CN108135984A - 细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供细胞，其包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一和第二CAR结合相同配体上的不同表位。所述细胞可以用于治疗疾病例如癌症的方法。

Description

细胞

发明领域

本发明涉及表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，其能够识别配体，例如可溶性配体。

发明背景

嵌合抗原受体(CAR)

已经描述了一些免疫治疗剂用于癌症的治疗，包括治疗性单克隆抗体(mAbs)，双特异性T细胞接合子和嵌合抗原受体(CAR)。

嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应子功能的蛋白。它们的通常形式是I型跨膜结构域蛋白，具有抗原识别氨基末端，间隔区，跨膜结构域，其全部连接至传输T细胞存活和活化信号的复合胞内域。

这些分子最常见的形式是来源于识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，经由间隔区和跨膜结构域融合至信号传导胞内域的融合物。响应scFv对其靶标的识别，此类分子导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达该靶抗原的靶细胞。已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的CAR，且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前已经在临床研究中用于多种癌症的治疗。

已经在体外和体内试验中测试了多种CAR，如以下表1中总结的。

表1

经由隔离(segregation)的T细胞活化

T细胞活化的发生是因为通过称为动态隔离(kinetic segregation)的过程，抑制性分子从突触位点的基于尺寸的排除。T细胞受体(TCR)和CAR通过刺激酪氨酸磷酸化引起T细胞信号传导。在静息的T细胞中，参与该过程的分子通过扩散的方式反复碰撞。TCR/CD3复合物不断被Lck(膜相关酪氨酸激酶)磷酸化，并继而被CD45(酪氨酸磷酸酶)连续去磷酸化。连续的磷酸化/去磷酸化以随机方式发生，且结果TCR的总体磷酸化较低，使得T细胞活化不进行。

TCR/肽-MHC复合物或CAR-靶细胞配体复合物跨越较短的长度。这形成了紧密接触的小区域，从其排除了具有过大而不能配合的胞外域的抑制性CD45和CD148磷酸酶分子。

CD45空间排阻延长了被捕获在紧密接触区内的TCR/肽-MHC复合物或CAR-靶细胞配体复合物的磷酸化半衰期。Lck激酶对ITAM的磷酸化的此类延长允许ZAP-70募集，通过磷酸化对其活化并随后磷酸化衔接蛋白LAT和SLP-76，导致T细胞活化的时间。

CAR-T细胞活化的隔离机制的中心是CAR结合靶细胞表面上的抗原，形成从中排除抑制性磷酸酶的紧密接触区域。

因此，迄今为止，仅开发了识别靶标(例如肿瘤细胞)上的膜结合抗原的CAR T细胞。

可溶性肿瘤抗原

癌症发展被定义为多步骤的过程，其中体细胞首先经历初始事件(即环境损伤)，且然后是第二事件或促进事件。肿瘤微环境是肿瘤进展的第二部分不可或缺的参与者。

肿瘤微环境是不同细胞类型之间形成串扰(crosstalk)的产物。例如，在上皮肿瘤中，这些细胞包括侵袭性癌及其基质成分。关键基质成分包括癌症相关的成纤维细胞，其通过分泌生长因子和趋化因子提供必需的通讯网络，诱导改变的ECM，从而提供另外的致癌信号，增强癌细胞增殖和侵袭。已经认识到肿瘤相关基质细胞对癌症进展的积极贡献。基质成分由细胞外基质(ECM)和各种表型的成纤维细胞，以及由免疫和炎性细胞，血液和淋巴管以及神经构成的支架组成。

为了肿瘤进展和发展成威胁生命的实体，它们必须发展四种关键的能力。第一是移动能力，第二是降解组织基质(ECM)的能力，第三是在血液中存活的能力，最后是能够在新的组织环境中建立自身的物理特性。微环境对于这个过程的成功至关重要。

癌细胞的微环境提供了打开转录因子的必要信号。因此，基质或非恶性细胞诱导必需的转录程序，允许必要的间充质表型以侵入远端组织并建立新的环境。然后癌细胞必须关闭转录因子程序，并从间充质再转变为上皮细胞，从而从原发性肿瘤细胞的核心重新创建自身。

肿瘤细胞直接分泌多种蛋白质，其包括生长因子和ECM降解蛋白酶或诱导宿主加工能够降解基质及其组分粘附分子的生物分子。基质降解发生在接近肿瘤细胞表面的区域中，其中活性降解酶的量超过基质中存在的或正常细胞分泌的天然蛋白酶抑制剂。肿瘤细胞分泌到ECM微环境中的蛋白因此参与细胞粘附，运动，细胞间通讯和侵入。

因此癌症的特征可以是在肿瘤微环境中存在许多可溶性配体，包括由肿瘤细胞或周围的非癌性(例如基质细胞)分泌的蛋白质和由于癌症活动如基质降解而产生的分子。

靶向此类可溶性配体的试剂例如单克隆抗体目前正在临床开发中，但迄今为止，没有细胞免疫疗法方法能够接近这种有价值的抗原来源。

中靶脱瘤毒性(On-target off-tumour toxicity)

存在单一抗原有效地描述癌症是相对罕见的，其可以导致缺乏特异性。

大多数癌症不能以单一抗原为基础从正常组织区分。因此，发生相当大的“中靶脱瘤”毒性，由此正常组织被治疗损伤。例如，尽管使用利妥昔单抗靶向CD20以治疗B细胞淋巴瘤，但整个正常B细胞部分被耗尽，而靶向CD52以治疗慢性淋巴细胞白血病，整个淋巴样部分被耗尽，而靶向CD33以治疗急性髓样白血病，整个髓样部分被损伤等。

临床试验已经证实了预测的“中靶脱瘤”毒性的问题。例如，靶向ERBB2的方法导致结肠癌转移至肺和肝的患者死亡。在一些患者中，ERBB2在结肠癌中过表达，但其在几种正常组织(包括心脏和正常血管)中也有表达。

对于一些癌症来说，靶向两种癌症抗原的存在可以比靶向一种更有选择性且因此更有效。例如，B-慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)是目前通过靶向CD19治疗的常见的白血病。这治疗淋巴瘤，但也消耗整个B细胞部分，使得该治疗具有相当的毒性作用。B-CLL具有不常见的表型，因为CD5和CD19共同表达。通过仅靶向表达CD5和CD19的细胞，将有可能显著降低中靶脱瘤毒性。

如果使用免疫疗法可能靶向可溶性配体，则可以基于膜抗原的存在与肿瘤或非肿瘤组织特征性的可溶性配体例如趋化因子，细胞因子或代谢物的存在的组合来靶向细胞。这也预期会大大降低中靶脱瘤毒性。

附图简述

图1：显示可溶性配体不导致与单CAR T细胞聚集的示意图。

图2：显示用可溶性配体和双CAR平台的预测的聚集的示意图，其中两种CAR识别相同的配体。

图3：显示用可溶性配体和双CAR平台的预测的聚集的示意图，其中两种CAR识别相同的配体且其中一个CAR是多价的。

图4：显示用于显示概念证明的模型的示意图。使用的配体是ROR-1，且第一和第二受体分别是R12和R11。

图5：显示使用实施例中测试的模型系统与ROR-1的预测的聚集的示意图。

图6：显示使用实施例中测试的模型系统与ROR-1的预测的聚集的示意图，其中一个CAR是多价的。

图7：显示在可溶性配体(ROR-1)存在下IL-2分泌的图。用单CAR(具有Fc或CD8STK或COMP间隔区的R11或R12)或用两种CAR转导BW5T-细胞。这些T细胞与可溶性ROR-1配体共培养，并在24小时后检测IL-2。

图8：显示在固定化配体存在下IL-2分泌的图。用单CAR(具有Fc或CD8STK或COMP间隔区的R11或R12)或用两种CAR转导BW5T-细胞。这些T细胞与用可溶性His标记的ROR-1配体预先包被的抗His珠共培养，并在24小时后检测IL-2。

图9：显示“拆分”CAR系统的实例的示意图。第三CAR结合细胞表面抗原如PSMA，提供经由TCR zeta胞内域的T细胞活化信号1。第一和第二CAR结合可溶性配体如PSA，提供经由CD28和OX40胞内域的T细胞活化信号2和3。细胞表面抗原(例如PSMA)和可溶性配体(例如PSA)两者的存在提供全部三种信号并导致T细胞活化。

图10：显示CAR系统的示意图，其中第一CAR和/或第二CAR抑制来自第三CAR的信号传导。第三CAR结合细胞表面抗原(“配体A”，例如PSMA)导致T细胞信号传导。然而，第一和第二CAR结合可溶性配体(例如IL6)导致聚集诱导的磷酸化和信号传导抑制。

图11：显示“TanCAR”系统的示意图，其中第一CAR包含两个抗原结合结构域，一个(“结合子A”)结合细胞表面抗原(“配体A”，例如PSMA)且一个(“结合子B1”)结合可溶性配体(“配体B”，例如IL-6)。第二CAR通过其抗原结合结构域(“结合子B2”)结合可溶性配体(“配体B”，例如IL-6)。第二种CAR具有抑制T细胞信号传导的胞内域。第一CAR结合细胞表面抗原(“配体A”，例如PSMA)导致T细胞信号传导。然而，第一和第二CAR结合可溶性配体(例如IL6)导致第二CAR上的抑制性胞内域与第一CAR上的激活性胞内域共定位，导致信号传导的抑制。

图12：显示“与门”系统的示意图，其中第一和/或第二CAR包含具有快速动力学的抑制性胞内域(例如CD148胞内域)。在不存在可溶性配体的情况下，抑制性胞内域组成性抑制第三CAR上的激活性胞内域。在可溶性配体的存在下，第一和第二CAR聚集并与第三CAR隔离，允许T细胞信号传导发生。

图13：显示替代的“与门”系统的示意图，其中第一CAR包含两个抗原结合结构域，一个(“结合子A”)结合细胞表面抗原(“配体A”，例如PSMA)且一个(“结合子B1”)结合可溶性配体(“配体B”，例如PSA)。第二CAR通过其抗原结合结构域(“结合子B2”)结合可溶性配体(“配体B”，例如PSA)。第一种CAR不包含功能性T细胞激活性胞内域，而第二CAR的确包含功能性T细胞激活性胞内域。在不存在可溶性配体的情况下，由于缺乏TCR zeta链，细胞表面抗原的结合不会导致细胞信号传导。在可溶性配体的存在下，第一CAR和第二CAR共定位并且第一CAR结合细胞表面抗原确实导致细胞信号传导。为了防止在不存在细胞表面配体的情况下的信号传导，第二CAR可以是单体的，这可以使用单体间隔区例如基于CD22的间隔区来实现。

