4 및 3E10-7; 및 인간화된 항-인간 CD22 항체 LT22 및 이노투주맙(Inotuzumab)(G5_44)이 공지되어 있다. 표 1은 각각의 항체에 대한 CD22의 표적 에피토프의 VH, VL 및 CDR 서열(볼드체 및 밑줄)과 위치를 요약한다. 이 항체들(또는 이들의 CDR 서열)은 본 발명의 CD22 CAR에 사용되기에 적합하다.

본 개시내용은

a) 서열 CDR1 - NFAMA(서열번호 101), CDR2 - SISTGGGNTYYRDSVKG(서열번호 102), 및 CDR3 - QRNYYDGSYDYEGYTMDA(서열번호 103)를 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH); 및

b) CDR1 - RSSQDIGNYLT(서열번호 104), CDR2 - GAIKLED(서열번호 105), 및 CDR3 - LQSIQYP(서열번호 106)를 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL)

을 포함하는 CD22 결합 도메인을 포함하는 CAR도 제공한다.

CD22 결합 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 돌연변이(치환, 추가 또는 결실)를 특정 또는 각각의 CDR 내로 도입할 수 있다. 각각의 CDR은 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다.

본 개시내용의 CAR은 하기 VH 서열을 포함할 수 있다:

본 개시내용의 CAR은 하기 VL 서열을 포함할 수 있다:

scFv는 VH-VL 배향 또는 VL-VH 배향으로 존재할 수 있다.

변이체 서열이 (적절한 경우, 상보적 VL 또는 VH 도메인과 함께 사용될 때) CD22에 결합하는 능력을 보유하는 한, 본 개시내용의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 63 또는 64로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

B 세포 개체발생 및 후속 종양 동안 B 세포 항원 발현

CD19는 범-B 항원으로서 널리 간주되지만, 매우 가끔 일부 계통 불신을 표시할 수 있다. CD19 분자는 보다 작은 도메인에 의해 분리된 2개의 세포외 IgSF 도메인, 및 하나의 ITAM을 가진, 거의 분자의 세포외 부분만큼 큰 긴 세포질내 꼬리로 구성된다. CD19는 B 세포의 발달 및 활성화에 있어서 핵심 분자이다. CD22는 2개의 이소형, 즉 7개의 도메인, 및 3개의 ITIM(면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프) 및 ITAM으로 구성된 세포질내 꼬리를 가진 이소형; 및 5개의 세포외 도메인, 및 하나의 ITIM을 가진 세포질내 꼬리로 구성된 스플라이싱 변이체로 존재할 수 있는 IgSF의 분자이다. CD22는 항원에 대한 B 세포 반응의 제어에 관여하는 억제 수용체인 것으로 생각된다. CD19와 마찬가지로, CD22는 일부 비-림프성 조직에서의 발현이 기재되어 있지만(Wen et al. (2012) J. Immunol. Baltim. Md 1950 188, 1075-1082), 범-B 항원인 것으로 널리 간주된다. 치료적 단일클론 항체 및 면역접합체를 사용한 CD22의 표적화는 임상 시험에 들어갔다. CD22 특이적 CAR의 생성은 기재되어 있다(Haso et al, 2013, Blood: Volume 121; 7: 1165-74, and James et al 2008, Journal of immunology, Volume 180; Issue 10; Pages 7028-38).

B 세포 백혈병의 상세한 면역표현형분류 연구는 표면 CD19가 항상 존재하지만, 표면 CD22가 거의 항상 존재한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 라포니 연구진(Raponi et al)(2011, 상기 문헌)은 B-ALL의 427건 사례의 표면 항원 표현형을 연구하였고 연구된 사례 중 341건의 사례에서 CD22가 존재함을 발견하였다.

전술된 CAR19 표적화 후 CD19 하향조절의 결과는 골디-콜드만 가설에 의해 설명될 수 있다. 골디-콜드만 가설은 종양 세포가 그의 내재하는 유전적 불안정성에 의존하는 비율로 내성 표현형으로 돌연변이되고 암이 내성 클론을 함유할 확률이 돌연변이율 및 종양의 크기에 의해 좌우된다고 예측한다. 암세포가 세포독성 T 세포의 직접적인 사멸에 대해 본질적으로 내성을 갖게 되는 것은 어려울 수 있지만, 항원 상실은 여전히 가능하다. 실제로, 이 현상은 흑색종 항원 및 EBV 유도 림프종을 표적화하였을 때 이미 보고되었다. 골디-콜드만 가설에 따르면, 치료의 가장 좋은 기회는 교차내성이 없는 표적을 동시에 공격하는 것이다. CD22가 B-ALL의 거의 모든 사례에서 발현된다는 점을 고려할 때, CD22와 함께 CD19의 동시적 CAR 표적화는 내성 CD19 음성 클론의 출현을 감소시킬 수 있다.

항원 결합 도메인

항원 결합 도메인은 항원을 인식하는 CAR의 일부이다. 항체, 항체 모방체 및 T 세포 수용체의 항원 결합 부위를 기반으로 한 항원 결합 도메인을 비롯한 많은 항원 결합 도메인들이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 단일클론 항체로부터 유래한 단일 쇄 가변 단편(scFv); 표적 항원의 천연 리간드; 표적에 대한 충분한 친화성을 가진 펩타이드; 단일 도메인 항체; 인공 단일 결합제, 예컨대, Darpin(설계된 안키린 반복부 단백질); 또는 T 세포 수용체로부터 유래한 단일 쇄를 포함할 수 있다.

CD19에 결합하는 CAR의 항원 결합 도메인은 CD19에 결합할 수 있는 임의의 도메인일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 표 1에 기재된 CD19 결합제를 포함할 수 있다.

CD19에 결합하는 CAR의 항원 결합 도메인은 표 2에 제시된 CD19 결합제들 중 하나로부터 유래한 서열을 포함할 수 있다.

CD22에 결합하는 CAR의 항원 결합 도메인은 CD22에 결합할 수 있는 임의의 도메인일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 표 3에 기재된 CD22 결합제를 포함할 수 있다.

스페이서 도메인

CAR은 항원 결합 도메인을 막횡단 도메인과 연결하고 엔도도메인으로부터 항원 결합 도메인을 공간적으로 분리하기 위해 스페이서 서열을 포함한다. 유연한 스페이서는 항원 결합 도메인이 결합을 용이하게 하기 위해 상이한 방향으로 배향될 수 있게 한다.

본 발명의 세포에서, 제1 CAR과 제2 CAR은 상이한 스페이서 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서 서열은 예를 들어, IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 인간 CD8 줄기 또는 마우스 CD8 줄기를 포함할 수 있다. 스페이서는 대안적으로 IgG1 Fc 영역, IgG1 힌지 또는 CD8 줄기와 유사한 길이 및/또는 도메인 간격 특성을 가진 대안적 링커 서열을 포함할 수 있다. 인간 IgG1 스페이서는 Fc 결합 모티프를 제거하도록 변경될 수 있다.

항-CD19 CAR을 위한 스페이서는 CD8 줄기 스페이서, 또는 CD8 줄기 스페이서와 동등한 길이를 가진 스페이서를 포함할 수 있다. 항-CD19 CAR을 위한 스페이서는 적어도 30개의 아미노산 또는 적어도 40개의 아미노산을 가질 수 있다. 이 스페이서는 35개 내지 55개의 아미노산, 예를 들어, 40개 내지 50개의 아미노산을 가질 수 있다. 이 스페이서는 약 46개의 아미노산을 가질 수 있다.

항-CD22 CAR을 위한 스페이서는 IgG1 힌지 스페이서, 또는 IgG1 힌지 스페이서와 동등한 길이를 가진 스페이서를 포함할 수 있다. 항-CD22 CAR을 위한 스페이서는 30개 미만의 아미노산 또는 25개 미만의 아미노산을 가질 수 있다. 이 스페이서는 15개 내지 25개의 아미노산, 예를 들어, 18개 내지 22개의 아미노산을 가질 수 있다. 이 스페이서는 약 20개의 아미노산을 가질 수 있다.

이 스페이서들에 대한 아미노산 서열의 예는 이하에 제공되어 있다.

CAR은 전형적으로 동종이량체이므로(도 1a 참조), 가교페어링은 이종이량체성 키메라 항원 수용체를 생성할 수 있다. 이것은 다양한 이유로, 예를 들어: (1) 가교페어링된 CAR이 하나의 항원에만 결합할 수 있도록 에피토프가 표적 세포에서 동일한 "수준"으로 존재하지 않을 수 있고; (2) 2개의 상이한 scFv로부터의 VH 및 VL이 교체되어, 표적을 인식하지 못하거나 더 심각하게는 예상치 못한 예측되지 않은 항원을 인식할 수 있기 때문에 바람직하지 않을 수 있다. 제1 CAR의 스페이서는 가교페어링을 피하기 위해 제2 CAR의 스페이서와 충분히 상이할 수 있다. 제1 스페이서의 아미노산 서열은 제2 스페이서와 아미노산 수준에서 50%, 40%, 30% 또는 20% 미만의 동일성을 공유할 수 있다.

코일드 코일 도메인

CAR은 전형적으로 항원 결합 도메인을 막횡단 도메인과 연결하기 위한 스페이서 서열을 포함한다. 스페이서는 항원 결합 도메인이 적절한 배향 및 도달을 가질 수 있게 한다. 스페이서는 또한 리간드 결합 시 포스파타제로부터의 분리를 제공한다.

본 발명의 CAR은 코일드 코일 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 구체적으로, CD22에 특이적인 CAR은 코일드 코일 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 코일드 코일 스페이서 도메인은 당분야에서 이미 기재된 스페이서에 비해 많은 이점을 제공한다.

