CN107406518A - 嵌合抗原受体 - Google Patents

Abstract

本发明提供嵌合抗原受体(CAR)形成多肽，其包含：(i)抗原结合结构域；(ii)卷曲螺旋间隔物结构域；(iii)跨膜结构域；和(iv)胞内域。本发明还提供了通过多个CAR形成多肽的联合凭借它们的卷曲螺旋间隔物结构域的联合形成的多聚CAR。

Description

嵌合抗原受体

发明领域

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含导致在细胞表面形成多聚CAR分子的特定的间隔物结构域。所述多聚CAR分子可以是“超敏感的”，且能够响应结合抗原诱导T细胞活化，所述抗原以低密度在靶细胞上表达。

发明背景

嵌合抗原受体(CAR)

传统上，抗原特异性T细胞是通过天然对靶抗原特异性的外周血T细胞的选择性扩增产生的。然而，选择和扩增对大多数癌症抗原特异性的大量T细胞是困难且常常是不可能的。使用整合载体的基因治疗提供了这个问题的解决方法，因为嵌合抗原受体(CAR)的转基因表达允许通过外周血T细胞的混合群体(bulk population)的离体病毒载体转导产生对任何表面抗原特异性的大量T细胞。

嵌合抗原受体是将抗原结合剂例如单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应功能。它们的通常形式是I型跨膜结构域蛋白的形式，其中抗原识别氨基末端，间隔物，跨膜结构域都连接到传输T细胞存活和活化信号的复合胞内域(参见图1A)。

这些分子的最常见形式是来源于识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)通过间隔物和跨膜结构域融合至信号传导胞内域的融合物。此类分子响应scFv对其靶标的识别而导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀伤表达所述靶抗原的靶细胞。针对肿瘤相关抗原已经开发了几种CAR，且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前在临床试验中用于多种癌症的治疗。

CAR通常包含间隔物结构域以提供抗原结合结构域和细胞膜之间的适当距离，并允许适当的取向，在配体接合时达到磷酸酶和与磷酸酶的分离。

使用的常见间隔物是IgG1的Fc，来自CD8α和CD28的茎部，且取决于抗原，甚至仅单独的IgG1铰链或CD247的胞外域可以满足(图2b)。

这些常见的间隔物是受到限制的，因为它们必须包含整个域结构以形成功能性间隔物，或者它们被重度糖基化，且氨基酸长度的变化将导致间隔物大小的不可预知的变化。例如，IgG间隔物必须含有全部数目的免疫球蛋白结构域。对于全部数目的结构域的这一要求意味着可以对间隔物进行的改变是有限的。

此外，上述列出的间隔物通常是长的一级氨基酸序列，其折叠形成所需的二级和三级结构。因此，它们通常由长核酸序列编码。对于长核酸序列的这一要求对于构建编码CAR的载体是一个问题。

经典CAR具有一定的设计限制。因为经典的CAR是同二聚体，通常存在两个(相同的)结合特异性和抗原结合结构域与细胞内T细胞信号传导结构域的1:1比率。这强加了一定的化学计量，并限制了系统作为整体的灵活性。

因此，需要替代CAR，其在设计方面提供更大的灵活性。

亲和力问题

CAR结合结构域通常来源于预先存在的抗体或选自文库的抗体的可变区。结果，大多数选择的CAR以纳摩尔亲和力结合关联(cognate)配体。相比之下，TCR：肽：MHC(TCR-pMHC)结合的生物物理性质通常为10-1uM(亲和力低数个数量级)。尽管更高的亲和力相互作用增加了在给定受体浓度下配体的特异性，但是存在新出现的证据，即TCR已经演变为具有较低的亲和力，以允许T细胞检测表达低密度关联肽MHC的靶细胞。

据报道，T细胞可以由少至10个关联pMHC来激活，并且一个pMHC可以在多达200个TCR分子中触发生产性信号。认为这是通过称为串行触发(serial triggering)的过程来实现的；其中存在于靶细胞上的一个关联pMHC可以多次经历结合，触发和然后与TCR解离的循环，有效地放大信号。因此，只需要少量的关联pMHC来转导生产性信号。

CAR的较高亲和力意味着相互作用的分子解离可以花费数分钟到数小时，这与TCR通常为数秒的量级不同。出于这个原因，CAR信号传导不太可能经历有效的串联触发反应，而是相反依赖于较高数量的受体的连接。这可以将CAR限制于靶向以高密度在靶细胞上表达的配体。据估计，高亲和力CAR需要靶细胞表达>10k个配体分子以引起有效的杀伤反应。更具体地说，使用第一代CAR，James等人已经显示了要求约30,000个靶分子/靶细胞(诱导约20,000个CAR分子的内吞作用)以引发最大裂解活性(S.James et al.,The Journal ofImmunology,vol.184(8)4284-4294,2010)。动物模型表明，表达低于杀伤阈值的配体的靶细胞可以逃避检测并可以重建疾病(U.Anurathapan et al.,Molecular Therapy,vol.22(3)623–633,2014)。

增加CAR对低密度配体的敏感性的一种方法是使用低亲和力结合剂结构域，其可以模拟TCR-pMHC串联触发反应。然而，该方法有一些限制。由于共刺激、伪二聚体形成和粘附分子在TCR-pMHC串联触发反应中起到的未知贡献，使用低亲和力CAR目前是不可预测的。在CAR治疗中，这些分子相互作用随靶细胞而变化，因此难以获得强力的串联触发反应。此外，将CAR的亲和力降低至与TCR相当的方法通常包括以高亲和力CAR开始，然后使CDR突变。这是冗长且经常不成功的方法，其可以导致不可预测的结果，并增加脱靶结合(off targetbinding)的风险。

工程化改造在低密度配体的存在下能够引发的CAR将允许疗法靶向更多的癌症，并且还减少癌症逃逸的几率。

因此，需要与上文列出的问题无关的CAR。

发明概述

在第一个方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)形成多肽，其包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)卷曲螺旋间隔物结构域；

(iii)跨膜结构域；和

(iv)胞内域。

本发明还提供辅助多肽，其包含：

(i)卷曲螺旋间隔物结构域；

(iii)跨膜结构域；和

(iv)胞内域。

卷曲螺旋结构域实现多个CAR形成多肽和/或辅助多肽例如至少三个CAR形成多肽/辅助多肽的多聚化，以形成多聚CAR。

卷曲螺旋结构域可以来源于以下任一项：软骨低聚基质蛋白(cartilage-oligomeric matrix protein，COMP)，甘露糖结合蛋白A，卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1(coiled-coil serine-rich protein 1)，多肽释放因子2，SNAP-25，SNARE，Lac阻遏物(Lacrepressor)或载脂蛋白E。

卷曲螺旋结构域可以包含SEQ ID No.1所示的序列或其片段，或具有至少80％序列同一性的其变体。

胞内域可以包含CD3zeta胞内域，CD28胞内域，41BB胞内域和OX40胞内域的至少一种。

胞内域可以包含SEQ ID No.7所示的序列，或具有至少80％序列同一性的其变体。

抗原结合结构域可以结合以低密度在靶细胞上表达的抗原。例如，抗原结合结构域可以结合ROR-1，Typr-1或BCMA。

CAR形成多肽可以包含能够与另一CAR形成桥的元件。

例如，所述元件可以能够与含有此类元件的另一CAR形成二硫桥。

本发明的第二个方面涉及多聚CAR，其由于卷曲螺旋间隔物结构域或CAR形成多肽和/或辅助多肽之间的相互作用而形成。

在本发明的第二个方面的第一个实施方案中，提供多聚嵌合抗原受体(CAR)，其包含多个如上文定义的CAR形成多肽。

在本发明的第二个方面的第二个实施方案中，提供多聚嵌合抗原受体(CAR)，其包括如上文定义的一个或多个CAR形成多肽和一个或多个辅助多肽。

多聚CAR中的CAR形成多肽和/或辅助多肽可以包含不同的胞内域。

如果多聚CAR包含两个或更多个CAR形成多肽，则它们可以具有不同的抗原结合结构域，例如具有不同结合特异性的抗原结合结构域。

CAR形成多肽和辅助多肽的胞内域之一可以包含CD3zeta胞内域，而CAR形成多肽和辅助多肽的另一个胞内域可以包含41BB胞内域。在存在两个辅助多肽的情况下，一个可以包含41BB胞内域，而另一个可以包含CD28胞内域。

多聚CAR可以是例如二聚的，三聚的，四聚的，五聚的，六聚的或七聚的。

五聚CAR可以包含CAR形成多肽和辅助多肽链的任意以下组合：

在多聚CAR包含根据本发明的第一个方面的第一和第二CAR形成多肽的情况下，第一CAR的抗原结合结构域可以与第二CAR的抗原结合结构域结合不同的表位。

在该实施方案中，第一CAR的抗原结合结构域可以与第二CAR的抗原结合结构域结合不同的抗原。

本发明还提供了接合的复合物(engaged complex)，其包含至少两个根据本发明的第二个方面的多聚CAR，其中第一多聚CAR上的第一CAR与第二多聚CAR上的第二CAR形成桥，使得第一和第二多聚CAR接合以形成复合物。

所述桥可以是二硫桥或另外的卷曲螺旋结构。

在第三个方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)信号传导系统，其包含：

(i)包含如上文定义的CAR形成多肽或辅助多肽的多聚CAR，所述CAR形成多肽或辅助多肽包含第一异二聚化结构域；和

(ii)细胞内信号传导组分，其包含信号传导结构域和第二异二聚化结构域；

其中第一和第二异二聚化结构域之间的异二聚化导致多聚CAR和信号传导组分以形成功能性CAR复合物。

所述或每个CAR形成多肽或辅助多肽可以包含多个异二聚化结构域，使得单个CAR形成多肽或辅助多肽能够与多个信号传导组分异二聚化。

CAR信号传导系统的信号传导组分可以包含多个信号传导结构域。

在第四个方面，本发明提供核酸，其编码根据本发明的第一个方面的CAR形成多肽和/或如上文定义的辅助多肽。

在第五个方面，本发明涉及核酸构建体，其包含两个或更多个核酸序列。

在本发明的第五个方面的第一个实施方案中，提供了核酸构建体，其编码两个或更多个根据本发明的第一个方面的CAR形成多肽。

在本发明的第五个方面的第二个实施方案中，提供了核酸构建体，其编码至少一个如上文定义的CAR形成多肽和至少一个如上文定义的辅助多肽。

在本发明的第五个方面的第一个实施方案中，提供了核酸构建体，其编码：

(i)至少一个根据本发明的第一个方面的CAR形成多肽，其形成根据本发明的第二个方面的多聚CAR；和

(ii)如关于本发明的第五个方面定义的细胞内信号传导组分。

在第六个方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明的第四个方面的核酸序列，或根据本发明的第五个方面的核酸构建体。