图14：基于聚集的与门仅在膜结合抗原(CD19)和可溶性配体(ROR1)存在下传导信号。

图15：显示在可溶性配体PSA的存在下IL-2分泌的图。用表达两种CAR的载体转导BW5T-细胞，所述两种CAR结合PSA的不同表位。一种CAR具有基于5A5A5的抗原结合结构域和而一种CAR具有基于5D3D11的抗原结合结构域(aPSA-A5-CD8STK-CD28TM-z_aPSA-D11-HL-铰链-CD28tmZ或aPSA-D11-CD8STK-CD28TM-z_aPSA-A5-HL-铰链-CD28tmZ)。将这些T细胞与可溶性PSA配体共培养，并在24小时后检测IL-2。

发明概述

本发明人已经发现通过使用包含各自识别相同可溶性配体上的表位的两种CAR的细胞使用CAR方法靶向可溶性配体是可能的。

因为CAR识别相同配体上的不同表位，所以配体的存在引起配体相关的CAR在细胞表面聚集。因此，本发明实际上将T细胞信号传导从基于隔离的过程转变为基于聚集的过程。

因此，在第一方面，本发明提供细胞，其包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一和第二CAR结合相同配体上的不同表位。

该配可以是可溶性配体，例如细胞因子，趋化因子或代谢物。可溶性配体可以例如选自下组：转化生长因子beta(TGF-β)，前列腺特异性抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)和血管内皮生长因子(VEGF)。

每个CAR可以包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)间隔区；和

(iii)跨膜结构域

第一和第二CAR的间隔区可以是不同的。

第一和/或第二CAR的间隔区可以是三聚的或多价的。

细胞可以包含第三CAR，其结合细胞表面抗原。

本发明的第一方面还提供五种不同的实施方案，其每个涉及在细胞表面抗原和配体例如可溶性配体的存在(或不存在)下信号传导的具体排列。

在第一实施方案中，第一和/或第二和第三CAR各自包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)跨膜结构域；和

(iii)胞内域

且第三CAR和第一和/或第二CAR的胞内域是互补的，使得当第一和第二CAR结合所述配体且第三CAR结合细胞表面抗原时发生细胞活化。

在该实施方案中，第三CAR可以包含CD3zeta胞内域，且第一和/或第二CAR可以包含CD28胞内域和OX40或41BB胞内域。

在该实施方案中，第三CAR可以结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)而第一和第二CAR可以结合前列腺特异性抗原(PSA)。

在第二实施方案中，第一和/或第二CAR包含抑制性胞内域，使得当第一和第二CAR结合配体时，由第三CAR结合细胞表面蛋白引起的细胞活化被抑制。

在第三实施方案中，第一CAR包含两个抗原结合结构域：一个结合可溶性配体；且一个结合细胞表面抗原。

在该实施方案中，第二CAR包含抑制性胞内域，使得当第一和第二CAR结合可溶性配体时，由第一CAR结合细胞表面抗原导致的细胞活化被抑制。

第二或第三实施方案的抑制性胞内域可以是或包含PTPN6的催化结构域或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。

对于第二或第三实施方案，第一和第二CAR可以结合IL-6。

在第四实施方案中，第一和/或第二CAR包含抑制性胞内域，使得：

在不存在所述配体的情况下，由第三CAR结合细胞表面抗原导致的细胞活化被抑制；和

在存在配体的情况下，第一和第二CAR聚集并与第三CAR隔离，使得当第三CAR结合细胞表面抗原时信号传导可以发生。

在第四实施方案中，抑制性胞内域可以是或包含CD45或CD148的胞内域。

在第五实施方案中，第一CAR缺乏功能性胞内域且第二CAR是单体的并包含功能性胞内域，使得可溶性配体的结合导致第一和第二CAR的共定位且当第一CAR结合细胞表面抗原时T细胞信号传导能够发生。

第二CAR可以包含单体间隔区，其例如可以包含一个或多个来自CD22的Ig结构域。

在第五实施方案中，第二CAR上的功能性胞内域包含CD3-zeta胞内域。

在第二方面，本发明提供核酸构建体，其包含编码如上文定义的第一CAR的第一核酸序列，和编码如上文定义的第二CAR的第二核酸序列。

核酸构建体可以具有以下结构：

AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2

其中

AgB1是编码第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；

coexpr是使得两个CAR能够共表达的核酸序列；

AgB2是编码第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列；

该核酸构建体当在T细胞中表达时编码多肽，所述多肽在切割位点被切割使得第一和第二CAR在T细胞表面共表达。

“coexpr”可以编码包含自切割肽的序列。

为了避免同源重组，可以在编码相同或相似氨基酸序列的区域中使用替换密码子。

核酸构建体还可以包含编码如上文定义的第三CAR的核酸序列。

在第三方面，本发明提供载体，其包含根据本发明的第二方面的核酸构建体。

载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

在第四方面，本发明提供试剂盒，其包含：

i)载体，其包含编码如上文定义的第一CAR的核酸序列；和

ii)载体，其包含编码如上文定义的第二CAR的核酸序列。

试剂盒还可以包含包括编码如上文定义的第三CAR的核酸序列的载体。

在第五方面，本发明提供制备根据本发明的第一方面的细胞的方法，其包括将以下项引入细胞的步骤：根据本发明第二方面的核酸构建体；根据本发明第三方面的载体；或根据本发明第四方面的载体的试剂盒。

在本发明的第五方面的方法中，细胞可以来自从受试者分离的样品。

在第六方面，本发明提供药物组合物，其包括多个根据本发明第一方面的细胞。

在第七方面，本发明提供治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据本发明第六方面的药物组合物施用至受试者的步骤。

该方法可以包括以下步骤：

(i)从受试者分离含细胞的样品；

(ii)使用以下项转导或转染细胞：根据本发明第二方面的核酸构建体；根据本发明第三方面的载体；或根据本发明第四方面的试剂盒；和

(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。

该样品可以是含T细胞的样品。

该疾病可以是癌症。

在第八方面，本发明提供根据本发明第六方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。

在第九方面，本发明提供根据本发明的第一方面的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

该疾病可以是癌症。

发明详述

嵌合抗原受体(CAR)

经典的CAR是嵌合I型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合子)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。结合子通常是来源于单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样抗原结合位点或配体样结合位点的其它形式。跨膜结构域将蛋白锚定在细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。

早期的CAR设计具有来源于FcεR1或CD3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足够触发T细胞对关联靶细胞的杀伤，但不能完全活化T细胞以增殖或存活。为了克服这一限制，构建了复合胞内域：将T细胞共刺激分子的细胞内部分融合至CD3ζ的细胞内部分，产生了第二代受体，其在抗原识别后能够同时传输活化和共刺激信号。最通常使用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-称为免疫信号2，其触发T细胞增殖。已经描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如紧密相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化，增殖和存活信号的胞内域。

可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸转移至T细胞。以这种方式，可以生成大量抗原特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至上面有其表达的T细胞。因此CAR将特异性和T细胞的细胞毒性引导至表达靶定抗原的细胞。

本发明的细胞包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR。细胞可以还包含第三CAR和任选地后续CAR。

CAR可以包含抗原结合结构域，间隔区结构域，跨膜结构域和胞内域。胞内域可以包含传输T细胞活化信号的结构域或与其缔合。

抗原结合结构域

抗原结合结构域是CAR的部分，其识别抗原。

本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；对于靶标具有足够亲和力的肽；单域结合子，如骆驼的(camelid)；人工单结合子例如Darpin；或来源于T细胞受体的单链。

抗原结合结构域可以结合可溶性或膜结合配体上的表位，如下文定义。

术语“配体”与“抗原”同义使用以表示由CAR的抗原结合结构域特异性识别并结合的实体。

可溶性配体

术语“可溶性配体”用于表示不是细胞的一部分或不附着于细胞，而是在细胞外空间中例如在感兴趣组织的体液中自由移动的配体或抗原。可溶性配体可以在个体的血清，血浆或其他体液中以无细胞状态存在。

可溶性配体可以是例如细胞因子，趋化因子或代谢物。

细胞因子是在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5-20kDa)。它们被细胞释放并影响其他细胞的行为。细胞因子包括趋化因子，干扰素，白细胞介素，淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子由广泛的细胞产生，包括免疫细胞如巨噬细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞，成纤维细胞和各种基质细胞。

细胞因子通过受体起作用，并且在健康和疾病中是重要的，特别是在宿主对感染的应答，免疫应答，炎症，创伤，败血症，癌症和生殖中。趋化因子介导细胞之间的化学吸引(趋化性)。

细胞因子被认为在对癌症的免疫应答和癌症的病理学中都起关键作用。细胞因子直接刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，增强细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞的识别。许多动物肿瘤模型研究已经证明，细胞因子具有广泛的抗肿瘤活性，并已被翻译成许多基于细胞因子的癌症治疗方法。近年来，已经看到包括GM-CSF，IL-7，IL-12，IL-15，IL-18和IL-21在内的许多细胞因子进入患有晚期癌症的患者的临床试验。

正在进行的临床前工作支持中和抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β以促进抗肿瘤免疫。用本发明的CAR细胞靶向免疫抑制性细胞因子的优点是CAR在两种方式中是有效的：首先通过被疾病特征性的细胞因子激活，然后通过隔离至少循环细胞因子的一部分，从而减轻其免疫抑制作用。

可溶性配体可以与特定疾病例如癌症的存在或病理学相关。

可溶性配体可以是癌症分泌物组，即肿瘤分泌的因子的集合的一部分，可以来自癌症干细胞，非干细胞或周围基质。可溶性配体可以由肿瘤细胞分泌。可溶性配体可以例如选自以下组：TGFβ，PSA，CEA和VEGF。

可溶性配体可以是疾病或患病组织特征性的。在患有疾病的受试者相对于健康受试者中，或在患病组织相对于健康组织中，其可以是排他性存在，或以较高的水平存在。在患有疾病的受试者相对于健康受试者，或在患病组织相对于健康组织中，可溶性配体可以以高至少2倍，5倍，10倍，100倍，1000倍，10,000倍或100,000倍的水平表达。