코일드 코일은 2개 내지 7개의 알파 나선이 로프의 가닥처럼 함께 감긴 구조적 모티프이다(도 7). 많은 내생성 단백질들은 코일드 코일 도메인을 포함한다. 코일드 코일 도메인은 단백질 폴딩에 관여할 수 있거나(예를 들어, 동일한 단백질 쇄 내에서 여러 알파 나선형 모티프들과 상호작용함), 단백질-단백질 상호작용을 담당할 수 있다. 후자의 경우, 코일드 코일은 동종 또는 이종 올리고머 구조를 시작할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 '다량체' 및 '다량체화'는 동의어이고 '올리고머' 및 '올리고머화'와 교환 가능하다.

코일드 코일 도메인의 구조는 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Lupas & Gruber (Advances in Protein Chemistry; 2007; 70; 37-38)]에 기재되어 있다.

코일드 코일은 일반적으로 헵타드(heptad) 반복부로서 지칭되는, 소수성(h) 아미노산 잔기와 하전된(c) 아미노산 잔기의 반복된 패턴인 hxxhcxc를 함유한다. 헵타드 반복부에서의 위치는 일반적으로 abcdefg로서 표지되고, 이때 a 및 d는 종종 이소류신, 류신 또는 발린에 의해 점유되는 소수성 위치이다. 이 반복 패턴을 가진 서열을 알파 나선형 2차 구조로 폴딩하는 것은 소수성 잔기가 왼손 방식으로 나선 주위를 부드럽게 감아 양친매성 구조를 형성하는 '줄무늬(stripe)'로서 제시되게 한다. 2개의 이러한 나선이 세포질에서 그들 자신을 배열하는 가장 유리한 방식은 소수성 가닥을 친수성 아미노산들 사이에 끼워진 상태로 서로에 대해 감싸는 것이다. 따라서, 올리고머화를 위한 열역학적 구동력을 제공하는 것은 소수성 표면의 매설(burial)이다. 코일드 코일 계면에서의 팩킹은 a 및 d 잔기의 측쇄들 사이에 거의 완전한 반 데르 발스 접촉에 의해 매우 단단하다.

α-나선은 평행 또는 역평행일 수 있고, 일반적으로 왼손 수퍼코일을 채택한다. 비록 불리하긴 하지만, 몇몇 오른손 코일드 코일도 자연계 및 설계된 단백질에서 관찰되었다.

코일드 코일 도메인은 코일드 코일 도메인을 포함하는 CAR 또는 보조 폴리펩타이드의 복합체가 형성되도록 코일드 코일 다량체를 형성할 수 있는 임의의 코일드 코일 도메인일 수 있다.

코일드 코일 도메인의 서열과 최종 폴딩된 구조 사이의 관계는 당분야에서 잘 이해되어 있다(Mahrenholz et al; Molecular & Cellular Proteomics; 2011; 10(5):M110.004994). 따라서, 코일드 코일 도메인은 합성에 의해 생성된 코일드 코일 도메인일 수 있다.

코일드 코일 도메인을 함유하는 단백질의 예는 키네신(kinesin) 운동 단백질, D형 간염 델타 항원, 고세균 박스 C/D sRNP 코어 단백질, 연골 올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩타이드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 억제인자(repressor) 또는 아포지단백질 E를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.

다양한 코일드 코일 도메인들의 서열은 이하에 표시되어 있다:

코일드 코일 도메인은 올리고머화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 코일드 코일 도메인은 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체를 형성할 수 있다.

코일드 코일 도메인은 류신 지퍼와 상이하다. 류신 지퍼는 이량체화 도메인으로서 작용하는 수퍼 2차 구조물이다. 이의 존재는 평행 알파 나선에서 부착력을 생성한다. 단일 류신 지퍼는 한쪽 면을 따라 이어지는 소수성 영역을 가진 양친매성 알파 나선을 형성하는, 대략 7개 잔기 간격으로 다수의 류신 잔기들로 구성된다. 이 소수성 영역은 이량체화를 위한 영역을 제공하여, 모티프들이 함께 "지퍼"를 형성하게 한다. 류신 지퍼는 전형적으로 길이가 20개 내지 40개 아미노산, 예를 들어, 대략 30개 아미노산이다.

류신 지퍼는 전형적으로 2개의 상이한 서열에 의해 형성되고, 예를 들어, 산성 류신 지퍼는 염기성 류신 지퍼와 이종이량체화된다. 류신 지퍼의 예는 이하에 더 자세히 기재되는 도킹 도메인(DDD1) 및 고착 도메인(AD1)이다.

류신 지퍼는 이량체를 형성하는 반면, 본 발명의 코일드 코일 스페이서는 다량체(삼량체 이상)를 형성한다. 류신 지퍼는 서열의 이량체화 부분에서 이종이량체화되는 반면, 코일드 코일 도메인은 동종이량체화된다.

과민감성 CAR은 CAR의 원자가를 증가시킴으로써 제공될 수 있다. 구체적으로, 상호작용하여 2개 초과의 코일드 코일 도메인을 포함함으로써 2개 초과의 CAR을 포함하는 다량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 스페이서 도메인의 사용은 존재하는 ITAM의 수 증가 및 올리고머 CAR 복합체의 결합력으로 인해 저밀도 리간드를 발현하는 표적에 대한 민감성을 증가시킨다.

따라서, 본원은 적어도 3개의 CAR 형성 폴리펩타이드의 다량체화를 가능하게 하는 코일드 코일 스페이서 도메인을 포함하는 CAR 형성 폴리펩타이드를 제공한다. 다시 말해, 이 CAR은 코일드 코일 도메인의 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체 또는 칠량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 도메인을 포함한다.

2개 초과의 코일드 코일 도메인을 포함하는 다량체를 형성할 수 있는 코일드 코일 도메인의 예는 연골 올리고머 매트릭스 단백질(COMP), 만노스 결합 단백질 A, 코일드 코일 세린 풍부 단백질 1, 폴리펩타이드 방출 인자 2, SNAP-25, SNARE, Lac 억제인자 또는 아포지단백질 E로부터 유래한 코일드 코일 도메인들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다(상기 서열번호 70 내지 82 참조).

코일드 코일 도메인은 COMP 코일드 코일 도메인일 수 있다.

COMP는 자연에서 가장 안정한 단백질 복합체들 중 하나이고(0℃ 내지 100℃ 및 광범위한 pH에서 안정함) 4 내지 6 M 구아니딘 염산염에 의해서만 변성될 수 있다. COMP 코일드 코일 도메인은 오량체를 형성할 수 있다. COMP는 또한 세포외 공간에서 천연적으로 발현되는, 내생적으로 발현된 단백질이다. 이것은 합성 스페이서에 비해 면역원성의 위험을 감소시킨다. 나아가, COMP 코일드 코일 모티프의 결정 구조를 풀어, 스페이서 길이에 대한 정확한 추정치를 제공한다(도 8). COMP 구조물은 (약 8.1 nm인 인간 IgG의 힌지 및 CH2CH3 도메인에 비해) 길이가 약 5.6 nm이다.

코일드 코일 도메인은 서열번호 83으로서 나타낸 서열 또는 이의 단편으로 구성될 수 있거나 이러한 서열 또는 단편을 포함할 수 있다.

도 8에 나타낸 바와 같이, N-말단에서 COMP 코일드 코일 도메인을 절단하고 표면 발현을 유지할 수 있다. 따라서, 코일드 코일 도메인은 N-말단에서 절단된 서열번호 83의 절단된 버전을 포함할 수 있거나 이러한 버전으로 구성될 수 있다. 절단된 COMP는 서열번호 83의 5개 C-말단 아미노산, 즉 서열 CDACG를 포함할 수 있다. 절단된 COMP는 5개 내지 44개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개의 아미노산을 포함할 수 있다. 절단된 COMP는 서열번호 83의 C-말단에 상응할 수 있다. 예를 들어, 20개의 아미노산을 포함하는 절단된 COMP는 서열 QQVREITFLKNTVMECDACG(서열번호 84)를 포함할 수 있다. 절단된 COMP는 다량체화에 관여하는 시스테인 잔기(들)를 보유할 수 있다. 절단된 COMP는 다량체를 형성하는 능력을 보유할 수 있다.

HIV로부터 유래한 gp41과 같은 육량체를 형성하는 다양한 코일드 코일 도메인들, 및 문헌[N. Zaccai et al. (2011) Nature Chem. Bio., (7) 935-941)]에 기재된 인공 단백질 설계 육량체 코일드 코일이 공지되어 있다. GCN4-p1 류신 지퍼의 돌연변이체 형태는 칠량체성 코일드 코일 구조물을 형성한다(J. Liu. et al., (2006) PNAS (103) 15457-15462).

변이체 서열이 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 보유하는 한, 코일드 코일 도메인은 전술된 코일드 코일 도메인들 중 한 코일드 코일 도메인의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체 서열이 코일드 코일 올리고머를 형성하는 능력을 보유하는 한, 코일드 코일 도메인은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 83 또는 70 내지 82로서 표시된 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

2개의 폴리펩타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 무료로 입수될 수 있는 BLAST와 같은 프로그램에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

코일드 코일 도메인을 포함하는 CAR은 국제 특허출원 공개 제WO2016/151315호에 더 상세히 기재되어 있고, 이 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

막횡단 도메인

막횡단 도메인은 막에 걸쳐 있는 CAR 서열이다.

막횡단 도메인은 막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조물일 수 있다. 이것은 전형적으로 여러 소수성 잔기들로 구성된 알파 나선이다. 본 발명의 막횡단 부분을 공급하기 위해 임의의 막횡단 단백질의 막횡단 도메인을 사용할 수 있다. 단백질의 막횡단 도메인의 존재 및 범위는 TMHMM 알고리즘(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)을 사용함으로써 당분야에서 숙련된 자에 의해 확인될 수 있다. 또한, 단백질의 막횡단 도메인이 비교적 단순한 구조물, 즉 막에 걸쳐 있기에 충분한 길이의 소수성 알파 나선을 형성할 것으로 예측되는 폴리펩타이드 서열이라는 점을 고려할 때, 인위적으로 설계된 TM 도메인도 사용될 수 있다(미국 특허 제7052906호(B1)는 합성 막횡단 구성요소를 기술함).