所述载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

在第七个方面，本发明提供了细胞，其表达根据本发明的第一个方面的CAR形成多肽或辅助多肽，根据本发明的第二个方面的多聚CAR，根据本发明的第三个方面的CAR信号传导系统；或如上文定义的接合复合物。

所述细胞可以是T细胞或NK细胞。

在第八个方面，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的第七个方面的细胞。

在第九个方面，本发明涉及根据本发明的第七个方面的细胞，其用于治疗疾病。

在第十个方面，本发明涉及根据本发明的第七个方面的细胞在制造用于治疗疾病的药物中的用途。

在第十一个方面，本发明涉及治疗疾病的方法，其包括将根据本发明的第七个方面的细胞施用至受试者的步骤。

所述疾病可以是癌症，例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，黑色素瘤，或骨髓瘤。

在第十二个方面，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明的第四个方面的核酸，根据本发明的第五个方面的核酸构建体，或根据本发明的第六个方面的载体。

在第十三个方面，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明的第七个方面的细胞。

在第十四个方面，本发明涉及制备根据本发明的第七个方面的细胞的方法，其包括引入根据本发明的第四个方面的核酸，根据本发明的第五个方面的核酸构建体，或根据本发明的第六个方面的载体的步骤。

所述细胞可以来自从受试者分离的样品。

使用卷曲螺旋结构域作为CAR中的间隔物提供了许多相对于先前已经使用的间隔物(例如衍生于IgG的Fc结构域)的优点。

例如，使用卷曲螺旋结构域使得间隔物尺寸能够以0.15nm的增量改变。单个氨基酸或一些氨基酸的加或减意味着卷曲螺旋间隔物的大小可以增量改变。相比之下，使用IgG间隔物仅允许添加或除去整个免疫球蛋白结构域。这意味着最小的变化增量是约4nm(即折叠的免疫球蛋白结构域的大小)。

与衍生自IgG的Fc结构域(约700个核苷酸)相比，卷曲螺旋结构域由更小的DNA片段(例如约100个核苷酸)编码。这允许更小的DNA载体，其对于改善病毒滴度和转导效率是重要的。

使用卷曲螺旋间隔物允许从不与其它卷曲螺旋结构域交叉杂交的大量卷曲螺旋间隔物进行选择。这与存在较为有限数量的间隔物选项的其他间隔物形成对比。

在CAR设计方面卷曲螺旋间隔物的使用比经典CAR具有更大的灵活性。例如，其允许形成同-或异寡聚CAR复合物。当使用CD28/OX40/41BB和TCRz胞内域工程化改造多链CAR时，异寡聚CAR复合物是有用的，以确保每个胞内域位于与膜的最佳接近性并以期望的比率存在。

本发明人已经工程化了超敏感CAR，而不改变结合剂结构域的生物物理特性。这是合意的，因为降低CAR结合剂的亲和力的方法是不可预测的，并且通常具有未表征的特异性。

通过增加CAR的效价来提供超敏感CAR。特别地，使用能够相互作用以形成包含多于两个CAR的多聚体的卷曲螺旋间隔物结构域增加了对表达低密度配体的靶标的敏感度，这是由于ITAMs和寡聚CAR复合物的亲合性(avidity)的增加。

可以通过增加螺旋-信号对scFv-螺旋的比率来增加敏感度，因此每个scFv附接到多个信号传导元件(参见图10c)。也可能通过形成多聚CAR的复合物来增加敏感度(图10f)。

在本发明的多聚CAR中，在膜近端位置以反式提供信号传导胞内域，使得能够精细调节T细胞信号传导结构域组合(图10a和b)；并且掺入超过三个不同的细胞内信号传导结构域(图10d)，使得该结构比第三代CAR包含更多的胞内域信号(图1d)。

使用在细胞内与CAR异二聚化的独立的细胞内信号传导组分分子使得能够进一步放大每个抗原结合结构域的胞内域的数量，产生“superCAR”(图15)。

本发明的多聚CAR可以包含多于一种抗原结合特异性，使得能够靶向多个表位或抗原(图10e)。

具有多个结合结构域的多聚CAR将具有比经典同二聚CAR大得多的亲合力。这可能是重要的，例如对于具有低亲和力的结合结构域，因为多重亲和力的累积强度提供高特异性结合。多聚CAR可以以类似于IgM的方式结合抗原，所述IgM包含共价连接形成五聚体或六聚体结构的多个免疫球蛋白。

附图简述

图1-a)图示经典CAR的示意图。(b)至(d)：不同代和排列的CAR胞内域：(b)初始设计通过FcεR1-γ或CD3ζ胞内域传输仅ITAM信号，而后来的设计在同一个复合胞内域中传输另外的(c)一种或(d)两种共刺激信号。

图2-a)图示经典CAR的示意图。b)图示常见的CAR间隔物的示意图。“S”表示二硫键。

图3-天然发生的二聚，三聚和四聚体卷曲螺旋结构(从Andrei N.Lupas andMarkus Gruber；Adv Protein Chem.2005；70:37-78修改)。

图4-来自胶原寡聚基质蛋白(COMP)和人IgG1的五聚体卷曲螺旋基序的晶体结构。个别的链用不同的颜色描绘。卷曲螺旋COMP结构从N末端展示，其中C末端延伸到页面中，并且也以C末端左边到N末端右侧从侧面展示。人IgG以N-末端(上)到C-末端(底部)从侧面展示。

图5-卷曲螺旋间隔物CAR。a)图示了具有衍生于COMP的五聚体卷曲螺旋间隔物的CAR的示意图。b)显示COMP CAR和对照CAR的ORF的构建物图谱。c)抗CD33COMP CAR和抗ROR-1COMP CAR的ORF的氨基酸序列。d)抗CD33COMP CAR和抗ROR-1COMP CAR的ORF的DNA序列。

图6-卷曲螺旋CAR表面表达水平。a)用抗CD33COMP CAR或抗CD33IgG1CAR转导鼠T细胞系。然后这些细胞使用与鼠Fc IgG2a融合的嵌合可溶性CD33染色，随后使用抗小鼠IgGPE进行二次染色。b)用抗ROR-1COMP CAR或抗ROR-1IgG1CAR转导鼠T细胞系。然后这些细胞使用可溶性His标记的ROR-1染色，之后用抗His-生物素进行二次染色，然后用链霉亲合素-APC三次染色。

图7-使用固定化配体刺激抗ROR-1COMP CAR T细胞。转染的鼠T细胞与预先包被不同浓度的可溶性His标记的ROR-1上清液的抗His珠共培养。16-24小时后通过ELISA分析共培养上清液中IL-2的量。

图8-靶细胞上的ROR-1表达水平。SKW细胞系天然表达低水平的ROR-1。使用ROR-1转导这些细胞以增加表达水平。这些细胞使用抗ROR-1APC染色并与未染色的细胞比较。

图9-使用ROR-1阳性SKW细胞刺激抗ROR-1COMP CAR T细胞。转导的鼠T细胞与表达低密度或高密度的ROR-1配体的SKW靶细胞共培养。T细胞保持恒定数量，而靶细胞的数量变化。16-24小时后通过ELISA分析共培养上清液中IL-2的量。灰色阴影区域表示该实验的标准曲线范围。虚线蓝线是PMA和离子霉素刺激的平均IL-2分泌。红色虚线是从仅T细胞(未刺激的)培养物检测到的平均IL-2。

图10-卷曲螺旋CAR设计。a)图示由CAR形成多肽和辅助多肽组成的CAR的示意图。CAR形成多肽向T细胞提供信号一，并由N末端的scFv结合剂，随后是COMP间隔物，跨膜和TCRz组成。辅助多肽向T细胞提供信号三，并组成如下：无N末端的配体结合剂，但是以COMP间隔物开始，随后是跨膜和41BB的信号传导基序；b)图示另一卷曲螺旋CAR系统的示意图，其包括CAR形成多肽和两个辅助多肽。CAR形成多肽向T细胞提供信号一，并由N末端的scFv结合剂，随后是COMP间隔物，跨膜和TCRz组成。第一辅助多肽向T细胞提供信号二，并组成如下：无N末端配体结合剂但是以COMP间隔物开始，随后是跨膜和CD28的信号传导基序。第二辅助多肽向T细胞提供信号三，并且组成如下：无N末端配体结合剂但是以COMP间隔物开始，随后是跨膜和41BB的信号转导基序。“S”表示二硫键。这种排列允许信号传导胞内域以反式位于膜近端位置，引起更好的信号传导；c)图示另一个卷曲螺旋CAR系统的示意图，其中scFv：螺旋的比率远小于螺旋：信号的比率，因此每个scFv附接于许多信号传导元件。这是放大系统：通过将scFv限制为每个复合物一个，每个接合的配体将通过5个TCRz链(两个配体通过10个TCRz)传导信号。这与传统的二聚CAR相反，其中两个配体通过2个TCRz链传导信号。该系统基本上将触发能力提高5倍；d)图示另一卷曲螺旋CAR系统的示意图，其包括比第三代CAR更多的胞内域。螺旋卷曲间隔物使得能够相对于并且高于传统的第三代CAR引入两个额外的信号传导结构域(“EXTRA”)；e)示出另一卷曲螺旋CAR信号传导系统的示意图，其包含多个靶物(这里示出了两种靶结合特异性：一个结合配体A和一个接合配体B)。这种排列是TanCAR的替换架构；f)示出另一卷曲螺旋CAR系统的示意图，其包括与另一卷曲螺旋间隔物CAR形成连接例如桥接二硫化物的元件，产生接合的复合物，其进一步增加scFv：信号传导结构域的价态。类似于图10c)中所示的排列，这是一种放大系统。每个接合的复合体将通过10个TCRz链传导信号。与通过2个TCRz链传导信号的传统二聚CAR相反。该系统基本上将触发能力提高5倍。使用三聚螺旋卷曲结构代替IgG铰链将这增加到仅8倍不到，而四聚螺旋卷曲将它增加10倍。

图11-COMP间隔物的截短

a)显示抗ROR-1COMP CAR的示意图，将COMP间隔区从N-末端截短，从45个氨基酸截短到“x”个氨基酸

b)使用截短的构建体转染293T细胞，并通过FACS分析。

图12-显示实施例6中测试的多聚和经典CAR的示意图

A)异多聚体CAR，其包含：具有抗CD19抗原结合结构域的多肽；螺旋卷曲间隔物结构域和CD3zeta胞内域；和具有螺旋卷曲间隔物结构域和41BB胞内域的辅助多肽。CAR由具有以下结构的双顺反子构建体编码：aCD19fmc63-COMP-CD28tmZ-2A-COMP-CD28tm-41BB。在该CAR结构中，41BB和TCRzeta信号传导基序是平行的。

