CN112771076A - 嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合低密度靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)，其包含Fab抗原结合结构域。本发明还涉及表达此类CAR的细胞及其在疾病治疗中的用途。

Description

嵌合抗原受体
发明领域
本发明涉及与低密度靶抗原如B细胞成熟抗原(BCMA)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
发明背景
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤(骨髓瘤)是浆细胞的骨髓恶性肿瘤。异常浆细胞的集合在骨髓中积累，在那里它们干扰正常血细胞的产生。骨髓瘤是美国第二常见的血液学恶性肿瘤(在非霍奇金淋巴瘤之后)，并且占血液学恶性肿瘤的13％和所有癌症的1％。该疾病在痛苦和医疗支出方面是繁重的，因为它导致病理性骨折、易感染、死亡前的肾衰竭以及随后骨髓衰竭。
与许多淋巴瘤不同，骨髓瘤目前无法治愈。淋巴瘤中使用的标准化疗剂对骨髓瘤基本无效。此外，由于浆细胞中CD20表达缺失，利妥昔单抗(Rituximab)不可以针对该疾病使用。新药剂如Bortezamib和Lenolidomide部分有效，但未能导致长期缓解。
因此，需要具有增加的功效和改善的长期效果的用于治疗骨髓瘤的替代药物。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体是以其通常形式将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应子功能的蛋白质。它们通常的形式是I型跨膜结构域蛋白，其中抗原识别氨基末端、间隔区、跨膜结构域都连接至复合胞内域，该复合胞内域传输T细胞存活和活化信号。
这些分子的最常见形式使用衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)来识别靶抗原。scFv经由间隔区和跨膜结构域与信号传导胞内域融合。此类分子响应于scFv对其靶标的识别导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀伤表达靶抗原的靶细胞。已经开发出几种针对肿瘤相关抗原的CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正处于临床试验中，用于治疗各种癌症。Carpenter等人(2013,Clin Cancer Res 19(8)2048-60)描述了一种CAR，其掺入了针对B细胞成熟抗原(BCMA)的scFv。
BCMA是在成熟淋巴细胞(即记忆B细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞)中优先表达的跨膜蛋白质。BCMA还在多发性骨髓瘤细胞上表达。
Carpenter等人证明了经转导以表达抗BCMACAR的T细胞能够从骨髓瘤患者的浆细胞瘤中特异性杀伤骨髓瘤细胞。
尽管使用抗BCMA抗体的CAR方法显示出了希望，但靶向这种抗原时要特别注意的是与例如淋巴瘤细胞上的CD19相比，骨髓瘤细胞上BCMA的密度特别低。尽管CAR-T细胞介导的治疗在临床上已显示出针对诸如CD19或GD2的丰富靶抗原的成功，但据报道嵌合抗原受体无法响应非常低密度的抗原。
例如，一项靶向间变性淋巴瘤激酶(ALK)的CAR-T研究表明，CAR-T细胞在人类神经母细胞瘤的两种异种移植模型中具有有限的抗肿瘤功效。据表明，细胞因子产生高度依赖于ALK靶标密度，而神经母细胞瘤细胞系上ALK的靶标密度不足以最大程度地激活CAR T细胞(Walker et al.(2017)Mol.Ther.25,2189–2201)。
另一项研究涉及使用抗CD22 CAR-T细胞治疗复发和/或难治性前B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，尽管观察到剂量依赖性抗白血病活性，但也观察到一些复发。复发与CD22位点密度降低有关，认为CD22位点密度降低使CD22+细胞逃逸而免于被CD22 CAR T细胞杀伤(Fry et al.(2017)Nat.Med.doi:10.1038/nm.4441)。
CAR T细胞活化从杀伤到细胞因子释放再到增殖存在层级。CAR T细胞可以杀伤具有低密度抗原的靶细胞，但无法完全活化。
因此，需要能够杀伤表达低密度靶抗原的靶细胞的替代性CAR T细胞方法。
附图说明
图1：BCMA在多发性骨髓瘤患者中的表达
图2：嵌合抗原受体的不同结合结构域形式
(a)Fab CAR形式；(b)dAb CAR形式；(c)scFv CAR形式
图3：阐明经典CAR-T细胞与以低密度表达靶抗原的靶细胞之间相互作用的示意图。(a)处于其基态的CAR T细胞膜；(b)CAR T细胞膜与高密度表达靶标的细胞形成免疫突触；(c)响应于具有低密度抗原的靶细胞的CAR T细胞膜。
图4：阐明组成型活性嵌合细胞因子受体的示意图。嵌合跨膜蛋白包含二聚化结构域和细胞因子受体胞内域。所示的实施方案具有“Fab”型结构，因为二聚化结构域包含抗体型重链和轻链恒定区。这些结构域之间恒定的二聚化将IL2受体共同γ链与IL-2受体β链或IL-7受体α链聚集在一起，从而导致组成型细胞因子信号传导。
图5：比较scFv和FabCAR形式的抗BCMACAR的杀伤测定的结果。将表达CAR的细胞与非BCMA表达(SupT1 NT)、低BCMA表达(SupT1BCMA低)或非常低BCMA表达(JeKo-1)的靶细胞以1:4(图5A)或1:8(图5B)比率共培养。先前表征的抗BCMACAR(bb2121)用作阳性对照。24小时后，通过FACS测定靶细胞的杀伤，并将靶细胞计数相对于用未转染的T细胞(NT)获得的计数进行标准化。
图6：比较scFv和FabCAR形式的抗BCMA CAR的杀伤测定的结果。将表达CAR的细胞与非BCMA表达(SupT1 NT)、低BCMA表达(SupT1BCMA低)或非常低BCMA表达(JeKo-1)的靶细胞以1:4(图6A)或1:8(图6B)比率共培养。先前表征的抗BCMACAR(bb2121)用作阳性对照。72小时后，通过FACS测定靶细胞的杀伤，并将靶细胞计数相对于用未转染的T细胞(NT)获得的计数进行标准化。
图7：与靶细胞共培养后，表达scFv或FabCAR形式的抗BCMACAR的T细胞的IFNγ产生。
将表达CAR的细胞与非BCMA表达(图7A)或低BCMA表达(图7B)的靶细胞以1:4或1:8比率共培养。先前表征的抗BCMACAR(bb2121)用作阳性对照。24小时后，通过ELISA测定IFNγ产生
图8：与靶细胞共培养后，表达scFv或FabCAR形式的抗BCMA CAR的T细胞的CD4和CD8细胞计数。
将表达CAR的细胞与非BCMA表达(SupT1 NT)、低BCMA表达(SupT1BCMA低)、非常低BCMA表达(JeKo-1)或MM.1s靶细胞以1:1比率共培养96小时。通过对CD3和标志物RQR8进行门控，然后对CD8+或CD8-进行门控来获得CD4(图8A)和CD8(图8B)T细胞的整个细胞计数。
图9：阐明可切割的FabCAR的示意图
可切割的FabCAR包含两个抗原结合结构域：外部(膜-远端)结合结构域1和内部(膜-近端)结合结构域2。结合结构域1和2通过可切割的接头接合。通过例如基质金属蛋白酶(MMP)切割接头来去除结合结构域1。在没有切割的情况下，当FabCAR完整时，由于位阻，外部结构域的存在部分地阻闭内部结合结构域。内部结构域在重链和轻链切割时被激活。
图10：阐明实施例7中描述的可溶性抗体的示意图。
设计具有两个可变结构域，以及针对BCMA的外部结合结构域(抗BCMA D8)和针对CD19的内部结合结构域(抗CD19 CAT)的可溶性抗体。在一条链上的VH结构域和另一条链上的VL结构域之间包括MMP-9可切割的接头。含VH的链也包含抗体的Fc部分。
图11：显示在MMP-9存在下温育后，可溶性抗体(D8-MMP9-CAT19)随时间的切割百分比的图。具有不包含MMP-9切割位点的混杂接头(scrambled linker)的等效抗体(D8-混杂-CAT19)用作阴性对照。
图12：显示未经处理或用MMP-9处理后，通过ELISA，可溶性抗体(D8-MMP9-CAT19)或具有混杂接头的阴性对照(D8-混杂-CAT19)的CD19结合的图。
图13：显示未经处理(D8-MMP9-CAT19)或用MMP-9处理(切割的D8-MMP9-CAT19)后，可溶性抗体针对CD19的结合动力学的图。CD-19单克隆抗体(CAT19 IgG)用作阳性对照。
发明概述
本发明人已经发现，对于靶向低密度靶抗原的CAR-T细胞，使用具有Fab抗原结合结构域的CAR导致更有效的CAR介导的信号传导。
因此，在第一方面，本发明提供了结合低密度靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含Fab抗原结合结构域。
靶抗原可以以小于每靶细胞1500个拷贝的平均密度表达。
靶抗原可以选自：ROR1、Tyrp-1、TACI、ALK和BCMA。例如，靶抗原可以是BCMA。
在本发明的第一方面的替代实施方案中，Fab抗原结合结构域可以包含结合第一靶抗原的第一结合结构域和结合第二靶抗原的第二结合结构域。
第一靶抗原或第二靶抗原可以是BCMA。
在该实施方案中，FabCAR可以包含第一结合结构域和第二结合结构域之间的可切割的接头。
接头可以是用药剂如酶可切割的。例如，接头可以是用基质金属蛋白酶(MMP)可切割的。可以在施用本发明的表达CAR的细胞之前或之后将药剂施用于受试者，以切割掉第一结合结构域并显露出第二结合结构域。或者，如果在特定位点表达切割剂(例如酶)，则切割可以自然发生在体内的该位点处。该位点可以是例如炎症部位或肿瘤部位。
在第二方面，本发明提供了核酸序列，其编码根据本发明第一方面的CAR。
在第三方面，本发明提供了核酸构建体，其编码根据本发明第一方面的CAR，并且具有以下一般结构之一：
VH-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL-CL；
VL-CL-coexpr-VH-CH-spacer-TM-endo；
VL-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH-CH；或
VH-CH-coexpr-VL-CL-spacer-TM-endo；
其中：
VH是编码重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一多肽和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL是编码轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
在本发明第三方面的替代实施方案中，核酸构建体可以具有以下一般结构之一：
VH1-L1-VH2-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL1-L2-VL2-CL；
VL1-L1-VL2-CL-coexpr-VH1-L2-VH2-CH-spacer-TM-endo；
VL1-L1-VL2-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH1-L2-VH2-CH；或
VH1-L1-VH2-CH-coexpr-VL1-L2-VL2-CL-spacer-TM-endo；
其中：
VH1是编码第一结合结构域的重链可变区的核酸序列；
L1和L2可以相同或不同，是可切割的接头；
VH2是编码第二结合结构域的重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL1是编码第一结合结构域的轻链可变区的核酸序列；
VL2是编码第二结合结构域的轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
核酸构建体还可以编码具有结构域抗体(dAb)、scFv或Fab抗原结合结构域的第二嵌合抗原受体。
第二嵌合抗原受体可以结合以下抗原之一：CD19、FcRL5和TACI。
在第四方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明第二方面的核酸序列或根据本发明第三方面的核酸构建体。
在第五方面，本发明提供了细胞，其表达根据本发明第一方面的CAR。
细胞可以表达根据本发明第一方面的第一CAR和如上所定义的第二嵌合抗原受体。
细胞还可以表达组成型活性细胞因子受体。
在第六方面，本发明提供了用于制备根据本发明第五方面的细胞的方法，其包括将以下项离体引入细胞中的步骤：根据本发明第二方面的核酸序列；根据本发明第三方面的核酸构建体；或根据本发明第四方面的载体。
在第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明第五方面的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在第八方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法，其包括将根据本发明第七方面的药物组合物施用于受试者的步骤。
癌症可以是多发性骨髓瘤。
在第九方面，本发明提供了根据本发明第七方面的药物组合物，其用于治疗癌症。
在第十方面，本发明提供了根据本发明第五方面的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
本发明提供了嵌合抗原受体，其在靶向以低密度在靶细胞上表达的抗原时，显示出改善的CAR介导的信号传导和靶细胞杀伤。此类抗原难以用经典CAR靶向，因为它们形成了次优的T细胞:靶细胞突触(图3)。
靶向此类抗原的能力为癌症治疗开辟了全新的可能性。许多潜在有用的癌症靶抗原在靶细胞上以低密度表达，如ROR1、Tyrp-1、TACI、ALK和BCMA。本发明提供了靶向这些抗原的改善的构建体，使它们能够用作单一靶标，并且重要的是，使它们能够被包括在靶向多种抗原的策略中，以提高CAR-T细胞效力和安全性。
其他方面
本发明还提供了在以下编号的段落中概括的方面。
1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含Fab抗原结合结构域，所述Fab抗原结合结构域包含结合第一靶抗原的第一结合结构域和结合第二靶抗原的第二结合结构域。
2.根据段落1的CAR，其包含所述第一结合结构域和第二结合结构域之间的可切割接头。
3.根据段落2的CAR，其中所述接头是用基质金属蛋白酶(MMP)可切割的。
4.根据前述段落中任一项的CAR，其中所述第一靶抗原在肿瘤部位表达，因此当将表达所述CAR的细胞施用于癌症患者时，其归巢于所述受试者内的肿瘤部位。
5.根据前述段落中任一项的CAR，其中所述第二靶抗原在肿瘤部位以及在一个或多个正常组织上表达。
6.根据前述段落中任一项的CAR，其中所述第一靶抗原和/或第二靶抗原选自以下组：BCMA、ROR1、Tyrp-1、TACI、ALK、ErbB2、MUC1、CD33、CD123、PSMA、EpCAM、GD2、NCAM、叶酸结合蛋白和MUC16。
7.根据段落1至5中任一项的CAR，其中所述第一靶抗原/第二靶抗原选自以下抗原对之一：ErbB2和MUC1；CD33和CD123；PSMA和EpCAM；GD2和NCAM；叶酸结合蛋白和MUC16。
8.根据段落7的CAR，其中所述第一靶抗原/第二靶抗原是表2中所示的靶抗原对之一。
9.核酸序列，其编码根据前述段落中任一项的CAR。
10.核酸构建体，其编码根据段落1至8中任一段的CAR，并具有以下一般结构之一：
VH1-L1-VH2-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL1-L2-VL2-CL；
VL1-L1-VL2-CL-coexpr-VH1-L2-VH2-CH-spacer-TM-endo；
VL1-L1-VL2-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH1-L2-VH2-CH；或
VH1-L1-VH2-CH-coexpr-VL1-L2-VL2-CL-spacer-TM-endo
其中：
VH1是编码所述第一结合结构域的重链可变区的核酸序列；