막횡단 도메인은 우수한 수용체 안정성을 제공하는 CD28로부터 유래할 수 있다.

막횡단 도메인은 인간 Tyrp-1로부터 유래할 수 있다. tyrp-1 막횡단 서열은 서열번호 85로서 표시된다.

활성화 엔도도메인

엔도도메인은 CAR의 신호 전달 부분이다. 항원 인식 후, 수용체 클러스터, 천연 CD45 및 CD148은 시냅스로부터 제외되고 신호는 세포에게 전달된다. 가장 통상적으로 사용되는 엔도도메인 구성요소는 3개의 ITAM을 함유하는 CD3-제타의 엔도도메인 구성요소이다. 이것은 항원이 결합된 후 활성화 신호를 T 세포에게 전달한다. CD3-제타는 충분한 능력을 가진 활성화 신호를 제공하지 않을 수 있고 추가 보조자극 신호전달이 필요할 수 있다. 예를 들어, 키메라 CD28 및 OX40은 CD3-제타와 함께 사용되어 증식/생존 신호를 전달할 수 있거나, 이들 세 가지 모두가 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 세포는 엔도도메인을 각각 가진 2개의 CAR을 포함한다.

제1 CAR의 엔도도메인은

(i) ITAM 함유 엔도도메인, 예컨대, CD3 제타의 엔도도메인; 및/또는

(ii) 생존 신호를 전달하는 도메인, 예를 들어, TNF 수용체 패밀리 엔도도메인, 예컨대, OX-40 또는 4-1BB

를 포함할 수 있다.

제2 CAR의 엔도도메인은

(i) ITAM 함유 엔도도메인, 예컨대, CD3 제타의 엔도도메인; 및/또는

(ii) 보조자극 도메인, 예컨대, CD28의 엔도도메인

을 포함할 수 있다.

이 배열에서, 보조자극 도메인과 생존 신호 생성 도메인은 OR 게이트에서 2개(또는 더 많은) CAR들 사이에 "공유"된다. 예를 들어, OR 게이트가 2개의 CAR, 즉 CAR A 및 CAR B를 가진 경우, CAR A는 보조자극 도메인(예를 들어, CD28 엔도도메인)을 포함할 수 있고 CAR B는 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인, 예컨대, OX-40 또는 4-1BB를 포함할 수 있다.

ITAM 모티프를 함유하는 엔도도메인은 본 발명에서 활성화 엔도도메인으로서 작용할 수 있다. 여러 단백질들이 하나 이상의 ITAM 모티프를 가진 엔도도메인을 함유하는 것으로 알려져 있다. 이러한 단백질의 예는 몇몇을 나열하자면 CD3 엡실론 쇄, CD3 감마 쇄 및 CD3 델타 쇄를 포함한다. ITAM 모티프는 임의의 2개의 다른 아미노산에 의해 류신 또는 이소류신으로부터 분리되어 시그니처 YxxL/I를 제공하는 티로신으로서 용이하게 인식될 수 있다. 항상 그런 것은 아니지만, 전형적으로 이 모티프들 중 2개는 분자의 꼬리에서 6개 내지 8개의 아미노산에 의해 분리된다(YxxL/Ix(6-8)YxxL/I). 따라서, 당분야에서 숙련된 자는 활성화 신호를 전달하기 위해 하나 이상의 ITAM을 함유하는 기존 단백질을 쉽게 찾을 수 있다. 또한, 모티프가 단순하고 복잡한 2차 구조가 요구되지 않는다는 점을 고려할 때, 당분야에서 숙련된 자는 활성화 신호를 전달하기 위해 인공 ITAM을 함유하는 폴리펩타이드를 설계할 수 있다(합성 신호전달 분자에 관한 국제 특허출원 공개 제WO 2000/063372호 참조).

활성화 엔도도메인을 가진 CAR의 막횡단 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인(엔도도메인)은 서열번호 86, 87 또는 88로서 나타낸 서열 또는 적어도 80% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함할 수 있다.

변이체 서열이 효과적인 막횡단 도메인 및 효과적인 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 제공하는 한, 변이체 서열은 서열번호 86, 87 또는 88에 대한 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.

"분할" OR 게이트 엔도도메인

본 발명은 보조자극/생존 신호 도메인이 2개의 CAR 사이에 "분할"되어 있는 OR 게이트를 제공한다.

이와 관련하여, 본 발명은 CD19에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 키메라 항원 수용체(CAR), 및 CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 세포 표면에서 공-발현하는 세포를 제공하는 것으로, 이때 각각의 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제1 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하고, 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 포함한다.

제1 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하고 보조자극 도메인(예컨대, CD28 엔도도메인)을 포함하지 않는다. 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 도메인을 포함하고 생존 신호를 전달하는 도메인(예컨대, TNF 수용체 패밀리 엔도도메인)을 포함하지 않는다.

보조자극 도메인은 CD28 보조자극 도메인일 수 있다. CD28 보조자극 도메인은 서열번호 89로서 나타낸 서열을 가질 수 있다.

변이체 서열이 항원 인식 시 T 세포를 보조자극하는, 즉 신호 2를 T 세포에게 제공하는 능력을 보유하는 한, 본 발명의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 89로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

TNF 수용체 패밀리 엔도도메인은 OX40 또는 4-1BB 엔도도메인일 수 있다. OX40 엔도도메인은 서열번호 90으로서 나타낸 서열을 가질 수 있다. 4-1BB 엔도도메인은 서열번호 91로서 나타낸 서열을 가질 수 있다.

변이체 서열이 항원 인식 시 생존 신호를 T 세포에게 전달하는 능력을 보유하는 한, 본 발명의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 90 또는 91로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

제1 CAR 및/또는 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 ITAM 함유 도메인, 예컨대, CD3 제타 도메인도 포함할 수 있다. CD3 제타 도메인은 서열번호 92로서 나타낸 서열을 가질 수 있다.

변이체 서열이 항원 인식 시 T 세포 신호전달을 유도하는, 즉 신호 1을 T 세포에게 제공하는 능력을 보유하는 한, 본 발명의 CAR은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 92로서 나타낸 서열의 변이체를 포함할 수 있다.

제1 CAR은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인이고;

TNF는 TNF 수용체 엔도도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이다.

"TNF"는 TNF 수용체 엔도도메인, 예컨대, OX40 또는 4-1BB 엔도도메인일 수 있다.

"ITAM"은 CD3 제타 엔도도메인일 수 있다.

제2 CAR은 하기 구조를 가질 수 있다:

AgB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM

이 구조에서,

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인이고;

costim은 보조자극 도메인이고;

ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인이다.

"Costim"은 CD28 보조자극 도메인일 수 있다.

"분할" 엔도도메인을 가진 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR 둘 다를 코딩하는 핵산 서열; 및 2개의 핵산, 즉 상기 정의된 바와 같이 분할 엔도도메인을 포함하는 제1 CAR을 코딩하는 핵산 및 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 키트도 제공한다.

공-발현 부위

본 발명의 제2 측면은 제1 CAR 및 제2 CAR을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

상기 핵산은 절단 부위에 의해 연결된 2개의 CAR 분자를 포함하는 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 이 절단 부위는 폴리펩타이드가 생성될 때, 임의의 외부 절단 활성을 필요로 하지 않으면서 제1 CAR 및 제2 CAR로 즉시 절단되도록, 자가 절단 부위 수 있다.

구제역 바이러스(FMDV) 2A 펩타이드 및 유사한 서열(Donnelly et al, Journal of General Virology (2001), 82, 1027-1041), 예를 들어, 서열번호 12로서 나타낸 서열을 가진, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스로부터의 2A 유사 서열을 포함하는 다양한 자가 절단 부위들이 공지되어 있다:

이 서열들은 시스 작용 하이드롤라제(hydrolase) 요소(CHYSEL) 서열로서 지칭될 수도 있다.

공-발현 서열은 내부 리보좀 진입 서열(IRES)일 수 있다. 공-발현 서열은 내부 프로모터일 수 있다.

핵산 구축물은 다수의 폴리펩타이드의 생성을 이끌어내는 다수의 공-발현 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 구축물은 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 다수의 2A 유사 서열을 포함할 수 있다.

CAR의 활성 조절

ITAM 인산화의 증강

생체내에서 T 세포가 활성화되는 동안(도 10a에 개략적으로 예시됨), T 세포 수용체(TCR)에 의한 항원 인식은 CD3ζ의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)의 인산화를 야기한다. 인산화된 ITAM은 ZAP70 SH2 도메인에 의해 인식되어, T 세포 활성화를 유발한다.

T 세포 활성화는 TCR에 의한 항원 인식을 다운스트림 활성화 신호로 전환하기 위해 동역학적 분리를 이용한다. 요약하건대, 바닥 상태에서 T 세포막의 신호 전달 구성요소는 동적 항상성 상태로 존재하므로, 탈인산화된 ITAM이 인산화된 ITAM보다 선호된다. 이것은 막횡단 CD45/CD148 포스파타제의 활성이 막에 연결된 키나제, 예컨대, lck보다 더 크기 때문이다. T 세포가 동족 항원의 T 세포 수용체(또는 CAR) 인식을 통해 표적 세포와 맞물릴 때, 단단한 면역학적 시냅스가 형성된다. T 세포와 표적 막의 이 긴밀한 병치는 CD45/CD148을 배제시키는데, 이는 이들의 큰 엑토도메인이 시냅스에 피팅될 수 없기 때문이다. 포스파타제의 부재 하에, 시냅스에서 고농도의 T 세포 수용체 관련 ITAM 및 키나제의 분리는 인산화된 ITAM이 선호되는 상태를 유발한다. ZAP70은 인산화된 ITAM의 역치를 인식하고 T 세포 활성화 신호를 전파한다.

이 과정은 CAR 매개 T 세포 활성화 동안 본질적으로 동일하다. 활성화 CAR은 그의 세포내 신호전달 도메인 내에 하나 이상의 ITAM(들)을 포함하는데, 이는 일반적으로 신호전달 도메인이 CD3ζ의 엔도도메인을 포함하기 때문이다. CAR에 의한 항원 인식은 CAR 신호전달 도메인에서 ITAM(들)의 인산화를 유발하여, T 세포 활성화를 야기한다.