B)由包含抗CD19抗原结合结构域；卷曲螺旋间隔物结构域和组合的41BB/CD3zeta胞内域的多肽组成的同二聚体CAR。该CAR由具有以下结构的构建体编码：aCD19fmc63-COMP-CD8TM-41BB-Z。在该CAR结构中，41BB和TCRzeta信号传导基序按顺序次序。

C)经典第二代同二聚体CAR，其包含具有抗CD19抗原结合结构域，CD8茎部间隔物结构域和组合的41BB/CD3zeta胞内域的两个多肽。该CAR由还编码自杀基因RQR8的双顺反子构建体编码。该构建体具有以下结构：RQR8-2A-aCD19fmc63-CD8STK-41BBZ。

图13-在第2天由图12所示的CAR对CD19+SupT1靶细胞的杀伤。

图14-在第5天由图12所示的CAR对CD19+SupT1靶细胞的杀伤。

图15-实施例7中测试的卷曲螺旋SuperCAR构建体的示意图：

aCD19-IgGFc-Z-每分子含有2个TCRz分子的经典同二聚体CAR，其具有fmc63aCD19结合剂。

由五个多肽构成的卷曲螺旋SuperCAR，每个多肽包含四个单独的AD1结构域。因此，卷曲螺旋SuperCAR包括20个AD1结构域。

COMP_x4AD1-卷曲螺旋SuperCAR与具有0拷贝的TCR zeta信号传导结构域的信号传导组分组合测试。这用作阴性对照。

COMP_x4AD1+Z-DDD1-Z-卷曲螺旋SuperCAR与具有2个拷贝的TCR zeta信号传导结构域的信号传导组分组合测试。由于DDD1以2：1化学计量结合AD1，对于每个5多肽卷曲螺旋CAR靶向组分，该信号传导结构域产生80个拷贝的TCR zeta结构域。

图16-使用表达不同浓度：低，中，高的关联抗原(CD19)的靶细胞攻击后的IL2释放。

发明详述

嵌合抗原受体(CAR)

经典CAR(其在图1中示意性显示)是嵌合I型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合剂)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。所述结合剂通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样或基于配体的抗原结合位点的其它形式。跨膜结构域将蛋白锚定于细胞膜中并将间隔物连接至胞内域。

早期CAR设计具有衍生于FcεR1的γ链或CD3ζ的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足以触发T细胞杀伤关联(cognate)靶细胞，但不能完全活化T细胞以增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3ζ的细胞内部分融合，产生第二代受体，其可以在抗原识别之后同时传递激活且共刺激的信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如密切相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述了甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化，增殖和存活信号的胞内域。

可以使用例如逆转录病毒载体将CAR编码核酸转移到T细胞。以这种方式，可以产生大量抗原特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致激活信号传输到上面有其表达的T细胞上。因此，CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶向抗原的细胞。

本发明的CAR包括抗原结合结构域，卷曲螺旋间隔物结构域，跨膜结构域和胞内域。卷曲螺旋间隔物结构域提供了与本领域先前描述的间隔物相比的许多优点。

卷曲螺旋结构域

CAR通常包含将抗原结合结构域与跨膜结构域连接的间隔物序列。间隔物允许抗原结合结构域具有适合的取向和延伸。间隔物还在配体接合时提供与磷酸酶的分离。

本发明的CAR包括卷曲螺旋间隔物结构域。

卷曲螺旋是其中两至七个α-螺旋像绳索的股一样缠绕在一起的结构基序(图3)。许多内源性蛋白掺入卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域可以参与蛋白折叠(例如，其与同一蛋白链中的七个α螺旋基序相互作用)，或负责蛋白-蛋白相互作用。在后一种情况下，卷曲螺旋可以引发同或异寡聚体结构。

如本文所使用的，术语“多聚物”和“多聚化”与“寡聚物”和“寡聚化”同义并可以互换使用。

卷曲螺旋结构域的结构是本领域公知的。例如，如Lupas&Gruber(Advances inProtein Chemistry；2007；70；37-38)所述。

卷曲螺旋通常含有疏水(h)和带电(c)氨基酸残基的重复模式hxxhcxc，其称为七件套重复(heptad repeat)。七件套重复的位置通常标记为abcdefg，其中a和d是疏水位置，通常被异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸占据。将具有这种重复模式的序列折叠成α-螺旋二级结构导致疏水残基呈现为以左旋方式轻轻地围绕螺旋缠绕的“条纹”，形成两亲性结构。对于两个此类螺旋，在细胞质中排列其自身最有利的方式是针对彼此缠绕疏水链，夹在亲水性氨基酸之间。因此，疏水性表面的埋藏为寡聚化提供了热力学驱动力。卷曲螺旋界面中的包装非常紧密，其中在a和d残基的侧链之间几乎完全为范德华接触。

α螺旋可以是平行的或反平行的，并且通常采用左旋超螺旋。虽然不是有利的，但在自然界和设计的蛋白中也观察到了一些右旋卷曲螺旋。

所述卷曲螺旋结构域可以是能够形成卷曲螺旋多聚体，使得形成包含卷曲螺旋结构域的CAR或辅助多肽的复合物的任何卷曲螺旋结构域。

卷曲螺旋结构域的序列和最终折叠结构之间的关系在本领域中是公知的(Mahrenholz et al；Molecular&Cellular Proteomics；2011；10(5):M110.004994)。因此，卷曲螺旋结构域可以是合成生成的卷曲螺旋结构域。

含有卷曲螺旋结构域的蛋白的实例包括但不限于驱动蛋白运动蛋白(kinesinmotor protein)，丁型肝炎delta抗原，古细菌盒C/D sRNP核心蛋白，软骨寡聚基质蛋白(COMP)，甘露糖结合蛋白A，卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1(coiled-coil serine-richprotein 1)，多肽释放因子2，SNAP-25，SNARE，Lac阻遏物(Lac repressor)或载脂蛋白E。

下文显示了多种卷曲螺旋结构域的序列：

驱动蛋白运动蛋白：平行同二聚体(SEQ ID No.30)

MHAALSTEVVHLRQRTEELLRCNEQQAAELETCKEQLFQSNMERKELHNTVMDLRGN

丁型肝炎delta抗原：平行同二聚体(SEQ ID No.31)

GREDILEQWVSGRKKLEELERDLRKLKKKIKKLEEDNPWLGNIKGIIGKY

古细菌盒C/D sRNP核心蛋白：反平行异二聚体(SEQ ID No.32)

RYVVALVKALEEIDESINMLNEKLEDIRAVKESEITEKFEKKIRELRELRRDVEREIEEVM

甘露糖结合蛋白A：平行同三聚体(SEQ ID No.33)

AIEVKLANMEAEINTLKSKLELTNKLHAFSM

卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1：平行同三聚体(SEQ ID No.34)

EWEALEKKLAALESKLQALEKKLEALEHG

多肽释放因子2：反平行异三聚体

链A:INPVNNRIQDLTERSDVLRGYLDY(SEQ ID No.35)

链B:VVDTLDQMKQGLEDVSGLLELAVEADDEETFNEAVAELDALEEKLAQLEFR(SEQ ID No.36)

SNAP-25和SNARE：平行异四聚体

链A:IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE(SEQ ID No.37)

链B:ALSEIETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKY(SEQ ID No.38)

链C:ELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNL(SEQ ID No.39)

链D:IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE(SEQ ID No.40)

Lac阻遏物：平行同四聚体

SPRALADSLMQLARQVSRLE(SEQ ID No.41)

载脂蛋白E：反平行异四聚体

SGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQA(SEQ ID No.42)

卷曲螺旋结构域能够寡聚化。在某些实施方案中，卷曲螺旋结构域可以能够形成三聚体，四聚体，五聚体，六聚体或七聚体。

卷曲螺旋结构域不同于亮氨酸拉链。亮氨酸拉链是作为二聚化结构域发挥功能的超二级结构。它们的存在产生平行α螺旋中的附着力。单个亮氨酸拉链由大约7个残基间隔的多个亮氨酸残基组成，其形成两亲性α螺旋，其中疏水区域沿着一侧延伸。该疏水区域为二聚化提供了面积，允许基序“拉上”在一起。亮氨酸拉链的长度通常为20至40个氨基酸，例如约30个氨基酸。

亮氨酸拉链通常由两种不同的序列形成，例如酸性亮氨酸拉链与碱性亮氨酸拉链异二聚化。亮氨酸拉链的一个实例是对接结构域(DDD1)和锚定结构域(AD1)，其在下文中更详细描述。

亮氨酸拉链形成二聚体，而本发明的卷曲螺旋间隔物用于多聚体(三聚物及以上)。亮氨酸拉链在序列的二聚化部分中异二聚化，而卷曲螺旋结构域同二聚化。

在一个实施方案中，本发明提供了超敏感CAR。

通过增加CAR的效价来提供超敏感CAR。特别地，使用能够相互作用以形成包含多于两个卷曲螺旋结构域，因此多于两个CAR的多聚体的卷曲螺旋间隔物结构域增加了对表达低密度配体的靶标的敏感度，这是由于增加了存在的ITAM的数量和寡聚CAR复合物的亲合力。

因此，在一个实施方案中，本发明的CAR形成多肽包含卷曲螺旋间隔物结构域，其使得能够进行至少三种CAR形成多肽的多聚化。换句话说，CAR包括卷曲螺旋结构域，其能够形成卷曲螺旋结构域的三聚体，四聚体，五聚物，六聚体或七聚体。

能够形成包含多于两个卷曲螺旋结构域的多聚体的卷曲螺旋结构域的实例包括但不限于衍生于软骨低聚基质蛋白(COMP)，甘露糖结合蛋白A，卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1，多肽释放因子2，SNAP-25，SNARE，Lac阻遏物或载脂蛋白E的那些(参见上文SEQ ID Nos.30-42)。

卷曲螺旋结构域可以是COMP卷曲螺旋结构域。

COMP是自然界中最稳定的蛋白复合物之一(0℃-100℃和宽pH范围内稳定)，且只能使用4-6M盐酸胍变性。COMP卷曲螺旋结构域能够形成五聚体。COMP也是一种内源性表达的蛋白，其在细胞外空间中天然表达。与合成间隔物相比，这降低了免疫原性的风险。此外，已经解出了COMP卷曲螺旋基序的晶体结构，其给出了对间隔物长度的准确估算(图4)。COMP结构的长度为约5.6nm(与约8.1nm的来自人IgG的铰链和CH2CH3结构域相比)。