L1和L2可以相同或不同，是可切割的接头；
VH2是编码所述第二结合结构域的重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一多肽和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL1是编码所述第一结合结构域的轻链可变区的核酸序列；
VL2是编码所述第二结合结构域的轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
11.载体，其包含根据段落9的核酸序列或根据段落10的核酸构建体。
12.细胞，其表达根据段落1至8中任一项的CAR。
13.用于制备根据段落12的细胞的方法，其包括将以下项离体引入细胞中的步骤：根据段落9的核酸序列；根据段落10的核酸构建体；或根据段落11的载体。
14.药物组合物，其包含多个根据段落12的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
15.用于治疗癌症的方法，其包括将根据段落14的药物组合物施用于受试者的步骤。
16.根据段落14的药物组合物，其用于治疗癌症。
17.根据段落12的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
发明详述
嵌合抗原受体
本发明涉及具有Fab抗原结合结构域的嵌合抗原受体。
经典的嵌合抗原受体(CAR)是一种嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原识别结构域(结合物)连接到细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合物通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但是它可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。通常需要间隔区结构域以将结合物与膜分开并允许其适当的定向。使用的常见间隔区结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足条件，例如来自CD8α的茎，以及甚至仅仅单独的IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中，并将间隔区连接至胞内域。
早期的CAR设计具有衍生自FcεR1的γ链或CD3ζ的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足以触发同源靶细胞的T细胞杀伤，但无法完全活化T细胞增殖和存活。为了克服此限制，已经构建了复合胞内域：T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3ζ的细胞内部分的融合产生第二代受体，该受体可以在抗原识别后同时传输活化信号和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最有力的共刺激信号——即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，如传输存活信号的密切相关的OX40和41BB。现在已经描述了甚至更有力的第三代CAR，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。
当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输到表达它的T细胞。因此，CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引导到表达靶定抗原的肿瘤细胞。
因此，CAR通常包含：(i)抗原结合结构域；(ii)间隔区；(iii)跨膜结构域；和(iii)细胞内结构域，其包含信号传导结构域或与信号传导结构域缔合。
CAR可以具有以下一般结构：
抗原结合结构域-间隔区结构域-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域(胞内域)。
抗原结合结构域
抗原结合结构域是嵌合受体识别抗原的部分。在经典CAR中，抗原结合结构域包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)(参见图2c)。还已经用结构域抗体(dAb)或VHH抗原结合结构域产生了CAR(参见图2b)。
在本发明的嵌合抗原受体中，抗原结合包含例如单克隆抗体的Fab片段(参见图2a)。FabCAR包含两条链：一条具有抗体样轻链可变区(VL)和恒定区(CL)；且一条具有重链可变区(VH)和恒定区(CH)。一条链还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CL和CH之间的缔合引起受体的组装。
Fab CAR的两条链可以具有以下一般结构：
VH-CH-间隔区-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；和
VL-CL
或者
VL-CL-间隔区-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；和
VH-CH。
对于本文所述的Fab型嵌合受体，抗原结合结构域由来自一条多肽链的VH和来自另一条多肽链的VL组成。
多肽链可以包含在VH/VL结构域和CH/CL结构域之间的接头。接头可以是柔性的，并且用于将VH/VL结构域与CH/CL结构域在空间上分开。
柔性接头可以由小的非极性残基(如甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸)组成。接头可以包含甘氨酸-丝氨酸接头的一个或多个重复，如(Gly4Ser)n(SEQ ID No.78)接头，其中n是重复的数目。所述接头或每个接头的长度可以小于50、40、30、20或10个氨基酸。
本发明还提供了可切割的FabCAR，其包含结合第一靶抗原的第一结合结构域和结合第二靶抗原的第二结合结构域。在图9中示意性地阐明了此类可切割的Fab CAR。
可切割的Fab CAR可以包含第一和第二结合结构域之间的可切割的接头。
可切割的Fab CAR的两条链可以具有以下一般结构：
VH1-VH2-CH-间隔区-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；和
VL1-VL2-CL
或者
VL1-CL1-间隔区-跨膜结构域-细胞内信号传导结构域；和
VH2-CH2。
在可切割的FabCAR中，在没有切割的情况下，由于第一结合结构域的位阻，膜-近端结合结构域(图9中的结合结构域2)的可及性降低。切割后，结合结构域1的去除导致结合结构域2的可及性增加，因此在其靶抗原存在下其得以激活。
可以通过药剂如小分子或酶如蛋白酶切割可切割的接头。可以将药剂施用于患者以切割接头并激活或增强经由第二结合结构域的信号传导。或者，切割剂可以在体内天然表达，例如在炎症或肿瘤生长/转移的部位表达。
基质金属蛋白酶(MMP)是一组负责在器官发生和生长期间大多数细胞外基质蛋白质降解的酶。MMP在成人组织中的表达和活性通常较低，但在包括炎症和癌症在内的各种病理状况下均显著增加。
MMP是具有共同结构域结构的钙依赖性含锌内肽酶。这三个共同结构域是前肽、催化结构域和通过柔性铰链区与催化结构域连接的血色素结合蛋白(haemopexin)样C端结构域。
MMP几乎存在于所有人类癌症中；它们可以由邻近基质中的成纤维细胞、与癌症相关的成纤维细胞和/或由非成纤维细胞性癌细胞表达。因此，MMP可以通过促进血管生成、肿瘤生长和转移来影响肿瘤环境。因此，MMP表达与肿瘤侵袭性、分期和患者预后有关。
MMP表达的增加与癌细胞增殖的增加和肿瘤大小的增加有关。已发现MMP家族的几个每一个成员在人类癌症中均失调，其中MMP-1,-2,-7,-9,-13和-14最常受到影响。
在本发明的可切割的FabCAR中，第一结合结构域和第二结合结构域之间的接头可以用MMP切割，特别是选自MMP-1,-2,-7,-9,-13和-14的MMP。
已知可用MMP酶切割的各种序列，例如：
MMP-1：PLGLWA(SEQ ID No.85)
MMP-2：PAGLAG(SEQ ID No.86)
MMP-9：PLGLAG(SEQ ID No.87)
本发明的可切割的FabCAR的可切割接头序列可以包含如SEQ ID No.85至87所示的序列之一。
恒定区结构域
人类中存在两种类型的轻链：kappa(κ)链和lambda(λ)链。lambda类具有4种亚型：λ1、λ2、λ3和λ4。Fab型嵌合受体的轻链恒定区可以衍生自这些轻链类型中的任何一种。
本发明的嵌合受体的轻链恒定结构域可以具有如SEQ ID NO.1所示的序列，其为kappa链恒定结构域。
SEQ ID No.1
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
哺乳动物免疫球蛋白重链存在五种类型：γ、δ、α、μ和ε，其分别定义了免疫球蛋白IgG、IgD、IgA、IgM和IgE类别。重链γ、δ和α具有由三个串联Ig结构域组成的恒定结构域，并且具有铰链以增加柔性。重链μ和ε由四个结构域组成。
本发明的Fab型嵌合受体的CH结构域可以包含如SEQ ID No.2所示的序列，其来自γ免疫球蛋白重链。
SEQ ID No.2
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
间隔区
经典CAR包含间隔区序列以将抗原结合结构域与跨膜结构域连接并且将抗原结合结构域与胞内域在空间上分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域以不同方向定向以促进结合。
如在经典的嵌合抗原受体(图2c)和dAb CAR(图2b)中，在Fab CAR(图2a)中，间隔区可以导致多肽链中的两条二聚化。多肽链中的两条可以，例如，包含一个或多个合适的半胱氨酸残基以形成一个或多个二硫化物桥。来自IgG1的铰链在这方面是合适的。基于IgG1铰链的间隔区可以具有如SEQ ID.No.3所示的序列。
SEQ ID No.3(人IgG1铰链)：
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
或者，铰链间隔区可以具有如SEQ ID No.4所示的序列。
SEQ ID No.4(铰链间隔区)
EPKSCDKTHTCPPCP
跨膜结构域
跨膜结构域是嵌合受体跨越膜的部分。跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域可以用于提供嵌合受体的跨膜部分。蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领结构域技术人员使用TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)确定。或者，可以使用人工设计的TM结构域。
胞内域
胞内域是嵌合受体的信号传输部分。它可以是嵌合受体的细胞内结构域的一部分或与之缔合。抗原识别后，受体簇天然CD45和CD148从突触中排除，且信号传输到细胞。最常用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的胞内域组分。抗原结合后，其向T细胞传输激活信号。CD3-zeta可能不提供完全足够的激活信号，并且可能需要另外的共刺激信号传导。共刺激信号促进T细胞增殖和存活。共刺激信号存在两种主要类型：属于Ig家族(CD28、ICOS)和TNF家族(OX40、41BB、CD27、GITR等)的共刺激信号。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-Zeta一起使用来传输增殖/存活信号，或者可以将全部三种一起使用。
胞内域可以包含：
(i)含有ITAM的胞内域，如来自CD3 zeta的胞内域；和/或
(ii)共刺激结构域，如来自CD28或ICOS的胞内域；和/或
(iii)传输存活信号的结构域，如TNF受体家族胞内域，如OX-40、4-1BB、CD27或GITR。
已经描述了许多系统，其中抗原识别部分位于与信号传输部分分开的分子上，如WO015/150771；WO2016/124930和WO2016/030691中描述的那些。因此，本发明的嵌合受体可以包含含有抗原结合结构域和跨膜结构域的抗原结合组分；其能够与包含信号传导结构域的单独的细胞内信号传导组分相互作用。本发明的载体可以表达包含此类抗原结合组分和细胞内信号传导组分的嵌合受体信号传导系统。
嵌合受体可以包含信号肽，以使得当其在细胞内表达时，新生蛋白质被引导至内质网，随后被引导至表达它的细胞表面。信号肽可以在分子的氨基末端。
靶抗原
“靶抗原”是被本发明的嵌合受体的抗原结合结构域特异性识别并结合的实体。
靶抗原可以是癌细胞上存在的抗原，例如肿瘤相关抗原。
CAR的靶抗原可以在靶细胞上以相对低的密度表达。
本发明的细胞可以能够杀伤表达低密度的CAR靶抗原的靶细胞，如癌细胞。已知在某些癌症中以低密度表达的肿瘤相关抗原的实例包括但不限于CLL中的ROR1，黑素瘤中的Typr-1，骨髓瘤中的BCMA和TACI以及神经母细胞瘤中的ALK。
实施例1描述了探究骨髓瘤细胞上BCMA的表达的研究。发现骨髓瘤细胞表面上的BCMA拷贝数的范围很低：处于每细胞348.7-4268.4个BCMA拷贝，平均值为1181且中位数为1084.9(图1)。
CAR的靶抗原的平均拷贝数可以小于每靶细胞约10000；5000；3000；2000；1000；或500个拷贝。
可以使用标准技术，如使用如实施例1中所述的PE Quantibrite珠来测量细胞如癌细胞上的抗原的拷贝数。
CAR的靶抗原可以由靶细胞表达，其平均拷贝数为每细胞1500个拷贝或更少，或每细胞1000个拷贝或更少。
靶抗原可以是例如BCMA、ROR1、Tyrp-1、TACI或ALK。
BCMA
B细胞成熟靶标也称为BCMA、TR17_HUMAN、TNFRSF17(UniProt Q02223)，是在成熟淋巴细胞(例如记忆B细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞)中表达的跨膜蛋白质。BCMA也在骨髓瘤细胞上表达。BCMA是非糖基化的III型跨膜蛋白质，其参与B细胞的成熟、生长和存活。
与BCMA结合的CAR或TanCAR的抗原结合结构域可以是能够结合BCMA的任何结构域。下面给出了十四种抗BCMA抗体的VH和VL序列，其中以粗体和下划线显示了CDR序列。
SEQ ID No.5(抗BCMA Ab1 VH)
QIQLVQSGPELVKPGSSVKLSCKTSGFTFSDSYMSWLKQVPGQSIEWIGNIYAGDGATHYHQKFKGKATLTVDTSSSTAYMDLSSLTSEDSALYFCARPLYTTAYYYVGGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.6(抗BCMA Ab1 VL)
DIVMTQSPSSLAVSAGETVTINCKSSQSLLSSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAIYYCQQYYDTPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID No.7(抗BCMA Ab2 VH)
EVKLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISTSGDTIYYRDSVKGRFTVSRDKAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARHDYYDGYQSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.8(抗BCMA Ab2 VL)
NTVMTQSPTSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDAAFYYCQRIYNSALTFGSGTKLEIK
SEQ ID No.9(抗BCMA Ab3 VH)
