JP2023524132A - 細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、（ｉ）ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む、細胞表面の第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、（ｉｉ）ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む、細胞表面の第２のＣＡＲと、（ｉｉｉ）ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）と、（ｉｖ）ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）とを共発現する細胞に関する。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫コンジュゲートｍＡｂ、放射性コンジュゲートｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、癌の処置に使用するためのいくつかの免疫療法剤が記載されている。

Description

本発明は、１を超えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞に関する。

治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫コンジュゲートｍＡｂ、放射性コンジュゲートｍＡｂおよび二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、癌の処置に使用するためのいくつかの免疫療法剤が記載されている。

典型的には、これらの免疫療法剤は単一の抗原を標的とし、例えば、リツキシマブはＣＤ２０を標的とし、ミエロターグはＣＤ３３を標的とし、アレムツズマブはＣＤ５２を標的とする。

ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化の非常に早い段階で発現され、形質細胞への最終的なＢ細胞分化でのみ失われる。その結果、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫を除く全てのＢ細胞悪性腫瘍で発現される。正常なＢ細胞区画の喪失は許容され得る毒性であるので、ＣＤ１９は魅力的なＣＡＲ標的であり、ＣＡＲを有するＣＤ１９を標的とする臨床研究は有望な結果を見ている。

腫瘍学の分野における特定の問題は、ゴルディ－コールドマン（Ｇｏｌｄｉｅ－Ｃｏｌｄｍａｎ）仮説によって提供され、これは、ほとんどの癌に固有の高い突然変異率のために、単一抗原の唯一の標的化が当該抗原の調節によって腫瘍エスケープをもたらし得ることを記載している。抗原発現のこの調節は、ＣＤ１９を標的とするものを含む既知の免疫療法の有効性を低下させる可能性がある。

したがって、ＣＤ１９を標的とする免疫治療薬の問題は、Ｂ細胞悪性腫瘍が変異してＣＤ１９陰性になる可能性があることである。これは、ＣＤ１９標的化治療薬に応答しないＣＤ１９陰性癌の再発をもたらし得る。例えば、１つの小児研究において、Ｇｒｕｐｐらは、Ｂ急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）に対するＣＤ１９標的化キメラ抗原受容体療法後の全再発の半数がＣＤ１９陰性疾患によるものであったことを報告した（５６^ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）。

したがって、ＣＤ１９陽性癌を含む多くの癌に関連するマーカー発現の複雑なパターンを反映するために１を超える細胞表面構造を標的とすることができる免疫療法剤が必要とされている。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、Ｔ細胞の生存シグナルおよび活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメインに全て接続された、アミノ末端を認識する抗原、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａを参照されたい）。

これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。腫瘍関連抗原に対していくつかのＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入アプローチは、様々な癌の処置のために現在臨床試験中である。

癌処置のためにＣＡＲアプローチを使用すると、腫瘍の不均一性および免疫編集がＣＡＲ処置からのエスケープを引き起こし得ることが観察されている。例えば、Ｇｒｕｐｐら（２０１３；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６８：１５０９－１５１８，ｐａｐｅｒ Ｎｏ ３８０，ＡＳＨ ２０１４）によって記載された研究では、急性Ｂリンパ性白血病の処置にＣＡＲ改変Ｔ細胞アプローチを使用した。その臨床試験では、１ヶ月後に完全寛解した１０人の患者が再発し、そのうち５人がＣＤ１９陰性疾患を再発したことが分かった。

したがって、癌エスケープおよび腫瘍不均一性の問題に対処する代替ＣＡＲ処置アプローチが必要とされている。

２つのＣＡＲ結合特異性の発現
タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二重特異性ＣＡＲは、複数の癌特異的マーカーを同時に標的とする試みで開発されている。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーによって連結された２つの抗原結合特異性をタンデムに含む。したがって、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は両方とも単一の膜貫通部分に連結され、一方のｓｃＦｖは膜に並置され、他方は遠位位置にある。

Ｇｒａｄａら（２０１３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０５）は、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、続いてＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー、次いでＨＥＲ２特異的ｓｃＦｖを含むＴａｎＣＡＲを記載している。ＨＥＲ２－ｓｃＦｖは膜近傍位置にあり、ＣＤ１９－ｓｃＦｖは遠位位置にあった。Ｔａｎ ＣＡＲは、２つの腫瘍制限抗原のそれぞれに対して異なるＴ細胞反応性を誘導することが示された。この配置は、ＨＥＲ２（６３２ａａ／１２５Å）およびＣＤ１９（２８０ａａ、６５Å）のそれぞれの長さがその特定の空間配置に適しているために選択された。ＨＥＲ２ ｓｃＦｖがＨＥＲ２の最遠位４ループに結合することも知られていた。
このアプローチの問題は、膜近傍ｓｃＦｖが、遠位ｓｃＦｖの存在、特に抗原に結合している遠位ｓｃＦｖの存在のためにアクセスできない可能性があることである。標的細胞上の抗原の空間的配置を考慮して２つのｓｃＦｖの相対位置を選択する必要性を考慮すると、全てのｓｃＦｖ結合対に対してこのアプローチを使用することは不可能な場合がある。さらに、ＴａｎＣａｒアプローチが２を超えるｓｃＦｖに使用され得る可能性は低く、３またはそれを超えるｓｃＦｖを有するＴａｎＣＡＲは非常に大きな分子であり、ｓｃＦｖは互いに十分に折り返すことができ、抗原結合部位を不明瞭にする。２つまたはそれを超える更なるｓｃＦｖによって膜貫通ドメインから分離される最も遠位のｓｃＦｖによる抗原結合が、Ｔ細胞活性化を引き起こすことができるかどうかも疑わしい。
したがって、Ｔ細胞等の細胞の表面に２つのＣＡＲ結合特異性を発現させるための代替アプローチが必要とされている。この問題は、国際公開第２０１６／１０２９６５号において本発明者らによって対処された。改善された生存および持続性も示す２つのＣＡＲ結合特異性を表面上に発現する細胞を提供する必要性が依然として存在する。

国際公開第２０１６／１０２９６５号

５６ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｇｒｕｐｐら（２０１３；Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６８：１５０９－１５１８，ｐａｐｅｒ Ｎｏ ３８０，ＡＳＨ ２０１４ Ｇｒａｄａら（２０１３，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０５）

本発明者らは、１つがＣＤ１９に特異的であり、１つがＣＤ２２に特異的である２つのＣＡＲを細胞表面に発現するＣＡＲ Ｔ細胞を開発した。さらに、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、本明細書においてより詳細に記載される増強モジュールを更に含む。

したがって、第１の態様では、本発明は、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞を提供し、各ＣＡＲは抗原結合ドメインを含み、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ１９に結合し、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ２２に結合し、更に、細胞はドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）およびドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）を発現する。

一方のＣＡＲがＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２２に結合するという事実は、いくつかのリンパ腫および白血病がＣＤ１９標的化後にＣＤ１９陰性になり（または場合によってはＣＤ２２標的化後にＣＤ２２陰性になり）、そのため、これが起こると「バックアップ」抗原を与えるので有利である。さらに、本発明者らは、本明細書に更に記載されるように、ｄＳＨＰ２およびｄｎＴＧＦβＲＩＩとの特定の組み合わせが有利であることを示した。

本発明者らはまた、細胞内シグナル伝達ドメインの特定の組み合わせも有利であることを示した。したがって、各ＣＡＲが細胞内シグナル伝達ドメインを含む本発明の細胞が提供され、第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインがＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激エンドドメインを含む。

共刺激エンドドメインは、ＣＤ２８共刺激エンドドメインであり得る。適切なＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインの例としては、ＯＸ－４０および４－１ＢＢエンドドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

第１および第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＩＴＡＭ含有エンドドメインを含み得る。

細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはＮＫＴ細胞等の免疫エフェクター細胞であり得る。Ｔ細胞に関連して本明細書で言及される特徴は、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞等の他の免疫エフェクター細胞にも等しく適用される。

各ＣＡＲは、
（ｉ）抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを、含み得る。

各ＣＡＲは、
（ｉ）抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）スペーサーと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインとを、含み得る。

第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲがヘテロ二量体を形成しないように、第１のＣＡＲのスペーサーは、第２のＣＡＲのスペーサーと異なっていてもよい。

第１のＣＡＲのスペーサーは、各ＣＡＲがそのそれぞれの標的抗原の認識のために調整されるように、第２のＣＡＲのスペーサーとは異なる長さおよび／または構成を有し得る。第２のＣＡＲに適したスペーサーには、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）コイルドコイルドメインが含まれるが、これらに限定されない。

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜遠位エピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン７、６、５または４上、例えばＣＤ２２のＩｇドメイン５上のエピトープに結合し得る。

第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、エクソン１、３または４によってコードされるＣＤ１９上のエピトープに結合し得る。

第１のＣＡＲのＣＤ１９結合ドメインは、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－SYWMN（配列番号１）；
ＣＤＲ２－QIWPGDGDTNYNGKFK（配列番号２）
ＣＤＲ３－RETTTVGRYYYAMDY（配列番号３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－KASQSVDYDGDSYLN（配列番号４）；
ＣＤＲ２－DASNLVS（配列番号５）
ＣＤＲ３－QQSTEDPWT（配列番号６）を含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７もしくは配列番号８として示される配列を有するＶＨドメイン、または配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号１１として示されている配列を有するＶＬドメイン、またはＣＤ１９に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４として示される配列、またはＣＤ１９に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

第２のＣＡＲのＣＤ２２結合ドメインは、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－NYWIN（配列番号１５）；
ＣＤＲ２－NIYPSDSFTNYNQKFKD（配列番号１６）
ＣＤＲ３－DTQERSWYFDV（配列番号１７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－RSSQSLVHSNGNTYLH（配列番号１８）；
ＣＤＲ２－KVSNRFS（配列番号１９）
ＣＤＲ３－SQSTHVPWT（配列番号２０）を含み得る。

ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２１もしくは配列番号２２として示されるＶＨ配列；または配列番号２３もしくは配列番号２４として示される配列を有するＶＬドメイン；またはＣＤ２２に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２５もしくは配列番号２６として示される配列、またはＣＤ２２に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

第２のＣＡＲのエンドドメインは、共刺激ドメインおよびＩＴＡＭ含有ドメインを含み、第１のＣＡＲのエンドドメインはＴＮＦ受容体ファミリードメインおよびＩＴＡＭ含有ドメインを含み得る。

例えば、第１のＣＡＲ（ＣＤ１９特異的である）は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ１は抗原結合ドメインであり、
スペーサー１はスペーサーであり、
ＴＭ１は膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦはＴＮＦ受容体エンドドメインであり、
ＩＴＡＭはＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有することができ、
第２のＣＡＲ（ＣＤ２２特異的である）は、構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ２は抗原結合ドメインであり、
スペーサー２はスペーサーであり、
ＴＭ２は膜貫通ドメインであり、
ｃｏｓｔｉｍは共刺激ドメインであり、
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有することができる。

第２の態様では、本発明は、ｄＳＨＰ２およびｄｎＴＧＦβＲＩＩと共に、本発明の第１の態様で定義される第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列を提供する。

核酸配列は、以下の構造：
モジュール１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｅｘｐｒ－モジュール２
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
モジュール１およびモジュール２は、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）またはドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）のいずれかをコードする核酸配列であり、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする場合、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードし、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする場合、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする）を有し得て、
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現される場合、第１および第２のＣＡＲがＴ細胞表面において共発現されるように、切断部位において切断されるポリペプチドをコードする。

核酸配列は、以下の構造：
モジュール１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２－ｃｏｅｘｐｒ－モジュール２
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり、
モジュール１およびモジュール２は、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）またはドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）のいずれかをコードする核酸配列であり、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする場合、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードし、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする場合、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする）を有し得て、
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現される場合、第１および第２のＣＡＲがＴ細胞表面において共発現されるように、切断部位において切断されるポリペプチドをコードする。

２つのＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列は、自己切断ペプチド、または２つのＣＡＲを共発現させる代替手段、例えば内部リボソーム進入配列もしくは第２のプロモーター、または当業者が同じベクターから２つのタンパク質を発現することができる他のそのような手段を可能にする配列をコードし得る。

相同組換えを回避するため、膜貫通および／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）等の同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替コドンを使用することができる。例えば、２つのＣＡＲが、この部分またはこれらの部分（単数または複数）について同じまたは類似のアミノ酸配列を有するが、異なる核酸配列によってコードされるように、代替コドンが、スペーサー、膜貫通ドメインおよび／またはエンドドメインの全部もしくは一部をコードする配列の部分において使用され得る。