TGF BETA

可溶性配体可以是TGFβ。

转化生长因子beta(TGF-β)是控制细胞增殖，细胞分化和其他功能的分泌蛋白。它是在免疫和各种疾病(包括癌症，支气管哮喘，肺纤维化，心脏病，糖尿病，多发性硬化症和AIDS)中起作用的细胞因子。

TGF-β由多种细胞类型(包括巨噬细胞)以潜在的形式分泌，其中它与其他两种多肽(潜伏的TGF-β结合蛋白(LTBP)和潜伏相关肽(LAP))复合。血清蛋白酶如纤溶酶催化活性TGF-β从复合物中释放。这通常发生在巨噬细胞表面，其中潜伏的TGF-β复合物通过其配体血小板反应蛋白-1(TSP-1)与CD36结合。活化巨噬细胞的炎性刺激物通过促进纤溶酶的活化来增强活性TGF-β的释放。巨噬细胞也可以吞噬由浆细胞分泌的IgG结合的潜伏TGF-β复合物，然后将活性TGF-β释放到细胞外液体中。

TGF-β以至少三种同种型存在：TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。关于TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3的序列和特征的信息可以从omim.org获得，分别是条目190180，190220和190230。

TGF-β在正常上皮细胞和肿瘤发生的早期阶段充当抗增殖因子。癌细胞增加它们的TGF-β产生，其也作用于周围的细胞。

在正常细胞中，通过其信号通路起作用的TGF-β停止G1期的细胞周期以停止增殖，诱导分化或促进细胞凋亡。当细胞转化为癌细胞时，TGF-β信号传导途径的一部分发生突变，并且TGF-β不再控制细胞。这些癌细胞增殖。周围的基质细胞(成纤维细胞)也增殖。两种细胞都增加了它们的TGF-β产生。该TGF-β作用于周围的基质细胞，免疫细胞，内皮细胞和平滑肌细胞。其引起免疫抑制和血管生成，使得癌症更具侵入性。TGF-β还将通常在炎症(免疫)反应中攻击癌症的效应T细胞转化为调节(抑制)T细胞，从而关闭炎症反应。

因此，TGF-β是本发明的识别可溶性配体的CAR的有吸引力的靶标，因为a)TGF-β的上调表达是许多癌症的特征；和b)通过CAR表达细胞隔离游离的TGF-β可以减少循环中的TGF-β的量以及其相关的免疫抑制，血管生成和抗炎作用。

本发明的细胞的第一或第二CAR可以包含基于fresolimumab的结合结构域。

Fresolimumab(GC1008)是结合并抑制TGF-β的所有同种型的人单克隆抗体。Fresolimumab已用于特发性肺纤维化(IPF)，局灶节段性肾小球硬化和癌症例如肾癌和黑素瘤的治疗。

第一或第二CAR的抗原结合结构域可以例如包含来自Fresolimumab的6个CDR或VH和/或VL结构域。

前列腺特异性抗原(PSA)

可溶性配体可以是前列腺特异性抗原(PSA)。

前列腺特异性抗原(PSA)，也称为γ-精浆蛋白或激肽释放酶-3(KLK3)，是由KLK3基因在人体内编码的糖蛋白酶。PSA是激肽释放酶相关肽酶家族的成员，并由前列腺的上皮细胞分泌。

PSA在具有健康前列腺的男性的血清中以少量存在，但是在患有前列腺癌和其他前列腺疾病的个体中升高。

PSA是237个残基的糖蛋白，并被KLK2激活。它的生理作用是精液凝固成分的液化，其导致精子的释放。在癌症中，PSA可以参与肿瘤生长和转移的过程。

PSA是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，具有典型的His-Asp-Ser三联体和与其他激肽释放酶相关肽酶的催化结构域类似的催化结构域。已经获得了PSA晶体结构：i)与单克隆抗体(mAb)8G8F5复合和ii)与两种mAbs 5D5A5和5D3D11的三明治式复合物中(Stura et al(J.Mol.Biol.(2011)414:530-544)。

各种单克隆抗体是已知的，包括在Bavat et al AvicennaJ.Med.Biotechnol.2015,7:2-7；和Leinonen(2004)289:157-67中描述的2G2-B2，2D8-E8，IgG1/K。

第一或第二CAR的抗原结合结构域可以例如包含来自PSA结合mAb如8G8F5，5D5A5或5D3D11的6个CDR或VH和/或VL结构域

以下给出5D3D11和5D5A5VH和VL的氨基酸序列。互补决定区(CDR)以粗体突出显示。

第一CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D5A5的6个CDR，并且第二CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D3D11的6个CDR。

第一CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D5A5的VH和/或VL结构域或其变体；并且第二CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D3D11的VH和/或VL结构域或其变体。变体VH和VL结构域可以与以上给出的序列具有至少80，90，95或99％的同一性，条件是它们保留PSA结合活性。

癌胚抗原(CEA)

可溶性配体可以是CEA。

癌胚抗原(CEA)描述了参与细胞粘附的一组高度相关的糖蛋白。CEA通常在胎儿发育期间在胃肠组织中产生，但在出生前停止产生。因此，CEA通常仅在健康成年人的血液中呈现非常低的水平。然而，在某些类型的癌症中血清水平升高，这意味着它可以在临床测试中用作肿瘤标志物。

CEA是糖基磷脂酰肌醇(GPI)细胞表面锚定的糖蛋白，其特化的唾液酸糖基化糖型作为功能性结肠癌L-选择素和E-选择素配体，其对于结肠癌细胞的转移性播散可以是关键的。在免疫学上它们被鉴定为CD66分化簇的成员。

CEA和相关基因组成属于免疫球蛋白超家族的CEA家族。在人类中，癌胚抗原家族由29个基因组成，其中18个正常表达。以下是编码癌胚抗原相关细胞粘附蛋白的一批人类基因：CEACAM1,CEACAM3,CEACAM4,CEACAM5,CEACAM6,CEACAM7,CEACAM8,CEACAM16,CEACAM18,CEACAM19，CEACAM20，CEACAM21。

靶向CEA的各种抗体描述于WO 2011/034660中。

血管内皮生长因子(VEGF)

可溶性配体可以是VEGF。

血管内皮生长因子(VEGF)是由细胞产生的信号蛋白，其刺激血管发生和血管生成。当血液循环不足时，其是恢复组织氧气供应的系统的一部分。在支气管哮喘和糖尿病中VEGF的血清浓度高。VEGF的正常功能是产生在胚胎发育过程中新的血管，损伤后的新血管，运动后的肌肉，以及绕过阻塞的血管的新血管(侧支循环)。

当VEGF过度表达时，其可以有助于疾病。如果没有足够的血液供应，实体癌症不能生长超过有限的大小；能够表达VEGF的癌症能够生长和转移。

VEGF是胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族的亚家族。它们是参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管生成(从预先存在的血管系统的血管生长)的重要信号传导蛋白。

在哺乳动物中VEGF家族包含五个成员：VEGF-A，胎盘生长因子(PGF)，VEGF-B，VEGF-C和VEGF-D。

已知各种针对VEGF的抗体，例如贝伐单抗(Avastin)和Ranibizumab(Lucentis)。

膜结合配体

术语“膜结合配体”用于表示作为细胞的一部分或附着于细胞的配体或抗原。配体可以在靶细胞的表面表达。配体可以是例如跨膜蛋白。

抗原结合结构域可以结合以低密度在细胞(例如癌细胞)上表达的TAA。以低密度表达的TAA可以指例如以每细胞10至1000个分子的水平表达的TAA。

已知在某些癌症中以低密度表达的TAA的例子包括但不限于CLL中的ROR1，黑色素瘤中的Typr-1和骨髓瘤中的BCMA。

先前已经描述了结合这些TAA的抗原结合结构域(如scFv或mAb)，例如如以下表1中所示。

表1

间隔区

本发明的CAR可以包含间隔序列，以将抗原结合结构域与跨膜结构域连接，并将抗原结合结构域从胞内域分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同的方向上定向以实现抗原结合。

第一CAR的间隔区可以不同于第二CAR的间隔区。

间隔序列可以例如包含IgG1Fc区，IgG1铰链或CD8茎部。接头可以备选地包含备选接头序列，其具有与IgG1Fc区域，IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。

可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。

这些间隔区的氨基酸序列的实例如下给出：

SEQ ID No.5(人IgG1的铰链-CH2CH3)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID No.6(人CD8茎部):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID No.7(人IgG1铰链):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

卷曲螺旋结构域

本发明的细胞的第一和/或第二CAR可以包含卷曲螺旋间隔结构域。

卷曲螺旋是一种结构基序，其中2-7个α-螺旋如绳的股一样缠绕在一起(图6)。许多内源蛋白整合了卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域可以参与蛋白质折叠(例如它与相同蛋白质链内的几个α螺旋基序相互作用)或负责蛋白质-蛋白质相互作用。在后一种情况下，卷曲螺旋可以引发同型或异型低聚物结构。

如本文所用，术语“多聚体”和“多聚化”与“寡聚体”和“寡聚化”同义并可以互换。

卷曲螺旋结构域的结构在本领域中是公知的。例如，如Lupas&Gruber(Advancesin Protein Chemistry；2007；70；37-38)所述。

卷曲螺旋通常含有疏水性(h)和带电荷(c)的氨基酸残基的重复模式hxxhcxc，称为七肽重复。七肽重复中的位置通常标记为abcdefg，其中a和d是疏水位置，通常被异亮氨酸，亮氨酸或缬氨酸占据。将具有这种重复模式的序列折叠成α-螺旋二级结构使得疏水性残基呈现为以左旋方式围绕螺旋轻轻缠绕的“条带(stripe)”，形成两亲性结构。两个此类螺旋将其自身排列在细胞质中的最有利的方式是彼此将疏水链缠绕，在亲水性氨基酸之间夹持。因此，为寡聚化提供了热力学驱动力的是疏水表面的埋藏物。卷曲螺旋界面中的包装非常紧密，其中a和d残基的侧链之间具有几乎完全范德华接触。

α-螺旋可以是平行或反平行的，且通常采用左旋超螺旋。虽然不利，但在自然界和设计的蛋白质中也观察到一些右旋卷曲螺旋。

卷曲螺旋结构域可以是任何能够形成螺旋卷曲多聚体的卷曲螺旋结构域，使得形成包含卷曲螺旋结构域的CAR复合物。

本领域中熟知卷曲螺旋结构域的序列与最终折叠结构之间的关系(Mahrenholzet al；Molecular&Cellular Proteomics；2011；10(5):M110.004994)。如此，卷曲螺旋结构域可以是合成产生的螺旋卷曲结构域。