QVQLQQSGAALVKPGASVKMSCKASGYTFTDYWVSWVKQSHGKSLEWIGEIYPNSGPTNFNKKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSRLTSEDSAIYYCTPRTVAPYNWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.10(抗BCMA Ab3 VL)
DIVLTQSPALAVSPGERVSISCRASESVSTRMHWYQQKPGQQPKLLIYGASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNDPYTFGAGTKLELK
SEQ ID No.11(抗BCMA Ab4 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCSASGFIFSNFDMAWVRQAPRKGLEWVASITTSGGDTHYRDSVKGRFTVSRHNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARHVYYGLFWFFDFWGPGTMVTVSS
SEQ ID No.12(抗BCMA Ab4 VL)
NTVMTQSPKSIFISVGDRVTVNCKASQNVGTNVDWYQQKTGQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISNMQAEDLAVYYCMQSNTNPFTFGAGTKLELKR
SEQ ID No.13(抗BCMA Ab5 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISTSGDTIYYRDSVKGRFTVSRDKAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARHDYYDGYQSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.14(抗BCMA Ab5 VL)
DIVMTQSPSTLPASLGERVTISCRASQSISNYLNWYQQKPDGTIKPLIYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEPEDFAMYYCQQDASFPWTFGGGTKLELKR
SEQ ID No.15(抗BCMA Ab6 VH)
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYPITNNYDWSWIRQFPGNKMEWMGYISDSGNTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASGYISYIPFAFWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.16(抗BCMA Ab6 VL)
DIVLTQSPALAVSLGQRATISCRASQSVSISSYNLMQWYQQKPGQQPKLLIYDASNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTIDPVQADDIATYYCQQSKDDPNTFGAGTKLEIKR
SEQ ID No.17(抗BCMA Ab7 VH)
EVQLQESGPGLVQPSQTLSLTCSVTGYPITNNYDWSWIRKFPGNKMEWMGYISDSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASGYISYIPFGFWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.18(抗BCMA Ab7 VL)
DIVLTQSPALAVSPGERVTISCRASESVSTRMHWYQQKPGQQPKLLIYGASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNDPPTFGSGTKLEIK
SEQ ID No.19(抗BCMA Ab8 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISTSGDTIYYRDSVKGRFTVSRDKAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARHDYYDGYQSFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.20(抗BCMA Ab8 VL)
DIVMTQSPASQAVSAGEKVTMSCKSSQSLLYSGDQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYLASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYYCQQHYSYPLTFGSGTKLEIK
SEQ ID No.21(抗BCMA Ab9 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISTSGDTIYYRDSVKGRFTVSRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCTRHGYYDGYQSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.22(抗BCMA Ab9 VL)
NTVMTQSPKSMSISVGDRVTMNCKASQNVGNNIAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGGGYGTDFTLTINSVQAEDAATYYCQQWNYPSITFGSGTKLEIK
SEQ ID No.23(抗BCMA Ab10 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGGSTYYRDSVKGRFTVSRDNAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYCTRGDYGYNYAYWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.24(抗BCMA Ab10 VL)
DIVMTQAPSSMPASLGERVTISCRASQGISNYLNWYQQKPDGTIKPLIYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEPEDFAMYYCQQYDSSPLTFGAGTKLELK
SEQ ID No.25(抗BCMA Ab11 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCEASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISTSGDSIYYRDSVKGRFTVSRDNVKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCARHGYYDGYQSFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.26(抗BCMA Ab12 VL)
DIVMTQSPSSLPASLGERVTISCRASQGISNNLNWYQQKPDGTIKPLIYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLEPEDFATYYCQQDETFPYTFGAGTKLELK
SEQ ID No.27(抗BCMA Ab13 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYDMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGGSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATHNYYDGSSLFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.28(抗BCMA Ab13 VL)
DIVLTQSPALAVSPGERVTISCGANETVSTLVHWYQQKPGQQPKLLIYLASHLESGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYYCQQSWNDPPTFGGGTKLELK
SEQ ID No.29(抗BCMA Ab14 VH)
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSDYNMAWVRQAPKKGLEWVATIIYDGSSTNHGDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCATRPGPFAYWGQGTLVTVS
SEQ ID No.30(抗BCMA Ab15 VL)
DVVLTQTPPTLSATIGQSVSISCRSSQSLLHSNGNTYLHWLLQRPGQSPQFLIYLVSGLGSGVPNRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGIYYCVHGTHAWTVGGGTKLELK
与BCMA结合的CAR的抗原结合结构域可以包含来自如上所述的抗BCMA Ab1至Ab14的任一个的CDR。
与BCMA结合的CAR的抗原结合结构域可以包含来自如上所述的抗BCMA Ab1至Ab14的任一个的VH和/或VL序列，或其具有至少70％、80％、90％或90％序列同一性的变体，所述变体保留结合BCMA的能力。
本发明还提供了新的结合BCMA的抗体，称为Ab1至Ab14。Ab1至Ab 14的VH、VL和CDR序列显示于以上SEQ ID No.5至30中或如以上SEQ ID No.5至30所示。
结合BCMA的抗体Ab1在CAR形式下显示出特别好的功效。例如，scFv CAR形式的Ab1与具有替代BCMA结合结构域的各种等效CAR相比，具有改善的靶细胞杀伤、IL-2释放和增殖(数据未显示)。
本发明还提供了在以下编号的段落中概括的方面。
1.抗原结合结构域，其包含：
a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)，所述VH具有SEQ ID No.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29中所示的序列；和
b)具有互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)，所述VL具有SEQ ID No.6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30中所示的序列。
2.根据段落1的抗原结合结构域，其包含：
a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-GFTFSDSY(SEQ ID No.68)
CDR2-IYAGDGAT(SEQ ID No.69)
CDR3-ARPLYTTAYYYVGGFAY(SEQ ID No.70)；和
b)具有互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-QSLLSSGNQKNY(SEQ ID No.71)
CDR2-WAS(SEQ ID No.72)
CDR3-QQYYDTPLT(SEQ ID No.73)。
3.根据段落1的抗原结合结构域，其包含：
a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-GFIFSDYN(SEQ ID No.79)
CDR2-IIYDGSST(SEQ ID No.80)
CDR3-ATRPGPFAY(SEQ ID No.81)；和
b)具有互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-QSLLHSNGNTY(SEQ ID No.82)
CDR2-LVS(SEQ ID No.83)
CDR3-VHGTHAWT(SEQ ID No.84)。
4.根据段落1的抗原结合结构域，其包含具有如SEQ ID No.5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29所示序列之一的VH结构域；和具有如SEQ ID No.6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30所示序列之一的VL结构域。
5.根据段落3的抗原结合结构域，其包含具有如SEQ ID No.5所示序列的VH结构域；和具有如SEQ ID No.6所示序列的VL结构域。
6.根据段落3的抗原结合结构域，其包含具有如SEQ ID No.29所示序列的VH结构域；和具有如SEQ ID No.30所示序列的VL结构域。
7.抗体，其包含根据前述段落中任一项的抗原结合结构域。
8.抗体-药物缀合物(ADC)或双特异性T细胞衔接器(BiTE)，其包含根据段落7的抗体。
9.嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据段落1至6中任一项的抗原结合结构域。
10.根据段落9的CAR，其是FabCAR。
11.核酸序列，其编码根据段落1至6中任一项的抗原结合结构域和根据段落6的抗体、根据段落8的ADC或BiTE、或根据段落9或10的CAR。
12.载体，其包含根据段落11的核酸序列。
13.细胞，其表达根据段落9或10的CAR。
14.用于制备根据段落13的细胞的方法，其包括将根据段落11的编码CAR的核酸序列引入细胞中的步骤。
15.药物组合物，其包含多个根据段落13的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
16.用于治疗癌症的方法，其包括将根据段落15的药物组合物施用于受试者的步骤。
17.根据段落15的方法，其中所述癌症是B细胞白血病或淋巴瘤。
18.根据段落13的细胞，其用于治疗癌症。
19.根据段落13的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
前面和后面章节中所述的例如嵌合抗原受体、核酸序列和构建体、载体、细胞、药物组合物以及制备和使用细胞的方法的一般特征也适用于以上段落中所述的相应组分。
ROR1
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)，也称为神经营养性酪氨酸激酶和受体相关1(NTRKR1)，是一种调节中枢神经系统中的神经突生长的受体酪氨酸激酶。它是一种I型膜蛋白，并属于细胞表面受体的ROR亚家族。
已显示ROR1在卵巢癌干细胞上表达，其在卵巢干细胞上似乎在促进体外迁移/侵袭或球状体形成以及免疫缺陷小鼠中的肿瘤移植中起功能性作用。用对ROR1具有特异性的人源化mAb治疗可以抑制卵巢癌细胞迁移、形成球状体或植入免疫缺陷小鼠的能力。
WO2017/072361描述了几种适用于CAR中的ROR1特异性抗体。
TACI
跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物TACI(UniProtKB:O14836)是免疫应答中的调节物，并且与BCMA一样，优先在成熟淋巴细胞中表达，所述成熟淋巴细胞如CD27+记忆B细胞，尤其是边缘区B细胞、骨髓浆细胞和骨髓瘤细胞。
另外，TACI在巨噬细胞上表达并介导巨噬细胞存活。TACI是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的淋巴细胞特异性成员，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13B(TNFRSF13B)，并且可以从细胞的表面脱落并以其可溶形式循环。与BCMA相反，生发中心B细胞中显著缺少TACI。已知TACI作为TNFSF13/APRIL和TNFSF13B/BAFF的受体起作用，并以高亲和力结合两种配体。TACI抑制B细胞扩充并促进浆细胞的分化和存活。