第３の態様では、本発明は、
（ｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、核酸配列が、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１
（式中、
ＡｇＢ１は、ＣＤ１９に結合する第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）を有する、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列であって、核酸配列が、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（式中、
ＡｇＢ２は、ＣＤ２２に結合する第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）を有する、第２の核酸配列と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のｄＳＨＰ２およびｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする第３の核酸配列と、を含むキットを提供する。

キットは、
（ｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、その核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｅｎｄｏ１
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）の構造を有する、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、その核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｅｎｄｏ２
（式中、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）の構造を有する第２の核酸配列と、を含み得る。

第４の態様では、本発明は、第１の核酸配列を含む第１のベクターと、第２の核酸配列を含む第２のベクターと、第３の核酸配列を含む第３のベクターとを含むキットを提供する。

ベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。ベクターはレンチウイルスベクターであり得る。

第５の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列を含むベクターを提供する。ベクターはレンチウイルスベクターであり得る。

ベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。

第６の態様では、本発明は、第１および第２のＣＡＲと、ｄＳＨＰ２と、ｄｎＴＧＦβＲＩＩとをコードする１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）、または上で定義される１またはそれを超えるベクター（単数または複数）を細胞に導入する工程を含む、本発明の第１の態様による細胞を作製するための方法を提供する。細胞はＴ細胞であり得る。

細胞は、限定されないが、患者、関係するもしくは関係のない造血移植ドナー、完全に無関係のドナー、臍帯血由来、胚細胞株から分化した、誘導性前駆細胞株から分化した、または形質転換細胞株に由来するものを含む、対象から単離された試料に由来し得る。

第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

第８の態様では、本発明は、疾患を処置するおよび／または予防する方法であって、本発明の第７の態様による医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。

本方法は、以下：
（ｉ）対象からの細胞含有試料の単離工程；
（ｉｉ）第１のＣＡＲ、第２のＣＡＲ、ｄＳＨＰ２およびｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）、またはそのような核酸配列（単数または複数）を含む１またはそれを超えるベクター（単数または複数）による細胞の形質導入またはトランスフェクション工程；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与する工程、を含み得る。

疾患は癌であり得る。癌は、Ｂ細胞悪性腫瘍であり得る。

第９の態様では、本発明は、疾患の処置するおよび／または予防に使用するための本発明の第７の態様による医薬組成物を提供する。

第１０の態様では、本発明は、疾患を処置するおよび／または予防するための医薬品の製造における本発明の第１の態様による細胞の使用を提供する。

本発明はまた、
ａ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のヌクレオチド配列と、
ｂ）第２のＣＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列と
（一方のＣＡＲがＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２２に結合する）、
ｃ）２つのＣＡＲが別々の実体として発現されるように、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間に位置する自己切断ペプチドをコードする配列と、を含む核酸配列も提供する。

代替コドンは、同じまたは類似のアミノ酸配列（単数または複数）をコードする領域内の第１および第２のヌクレオチド配列の１またはそれを超える部分（単数または複数）に使用され得る。

本発明はまた、そのような核酸を含むベクターおよび細胞を提供する。

ベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターであり得る。

本発明者らはまた、ＯＲゲートシステムにおいて、共刺激ドメインおよび生存シグナルを生成するドメインが２つ（またはそれを超える）のＣＡＲ間で「スプリット（ｓｐｌｉｔ）」される場合、性能が改善されることを見出した。

したがって、第１１の態様では、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲとを細胞表面に共発現する細胞が提供され、各ＣＡＲは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインを含む。

共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインは、例えば、ＯＸ－４０または４－１ＢＢエンドドメインであり得る。

第１および第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＣＤ３ゼータエンドドメイン等のＩＴＡＭ含有ドメインを含み得る。

第１のＣＡＲは、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーであり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦはＴＮＦ受容体エンドドメインであり、
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）。

第２のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーであり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
ｃｏｓｔｉｍは共刺激ドメインであり、
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有し得る。

第１２の態様では、本発明の第１１の態様において定義される第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列が提供される。

核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ２
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体エンドドメインをコードする核酸配列であり、
ＩＴＡＭ１は、第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり、
ＩＴＡＭ２は、第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）を有し得る。

核酸配列が細胞内で発現される場合、それは、第１および第２のＣＡＲが細胞表面で共発現されるように、切断部位で切断されるポリペプチドをコードし得る。

第１３の態様では、
（ｉ）本発明の第１１の態様において定義される第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、その核酸配列が以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ１
（式中、ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体エンドドメインをコードする核酸配列であり、
ＩＴＡＭ１は、第１のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）を有する、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）本発明の第１１の態様において定義される第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列であって、その核酸配列が、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ２
（ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｓｔｉｍは、共刺激ドメインをコードする核酸配列であり、
ＩＴＡＭ２は、第２のＣＡＲのＩＴＡＭ含有エンドドメインをコードする核酸配列である）を有する、第２の拡散配列と、を含むキットが提供される。

第１４の態様では、本発明の第１１の態様または本発明の第１２の態様で定義される核酸配列を含むベクターが提供される。

第１５の態様では、本発明の第１１の態様による細胞を作製するための方法であって、本発明の第１２の態様による核酸配列；本発明の第１３の態様で定義される第１の核酸配列および第２の核酸配列；または本発明の第１４の態様によるベクターを細胞に導入する工程を含む方法が提供される。

第１６の態様では、本発明は、本発明の第１１の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。

本発明の第１６の態様による医薬組成物を対象に投与する工程を含む、疾患を処置するおよび／または予防する方法も提供される。

疾患の処置するおよび／または予防に使用するための本発明の第１６の態様による医薬組成物も提供される。

疾患を処置するおよび／または予防するための医薬品の製造における本発明の第１１の態様による細胞の使用も提供される。

ＣＤ１９を標的とする１つのＣＡＲおよびＣＤ２２を標的とする１つのＣＡＲを提供することによって、これらのマーカーの各々を標的とすることが可能であり、それにより、癌エスケープの問題が軽減される。

ＣＡＲは別個の分子として細胞の表面上に発現されるため、このアプローチは、ＴａｎＣＡＲに関連する空間的および接近可能性の問題を克服する。細胞活性化効率も向上する。各ＣＡＲがそれ自体のスペーサーを有する場合、スペーサー、したがって結合ドメインが細胞表面から突出する距離およびその柔軟性等を特定の標的抗原に合わせることが可能である。この選択は、ＴａｎＣＡＲに関連する設計上の検討事項、すなわち、１つのＣＡＲがＴ細胞膜に並置される必要があり、１つのＣＡＲが遠位にあり、第１のＣＡＲとタンデムに配置される必要があることによって束縛されない。

切断部位によって分離された２つのＣＡＲをコードする単一の核酸を提供することによって、単純な単一の形質導入手順を用いて２つのＣＡＲを共発現するように細胞を操作することが可能である。二重トランスフェクション手順は、別々のコンストラクト中のＣＡＲコード配列と共に使用することができるが、これはより複雑で高価であり、核酸のためのより多くの組込み部位を必要とする。二重トランスフェクション手順はまた、両方のＣＡＲコード核酸が形質導入され、効果的に発現されたかどうかに関する不確実性に関連するであろう。

ＣＡＲは、高い相同性の部分を有し、例えば、膜貫通ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインは、高い相同性を有する可能性が高い。同じまたは類似のリンカーが２つのＣＡＲに使用される場合、それらは高度に相同である。これは、両方のＣＡＲが単一の核酸配列上に提供されるアプローチが、配列間の相同組換えの可能性のために不適切であることを示唆するであろう。しかしながら、本発明者らは、相同性の高い領域をコードする配列の部分を「コドンゆらぎ」によって、単一のコンストラクトから２つのＣＡＲを高効率で発現させることが可能であることを見出した。コドンのゆらぎ（Ｃｏｄｏｎ ｗｏｂｂｌｉｎｇ）は、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域において代替コドンを使用することを含む。

ａ）古典的ＣＡＲを示す概略図。（ｂ）～（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および順列：（ｂ）初期設計は、ＦｃεＲ１－γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭシグナルのみを伝達し、その後の設計は、同じ化合物エンドドメインにおいて追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達した。 Ｂ細胞成熟経路／Ｂ細胞の個体発生。ＤＲ＝ＨＬＡ－ＤＲ；ｃＣＤ７９＝細胞質ＣＤ７９；ｃＣＤ２２＝細胞質ＣＤ２２。ＣＤ１９抗原およびＣＤ２２抗原の両方が、Ｂ細胞成熟の初期段階で発現される。Ｂ細胞急性白血病に発展するのはこれらの細胞である。ＣＤ１９ならびにＣＤ２２の両方を同時に標的とすることは、Ｂ細胞急性白血病を標的とするのに最も適している。 ＣＤ１９の構造およびエクソン 抗ＣＤ１９ ＯＲ ＣＤ２２ ＣＡＲカセットの設計のための戦略。ＣＤ１９を認識するバインダーおよびＣＤ２２を認識するバインダーを選択する。各ＣＡＲについて最適なスペーサードメインおよびシグナル伝達ドメインが選択される。（ａ）ＦＭＤ－２Ａペプチドを使用して両方のＣＡＲが共発現されるようにＯＲゲートカセットが構築される。組換えを回避するために、任意の相同配列をコドンゆらぎにする。（ｂ）２つのＣＡＲは、Ｔ細胞表面上に別個のタンパク質として共発現される。 同一のペプチド配列のレトロウイルスベクターにおける共発現を可能にするが相同組換えを回避するためのコドンゆらぎの例。ここで、野生型ＨＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍゼータを、コドンゆらぎＨＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍゼータと整列させる。 本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートの概略図。 天然に存在する二量体、三量体および四量体コイルドコイル構造（Ａｎｄｒｅｉ Ｎ．ＬｕｐａｓおよびＭａｒｋｕｓ Ｇｒｕｂｅｒ；Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．２００５；７０：３７－７８から改変）。 コラーゲンオリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）およびヒトＩｇＧ１由来の五量体コイルドコイルモチーフの結晶構造。個々の鎖は、異なる色で示されている。コイルドコイルＣＯＭＰ構造は、Ｎ末端からＣ末端がページ内に延在して表示され、また、Ｃ末端が左からＮ末端右に向かってプロファイルから表示される。ヒトＩｇＧ１を、Ｎ末端（上）からＣ末端（下）を有するプロファイルから表示する。 ＣＯＭＰスペーサーの切断。ａ）抗ＲＯＲ－１ ＣＯＭＰ ＣＡＲを示す概略図であり、ＣＯＭＰスペーサーは、Ｎ末端から４５アミノ酸から「ｘ」アミノ酸まで切断されていた。ｂ）２９３Ｔ細胞を切断型コンストラクトでトランスフェクトし、ＦＡＣＳによって分析した。 ＣＯＭＰスペーサーの切断。ａ）抗ＲＯＲ－１ ＣＯＭＰ ＣＡＲを示す概略図であり、ＣＯＭＰスペーサーは、Ｎ末端から４５アミノ酸から「ｘ」アミノ酸まで切断されていた。ｂ）２９３Ｔ細胞を切断型コンストラクトでトランスフェクトし、ＦＡＣＳによって分析した。 ｉｎ ｖｉｖｏでのａ）Ｔ細胞活性化およびｂ）Ｔ細胞阻害の機序を示す概略図。 ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトの概要。異なる分子としての各ＣＡＲの発現を達成するために、ＣＤ１９およびＣＤ２２ ＣＡＲを自己切断２Ａ配列によって分離した。 様々なＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトの比較。コンストラクトの１つを発現する細胞を、標的細胞と１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比（５０，０００個の標的細胞）で７２時間共培養した。（Ａ）残りの標的細胞；（Ｂ）ＩＬ－２産生；（Ｃ）ＩＦＮ－γ産生；（Ｄ）増殖。青色円：形質導入されていない細胞；赤色四角：コンストラクト１；緑色菱形：コンストラクト３；紫色円：コンストラクト４；黒色四角；コンストラクト５。 同上。 様々なＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。コンストラクトの１つを発現する細胞を、標的細胞と１：１および１：１０のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で７２時間共培養した。青色円：形質導入されていない細胞；赤色四角：コンストラクト１；緑色三角：コンストラクト３；紫色三角：コンストラクト５。（Ａ）残りの標的細胞；（Ｂ） 様々なＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。コンストラクトの１つを発現する細胞を、標的細胞と１：１および１：１０のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で７２時間共培養した。青色円：形質導入されていない細胞；赤色四角：コンストラクト１；緑色三角：コンストラクト３；紫色三角：コンストラクト５。（Ａ）残りの標的細胞；（Ｂ） 様々なＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験。コンストラクトの１つを発現する細胞を、標的細胞と１：１および１：１０のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で７２時間共培養した。青色円：形質導入されていない細胞；赤色四角：コンストラクト１；緑色三角：コンストラクト３；紫色三角：コンストラクト５。（Ａ）残りの標的細胞；（Ｂ） ｄｎＴＧＦβＲＩＩモジュールの試験。青色円：媒体のみ；赤色丸：＋１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＴＧＦ－β。 ｄｎＴＧＦβＲＩＩモジュールの試験。青色円：媒体のみ；赤色丸：＋１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＴＧＦ－β。 ｄＳＨＰ２モジュールの試験。青色円：形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞；ＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１細胞；ＣＤ１９＋ＰＤＬ＋ＳｕｐＴ１細胞。 ｄＳＨＰ２モジュールの試験。青色円：形質導入されていないＳｕｐＴ１細胞；ＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１細胞；ＣＤ１９＋ＰＤＬ＋ＳｕｐＴ１細胞。 再刺激アッセイ。赤色バー：標的細胞；青色バー：Ｔ細胞。上段：ＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１細胞；下段：ＣＤ２２＋ＳｕｐＴ１細胞。 コンストラクト５を比較するための出発点として役立つ、コンストラクト１を発現する細胞の準最適用量の同定。 コンストラクト１、３、および５のｉｎ ｖｉｖｏ比較。コンストラクト１を発現する細胞は、この投与量レベル（２．５×１０^６個のＴ細胞）で腫瘍負荷を制御することができない。コンストラクト３またはコンストラクト５を発現する細胞は、改善された活性を示す。特に、コンストラクト５は、全てのマウスにおいて２３日目まで腫瘍負荷の制御を示す。フラックスの差は、コンストラクト１と比較して統計的に有意である。 ＣＤ１９ノックアウトＮａｌｍ ６マウスにおけるコンストラクト１、３および５のｉｎ ｖｉｖｏ比較。コンストラクト１を発現する細胞は、この投与量レベル（２．５×１０^６個のＴ細胞）で腫瘍負荷を制御することができない。コンストラクト３またはコンストラクト５を発現する細胞は、改善された活性を示す。特に、コンストラクト５は、一匹を除く全てのマウスにおいて２７日目まで腫瘍負荷の制御を示す。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＣＡＲは、図１に概略的に示されており、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことができる。バインダーを膜から単離し、適切な配向を可能にするために、スペーサードメインが通常必要である。使用される共通のスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。よりコンパクトなスペーサーは、抗原に応じて、例えばＣＤ８αからのストーク、更にはＩｇＧ１ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。その結果、これらの第一世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、これは、同族標的細胞のＴ細胞殺傷を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖して生存させることができなかった。この制限を克服するために、化合物エンドドメインが構築されており、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合は、抗原認識後に同時に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを伝達することができる第二世代受容体をもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインはＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給し、Ｔ細胞増殖を誘発する。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢ等のＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、更により強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。

ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターを使用してもよい。このようにして、養子細胞移入のために多数の癌特異的Ｔ細胞を生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、ＣＡＲが発現するＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的化抗原を発現する腫瘍細胞に向ける。

本発明の第１の態様は、Ｔ細胞がこれらのマーカーのいずれかを発現する標的細胞を認識することができるように、一方のＣＡＲがＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２２に結合する、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを共発現する細胞に関する。

したがって、本発明の第１および第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは異なる抗原に結合し、両方のＣＡＲは活性化エンドドメインを含む。さらに、各ＣＡＲは異なる細胞内シグナル伝達ドメインを使用する。２つのＣＡＲは、同じであってもよく、または２つの異なる受容体の交差対合を防止するために十分に異なっていてもよいスペーサードメインを含み得る。したがって、細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２２のいずれかまたは両方の認識時に活性化するように操作することができる。これは、ゴルディ－コールドマン仮説によって示されるように腫瘍学の分野において有用であり、単一抗原の唯一の標的化は、ほとんどの癌に固有の高い突然変異率のために当該抗原の調節によって腫瘍エスケープをもたらし得る。２つの抗原を同時に標的とすることによって、そのような回避の可能性は指数関数的に減少する。

２つのＣＡＲがヘテロ二量体化しないことが重要である。

本発明のＴ細胞の第１および第２のＣＡＲは、切断部位と共に両方のＣＡＲを含むポリペプチドとして産生され得る。

シグナルペプチド
本発明の細胞のＣＡＲは、ＣＡＲがＴ細胞等の細胞内で発現される場合、新生タンパク質が小胞体に向けられ、続いて細胞表面に向けられ、そこで発現されるように、シグナルペプチドを含み得る。

シグナルペプチドのコアは、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有し得る。シグナルペプチドは、転座中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ、短い正電荷を帯びたアミノ酸のストレッチから始まる場合がある。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断される一続きのアミノ酸が存在する。シグナルペプチダーゼは、転位の間または完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドを特異的プロテアーゼによって消化する。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。

シグナルペプチドは、シグナルペプチドが依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能する限り、配列番号２７、２８もしくは２９、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそのバリアントを含み得る。
配列番号２７：MGTSLLCWMALCLLGADHADG

配列番号２７のシグナルペプチドは、コンパクトで高効率である。これは、末端グリシンの後に約９５％の切断を与え、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去を与えると予測される。
配列番号２８：MSLPVTALLLPLALLLHAARP

配列番号２８のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
配列番号２９：MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

配列番号２９のシグナルペプチドは、ＣＤ８に由来する。

第１のＣＡＲのためのシグナルペプチドは、第２のＣＡＲのシグナルペプチドとは異なる配列を有し得る。

ＣＤ１９
ヒトＣＤ１９抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する９５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ１９は、単一の膜貫通ドメイン、細胞質Ｃ末端および細胞外Ｎ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質として分類される。ＣＤ１９の一般構造を図３に示す。

ＣＤ１９は、正常および新生物Ｂ細胞ならびに濾胞樹状細胞のバイオマーカーである。実際、これは、Ｂ細胞芽球への発達中の最も早い認識可能なＢ系統細胞からのＢ細胞上に存在するが、形質細胞への成熟時に失われる。それは、主にＣＤ２１およびＣＤ８１と共にＢ細胞共受容体として作用する。活性化されると、ＣＤ１９の細胞質尾部はリン酸化され、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる結合およびＰＩ－３キナーゼの動員をもたらす。ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化の非常に早い段階で発現され、形質細胞への最終的なＢ細胞分化でのみ失われる。その結果、ＣＤ１９は、多発性骨髄腫を除く全てのＢ細胞悪性腫瘍で発現される。

以下の表に概説されるように、異なる設計のＣＡＲが異なる施設においてＣＤ１９に対して試験されている。

上記のように、現在までに行われた研究のほとんどは、ＣＤ１９を認識するための結合ドメインの一部としてハイブリドーマｆｍｃ６３に由来するｓｃＦｖを使用した。

図３に示されるように、ＣＤ１９をコードする遺伝子は１０個のエクソンを含み、エクソン１～４は細胞外ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６～１０は細胞質ドメインをコードする。

本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエクソン１によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。
本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエクソン３によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。

本発明のＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートにおいて、抗ＣＤ１９ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９遺伝子のエクソン４によってコードされるＣＤ１９のエピトープに結合し得る。

本発明者らは、バインダーｆｍｃ６３を含む公知の抗ＣＤ１９ ＣＡＲと比較して改善された特性を有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲを開発した（その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１０２９６５号の実施例２および３を参照されたい）。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、以下に同定されるＣＤＲおよびＶＨ／ＶＬ領域を有するＣＤ１９バインダーＣＤ１９ＡＬＡｂに基づく。

したがって、本開示は、ＣＡＲであって、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－SYWMN（配列番号１）；
ＣＤＲ２－QIWPGDGDTNYNGKFK（配列番号２）
ＣＤＲ３－RETTTVGRYYYAMDY（配列番号３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－KASQSVDYDGDSYLN（配列番号４）；
ＣＤＲ２－DASNLVS（配列番号５）
ＣＤＲ３－QQSTEDPWT（配列番号６）を含む、ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。

ＣＤ１９結合活性に悪影響を及ぼすことなく、１またはそれを超える変異（置換、付加または欠失）をＣＤＲまたは各ＣＤＲに導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。

本開示のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る。

ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬ配向（配列番号１２、１３および１４に示されるように）またはＶＬ－ＶＨ配向であり得る。

本開示のＣＡＲは、以下のＶＨ配列の１つを含み得る：

本開示のＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る。

本発明のＣＡＲは、ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－GYAFSSS（配列番号３０）；
ＣＤＲ２－YPGDED（配列番号３１）
ＣＤＲ３－SLLYGDYLDY（配列番号３２）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－SASSSVSYMH（配列番号３３）；
ＣＤＲ２－DTSKLAS（配列番号３４）
ＣＤＲ３－QQWNINPLT（配列番号３５）を含むＣＤ１９結合ドメインを含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにグラフトされた上記に定義される６つのＣＤＲを含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号３６として示される配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号３７として示される配列を有するＶＬドメイン、または少なくとも９５％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、ＶＨ－ＶＬの配向のｓｃＦｖを含み得る。

ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号３８として示されている配列、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

本開示のＣＡＲは、少なくとも８０、８５、２１、１３、１０または９９％の配列同一性を有する配列番号９０、９５、７、８、９、９８、１４、１１、２６、３７または３８として示されている配列のバリアントを含み得るが、ただし、バリアント配列はＣＤ１９に結合する能力を保持する（必要に応じて、相補的なＶＬまたはＶＨドメインと併せて）。

２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で自由に入手可能なＢＬＡＳＴ等のプログラムによって容易に決定することができる。

ＣＤ２２
ヒトＣＤ２２抗原は、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーに属する分子である。これは、成熟Ｂ細胞の表面およびいくつかの未成熟Ｂ細胞上に見出される。一般的に言えば、ＣＤ２２は、免疫系の過剰活性化および自己免疫疾患の発症を防止する調節分子である。

ＣＤ２２は、そのＮ末端に位置する免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインでシアル酸に特異的に結合する糖結合膜貫通タンパク質である。Ｉｇドメインの存在は、ＣＤ２２を免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーにする。ＣＤ２２は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達に対する阻害性受容体として機能する。

ＣＤ２２は、７つのドメインと、３つのＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）およびＩＴＡＭを含む細胞質内尾部とを有するもの、および代わりに５つの細胞外ドメインと、１つのＩＴＩＭを担持する細胞質内尾部とを含むスプライシングバリアントの２つのアイソフォームで存在し得るＩｇＳＦの分子である。ＣＤ２２は、抗原に対するＢ細胞応答の制御に関与する阻害性受容体であると考えられている。ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２はｐａｎ－Ｂ抗原であると広く考えられているが、いくつかの非リンパ組織での発現が記載されている。治療用モノクローナル抗体および免疫抱合体によるＣＤ２２の標的化は、臨床試験に入っている。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲの例は、Ｈａｓｏら（Ｂｌｏｏｄ；２０１３；１２１（７））によって記載されている。具体的には、ｍ９７１、ＨＡ２２およびＢＬ２２ ｓｃＦｖに由来する抗原結合ドメインを有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲが記載される。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲの抗原結合ドメインは、３０～５０ｎＭ、例えば３０～４０ｎＭの範囲のＫ_ＤでＣＤ２２に結合し得る。Ｋ_Ｄは約３２ｎＭであり得る。

ＣＤ－２２は、一般にＩｇドメイン１～Ｉｇドメイン７として同定される７つの細胞外ＩｇＧ様ドメインを有し、Ｉｇドメイン７はＢ細胞膜の最も近位にあり、Ｉｇドメイン７はＩｇ細胞膜の最も遠位にある（上記の図２ＢのＨａｓｏら ２０１３を参照されたい）。

ＣＤ２２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ２０２７３）のアミノ酸配列に関するＩｇドメインの位置を以下の表に要約する：