도 10b에 개략적으로 예시된 바와 같이, 억제 면역수용체, 예컨대, PD1은 인산화된 ITAM의 탈인산화를 야기한다. PD1은 PTPN6(SHP-1) 및 PTPN11(SHP-2)과 같은 분자의 SH2 도메인에 의해 인식되는 ITIM을 그의 엔도도메인 내에 가진다. 인식 시, PTPN6은 막 인접 영역으로 동원되고, 그 후 그의 포스파타제 도메인은 ITAM 도메인을 탈인산화하여 면역 활성화를 억제한다.

CAR-T 세포의 활성 조절

체크포인트 억제

CAR 매개 T 세포 활성화는 억제 면역수용체, 예컨대, CTLA4, PD-1, LAG-3, 2B4 또는 BTLA 1에 의해 매개된다(앞서 언급되고 도 10b에 개략적으로 예시됨).

PD-1/PD-L1

암 질환 상태에서, 종양 세포의 PD-L1과 T 세포의 PD-1의 상호작용은 전술된 바와 같이 T 세포 활성화를 감소시킴으로써, 면역 시스템이 종양 세포를 공격하려는 노력을 방해한다. PD-L1과 PD-1 수용체의 상호작용을 차단하는 억제제의 사용은 암이 이러한 방식으로 면역 시스템을 회피하는 것을 방지할 수 있다. 여러 PD-1 및 PD-L1 억제제들이 다른 암 유형들 중에서 진행된 흑색종, 비-소세포 폐암, 신장 세포 암종, 방광암 및 호지킨 림프종에 사용하기 위해 임상 시험되고 있다. PD1 억제제인 니볼루맙(Nivolumab)과 펨브롤리주맙(Pembrolizumab) 및 PD-L1 억제제인 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 두르발루맙(Durvalumab)을 비롯한 일부 이러한 억제제들이 현재 승인되었다.

CTLA4

CTLA4는 활성화된 T 세포에 의해 발현되고 억제 신호를 T 세포에게 전달하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T 세포 보조자극 단백질인 CD28과 상동성을 갖고, 이 분자들 둘 다가 항원 제시 세포에서 각각 B7-1 및 B7-2로서도 지칭되는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 CD28보다 더 큰 친화성 및 결합력으로 CD80 및 CD86에 결합함으로써, 그의 리간드에 대해 CD28을 능가할 수 있다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에게 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다.

CTLA4에 대한 길항제 항체는 이필리무맙(ipilimumab) 및 트레멜리무맙(tremelimumab)을 포함한다.

LAG-3

LAG-3 및 CD223으로서도 알려진 림프구 활성화 유전자 3은 T 세포 기능에 대한 다양한 생물학적 효과를 가진 면역 체크포인트 수용체이다.

LAG3에 대한 항체는 현재 1상 임상 시험 중인 렐라틀리맙(relatlimab), 및 임상전 개발 중인 다수의 다른 항체들을 포함한다. LAG-3은 CTLA-4 또는 PD-1보다 더 우수한 체크포인트 억제제 표적일 수 있는데, 이는 이들 두 체크포인트에 대한 항체만이 이펙터 T 세포를 활성화시키고 Treg 활성을 억제하지 않는 반면, 길항제 LAG-3 항체는 (LAG-3 억제 신호를 미리 활성화된 LAG-3+ 세포로 하향조절함으로써) T 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있고 유도된(즉, 항원 특이적) Treg 억제 활성을 억제할 수 있기 때문이다. LAG-3 항체와 CTLA-4 또는 PD-1 항체를 이용하는 조합 요법도 진행 중이다.

우성 음성 SHP

국제 특허출원 공개 제WO2016/193696호는 T-세포:표적 세포 시냅스에서 인산화:탈인산화의 균형을 조절할 수 있는 다양한 상이한 유형의 단백질을 기술한다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개 제WO2016/193696호는 SH2 도메인들 중 하나 또는 둘 다를 포함하지만 포스파타제 도메인을 결여하는 절단된 형태의 SHP-1 또는 SHP-2를 기술한다. CAR-T 세포에서 발현될 때, 이 분자들은 야생형 SHP-1 및 SHP-2의 우성 음성 버전으로서 작용하고 인산화된 ITIM과의 결합에 대해 내생성 분자와 경쟁한다.

야생형 SHP-1 및 SHP-2의 이 우성 음성 버전은 억제 면역수용체, 예컨대, CTLA4, PD-1, LAG-3, 2B4 또는 BTLA 1에 의해 매개된 억제를 차단하거나 감소시키고 T-세포:표적 세포 시냅스에서 인산화:탈인산화의 균형을 ITAM의 인산화에 유리한 쪽으로 기울게 함으로써, T-세포 활성화를 유발한다.

본 발명의 세포는 인산화된 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)에 결합하지만 포스파타제 도메인을 결여하는 단백질로부터의 SH2 도메인을 포함하는 절단된 단백질을 발현할 수 있다. 절단된 단백질은 SHP-1 SH2 도메인(들) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있으나 SHP-1 포스파타제 도메인을 결여할 수 있다. 대안적으로, 절단된 단백질은 SHP-2 SH2 도메인(들) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있으나 SHP-2 포스파타제 도메인을 결여할 수 있다.

SHP-1

Src 상동성 영역 2 도메인 함유 포스파타제-1(SHP-1)은 단백질 티로신 포스파타제 패밀리의 구성원이다. 이것은 PTPN6으로서도 알려져 있다.

SHP-1의 N-말단 영역은 SHP-1과 이의 기질의 상호작용을 매개하는 2개의 탠덤 SH2 도메인을 함유한다. C-말단 영역은 티로신-단백질 포스파타제 도메인을 함유한다.

SHP-1은 다수의 억제 면역수용체 또는 ITIM 함유 수용체에 결합하여 이들로부터 신호를 전파할 수 있다. 이러한 수용체의 예는 PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 및 KIR3DL3을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.

인간 SHP-1 단백질은 UniProtKB 수탁번호 P29350을 가진다.

절단된 SHP-1은 서열번호 94로서 하기 표시된 SHP-1 탠덤 SH2 도메인을 포함할 수 있거나 이러한 도메인으로 구성될 수 있다.

SHP-1은 서열의 N-말단 잔기 4 내지 100 및 110 내지 213에서 2개의 SH2 도메인을 가진다. 절단된 SHP-1은 서열번호 95 및 96으로서 나타낸 서열들 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

변이체 서열이 요구된 특성을 가진 SH2 도메인 서열인 한, 절단된 SHP-1은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 94, 95 또는 96의 변이체를 포함할 수 있다. 다시 말해, 변이체 서열은 PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 또는 KIR3DL3 중 적어도 하나의 세포질 꼬리에서 SHP-1의 동원을 허용하는 인산화된 티로신 잔기에 결합할 수 있어야 한다.

SHP-2

PTPN11, PTP-1D 및 PTP-2C로서도 알려진 SHP-2는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 패밀리의 구성원이다. PTPN6과 마찬가지로, SHP-2는 그의 N-말단에 있는 2개의 탠덤 SH2 도메인 및 이를 뒤따르는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 도메인으로 구성된 도메인 구조를 가진다. 불활성 상태에서, N-말단 SH2 도메인은 PTP 도메인에 결합하고 잠재적 기질이 활성 부위에 접근하는 것을 차단한다. 따라서, SHP-2는 자동 억제된다. N-말단 SH2 도메인은 표적 인-티로실 잔기에 결합할 때 PTP 도메인으로부터 방출되어, 자가 억제를 완화함으로써 효소를 촉매 활성화시킨다.

인간 SHP-2는 UniProtKB 수탁번호 P35235-1을 가진다.

절단된 SHP-2는 서열번호 99로서 아래에 나타낸 SHP-1 탠덤 SH2 도메인을 포함할 수 있거나 이러한 도메인으로 구성될 수 있다. SHP-1은 서열의 N-말단 잔기 6 내지 102 및 112 내지 216에서 2개의 SH2 도메인을 가진다. 절단된 SHP-2는 서열번호 97 및 98로서 나타낸 서열들 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

변이체 서열이 요구된 특성을 가진 SH2 도메인 서열인 한, 절단된 SHP-2는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진, 서열번호 97, 98 또는 99의 변이체를 포함할 수 있다. 즉, 변이체 서열은 PD1, PDCD1, BTLA4, LILRB1, LAIR1, CTLA4, KIR2DL1, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL1 또는 KIR3DL3 중 적어도 하나의 세포질 꼬리에서 SHP-2의 동원을 허용하는 인산화된 티로신 잔기에 결합할 수 있어야 한다.

TGFβ 신호전달의 조절

조작된 세포는 입양 면역요법을 제한하는 적대적인 미세환경에 직면한다. 종양 미세환경 내의 주요 억제 기작들 중 하나는 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)이다. TGFβ 신호전달 경로는 다양한 세포 과정을 제어하는 조절 신호전달에서 중추적인 역할을 한다. TGFβ는 T 세포 항상성 및 세포 기능의 제어에서도 중추적인 역할을 한다. 특히, TGFβ 신호전달은 증식 및 활성화가 감소되는, T 세포의 면역저하 상태와 연관되어 있다. TGFβ 발현은 종양의 면역억제 미세환경과 연관되어 있다.

다양한 암성 종양 세포들이 TGFβ를 직접 생성하는 것으로 알려져 있다. 암성 세포에 의한 TGFβ 생성 외에도, TGFβ는 종양 부위에 존재하는 매우 다양한 비-암성 세포들, 예컨대, 종양 관련 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 대식세포, 상피 세포 및 기질 세포에 의해 생성될 수 있다.