含有卷曲螺旋结构域的蛋白质的实例包括但不限于驱动蛋白运动蛋白，丁肝delta抗原，古细菌盒C/D sRNP核心蛋白，软骨寡聚基质蛋白(COMP)，甘露糖结合蛋白A，卷曲螺旋富含丝氨酸的蛋白1，多肽释放因子2，SNAP-25，SNARE，Lac阻遏蛋白或载脂蛋白E。

各种卷曲螺旋结构域的序列如下所示：

驱动蛋白运动蛋白:平行同二聚体(SEQ ID No.8)

MHAALSTEVVHLRQRTEELLRCNEQQAAELETCKEQLFQSNMERKELHNTVMDLRGN

丁肝delta抗原:平行同二聚体(SEQ ID No.9)

GREDILEQWVSGRKKLEELERDLRKLKKKIKKLEEDNPWLGNIKGIIGKY

古细菌盒C/D sRNP核心蛋白:反平行异二聚体(SEQ ID No.10)

RYVVALVKALEEIDESINMLNEKLEDIRAVKESEITEKFEKKIRELRELRRDVEREIEEVM

甘露糖结合蛋白A:平行同三聚体(SEQ ID No.11)

AIEVKLANMEAEINTLKSKLELTNKLHAFSM

卷曲螺旋富含丝氨酸的蛋白1:平行同三聚体(SEQ ID No.12)

EWEALEKKLAALESKLQALEKKLEALEHG

多肽释放因子2:反平行异三聚体

A链:INPVNNRIQDLTERSDVLRGYLDY(SEQ ID No.13)

B链:VVDTLDQMKQGLEDVSGLLELAVEADDEETFNEAVAELDALEEKLAQLEFR(SEQ ID No.14)

SNAP-25和SNARE:平行异四聚体

A链:IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE(SEQ ID No.15)

B链:ALSEIETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERAVSDTKKAVKY(SEQ ID No.16)

C链:ELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNL(SEQ ID No.17)

D链:IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE(SEQ ID No.18)

Lac阻遏物:平行同四聚体

SPRALADSLMQLARQVSRLE(SEQ ID No.19)

载脂蛋白E:反平行异四聚体

SGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQA(SEQ IDNo.20)

卷曲螺旋结构域能够进行寡聚化。卷曲螺旋结构域可以能够形成二聚体，三聚体，四聚体，五聚体，六聚体或七聚体。

能够形成包含多于两个卷曲螺旋结构域的多聚体的卷曲螺旋结构域的实例包括但不限于来自软骨寡聚基质蛋白(COMP)，甘露糖结合蛋白A，卷曲螺旋富含丝氨酸蛋白1，多肽释放因子2，SNAP-25，SNARE，Lac阻遏物或载脂蛋白E(参见以上SEQ ID Nos.11-20)的那些。

卷曲螺旋结构域可以是COMP卷曲螺旋结构域。

COMP是自然界中最稳定的蛋白质复合物之一(在0℃-100℃和宽范围的pH下稳定)，且只能用4-6M盐酸胍进行变性。COMP卷曲螺旋结构域能够形成五聚体。COMP也是在细胞外空间中天然表达的内源表达的蛋白质。与合成的间隔区相比，这降低了免疫原性的风险。此外，COMP卷曲螺旋基序的晶体结构已经解析，其给出了间隔区长度的准确估算。COMP结构的长度为约5.6nm(与约8.1nm的来自人IgG的铰链和CH2CH3结构域相比)。

卷曲螺旋结构域可以由SEQ ID No.21所示的序列或其片段组成或包含SEQ IDNo.21所示的序列或其片段。

SEQ ID No.21

DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG

可能在N末端截短COMP卷曲螺旋结构域并保留表面表达。卷曲螺旋结构域因此可以包含SEQ ID No.21的截短形式或由SEQ ID No.21的截短形式组成，所述截短形式在N末端被截短。截短的COMP可以包含SEQ ID No.21的5个C末端氨基酸，即序列CDACG。截短的COMP可以包含5至44个氨基酸，例如至少5个，10个，15个，20个，25个，30个，35个或40个氨基酸。截短的COMP可以对应于SEQ ID No.21的C末端。例如，包含20个氨基酸的截短的COMP可以包含序列QQVREITFLKNTVMECDACG。截短的COMP可以保留参与多聚化的半胱氨酸残基。截短COMP可以保留形成多聚体的能力。

已知形成六聚体的各种卷曲螺旋结构域，如来源于HIV的gp41，以及由N.Zaccaiet al.(2011)Nature Chem.Bio.,(7)935-941)描述的人工蛋白设计的六聚体卷曲螺旋。GCN4-p1亮氨酸拉链的突变形式形成七聚体卷曲螺旋结构(J.Liu.et al.,(2006)PNAS(103)15457–15462)。

卷曲螺旋结构域可包含上文所述的卷曲螺旋结构域之一的变体，条件是该变体序列保留形成卷曲螺旋寡聚体的能力。例如，卷曲螺旋结构域可以包含SEQ ID No.8至21所示序列的变体，其具有至少80，85，90，95，98或99％序列同一性，条件是变体序列保留形成卷曲螺旋寡聚体的能力。

两个多肽序列之间的同一性百分比可以通过程序例如在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov上免费获得的BLAST来容易地确定。

跨膜结构域

跨膜结构域是CAR跨越膜的序列。其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以来源于CD28，其产生良好的受体稳定性。

信号肽

本发明的CAR可以包含信号肽，使得当CAR在细胞，例如T细胞内部表达时，新生蛋白被引导至内质网和随后引导至细胞膜，在那里其表达。

信号肽的核心可以含有一长段疏水性氨基酸，其具有形成单个α螺旋的倾向。信号肽可以以短的，带正电的氨基酸段开始，其帮助转位期间执行多肽的正确拓扑结构。在信号肽的末端，通常是由信号肽酶识别并切割的氨基酸段。信号肽酶可以在转位期间或转位完成后切割，以生成游离的信号肽和成熟蛋白。接着，游离的信号肽被特定蛋白酶消化。

信号肽可以在分子的氨基末端。

信号肽可以包含SEQ ID No.22，23或24所示的序列，或具有5，4，3，2或1个氨基酸突变(插入，取代或添加)的其变体，只要信号肽仍然发挥功能以引起CAR的细胞表面表达。

SEQ ID No.22:MGTSLLCWMALCLLGADHADG

SEQ ID No.22的信号肽是紧密且高效的，且来源于TCR beta链。预测它在末端甘氨酸之后产生约95％的切割，产生由信号肽酶进行的有效移除。

SEQ ID No.23:MSLPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID No.23的信号肽来源于IgG1。

SEQ ID No.24:MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

SEQ ID No.24的信号肽来源于CD8a。

胞内域

胞内域是经典CAR的部分，其定位于膜的细胞内侧。

胞内域是经典CAR的信号传输部分。在抗原结合结构域识别抗原后，个体CAR分子簇集，原生(native)CD45和CD148从突触排除，且信号传输至细胞。

如本文定义的第一，第二或第三CAR的胞内域可以是或包含细胞内信号传导结构域。在备选实施方案中，本CAR的胞内域可以能够与存在于胞质的细胞内信号传导分子相互作用，导致信号传导。

细胞内信号传导结构域或分开的细胞内信号传导分子可以是或包含T细胞信号传导结构域。

最普遍使用的信号传导结构域组分是CD3-zeta胞内域的，其含有3个ITAM。这在抗原结合后传输活化信号至T细胞。CD3-zeta可能不提供完全有能力的活化信号，且可能需要另外的共刺激信号传导。例如，可以与CD3-Zeta一同使用嵌合CD28和OX40，以传输增殖/存活信号，或可以全部三个一起使用。

本CAR可以包含单独的CD3-zeta胞内域、CD3-Zeta胞内域与CD28和OX40的胞内域、或CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内域。

胞内域可以包含一个或多个以下项：ICOS胞内域，CD27胞内域，BTLA胞内域，CD30胞内域，GITR胞内域和HVEM胞内域。

胞内域可以包含如SEQ ID No.25至33所示的序列或具有至少80％序列同一性的其变体。

SEQ ID No.25-CD3Z胞内域

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.26-CD28和CD3Zeta胞内域

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.27-CD28,OX40和CD3Zeta胞内域

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID No.28-ICOS胞内域

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL

SEQ ID No.29-CD27胞内域

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP

SEQ ID No.30-BTLA胞内域

RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS

SEQ ID No.31-CD30胞内域

HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK

SEQ ID No.32-GITR胞内域

QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV

SEQ ID No.33-HVEM胞内域

CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH

变体序列可以与SEQ ID No.25至33具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％序列同一性，条件是该序列提供有效的细胞内信号传导结构域。

后续CAR(Subseqeunt CAR)

除了以上定义的第一和第二CAR之外，本发明的细胞可以包含第三和任选的后续CAR(第四，第五，第六等)。

例如，第三CAR可以结合细胞表面抗原，例如肿瘤相关抗原。

各种肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，如以下表2中所示。第三或后续CAR的抗原结合结构域可以是能够结合这些TAA之一的结构域。

表2

癌症类型	TAA
		弥漫性大B细胞淋巴瘤	CD19,CD20,CD22
乳腺癌	ErbB2,MUC1
		AML	CD13,CD33
神经母细胞瘤	GD2,NCAM,ALK,GD2
		B-CLL	CD19,CD52,CD160
结直肠癌	叶酸结合,CA-125
		慢性淋巴细胞白血病	CD5,CD19
胶质瘤	EGFR,波形蛋白
		多发性骨髓瘤	BCMA,CD138
肾细胞癌	碳酸酐酶IX,G250
		前列腺癌	PSMA
肠癌(Bowel cancer)	A33

核酸

本发明还提供了核酸构建体，其包含编码如本发明第一方面相关定义的第一CAR的第一核酸序列；和编码本发明第一方面相关定义的第二CAR的第二核酸序列。

核酸构建体可具有以下结构：

AGB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2

其中

AgB1是编码第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer1是编码第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo 1是编码第一CAR的胞内域的核酸序列；

coexpr是使得能够共同表达两种CAR的核酸序列

AgB2是编码第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer2是编码第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码第二CAR的胞内域的核酸序列。