TACI是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，并且作为B细胞功能的关键调节物。TACI以高亲和力结合两种配体APRIL和BAFF，并在其细胞外区域含有两个富含半胱氨酸的结构域(CRD)。然而，存在另一种形式的TACI，其中通过可变剪接除去N端CRD。已经表明，该较短的形式能够进行配体诱导的细胞信号传导，并且单独的第二CRD(TACI_d2)含有对两种配体的完全亲和力(Hymowitz et al 2005Am Soc.Biochem.And Mol.Biol.Inc 280(8)7218-7227)。
已经解析了TACI_d2的晶体结构以及APRILTACI_d2和APRIL BCMA复合物的共晶结构(Hymowitz et al 2005，如上)。
TACI的CRD以及其他TNFR的CRD具有共同的序列特征，即所谓的DXL基序，其由保守的6残基序列(Phe/Tyr/Trp)-Asp-Xaa-Leu-(Val/Thr)-(Arg/Gly)(SEQ ID No.74)组成。该基序是结合APRIL或BAFF所必需的。受体基序结合在疏水口袋中并与BAFF表面上的两个保守的精氨酸残基相互作用。
与TACI结合的CAR或tanCAR的抗原结合结构域可以是能够结合TACI的任何结构域。例如，抗原结合结构域可以包含可衍生自表1中列出的市售抗TACI抗体之一的TACI结合物：
表1
Figure BDA0002993676710000221
Figure BDA0002993676710000231
抗原结合结构域可以包含来自克隆2H6、2G2、1G6或4B11的TACI结合物之一。
这些TACI结合物具有以下序列：
2H6
ScFv：
EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKASGYTFTNYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPSNDDTKYTEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTHGDYYALDYWGQGTSVTVSSGGGGAGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQSVTISCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQAPKLLIYGASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQSRKVPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.31)
CDR H1：NYVMH(SEQ ID No.32)
CDR H2：YINPSNDDTKYTEKFKG(SEQ ID No.33)
CDR H3：GTHGDYYALDY(SEQ ID No.34)
CDR L1：RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID No.35)
CDR L2：GASNVES(SEQ ID No.36)
CDR L3：QQSRKVP(SEQ ID No.37)
2G2
ScFv：
QVTLKESGPGMLQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDAQYSNPALRSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCSRIHSYYSYDEGFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSYRTFGGGTKLEIKR(SEQ ID No.38)
CDR H1：TFGMGVG(SEQ ID No.39)
CDR H2：HIWWDDAQYSNPALRS(SEQ ID No.40)
CDR H3：RIHSYYSYDEGFAY(SEQ ID No.41)
CDR L1：KASQNVGTAVA (SEQ ID No.42)
CDR L2：SASNRYT(SEQ ID No.43)
CDR L3：QQYSSY(SEQ ID No.44)
1G6
VH：
QVQLKQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVDWVRQSPGKGLEWLGIIWGGGRTNYNSAFKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCASGDRAADYWGQGTSVTVSS(SEQ ID No.45)
CDR H1：SYGVD(SEQ ID No.47)
CDR H2：IIWGGGRTNYNSAFKS(SEQ ID No.48)
CDR H3：GDRAADY(SEQ ID No.49)
VL：
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVTITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPVRFTGSGSGTDFTLTINNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID No.46)
CDR L1：KASQNVGTAVA(SEQ ID No.50)
CDR L2：SASNRYT(SEQ ID No.51)
CDR L3：QQYSSYP(SEQ ID No.52)
4B11
VH：
EVQLQQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGKIDPANGNSEYAPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTTIYYCTSGYGAYWGQGTTLTVSS(SEQ ID No.53)
CDR H1：NTYIH(SEQ ID No.55)
CDR H2：KIDPANGNSEYAPKFQG(SEQ ID No.56)
CDR H3：GYGAY(SEQ ID No.57)
VL：
DIVLSQSPSSLAVSIGEKVTLSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWFQQKPGQSLKLLIYWASTREFGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVYYCQQYYTWTFGGGTKLEIK(SEQ ID No.54)
CDR L1：KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID No.58)
CDR L2：WASTREF(SEQ ID No.59)
CDR L3：QQYYTW(SEQ ID No.60)
本发明提供抗TACI剂，如抗体、scFv、CAR或tanCAR，其包含基于克隆2H6、2G2、1G6或4B11之一的TCI结合结构域。抗TACI剂可以包含一个或多个CDR，所述CDR具有如SEQ IDNo 32-37；39-44；47-52；55-60所示的序列。药剂可以包含以下六个CDR的组中的一个：SEQID No 32-37；SEQ ID No39-44；SEQ ID No 47-52和55-60。
抗TACI剂可以包含例如Fab形式的SEQ ID No.31或38中所示的VH和/或VL序列(VH在丝氨酸-甘氨酸接头之前，VL在丝氨酸-甘氨酸接头之后)。抗TACI剂可以包含例如Fab形式的SEQ ID No.45或53中所示的VH序列和/或SEQ ID No.46或54中所示的VL序列。抗TACI剂可以包含SEQ ID No 31或38中所示的scFv，或通过将SEQ ID No.45与SEQ ID No.46连接或者将SEQ ID No.53与SEQ ID No.54连接而形成的scFv。
对于所有上述序列，抗TACI剂可以包含与给定序列具有80％、85％、90％、95％或98％同一性的序列，条件是变体序列保留结合TACI的能力。
TYRP-1
Tyrp1是涉及黑色素合成的黑素细胞特异性基因产物。虽然小鼠Tyrp1具有二羟基吲哚羧酸氧化酶活性，但在人黑素细胞中的功能尚不清楚。除其在黑色素合成中的作用外，Tyrp1还参与稳定酪氨酸酶蛋白并调节其催化活性。Tyrp1还参与维持黑素体结构，并影响黑素细胞增殖和黑素细胞死亡。
WO2009114585描述了结合Tyrp-1的几种抗体。抗Tyrp-1抗体也可商购获得，如来自Sigma-Aldrich的SAB1406566和HPA000937。
ALK
间变性淋巴瘤激酶(ALK)是属于胰岛素受体超家族的受体酪氨酸激酶。该蛋白质包括细胞外结构域、对应于单次跨膜区域的疏水性段、和细胞内激酶结构域。人ALK序列是可公开获得的，例如
Figure BDA0002993676710000261
登录号NP_004295(蛋白质)和NM_004304(核酸)以及UniProt登录号Q9UM73。
WO2015069922描述了结合ALK的几个scFv型抗原结合结构域。
可切割FABCAR的靶抗原
本发明的Fab CAR可以具有两个抗原结合结构域，如图9中所示意性阐明。
在本发明的可切割的FabCAR中，第一和/或第二结合结构域可以结合在靶细胞上以相对低水平表达的抗原。例如，它可以结合选自ROR1、Typr-1、BCMA、TACI和ALK的抗原。具体而言，第二(膜近端)结合结构域的靶抗原可以是在靶细胞上以相对低水平表达的抗原。
通过第一(膜-远端)结合结构域结合的靶抗原可以用于将CAR靶向肿瘤。肿瘤中接头的切割允许经由第二结合结构域结合第二靶抗原而激活，从而导致肿瘤细胞杀伤。然而，应注意的是，第一靶抗原与第一结合结构域的结合也可以触发细胞杀伤，但由于无效的突触形成，杀伤效率可以降低(与经由第二结合结构域结合靶抗原诱导的杀伤相比)。
可切割的FabCAR的优点之一是由于位阻，完整分子中的内部结合结构域(即第二结合结构域)被部分阻闭。在第二靶抗原在一个或多个正常组织上以某种程度表达的情况下，这可以提高安全性，因为第二结合结构域对其靶抗原的暴露将减少，直到第一结合结合域被切割掉为止，而这在表达CAR的细胞到达肿瘤之前可能不会发生。
因此，第二抗原可以在肿瘤细胞上以高水平表达，而在一个或多个正常组织中以低水平表达。
用于第一或第二结合结构域的靶抗原可以选自以下之一：ErbB2、MUC1、CD33、CD123、PSMA、EpCAM、GD2、NCAM、叶酸结合蛋白和MUC16。
具体而言，本发明的可切割的FabCAR可以包含针对以下靶抗原对之一的结合结构域：ErbB2和MUC1；CD33和CD123；PSMA和EpCAM；GD2和NCAM；叶酸结合蛋白和MUC16。在这些靶抗原对中，结合结构域1和结合结构域2可以结合例如靶抗原对ErbB2和MUC1的任一抗原，结合结构域1可以结合ErbB2且结合结构域2可以结合MUC1，或者结合结构域2可以结合ErbB2且结合结构域1可以结合MUC1。
具体而言，本发明的可切割的FabCA可以包含针对表2中所示的靶抗原对之一的结合结构域。
表2
适应症 结合结构域1的靶抗原 结合结构域2的靶抗原
乳腺癌 ErbB2 MUC1
AML CD33 CD123
前列腺癌 PSMA EpCAM
神经母细胞瘤 GD2 NCAM
卵巢癌 叶酸结合蛋白 MUC16
或门
本发明的CAR可以与一个或多个其他激活性或抑制性嵌合抗原受体组合使用。例如，它们可以与一个或多个其他CAR以“逻辑门(logic-gate)”组合使用，当由细胞(如T细胞)表达时，CAR组合能够检测至少两种靶抗原的特定表达模式。如果将该至少两种靶抗原任意指定为抗原A和抗原B，则三种可能的选项如下：
“或门(OR GATE)”–当靶细胞上存在抗原A或抗原B时，T细胞触发
“与门(AND GATE)”–仅当靶细胞上存在抗原A和B两者时，T细胞触发
“与非门(AND NOT GATE)”–若靶细胞上抗原A单独存在，T细胞触发，而若靶细胞上抗原A和B两者同时存在，T细胞不触发
可以基于两种或多种标志物的特定表达(或缺乏表达)，将表达这些CAR组合的工程化T细胞定制为对癌细胞具有强特异性。
此类“逻辑门”描述于例如WO2015/075469、WO2015/075470和WO2015/075470中。
“或门”包含两个或更多个激活性CAR，其各自针对由靶细胞表达的不同靶抗原。或门的优点在于靶细胞上的有效可靶向抗原增加，因为它实际上是抗原A+抗原B。这对于在靶细胞上以可变或低密度表达的抗原特别重要，因为单个抗原的水平可能低于CAR-T细胞有效靶向所需的阈值。而且，它避免了抗原逃逸的现象。例如，一些淋巴瘤和白血病在CD19靶向后变为CD19阴性：如果发生这种情况，使用靶向CD19与另一抗原组合的或门则提供了“后备”抗原。
本发明的FabCAR可以与针对由靶细胞表达的第二靶抗原的第二CAR组合以或门使用。
对于抗BCMA FabCAR，或门可以包含针对在B细胞或浆细胞中表达的第二抗原(如CD19、TACI或FcRL5)的CAR。
第二CAR可以具有任何合适的抗原结合结构域，例如基于scFv、结构域抗体(dAb)或Fab的结合结构域。
或门可以是双重Fab CAR。在这方面，细胞可以表达具有Fab型抗原结合结构域的两个单独的CAR。FabCAR可以例如针对BCMA和TACI或BCMA和FcRL5。
本发明还提供三重或门，其包含三个CAR，其中至少一个是根据本发明第一方面的FabCAR。三重或门可以例如包含BCMA Fab CAR、CD19 CAR和FcRL5 CAR或Fab CAR。
第二CAR可以包含间隔区以在空间上将抗原结合结构域与跨膜结构域分开并提供一定程度的柔性。各种序列通常用作CAR的间隔区，例如IgG1 Fc区、IgG1铰链(如上所述)或人CD8茎部。间隔区可以包含卷曲螺旋结构域，例如，如WO2016/151315中所述。
第二CAR包含激活胞内域。它可以例如包含来自CD3ζ的胞内域。它可以包含一个或多个如上所述的共刺激结构域。例如，它可以包含来自CD28、OX-40或4-1BB的胞内域。
CD19结合物
先前已经以CAR形式描述了几种抗CD19抗体，如fmc63、4G7、SJ25C1、CAT19(如WO2016/139487中所述)和CD19ALAb(如WO2016/102965中所述)。
用于本发明的双重或三重或门的抗CD19 CAR可以包含衍生自这些抗CD19抗体中的一个的抗原结合结构域，如scFv型抗原结合结构域。
CD19结合结构域可以包含：
a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)，所述CDR具有以下序列：
CDR1–GYAFSSS(SEQ ID No.61)；
CDR2–YPGDED(SEQ ID No.62)；
CDR3–SLLYGDYLDY(SEQ ID No.63)；和
b)具有CDR的轻链可变区(VL)，所述CDR具有以下序列：
CDR1–SASSSVSYMH(SEQ ID No.64)；
CDR2–DTSKLAS(SEQ ID No.65)；
CDR3–QQWNINPLT(SEQ ID No.66)。
可以在每个CDR中引入一个或多个突变(取代、添加或缺失)，而不负面影响CD19结合活性。每个CDR可以，例如具有一个、两个或三个氨基酸突变。
CDR可以是单链可变片段(scFv)的形式，其是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。scFv可以定向为VH-VL，即VH在CAR分子的氨基末端，且VL结构域连接至间隔区，并依次连接至跨膜结构域和胞内域。
CDR可以被移植到人抗体或scFv的框架上。例如，本发明的CAR可以包含由以下序列中的一种组成或包含以下序列中的一种的CD19结合结构域：
抗CD19 CAR可以包含以下VH序列：
SEQ ID No.67–来自鼠单克隆抗体的VH序列
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSS
抗CD19 CAR可以包含以下VL序列：
SEQ ID No 75–来自鼠单克隆抗体的VL序列
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKR
抗CD19 CAR可以包含以下scFv序列：
SEQ ID No 76–来自鼠单克隆抗体的VH-VL scFv序列
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKR。
两条多肽序列之间的同一性百分比可以容易地通过程序如BLAST来确定，该程序可从http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费获得。