卷曲螺旋结构域可以如SEQ ID No.1所示的序列或其片段组成，或包含如SEQ IDNo.1所示的序列或其片段。

SEQ ID No.1

DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG

如图11中所示，可以在N末端截短COMP卷曲螺旋结构域并保持表面表达。因此卷曲螺旋结构域可以包含SEQ ID No.1的截短形式或由SEQ ID No.1的截短形式组成，所述SEQID No.1的截短形式在N末端截短。截短的COMP可以包含SEQ ID No.1的5个C末端氨基酸，即序列CDACG。截短的COMP可以包含5至44个氨基酸，例如至少5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。截短的COMP可以对应于SEQ ID No.1的C末端。例如，包含20个氨基酸的截短的COMP可以包含序列QQVREITFLKNTVMECDACG。截短的COMP可以保留参与多聚化的半胱氨酸残基。截短的COMP可以保留形成多聚体的能力。

形成六聚体的各种卷曲螺旋结构域是已知的，例如来源于HIV的gp41，以及N.Zaccai et al.(2011)Nature Chem.Bio.,(7)935-941)描述的人工蛋白设计的六聚体卷曲螺旋。GCN4-p1亮氨酸拉链的突变形式形成七聚体卷曲螺旋结构(J.Liu.et al.,(2006)PNAS(103)15457–15462)。

卷曲螺旋结构域可以包括上述卷曲螺旋结构域之一的变体，条件是变体序列保留了形成卷曲螺旋寡聚体的能力。例如，卷曲螺旋结构域可以包含如SEQ ID No.1或30至42所示序列的变体，其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性，条件是变体序列保留形成卷曲螺旋寡聚体的能力。

两个多肽序列之间的百分比同一性可以通过程序诸如可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得的BLAST容易地确定。

抗原结合结构域

抗原结合结构域是经典CAR的部分，其识别抗原。

许多抗原结合结构域是本领域已知的，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的抗原结合结构域。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；具有对靶标足够亲和力的肽；单结构域结合剂例如骆驼的；单个作为Darpin的人工结合剂；或衍生于T细胞受体的单链。

各种肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，如下表1中所示。本发明中使用的抗原结合结构域可以是能够结合本文所述的TAA的结构域。

表1

在某些实施方案中，本发明提供了能够响应以低密度在靶细胞上表达的抗原刺激细胞活化的超敏感CAR。

抗原结合结构域可以结合以低密度在细胞例如癌细胞上表达的TAA。以低密度表达的TAA可以是指例如以每细胞几10至几1000个分子的水平表达的TAA。

已知在某些癌症中以低密度表达的TAA的实例包括但不限于CLL中的ROR1，黑色素瘤中的Typr-1和骨髓瘤中的BCMA。

先前已经描述了结合这些TAA的抗原结合结构域(例如scFv或mAb)，例如如下表所示：

跨膜结构域

跨膜结构域是跨越膜的CAR的序列。其可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以衍生于CD28，其产生良好的受体稳定性。

信号肽

本发明的CAR形成多肽和/或辅助多肽可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面，其在那里表达。

信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以以氨基酸的短正电荷区段开始，这有助于在移位期间强制多肽的适当拓扑学。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。

信号肽可以在分子的氨基末端。

信号肽可以包含如SEQ ID No.2,3或4所示的序列或具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入，取代或添加)的其变体，条件是信号肽仍然发挥功能以引起CAR的细胞表面表达。

SEQ ID No.2：MGTSLLCWMALCLLGADHADG

SEQ ID No.2的信号肽是紧凑且高效的，并且衍生于TCRβ链。预期在末端甘氨酸后可产生约95％的切割，产生由信号肽酶的有效去除。

SEQ ID No.3：MSLPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID No.3的信号肽衍生于IgG1。

SEQ ID No.4：MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

SEQ ID No.4的信号肽衍生于CD8a。

胞内域

胞内域是经典CAR的部分，其位于膜的细胞内侧。

胞内域是经典CAR的信号传输部分。在抗原结合结构域的抗原识别后，个体CAR分子簇，天然CD45和CD148从突触中排除，且信号传输至细胞。

卷曲螺旋间隔物CAR的胞内域可以是或包含细胞内信号传导结构域。在替代实施方案中，本CAR的胞内域可以能够与存在于细胞质中的细胞内信号传导分子相互作用，导致信号传导。

细胞内信号传导结构域或单独的细胞内信号传导分子可以是或包含T细胞信号传导结构域。

最普遍使用的信号传导结构域是含有3个ITAM的CD3-zeta胞内域的。这在抗原结合后将活化信号传输至T细胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的活化信号，并且可以需要另外的共刺激信号。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-Zeta一起使用以传输增殖/存活信号，或者所有三种可以一起使用(如图1B所示)。

本发明的CAR可以包含仅CD3-Zeta胞内域，CD3-Zeta胞内域与CD28或OX40的胞内域，或者CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内域(图1)。

胞内域可以包含一种或多种以下项：ICOS胞内域，CD27胞内域，BTLA胞内域，CD30胞内域，GITR胞内域和HVEM胞内域。

胞内域可以包含如SEQ ID No.5至13所示的序列或具有至少80％序列同一性的其变体。

SEQ ID No.5-CD3Z胞内域

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.6-CD28和CD3Zeta胞内域

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.7-CD28,OX40和CD3Zeta胞内域

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.8–ICOS胞内域

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL

SEQ ID No.9-CD27胞内域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP

SEQ ID No.10-BTLA胞内域

RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS

SEQ ID No.11-CD30胞内域

HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK

SEQ ID No.12-GITR胞内域

QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV

SEQ ID No.13-HVEM胞内域

CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH

变体序列可以与SEQ ID No.5至13具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供有效的细胞内信号传导结构域。

嵌合抗原受体(CAR)

在一个方面，本发明提供CAR，其包含根据本发明第一个方面的CAR形成多肽和辅助多肽，所述CAR形成多肽和辅助多肽包含(i)卷曲螺旋间隔物结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)胞内域，其中所述辅助多肽的卷曲螺旋间隔物结构域能够与所述CAR形成多肽的卷曲螺旋结构域相互作用。

CAR形成多肽提供抗原结合结构域，从而提供抗原特异性。

辅助多肽提供另外的胞内域，其可以用于产生期望的信号传导反应。这比复合信号传导结构域有利，因为每个信号传导结构域保持不受其它信号传导结构域的妨碍。此外，其允许每个信号传导结构域定位在对于信号传导最佳的膜接近性。

CAR形成多肽的胞内域可以包含至少第一细胞内信号传导结构域；且辅助多肽的胞内域可以包含至少第二细胞内信号传导结构域。例如，CAR形成多肽和辅助多肽的胞内域之一可以包含CD3zeta胞内域，而CAR和辅助多肽的另一胞内域可以包含41BB胞内域。

在另一个实施方案中，本发明提供根据本发明第二个方面的CAR，其进一步包含第二辅助多肽，所述第二辅助多肽包含：(i)卷曲螺旋结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)胞内域；其中第二辅助多肽的卷曲螺旋结构域能够与CAR形成多肽和第一辅助多肽的卷曲螺旋结构域相互作用。

CAR形成多肽的胞内域可以包含至少第一细胞内信号传导结构域，第一辅助多肽的胞内域可以包含至少第二细胞内信号传导结构域，且第二辅助多肽的胞内域可以包含至少第三细胞内信号传导结构域。

例如，CAR，第一个辅助多肽和第二个辅助多肽的胞内域在它们之间可以包含CD3zeta胞内域；41BB的胞内域；和CD28胞内域。

本发明还提供了适用于如本文所述的CAR中的辅助多肽。

多聚CAR

本发明提供了多聚CAR，其包含多个根据本发明的CAR形成多肽和任选的辅助多肽，其由于卷曲螺旋间隔物结构域之间的相互作用形成复合物。

多聚CAR可以是例如三聚体，四聚体，五聚体，六聚体或七聚体。

每种类型的CAR中的CAR形成多肽对辅助蛋白的数量总结于下表中：

三聚体CAR

CAR形成多肽的数量	辅助多肽的数量
		1	2
2	1
		3	0

四聚体CAR

CAR形成多肽的数量	辅助多肽的数量
		1	3
2	2
		3	1
4	0

五聚体CAR

CAR形成多肽的数量	辅助多肽的数量
		1	4
2	3
		3	2
4	1
		5	0

CAR形成多肽和辅助多肽在细胞内的结合将是随机的，因此上表中给出的选项可以指单个多聚CAR，其中可以精确定义CAR形成多肽和辅助多肽的数量，或者是细胞上表达的多重CAR中的CAR形成多肽和辅助多肽的平均数量。在存在高辅助多肽：CAR形成多肽比率的系统中，在细胞表面上表达一些仅辅助多肽的多重体(multiplexes)是可能的。这不是问题，只要在细胞表面表达的至少一些多重体包含CAR形成多肽。

多个CAR形成多肽和任选的辅助多肽可以包含相同的胞内域。

或者，多个CAR形成多肽和任选的辅助多肽可以包含不同的胞内域。以这种方式，可以同时活化多个不同的胞内域。这比复合信号传导结构域有利，因为每个信号传导结构域保持不受其它信号传导结构域的阻碍。此外，其允许每个信号传导结构域定位在对于信号传导最佳的膜接近性。

在多聚CAR包含多个抗原结合结构域的情况下，这将增加抗原结合的亲合性。多聚CAR可以模拟IgM的抗原结合，所述IgM包含免疫球蛋白的五聚体或六聚体排列。

CAR信号传导系统

本发明还提供嵌合抗原受体(CAR)信号传导系统，其包含：

(i)包含如上定义的CAR形成多肽或辅助多肽的多聚体CAR，所述CAR形成多肽或辅助多肽包含第一异二聚化结构域；和

(ii)包含信号传导结构域和第二异二聚化结构域的细胞内信号传导组分；

其中第一和第二异二聚化结构域之间的异二聚化导致多聚体CAR和信号传导组分形成功能性CAR复合物。

每个CAR形成多肽或辅助多肽可以包含多个异二聚化结构域，使得单个CAR形成多肽或辅助多肽能够与多个信号传导组分异二聚化。此类系统的实例在图15中显示。

为了进一步增加信号传导结构域：抗原结构域结合域，每个信号传导组分可以包括多个信号传导结构域。

异二聚化可以仅在小分子的存在下发生，例如使用例如WO2016/030691中描述的系统。

或者，异二聚化可以自发地发生。第一和第二异二聚化结构域能够彼此自发二聚化。仅第一和第二异二聚化结构域发生异二聚化，而不需要任何单独的分子作为二聚化的“诱导剂”。

本发明的信号传导系统不受特定的异二聚化结构域对的排列的限制。靶向组分(即多聚CAR)可以包含来自一对异二聚化结构域的任一结构域，只要信号传导组分包含相应的互补结构域，其使得靶向组分和信号传导组分能够在细胞膜上共定位。