형질전환 성장 인자 베타 수용체는 세린/쓰레오닌 키나제 수용체의 수퍼패밀리이다. 이 수용체는 성장 인자 및 사이토카인 신호전달 단백질의 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원에 결합한다. (활성화 수용체인) 5개의 II형 수용체 및 (신호전달 전파 수용체인) 7개의 I형 수용체가 있다.

보조적인 보조수용체(III형 수용체로서도 알려짐)도 존재한다. 리간드의 TGFβ 수퍼패밀리의 각각의 서브패밀리는 I형 수용체 및 II형 수용체에 결합한다.

상기 세 가지 형질전환 성장 인자들은 많은 활성을 가진다. TGFβ1 및 TGFβ2는 암 줄기 세포를 자극할 수 있고 섬유증/섬유조직형성 반응을 증가시킬 수 있고 종양의 면역 인식을 억제할 수 있으므로 암과 관련되어 있다.

TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3은 수용체 TβRII에 결합한 다음 TβRI에 결합하고 TGFβ2의 경우 TβRIII에도 결합함으로써 신호를 보낸다. 이것은 TβRI을 통해 SMAD를 통한 후속 신호전달로 이어진다.

TGFβ는 전형적으로 전(pre)-전구(pro) 형태로 분비된다. "전"은 소포체(ER) 내로 들어갈 때 절단되는 N-말단 신호 펩타이드이다. "전구"는 ER에서 절단되나, 공유결합된 상태를 유지하고 잠복 관련 펩타이드(LAP)로서 지칭되는 TGFβ의 주위에서 케이지(cage)를 형성한다. 이 케이지는 무엇보다도 트롬빈 및 메탈로프로테아제를 비롯한 다양한 프로테아제들에 반응하여 개방된다. C-말단 영역은 단백질분해성 절단에 의해 전구영역으로부터 방출된 후 성숙 TGFβ 분자가 된다. 성숙 TGFβ 단백질은 이량체화되어 활성 동종이량체를 생성한다.

TGFβ 동종이량체는 TGFβ 유전자 생성물의 N-말단 영역으로부터 유래한 LAP와 상호작용하여, 작은 잠복 복합체(SLC)로서 지칭되는 복합체를 형성한다. 이 복합체는 큰 잠복 복합체(LLC)로서 지칭되는 복합체를 함께 형성하는 잠복 TGFβ 결합 단백질(LTBP)로서 지칭되는 또 다른 단백질인 세포외 기질(ECM) 단백질에 의해 결합될 때까지 세포에 남아 있다. LLC는 ECM으로 분비된다. TGFβ는 메탈로프로테아제 및 트롬빈을 비롯한 여러 부류의 프로테아제에 의해 이 복합체로부터 생물학적 활성 형태로 방출된다.

우성 음성 TGFβ 수용체

활성 TGFβ 수용체(TβR)는 2개의 TGFβ 수용체 I(TβRI) 및 2개의 TGFβ 수용체 II(TβRII)로 구성된 이종사량체이다. TGFβ1은 잠복 형태로 분비되고 여러 기작에 의해 활성화된다. 이것은 일단 활성화되면, TβRI을 인산화하고 활성화시키는 TβRII TβRI와 복합체를 형성한다.

본 발명의 세포는 우성 음성 TGFβ 수용체를 발현한다. 우성 음성 TGFβ 수용체는 키나제 도메인을 결여할 수 있다.

예를 들어, 우성 음성 TGFβ 수용체는 TGF 수용체 II의 단량체 버전인 서열 번호 100으로서 나타낸 서열을 포함할 수 있거나 이러한 서열로 구성될 수 있다.

우성 음성 TGF-βRII(dnTGF-βRII)는 공격적인 인간 전립선암 마우스 모델에서 PSMA 표적화 CAR-T 세포 증식, 사이토카인 분비, 고갈에 대한 내성, 장기간 생체내 지속성 및 종양 박멸의 유도를 증강시키는 것으로 보고되었다(Kloss et al (2018) Mol. Ther.26:1855-1866).

세포

본 발명은 세포 표면에서 제1 CAR 및 제2 CAR을 공-발현하는 세포에 관한 것으로, 이때 하나의 CAR은 CD19에 결합하고 다른 CAR은 CD22에 결합한다.

세포는 세포 표면에서 CAR을 발현할 수 있는 임의의 진핵 세포, 예컨대, 면역 세포일 수 있다.

특히, 세포는 면역 이펙터 세포, 예컨대, T 세포 또는 천연 킬러(NK) 세포일 수 있다.

T 세포 또는 T 림프구는 세포 매개 면역에서 중추적인 역할을 하는 일종의 림프구이다. 이 세포는 T 세포 수용체(TCR)가 세포 표면에 존재한다는 점에 의해 다른 림프구, 예컨대, B 세포 및 천연 킬러 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다. 아래에 요약된 바와 같이, 다양한 유형의 T 세포가 있다.

헬퍼 T 헬퍼 세포(TH 세포)는 형질 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 성숙, 및 세포독성 T 세포와 대식세포의 활성화를 비롯한 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다. TH 세포는 그의 표면에서 CD4를 발현한다. TH 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원을 제시받을 때 활성화된다. 이 세포는 다양한 유형의 면역 반응을 촉진하기 위해 다양한 사이토카인을 분비하는 TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 또는 TFH를 비롯한 여러 하위유형들 중 하나로 분화할 수 있다.

세포독성 T 세포(TC 세포 또는 CTL)는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고 이식 거부와도 연관되어 있다. CTL은 그의 표면에서 CD8을 발현한다. 이 세포는 모든 유핵 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. CD8+ 세포는 조절 T 세포에 의해 분비되는 IL-10, 아데노신 및 다른 분자를 통해 무반응 상태로 불활성화되어, 실험적 자가면역 뇌척수염과 같은 자가면역 질환을 예방할 수 있다.

기억 T 세포는 감염이 해소된 후에 장기간 지속되는 항원 특이적 T 세포의 서브세트이다. 이 세포는 그의 동족 항원에 재노출될 때 많은 수의 이펙터 T 세포로 빠르게 증폭되어, 과거 감염에 대한 "기억"을 면역 시스템에게 제공한다. 기억 T 세포는 3가지 하위유형, 즉 중추 기억 T 세포(TCM 세포) 및 2가지 유형의 이펙터 기억 T 세포(TEM 세포 및 TEMRA 세포)를 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 기억 T 세포는 전형적으로 세포 표면 단백질 CD45RO를 발현한다.

이전에 억제자 T 세포로서 알려진 조절 T 세포(Treg 세포)는 면역학적 관용의 유지에 중요하다. 이의 주요 역할은 면역 반응이 끝날 때 T 세포 매개 면역을 차단하고 흉선에서 음성 선택 과정을 벗어난 자가 반응성 T 세포를 억제하는 것이다.

2가지 주요 부류의 CD4+ Treg 세포, 즉 천연 생성 Treg 세포 및 적응 Treg 세포가 기재되어 있다.

천연 생성 Treg 세포(CD4+CD25+FoxP3+ Treg 세포로서도 알려짐)는 흉선에서 생성되고 TSLP에 의해 활성화되는, 발달 중인 T 세포와 골수성(CD11c+) 수지상 세포 및 형질세포양(CD123+) 수지상 세포 둘 다 사이의 상호작용과 연관되어 있다. 천연 생성 Treg 세포는 FoxP3으로서 지칭되는 세포내 분자의 존재에 의해 다른 T 세포와 구별될 수 있다. FOXP3 유전자의 돌연변이는 조절 T 세포 발달을 방해하여, 치명적인 자가면역 질환 IPEX를 야기할 수 있다.

적응 Treg 세포(Tr1 세포 또는 Th3 세포로서도 알려짐)는 정상적인 면역 반응 동안 발생될 수 있다.

천연 킬러 T(NKT) 세포는 T 세포 및 천연 킬러 세포 둘 다의 특성을 공유하는 불균질한 T 세포 군이다. 이 세포들 중 대다수는 자가 지질과 당지질 및 외래 지질과 당지질에 결합하는 항원 제시 분자인 비-다형성 CD1d 분자를 인식한다.

본 발명의 T 세포는 상기 언급된 임의의 T 세포 유형, 특히 CTL일 수 있다.

천연 킬러(NK) 세포는 선천성 면역 시스템의 일부를 형성하는 일종의 세포용해성 세포이다. NK 세포는 MHC 독립적 방식으로 바이러스에 감염된 세포로부터의 선천성 신호에 대한 신속한 반응을 제공한다.

(선천성 림프성 세포 군에 속하는) NK 세포는 큰 과립 림프구(LGL)로서 정의되고 B 및 T 림프구를 생성하는 공통 림프성 전구체로부터 분화된 세 번째 종류의 세포를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선에서 분화하고 성숙된 후 순환계 내로 들어가는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 CAR 세포는 상기 언급된 세포 유형들 중 임의의 세포 유형일 수 있다.

CAR 발현 T 또는 NK 세포와 같은 CAR 발현 세포는 환자 자신(제1 당사자)의 말초 혈액으로부터 생체외에서 생성될 수 있거나, 기증자(제2 당사자) 말초 혈액 또는 연관성 없는 기증자(제3 당사자)의 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포를 이식하는 상황에서 생체외에서 생성될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 CAR 발현 T 세포 및/또는 CAR 발현 NK 세포를 포함하는 세포 조성물도 제공한다. 이 세포 조성물은 생체외에서 혈액 샘플을 본 발명에 따른 핵산으로 형질도입함으로써 제조될 수 있다.

대안적으로, 생체외에서 유도성 전구체 세포 또는 배아 전구체 세포를 T 세포와 같은 관련 세포 유형으로 분화시킴으로써 CAR 발현 세포를 유도할 수 있다. 대안적으로, 불멸화된 세포주, 예컨대, 용해 기능을 보유하고 치료제로서 작용할 수 있는 T 세포주를 사용할 수 있다.

모든 이들 실시양태에서, CAR 세포는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입, DNA 또는 RNA를 사용한 형질감염을 비롯한 많은 수단들 중 하나로 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입함으로써 생성된다.