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜遠位エピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン７、６、５または４上、例えばＣＤ２２のＩｇドメイン５上のエピトープに結合し得る。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のアミノ酸２０～４１６の間、例えばＣＤ２２のアミノ酸２４２～３２６の間に位置するエピトープに結合し得る。

抗ＣＤ２２抗体ＨＡ２２およびＢＬ２２（上記のＨａｓｏら２０１３）、ならびに下記のＣＤ２２ ＡＬＡｂは、ＣＤ２２のＩｇドメイン５上のエピトープに結合する。

第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２上の膜近位エピトープに結合しない場合がある。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のＩｇドメイン３、２または１上のエピトープに結合しない場合がある。第２のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２のアミノ酸４１９～６７６の間、例えばＣＤ２２の５０５～６７６の間に位置するエピトープに結合しない場合がある。

本発明者らは、バインダーｍ９７１を含む公知の抗ＣＤ２２ ＣＡＲと比較して改善された特性を有する抗ＣＤ２２ ＣＡＲを開発した（上記の国際公開第２０１６／１０２９６５号の実施例２および３、ならびにＨａｓｏら（２０１３）を参照されたい。これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、以下に同定されるＣＤＲおよびＶＨ／ＶＬ領域を有するＣＤ２２バインダーＣＤ２２ ＡＬＡｂに基づく。

したがって、本開示はまた、
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－NYWIN（配列番号１５）；
ＣＤＲ２－NIYPSDSFTNYNQKFKD（配列番号１６）
ＣＤＲ３－DTQERSWYFDV（配列番号１７）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－RSSQSLVHSNGNTYLH（配列番号１８）；
ＣＤＲ２－KVSNRFS（配列番号１９）
ＣＤＲ３－SQSTHVPWT（配列番号２０）を含むＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。

ＣＤ２２結合活性に悪影響を及ぼすことなく、１またはそれを超える変異（置換、付加または欠失）をＣＤＲまたは各ＣＤＲに導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。

本開示のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得る。

ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬ配向（配列番号２５および２６に示す）またはＶＬ－ＶＨ配向であり得る。

本開示のＣＡＲは、以下のＶＨ配列の１つを含み得る：

本開示のＣＡＲは、以下のＶＬ配列のうちの１つを含み得る。

本開示のＣＡＲは、バリアント配列がＣＤ２２に結合する能力を保持する（必要に応じて、相補的なＶＬまたはＶＨドメインと併せて）限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、２５または９９％の配列同一性を有する配列番号９８、２６、２１、２２、２３または２４として示されている配列の変異体を含み得る。

他の抗ＣＤ２２抗体、例えば、マウス抗ヒトＣＤ２２抗体１Ｄ９－３、３Ｂ４－１３、７Ｇ６－６、６Ｃ４－６、４Ｄ９－１２、５Ｈ４－９、１０Ｃ１－Ｄ９、１５Ｇ７－２、２Ｂ１２－８、２Ｃ４－４および３Ｅ１０－７；ならびにヒト化抗ヒトＣＤ２２抗体ＬＴ２２およびイノツズマブ（Ｇ５＿４４）が公知である。表１は、各抗体について、ＶＨ、ＶＬおよびＣＤＲ配列（太字および下線）、ならびにＣＤ２２上の標的エピトープの位置を要約する。これらの抗体（またはそれらのＣＤＲ配列）は、本発明のＣＤ２２ ＣＡＲにおける使用に適している。

本開示はまた、下記を含むＣＤ２２結合ドメインを含むＣＡＲを提供する
ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
ＣＤＲ１－NFAMA（配列番号１０１）；
ＣＤＲ２－SISTGGGNTYYRDSVKG（配列番号１０２）
ＣＤＲ３－QRNYYDGSYDYEGYTMDA（配列番号１０３）；および
ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
ＣＤＲ１－RSSQDIGNYLT（配列番号１０４）；
ＣＤＲ２－GAIKLED（配列番号１０５）
ＣＤＲ３－LQSIQYP（配列番号１０６）。

ＣＤ２２結合活性に悪影響を及ぼすことなく、１またはそれを超える変異（置換、付加または欠失）をＣＤＲまたは各ＣＤＲに導入することが可能であり得る。各ＣＤＲは、例えば、１つ、２つまたは３つのアミノ酸変異を有し得る。

本開示のＣＡＲは、以下のＶＨ配列を含み得る：

本開示のＣＡＲは、以下のＶＬ配列を含み得る：

ｓｃＦｖは、ＶＨ－ＶＬ配向またはＶＬ－ＶＨ配向であり得る。

本開示のＣＡＲは、バリアント配列がＣＤ２２に結合する能力を保持する（必要に応じて、相補的なＶＬまたはＶＨドメインと併せて）限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号６３または６４として示される配列のバリアントを含み得る。

Ｂ細胞の個体発生時およびその後の腫瘍におけるＢ細胞抗原発現
ＣＤ１９は、ｐａｎ－Ｂ抗原であると広く考えられているが、非常にまれにではあるが、何らかの系統不全を示し得る。ＣＤ１９分子は、より小さいドメインと、１つのＩＴＡＭを担持する分子の細胞外部分とほぼ同じ大きさの長い細胞質内尾部とによって分離された２つの細胞外ＩｇＳＦドメインを含む。ＣＤ１９は、Ｂ細胞の発生および活性化における重要な分子である。ＣＤ２２は、７つのドメインと、３つのＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ）およびＩＴＡＭを含む細胞質内尾部とを有するもの、および代わりに５つの細胞外ドメインと、１つのＩＴＩＭを担持する細胞質内尾部とを含むスプライシングバリアントの２つのアイソフォームで存在し得るＩｇＳＦの分子である。ＣＤ２２は、抗原に対するＢ細胞応答の制御に関与する阻害性受容体であると考えられている。ＣＤ１９と同様に、ＣＤ２２はｐａｎ－Ｂ抗原であると広く考えられているが、いくつかの非リンパ組織での発現が記載されている（Ｗｅｎ ら（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ １９５０ １８８，１０７５－１０８２）。治療用モノクローナル抗体および免疫抱合体によるＣＤ２２の標的化は、臨床試験に入っている。ＣＤ２２特異的ＣＡＲの作製が記載されている（Ｈａｓｏら，２０１３，Ｂｌｏｏｄ：Ｖｏｌｕｍｅ １２１；７：１１６５－７４、およびＪａｍｅｓら ２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８０；Ｉｓｓｕｅ １０；Ｐａｇｅｓ ７０２８－３８）。

Ｂ細胞白血病の詳細な免疫防御試験は、表面ＣＤ１９は常に存在するが、表面ＣＤ２２はほぼ常に存在することを示す。例えば、Ｒａｐｏｎｉら（上記の２０１１）は、Ｂ－ＡＬＬの４２７症例の表面抗原表現型を試験し、試験した３４１症例にＣＤ２２が存在することを見出した。

上記のＣＡＲ１９標的化後のＣＤ１９ダウンレギュレーションの起こりやすさは、ゴルディ－コールドマン仮説によって説明され得る。ゴルディ－コールドマン仮説は、腫瘍細胞がその固有の遺伝的不安定性に依存する速度で耐性表現型に変異すること、ならびに癌が耐性クローンを含有する確率が変異率および腫瘍のサイズに依存することを予測する。癌細胞が細胞傷害性Ｔ細胞の直接死滅に対して本質的に耐性になることは困難であり得るが、抗原喪失は依然として可能である。実際、この現象は、黒色腫抗原およびＥＢＶ駆動型リンパ腫（ＥＢＶ－ｄｒｉｖｅｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）を標的とすることで以前に報告されている。ゴルディ－コールドマン仮説によれば、治癒の最良の可能性は、非交差耐性標的を同時に攻撃することであろう。ＣＤ２２がＢ－ＡＬＬのほぼ全ての症例で発現されることを考えると、ＣＤ２２と共にＣＤ１９の同時ＣＡＲ標的化は、耐性ＣＤ１９陰性クローンの出現を減少させ得る。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む、多数の抗原結合ドメインが当技術分野で公知である。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計アンキリンリピートタンパク質）等の人工単一バインダー；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖。

ＣＤ１９に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９に結合することができる任意のドメインであり得る。例えば、抗原結合ドメインは、表１に記載のＣＤ１９バインダーを含み得る。

ＣＤ１９に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、表２に示されるＣＤ１９バインダーの１つに由来する配列を含み得る。

ＣＤ２２に結合するＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ２２に結合することができる任意のドメインであり得る。例えば、抗原結合ドメインは、表３に記載のＣＤ２２バインダーを含み得る。

スペーサー領域
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列を含む。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが結合を促進するために異なる方向に配向することを可能にする。

本発明の細胞において、第１および第２のＣＡＲは、異なるスペーサー分子を含み得る。例えば、スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。或いは、スペーサーは、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様の長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代替リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために変更され得る。

抗ＣＤ１９ ＣＡＲのためのスペーサーは、ＣＤ８ストークスペーサー、またはＣＤ８ストークスペーサーと同等の長さを有するスペーサーを含み得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲのためのスペーサーは、少なくとも３０アミノ酸または少なくとも４０アミノ酸を有し得る。該スペーサーは、３５～５５アミノ酸、例えば４０～５０アミノ酸を有し得る。該スペーサーは約４６個のアミノ酸を有し得る。

抗ＣＤ２２ ＣＡＲのためのスペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジスペーサー、またはＩｇＧ１ヒンジスペーサーと同等の長さを有するスペーサーを含み得る。抗ＣＤ２２ ＣＡＲのスペーサーは、３０個未満のアミノ酸、または２５個未満のアミノ酸を有し得る。該スペーサーは、１５～２５アミノ酸、例えば１８～２２アミノ酸を有し得る。該スペーサーは、約２０個のアミノ酸を有し得る。

これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を以下に示す：

ＣＡＲは典型的にはホモ二量体であるため（図１ａを参照されたい）、交差対合はヘテロ二量体キメラ抗原受容体をもたらし得る。これは、例えば以下の様々な理由で望ましくない：（１）エピトープは、交差対合したＣＡＲが１つの抗原にのみ結合することができるように、標的細胞上で同じ「レベル」でなくてもよい；（２）２つの異なるｓｃＦｖからのＶＨおよびＶＬが入れ替わり、標的を認識できないか、または更に悪ければ予想外の予測されない抗原を認識する可能性がある。第１のＣＡＲのスペーサーは、交差対合を回避するために、第２のＣＡＲのスペーサーと十分に異なっていてもよい。第１のスペーサーのアミノ酸配列は、第２のスペーサーとアミノ酸レベルで５０％、４０％、３０％または２０％未満の同一性を共有し得る。

コイルドコイルドメイン
ＣＡＲは、典型的には、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続するためのスペーサー配列を含む。スペーサーは、抗原結合ドメインが適切な配向および到達を有することを可能にする。スペーサーはまた、リガンド結合時にホスファターゼからの分離を提供する。

本発明のＣＡＲは、コイルドコイルスペーサードメインを含み得る。特に、ＣＤ２２に特異的なＣＡＲは、コイルドコイルスペーサードメインを含み得る。コイルドコイルスペーサードメインは、当技術分野で前述したスペーサーを超える多くの利点を提供する。

コイルドコイルは、２～７個のアルファ－ヘリックスがロープのストランドのように一緒に包まれた構造モチーフである（図７）。多くの内因性タンパク質はコイルドコイルドメインを組み込んでいる。コイルドコイルドメインは、タンパク質折り畳み（例えば、同じタンパク質鎖内のいくつかのアルファらせんモチーフと相互作用する）に関与し得るか、またはタンパク質－タンパク質相互作用を担う場合がある。後者の場合、コイルドコイルはホモまたはヘテロオリゴマー構造を開始することができる。

本明細書で使用される場合、「多量体」および「多量体化」という用語は、「オリゴマー」および「オリゴマー化」と同義であり、交換可能である。

コイルドコイルドメインの構造は、当技術分野で周知である。例えば、Ｌｕｐａｓ＆Ｇｒｕｂｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２００７；７０；３７－３８）に記載されている。