FCRL5
Fc受体样蛋白5(FCRL5)是免疫球蛋白受体超家族的成员，并且Fc受体样家族FCRL5是单次I型膜蛋白，且含有8个免疫球蛋白样C2型结构域。成熟蛋白质为106kDa。
FCRL5具有带有两个抑制性ITIM磷酸化信号传导基序的胞质尾巴。它通过在B细胞抗原受体共刺激时募集SHP1来抑制B细胞抗原受体信号传导，从而导致减少钙内流和蛋白质酪氨酸磷酸化。FCRL5和B细胞抗原受体的共刺激促进幼稚B细胞的增殖和分化。FCRL5在成熟B细胞和浆细胞两者上表达，并由EBV蛋白诱导。它在毛细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤患者的恶性B细胞上过表达。
已知针对FCRL5的市售单克隆抗体，如CD307e(ThermoFisher)和REA391(MiltenyiBiotec)。
WO2016090337描述了结合FcRL5的几个scFv型抗原结合结构域。
在本发明的或门中，抗FcRL5 CAR可以包含dAb、scFv或Fab抗原结合结构域。FcRL5可以包含Fab抗原结合结构域。
核酸构建体
本发明还提供了编码本发明的嵌合受体的核酸构建体。
编码FabCAR(图2a)的核酸构建体可以具有以下结构：
VH-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL-CL或
VL-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH-CH
其中：
VH是编码重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸序列；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL是编码轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
对于上述两种结构，编码这两种多肽的核酸序列在构建体中可以是任何顺序。
还提供了编码或门的核酸构建体，该或门包含两个或更多个CAR，其中至少一个是根据本发明的Fab CAR。
编码双重或门的核酸构建体可以具有以下结构：
VH-CH-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-VL-CL-coexpr2-AgBD-spacer2-TM2-endo2；或
VL-CL-spacer-TM1-endo1-coexpr1-VH-CH-coexpr2-AgBD-spacer2-TM2-e ndo2
其中：
VH是编码第一CAR的重链可变区的核酸序列；
CH是编码第一CAR的重链恒定区的核酸序列；
Spacer 1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；
Endo1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；
Coexpr1和coexpr2，可以相同或不同，是使第一CAR的第一和第二多肽；以及第一和第二CAR能够共表达的核酸序列；
VL是编码第一CAR的轻链可变区的核酸序列；
CL是编码第一CAR的轻链恒定区的核酸序列；
AgBD是编码第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；
Spacer2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；且
Endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列。
第二CAR的抗原结合结构域可以是，例如scFv或dAb。
对于上述两种结构，编码第一CAR的两条多肽的核酸序列；以及编码第一和第二CAR的核酸序列在构建体中可以是任何顺序。
编码双重FabCAR或门的核酸构建体可以具有以下结构：
VH1-CH1-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-VL1-CL1-coexpr2-VH2-CH2-space r2-TM2-endo2-coexpr3-VL2-CL2；
VH1-CH1-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-VL1-CL1-coexpr2-VL2-CL2-space r2-TM2-endo2-coexpr3-VH2-CH2；
VL1-CL1-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-VH1-CH1-coexpr2-VL2-CL2-space r2-TM2-endo2-coexpr3-VH2-CH2；或
VL1-CL1-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-VH1-CH1-coexpr2-VH2-CH2-space r2-TM2-endo2-coexpr3-VL2-CL2；
其中：
VH1是编码第一CAR的重链可变区的核酸序列；
CH1是编码第一CAR的重链恒定区的核酸序列；
Spacer 1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；
Endo1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；
Coexpr1、coexpr2和coexpr 3，可以相同或不同，是使第一CAR的第一和第二多肽；以及第二CAR的第一和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL2是编码第二CAR的轻链可变区的核酸序列；
CL2是编码第二CAR的轻链恒定区的核酸序列；
VH2是编码第二CAR的重链可变区的核酸序列；
CH2是编码第二CAR的重链恒定区的核酸序列；
Spacer 2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；
Endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列；
VL2是编码第二CAR的轻链可变区的核酸序列；
CL2是编码第二CAR的轻链恒定区的核酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端处添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解，可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
关于核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括从该序列或对该序列的一个(或多个)核酸进行的任何取代、变化、修饰、替换、缺失或添加。
在以上结构中，“coexpr”是使两种多肽作为单独实体能够共表达的核酸序列。其可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生通过切割位点接合的两种多肽。切割位点可以是自切割的，使得当产生多肽时，其立即切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。
切割位点可以是能够使两种多肽分开的任何序列。
术语“切割”在本文中为了方便而使用，但是切割位点可以通过除经典切割外的机制将肽分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自切割肽(参见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：由宿主-细胞蛋白酶蛋白水解、自体蛋白水解或翻译效应(Donnelly et al(2001)J.Gen.Virol.82:1027-1041)。只要当位于编码蛋白质的核酸序列之间的切割位点导致蛋白质作为单独的实体表达时，此类“切割”的确切机制对于本发明的目的而言就并不重要。
切割位点可以是例如弗林蛋白酶(furin)切割位点、烟草蚀刻病毒(TEV)切割位点或编码自切割肽。
“自切割肽”是指下述肽，该肽发挥功能使得当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其立即被“切割”或分离成不同的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。
自切割肽可以是来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽。口蹄病毒和心脏病毒的主要2A/2B切割由在其自身C端“切割”的2A介导。在口蹄病毒如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒中，2A区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白2B的N端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表了能够在其自身C端介导“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)，如上文)。
已经在除口蹄病毒或心脏病毒外的小核糖核酸病毒，“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒，C型轮状病毒，锥虫属物种中的重复序列和细菌序列中发现了“2A样”序列(Donnelly etal(2001)，如上文)。
切割位点可以包含如SEQ ID No.77(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)所示的2A样序列。
嵌合细胞因子受体
本发明的核酸构建体还可以包含一个或多个编码嵌合细胞因子受体的核酸序列。
嵌合细胞因子受体描述于WO2017/029512中，其通过引用在此并入。
嵌合细胞因子受体可以包含：
与配体结合的胞外域；和
细胞因子受体胞内域。
配体可以是例如肿瘤分泌因子、趋化因子或细胞表面抗原。
嵌合细胞因子受体包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)结合配体的第一表位的第一抗原结合结构域
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)结合配体的第二表位的第二抗原结合结构域
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
在一个替代的实施方案中，嵌合细胞因子受体可以包含二聚化结构域；和细胞因子受体胞内域。
二聚化可以自发发生，在这种情况下，嵌合跨膜蛋白将具有组成型活性。或者，二聚化可以仅在二聚化的化学诱导物(CID)的存在下发生，在这种情况下，跨膜蛋白仅在CID的存在下引起细胞因子型信号传导。
合适的二聚化结构域和CID描述于WO2015/150771中，其内容通过引用在此并入。
例如，一个二聚化结构域可以包含FK结合蛋白12(FKBP12)的雷帕霉素结合结构域，另一个可以包含mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域；并且CID可以是雷帕霉素或其衍生物。
在二聚化结构域自发异源二聚化的情况下，它可以基于抗体的二聚化结构域。具体而言，它可以包含重链恒定结构域(CH)和轻链恒定结构域(CL)的二聚化部分。恒定结构域的“二聚化部分”是形成链间二硫键的序列的部分。
嵌合细胞因子受体可以包含抗体的Fab部分作为胞外域，例如如图4中示意性阐明。
嵌合细胞因子受体可以包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)第一二聚化结构域；和
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)第二二聚化结构域，其与第一二聚化结构域二聚化；和
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
嵌合细胞因子受体可以包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)重链恒定结构域(CH)
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)轻链恒定结构域(CL)
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
细胞因子受体胞内域可以例如包含：
(i)IL-2受体β链胞内域
(ii)IL-7受体α链胞内域；或
(iii)IL-15受体α链胞内域；和/或
(iv)共同γ链受体胞内域。
编码Fab型组成型活性嵌合细胞因子受体的核酸构建体可以具有以下一般结构：
CH-CRE1-coexpr-CL-CRE2；或
CL-CRE2-coexpr-CH-CRE1
其中：
CH是编码第一多肽的重链恒定结构域的核酸序列；
CRE1是编码第一多肽的细胞因子受体胞内域的第一链的核酸序列；
coexpr编码使第一和第二多肽能够共表达的序列；
CL是编码第二多肽的重链恒定结构域的核酸序列；
CRE2是编码第二多肽的细胞因子受体胞内域的第二链的核酸序列。
本发明的核酸构建体可以编码FabCAR和嵌合细胞因子受体。
载体
本发明还提供了载体或载体的试剂盒，其包含一个或多个编码根据本发明的嵌合受体的一种或多种核酸序列。此类载体可以用于将核酸序列引入到宿主细胞中，使得其表达根据本发明第一方面的CAR。
还提供了一种载体，其包含编码FabCAR和嵌合细胞因子受体的核酸序列的核酸构建体。
载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mRNA。
载体可以能够转染或转导细胞，如T细胞或NK细胞。
细胞
本发明提供了细胞，其包含本发明的嵌合抗原受体。细胞可以包含两种或更多种CAR，例如其可以包含如以上所述的双重或三重或门。
还提供了一种细胞，其共表达本发明的FabCAR或者或门和嵌合细胞因子受体。
细胞可以包含本发明的核酸或载体。
细胞可以是细胞裂解性免疫细胞，如T细胞或NK细胞。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。当TH细胞通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，它们得以活化。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞裂解性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面处表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其他分子，可以使CD8+细胞失活至无能力状态，这防止自身免疫疾病，如实验性自身免疫脑脊髓炎。
记忆T细胞是在感染已经解决之后长期存在的抗原特异性T细胞的亚组。它们在再次暴露于其同源抗原后迅速扩充为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包含三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
以前称为抑制性T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以实现免疫反应的结束，以及抑制逃逸胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞——天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并且已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞两者之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其他T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，从而导致致命的自身免疫疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间起源。