본 발명의 CAR T 세포는 대상체로부터의 생체외 T 세포일 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플로부터 유래할 수 있다. T 세포는 CAR 코딩 핵산으로 형질도입하기 전에, 예를 들어, 항-CD3 단일클론 항체를 사용한 처리에 의해 활성화될 수 있고/있거나 증폭될 수 있다.

본 발명의 CAR T 세포는

(i) 상기 나열된 대상체 또는 다른 공급원으로부터 T 세포 함유 샘플을 단리하는 단계; 및

(ii) 제1 CAR 및 제2 CAR을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(들)로 T 세포를 형질도입하거나 형질감염시키는 단계

에 의해 제조될 수 있다.

이어서, 제1 CAR 및 제2 CAR의 공-발현을 기반으로 T 세포를 정제, 예를 들어, 선택할 수 있다.

핵산 서열

본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에서 정의된 제1 CAR 및 제2 CAR을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(들)에 관한 것이다.

핵산 서열은 예를 들어, RNA, DNA 또는 cDNA 서열일 수 있다.

핵산 서열은 CD19에 결합하는 하나의 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CD22에 결합하는 또 다른 CAR을 코딩할 수 있다.

핵산 서열은 하기 구조를 가질 수 있고, 핵산 서열은 T 세포에서 발현될 때, 제1 CAR 및 제2 CAR이 세포 표면에서 공-발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩타이드를 코딩한다:

AgB1-스페이서1-TM1-coexpr-AbB2-스페이서2-TM2

이 구조에서,

AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

coexpr은 공-발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;

AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;

스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;

TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이다.

대안적으로, 핵산 서열은 하기 구조를 가질 수 있다:

AbB2-스페이서2-TM2-coexpr-AgB1-스페이서1-TM1

이 구조에서, 구성요소 AgB1, 스페이서1, TM1, coexpr, AbB2, 스페이서2 및 TM2는 상기 정의된 바와 같다.

상동 재조합을 피하기 위해 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 영역에서 대체 코돈을 사용할 수 있다.

유전 코드의 축퇴성으로 인해, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 대체 코돈을 사용할 수 있다. 예를 들어, 코돈 "ccg" 및 "cca"는 둘 다 아미노산 프롤린을 코딩하므로, "ccg"의 사용은 번역된 단백질의 서열에서 이 위치의 아미노산에 영향을 미치지 않으면서 "cca"로 교체될 수 있다.

각각의 아미노산을 코딩하는 데 사용될 수 있는 대안적 RNA 코돈은 표 4에 요약되어 있다.

특히 동일하거나 유사한 스페이서가 제1 CAR 및 제2 CAR에서 사용되는 경우, 제1 CAR의 스페이서 및 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열의 부분에서 대체 코돈이 사용될 수 있다. 도 5는 스페이서 HCH2CH3 - 힌지를 코딩하는 2개의 서열을 보여주고, 이들 중 하나에서 대체 코돈이 사용되었다.

특히 동일하거나 유사한 막횡단 도메인이 제1 CAR 및 제2 CAR에서 사용되는 경우, 제1 CAR의 막횡단 도메인 및 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 부분에서 대체 코돈이 사용될 수 있다. 도 5는 CD28 막횡단 도메인을 코딩하는 2개의 서열을 보여주고, 이들 중 하나에서 대체 코돈이 사용되었다.

대체 코돈은 제1 CAR의 엔도도메인의 전부 또는 일부 및 제2 CAR의 엔도도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열의 부분에서 사용될 수 있다. 대체 코돈은 CD3 제타 엔도도메인에서 사용될 수 있다. 도 5는 CD3 제타 엔도도메인을 코딩하는 2개의 서열을 보여주고, 이들 중 하나에서 대체 코돈이 사용되었다.

대체 코돈은 하나 이상의 보조자극 도메인, 예컨대, CD28 엔도도메인에서 사용될 수 있다.

대체 코돈은 생존 신호를 전달하는 하나 이상의 도메인, 예컨대, OX40 및 41BB 엔도도메인에서 사용될 수 있다.

대체 코돈은 CD3제타 엔도도메인을 코딩하는 핵산 서열의 부분 및/또는 하나 이상의 보조자극 도메인(들)을 코딩하는 핵산 서열의 부분 및/또는 생존 신호를 전달하는 하나 이상의 도메인(들)을 코딩하는 핵산 서열의 부분에서 사용될 수 있다.

벡터

본 발명은 또한 하나 이상의 CAR 코딩 핵산 서열(들)을 포함하는 벡터, 또는 벡터의 키트를 제공한다. 이러한 벡터는 제1 CAR 및 제2 CAR을 발현하도록 핵산 서열(들)을 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.

벡터는 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포존 기반 벡터 또는 합성 mRNA일 수 있다.

벡터는 T 세포를 형질감염시키거나 형질도입할 수 있다.

약학 조성물

본 발명은 또한 본 발명의 제1 측면에 따른 T 세포 또는 NK 세포와 같은 복수의 CAR 발현 세포를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가의 약학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태로 존재할 수 있다.

치료 방법

본 발명의 세포는 B 세포 림프종 세포와 같은 암세포를 사멸시킬 수 있다. CAR 발현 세포, 예컨대, T 세포는 환자 자신(제1 당사자)의 말초 혈액으로부터 생체외에서 생성될 수 있거나, 기증자(제2 당사자) 말초 혈액 또는 연관성 없는 기증자(제3 당사자)의 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포를 이식하는 상황에서 생체외에서 생성될 수 있다. 대안적으로, 생체외에서 유도성 전구체 세포 또는 배아 전구체 세포를 T 세포로 분화시킴으로써 CAR T 세포를 유도할 수 있다. 이 경우, CAR T 세포는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입, DNA 또는 RNA를 사용한 형질감염을 비롯한 많은 수단들 중 하나로 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입함으로써 생성된다.

본 발명의 세포는 암세포와 같은 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포는 CD19 또는 CD22의 발현에 의해 인식될 수 있다.

다양한 유형의 B 세포 백혈병에서의 통상적으로 연구된 림프성 항원의 발현은 B 세포 개체발생의 발현을 철저히 반영한다(도 2 참조).

본 발명의 T 세포는 암, 특히 B 세포 악성종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.

CD19 또는 CD22를 발현하는 암의 예는 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 B 세포 림프종; 및 B 세포 백혈병이다.

예를 들어, B 세포 림프종은 미만성 B 대세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 변연부 림프종(MZL) 또는 점막 관련 림프 조직 림프종(MALT), 소세포 림프구성 림프종(만성 림프구성 백혈병과 중첩됨), 맨틀 세포 림프종(MCL), 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) B 대세포 림프종, 림프형질세포성 림프종(발덴스트롬 마크로글로불린혈증으로서 나타날 수 있음), 결절 변연부 B 세포 림프종(NMZL), 비장 변연부 림프종(SMZL), 혈관내 B 대세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종모양 육아종증, T 세포/조직구 풍부 B 대세포 림프종 또는 원발성 중추신경계 림프종일 수 있다.

B 세포 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병, B 세포 만성 림프구성 백혈병, B 세포 전구림프구성 백혈병, 전구체 B 림프모구성 백혈병 또는 털세포 백혈병일 수 있다.

B 세포 백혈병은 급성 림프모구성 백혈병일 수 있다.

본 발명의 T 세포를 사용한 치료는 표준 접근법의 이용 시 종종 발생하는 종양 세포의 탈출 또는 방출을 방지하는 데 도움이 될 수 있다.

지금부터 본 발명은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자가 본 발명을 수행하는 데 도움을 주기 위한 것이고 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아닌 실시예를 통해 더 설명될 것이다.

실시예

실시예 1 - CD19/CD22 논리적 'OR' 게이트 구축물 및 표적 세포의 준비

CD19 CAR이 TNFR 패밀리 엔도도메인(4-1BB)을 갖고 CD22 CAR이 보조자극 엔도도메인(CD28)을 가진 CD19 'OR' CD22 게이트를 구축하였다. 각각의 CAR의 구조는 도 6에 제공되어 있다.

여러 CD19/CD22 OR 게이트 구축물들은 도 11에 나타낸 바와 같이 제조되었고 표 6에 요약되어 있다. 제1 구축물은 국제 특허출원 공개 제WO2016/102965호에 기재된 CD19 CAR 및 CD22 CAR을 포함한다(구축물 1, 도 11). 제2 구축물은 도 6에 나타낸 CD19 CAR 및 CD22 CAR을 포함한다(구축물 2, 도 11). 우성 음성 SHP2 모듈(dSHP2) 및 우성 음성 TGFβRII 모듈(dnTGFβRII)을 추가로 포함하는 3개의 추가 구축물을 제조하였다(구축물 3, 4 및 5, 도 11). 2개의 CAR을 2A 펩타이드에 의해 분리된 프레임 내로 클로닝함으로써 공-발현을 달성하였다.

실시예 2 - CAR 엔도도메인의 비교

이중 표적화 CD19/CD22 CAR-T 세포에 대한 최적 엔도도메인을 확인하기 위해, CD19+ 또는 CD22+ SupT1 세포를 사멸시키는 구축물 1, 3, 4 또는 5 중 하나를 발현하는 T 세포의 능력을 비교하였다. 추가로, CD19+ 또는 CD22+ SupT1 세포의 존재 하에 구축물 1, 3, 4 또는 5 중 하나를 발현하는 T 세포의 증식을 조사하였다.

상기 구축물들 중 하나를 발현하는 세포를 1:1 이펙터:표적(E:T) 세포 비(50,000개의 표적 세포)로 표적 세포와 72시간 동안 공-배양하였다.

결과는 도 12에 제시되어 있다. 모든 구축물들이 CD19+ 표적 세포를 사멸시킬 수 있었지만, 이 결과는 구축물 5가 구축물 1, 3, 및 4에 비해 개선된 CD22+ 표적 세포 사멸을 보여줌을 입증한다. 구축물 5를 발현하는 세포의 증식도 개선되었다. IL-2 및 IFN-γ의 수준은 모든 구축물들에 대해 유사하였다.