コイルドコイルは、通常、疎水性アミノ酸残基（ｈ）および荷電アミノ酸残基（ｃ）の反復パターンｈｘｘｈｃｘｃを含有し、これをヘプタッドリピートと呼ぶ。ヘプタドリピートにおける位置は、通常、ａｂｃｄｅｆｇと標識され、ここで、ａおよびｄは、疎水性位置であり、多くの場合、イソロイシン、ロイシンまたはバリンによって占められている。この反復パターンを有する配列をアルファ－ヘリックス二次構造に折り畳むと、疎水性残基は、左巻き様式でヘリックスの周りに穏やかに巻き付いて両親媒性構造を形成する「ストライプ」として提示される。２つのそのようなヘリックスがそれら自体を細胞質内に配列するための最も好ましい方法は、親水性アミノ酸の間に挟まれた疎水性鎖を互いに巻き付けることである。したがって、オリゴマー化のための熱力学的駆動力を提供するのは疎水性表面の埋没である。コイルドコイル界面の充填は非常に密であり、ａ残基およびｄ残基の側鎖間のファンデルワールス接触はほぼ完全である。

αヘリックスは、平行であっても逆平行であってもよく、通常、左巻きのスーパーコイルを採用する。好ましくはないが、いくつかの右巻きコイルドコイルも自然界および設計タンパク質において観察されている。

コイルドコイルドメインは、コイルドコイルドメインを含むＣＡＲまたはアクセサリポリペプチドの複合体が形成されるようにコイルドコイルマルチマーを形成することができる任意のコイルコイルドメインであり得る。

コイルドコイルドメインの配列と最終的な折り畳み構造との関係は、当技術分野でよく理解されている（Ｍａｈｒｅｎｈｏｌｚら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；２０１１；１０（５）：Ｍ１１０．００４９９４）。したがって、コイルドコイルドメインは、合成的に生成されたコイルコイルドメインであり得る。

コイルドコイルドメインを含有するタンパク質の例としては、限定されないが、キネシンモータータンパク質、Ｄ型肝炎デルタ抗原、古細菌ボックスＣ／Ｄ ｓＲＮＰコアタンパク質、軟骨－オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ－２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサーまたはアポリポタンパク質Ｅが挙げられる。

様々なコイルドコイルドメインの配列を以下に示す：

コイルドコイルドメインはオリゴマー化することができる。特定の実施形態では、コイルドコイルドメインは、三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を形成することができる。

コイルドコイルドメインはロイシンジッパーとは異なる。ロイシンジッパーは、二量体化ドメインとして機能する超二次構造である。それらの存在は、平行なアルファヘリックスに接着力を生じさせる。単一ロイシンジッパーは、およそ７残基間隔で複数のロイシン残基からなり、片側に沿って延びる疎水性領域を有する両親媒性アルファヘリックスを形成する。この疎水性領域は、二量体化のための領域を提供し、モチーフを一緒に「留める（ｚｉｐ）」ことを可能にする。ロイシンジッパーは、典型的には２０～４０アミノ酸長、例えばおよそ３０アミノ酸である。

ロイシンジッパーは、典型的には、２つの異なる配列によって形成され、例えば、酸性ロイシンジッパーは、塩基性ロイシンジッパーとヘテロ二量体化する。ロイシンジッパーの一例は、ドッキングドメイン（ＤＤＤ１）およびアンカードメイン（ＡＤ１）であり、これらは以下により詳細に記載される。

ロイシンジッパーは二量体を形成するが、多量体（三量体以上）用の本発明のコイルドコイルスペーサーは二量体を形成する。ロイシンジッパーは、配列の二量体化部分においてヘテロ二量体化するが、コイルドコイルドメインはホモ二量体化する。

高感受性ＣＡＲは、ＣＡＲの価数を増加させることによって提供され得る。特に、相互作用して２を超えるコイルドコイルドメイン、したがって２を超えるＣＡＲを含む多量体を形成することができるコイルドコイルスペーサードメインの使用は、存在するＩＴＡＭの数およびオリゴマーＣＡＲ複合体の結合活性を増加させるため、低密度リガンドを発現する標的に対する感受性を増加させる。

したがって、本明細書中には、少なくとも３つのＣＡＲ形成ポリペプチドの多量体化を可能にするコイルドコイルスペーサードメインを含むＣＡＲ形成ポリペプチドが提供される。言い換えれば、ＣＡＲは、コイルドコイルドメインの三量体、四量体、五量体、六量体または七量体を形成することができるコイルドコイルドメインを含む。

２を超えるコイルドコイルドメインを含む多量体を形成することができるコイルドコイルドメインの例としては、限定されないが、軟骨－オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ－２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサーまたはアポリポタンパク質Ｅ（上記の配列番号７０～８２を参照されたい）によるものが挙げられる。

コイルドコイルドメインは、ＣＯＭＰコイルドコイルドメインであり得る。

ＣＯＭＰは、自然界で最も安定なタンパク質複合体の１つであり（０℃～１００℃および広範囲のｐＨで安定）、４～６Ｍグアニジン塩酸塩でのみ変性することができる。ＣＯＭＰコイルドコイルドメインは、五量体を形成することができる。ＣＯＭＰはまた、細胞外空間で天然に発現される内因的に発現されるタンパク質である。これは、合成スペーサーと比較して免疫原性のリスクを低下させる。さらに、ＣＯＭＰコイルドコイルモチーフの結晶構造が解明されており、これによりスペーサー長の正確な推定が得られる（図８）。ＣＯＭＰ構造は、長さが約５．６ｎｍである（約８．１ｎｍであるヒトＩｇＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ＣＨ３ドメインと比較して）。

コイルドコイルドメインは、配列番号８３として示されている配列またはその断片からなるか、またはそれらを含み得る。
配列番号８３
DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG

図８に示すように、ＣＯＭＰコイルドコイルドメインをＮ末端で切断し、表面発現を保持することが可能である。したがって、コイルドコイルドメインは、Ｎ末端が切断された配列番号８３の切断型を含むかまたはそれからなり得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号８３の５個のＣ末端アミノ酸、すなわち配列ＣＤＡＣＧを含み得る。切断型ＣＯＭＰは、５～４４個のアミノ酸、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個のアミノ酸を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号８３のＣ末端に対応し得る。例えば、２０個のアミノ酸を含む切断型ＣＯＭＰは、配列QQVREITFLKNTVMECDACG（配列番号８４）を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体化に関与するシステイン残基（単数または複数）を保持し得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体を形成する能力を保持し得る。

ＨＩＶに由来するｇｐ４１等の六量体を形成する様々なコイルドコイルドメイン、およびＮ．Ｚａｃｃａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，（７）９３５－９４１）によって記載される人工タンパク質設計六量体コイルドコイルが公知である。ＧＣＮ４－ｐ１ロイシンジッパーの変異型は、七量体コイルドコイル構造を形成する（Ｊ．Ｌｉｕ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＰＮＡＳ（１０３）１５４５７－１５４６２）。

コイルドコイルドメインは、バリアント配列がコイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持する限り、上述のコイルコイルドメインの１つのバリアントを含み得る。例えば、コイルドコイルドメインは、バリアント配列がコイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持する限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号８３または７０～８２として示される配列のバリアントを含み得る。

２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で自由に入手可能なＢＬＡＳＴ等のプログラムによって容易に決定することができる。

コイルドコイルドメインを含むＣＡＲは、国際公開第２０１６／１５１３１５号に更に詳細に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるＣＡＲの配列である。

膜貫通ドメインは、膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを、本発明の膜貫通部分を供給するために使用することができる。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および全長は、当業者によって、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を使用して決定することができる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜にまたがるのに十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であることを考えると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用することができる（米国特許第７０５２９０６号Ｂ１は合成膜貫通成分を記載している）。

膜貫通ドメインは、良好な受容体安定性を与えるＣＤ２８に由来し得る。

膜貫通ドメインは、ヒトＴｙｒｐ－１に由来し得る。ｔｙｒｐ－１膜貫通配列を配列番号８５として示す。
配列番号８５
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI

活性化エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原認識後、受容体クラスター、ネイティブＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから排除され、シグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ゼータの成分である。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３－ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされることがある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ゼータと共に使用することができ、または３つ全てを一緒に使用することができる。

本発明の細胞は、それぞれエンドドメインを有する２つのＣＡＲを含む。

第１のＣＡＲのエンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えばＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＯＸ－４０または４－１ＢＢ等のＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み得る。

第２のＣＡＲのエンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えばＣＤ３ζ由来のエンドドメイン、および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８由来のエンドドメインを含み得る。

この配置では、共刺激ドメインおよび生存シグナル生成ドメインは、ＯＲゲート内の２つ（またはそれを超える）のＣＡＲ間で「共有」される。例えば、ＯＲゲートが２つのＣＡＲ、ＣＡＲ ＡおよびＣＡＲ Ｂを有する場合、ＣＡＲ Ａは共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８エンドドメイン）を含み得、ＣＡＲ ＢはＯＸ－４０または４－１ＢＢ等のＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み得る。

ＩＴＡＭモチーフを含有するエンドドメインは、本発明において活性化エンドドメインとして作用することができる。いくつかのタンパク質が、１またはそれを超えるＩＴＡＭモチーフを有するエンドドメインを含有することが知られている。そのようなタンパク質の例としては、いくつか例を挙げると、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖およびＣＤ３デルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンとして容易に認識され得、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉを与える。必ずしもそうとは限らないが、典型的には、これらのモチーフのうちの２つは、分子（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉ）の尾部において６～８アミノ酸によって分離されている。したがって、当業者は、活性化シグナルを伝達するための１またはそれを超えるＩＴＡＭを含有する既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純であり、複雑な二次構造が必要とされないことを考えると、当業者は、活性化シグナルを伝達する人工ＩＴＡＭを含有するポリペプチド（合成シグナル伝達分子に関する国際公開第２０００／０６３３７２号を参照されたい）を設計することができる。

活性化エンドドメインを有するＣＡＲの膜貫通および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）は、配列番号８６、８７もしくは８８として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。

バリアント配列は、配列が有効な膜貫通ドメインおよび有効な細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを提供する限り、配列番号８６、８７または８８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。

「スプリット」またはゲートエンドドメイン
本発明は、共刺激／生存シグナルドメインが２つのＣＡＲ間で「スプリット」されているＯＲゲートを提供する。

これに関して、本発明は、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲとを細胞表面に共発現する細胞を提供し、各ＣＡＲは細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインを含む。

第１のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８エンドドメイン）を含まない。第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインを含み、生存シグナルを伝達するドメイン（ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメイン等）を含まない。

共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号８９として示される配列を有し得る。
配列番号８９（ＣＤ２８共刺激エンドドメイン）
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

本発明のＣＡＲは、バリアント配列が、抗原認識時にＴ細胞を共刺激する能力を保持する、すなわちＴ細胞にシグナル２を提供する限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号８９として示される配列のバリアントを含み得る。

ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインは、ＯＸ４０または４－１ＢＢエンドドメインであり得る。ＯＸ４０エンドドメインは、配列番号９０として示される配列を有し得る。４－１ＢＢエンドドメインは、配列番号９１として示される配列を有し得る。

本発明のＣＡＲは、バリアント配列が、抗原認識時に生存シグナルをＴ細胞に伝達する能力を保持する限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号９０または９１として示される配列のバリアントを含み得る。

第１および／または第２のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＣＤ３ゼータドメイン等のＩＴＡＭ含有ドメインを含み得る。ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号９２として示される配列を有し得る。

本発明のＣＡＲは、バリアント配列が、抗原認識時にＴ細胞シグナル伝達を誘導する能力を保持する、すなわちＴ細胞にシグナル１を提供する限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号９２として示される配列の変異体を含み得る。

第１のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーであり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
ＴＮＦはＴＮＦ受容体エンドドメインであり、
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有し得る。
「ＴＮＦ」は、ＯＸ４０または４－１ＢＢエンドドメイン等のＴＮＦ受容体エンドドメインであり得る。
「ＩＴＡＭ」は、ＣＤ３ゼータエンドドメインであり得る。

第２のＣＡＲは、以下の構造：
ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
（式中、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーであり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
ｃｏｓｔｉｍは共刺激ドメインであり、
ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有し得る。
「Ｃｏｓｔｉｍ」は、ＣＤ２８共刺激ドメインであり得る。

「スプリット」エンドドメインを有する第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方をコードする核酸配列、および１つは第１のＣＡＲをコードし、１つは上記で定義されるスプリットエンドドメインを含む第２のＣＡＲをコードする２つの核酸を含むキットも提供される。

共発現部位
本発明の第２の態様は、第１および第２のＣＡＲをコードする核酸に関する。

核酸は、切断部位によって連結された２つのＣＡＲ分子を含むポリペプチドを産生し得る。切断部位は自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが産生されると、いかなる外部切断活性も必要とせずに、第１および第２のＣＡＲに直ちに切断される。

口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチドおよび類似の配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１），８２，１０２７－１０４１）、例えば配列番号１２として示される配列を有するＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａ様配列のような類似の配列を含む、様々な自己切断部位が公知である。
配列番号９３
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.