当核酸构建体在细胞例如T细胞中表达时，其编码在切割位点切割的多肽，使得第一和第二CAR在细胞表面共表达。

当核酸构建体编码三种CAR时，其可以具有以下结构：

AGB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr1-AbB2-spacer2-TM2-endo2-coexpr2-AbB3-spacer3-TM3-endo3

胞内域可以是细胞内的细胞信号传导结构域，或者可以与单独的细胞内信号传导结构域相关联。

如本文所用，术语“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。

技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解的是，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸替换，其不影响此处描述的多核苷酸编码的多肽序列，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物体的密码子选择。

根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包含合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了如本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以进行这样的修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。

与核苷酸序列有关的术语“变体”，“同源物”或“衍生物”包括对序列的一种(或多种)核酸的任何取代，修饰，置换，缺失或添加。

在上述结构中，“coexpr”是使得能够共同表达第一和第二CAR的核酸序列。其可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生包含通过切割位点连接的两个或更多个CAR。切割位点可以是自切割的，从而当产生多肽时，其立即切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。

切割位点可以是能够使得第一和第二CAR分开的任何序列。

术语“切割”在本文中为了方便而使用，但是切割位点可以通过除经典切割外的机制将肽分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自身切割肽(参见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：由宿主-细胞蛋白酶蛋白水解，自体蛋白水解或翻译效应(Donnelly等(2001)J.Gen.Virol.82：1027-1041)。只要当位于编码蛋白质的核酸序列之间的切割位点导致蛋白质作为单独的实体表达时，这种“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要。

切割位点可以是弗林蛋白酶切割位点。

弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是将潜伏的前体蛋白加工成其生物学活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在它们配对的碱性氨基酸加工位点有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原，转化生长因子β1前体，白蛋白原，β-分泌酶原，膜1型基质金属蛋白酶，神经生长因子原的β亚基和Willebrand因子。弗林蛋白酶正好在基本氨基酸靶序列(典型地为Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')的下游切割蛋白，并且在高尔基体中富集。

切割位点可以是烟草蚀刻病毒(TEV)切割位点。

TEV蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是糜蛋白酶样蛋白酶。它非常特异于其靶切割位点，因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有TEV切割位点为ENLYFQ\S(其中“\”表示被切割的肽键)。哺乳动物细胞，如人类细胞，不表达TEV蛋白酶。因此，在本核酸构建体包含TEV切割位点并且在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，必须在哺乳动物细胞中也表达外源TEV蛋白酶。

切割位点可以编码自切割肽。

“自切割肽”是指下述肽，该肽发挥功能使得当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其立即被“切割”或分离成独特的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。

自切割肽可以是来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽。口蹄病毒和心脏病毒的主要2A/2B切割由在其自身C末端“切割”的2A介导。在口蹄病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A型病毒中，2A区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白2B的N末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表了能够在其自身C末端介导“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)，如上文)。

已经在除口蹄病毒或心脏病毒外的小核糖核酸病毒，“小RNA病毒样”昆虫病毒，C型轮状病毒，锥虫属物种中的重复序列和细菌序列中发现了“2A样”序列(Donelly et al(2001)，如上文)。切割位点可以包含这些2A样序列之一，例如：

YHADYYKQRLIHDVEMNPGP(SEQ ID No.34)

HYAGYFADLLIHDIETNPGP(SEQ ID No.35)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID No.36)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID No.37)

AARQMLLLLSGDVETNPGP(SEQ ID No.38)

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID No.39)

TRAEIEDELIRAGIESNPGP(SEQ ID No.40)

TRAEIEDELIRADIESNPGP(SEQ ID No.41)

AKFQIDKILISGDVELNPGP(SEQ ID No.42)

SSIIRTKMLVSGDVEENPGP(SEQ ID No.43)

CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP(SEQ ID No.44)

YPIDFGGFLVKADSEFNPGP(SEQ ID No.45)

切割位点可以包含如SEQ ID No.39所示的2A样序列(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)。

本发明还提供了试剂盒，其包含一种或多种编码根据本发明的第一方面的第一和第二CAR的核酸序列。

拆分(Split)CAR系统

在本发明的一个实施方案中，T细胞刺激胞内域在识别可溶性配体的第一和第二CAR以及识别细胞表面抗原的第三CAR之间“拆分”(参见图9)。

此类“拆分”CAR系统的一个优点是避免了T细胞“打空拳(shadow-boxing)”的可能性，即试图杀伤不在那里的东西。例如，如果可溶性配体存在于T细胞附近，但是分泌可溶性配体的肿瘤细胞太远而不能被活化的T细胞杀伤，则可能发生这种情况。

在该系统中，胞内域可以例如在结合可溶性配体的第一CAR和/或第二CAR；以及与细胞表面抗原结合的第三CAR之间拆分，如下表所示：

在本发明的该实施方案中，第三CAR和第一和/或第二CAR的胞内域在以下意义上“互补”，即它们一起提供信号1和2，或1，2和3，引起细胞活化。因此，当可溶性配体被第一和第二CAR结合并且细胞表面抗原被第三CAR结合时，发生最佳T细胞活化。

在该实施方案中，第三CAR可以结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)而第一和第二CAR可以结合前列腺特异性抗原(PSA)。

基于聚集的抑制性CAR系统

在本发明的第二实施方案中，第一CAR和第二CAR对配体的连接引起第三CAR的抑制。在不存在配体(例如可溶性配体)的情况下第三CAR结合细胞表面抗原导致细胞活化。相反，在配体(例如可溶性配体)存在下，第三CAR结合细胞表面抗原不导致细胞活化，或导致降低的细胞活化(参见图10)。

在该实施方案中，可溶性配体可以是由正常组织而不是癌性组织释放的实体，例如细胞因子。配体可以是例如IL-6。以这种方式，由可溶性CAR提供的抑制性信号可以用于提供CAR相关问题如细胞因子释放综合征或大量活化综合征(mass-activation syndrome)的负反馈回路。

第一和/或第二CAR包含“连接开启”抑制性胞内域，使得当第一和第二CAR结合配体时，由第三CAR结合细胞表面抗原引起的细胞活化被抑制。

在可溶性配体不存在的情况下，“连接开启”抑制性胞内域不显著抑制由第三CAR的细胞活化，但当第一和第二CAR结合可溶性配体时抑制第三CAR的T细胞活化。

“连接开启”抑制性胞内域可以是或包含对于磷酸化ITAM具有足够慢的催化速率的酪氨酸磷酸酶，其当仅第三CAR结合其(细胞表面)抗原时不抑制TCR信号传导，但是当第一和第二CAR的聚集导致抑制性胞内域在突触处浓缩时能够抑制TCR信号传导。

抑制性胞内域可以包含蛋白-酪氨酸磷酸酶如PTPN6的全部或部分。

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)是调节多种细胞过程(包括细胞生长，分化，有丝分裂周期和致癌转化)的信号传导分子。PTP的N末端部分含有两个串联的Src同系物(SH2)结构域，其作为蛋白磷酸-酪氨酸结合结构域起作用，并介导该PTP与其底物的相互作用。该PTP主要在造血细胞中表达，并作为造血细胞中多种信号传导途径的重要调节子起作用。

抑制性结构域可以包含PTPN6的全部(SEQ ID No.46)或仅包含磷酸酶结构域(SEQID No.47)。

SEQ ID 46–PTPN6的序列

MVRWFHRDLSGLDAETLLKGRGVHGSFLARPSRKNQGDFSLSVRVGDQVTHIRIQNSGDFYDLYGGEKFATLTELVEYYTQQQGVLQDRDGTIIHLKYPLNCSDPTSERWYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYYATRVNAADIENRVLELNKKQESEDTAKAGFWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQFIETTKKKLEVLQSQKGQESEYGNITYPPAMKNAHAKASRTSSKHKEDVYENLHTKNKREEKVKKQRSADKEKSKGSLKRK

SEQ ID 47–PTPN6的磷酸酶结构域的序列

FWEEFESLQKQEVKNLHQRLEGQRPENKGKNRYKNILPFDHSRVILQGRDSNIPGSDYINANYIKNQLLGPDENAKTYIASQGCLEATVNDFWQMAWQENSRVIVMTTREVEKGRNKCVPYWPEVGMQRAYGPYSVTNCGEHDTTEYKLRTLQVSPLDNGDLIREIWHYQYLSWPDHGVPSEPGGVLSFLDQINQRQESLPHAGPIIVHCSAGIGRTGTIIVIDMLMENISTKGLDCDIDIQKTIQMVRAQRSGMVQTEAQYKFIYVAIAQF

或者，抑制性胞内域可以是含有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)的胞内域，例如来自CD22，LAIR-1，杀伤抑制性受体家族(KIR)，LILRB1，CTLA4，PD-1，BTLA等的。当磷酸化时，ITIM通过其SH2结构域募集内源性PTPN6。如果与含有ITAM的胞内域共定位，则发生去磷酸化且激活性CAR被抑制。

ITIM是在免疫系统的许多抑制性受体的细胞质尾部中发现的保守的氨基酸序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)。本领域技术人员可以容易地找到含有ITIM的蛋白质结构域。已经通过全蛋白质组扫描生成了含ITIM的人候选蛋白质的列表(Staub,et al(2004)Cell.Signal.16,435–456)。此外，由于共有序列是公知的且似乎需要很少的二级结构，本领域技术人员可以生成人工ITIM。

来自PDCD1，BTLA4，LILRB1，LAIR1，CTLA4，KIR2DL2，KIR2DL4，KIR2DL5，KIR3DL1和KIR3DL3的ITIM胞内域分别在SEQ ID 48至57中显示。

SEQ ID No.48-PDCD1胞内域

CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

SEQ ID No.49-BTLA4

KLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH

SEQ ID No.50-LILRB1

LRHRRQGKHWTSTQRKADFQHPAGAVGPEPTDRGLQWRSSPAADAQEENLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEVKHSRPRREMASPPSPLSGEFLDTKDRQAEEDRQMDTEAAASEAPQDVTYAQLHSLTLRREATEPPPSQEGPSPAVPSIYATLAIH

SEQ ID No.51-LAIR1

HRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSALAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH

SEQ ID No.52CTLA4

FLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN

SEQ ID No.53KIR2DL1

GNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP

SEQ ID No.54KIR2DL4

GIARHLHAVIRYSVAIILFTILPFFLLHRWCSKKKENAAVMNQEPAGHRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLDHCIFTQRKITGPSQRSKRPSTDTSVCIELPNAEPRALSPAHEHHSQALMGSSRETTALSQTQLASSNVPAAGI

SEQ ID No.55KIR2DL5

TGIRRHLHILIGTSVAIILFIILFFFLLHCCCSNKKNAAVMDQEPAGDRTVNREDSDDQDPQEVTYAQLDHCVFTQTKITSPSQRPKTPPTDTTMYMELPNAKPRSLSPAHKHHSQALRGSSRETTALSQNRVASSHVPAAGI

SEQ ID No.56KIR3DL1

KDPRHLHILIGTSVVIILFILLLFFLLHLWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTANSEDSDEQDPEEVTYAQLDHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTILYTELPNAKPRSKVVSCP

SEQ ID No.57KIR3DL3

KDPGNSRHLHVLIGTSVVIIPFAILLFFLLHRWCANKKNAVVMDQEPAGNRTVNREDSDEQDPQEVTYAQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDTSV

或者，抑制性胞内域可以是与融合蛋白共表达的含有ITIM的胞内域。融合蛋白可以包含蛋白酪氨酸磷酸酶的至少一部分和受体样酪氨酸磷酸酶的至少一部分。融合物可以包含来自蛋白-酪氨酸磷酸酶的一个或多个SH2结构域。例如，融合可以在PTPN6SH2结构域和CD45胞内域之间，或者在PTPN6SH2结构域和CD148胞内域之间。当磷酸化时，ITIM结构域募集融合蛋白，使得高度有效的CD45或CD148磷酸酶接近激活性胞内域，阻断活化。说明性融合蛋白的序列以SEQ ID No.58和59给出。

SEQ ID No.58-PTPN6-CD45融合蛋白

WYHGHMSGGQAETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYDYNRVLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFMIQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS

SEQ ID No.59-PTPN6-CD148融合蛋白

ETLLQAKGEPWTFLVRESLSQPGDFVLSVLSDQPKAGPGSPLRVTHIKVMCEGGRYTVGGLETFDSLTDLVEHFKKTGIEEASGAFVYLRQPYRKKRKDAKNNEVSFSQIKPKKSKLIRVENFEAYFKKQQADSNCGFAEEYEDLKLVGISQPKYAAELAENRGKNRYNNVLPYDISRVKLSVQTHSTDDYINANYMPGYHSKKDFIATQGPLPNTLKDFWRMVWEKNVYAIIMLTKCVEQGRTKCEEYWPSKQAQDYGDITVAMTSEIVLPEWTIRDFTVKNIQTSESHPLRQFHFTSWPDHGVPDTTDLLINFRYLVRDYMKQSPPESPILVHCSAGVGRTGTFIAIDRLIYQIENENTVDVYGIVYDLRMHRPLMVQTEDQYVFLNQCVLDIVRSQKDSKVDLIYQNTTAMTIYENLAPVTTFGKTNGYIA

抑制性胞内域可以包含SEQ ID No 46或47的全部或部分。其可以包含SEQ ID 48至57的全部或部分。其可以包含与SEQ ID 58或SEQ ID 59共表达的SEQ ID 48至57的全部或部分。其可以包含具有至少80％序列同一性的序列或其部分的变体，只要该变体保留了在第一和第二CAR连接时抑制第三CAR的T细胞信号传导的能力。

基于共定位的抑制性CAR系统

在本发明的第三实施方案中，第一CAR包含两个抗原结合结构域：一个结合可溶性配体；且一个结合细胞表面抗原。图11中示意性说明了结合结构域的这种串联排列(TanCAR系统)。

当第一CAR在细胞如T细胞表面表达时，结合细胞表面抗原的抗原结合结构域可以在细胞膜的远端，而结合可溶性配体的抗原结合结构域可以在细胞膜的近端。

在该系统中，第二CAR可以包含抑制性胞内域，使得当第一和第二CAR结合可溶性配体时，由第一CAR结合细胞表面抗原引起的细胞活化被抑制。

该抑制性胞内域是“连接开启”抑制性胞内域，使得在不存在可溶性配体的情况下，第二CAR不显著抑制第一CAR的T细胞活化，但当第一和第二CAR结合可溶性配体时抑制第一CAR的T细胞活化。

抑制性胞内域可以是或包含具有慢动力学的磷酸酶，例如包含PTPN6的催化结构域或前面章节中定义的ITIM的磷酸酶。

在本发明的该实施方案中，第一和第二CAR可以结合IL-6。

基于聚集的与门

在本发明的第四实施方案中，结合细胞表面抗原的第三CAR包含激活性胞内域，第一和/或第二CAR包含“结合-关闭(ligation-off)”抑制性胞内域(参见图12)。

该实施方案基于T细胞活化的动力学隔离模型(KS)。这是一种由实验数据支持的功能模型，其解释了T细胞受体的抗原识别如何转化为下游活化信号。简言之：在基态时，T细胞膜上的信号传导组分处于动态平衡状态，因此去磷酸化的ITAM比磷酸化的ITAM有利。这是由于跨膜CD45/CD148磷酸酶比膜栓系的激酶如lck具有更大的活性。当T细胞通过T细胞受体(或CAR)识别关联抗原而与靶细胞接合时，形成紧密的免疫突触。T细胞和靶细胞膜的这种紧密的并置排除了CD45/CD148，因为它们较大的胞外域不能配合到突触中。在没有磷酸酶的情况下，突触中高浓度的T细胞受体相关ITAM和激酶的隔离导致了其中磷酸化ITAM有利的状态。ZAP70识别磷酸化ITAM的阈值并传播T细胞活化信号。本发明利用了对T细胞活化的这种深入理解。具体而言，本发明基于不同长度和/或体积和/或电荷和/或构型和/或糖基化的胞外域在突触形成后如何导致差异隔离的此种理解。

在本发明实施方案的基于聚集的与门中，结合细胞表面抗原的第三CAR包含激活性胞内域，结合可溶性配体的第一和/或第二CAR包含抑制性胞内域。抑制性CAR组成性抑制第三CAR，但在结合可溶性配体后，释放其对激活性CAR的抑制。以这种方式，可以工程化改造T细胞以仅在细胞表面抗原(图12中的配体A)和可溶性抗原(图12中的配体B)存在的情况下触发。这种行为通过包含含有ITAM结构域的激活性胞内域(例如CD3Zeta的胞内域)的第三CAR和包含来自能够使ITAM去磷酸化的磷酸酶(例如CD45或CD148)的胞内域的抑制性CAR来实现。当仅第三CAR连接时，具有抑制性胞内域的第一和/或第二CAR在T细胞表面上在溶液中，并可以扩散进和出突触，抑制激活性CAR。当第一和第二CAR结合可溶性配体时，它们聚集，导致与第三CAR隔离，允许第三CAR触发T细胞活化。

基于共定位的与门

在本发明的第五实施方案中，第一CAR包含两个抗原结合结构域：一个结合可溶性配体；且一个结合细胞表面抗原。结合结构域的串联排列(TanCAR系统)与上述本发明的第三实施方案类似。

在基于共定位的此与门中，第一CAR缺乏功能性胞内域。其可以包含惰性或截短的胞内域。在结合抗原之后，胞内域可以缺少任何或足够数量的ITAM以将活化信号传递至T细胞。

第二CAR包含功能性胞内域，其包含一个或多个能够触发T细胞信号传导的ITAM。可溶性配体的结合引起第一和第二CAR的共定位，并且使得当第一CAR结合细胞表面抗原时发生T细胞信号传导。第二CAR例如可以包含CD3zeta胞内域。

第二CAR可以是单体的以避免在不存在配体A的情况下进行信号传导。这可以通过包含单体间隔区的第二CAR实现。

包含一个或多个Ig结构域的截短形式的CD22可以用作单体间隔区。

载体

本发明还提供载体，或载体的试剂盒，其包含编码根据本发明的第一方面的第一CAR和第二CAR的一种或多种核酸。此类载体可以用于将核酸序列引入宿主细胞中，使得其表达根据本发明的第一方面的第一和第二CAR。

载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。

载体可以能够转染或转导T细胞或NK细胞。

细胞

本发明提供细胞，其包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，所述第一和第二CAR结合相同配体上的不同表位。

该细胞可以包含本发明的核酸或载体。

该细胞可以是细胞裂解性免疫细胞例如T细胞或NK细胞。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其它淋巴细胞例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。

辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。当它们通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，TH细胞被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。

细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原结合而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10，腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞失活至无能力状态，这防止自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。

记忆T细胞是在感染已经消退之后长期持续的抗原特异性T细胞的子集。它们在再次暴露于其关联抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供了针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

以前称为抑制性T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，和抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。

已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞，即自然发生的Treg细胞和适应性Treg细胞。

自然发生的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并与已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其它T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。

适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。

该细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。

NK细胞(属于先天性淋巴样细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴样祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓，淋巴结，脾，扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入循环。

本发明的CAR细胞可以是上述任何细胞类型。

根据本发明第一方面的T或NK细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的设置中产生，或来自不相关供体的外周血(第三方)。

或者，根据本发明第一方面的T或NK细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为T或NK细胞。或者，可以使用保留其溶解功能并且可以用作治疗剂的永生化T细胞系。

在所有这些实施方案中，通过包括使用病毒载体转导，使用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码第一和第二CAR的DNA或RNA来生成CAR细胞。

本发明的CAR细胞可以是来自受试者的离体T或NK细胞。T或NK细胞可以来自外周血单个核细胞(PBMC)样品。T或NK细胞可以在用核酸转导之前活化和/或扩增，所述核酸编码提供根据本发明的第一方面的CAR或根据本发明的第二方面的CAR信号传导系统的组分的分子，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。

本发明的T或NK细胞可以通过以下制备：

(i)从受试者或上文列出的其它来源分离含T或NK细胞的样品；和

(ii)用编码第一和第二CAR的一种或多种核酸序列转导或转染T或NK细胞。

然后可以纯化T或NK细胞，例如通过基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达进行选择来进行。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，其含有多个根据本发明的第一方面的细胞。

药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类剂型可以是例如以适合用于静脉输注的形式。

治疗方法

本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在上述药物组合物中)施用至受试者的步骤。

治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在本文中，细胞可以施用于患有现有疾病或状况的受试者，以减轻，降低或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓，降低或阻断疾病的进展。