用于本CAR系统的异二聚化结构域不限于以1:1的比例相互作用的那些。例如，异二聚化结构域可以相互作用以形成多聚体(例如三聚体或四聚体)。所述结构域可以以单个第一异二聚化结构域与多个(例如2个或3个)第二异二聚化结构域共定位的方式相互作用。在本文中，可以有利的是具有包含第二异二聚化结构域的信号传导结构域，使得多个信号传导组分可以与单个多聚CAR共定位。这可以是有利的，例如，当抗原结合到多聚CAR时需要高水平的信号传导。

多聚CAR可以包括多个异二聚化结构域，使得其与多个信号传导组分相互作用。例如，多聚CAR可以包含多于两个异二聚化结构域，例如3至10个异二聚化结构域。图15显示了多聚CAR，其包含20个异二聚化结构域，每个CAR形成多肽/辅助多肽四个。

为方便起见，术语异二聚化结构域在本文中用于介导多聚CAR和信号传导组分的共定位的所有结构域。

大量的适合的异二聚化结构域是本领域已知的，本文提供其实例。

第一和第二异二聚化结构域可以是亮氨酸拉链。

亮氨酸拉链是本领域公知的(例如参见Hakoshima；Encyclopedia of LifeSciences；2005)。亮氨酸拉链是作为二聚化结构域发挥功能的超二级结构。其存在产生平行α螺旋中的粘附力。单个亮氨酸拉链由大约7个残基间隔的多个亮氨酸残基组成，其形成两亲性α螺旋，其中疏水区域沿着一侧延伸。该疏水区域为二聚化提供了面积，允许基序“拉上”在一起。亮氨酸拉链的长度通常为20至40个氨基酸，例如约30个氨基酸。

第一和/或第二异二聚化结构域可以包含如SEQ ID NO：43或44所示的序列。第一异二聚化结构域可以包含如SEQ ID NO：43所示的序列，第二异二聚化结构域可以包含如SEQ ID NO：44所示的序列，或反之亦然。

SEQ ID NO:43:QLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ

SEQ ID NO:44:QLEKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQ

在某些实施方案中，第一和第二异二聚化结构域可以是酸性的(例如SEQ ID NO：43)或碱性(例如SEQ ID NO：44)亮氨酸拉链。特别地，当第一异二聚化结构域是酸性亮氨酸拉链时，第二异二聚化是碱性亮氨酸拉链，反之亦然。

第一和第二异二聚化结构域可以是二聚化和对接结构域(DDD1)和锚定结构域(AD1)。这些结构域和它们之间的相互作用是本领域已知的(Rossi et al.；PNAS；2006；103(18)；6841-6846)。

DDD1是衍生于蛋白激酶A(PKA)的短α螺旋结构。AD1是衍生于A激酶锚蛋白(AKAP)的短α螺旋结构。

DDD1结构域可以包含如SEQ ID NO：45所示的序列。

SEQ ID NO：45：SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA

AD1结构域可以包含如SEQ ID NO：46所示的序列。

SEQ ID NO：46：VQIEYLAKQIVDNAIQQA

由于DDD1/AD1相互作用是三聚的，CAR胞内域上存在的AD1结构域将募集三个包含DDD1结构域的信号传导结构域。因此，在特定实施方案中，CAR胞内域包含AD1结构域，且细胞内信号传导组分包含DDD1结构域。

异二聚化结构域可以衍生于细菌核糖核酸酶(Barnase)和Barnstar肽。

Barnase是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)核糖核酸酶蛋白。其由110个氨基酸组成。Barnstar发挥功能以抑制Barnase的核酸酶活性，从而以非常高的亲和力(结合速率(on-rate)为108s-1M-1)结合Barnstar。

异二聚化结构域可以衍生于人胰腺RNA酶和S-肽。

人胰腺RNA酶是嘧啶特异性核酸内切酶。S-肽是RNA酶的酶促无活性蛋白水解片段，其缺少RNA结合位点。

本发明还包括本文所述的异二聚化序列的变体，其保留与相应异二聚化结构域二聚化的能力。异二聚化结构域可以是与SEQ ID No.43,44,45或46所示的序列相比具有5,4,3,2或1个氨基酸突变(插入，取代或添加)或至少80％，85％，90％，95％，98％或99％序列同一性的变体，条件是它们仍然引起CAR和信号传导组分之间的异二聚化。

核酸

本发明还提供编码根据本发明第一个方面的CAR形成多肽和/或如本发明第一个方面中定义的辅助多肽的核酸。

如本文所用的，术语“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”意图彼此同义。

技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸替换，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物体的密码子选择。

根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是在其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本文所述的用途的目的，应当理解，可以通过本领域可获得的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。

关于核苷酸序列的术语“变体”，“同源物”或“衍生物”包括从序列或对序列的一个(或多个)核酸的任何取代，变异，修饰，替换，缺失或添加。

本发明还提供编码适用于根据本发明第二个方面的CAR中的辅助多肽的核酸序列。

核酸构建体

本发明还提供了编码多个核酸序列的核酸构建体。

例如，核酸构建体可编码两个或更多个如本发明第一个方面所定义的CAR形成多肽。

在该实施方案中，核酸构建体可以包含至少两个核酸序列：

(i)编码第一CAR形成多肽的第一核酸序列；和

(ii)编码第二CAR形成多肽的第二核酸序列。

核酸构建体可以编码至少一个如本发明第一个方面所定义的CAR形成多肽和至少一个如上文定义的辅助多肽。

在该实施方案中，核酸构建体可以包含至少两个核酸序列：

(i)编码CAR形成多肽的第一核酸序列；和

(ii)编码辅助多肽的第二核酸序列。

核酸构建体可以编码：

(i)至少一个CAR形成多肽，其形成如本发明第二个方面定义的多聚CAR；和

(ii)如上文定义的细胞内信号传导组分。

在该实施方案中，核酸构建体可以包含至少两个核酸序列：

(i)编码CAR形成多肽的第一核酸序列；和

(ii)编码细胞内信号传导组分的第二核酸序列。

核酸构建体可以包含编码辅助多肽的第三核酸序列。

因此，核酸构建体可以产生通过切割位点连接的两个或更多个多肽。切割位点可以是自切割的，使得当新生翻译产物产生时，其立即切割成单个多肽，而不需要任何外部切割活性。

切割位点可以是使得包含多个CAR和/或辅助多肽的多肽能够被分离的任何序列。

为了方便在本文中使用术语“切割”，但是切割位点可以通过除经典切割以外的机制导致肽分离成单个实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自切割肽(见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：宿主细胞蛋白酶的蛋白水解，自体蛋白水解或翻译效应(Donnelly et al(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。只要当切割位点位于编码蛋白的核酸序列之间时，导致蛋白表达为单独的实体，对于本发明的目的此类“切割”的确切机制并不重要。

所述切割位点可以是弗林蛋白酶(furin)切割位点。

弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是将潜伏的前体蛋白加工成其生物活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是一种钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其能够在配对的碱性氨基酸加工位点有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原(proparathyroid hormone)，转化生长因子β1前体，清蛋白原，β-分泌酶原，膜1型基质金属蛋白酶，神经生长因子原的β亚基和vonWillebrand因子。弗林蛋白酶刚好在碱性氨基酸靶序列(典型地为Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')的下游切割蛋白，并在高尔基体中富集。

所述切割位点可以是烟草蚀刻病毒(TEV)切割位点。

TEV蛋白酶是一种高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。它对于其靶切割位点非常特异，因此经常用于体外和体内对融合蛋白的受控切割。共有TEV切割位点是ENLYFQ\S(其中“\”表示切割的肽键)。哺乳动物细胞如人细胞不表达TEV蛋白酶。因此，在存在的核酸构建体包含TEV切割位点并且在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，外源TEV蛋白酶也必须在哺乳动物细胞中表达。

所述切割位点可以编码自切割肽。

“自切割肽”是指其发挥功能使得当产生包含多肽和自切割肽的新生产物时，其立即“切割”或分离成不同且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性的肽。

自切割肽可以是来自口疮病毒或心脏病毒的2A自切割肽。口疮病毒和心脏病毒的主要2A/2B切割由其自身C末端的2A“切割”介导。在口疮病毒中，例如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒，2A区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白2B的N末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表了能够在其自身C末端介导“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)，如上文)。

已经在除了口疮病毒或心脏病毒之外的小核糖核酸病毒，“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒，C型轮状病毒，和Trypanosoma spp中的重复序列和细菌序列中发现了“2A样”序列(Donelly et al(2001)，如上文)。切割位点可以包含这些2A样序列之一，例如：

YHADYYKQRLIHDVEMNPGP(SEQ ID No.14)

HYAGYFADLLIHDIETNPGP(SEQ ID No.15)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID No.16)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID No.17)

AARQMLLLLSGDVETNPGP(SEQ ID No.18)

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID No.19)

TRAEIEDELIRAGIESNPGP(SEQ ID No.20)

TRAEIEDELIRADIESNPGP(SEQ ID No.21)

AKFQIDKILISGDVELNPGP(SEQ ID No.22)

SSIIRTKMLVSGDVEENPGP(SEQ ID No.23)

CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP(SEQ ID No.24)

YPIDFGGFLVKADSEFNPGP(SEQ ID No.25)

切割位点可以包含如SEQ ID No.19所示的2A样序列(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)。

本发明还提供试剂盒，其包含一个或多个编码根据本发明第一个方面的CAR形成多肽和/或适用于产生根据本发明第二个方面的CAR的辅助多肽的核酸序列。

载体

本发明还提供载体或载体试剂盒，其包含一个或多个如上文定义的核酸序列或核酸构建体。可以使用此类载体将核酸序列引入宿主细胞中，使得其表达根据本发明的第一个方面的CAR形成多肽或辅助多肽，和/或根据第二个方面的CAR。

载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。

载体可以能够转染或转导免疫细胞例如T细胞或NK细胞。

细胞

本发明还涉及细胞，例如免疫细胞，其包含如上文所述的CAR形成多肽，CAR或CAR信号传导系统。

所述细胞可以包含本发明的核酸，核酸构建体或载体。

所述细胞可以是免疫细胞，特别是细胞溶解性免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其它淋巴细胞例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。

辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。TH细胞当通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子给它们呈递肽抗原时被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

细胞溶解性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10，腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞失活至无能力状态，其防止自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。

记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，所述抗原特异性T细胞在感染已经消退之后长期持续。它们在再次暴露于其关联(cognate)抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供了针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

以前称为抑制性T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，和抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。