실시예 3 - 추가 시험관내 분석

구축물 1, 3 또는 5를 발현하는 세포를 시험관내에서 하기 표적 세포에 대해 시험하였다:

Raji 세포(CD19/CD22 양성 암 세포주);

CD19 넉아웃 Raji 세포;

SupT1 고밀도 CD19;

SupT1 저밀도 CD19;

SupT1 고밀도 CD22; 및

SupT1 저밀도 CD22.

상기 구축물들 중 하나를 발현하는 형질도입된 PBMC를 1:1 및 1:10 이펙터:표적 세포 비 둘 다로 표적 세포와 72시간 동안 공-배양하였다.

결과는 도 13에 제시되어 있다. 구축물 5는 저밀도 CD22 표적 세포의 개선된 사멸을 보여주었다. 사이토카인 생성 수준은 유사하였다.

실시예 4 - 모듈 시험

dnTGFβRII

세포가 TGF-β의 존재 하에 배양될 때, 구축물 5가 형질도입된 세포를 dnTGFβRII 모듈의 효과에 대해 시험하였다. 표적 세포와의 공-배양을 1:8의 E:T 비로 rhTGF-β(10 ng/㎖)의 존재 하에 설정하였다. 7일째 날에 판독을 수행하였다. 추가로, 증식 추적을 위해 이펙터 세포를 CTV로 표지하였다.

결과는 도 14에 표시되어 있다. 이 데이터는 dnTGFβRII 모듈의 존재가 TGF-β의 존재 하에 표적 세포 사멸을 개선한다는 것을 입증한다. 나아가, dnTGFβRII 모듈은 TGFβ의 존재 하에 증식의 억제를 방해한다.

dSHP2

구축물 5가 형질도입된 세포를 dSHP2 모듈의 존재 효과에 대해 시험하였다. PBMC를 구축물 5 및 PD1 둘 다로 공-형질도입한 후, PDL1을 발현하는 세포의 존재 하에 배양하였다. dSHP2가 효과적인 경우, 그의 존재는 PD1/PDL1을 통한 신호전달을 방해할 것이다.

PDL1의 존재 및 부재 하에 CD19+ 표적 세포와의 공-배양은 1:1의 E:T 비로 설정되었다. 6일째 날에 판독을 수행하였다.

결과는 도 15에 제시되어 있다.

이 데이터는 dSHP2의 존재가 PD1/PDL1 상호작용을 극복함을 입증한다.

실시예 5 - 재자극 어세이

재자극 어세이를 이용하여 구축물 1, 2 및 5의 성능을 조사하였다.

요약하건대, 구축물 1, 구축물 2 또는 구축물 5를 발현하는 CAR-T 세포를 CD19+ SupT1 세포 또는 CD22+ SupT1 세포로 챌린징하였다. 플레이트를 총 9 라운드 동안 3일 내지 4일마다 새로운 표적 세포 및 새로운 배지로 재자극하였다. 결과는 도 16에 표시되어 있다.

구축물 2 발현 CAR-T 세포 및 구축물 5 발현 CAR-T 세포 둘 다가 재자극 시 더 큰 비율의 세포 집단이었고, 이는 증가된 표적 사멸을 시사한다. 특히, 구축물 2 발현 세포 및 구축물 5 발현 세포는 CD22 양성 표적 세포가 사용될 때 더 큰 비율의 세포 집단이었다. 따라서, 이 변이체들은 구축물 1에 비해 CD22 양성 세포의 증강된 사멸을 보여준다.

실시예 6 - 시험관내 시험

구축물 3 및 5가 형질도입된 T 세포가 NGS 마우스의 Nalm6 종양 모델에서 종양 세포를 제거하는 능력을 조사하였다. 모든 경우, -6일째 날에 1x10⁶개의 표적 세포, NT 세포 또는 PBS를 마우스에게 주사하였다.

초기 단계로서, 구축물 1을 발현하는 세포의 준최적 용량은 구축물 5 투여를 위한 출발점으로서 작용하는 것으로 확인되었다. 0.3 x 10⁶개, 1 x 10⁶개, 5 x 10⁶개 및 10 x 10⁶개 세포 용량을 조사하였다. 결과는 도 17에 표시되어 있다. 0.3x10⁶ 용량은 PBS 대조군 코호트와 유사한 플럭스를 보여줌으로써, 비효율적인 용량을 시사한다. 완전한 제거(Clearance)는 10x10⁶ 용량에서 달성되었으나, 이식편 대 숙주 질환(GvH)이 의심되었기 때문에 13일째 날에 마우스를 희생시켰다. 5x10⁶ 코호트는 표적 세포를 제거한 반면, 1x10⁶ 코호트는 총 플럭스를 제어할 수 없었다. 이 조사 후, 구축물 3 및 5를 시험하기 위해 2.5 x 10⁶개 세포 용량을 선택하였다.

따라서, 구축물 1, 3, 또는 5를 발현하는 2.5x10⁶개의 세포를 마우스에게 주사하였다. 총 플럭스는 도 18에 표시되어 있다. 구축물 1을 발현하는 세포는 2.5 x 10⁶개 세포 용량에서 표적 세포 생장을 제어할 수 없다. 구축물 3 및 5는 둘 다 생체내에서 개선된 기능을 보여준다. 특히, 구축물 5는 모든 마우스에서 23일째 날까지 종양 세포 생장을 제어할 수 있었다. 플럭스의 차이는 구축물 1에 비해 통계적으로 유의미하다.

또한, 구축물 1, 3 또는 5를, CD19 발현이 넉아웃된(CD19KO) Nalm6 마우스에서 시험하였다. 2.5 x 10⁶개 세포 용량을 사용하되, 전술된 야생형(WT) Nalm6 마우스에 대한 조건과 동일한 조건을 이용하였다.

총 플럭스는 도 19에 표시되어 있다. 구축물 1을 발현하는 세포는 2.5 x 10⁶개 세포 용량에서 표적 세포 생장을 제어할 수 없다. 구축물 3 및 5는 둘 다 개선된 기능을 보여준다. 특히, 구축물 5는 1마리를 제외한 모든 마우스에서 27일째 날까지 종양 세포 생장을 제어할 수 있었다. 이 데이터는 구축물 5를 발현하는 세포가 심지어 CD19의 부재 하에서도 종양 부하를 제어할 수 있음을 확인시켜준다.

상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않으면서 당분야에서 숙련된 자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명이 이러한 특정 실시양태로 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 생물학 또는 관련 분야에서 숙련된 자에게 자명한, 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위 내에 있다.

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Val Lys Glu 20 25 30 Ser Glu Ile Thr Glu Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Arg Glu 35 40 45 Leu Arg Arg Asp Val Glu Arg Glu Ile Glu Glu Val Met 50 55 60 <210> 73 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 73 Ala Ile Glu Val Lys Leu Ala Asn Met Glu Ala Glu Ile Asn Thr Leu 1 5 10 15 Lys Ser Lys Leu Glu Leu Thr Asn Lys Leu His Ala Phe Ser Met 20 25 30 <210> 74 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 74 Glu Trp Glu Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Ala Leu Glu Ser Lys Leu 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Leu Glu His Gly 20 25 <210> 75 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 75 Ile Asn Pro Val Asn Asn Arg Ile Gln Asp Leu Thr Glu Arg Ser Asp 1 5 10 15 Val Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr 20 <210> 76 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 76 Val Val Asp Thr Leu Asp Gln Met Lys Gln Gly Leu Glu Asp Val Ser 1 5 10 15 Gly Leu Leu Glu Leu Ala Val Glu Ala Asp Asp 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Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp 20 25 30 Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu 35 40 45 Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu 50 55 60 Ala Glu Lys Asn Leu 65 <210> 80 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 80 Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg 1 5 10 15 Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln 20 25 30 Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp 35 40 45 Tyr Val Glu 50 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 81 Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln Val 1 5 10 15 Ser Arg Leu Glu 20 <210> 82 <211> 136 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 82 Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu 1 5 10 15 Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser 20 25 30 Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met Asp Glu Thr Met Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Ala Arg 50 55 60 Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met 65 70 75 80 Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala 85 90 95 Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His 100 105 110 Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln 115 120 125 Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala 130 135 <210> 83 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 83 Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr 20 25 30 Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly 35 40 45 <210> 84 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 84 Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys 1 5 10 15 Asp Ala Cys Gly 20 <210> 85 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 85 Ile Ile Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile 1 5 10 15 Phe Gly Thr Ala Ser Tyr Leu Ile 20 <210> 86 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 86 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe 20 25 30 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 35 40 45 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 50 55 60 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 65 70 75 80 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 85 90 95 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 100 105 110 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 115 120 125 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 130 135 140 <210> 87 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 87 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 20 25 30 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 35 40 45 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 50 55 60 Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 65 70 75 80 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 85 90 95 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 100 105 110 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 115 120 125 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 130 135 140 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 165 170 175 Leu Pro Pro Arg 180 <210> 88 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 88 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 20 25 30 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 35 40 45 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 50 55 60 Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro 65 70 75 80 Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp 85 90 95 Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 100 105 110 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 115 120 125 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 130 135 140 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 145 150 155 160 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 165 170 175 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 180 185 190 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 195 200 205 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 210 215 <210> 89 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 89 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 90 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 90 Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr 20 25 30 Leu Ala Lys Ile 35 <210> 91 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 91 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 92 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 92 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 93 Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 94 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 94 Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr 1 5 10 15 Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser 20 25 30 Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln 35 40 45 Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr 65 70 75 80 Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu 85 90 95 Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His 100 105 110 Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly 115 120 125 Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp 130 135 140 Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser 145 150 155 160 Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr 165 170 175 Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu 180 185 190 His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr 195 200 205 Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr 210 <210> 95 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 95 Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys 1 5 10 15 Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn 20 25 30 Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His 35 40 45 Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu 50 55 60 Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln 65 70 75 80 Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro 85 90 95 Leu <210> 96 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 96 Trp Tyr His Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly 35 40 45 Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly 50 55 60 Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp 65 70 75 80 Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala 85 90 95 Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr 100 <210> 97 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 97 Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His 35 40 45 Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu 50 55 60 Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His 65 70 75 80 Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro 85 90 95 Leu <210> 98 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 98 Trp Phe His Gly His Leu Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Glu Lys Gly Lys His Gly Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu 35 40 45 Ser Asn Asp Gly Lys Ser Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln 50 55 60 Glu Leu Lys Tyr Asp Val Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr 65 70 75 80 Asp Leu Val Glu His Tyr Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly 85 90 95 Thr Val Leu Gln Leu Lys Gln Pro Leu 100 105 <210> 99 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 99 Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala Glu Asn Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Lys Ser Asn 20 25 30 Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn Gly Ala Val Thr His 35 40 45 Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu 50 55 60 Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr Tyr Met Glu His His 65 70 75 80 Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile Glu Leu Lys Tyr Pro 85 90 95 Leu Asn Cys Ala Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Phe His Gly His Leu 100 105 110 Ser Gly Lys Glu Ala Glu Lys Leu Leu Thr Glu Lys Gly Lys His Gly 115 120 125 Ser Phe Leu Val Arg Glu Ser Gln Ser His Pro Gly Asp Phe Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Thr Gly Asp Asp Lys Gly Glu Ser Asn Asp Gly Lys Ser 145 150 155 160 Lys Val Thr His Val Met Ile Arg Cys Gln Glu Leu Lys Tyr Asp Val 165 170 175 Gly Gly Gly Glu Arg Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Tyr 180 185 190 Lys Lys Asn Pro Met Val Glu Thr Leu Gly Thr Val Leu Gln Leu Lys 195 200 205 Gln Pro Leu 210 <210> 100 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 100 Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 1 5 10 15 Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 20 25 30 Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 35 40 45 Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 50 55 60 Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 65 70 75 80 Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 85 90 95 Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 100 105 110 Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln 130 135 140 Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val 145 150 155 160 Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser 165 170 175 Ser <210> 101 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 101 Asn Phe Ala Met Ala 1 5 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 102 Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 103 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 103 Gln Arg Asn Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Tyr Thr Met 1 5 10 15 Asp Ala <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 104 Arg Ser Ser Gln Asp Ile Gly Asn Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 105 Gly Ala Ile Lys Leu Glu Asp 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial Sequence <400> 106 Leu Gln Ser Ile Gln Tyr Pro 1 5