细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
NK细胞(属于先天性淋巴样细胞的组)定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从生成B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖代分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟，随后进入循环。
本发明的细胞可以是上述任何细胞类型。
根据本发明的细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体创建，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中创建，或来自不相关供体的外周血(第三方)。
或者，细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为例如T或NK细胞。或者，可以使用保留其裂解功能并且可以充当治疗剂的永生化T细胞系。
在所有这些实施方案中，通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码嵌合多肽的DNA或RNA来生成表达嵌合多肽的细胞。
本发明的细胞可以是来自受试者的离体细胞。细胞可以来自外周血单个核细胞(PBMC)样品。可以在用编码提供根据本发明第一方面的嵌合多肽的分子的核酸转导之前活化和/或扩充细胞，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。
本发明的细胞可以通过以下制备：
(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含有细胞的样品；和
(ii)用一种或多种编码嵌合多肽的核酸序列转导或转染细胞。
然后可以纯化细胞，例如通过基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达进行选择来纯化细胞。
药物组合物
本发明还涉及含有多个根据本发明的细胞的药物组合物。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如适合用于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明提供了用于治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本发明的细胞(例如在如上文所述的药物组合物中)的步骤。
用于治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗性用途。在本文中，可以对已患有现有疾病或病况的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。
用于预防疾病的方法涉及本发明的细胞的防治性用途。在本文中，可以对尚未感染疾病和/或未显示任何疾病症状的受试者施用此类细胞，以预防或削弱疾病的起因，或减少或预防至少一种与疾病有关的症状的形成。受试者可以具有疾病的素因，或被认为有形成疾病的风险。
方法可以涉及以下步骤：
(i)分离含有细胞的样品；
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
可以从受试者或从其他来源分离含有细胞的样品，如上所述。
本发明提供了本发明的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还涉及本发明的细胞在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
待通过本发明的方法治疗的疾病可以是癌性疾病，如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、白血病、肺癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
该疾病可以是多发性骨髓瘤(MM)、B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、神经母细胞瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
该疾病可以是浆细胞病症，如浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变性、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病或闷烧多发性骨髓瘤。
本发明的细胞可以能够杀伤靶细胞，如癌细胞。靶细胞的特征可以在于在靶细胞附近存在肿瘤分泌的配体或趋化因子配体。靶细胞的特征可以在于可溶配体的存在以及靶细胞表面处肿瘤相关抗原(TAA)的表达。
本发明的细胞和药物组合物可以用于治疗和/或预防上述疾病。
现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，所述实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明，并不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-多发性骨髓瘤细胞的表面上BCMA的表达
通过对来自已知患有frank疾病的多发性骨髓瘤患者的新鲜骨髓样品进行CD138免疫磁性选择，分离出原代骨髓瘤细胞。用与PE缀合的BCMA特异性J6MO mAb(GSK)对这些细胞进行染色。同时，按照制造商的说明，使用PE Quantibrite珠试剂盒(Becton Dickenson)生成了具有已知数量结合位点的标准珠。通过将骨髓瘤细胞的平均荧光强度与衍生自珠的标准曲线相关联而得出骨髓瘤细胞上的BCMA拷贝数。发现骨髓瘤细胞表面上的BCMA拷贝数范围很低：每细胞348.7-4268.4个BCMA拷贝，平均值为1181，且中位数为1084.9(图1)。这大大低于例如CD19和GD2(CAR的典型靶标)。
实施例2-抗BCMA FabCAR的构建以及与抗BCMA scFv CAR的比较
如下生成一组编码CAR的核酸构建体：
RQR8-2A-aBCMAscFv-CD8STK-41BBZ-单链Fv CAR构建体
RQR8-2A-aBCMAFAb-CD8STK-41BBZ-基于Fab的CAR构建体
RQR8-2A-aBCMA_C11D5.3-CD8STK-41BB-z-bb2121 scFv CAR构建体(阳性对照)
抗BCMA scFv和Fab结构域包括上述抗BCMA Ab 1的VH和VL序列(分别为SEQ ID No5和6)。所有构建体均与分选自杀基因RQR8(其描述于WO2013/153391中)共表达，并具有scFv或Fab形式的BCMA结合部分。
实施例3-CAR表达的测试
为了比较不同形式的CAR的表达，用scFv或Fab CAR转导T细胞，并通过流式细胞术在细胞表面上检测受体。通过将T细胞与可溶性BCMA-FC和QBEND10共染色(以检测RQR8的表达)来检测CAR表达。
实施例4-基于FACS的杀伤测定(FBK)
使用基于FACS的杀伤测定研究了CAR-T细胞杀伤表达BCMA的靶细胞的能力。将T细胞与靶细胞以1:4和1:8的效应物与靶标比率共培养。经过工程化以表达生理水平的BCMA抗原的SupT1细胞用作靶细胞：每细胞平均686个拷贝的BCMA(SupT1-BCMA低)。还创建了表达非常低水平的BCMA的靶细胞：每细胞平均81个拷贝的BCMA(JeKo-1)。未经工程化的SupT1细胞(SupT1-NT)也用作阴性对照。测定在96孔板中以0.2ml总体积进行，每孔使用5x104个经转导的靶细胞。在对转导效率标准化后建立共培养物。温育24h或72h后测定FBK。
结果显示于图5和6中。24小时共培养后(图5)，BCMA scFv CAR和BCMA FabCAR两者均显示出对表达低水平BCMA抗原的靶细胞的成功杀伤。然而，BCMA FabCAR表现出比等效scFv CAR对表达非常低水平BCMA的靶细胞(JeKo-1)更好的杀伤。BCMA FabCAR还表现出比其他BCMA scFv CAR，bb2121更好的杀伤。72小时后(图6)，可以看到类似的模式。在1:8E:T比率下，BCMA FabCAR给出对表达非常低的BCMA的靶细胞的几乎完全杀伤，而具有等效结合物的scFv CAR仅显示部分靶细胞杀伤。
实施例5-细胞因子释放
如实施例4中所述，通过从处于1:4和1:8的效应物:靶标比率的共培养物中收集24小时的上清液来测量CAR T细胞的IL-2和干扰素-gamma(IFNγ)分泌。通过ELISA检测IL-2和IFN-G的产生。
对于与抗原非BCMA表达靶细胞(图7A)或表达低水平的BCMA的靶细胞(图7B)进行的共培养，IFNγ的结果显示在图7中。与BCMA低表达靶细胞共培养后，表达BCMA FabCAR的T细胞与等效scFv CAR相比，产生相当水平的IFNγ。对于bb2121和等效的scFv CAR两者，用未转导的SupT1靶细胞观察到比用FabCAR观察到的背景高。
实施例6-增殖测定(PA)
为了测量增殖，用染料Cell Trace Violet(CTV)标记实施例4中描述的表达同一组CAR的T细胞。将T细胞与CTV在37℃下温育20分钟。随后，通过添加5V完全培养基淬灭细胞。温育5分钟后，洗涤T细胞并将其重悬于2ml完全培养基中。在室温下进行另外的10分钟温育，以使乙酸盐水解并保留染料。将标记的T细胞与非BCMA表达(SupT1 NT)，低BCMA表达(SupT1BCMA低)，非常低BCMA表达(JeKo-1)或MM.1s靶细胞以1:1比率共培养96个小时。在96孔板中以0.2ml总体积在每孔中使用5x104个转导的T细胞和等数目的靶细胞(比率1:1)进行测定。共培养后，通过流式细胞术分析T细胞以测量CTV随着T细胞分裂的稀释度。
对CD3和标志物RQR8，然后对CD8+或CD8-对细胞进行门控，以研究CD4和CD8 T细胞的整个细胞计数。结果显示于图8中。与所有三种表达BCMA的靶细胞类型(低表达、非常低表达和MM.1s靶标)共培养后，与等效scFv CAR和bb2121相比，BCMA FabCAR显示出高CD8细胞计数，反映了更大的增殖和/或减少的细胞死亡(图8B)。还值得注意的是，在CD4细胞中bb2121和scFv CAR的背景增殖比对于FabCAR观察到的高。这可能使靶细胞具有更高的表观增殖，但实际上反映出在不存在抗原的情况下CAR的激活增加。
实施例7-具有等效于可切割FabCAR的抗原结合结构域的双重可变结构域的抗体 的设计和构建
图9中示意性地阐明了可切割的FabCAR。它包含两个抗原结合结构域：外部(膜-远端)结合结构域1和内部(膜-近端)结合结构域2。结合结构域1和2通过可切割的接头接合。通过例如基质金属蛋白酶(MMP)对接头的切割将结合结构域1从CAR除去。在不存在切割的情况下，当FabCAR完整时，由于位阻，内部结合结构域被外部结构域的存在部分地阻闭。内部结构域在重链和轻链切割时被激活。
为了表明可以设计具有两个结合结构域的分子并通过用酶切割外部结合结构域来激活内部结合结构域，设计了可溶性抗体，如图10中所示。
抗体包含结合BCMA，并具有以上分别如SEQ ID No.29和30所示的VH和VL序列的第一抗原结合结构域。第二抗原结合结构域结合CD19，并具有以上分别如SEQ ID No.67和SEQID No.68所示的VH和VL序列。
在两个VL结构域之间和在两个VH结构域之间包括具有序列PLGLAG(SEQ IDNo.87)的MMP-9可切割的接头。作为阴性对照，使用了该序列的混杂形式：LALGPG(SEQ IDNo.88)。
构建体制备如下：
质粒1:D8_MMP9_CAT19_HC_HuIgG1
质粒2:D8_混杂_CAT19_HC_HuIgG1
质粒3:D8_MMP9_CAT19_LC
质粒4:D8_混杂_CAT19_LC
用质粒1和质粒3共转染CHO细胞，以使它们产生具有MMP可切割接头的图10中所示的抗体；或用质粒2和质粒4共转染，以使它们产生在含VH链和含VL链中具有混杂接头的等效抗体。
实施例8-证明可以使用酶切割二结合结构域抗体的外部结合结构域
实施例7中描述的抗体包含BCMA结合结构域和CD19结合结构域的VH结构域和VL结构域之间的MMP-9可切割的接头。为了证明可以使用MMP-9酶切割BCMA结合结构域，如下建立消化测定。
在测定缓冲液中将重组人MMP-9配制为100μg/mL。添加对氨基乙酸苯汞乙酸盐(APMA)至1mM的终浓度以激活酶，并在37℃温育24小时。
通过在200ul的最终缓冲液中混合50ug抗体和6ul活化酶来准备消化测定。消化测定在37℃温育，并在各个时间点取出1ug抗体溶液(4ul)，重悬于NuPAGE负载染料中，煮沸，冷冻，然后在SDS-PAGE上运行。通过光密度法分析切割百分比，并且结果显示于图11中。
基质金属蛋白酶随时间消化含有MMP-9可切割接头的抗体，暴露于该酶约1小时后趋于稳定。即使在暴露于酶24小时后，具有混杂接头的抗体也没有显示出明显的消化增加。
实施例9-研究外部结合结构域的切割对内部结合结构域结合靶抗原的影响
为了研究内部结合结构域在去除和不去除外部结合结构域情况下的活性，建立了ELISA测定以研究与CD19的结合。将重组CD19以1μg/ml以50ul/孔包被在96孔板上。封闭后，将实施例7中所述的抗体(含有MMP-9或混杂接头，以及先前暴露或未暴露于MMP-9)以15ug/ml加载30’，然后在PBS 0.05％Tween20中洗涤。以1:3000稀释度添加抗人Fc HRP缀合二抗，温育1小时。用1步Ultra TMB底物检测信号，并在1M H2SO4中封闭。结果显示在图12中：可溶性抗体(D8-MMP-CAT19)在MMP-9切割后显示出与CD19的结合增加，而对于具有混杂接头的抗体(D8-混杂-CAT19)，先前暴露于MMP-9不影响CD19结合。
实施例10-研究外部结合结构域的切割对CD19结合的动力学的影响
通过在Biacore 8K仪器上的蛋白A芯片上捕获抗体来测试CD19结合动力学。对于实施例8描述的抗体，在先前暴露于或未暴露于MMP-9的情况下，阳性对照抗体(CAT19 IgG)在75RU处捕获为IgG，且在100RU处捕获为二结合结构域构建体。重组CD19在HBS-EP+缓冲液中透析，且分析物在500nM以2倍系列稀释进行测试。结果显示在图13中。与未暴露于MMP-9的等效抗体(D8-MMP9-CAT19)相比，具有MMP-9可切割接头的抗体在用MMP-9切割后(切割的D8-MMP9-CAT19)显示出CD19结合的Rmax增加。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的是描述的用于实施本发明的方式的各种修改都旨在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 奥托路斯有限公司
<120> 嵌合抗原受体
<130> P116016PCT
<150> GB 1815775.0
<151> 2018-09-27
<150> GB 1902021.3
<151> 2019-02-14
<160> 88
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> kappa链恒定结构域
<400> 1
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gamma免疫球蛋白重链的序列
<400> 2
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
85 90 95
Val
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔物, 人IgG1铰链
<400> 3
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys
20
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔物，铰链间隔物
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA (B细胞成熟靶标) Ab1 VH (重链可变区)