已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞-天然发生的Treg细胞和适应性Treg细胞。

天然发生的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并且已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用相关联。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其它T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。

适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。

所述细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。

NK细胞(属于先天性淋巴样细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓，淋巴结，脾，扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那些地方然后它们进入循环。

本发明的CAR细胞可以是上述任何细胞类型。

表达根据本发明的CAR或其组分的T细胞或NK细胞，可以从患者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的背景中，或来自不相关供体的外周血(第三方)离体产生。

或者，表达根据本发明的CAR或其组分的T细胞或NK细胞可以衍生于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为T细胞或NK细胞。或者，可以使用保留其溶解功能并且可以用作治疗剂的永生化T细胞系。

在所有这些实施方案中，通过包括使用病毒载体转导，使用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码本发明的CAR或其组分的DNA或RNA来生成CAR细胞。

本发明的CAR细胞可以是来自受试者的离体T细胞或NK细胞。T细胞或NK细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。在用编码提供本发明CAR或CAR组分的分子的核酸转导之前T细胞或NK细胞可以进行活化和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。

本发明的T或NK细胞可以如下制备：

(i)从受试者或上文列出的其它来源分离含T细胞或NK细胞的样品；和

(ii)用一种或多种如上文所述的核酸序列或核酸构建体转导或转染T细胞或NK细胞。

然后可以通过纯化，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达选择T细胞或NK细胞。

药物组合物

本发明还涉及含有多个表达根据本发明的CAR或其成分的细胞的药物组合物。

药物组合物可另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如适于静脉输注的形式。

治疗方法

本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在上述药物组合物中)施用至受试者的步骤。

治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在本文中，细胞可以施用于具有现有疾病或状况的受试者，以减轻，降低或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓，降低或阻断疾病的进展。

预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防用途。在本文中，此类细胞可以施用于尚未感染疾病的受试者和/或没有显示任何疾病症状的受试者以预防或削弱疾病的起因或降低或预防与疾病相关的至少一种症状的形成。该受试者可以具有形成疾病的素因，或认为有风险形成疾病。

所述方法可以包括以下步骤：

(i)分离含T细胞或NK细胞的样品；

(ii)用本发明的核酸序列，核酸构建体或载体转导或转染此类细胞；

(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。

含T细胞或NK细胞的样品可以从受试者或其他来源(例如如上所述)分离。可以从受试者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植(第二方)的背景中，或来自不相关供体的外周血(第三方)分离T细胞或NK细胞。

本发明提供本发明的CAR细胞，其用于治疗和/或预防疾病。

本发明还涉及本发明的CAR细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，肾癌(肾细胞)，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。

本发明的CAR细胞可以能够杀伤靶细胞，例如癌细胞。可以通过TAA的表达来识别靶细胞，例如上文表1中提供的TAA的表达。

本发明的CAR细胞可以能够杀死表达低密度TAA的靶细胞，例如癌细胞。已知在某些癌症中以低密度表达的TAA的实例包括但不限于CLL中的ROR1，黑色素瘤中的Typr-1和骨髓瘤中的BCMA。

本发明的CAR细胞和药物组合物可用于上述疾病的治疗和/或预防。

本发明的CAR细胞和药物组合物可以用于上述任何方法中。

现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1-细胞表面的COMP CAR表达

用抗CD33COMP CAR(氨基酸序列示于图5c和核酸序列示于图5d)或抗CD33IgG1CAR转导鼠T细胞系。

然后将这些细胞使用与鼠Fc IgG2a融合的嵌合可溶性CD33染色，随后使用抗小鼠IgG PE进行二次染色(图6a)。

使用抗ROR-1COMP CAR CAR(氨基酸序列示于图5c和核酸序列示于图5d)或抗ROR-1IgG1CAR转导鼠T细胞系。

然后将这些细胞使用可溶性His标记的ROR-1染色，随后使用抗His-生物素进行二次染色，然后用链霉亲合素-TS3三次染色(图6b)。

所有四种CAR在细胞表面上成功表达。这些数据还表明，当与COMP间隔物连接时，CAR结合结构域以不阻碍配体结合的方式定向。

实施例2-使用固定化的配体刺激COMP CAR T细胞

使用T细胞及使用固定化配体包被的珠刺激COMP ROR-1CAR T细胞。为了实现这一点，构建并表达可溶性His-标签ROR-1。然后将含有这些可溶性配体的上清液以不同浓度与一定数量的抗His珠孵育。然后洗涤珠以去除未结合的配体，并且使用这些珠刺激用COMPCAR平台或具有IgG间隔物的等同CAR转导的T细胞。

将转导的鼠T细胞与抗His珠共培养，所述抗His珠使用不同浓度的可溶性His标记的ROR-1上清液预包被。16-24小时后通过ELISA分析共培养上清液中IL-2的量(图7)。

实施例3-ROR-1靶细胞的表达水平

SKW细胞系天然表达低水平的ROR-1。使用ROR-1转导这些细胞以增加表达水平。将这些细胞用抗ROR-1APC染色，并与未染色的细胞比较(图8)。

实施例4-使用ROR-1阳性SKW细胞刺激抗ROR-1COMP CAR T细胞

将转导的鼠T细胞(实施例1和2中所述)与以低浓度或高密度表达ROR-1配体的SKW靶细胞共培养。T细胞保持恒定数量，而靶细胞变化。16-24小时后通过ELISA分析共培养上清液中IL-2的量(图9)。

与抗ROR-1IgG1CAR相比，当将抗ROR-1COMP CAR T细胞与表达低密度ROR-1配体的SKW靶细胞共培养时，检测到较高水平的IL-2。

使用SKW高靶细胞，这两种CAR都能够起始活化反应。

实施例5-COMP间隔物的截短

具有COMP间隔物的aROR-1CAR从其45个氨基酸的原始长度截短。将这些COMP截短的构建体转染到293T细胞中，然后用sROR-1His随后是抗His-生物素接着是链霉亲合素-PE.Cy7针对CAR表面表达染色。这些细胞还使用抗CD34-FITC抗体针对RQR8标志物染色。这些FACS图显示了各种截短形式的COMP间隔物的稳定的表面表达，展示了将卷曲螺旋间隔物的长度一次改变一到几个氨基酸的能力(图11)。

实施例6-比较多聚卷曲螺旋间隔物CAR和经典二聚CAR

为了比较本发明的卷曲螺旋间隔物CAR与常规CAR的功能，制备了具有相同抗原结合结构域和等同胞内域但具有不同间隔物的一系列构建体，产生完全不同的CAR结构。不同的CAR在图12中显示。

所有CAR包含基于fmc63的抗CD19抗原结合结构域和包含41BB和CD3zeta胞内域的“第二代”胞内域。测试了以下形式：

a)异多聚体CAR，其包含：具有抗CD19抗原结合结构域；卷曲螺旋间隔物结构域和CD3zeta胞内域的多肽；和具有卷曲螺旋间隔物结构域和41BB胞内域的辅助多肽(图12A)；

b)由包含抗CD19抗原结合结构域；卷曲螺旋间隔物结构域和组合的41BB/CD3zeta胞内域的多肽组成的同多聚体CAR(图12B)；和

c)经典的第二代同二聚体CAR，其包含两个具有抗CD19抗原结合结构域，CD8茎部间隔物结构域和组合的41BB/CD3zeta胞内域的多肽(图12C)。

编码CAR的载体在图12中显示。

产生了编码各种CAR结构的RD114-假型化逆转录病毒。

对T细胞耗竭表达CD56的细胞，并与相同数量的SupT1共培养以达到1：1的效应细胞：靶标比例。在通过流式细胞术分析之前，将相同数量的荧光计数珠添加到每个共培养物中以允许细胞数量的标准化并考虑摄取量的任何差异。如下通过流式细胞术评估CAR介导的细胞毒性：通过相对于FCS针对CD3表达染色区分T细胞与肿瘤细胞，并肿瘤细胞通过其CD3的缺乏和较高的FCS信号鉴定。通过死细胞排除染料7-AAD的染色评估存活力，且活细胞定义为不吸收该染料的那些。对于每个共培养条件计算活肿瘤细胞，并通过相对于与非转导的PBMC实施共培养回收的活肿瘤细胞数目(100％)标准化活肿瘤细胞的数量计算百分比细胞毒性。在第2天和第5天评估对靶细胞的杀伤。

结果示于图13(第2天)和图14(第5天)中。两天后，所有三种CAR结构显示对CD19+SupT1靶细胞的杀伤。两种多聚体CAR显示出优于等同的经典同二聚体CAR的杀伤。同多聚体CAR(Fmc63-COMP-41BBz)显示出最多的杀伤。在第5天，使用经典同二聚体CAR(Fmc63-CD8STK-41BBz)，保持了一些残留的靶细胞，但是对于两种多聚体CAR，几乎检测不到活靶细胞。

实施例7-卷曲螺旋SuperCAR的产生和测试

CAR技术的一项主要挑战是检测以低密度存在于靶细胞上的抗原。为了解决这个问题，本发明人设计了基于卷曲螺旋间隔物形式的“SuperCAR”，其对于每个抗原相互作用募集多个TCR zeta链。

构成卷曲螺旋CAR结构的多肽的细胞内部分包含多个异二聚化结构域，其每个能够与一个或多个细胞内信号传导组分相互作用，所述细胞内信号传导组分包含一个或多个细胞内信号传导结构域。

在图15所示的构建体中，细胞内二聚化在二聚化和对接结构域(DDD1)和锚定结构域(AD1)之间。构成卷曲螺旋间隔物CAR的每个多肽包含四个单独的AD1结构域。因此，包含5个多肽的卷曲螺旋CAR将包含20个AD1结构域。

与不同的信号传导组分组合测试卷曲螺旋SuperCAR，所述信号传导组分具有0或2个拷贝的TCR zeta信号传导结构域。因为DDD1以2：1化学计量结合AD1，对于每个5-多肽卷曲螺旋CAR靶向组分，这些信号传导结构域分别产生0和80个拷贝的TCR zeta结构域。

作为对照，使用具有相同抗原结合结构域的经典同二聚体抗CD19CAR(图15：aCD19-IgGFc-Z)。

使用每种CAR转导鼠T细胞系BW5，并使用以不同浓度(低、中和高)表达关联抗原(CD19)的SupT1细胞攻击。通过使用次优信号肽和/或引入衍生自Tyrp-1的细胞质保留基序(插入到膜近端)或来自腺病毒的糖蛋白E3-19k(插入到C-末端)，将这些SupT1细胞工程化为以不同水平表达CD19。抗原攻击后测量IL-2释放。