これらの配列は、シス作用性加水分解酵素要素（ＣＨＹＳＥＬ）配列とも呼ばれる場合がある。

共発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。

核酸コンストラクトは、複数のポリペプチドの産生をもたらす複数の共発現部位を含有し得る。例えば、コンストラクトは、同じであっても異なっていてもよい複数の２Ａ様配列を含み得る。

ＣＡＲの活性の調節
ＩＴＡＭリン酸化の増強
ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化（図１０ａに概略的に図示する）の間、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識は、ＣＤ３ζ上の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらす。リン酸化ＩＴＡＭは、ＺＡＰ７０ ＳＨ２ドメインによって認識され、Ｔ細胞活性化をもたらす。

Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲによる抗原認識を下流活性化シグナルに変換するために速度論的分離を使用する。簡潔には、基底状態では、Ｔ細胞膜上のシグナル伝達成分は動的恒常性にあり、それによって脱リン酸化ＩＴＡＭがリン酸化ＩＴＡＭよりも優先される。これは、ｌｃｋ等の膜結合型キナーゼよりも膜貫通型ＣＤ４５／ＣＤ１４８ホスファターゼの活性が高いためである。Ｔ細胞が、同族抗原のＴ細胞受容体（またはＣＡＲ）認識を介して標的細胞に関与すると、緊密な免疫学的シナプスが形成される。Ｔ細胞膜と標的膜とのこの密接な並置は、シナプスに適合できないそれらの大きなエクトドメインのためにＣＤ４５／ＣＤ１４８を除外する。ホスファターゼの非存在下でのシナプスにおける高濃度のＴ細胞受容体関連ＩＴＡＭおよびキナーゼの分離は、リン酸化ＩＴＡＭが優先される状態をもたらす。ＺＡＰ７０は、リン酸化ＩＴＡＭの閾値を認識し、Ｔ細胞活性化シグナルを伝播する。

このプロセスは、ＣＡＲ媒介Ｔ細胞活性化の間、本質的に同じである。活性化ＣＡＲは、通常、シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζのエンドドメインを含むため、その細胞内シグナル伝達ドメインに１またはそれを超えるＩＴＡＭ（単数または複数）を含む。ＣＡＲによる抗原認識は、ＣＡＲシグナル伝達ドメインにおけるＩＴＡＭ（単数または複数）のリン酸化をもたらし、Ｔ細胞活性化を引き起こす。

図１０ｂに概略的に示されるように、ＰＤ１等の阻害性免疫受容体は、リン酸化ＩＴＡＭの脱リン酸化を引き起こす。ＰＤ１は、ＰＴＰＮ６（ＳＨＰ－１）およびＰＴＰＮ１１（ＳＨＰ－２）等の分子のＳＨ２ドメインによって認識されるＩＴＩＭをそのエンドドメインに有する。認識されると、ＰＴＰＮ６が膜近傍領域に動員され、そのホスファターゼドメインはその後、免疫活性化を阻害するＩＴＡＭドメインを脱リン酸化する。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性の調節
チェックポイント阻害
ＣＡＲ媒介Ｔ細胞活性化は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４またはＢＴＬＡ１等の阻害性免疫受容体によって媒介される（上述し、図１０ｂに概略的に例示される）。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１
癌疾患状態では、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１とＴ細胞上のＰＤ－１との相互作用は、上記のようにＴ細胞活性化を減少させ、したがって腫瘍細胞を攻撃するその努力において免疫系を妨害する。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１受容体との相互作用を遮断する阻害剤の使用は、このようにして癌が免疫系を回避するのを防ぐことができる。いくつかのＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害剤は、他の癌タイプの中でも、進行した黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、膀胱癌およびホジキンリンパ腫において使用するために、臨床において試験されている。ＰＤ１阻害剤ニボルマブおよびペンブロリズマブ、ならびにＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブを含むいくつかのそのような阻害剤が現在承認されている。

ＣＴＬＡ４
ＣＴＬＡ４は、活性化Ｔ細胞によって発現され、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と相同であり、両方の分子は、抗原提示細胞上のそれぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも大きな親和性および結合活性でＣＤ８０およびＣＤ８６に結合し、したがってそのリガンドについてＣＤ２８を打ち負かす（ｏｕｔｃｏｍｐｅｔｅ）ことを可能にする。ＣＴＬＡ４は阻害シグナルをＴ細胞に伝達し、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。

ＣＴＬＡ４に対するアンタゴニスト抗体には、イピリムマブおよびトレメリムマブが含まれる。

ＬＡＧ－３
ＬＡＧ－３およびＣＤ２２３としても知られるリンパ球活性化遺伝子３は、Ｔ細胞機能に対する多様な生物学的効果を有する免疫チェックポイント受容体である。

ＬＡＧ３に対する抗体としては、現在第１相臨床試験中のレラトリマブ（ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）および前臨床開発中の他の多くの抗体が挙げられる。ＬＡＧ－３は、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１よりも優れたチェックポイント阻害剤標的となり得るが、これは、これらの２つのチェックポイントに対する抗体はエフェクターＴ細胞のみを活性化し、Ｔｒｅｇ活性を阻害しないのに対して、アンタゴニストＬＡＧ－３抗体は、（ＬＡＧ－３阻害シグナルを事前活性化ＬＡＧ－３＋細胞にダウンレギュレートすることによって）Ｔエフェクター細胞を活性化することもでき、また誘導された（すなわち抗原特異的）Ｔｒｅｇ抑制活性を阻害することもできるからである。ＬＡＧ－３抗体およびＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１抗体を含む併用療法も進行中である。

ドミナントネガティブＳＨＰ
国際公開第２０１６／１９３６９６号は、リン酸化：Ｔ細胞での脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）：標的細胞シナプスのバランスを調節することができる様々な異なる種類のタンパク質を記載している。例えば、国際公開第２０１６／１９３６９６号は、一方または両方のＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠く切断型のＳＨＰ－１またはＳＨＰ－２を記載する。ＣＡＲ－Ｔ細胞において発現される場合、これらの分子は、野生型ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のドミナントネガティブ型として作用し、リン酸化ＩＴＩＭへの結合について内因性分子と競合する。

野生型ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のこれらのドミナントネガティブ型は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４またはＢＴＬＡ１等の阻害性免疫受容体によって媒介される阻害を遮断または低減し、ＩＴＡＭのリン酸化に有利なＴ細胞：標的細胞シナプスでのリン酸化：脱リン酸化（ｄｅｐｈｏｓｐｏｒｙｌａｔｉｏｎ）のバランスを取って、Ｔ細胞活性化をもたらす。

本発明の細胞は、リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）に結合するがホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む切断型タンパク質を発現し得る。切断型タンパク質は、ＳＨＰ－１ ＳＨ２ドメイン（単数または複数）の一方または両方を含み得るが、ＳＨＰ－１ホスファターゼドメインを欠いている。或いは、切断型タンパク質は、ＳＨＰ－２ ＳＨ２ドメイン（単数または複数）の一方または両方を含み得るが、ＳＨＰ－２ホスファターゼドメインを欠いている。

ＳＨＰ－１
Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１（ＳＨＰ－１）は、プロテインチロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６としても知られている。

ＳＨＰ－１のＮ末端領域は、ＳＨＰ－１およびその基質の相互作用を媒介する２つのタンデムＳＨ２ドメインを含有する。Ｃ末端領域は、チロシン－タンパク質ホスファターゼドメインを含有する。

ＳＨＰ－１は、いくつかの阻害性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合し、そこからシグナルを伝播することができる。そのような受容体の例としては、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３が挙げられるが、これらに限定されない。

ヒトＳＨＰ－１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９３５０を有する。

切断型ＳＨＰ－１は、以下に配列番号９４として示されるＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含み得るか、またはそれからなり得る。

ＳＨＰ－１は、残基４～１００および１１０～２１３において、配列のＮ末端に２つのＳＨ２ドメインを有する。切断型ＳＨＰ－１は、配列番号９５および９６として示されている配列の一方または両方を含み得る。

切断型ＳＨＰ－１は、バリアント配列が必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列である限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号９４、９５または９６のバリアントを含み得る。言い換えれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－１の動員を可能にするＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の少なくとも１つの細胞質尾部のリン酸化チロシン残基に結合することができなければならない。

ＳＨＰ－２
ＳＨＰ－２は、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ－１ＤおよびＰＴＰ－２Ｃとしても知られており、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６と同様に、ＳＨＰ－２は、そのＮ末端における２つのタンデムＳＨ２ドメインと、それに続くタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインとからなるドメイン構造を有する。不活性状態では、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインに結合し、活性部位への潜在的な基質のアクセスを阻止する。したがって、ＳＨＰ－２は自己阻害される。標的ホスホ－チロシル残基に結合すると、Ｎ末端ＳＨ２ドメインがＰＴＰドメインから放出され、自己阻害を軽減することによって酵素を触媒的に活性化する。

ヒトＳＨＰ－２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５２３５－１を有する。

切断型ＳＨＰ－２は、以下に配列番号９９として示されるＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含み得るか、またはそれからなり得る。ＳＨＰ－１は、残基６～１０２および１１２～２１６において、配列のＮ末端に２つのＳＨ２ドメインを有する。切断型ＳＨＰ－２は、配列番号９７および９８として示される配列の一方または両方を含み得る。

切断型ＳＨＰ－２は、変異型配列が必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列である限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号９７、９８または９９のバリアントを含み得る。言い換えれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－２の動員を可能にするＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の少なくとも１つの細胞質尾部のリン酸化チロシン残基に結合することができなければならない。

ＴＧＦβシグナル伝達の調節
操作された細胞は、養子免疫療法を制限する厳しい微小環境に直面する。腫瘍微小環境内の主な阻害機構の１つは、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）である。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、様々な細胞プロセスを制御する調節シグナル伝達において極めて重要な役割を果たす。ＴＧＦβはまた、Ｔ細胞の恒常性および細胞機能の制御において中心的な役割を果たす。特に、ＴＧＦβシグナル伝達は、増殖および活性化が低下したＴ細胞の免疫抑制状態に関連する。ＴＧＦβの発現は、腫瘍の免疫抑制性微小環境に関連する。

様々な癌性腫瘍細胞がＴＧＦβを直接産生することが知られている。癌性細胞によるＴＧＦβ産生に加えて、ＴＧＦβは、腫瘍関連Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、上皮細胞および間質細胞等の腫瘍部位に存在する多種多様な非癌性細胞によって産生され得る。

トランスフォーミング成長因子ベータ受容体は、セリン／トレオニンキナーゼ受容体のスーパーファミリーである。これらの受容体は、成長因子およびサイトカインシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーに結合する。５つのＩＩ型受容体（活性化受容体である）および７つのＩ型受容体（シグナル伝達増殖受容体である）が存在する。

補助共受容体（ＩＩＩ型受容体としても知られる）も存在する。リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーの各サブファミリーは、Ｉ型およびＩＩ型受容体に結合する。

３つの形質転換成長因子は多くの活性を有する。ＴＧＦβ１および２は癌に関与しており、癌幹細胞を刺激し、線維化／線維形成反応を増加させ、腫瘍の免疫認識を抑制し得る。

ＴＧＦβ１、２および３は、受容体ＴβＲＩＩへの結合を介してシグナル伝達し、次いでＴβＲＩに会合し、ＴＧＦβ２の場合はＴβＲＩＩＩにも会合する。これは、ＴβＲＩを介したＳＭＡＤを介したその後のシグナル伝達をもたらす。

ＴＧＦβは、典型的には、ｐｒｅ－ｐｒｏ形態で分泌される。「ｐｒｅ」は、小胞体（ＥＲ）に入ると切断されるＮ末端シグナルペプチドである。「ｐｒｏ」はＥＲで切断されるが、共有結合したままであり、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）と呼ばれるＴＧＦβの周りにケージを形成する。ケージは、とりわけトロンビンおよびメタロプロテアーゼを含む様々なプロテアーゼに応答して開く。Ｃ末端領域は、タンパク質分解的切断によるｐｒｏ領域からのその放出後に成熟ＴＧＦβ分子になる。成熟型ＴＧＦβタンパク質は二量体化して活性ホモ二量体を生成する。