Claims (31)

1. 다음을 공-발현하는 세포:
   (i) CD19에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 세포 표면의 제1 키메라 항원 수용체(CAR);
   (ii) CD22에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 세포 표면의 제2 CAR;
   (iii) 우성 음성 SHP2(dSHP2); 및
   (iv) 우성 음성 TGFβ 수용체 II(dnTGFβRII).
2. 제1항에 있어서, 각각의 CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제1 CAR의 세포내 신호전달 도메인이 TNF 수용체 패밀리 엔도도메인을 포함하고; 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인이 보조자극 엔도도메인을 포함하는 것인 세포.
3. 제2항에 있어서, 보조자극 도메인이 CD28 보조자극 엔도도메인인 세포.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, TNF 수용체 패밀리 엔도도메인이 OX-40 또는 4-1BB 엔도도메인인 세포.
5. 제2항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CAR 및 제2 CAR의 세포내 신호전달 도메인이 ITAM 함유 도메인도 포함하는 것인 세포.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 CAR이
   (i) 항원 결합 도메인;
   (ii) 스페이서; 및
   (iii) 막횡단 도메인
   을 포함하고; 제1 CAR의 스페이서가 제2 CAR의 스페이서와 상이한 것인 세포.
7. 제6항에 있어서, 제2 CAR의 스페이서가 연골 올리고머 매트릭스 단백질(COMP) 코일드 코일 도메인을 포함하는 것인 세포.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CAR이
   a) 다음 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH):
   CDR1 - SYWMN(서열번호 1);
   CDR2 - QIWPGDGDTNYNGKFK(서열번호 2)
   CDR3 - RETTTVGRYYYAMDY(서열번호 3); 및
   b) 다음 서열을 갖는 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL):
   CDR1 - KASQSVDYDGDSYLN(서열번호 4);
   CDR2 - DASNLVS(서열번호 5)
   CDR3 - QQSTEDPWT(서열번호 6)
   을 포함하는 CD19 결합 도메인을 포함하는 것인 세포.
9. 제8항에 있어서, CD19 결합 도메인이 서열번호 7 또는 서열번호 8로서 나타낸 서열을 가진 VH 도메인; 또는 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11로서 나타낸 서열을 가진 VL 도메인, 또는 CD19에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하는 것인 세포.
10. 제9항에 있어서, CD19 결합 도메인이 서열번호 12, 서열번호 13 또는 서열번호 14로서 나타낸 서열, 또는 CD19에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하는 것인 세포.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CAR이
    a) 다음 서열을 가진 상보성 결정 영역(CDR)을 가진 중쇄 가변 영역(VH):
    CDR1 - NYWIN(서열번호 15);
    CDR2 - NIYPSDSFTNYNQKFKD(서열번호 16)
    CDR3 - DTQERSWYFDV(서열번호 17); 및
    b) 다음 서열을 가진 CDR을 가진 경쇄 가변 영역(VL):
    CDR1 - RSSQSLVHSNGNTYLH(서열번호 18);
    CDR2 - KVSNRFS(서열번호 19);
    CDR3 - SQSTHVPWT(서열번호 20)
    을 포함하는 CD22 결합 도메인을 포함하는 것인 세포.
12. 제11항에 있어서, CD22 결합 도메인이 서열번호 21 또는 서열번호 22로서 나타낸 서열을 가진 VH 도메인; 또는 서열번호 23 또는 서열번호 24로서 나타낸 서열을 가진 VL 도메인, 또는 CD22에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하는 것인 세포.
13. 제11항에 있어서, CD22 결합 도메인이 서열번호 25 또는 서열번호 26으로서 나타낸 서열, 또는 CD22에 결합하는 능력을 보유하는, 적어도 90% 서열 동일성을 가진 이의 변이체를 포함하는 것인 세포.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CAR이 하기 구조:
    AgB1-스페이서1-TM1-TNF-ITAM
    을 갖고;
    상기 구조에서,
    AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인이고;
    스페이서1은 제1 CAR의 스페이서이고;
    TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인이고;
    TNF는 TNF 수용체 엔도도메인이고;
    ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인임;
    제2 CAR이 하기 구조:
    AgB2-스페이서2-TM2-costim-ITAM
    을 가진 것인 세포:
    상기 구조에서,
    AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인이고;
    스페이서2는 제2 CAR의 스페이서이고;
    TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인이고;
    costim은 보조자극 도메인이고;
    ITAM은 ITAM 함유 엔도도메인임.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 제1 키메라 항원 수용체(CAR) 및 제2 CAR 둘 다, dSHP2, 및 dnTGFβRII를 코딩하는 핵산 서열.
16. 제15항에 있어서, 하기 구조:
    모듈1-coexpr-AgB1-스페이서1-TM1-coexpr-AgB2-스페이서2-TM2-coexpr-모듈2
    를 가지며, T 세포에서 발현될 때, 제1 CAR 및 제2 CAR이 T 세포 표면에서 공-발현되도록 절단 부위에서 절단되는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열:
    상기 구조에서,
    AgB1은 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    coexpr은 공-발현을 가능하게 하는 핵산 서열이고;
    AgB2는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    spacer2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    모듈1 및 모듈2는 우성 음성 SHP2(dSHP2) 또는 우성 음성 TGFβRII(dnTGFβRII)를 코딩하는 핵산 서열이고, 모듈1이 dSHP2를 코딩할 때, 모듈2는 dnTGFβRII를 코딩하고, 모듈2가 dnTGFβRII를 코딩할 때, 모듈1은 dSHP2를 코딩한다.
17. 제16항에 있어서, coexpr이 자가 절단 펩타이드를 포함하는 서열을 코딩하는 것인 핵산 서열.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상동 재조합을 피하기 위해 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 서열 영역에서 대체 코돈이 사용되는 것인 핵산 서열.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
20. 제19항에 따른 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포존.
21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제조하는 방법으로서, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열; 또는 제19항 또는 제20항에 따른 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 세포의 제조 방법.
22. 제21항에 있어서, 세포가 대상체로부터 단리된 샘플로부터 유래한 것인 방법.
23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 복수의 세포를 포함하는 약학 조성물.
24. 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법으로서, 제23항에 따른 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서,
    (i) 대상체로부터 세포 함유 샘플을 단리하는 단계;
    (ii) 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열; 또는 제19항 또는 제20항에 따른 벡터로 세포를 형질도입하거나 형질감염시키는 단계; 및
    (iii) (ii) 단계로부터의 세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 질환이 암인 방법.
27. 제26항에 있어서, 암이 B 세포 악성종양인 방법.
28. 제23항에 있어서, 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
29. 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
30. 하기 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 키트:
    (i) 제1 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 제1 핵산 서열로서, 하기 구조:
    AgB1-스페이서1-TM1
    을 가진 제1 핵산 서열;
    상기 구조에서,
    AgB1은 CD19에 결합하는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    스페이서1은 제1 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM1은 제1 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열임;
    (ii) 제2 키메라 항원 수용체를 코딩하는 제2 핵산 서열로서, 하기 구조:
    AgB2-스페이서2-TM2
    를 가진 제2 핵산 서열;
    상기 구조에서,
    AgB2는 CD22에 결합하는 제2 CAR의 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이고;
    스페이서2는 제2 CAR의 스페이서를 코딩하는 핵산 서열이고;
    TM2는 제2 CAR의 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열임;
    (iii) 본원에 기재된 dSHP2 및 dnTGFβRII를 코딩하는 제3 핵산 서열.
31. 제30항에서 정의된 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 벡터; 제30항에서 정의된 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터; 및 제30항에서 정의된 제3 핵산 서열을 포함하는 제3 벡터를 포함하는 키트.

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