结果示于图16中。发现每5聚体卷曲螺旋CAR包含80个拷贝的TCR zeta的superCAR比每分子包含两个拷贝的TCR zeta的等同经典CAR给出大得多的对抗原的响应。

上述说明书中提到的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应过度限于这些具体实施方案。实际上，对分子生物学，细胞生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的描述模式的各种修改意图在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> UCL商务股份有限公司

<120> 嵌合抗原受体

<130> P106296PCT

<150> GB 1504840.8

<151> 2015-03-23

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域

<400> 1

Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr

20 25 30

Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly

35 40 45

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生于TCR beta链的信号肽

<400> 2

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Gly

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生于IgG1的信号肽

<400> 3

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生于CD8a的信号肽

<400> 4

Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys

20

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 Z胞内域

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28和CD3 Zeta胞内域

<400> 6

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

35 40 45

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

50 55 60

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

65 70 75 80

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

85 90 95

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

100 105 110

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

115 120 125

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

130 135 140

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 7

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28, OX40和CD3 Zeta胞内域

<400> 7

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp

35 40 45

Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu

50 55 60

Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe

65 70 75 80

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

85 90 95

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

100 105 110

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

115 120 125

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

130 135 140

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

145 150 155 160

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

165 170 175

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

180 185

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOS胞内域

<400> 8

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn

1 5 10 15

Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Asp Val Thr Leu

35

<210> 9

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27胞内域

<400> 9

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BTLA胞内域

<400> 10

Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg

1 5 10 15

Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala

20 25 30

Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr

35 40 45

Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val

50 55 60

Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala

65 70 75 80

Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn

85 90 95

Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser

100 105 110

<210> 11

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD30胞内域

<400> 11

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

20 25 30

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

35 40 45

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr

50 55 60

Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro

85 90 95

Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile

100 105 110

Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro

115 120 125

Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu

130 135 140

Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro

145 150 155 160

Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly

165 170 175

Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180 185

<210> 12

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR胞内域

<400> 12

Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro

1 5 10 15

Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala

20 25 30

Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu

35 40 45

Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val

50 55

<210> 13

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVEM胞内域

<400> 13

Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile

20 25 30

Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu

35 40 45

Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His

50 55 60

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 14

Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 15

His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 16

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 17

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 17

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 18

Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 19

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 20

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 21

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Asp Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 22

Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 23

Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 24

Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2A样序列

<400> 25

Tyr Pro Ile Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 26

<211> 647

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD33 COMP CAR的ORF的氨基酸序列

<400> 26

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

165 170 175

Pro Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu

180 185 190

Thr Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

195 200 205

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu

210 215 220

Asp Ile Tyr Phe Asn Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

225 230 235 240

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro

245 250 255

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile

260 265 270

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr

275 280 285

Lys Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

290 295 300

Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

325 330 335

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala

355 360 365

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Leu Asn Gly Gly

370 375 380

Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

385 390 395 400

Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

405 410 415

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gln Asp Ala Tyr Thr Gly

420 425 430

Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

435 440 445

Met Asp Pro Ala Gly Ser Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu

450 455 460

Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln

465 470 475 480

Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp

485 490 495

Ala Cys Gly Ser Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val

500 505 510

Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe

515 520 525

Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

530 535 540

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

545 550 555 560

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

565 570 575

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

580 585 590

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

595 600 605

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

610 615 620

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

625 630 635 640

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645

<210> 27

<211> 638

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗ROR-1 COMP CAR的ORF的氨基酸序列

<400> 27

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser

35 40 45

Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser

50 55 60

Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro

65 70 75 80

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

85 90 95

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

100 105 110

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

115 120 125

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

130 135 140

Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Arg Ala Glu

145 150 155 160

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

165 170 175

Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val

180 185 190

Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val

195 200 205

Thr Pro Ala Gly Asn Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp

210 215 220

Ile Asn Asp Tyr Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

225 230 235 240

Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala

245 250 255

Ser Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val

260 265 270

Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

275 280 285

Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly

290 295 300

Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro

325 330 335

Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln

340 345 350

Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro

355 360 365

Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

370 375 380

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr

385 390 395 400

Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

405 410 415

Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly

420 425 430

Thr Glu Val Val Val Lys Arg Ser Asp Pro Ala Gly Ser Asp Leu Gly

435 440 445

Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala Leu Gln Asp

450 455 460

Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys

465 470 475 480

Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly Ser Gly Lys Lys Asp Pro

485 490 495

Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

500 505 510

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Arg Val

515 520 525

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

530 535 540

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

545 550 555 560

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

565 570 575

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

580 585 590

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

595 600 605

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

610 615 620

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

625 630 635

<210> 28

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD33 COMP CAR的ORF的DNA序列

<400> 28

atgggcacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat 60

gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc 120

cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc 180

tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct 240

cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc 300

ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc 360

tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420

tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag 480

ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggccgtg 540

cccactcagg tcctggggtt gttgctactg tggcttacag atgccagatg tgacatccag 600

atgacacagt ctccatcttc cctgtctgca tctgtcggag atcgcgtcac catcacctgt 660

cgagcaagtg aggacattta ttttaattta gtgtggtatc agcagaaacc aggaaaggcc 720

cctaagctcc tgatctatga tacaaatcgc ttggcagatg gggtcccatc acggttcagt 780

ggctctggat ctggcacaca gtatactcta accataagta gcctgcaacc cgaagatttc 840

gcaacctatt attgtcaaca ctataagaat tatccgctca cgttcggtca ggggaccaag 900

ctggaaatca aaagatctgg tggcggaggg tcaggaggcg gaggcagcgg aggcggtggc 960

tcgggaggcg gaggctcgag atctgaggtg cagttggtgg agtctggggg cggcttggtg 1020

cagcctggag ggtccctgag gctctcctgt gcagcctcag gattcactct cagtaattat 1080

ggcatgcact ggatcaggca ggctccaggg aagggtctgg agtgggtctc gtctattagt 1140

cttaatggtg gtagcactta ctatcgagac tccgtgaagg gccgattcac tatctccagg 1200

gacaatgcaa aaagcaccct ctaccttcaa atgaatagtc tgagggccga ggacacggcc 1260

gtctattact gtgcagcaca ggacgcttat acgggaggtt actttgatta ctggggccaa 1320

ggaacgctgg tcacagtctc gtctatggat cccgccggga gcgacctggg ccctcagatg 1380

ctgcgggagc tgcaggagac aaatgccgcc ctgcaggacg tgcgcgagct gctgagacag 1440

caggtgcggg agattacatt cctgaagaac accgtgatgg agtgcgatgc ctgcggatct 1500

gggaagaagg accccaagtt ctgggtcctg gtggtggtgg gaggcgtgct ggcctgttac 1560

tctctcctgg tgaccgtggc cttcatcatc ttttgggtgc gctcccgggt gaagttttct 1620

cgctctgccg atgccccagc ctatcagcag ggccagaatc agctgtacaa tgaactgaac 1680

ctgggcaggc gggaggagta cgacgtgctg gataagcgga gaggcagaga ccccgagatg 1740

ggcggcaaac cacggcgcaa aaatccccag gagggactct ataacgagct gcagaaggac 1800

aaaatggccg aggcctattc cgagatcggc atgaagggag agagaagacg cggaaagggc 1860

cacgacggcc tgtatcaggg attgtccacc gctacaaaag atacatatga tgccctgcac 1920

atgcaggccc tgccacccag atga 1944

<210> 29

<211> 1914

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗ROR-1 COMP CAR的ORF的DNA序列

<400> 29

atgggcacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgat 60

gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggaggcg gcggcagcga gctgcccacc 120

cagggcacct tctccaacgt gtccaccaac gtgagcccag ccaagcccac caccaccgcc 180

tgtccttatt ccaatccttc cctgtgtagc ggagggggag gcagcccagc ccccagacct 240

cccaccccag cccccaccat cgccagccag cctctgagcc tgagacccga ggcctgccgc 300

ccagccgccg gcggcgccgt gcacaccaga ggcctggatt tcgcctgcga tatctacatc 360

tgggccccac tggccggcac ctgtggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420

tgcaaccacc gcaaccgcag gcgcgtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt gagagccgag 480