ＴＧＦβホモ二量体は、ＴＧＦβ遺伝子産物のＮ末端領域から誘導されるＬＡＰと相互作用し、潜在型小複合体（ＳＬＣ）と呼ばれる複合体を形成する。この複合体は、別のタンパク質、すなわち、潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）と呼ばれる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質に結合するまで細胞内に留まり、これらは一緒になって、潜在型大複合体（ＬＬＣ）と呼ばれる複合体を形成する。ＬＬＣはＥＣＭに分泌される。ＴＧＦβは、メタロプロテアーゼおよびトロンビンを含むいくつかのクラスのプロテアーゼによって、この複合体から生物学的に活性な形態に放出される。

ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体
活性型ＴＧＦβ受容体（ＴβＲ）は、２つのＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴβＲＩ）と２つのＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）とから構成されるヘテロ四量体である。ＴＧＦβ１は潜在型で分泌され、複数の機構によって活性化される。活性化されると、ＴβＲＩをリン酸化して活性化するＴβＲＩＩ ＴβＲＩと複合体を形成する。

本発明の細胞は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体を発現する。ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体は、キナーゼドメインを欠いていてもよい。

例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦ受容体ＩＩのモノマー型である配列番号１００として示される配列を含み得るか、またはそれからなり得る。

ドミナントネガティブＴＧＦ－βＲＩＩ（ｄｎＴＧＦ－βＲＩＩ）は、攻撃的なヒト前立腺癌マウスモデルにおいて、ＰＳＭＡ標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、疲弊に対する耐性、長期のｉｎ ｖｉｖｏ持続性、および腫瘍根絶の誘導を増強することが報告されている（Ｋｌｏｓｓら（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２６：１８５５－１８６６）。

細胞
本発明は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを細胞表面に共発現する細胞であって、一方のＣＡＲがＣＤ１９に結合し、他方のＣＡＲがＣＤ２２に結合する細胞に関する。

細胞は、免疫学的細胞等、細胞表面にＣＡＲを発現することができる任意の真核細胞であり得る。

特に、細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の免疫エフェクター細胞であり得る。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種である。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）等の他のリンパ球と区別することができる。以下に要約するように、様々なタイプのＴ細胞が存在する。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において他の白血球を支援する。ＴＨ細胞は、その表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されると活性化される。これらの細胞は、異なる種類の免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができる。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬはその表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシンおよび他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態に不活性化され得、これにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎等の自己免疫疾患が予防される。

メモリーＴ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露されるとすぐに多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、したがって免疫系に過去の感染に対する「記憶」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって極めて重要である。それらの主な役割は、免疫反応の終わりに向かってＴ細胞媒介性免疫を遮断し、胸腺における負の選択の過程を脱した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、すなわち天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は、胸腺で生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発達を妨げ、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こす可能性がある。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。

ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞の両方の特性を共有するＴ細胞の異種グループである。これらの細胞の多くは、自己および外来の脂質および糖脂質に結合する抗原提示分子である非多型ＣＤ１ｄ分子を認識する。

本発明のＴ細胞は、上記のＴ細胞型のいずれか、特にＣＴＬであり得る。

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の一種である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的な様式でウイルス感染細胞からの自然シグナルに対する迅速な応答を提供する

ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通リンパ球前駆体から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後、循環に入ることが知られている。

本発明のＣＡＲ細胞は、上記の細胞型のいずれかであり得る。

ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞等のＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の状況で、または無関係のドナー（第三者）からの末梢血のいずれかからｅｘ ｖｉｖｏで作製され得る。

本発明はまた、本発明によるＣＡＲ発現Ｔ細胞および／またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞を含む細胞組成物を提供する。細胞組成物は、血液試料に本発明による核酸をｅｘ ｖｉｖｏで形質導入することによって作製され得る。

或いは、ＣＡＲ発現細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の関連する細胞型（例えば、Ｔ細胞等）へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来する場合がある。或いは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用することができるＴ細胞株等の不死化細胞株を使用することができる。

これらの実施形態の全てにおいて、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによってＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作製される。

本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、対象からの由来のｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体で処置することによって、活性化および／または拡大され得る。

本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は、
（ｉ）対象または上に列挙した他の供給源からのＴ細胞含有試料の単離；ならびに
（ｉｉ）第１および第２のＣＡＲをコードする１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）によるＴ細胞の形質導入またはトランスフェクションによって作製され得る。

次いで、Ｔ細胞は、精製によって、例えば、第１および第２のＣＡＲの共発現に基づいて選択され得る。

核酸配列
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で定義される第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする１またはそれを超える核酸配列（単数または複数）に関する。

核酸配列は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列であり得る。

核酸配列は、ＣＤ１９に結合する１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＣＤ２２に結合する別のＣＡＲをコードし得る。

核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）を有することができ、
その核酸配列は、Ｔ細胞において発現される場合、第１および第２のＣＡＲが細胞表面において共発現されるように、切断部位において切断されるポリペプチドをコードする。

或いは、核酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＡｂＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１
（式中、成分ＡｇＢ１、スペーサー１、ＴＭ１、ｃｏｅｘｐｒ、ＡｂＢ２、スペーサー２、およびＴＭ２は上記で定義したとおりである）。

相同組換えを回避するために、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替コドンを使用してもよい。

遺伝暗号の縮重のために、同じアミノ酸配列をコードする代替コドンを使用することが可能である。例えば、コドン「ｃｃｇ」および「ｃｃａ」は両方ともアミノ酸プロリンをコードするため、「ｃｃｇを使用すると、翻訳されたタンパク質の配列のこの位置のアミノ酸に影響を及ぼすことなく、「ｃｃａ」と交換され得る。

各アミノ酸をコードするために使用され得る代替ＲＮＡコドンを表４に要約する。

特に同じまたは類似のスペーサーが第１および第２のＣＡＲにおいて使用される場合、第１のＣＡＲのスペーサーおよび第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列の部分において代替コドンが使用され得る。図５は、スペーサーＨＣＨ２ＣＨ３－ヒンジをコードする２つの配列を示し、そのうちの１つでは、代替コドンが使用されている。

特に同じまたは類似の膜貫通ドメインが第１および第２のＣＡＲにおいて使用される場合、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインおよび第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列の部分において代替コドンが使用され得る。図５は、ＣＤ２８膜貫通ドメインをコードする２つの配列を示し、そのうちの１つにおいて、代替コドンが使用されている。

第１のＣＡＲのエンドドメインの全部または一部、および第２のＣＡＲのエンドドメインの全部または一部をコードする核酸配列の部分には、代替コドンが使用され得る。代替コドンが、ＣＤ３ゼータエンドドメインにおいて使用される場合がある。図５は、ＣＤ３ゼータエンドドメインをコードする２つの配列を示し、そのうちの１つにおいて、代替コドンが使用されている。

代替コドンが、１またはそれを超える共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８エンドドメイン等）において使用される場合がある。

代替コドンが、生存シグナルを伝達する１またはそれを超えるドメイン（例えば、ＯＸ４０エンドドメインおよび４１ＢＢエンドドメイン等）において使用される場合がある。

代替コドンは、ＣＤ３ゼータエンドドメインをコードする核酸配列の部分、および／または１またはそれを超える共刺激ドメイン（単数または複数）をコードする核酸配列の部分、および／または生存シグナルを伝達する１またはそれを超えるドメイン（単数または複数）をコードする核酸配列の部分において使用され得る。

ベクター
本発明はまた、１またはそれを超えるＣＡＲコード核酸配列（単数または複数）を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、第１および第２のＣＡＲを発現するように、核酸配列（単数または複数）を宿主細胞に導入するために使用され得る。

ベクターは、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、Ｔ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。

医薬組成物
本発明はまた、本発明の第１の態様によるＴ細胞またはＮＫ細胞等の複数のＣＡＲ発現細胞を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を更に含んでもよい。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超える更なる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。

処置の方法
本発明の細胞は、Ｂ細胞リンパ腫細胞等の癌細胞を死滅させることができる。Ｔ細胞等のＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）からの造血幹細胞移植の状況で、または無関係のドナー（第三者）からの末梢血のいずれかからｅｘ ｖｉｖｏで作製され得る。或いは、ＣＡＲ Ｔ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化に由来し得る。これらの例では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによってＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。

本発明の細胞は、癌細胞等の標的細胞を死滅させることができる場合がある。標的細胞は、ＣＤ１９またはＣＤ２２の発現によって認識可能である。

Ｃａｍｐａｎａら（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３，５９－７５（２０００））から得た。ｃＩｇμ－細胞質免疫グロブリン重鎖；ｓＩｇμ－表面免疫グロブリン重鎖。

異なるタイプのＢ細胞白血病における一般的に研究されているリンパ系抗原の発現は、Ｂ細胞の個体発生の発現と密接に似ている（図２を参照されたい）。

本発明のＴ細胞は、癌、特にＢ細胞悪性腫瘍を処置するために使用され得る。

ＣＤ１９またはＣＤ２２を発現する癌の例は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫、ならびにＢ細胞白血病である。

例えば、Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）または粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫（慢性リンパ性白血病と重複する）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、原発縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫．、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンストロームマクログロブリン血症として現れることがある）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または原発性中枢神経系リンパ腫であり得る。

Ｂ細胞白血病は、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、前駆Ｂリンパ芽球性白血病または有毛細胞白血病であり得る。

Ｂ細胞白血病は、急性リンパ芽球性白血病であり得る。

本発明のＴ細胞による処置は、標準的なアプローチでしばしば起こる腫瘍細胞のエスケープまたは放出を防ぐのに役立ち得る。

ここで、本発明を実施例によって更に説明するが、これらは当業者が本発明を実施することを支援するのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。

実施例１－ＣＤ１９／ＣＤ２２論理「ＯＲ」ゲートコンストラクトおよび標的細胞の調製
ＣＤ１９ ＣＡＲがＴＮＦＲファミリーエンドドメイン（４－１ＢＢ）を保有し、ＣＤ２２ ＣＡＲが共刺激エンドドメイン（ＣＤ２８）を保有するＣＤ１９「ＯＲ」ＣＤ２２ゲートを構築した。各ＣＡＲの構造を図６に示す。

いくつかのＣＤ１９／ＣＤ２２ ＯＲゲートコンストラクトを図１１に示すように調製し、表６に要約した。第１のコンストラクトは、国際公開第２０１６／１０２９６５号（コンストラクト１、図１１）に記載されているＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲを含む。第２のコンストラクトは、図６に示されるようにＣＤ１９ ＣＡＲおよびＣＤ２２ ＣＡＲを含む（コンストラクト２、図１１）。ドミナントネガティブＳＨＰ２モジュール（ｄＳＨＰ２）およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩモジュール（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）を更に含む３つの更なるコンストラクトを調製した（コンストラクト３、４、および５、図１１）。共発現は、２Ａペプチドによって分離された２つのＣＡＲをインフレームでクローニングすることによって達成された。

実施例２－ＣＡＲエンドドメインの比較
二重標的化ＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞のための最適なエンドドメインを特定するために、コンストラクト１、３、４または５のうちの１つを発現するＴ細胞がＣＤ１９＋またはＣＤ２２＋ＳｕｐＴ１細胞を死滅させる能力を比較した。さらに、ＣＤ１９＋またはＣＤ２２＋ＳｕｐＴ１細胞の存在下で、コンストラクト１、３、４、または５の１つを発現するＴ細胞の増殖を調べた。

コンストラクトの１つを発現する細胞を、標的細胞と１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比（５０，０００個の標的細胞）で７２時間共培養した。

結果を図１２に示す。全てのコンストラクトがＣＤ１９＋標的細胞を死滅させることができたが、これらの結果は、コンストラクト５が、コンストラクト１、３および４と比較してＣＤ２２＋標的細胞の改善された死滅を示すことを実証している。コンストラクト５を発現する細胞の増殖も改善された。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γのレベルは、全てのコンストラクトについて同様であった。

実施例３－更なるｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
コンストラクト１、３、または５のいずれかを発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで以下の標的細胞に対して試験した：
・Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９／ＣＤ２２陽性癌細胞株）；
・ＣＤ１９ノックアウトＲａｊｉ細胞；
・ＳｕｐＴ１高密度ＣＤ１９；
・ＳｕｐＴ１低密度ＣＤ１９；
・ＳｕｐＴ１高密度ＣＤ２２；および
・ＳｕｐＴ１低密度ＣＤ２２。