<400> 5
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Leu Lys Gln Val Pro Gly Gln Ser Ile Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Ala Thr His Tyr His Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Leu Tyr Thr Thr Ala Tyr Tyr Tyr Val Gly Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab1 VL (轻链可变区)
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab2 VH
<400> 7
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Lys Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Tyr Tyr Asp Gly Tyr Gln Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab2 VL
<400> 8
Asn Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Phe Tyr Tyr Cys Gln Arg Ile Tyr Asn Ser Ala Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab3 VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Pro Thr Asn Phe Asn Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Pro Arg Thr Val Ala Pro Tyr Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab3 VL
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Arg Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab4 VH
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Thr Ser Gly Gly Asp Thr His Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg His Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Val Tyr Tyr Gly Leu Phe Trp Phe Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab4 VL
<400> 12
Asn Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Ile Phe Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Met Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Thr Asn Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 13
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab5 VH
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Lys Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Tyr Tyr Asp Gly Tyr Gln Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab5 VL
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ala Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab6 VH
<400> 15
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Pro Ile Thr Asn Asn
20 25 30
Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Tyr Ile Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab6 VL
<400> 16
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Asn Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Asp
85 90 95
Asp Pro Asn Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab7 VH
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Pro Ile Thr Asn Asn
20 25 30
Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Gly Tyr Ile Ser Tyr Ile Pro Phe Gly Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab7 VL
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Arg Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab8 VH
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Lys Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Tyr Tyr Asp Gly Tyr Gln Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab8 VL
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab9 VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab9 VL
<400> 22
Asn Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Asn Asn
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Ser Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab10 VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Asn Tyr Ala Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab10 VL
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Ser Ser Met Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab11 VH
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr Gln Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab12 VL
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Glu Thr Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab13 VH
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr His Asn Tyr Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab13 VL
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Gly Ala Asn Glu Thr Val Ser Thr Leu Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 29
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab14 VH
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Asn His Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Pro Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser
115
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗BCMA Ab15 VL
<400> 30
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser Ala Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Phe Leu Ile Tyr Leu Val Ser Gly Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Val His Gly
85 90 95
Thr His Ala Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜激活物和钙调控物和亲环蛋白配体(CAML)相互作用物(TACI)结合物, 2H6ScFv
<400> 31
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr His Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn
180 185 190
Val Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met
210 215 220
Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR H1
<400> 32
Asn Tyr Val Met His
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR H2
<400> 33
Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR H3
<400> 34
Gly Thr His Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR L1
<400> 35
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR L2
<400> 36
Gly Ala Ser Asn Val Glu Ser
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2H6, CDR L3
<400> 37
Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro
1 5
<210> 38
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物, 2G2 ScFv
<400> 38
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Ala Gln Tyr Ser Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Arg Ile His Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Gly Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg
180 185 190
Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
210 215 220
Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR H1
<400> 39
Thr Phe Gly Met Gly Val Gly
1 5
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR H2
<400> 40
His Ile Trp Trp Asp Asp Ala Gln Tyr Ser Asn Pro Ala Leu Arg Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR H3
<400> 41
Arg Ile His Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Glu Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR L1
<400> 42
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR L2
<400> 43
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物2G2, CDR L3
<400> 44
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr
1 5
<210> 45
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物, 1G6 VH
<400> 45
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Gly Asp Arg Ala Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物, 1G6 VL
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Val Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Gly Val Asp
1 5
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR H2
<400> 48
Ile Ile Trp Gly Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Lys Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR H3
<400> 49
Gly Asp Arg Ala Ala Asp Tyr
1 5
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR L1
<400> 50
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR L2
<400> 51