ggcagaggca gcctgctgac ctgcggcgac gtggaggaga acccaggccc catggagacc 540

gacaccctgc tgctgtgggt gctgctgctg tgggtgcccg gcagcaccgg ccagagcgtg 600

aaggagagcg agggcgacct ggtgacccca gccggcaacc tgaccctgac ctgcaccgcc 660

agcggcagcg acatcaacga ctaccccatc agctgggtgc ggcaggcccc aggcaagggc 720

ctggagtgga tcggcttcat caacagcggc ggcagcacct ggtacgccag ctgggtgaag 780

ggccggttca ccatcagccg gaccagcacc accgtggacc tgaagatgac cagcctgacc 840

accgacgaca ccgccaccta cttctgcgcc agaggctaca gcacctacta cggcgacttc 900

aacatctggg gacccggcac cctggtgacc atcagcagcg gaggcggagg gtctgggggc 960

ggcggtagcg gcggaggagg gagcgagctg gtgatgaccc agaccccaag cagcaccagc 1020

ggcgccgtgg gcggcaccgt gaccatcaac tgccaggcca gccagagcat cgacagcaac 1080

ctggcctggt tccagcagaa gcctggccag ccacccaccc tgctgatcta ccgggccagc 1140

aacctggcca gcggcgtgcc cagccggttc agcggcagcc ggagcggcac cgagtacacc 1200

ctgaccatca gcggcgtgca gcgggaggac gccgccacct actactgcct gggcggagtg 1260

ggcaacgtga gctaccggac cagcttcggc ggaggcaccg aggtggtggt gaagcggtcg 1320

gatcccgccg ggagcgacct gggccctcag atgctgcggg agctgcagga gacaaatgcc 1380

gccctgcagg acgtgcgcga gctgctgaga cagcaggtgc gggagattac attcctgaag 1440

aacaccgtga tggagtgcga tgcctgcgga tctgggaaga aggaccccaa gttctgggtc 1500

ctggtggtgg tgggaggcgt gctggcctgt tactctctcc tggtgaccgt ggccttcatc 1560

atcttttggg tgcgctcccg ggtgaagttt tctcgctctg ccgatgcccc agcctatcag 1620

cagggccaga atcagctgta caatgaactg aacctgggca ggcgggagga gtacgacgtg 1680

ctggataagc ggagaggcag agaccccgag atgggcggca aaccacggcg caaaaatccc 1740

caggagggac tctataacga gctgcagaag gacaaaatgg ccgaggccta ttccgagatc 1800

ggcatgaagg gagagagaag acgcggaaag ggccacgacg gcctgtatca gggattgtcc 1860

accgctacaa aagatacata tgatgccctg cacatgcagg ccctgccacc caga 1914

<210> 30

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 驱动蛋白运动蛋白：平行同二聚体

<400> 30

Met His Ala Ala Leu Ser Thr Glu Val Val His Leu Arg Gln Arg Thr

1 5 10 15

Glu Glu Leu Leu Arg Cys Asn Glu Gln Gln Ala Ala Glu Leu Glu Thr

20 25 30

Cys Lys Glu Gln Leu Phe Gln Ser Asn Met Glu Arg Lys Glu Leu His

35 40 45

Asn Thr Val Met Asp Leu Arg Gly Asn

50 55

<210> 31

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 丁型肝炎delta抗原：平行同二聚体

<400> 31

Gly Arg Glu Asp Ile Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu

1 5 10 15

Glu Glu Leu Glu Arg Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys

20 25 30

Leu Glu Glu Asp Asn Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly

35 40 45

Lys Tyr

50

<210> 32

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 古细菌盒C/D sRNP核心蛋白：反平行异二聚体

<400> 32

Arg Tyr Val Val Ala Leu Val Lys Ala Leu Glu Glu Ile Asp Glu Ser

1 5 10 15

Ile Asn Met Leu Asn Glu Lys Leu Glu Asp Ile Arg Ala Val Lys Glu

20 25 30

Ser Glu Ile Thr Glu Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Arg Glu

35 40 45

Leu Arg Arg Asp Val Glu Arg Glu Ile Glu Glu Val Met

50 55 60

<210> 33

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 甘露糖结合蛋白A ：平行同三聚体

<400> 33

Ala Ile Glu Val Lys Leu Ala Asn Met Glu Ala Glu Ile Asn Thr Leu

1 5 10 15

Lys Ser Lys Leu Glu Leu Thr Asn Lys Leu His Ala Phe Ser Met

20 25 30

<210> 34

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1：平行同三聚体

<400> 34

Glu Trp Glu Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Ala Leu Glu Ser Lys Leu

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Leu Glu His Gly

20 25

<210> 35

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽释放因子2：反平行异三聚体链A

<400> 35

Ile Asn Pro Val Asn Asn Arg Ile Gln Asp Leu Thr Glu Arg Ser Asp

1 5 10 15

Val Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr

20

<210> 36

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽释放因子2：反平行异三聚体链B

<400> 36

Val Val Asp Thr Leu Asp Gln Met Lys Gln Gly Leu Glu Asp Val Ser

1 5 10 15

Gly Leu Leu Glu Leu Ala Val Glu Ala Asp Asp Glu Glu Thr Phe Asn

20 25 30

Glu Ala Val Ala Glu Leu Asp Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ala Gln Leu

35 40 45

Glu Phe Arg

50

<210> 37

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP-25和SNARE：平行异四聚体链A

<400> 37

Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg

1 5 10 15

Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln

20 25 30

Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp

35 40 45

Tyr Val Glu

50

<210> 38

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP-25和SNARE：平行异四聚体链B

<400> 38

Ala Leu Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu

1 5 10 15

Asn Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu

20 25 30

Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu

35 40 45

His Ala Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala

50 55 60

Val Lys Tyr

65

<210> 39

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP-25和SNARE：平行异四聚体链C

<400> 39

Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser

1 5 10 15

Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp

20 25 30

Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu

35 40 45

Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu

50 55 60

Ala Glu Lys Asn Leu

65

<210> 40

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP-25和SNARE：平行异四聚体链D

<400> 40

Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg

1 5 10 15

Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln

20 25 30

Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp

35 40 45

Tyr Val Glu

50

<210> 41

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Lac阻遏物：平行同四聚体

<400> 41

Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln Val

1 5 10 15

Ser Arg Leu Glu

20

<210> 42

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 载脂蛋白E：反平行异四聚体

<400> 42

Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu

1 5 10 15

Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser

20 25 30

Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met Asp Glu Thr Met Lys

35 40 45

Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Ala Arg

50 55 60

Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met

65 70 75 80

Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala

85 90 95

Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His

100 105 110

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln

115 120 125

Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala

130 135

<210> 43

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 异二聚化结构域

<400> 43

Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu

1 5 10 15

Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln

20 25

<210> 44

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 异二聚化结构域

<400> 44

Gln Leu Glu Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu

1 5 10 15

Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Leu Ala Gln

20 25

<210> 45

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 二聚化和对接结构域(DDD1)

<400> 45

Ser His Ile Gln Ile Pro Pro Gly Leu Thr Glu Leu Leu Gln Gly Tyr

1 5 10 15

Thr Val Glu Val Leu Arg Gln Gln Pro Pro Asp Leu Val Glu Phe Ala

20 25 30

Val Glu Tyr Phe Thr Arg Leu Arg Glu Ala Arg Ala

35 40

<210> 46

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 锚定结构域(AD1)

<400> 46

Val Gln Ile Glu Tyr Leu Ala Lys Gln Ile Val Asp Asn Ala Ile Gln

1 5 10 15

Gln Ala

<210> 47

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的COMP

<400> 47

Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys

1 5 10 15

Asp Ala Cys Gly

20

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点

<400> 48

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

Claims (38)

1.嵌合抗原受体(CAR)形成多肽，其包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)卷曲螺旋间隔物结构域；

(iii)跨膜结构域；和

(iv)胞内域。

2.根据权利要求1所述的CAR形成多肽，其中所述抗原结合结构域结合以低密度在靶细胞上表达的抗原。

3.根据权利要求2所述的CAR形成多肽，其中所述抗原结合结构域结合ROR-1、Typr-1或BCMA。

4.辅助多肽，其包含：

(i)卷曲螺旋间隔物结构域；

(iii)跨膜结构域；和

(iv)胞内域。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的CAR形成多肽，或根据权利要求4所述的辅助多肽，其中所述卷曲螺旋间隔物结构域实现至少三个CAR形成多肽/辅助多肽的多聚化。

6.根据权利要求5所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述卷曲螺旋间隔物结构域来自：软骨低聚基质蛋白(COMP)、甘露糖结合蛋白A、卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1(coiled-coilserine-rich protein 1)、多肽释放因子2、SNAP-25、SNARE、Lac阻遏物(Lac repressor)或载脂蛋白E。

7.根据权利要求6所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述卷曲螺旋间隔物结构域包含如SEQ ID No.1或30至42所示的序列之一，或其片段或其具有至少80％的序列同一性的变体。

8.根据前述权利要求中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述胞内域包含CD3zeta胞内域、CD28胞内域、41BB胞内域和OX40胞内域中的至少一种。

9.根据前述权利要求中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述胞内域包含如SEQ ID No.7所示的序列，或其具有至少80％序列同一性的变体。

10.根据前述权利要求中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述胞内域包含异二聚化结构域，其能够与细胞内信号传导组分异二聚化。

11.根据权利要求10所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述异二聚化结构域包含以下之一：亮氨酸拉链结构域，DDD1或AD1结构域；Barnase或Barnstar结构域；人胰腺RNA酶或S肽结构域。

12.根据前述权利要求中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其包含能够与另一CAR形成桥的元件。

13.根据权利要求10所述的CAR形成多肽或辅助多肽，其中所述元件能够与含有此类元件的另一CAR形成多肽或辅助多肽形成二硫桥。

14.多聚嵌合抗原受体(CAR)，其包含多个如前述权利要求中任一项定义的CAR形成多肽。

15.多聚嵌合抗原受体(CAR)，其包含一个或多个如权利要求1至11中任一项定义的CAR形成多肽和一个或多个如权利要求1至11中任一项定义的辅助多肽。

16.根据权利要求12或13所述的多聚CAR，其中所述CAR形成多肽和/或辅助多肽包含不同的胞内域。

17.根据权利要求12至14中任一项所述的多聚CAR，其包含具有不同的抗原结合结构域的至少两个CAR形成多肽。

18.接合复合物(engaged complex)，其包含根据权利要求12至15中任一项所述的第一和第二多聚CAR，其中所述第一多聚CAR与所述第二多聚CAR形成桥，使得所述第一和第二多聚CAR接合以形成复合物。

19.根据权利要求16的接合复合物，其中所述桥是二硫桥。

20.嵌合抗原受体(CAR)信号传导系统，其包含：

(i)包含如权利要求10或11中定义的CAR形成多肽或辅助多肽的多聚CAR，所述CAR形成多肽或辅助多肽包含第一异二聚化结构域；和

(ii)细胞内信号传导组分，其包含信号传导结构域和第二异二聚化结构域；

其中所述第一和第二异二聚化结构域之间的异二聚化导致所述多聚CAR和信号传导组分形成功能性CAR复合物。

21.根据权利要求20所述的CAR信号传导系统，其中所述或每个CAR形成多肽或辅助多肽包含多个异二聚化结构域，使得单个CAR形成多肽或辅助多肽能够与多个信号传导组分异二聚化。

22.根据权利要求20或21所述的CAR信号传导系统，其中每个信号传导组分包含多个信号传导结构域。

23.核酸，其编码根据权利要求1至13中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽。

24.核酸构建体，其编码两个或更多个如权利要求1至3和5至13中任一项定义的CAR形成多肽。

25.核酸构建体，其编码至少一个如权利要求1至3和5至13中任一项定义的CAR形成多肽和至少一个如权利要求4至13中任一项定义的辅助多肽。

26.核酸构建体，其编码：

(i)至少一个如权利要求1至3和5至13中任一项定义的CAR形成多肽，其形成如权利要求20至22中任一项定义的多聚CAR；和

(ii)如权利要求20至22中任一项定义的细胞内信号传导组分。

27.载体，其包含根据权利要求23所述的核酸序列或根据权利要求24至26中任一项所述的核酸构建体。

28.根据权利要求27所述的载体，其是逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

29.细胞，其表达根据权利要求1至13中任一项所述的CAR形成多肽或辅助多肽；根据权利要求20至22中任一项所述的CAR信号传导系统；根据权利要求14至17中任一项所述的多聚CAR；或根据权利要求18或19所述的接合复合物。

30.根据权利要求29所述的细胞，其是T细胞或NK细胞。

31.药物组合物，其包含根据权利要求29或30所述的细胞。

32.根据权利要求30或31所述的细胞，其用于治疗疾病。

33.根据权利要求29或30所述的细胞在制造用于治疗疾病的药物中的用途。

34.用于治疗疾病的方法，其包括将根据权利要求29或30的细胞施用至受试者的步骤。

35.根据权利要求32使用的细胞，根据权利要求33所述的用途，或根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病是癌症。

36.根据权利要求35的细胞、用途或方法，其中所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、黑色素瘤、或骨髓瘤。

37.用于制造根据权利要求29或30所述的细胞的方法，其包括将根据权利要求23所述的核酸，根据权利要求24至26中任一项所述的核酸构建体，或根据权利要求27或28所述的载体引入细胞的步骤。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。