コンストラクトの１つを発現する形質導入ＰＢＭＣを、１：１および１：１０のエフェクター：標的細胞比の両方で標的細胞と７２時間共培養した。

結果を図１３に示す。コンストラクト５は、低密度ＣＤ２２標的細胞の改善された死滅を示した。サイトカイン産生レベルは類似していた。

実施例４－モジュール試験
ｄｎＴＧＦβＲＩＩ
コンストラクト５を形質導入した細胞をＴＧＦ－βの存在下で培養した場合のｄｎＴＧＦβＲＩＩモジュールの効果について試験した。標的細胞との共培養物を、１：８のＥ：Ｔ比でｒｈＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でセットアップした。読み出しを７日目に行った。さらに、エフェクター細胞を増殖追跡のためにＣＴＶ標識した。

結果を図１４に示す。これらのデータは、ｄｎＴＧＦβＲＩＩモジュールの存在がＴＧＦ－βの存在下で標的細胞の死滅を改善することを実証している。さらに、ｄｎＴＧＦβＲＩＩモジュールは、ＴＧＦβの存在下での増殖の阻害を防止する。

ｄＳＨＰ２
コンストラクト５を形質導入した細胞を、ｄＳＨＰ２モジュールの存在の影響について試験した。ＰＢＭＣにコンストラクト５およびＰＤ１の両方を同時形質導入し、次いでＰＤＬ１を発現する細胞の存在下で培養した。ｄＳＨＰ２が有効である場合、その存在はＰＤ１／ＰＤＬ１を介したシグナル伝達を妨げる。

ＰＤＬ１ありおよびなしの両方のＣＤ１９＋標的細胞との共培養を、１：１のＥ：Ｔ比で設定した。読み出しを６日目に行った。

結果を図１５に示す。

これらのデータは、ｄＳＨＰ２の存在がＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用を克服することを実証している。

実施例５－再刺激アッセイ
再刺激アッセイを使用して、コンストラクト１、２、および５の性能を調査した。

簡潔には、コンストラクト１、コンストラクト２またはコンストラクト５のいずれかを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１細胞またはＣＤ２２＋ＳｕｐＴ１細胞のいずれかでチャレンジした。プレートを新鮮な標的細胞および新鮮な培地で３～４日ごとに合計９回再刺激した。結果を図１６に示す。

ＣＡＲ－Ｔ細胞を発現するコンストラクト２およびコンストラクト５の両方が、再刺激時に細胞集団のより大きな割合であり、標的殺傷の増加を示した。特に、コンストラクト２およびコンストラクト５を発現する細胞は、ＣＤ２２陽性標的細胞を使用した場合、細胞集団のより大きな割合であった。したがって、これらのバリアントは、コンストラクト１と比較してＣＤ２２陽性細胞の死滅の増強を示す。

実施例６－ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
コンストラクト３および５で形質導入されたＴ細胞が、ＮＧＳマウスのＮａｌｍ６腫瘍モデルにおいて腫瘍細胞を除去する能力を調べた。全ての場合において、マウスに、－６日目に１×１０^６個の標的細胞、ＮＴ細胞またはＰＢＳを注射した。

最初の工程として、コンストラクト１を発現する細胞の準最適な用量が、コンストラクト５の投与の開始点として作用することが確認された。０．３×１０^６細胞、１×１０^６細胞、５×１０^６細胞および１０×１０^６細胞の用量を調べた。結果を図１７に示す。０．３×１０^６用量は、ＰＢＳ対照コホートと同様の流動を示し、非効率的な用量を示した。クリアランスは１０×１０^６用量で達成されたが、移植片対宿主病（ＧｖＨ）の疑いのためマウスを１３日目に屠殺した。５×１０^６コホートは標的細胞を排除したが、１×１０^６コホートは総フラックスを制御することができなかった。この調査に続いて、コンストラクト３および５を試験するために２．５×１０^６細胞の用量を選択した。

したがって、コンストラクト１、３、または５のいずれかを発現する２．５×１０^６個の細胞をマウスに注射した。総フラックスを図１８に示す。コンストラクト１を発現する細胞は、２．５×１０^６細胞用量で標的細胞増殖を制御することができない。コンストラクト３および５は両方とも、ｉｎ ｖｉｖｏで改善された機能を示す。特に、コンストラクト５は、全てのマウスにおいて腫瘍細胞成長を２３日目まで制御することができた。フラックスの差は、コンストラクト１と比較して統計的に有意である。

さらに、コンストラクト１、３、または５を、ＣＤ１９発現がノックアウトされたＮａｌｍ６マウス（ＣＤ１９ＫＯ）で試験した。２．５×１０^６細胞用量を使用して、上記の野生型（ＷＴ）Ｎａｌｍ ６マウスと同じ条件を使用した。

総フラックスを図１９に示す。コンストラクト１を発現する細胞は、２．５×１０^６細胞用量で標的細胞増殖を制御することができない。コンストラクト３および５は両方とも改善された機能を示す。特に、コンストラクト５は、１匹を除く全てのマウスにおいて腫瘍細胞成長を２７日目まで制御することができた。これらのデータは、コンストラクト５を発現する細胞がＣＤ１９の非存在下でさえ腫瘍負荷を制御することができることを確認する。

上記の明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学、細胞生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (31)

1. 細胞であって、
   （ｉ）ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む、前記細胞の表面の第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
   （ｉｉ）ＣＤ２２に結合する抗原結合ドメインを含む、前記細胞の表面の第２のＣＡＲと、
   （ｉｉｉ）ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）と、
   （ｉｖ）ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）とを共発現する、細胞。
2. 各ＣＡＲが細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記第１のＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含み、前記第２のＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激エンドドメインを含む、請求項１に記載の細胞。
3. 前記共刺激ドメインがＣＤ２８共刺激エンドドメインである、請求項２に記載の細胞。
4. 前記ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインがＯＸ－４０または４－１ＢＢエンドドメインである、請求項２または３に記載の細胞。
5. 前記第１および第２のＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＩＴＡＭ含有ドメインも含む、請求項２、３または４のいずれかに記載の細胞。
6. 各ＣＡＲが、
   （ｉ）抗原結合ドメインと、
   （ｉｉ）スペーサーと、
   （ｉｉｉ）膜貫通ドメインとを含み、
   前記第１のＣＡＲの前記スペーサーが、前記第２のＣＡＲの前記スペーサーとは異なる、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞。
7. 前記第２のＣＡＲの前記スペーサーが、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）コイルドコイルドメインを含む、請求項６に記載の細胞。
8. 前記第１のＣＡＲが、
   ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
   ＣＤＲ１－SYWMN（配列番号１）；
   ＣＤＲ２－QIWPGDGDTNYNGKFK（配列番号２）
   ＣＤＲ３－RETTTVGRYYYAMDY（配列番号３）；および
   ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
   ＣＤＲ１－KASQSVDYDGDSYLN（配列番号４）；
   ＣＤＲ２－DASNLVS（配列番号５）
   ＣＤＲ３－QQSTEDPWT（配列番号６）を含む、ＣＤ１９結合ドメインを含む、請求項１～７のいずれかに記載の細胞。
9. 前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号７若しくは配列番号８として示される配列を有するＶＨドメイン、または配列番号９、配列番号１０もしくは配列番号１１として示される配列を有するＶＬドメイン、ＣＤ１９に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項８に記載の細胞。
10. 前記ＣＤ１９結合ドメインが、配列番号１２、配列番号１３もしくは配列番号１４として示される配列、またはＣＤ１９に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項９に記載の細胞。
11. 前記第２のＣＡＲが、
    ａ）以下の配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）：
    ＣＤＲ１－NYWIN（配列番号１５）；
    ＣＤＲ２－NIYPSDSFTNYNQKFKD（配列番号１６）
    ＣＤＲ３－DTQERSWYFDV（配列番号１７）；および
    ｂ）以下の配列を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）：
    ＣＤＲ１－RSSQSLVHSNGNTYLH（配列番号１８）；
    ＣＤＲ２－KVSNRFS（配列番号１９）
    ＣＤＲ３－SQSTHVPWT（配列番号２０）を含むＣＤ２２結合ドメインを含む、請求項１～７のいずれかに記載の細胞。
12. 前記ＣＤ２２結合ドメインが、配列番号２１もしくは配列番号２２として示される配列を有するＶＨドメイン、または配列番号２３もしくは配列番号２４として示される配列を有するＶＬドメイン、またはＣＤ２２に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１１に記載の細胞。
13. 前記ＣＤ２２結合ドメインが、配列番号２５もしくは配列番号２６として示される配列、またはＣＤ２２に結合する能力を保持する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、請求項１１に記載の細胞。
14. 前記第１のＣＡＲが、構造：
    ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ＴＮＦ－ＩＴＡＭ
    （式中、
    ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
    スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーであり、
    ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
    ＴＮＦはＴＮＦ受容体エンドドメインであり、
    ＩＴＡＭはＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有し、
    前記第２のＣＡＲは、構造：
    ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｓｔｉｍ－ＩＴＡＭ
    （式中、
    ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインであり、
    スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーであり、
    ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインであり、
    ｃｏｓｔｉｍは共刺激ドメインであり、
    ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ含有エンドドメインである）を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
15. 請求項１～１４のいずれかに定義される前記第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の両方と、ｄＳＨＰ２と、ｄｎＴＧＦβＲＩＩとをコードする、核酸配列。
16. 以下の構造：
    モジュール１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１－ｃｏｅｘｐｒ－ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２－ｃｏｅｘｐｒ－モジュール２
    （式中、
    ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
    スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
    ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
    ｃｏｅｘｐｒは、共発現を可能にする核酸配列であり、
    ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
    スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
    ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
    モジュール１およびモジュール２は、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄＳＨＰ２）またはドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩ（ｄｎＴＧＦβＲＩＩ）のいずれかをコードする核酸配列であり、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする場合、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードし、モジュール２がｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする場合、モジュール１がｄＳＨＰ２をコードする）を有し、
    その核酸配列が、前記Ｔ細胞において発現される場合、前記第１および第２のＣＡＲが前記Ｔ細胞表面において共発現されるように、切断部位において切断されるポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の核酸配列。
17. ｃｏｅｘｐｒが、自己切断ペプチドを含む配列をコードする、請求項１６に記載の核酸配列。
18. 相同組換えを回避するため、同じまたは類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替コドンが使用される、請求項１６または１７に記載の核酸配列。
19. 請求項１５～１８のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
20. 請求項１９に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
21. 請求項１５～１８のいずれかに記載の核酸配列、または請求項１９もしくは２０に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
22. 前記細胞が、対象から単離された試料に由来する、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１～１４のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
24. 請求項２３に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、疾患を処置するおよび／または予防する方法。
25. 以下：
    （ｉ）対象からの細胞含有試料の単離工程と、
    （ｉｉ）請求項１５～１８のいずれかに記載の核酸配列、または請求項１９もしくは２０に記載のベクターによる前記細胞の形質導入またはトランスフェクション工程と、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）からの前記細胞を前記対象に投与する工程と、を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記疾患が癌である、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記癌がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項２６に記載の方法。
28. 疾患を処置および／または予防における使用のための、請求項２３に記載の医薬組成物。
29. 疾患を処置するおよび／または予防するための医薬品の製造における請求項１～１４のいずれかに記載の細胞の使用。
30. キットであって、
    （ｉ）第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列であって、その核酸配列が、以下の構造：
    ＡｇＢ１－スペーサー１－ＴＭ１
    （式中、
    ＡｇＢ１は、ＣＤ１９に結合する前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
    スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
    ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）を有する、第１の核酸配列と、
    （ｉｉ）第２のキメラ抗原受容体をコードする第２の核酸配列であって、その核酸配列が、以下の構造：
    ＡｇＢ２－スペーサー２－ＴＭ２
    （式中、
    ＡｇＢ２は、ＣＤ２２に結合する前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
    スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
    ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列である）を有する、第２の核酸配列と、
    （ｉｉｉ）本明細書に記載のｄＳＨＰ２およびｄｎＴＧＦβＲＩＩをコードする第３の核酸配列と、を含む、キット。
31. 請求項３０に定義される前記第１の核酸配列を含む第１のベクターと、請求項３０に定義される前記第２の核酸配列を含む第２のベクターと、請求項３０に定義される前記第３の核酸配列を含む第３のベクターとを含む、キット。

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