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物1G6, CDR L3
<400> 52
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro
1 5
<210> 53
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物, 4B11 VH
<400> 53
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Val Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asn Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Thr Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Gly Tyr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 54
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物, 4B11 VL
<400> 54
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ile Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Leu Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR H1
<400> 55
Asn Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR H2
<400> 56
Lys Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR H3
<400> 57
Gly Tyr Gly Ala Tyr
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR L1
<400> 58
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR L2
<400> 59
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Phe
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI结合物4B11, CDR L3
<400> 60
Gln Gln Tyr Tyr Thr Trp
1 5
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VH CDR, CDR1
<400> 61
Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VH CDR, CDR2
<400> 62
Tyr Pro Gly Asp Glu Asp
1 5
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VH CDR, CDR3
<400> 63
Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VL CDR, CDR1
<400> 64
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VL CDR, CDR2
<400> 65
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19结合结构域VL CDR, CDR3
<400> 66
Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 67
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠单克隆抗体的VH序列
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR1
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Tyr
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR2
<400> 69
Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Ala Thr
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR3
<400> 70
Ala Arg Pro Leu Tyr Thr Thr Ala Tyr Tyr Tyr Val Gly Gly Phe Ala
1 5 10 15
Tyr
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR1
<400> 71
Gln Ser Leu Leu Ser Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 72
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR2
<400> 72
Trp Ala Ser
1
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR3
<400> 73
Gln Gln Tyr Tyr Asp Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TACI富含半胱氨酸结构域(CRD)的DXL基序
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Phe, Tyr或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Val或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是Arg或Gly
<400> 74
Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa
1 5
<210> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠单克隆抗体的VL序列
<400> 75
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile Asn Asn Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ile Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 76
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠单克隆抗体的VH-VL scFv序列
<400> 76
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Glu Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Leu Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Thr Ile
195 200 205
Asn Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Asn Ile Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
225 230 235 240
Arg
<210> 77
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 77
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 78
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR1
<400> 79
Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Asn
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR2
<400> 80
Ile Ile Tyr Asp Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR3
<400> 81
Ala Thr Arg Pro Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR1
<400> 82
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 83
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR2
<400> 83
Leu Val Ser
1
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR3
<400> 84
Val His Gly Thr His Ala Trp Thr
1 5
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP-1, 可用MMP酶切割的序列
<400> 85
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 86
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP-2, 可用MMP酶切割的序列
<400> 86
Pro Ala Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP-9, 可用MMP酶切割的序列
<400> 87
Pro Leu Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 混杂MMP-9可切割接头 (阴性对照)
<400> 88
Leu Ala Leu Gly Pro Gly
1 5

Claims (25)

1.结合低密度靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含Fab抗原结合结构域。
2.根据权利要求1的CAR，其中所述靶抗原以小于每靶细胞1500个拷贝的平均密度表达。
3.根据权利要求1或2的CAR，其中所述靶抗原选自：ROR1、Tyrp-1、TACI、ALK和BCMA。
4.根据权利要求3的CAR，其中所述靶抗原是BCMA。
5.根据权利要求4的CAR，其中所述Fab抗原结合结构域包含：
a)具有互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-GFIFSDYN(SEQ ID No.79)
CDR2-IIYDGSST(SEQ ID No.80)
CDR3-ATRPGPFAY(SEQ ID No.81)；和
b)具有互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)，所述CDR具有以下序列：
CDR1-QSLLHSNGNTY(SEQ ID No.82)
CDR2-LVS(SEQ ID No.83)
CDR3-VHGTHAWT(SEQ ID No.84)。
6.根据权利要求5的CAR，其中所述Fab抗原结合结构域包含具有如SEQ ID No.29所示的序列的VH结构域；和具有如SEQ ID No.30所示的序列的VL结构域。
7.根据前述权利要求中任一项的CAR，其中所述Fab抗原结合结构域包含结合第一靶抗原的第一结合结构域和结合第二靶抗原的第二结合结构域。
8.根据权利要求7的CAR，其中所述第一靶抗原或所述第二靶抗原是BCMA。
9.根据权利要求7或8的CAR，其包含所述第一结合结构域和第二结合结构域之间的可切割的接头。
10.根据权利要求9的CAR，其中所述接头是用基质金属蛋白酶(MMP)可切割的。
11.核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的CAR。
12.核酸构建体，其编码根据权利要求1至6中任一项的CAR，并且具有以下一般结构之一：
VH-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL-CL；
VL-CL-coexpr-VH-CH-spacer-TM-endo；
VL-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH-CH；或
VH-CH-coexpr-VL-CL-spacer-TM-endo；
其中：
VH是编码重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一多肽和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL是编码轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
13.核酸构建体，其编码根据权利要求7至10中任一项的CAR，并且具有以下一般结构之一：
VH1-L1-VH2-CH-spacer-TM-endo-coexpr-VL1-L2-VL2-CL；
VL1-L1-VL2-CL-coexpr-VH1-L2-VH2-CH-spacer-TM-endo；
VL1-L1-VL2-CL-spacer-TM-endo-coexpr-VH1-L2-VH2-CH；或
VH1-L1-VH2-CH-coexpr-VL1-L2-VL2-CL-spacer-TM-endo；
其中：
VH1是编码所述第一结合结构域的重链可变区的核酸序列；
L1和L2可以相同或不同，是可切割的接头；
VH2是编码所述第二结合结构域的重链可变区的核酸序列；
CH是编码重链恒定区的核酸序列；
spacer是编码间隔区的核酸；
TM是编码跨膜结构域的核酸序列；
endo是编码胞内域的核酸序列；
coexpr是使第一和第二多肽能够共表达的核酸序列；
VL1是编码所述第一结合结构域的轻链可变区的核酸序列；
VL2是编码所述第二结合结构域的轻链可变区的核酸序列；且
CL是编码轻链恒定区的核酸序列。
14.根据权利要求12或13的核酸构建体，其还编码具有结构域抗体(dAb)、scFv或Fab抗原结合结构域的第二嵌合抗原受体。
15.根据权利要求14的核酸构建体，其中所述第二嵌合抗原受体结合以下抗原之一：CD19、FcRL5和TACI。
16.载体，其包含根据权利要求9的核酸序列或根据权利要求12至15中任一项的核酸构建体。
17.细胞，其表达根据权利要求1至10中任一项的CAR。
18.细胞，其表达根据权利要求1至10中任一项的第一CAR和如权利要求14或15中所定义的第二嵌合抗原受体。
19.根据权利要求17或18的细胞，其还表达组成型活性细胞因子受体。
20.用于制备根据权利要求17至19中任一项的细胞的方法，其包括将以下项离体引入细胞中的步骤：根据权利要求11的核酸序列；根据权利要求12至15中任一项的核酸构建体；或根据权利要求16的载体。
21.药物组合物，其包含多个根据权利要求17至19中任一项的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
22.用于治疗癌症的方法，其包括将根据权利要求21的药物组合物施用于受试者的步骤。
23.根据权利要求22的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
24.根据权利要求21的药物组合物，其用于治疗癌症。
25.根据权利要求17至19中任一项的细胞在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
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