预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防用途。在本文中，此类细胞可以施用于尚未感染疾病的受试者和/或没有显示任何疾病症状的受试者以预防或削弱疾病的起因或降低或预防与疾病相关的至少一种症状的形成。该受试者可以具有形成疾病的倾向，或认为有风险形成疾病。

该方法可以包括以下步骤：

(i)分离含T细胞或NK细胞的样品；

(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；

(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。

含T细胞或NK细胞的样品可以从受试者或其他来源(例如如上所述)分离。可以从受试者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植(第二方)的背景中，或从不相关供体的外周血(第三方)分离T细胞或NK细胞。

本发明提供本发明的CAR细胞，其用于治疗和/或预防疾病。

本发明还涉及本发明的CAR细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，肾癌(肾细胞)，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。

在可溶性配体是PSA的情况下，癌症可以是前列腺癌。

本发明的CAR细胞可以能够杀死靶细胞，例如癌细胞。靶细胞可以通过在靶细胞附近可溶性配体的存在来表征。靶细胞可以通过可溶性配体的存在以及靶细胞表面处肿瘤相关抗原(TAA)的表达来表征。

本发明的CAR细胞可以能够杀伤靶细胞，例如癌细胞，其表达低密度的TAA。已知在某些癌症中以低密度表达的TAA的实例包括但不限于CLL中的ROR1，黑色素瘤中的Typr-1和骨髓瘤中的BCMA。

本发明的CAR细胞和药物组合物可用于上述疾病的治疗和/或预防。

本发明的CAR细胞和药物组合物可以用于上述任何方法中。

现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并不意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1-用可溶性配体触发T细胞活化

通常情况下，CAR不会被单体可溶性配体激活，因为配体只与受体结合而不会导致接合的受体的隔离(图1)。为了将受体聚集于可溶性配体，有必要具有与两个非竞争性表位结合的至少两种CAR(图2)。CAR通常是同二聚体，但是三聚体或多价受体可以显示改善的性能(图3)。

作为概念验证，使用可溶性单体ROR-1作为配体(图4)。使用两个CAR，其与ROR-1配体上名为R12和R11的互斥表位结合。根据聚集模型，预测使用可溶性配体，表达R11或R12的T细胞将不会活化，但是在可溶性配体存在下表达R12和R11两者的T细胞将活化。为了停止R12和R11CAR彼此交叉结合(引起异源二聚体)，将R12置于CD8STK间隔区上并将R11置于Fc间隔区上(图5)。作为对照，使用表达双CAR的T细胞，其中两个CAR都含有R12scFv(一个在CD8STK上而另一个在Fc间隔区上)。为了研究具有CAR之一为多价CAR的效果，在一个系统中将R12CAR置于CD8STK间隔区上并将R11置于COMP间隔区上(图6)。

使用含有CD8STK或Fc间隔区上的R12scFv的单CAR或含有Fc或COMP间隔区上的R11scFv的单CAR转导小鼠T细胞系(BW5细胞)。另外，转导R12-CD8STK阳性的BW5细胞以表达第二CAR，其是R11-Fc，R11-COMP或作为对照的R12-Fc。本实验中使用的所有CAR都具有细胞内TCRz结构域(第1代)。使用含有可溶性ROR-1(His标签)的上清液刺激这些细胞，24小时后测量IL-2(图7)。

发现只有表达R11和R12CAR两者的T细胞能够在可溶性配体存在下刺激。重要的是，表达R12的两个拷贝的T细胞不能用可溶性配体刺激。

作为测试这些T细胞能够被固定化配体刺激的进一步对照，这些T细胞用用不同浓度的可溶性ROR-1his标签预先包被的抗His珠粒刺激(图8)。该图显示所有T细胞都能够用固定化配体刺激，表明本实验中使用的所有T细胞都能够传输信号，但是只有针对两个互斥表位的双CAR才能用可溶性配体刺激。

实施例2-使用基于聚集的与门以在膜结合配体和可溶性配体两者的存在下触发T 细胞活化

为了证明“拆分”CAR系统的可行性，用表达以下任一项的载体转导BW5细胞：

i)aCD19-CD8STK-TCRz-2A-R12-IgGFc-CD148或

ii)aCD19-CD8STK-TCRz-2A-R12-IgGFc-CD148和R11-IgMFc-CD148并暴露于未转染的SupT1靶细胞或表达CD19的SupT1靶细胞。用不同浓度的可溶性ROR-1上清液以4:1的靶标对效应物比率进行共培养。

结果显示在图14中。在存在膜结合抗原(CD19)和可溶性配体(ROR1)两者的情况下，T细胞活化是最大的。不表达膜结合抗原(NT)的靶标不产生T细胞刺激。

实施例3-使用基于结合PSA的mAb(5D5A5和5D5D11)的双CAR系统，用可溶性配体 PSA发生诱导聚集和后续T细胞活化

使用表达以下项的载体转导BW5T细胞；

i)A5-D11(aPSA-A5-CD8STK-CD28TM-z_aPSA-D11-HL-Hinge-CD28tmZ)或

ii)D11-A5(aPSA-D11-CD8STK-CD28TM-z_aPSA-A5-HL-Hinge-CD28tmZ)

然后在300pg/mL PSA的存在下孵育以确定双CAR系统的构建体中的PSA抗原结合结构域是否诱导聚集和后续的CAR活化。图(图15)显示了A5-D11和D11-A5构建体均导致BW5T细胞分泌显著水平的IL-2，指示T细胞活化。

在上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该过度限于这些具体实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰旨在在所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 奥托路斯有限公司

<120> 细胞

<130> P106882PCT

<150> GB1514874.5

<151> 2015-08-20

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5D3D11 VH的序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Tyr Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5D3D11 VL的序列

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Pro Ser Val Phe Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5D5A5 VH的序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5D5A5 VL的序列

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Leu Tyr

20 25 30

Gly Phe Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Ile Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1的铰链-CH2CH3

<400> 5

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp

225 230

<210> 6

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD8茎部

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1铰链

<400> 7

Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Pro Lys

20

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (驱动蛋白运动蛋白: 平行同二聚体)

<400> 8

Met His Ala Ala Leu Ser Thr Glu Val Val His Leu Arg Gln Arg Thr

1 5 10 15

Glu Glu Leu Leu Arg Cys Asn Glu Gln Gln Ala Ala Glu Leu Glu Thr

20 25 30

Cys Lys Glu Gln Leu Phe Gln Ser Asn Met Glu Arg Lys Glu Leu His

35 40 45

Asn Thr Val Met Asp Leu Arg Gly Asn

50 55

<210> 9

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (D型肝炎delta抗原:平行同二聚体)

<400> 9

Gly Arg Glu Asp Ile Leu Glu Gln Trp Val Ser Gly Arg Lys Lys Leu

1 5 10 15

Glu Glu Leu Glu Arg Asp Leu Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys

20 25 30

Leu Glu Glu Asp Asn Pro Trp Leu Gly Asn Ile Lys Gly Ile Ile Gly

35 40 45

Lys Tyr

50

<210> 10

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (古细菌盒C/D sRNP核心蛋白:反平行异二聚体)

<400> 10

Arg Tyr Val Val Ala Leu Val Lys Ala Leu Glu Glu Ile Asp Glu Ser

1 5 10 15

Ile Asn Met Leu Asn Glu Lys Leu Glu Asp Ile Arg Ala Val Lys Glu

20 25 30

Ser Glu Ile Thr Glu Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Arg Glu

35 40 45

Leu Arg Arg Asp Val Glu Arg Glu Ile Glu Glu Val Met

50 55 60

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (甘露糖结合蛋白A: 平行同三聚体)

<400> 11

Ala Ile Glu Val Lys Leu Ala Asn Met Glu Ala Glu Ile Asn Thr Leu

1 5 10 15

Lys Ser Lys Leu Glu Leu Thr Asn Lys Leu His Ala Phe Ser Met

20 25 30

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (C卷曲螺旋富含丝氨酸的蛋白1: 平行同三聚体)

<400> 12

Glu Trp Glu Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ala Ala Leu Glu Ser Lys Leu

1 5 10 15

Gln Ala Leu Glu Lys Lys Leu Glu Ala Leu Glu His Gly

20 25

<210> 13

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (多肽释放因子2: 反平行异三聚体链A)

<400> 13

Ile Asn Pro Val Asn Asn Arg Ile Gln Asp Leu Thr Glu Arg Ser Asp

1 5 10 15

Val Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr

20

<210> 14

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (多肽释放因子2: 反平行异三聚体链B)

<400> 14

Val Val Asp Thr Leu Asp Gln Met Lys Gln Gly Leu Glu Asp Val Ser

1 5 10 15

Gly Leu Leu Glu Leu Ala Val Glu Ala Asp Asp Glu Glu Thr Phe Asn

20 25 30

Glu Ala Val Ala Glu Leu Asp Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ala Gln Leu

35 40 45

Glu Phe Arg

50

<210> 15

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (SNAP-25和SNARE: 平行异四聚体链A)

<400> 15

Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg

1 5 10 15

Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln

20 25 30

Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp

35 40 45

Tyr Val Glu

50

<210> 16

<211> 67

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (SNAP-25和SNARE: 平行异四聚体链B)

<400> 16

Ala Leu Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu

1 5 10 15

Asn Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu

20 25 30

Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu

35 40 45

His Ala Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala

50 55 60

Val Lys Tyr

65

<210> 17

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (链C)

<400> 17

Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser

1 5 10 15

Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp

20 25 30

Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu

35 40 45

Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu

50 55 60

Ala Glu Lys Asn Leu

65

<210> 18

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (SNAP-25和SNARE: 平行异四聚体链D)

<400> 18

Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser Ile Arg

1 5 10 15

Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser Gln

20 25 30

Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala Val Asp

35 40 45

Tyr Val Glu

50

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (Lac阻遏蛋白: 平行同四聚体)

<400> 19

Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln Val

1 5 10 15

Ser Arg Leu Glu

20

<210> 20

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 卷曲螺旋结构域的序列 (载脂蛋白E: 反平行异四聚体)

<400> 20

Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu

1 5 10 15

Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser

20 25 30

Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met Asp Glu Thr Met Lys

35 40 45

Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Ala Arg

50 55 60

Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met

65 70 75 80

Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala

85 90 95

Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His

100 105 110

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln

115 120 125

Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala

130 135

<210> 21

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> COMP卷曲螺旋结构域

<400> 21

Asp Leu Gly Pro Gln Met Leu Arg Glu Leu Gln Glu Thr Asn Ala Ala

1 5 10 15

Leu Gln Asp Val Arg Glu Leu Leu Arg Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr

20 25 30

Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys Asp Ala Cys Gly

35 40 45

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于TCR beta链的信号肽

<400> 22

Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Asp His Ala Asp Gly

20

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于IgG1的信号肽

<400> 23

Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来源于CD8a的信号肽

<400> 24

Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys

20

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3 Z 胞内域

<400> 25

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 26

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28和CD3 Zeta 胞内域

<400> 26

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

35 40 45

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

50 55 60

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

65 70 75 80

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

85 90 95

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

100 105 110

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

115 120 125

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

130 135 140

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

145 150

<210> 27

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28, OX40和CD3 Zeta 胞内域

<400> 27

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp

35 40 45

Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu

50 55 60

Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe

65 70 75 80

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

85 90 95

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

100 105 110

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

115 120 125

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

130 135 140

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

145 150 155 160

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

165 170 175

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

180 185

<210> 28

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ICOS 胞内域

<400> 28

Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn

1 5 10 15

Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg

20 25 30

Leu Thr Asp Val Thr Leu

35

<210> 29

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD27 胞内域

<400> 29

Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr

20 25 30

Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

35 40 45

<210> 30

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BTLA 胞内域

<400> 30

Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg

1 5 10 15

Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala

20 25 30

Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr

35 40 45

Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val

50 55 60

Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala

65 70 75 80

Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn

85 90 95

Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser

100 105 110

<210> 31

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD30 胞内域

<400> 31

His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg

20 25 30

Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu

35 40 45

Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr

50 55 60

Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp

65 70 75 80

Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro

85 90 95

Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile

100 105 110

Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro

115 120 125

Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu

130 135 140

Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro

145 150 155 160

Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly

165 170 175

Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys

180 185

<210> 32

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GITR 胞内域

<400> 32

Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro

1 5 10 15

Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala

20 25 30

Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu

35 40 45

Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val

50 55

<210> 33

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HVEM 胞内域

<400> 33

Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile

20 25 30

Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu

35 40 45

Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His

50 55 60

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 34

Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 35

His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu Thr

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 36

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 37

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 38

Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 39

Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 40

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 40

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 41

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 41

Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Asp Ile Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 42

Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 43

Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 44

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 44

Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 45

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 切割位点, 2A样序列

<400> 45

Tyr Pro Ile Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 46

<211> 595

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制结构域, PTPN6

<400> 46

Met Val Arg Trp Phe His Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr

1 5 10 15

Leu Leu Lys Gly Arg Gly Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser

20 25 30

Arg Lys Asn Gln Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln

35 40 45

Val Thr His Ile Arg Ile Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr

50 55 60

Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr

65 70 75 80

Gln Gln Gln Gly Val Leu Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu

85 90 95

Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ser Asp Pro Thr Ser Glu Arg Trp Tyr His

100 105 110

Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly

115 120 125

Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp

130 135 140

Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser

145 150 155 160

Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr

165 170 175

Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu

180 185 190

His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr

195 200 205

Leu Arg Gln Pro Tyr Tyr Ala Thr Arg Val Asn Ala Ala Asp Ile Glu

210 215 220

Asn Arg Val Leu Glu Leu Asn Lys Lys Gln Glu Ser Glu Asp Thr Ala

225 230 235 240

Lys Ala Gly Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val

245 250 255

Lys Asn Leu His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly

260 265 270

Lys Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile

275 280 285

Leu Gln Gly Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala

290 295 300

Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Tyr Ile Ala Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp

325 330 335

Gln Met Ala Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg

340 345 350

Glu Val Glu Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val

355 360 365

Gly Met Gln Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu

370 375 380

His Asp Thr Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu

385 390 395 400

Asp Asn Gly Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser

405 410 415

Trp Pro Asp His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe

420 425 430

Leu Asp Gln Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro

435 440 445

Ile Ile Val His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile

450 455 460

Val Ile Asp Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys

465 470 475 480

Asp Ile Asp Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser

485 490 495

Gly Met Val Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile

500 505 510

Ala Gln Phe Ile Glu Thr Thr Lys Lys Lys Leu Glu Val Leu Gln Ser

515 520 525

Gln Lys Gly Gln Glu Ser Glu Tyr Gly Asn Ile Thr Tyr Pro Pro Ala

530 535 540

Met Lys Asn Ala His Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ser Ser Lys His Lys

545 550 555 560

Glu Asp Val Tyr Glu Asn Leu His Thr Lys Asn Lys Arg Glu Glu Lys

565 570 575

Val Lys Lys Gln Arg Ser Ala Asp Lys Glu Lys Ser Lys Gly Ser Leu

580 585 590

Lys Arg Lys

595

<210> 47

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制结构域, PTPN6的磷酸酶结构域

<400> 47

Phe Trp Glu Glu Phe Glu Ser Leu Gln Lys Gln Glu Val Lys Asn Leu

1 5 10 15

His Gln Arg Leu Glu Gly Gln Arg Pro Glu Asn Lys Gly Lys Asn Arg

20 25 30

Tyr Lys Asn Ile Leu Pro Phe Asp His Ser Arg Val Ile Leu Gln Gly

35 40 45

Arg Asp Ser Asn Ile Pro Gly Ser Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Ile

50 55 60

Lys Asn Gln Leu Leu Gly Pro Asp Glu Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Ala

65 70 75 80

Ser Gln Gly Cys Leu Glu Ala Thr Val Asn Asp Phe Trp Gln Met Ala

85 90 95

Trp Gln Glu Asn Ser Arg Val Ile Val Met Thr Thr Arg Glu Val Glu

100 105 110

Lys Gly Arg Asn Lys Cys Val Pro Tyr Trp Pro Glu Val Gly Met Gln

115 120 125

Arg Ala Tyr Gly Pro Tyr Ser Val Thr Asn Cys Gly Glu His Asp Thr

130 135 140

Thr Glu Tyr Lys Leu Arg Thr Leu Gln Val Ser Pro Leu Asp Asn Gly

145 150 155 160

Asp Leu Ile Arg Glu Ile Trp His Tyr Gln Tyr Leu Ser Trp Pro Asp

165 170 175

His Gly Val Pro Ser Glu Pro Gly Gly Val Leu Ser Phe Leu Asp Gln

180 185 190

Ile Asn Gln Arg Gln Glu Ser Leu Pro His Ala Gly Pro Ile Ile Val

195 200 205

His Cys Ser Ala Gly Ile Gly Arg Thr Gly Thr Ile Ile Val Ile Asp

210 215 220

Met Leu Met Glu Asn Ile Ser Thr Lys Gly Leu Asp Cys Asp Ile Asp

225 230 235 240

Ile Gln Lys Thr Ile Gln Met Val Arg Ala Gln Arg Ser Gly Met Val

245 250 255

Gln Thr Glu Ala Gln Tyr Lys Phe Ile Tyr Val Ala Ile Ala Gln Phe

260 265 270

<210> 48

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDCD1 胞内域

<400> 48

Cys Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln

1 5 10 15

Pro Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr

20 25 30

Gly Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val

35 40 45

Pro Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser

50 55 60

Gly Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro

65 70 75 80

Arg Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro

85 90 95

Leu

<210> 49

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BTLA4 胞内域

<400> 49

Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly Leu Gln

1 5 10 15

Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys Val Arg

20 25 30

Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr Asn Pro

35 40 45

Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro Glu Met

50 55 60

Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln Arg Pro

65 70 75 80

Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His Lys Arg

85 90 95

Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu Asp Glu

100 105 110

Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu Arg Pro

115 120 125

Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His

130 135 140

<210> 50

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LILRB1 胞内域

<400> 50

Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys

1 5 10 15

Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp

20 25 30

Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu

35 40 45

Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu

50 55 60

Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro

85 90 95

Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu

100 105 110

Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln

115 120 125

Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala

130 135 140

Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser

145 150 155 160

Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His

165

<210> 51

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LAIR1 胞内域

<400> 51

His Arg Gln Asn Gln Ile Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu

1 5 10 15

Glu Gln Lys Pro Gln Gln Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu

20 25 30

Arg Thr Ala Asp Lys Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg

35 40 45

Glu Thr Asp Thr Ser Ala Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Ala Gln Leu Asp His Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala

65 70 75 80

Val Ser Pro Gln Ser Thr Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala

85 90 95

Ala Val Ala Arg His

100

<210> 52

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA4 胞内域

<400> 52

Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr

1 5 10 15

Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg

20 25 30

Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro

35 40 45

Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

50 55 60

<210> 53

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KIR2DL1 胞内域

<400> 53

Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile

1 5 10 15

Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ala

20 25 30

Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg

35 40 45

Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Thr Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg

65 70 75 80

Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Ile Ile Val Tyr Thr

85 90 95

Glu Leu Pro Asn Ala Glu Ser Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro

100 105 110

<210> 54

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KIR2DL4 胞内域

<400> 54

Gly Ile Ala Arg His Leu His Ala Val Ile Arg Tyr Ser Val Ala Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Thr Ile Leu Pro Phe Phe Leu Leu His Arg Trp Cys Ser

20 25 30

Lys Lys Lys Glu Asn Ala Ala Val Met Asn Gln Glu Pro Ala Gly His

35 40 45

Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln Glu Val

50 55 60

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Ile Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr

65 70 75 80

Gly Pro Ser Gln Arg Ser Lys Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ser Val Cys

85 90 95

Ile Glu Leu Pro Asn Ala Glu Pro Arg Ala Leu Ser Pro Ala His Glu

100 105 110

His His Ser Gln Ala Leu Met Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Gln Thr Gln Leu Ala Ser Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Ile

130 135 140

<210> 55

<211> 143

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KIR2DL5 胞内域

<400> 55

Thr Gly Ile Arg Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Ala

1 5 10 15

Ile Ile Leu Phe Ile Ile Leu Phe Phe Phe Leu Leu His Cys Cys Cys

20 25 30

Ser Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asp

35 40 45

Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Asp Gln Asp Pro Gln Glu Val

50 55 60

Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Thr Lys Ile Thr

65 70 75 80

Ser Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Thr Met Tyr

85 90 95

Met Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Leu Ser Pro Ala His Lys

100 105 110

His His Ser Gln Ala Leu Arg Gly Ser Ser Arg Glu Thr Thr Ala Leu

115 120 125

Ser Gln Asn Arg Val Ala Ser Ser His Val Pro Ala Ala Gly Ile

130 135 140

<210> 56

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KIR3DL1 胞内域

<400> 56

Lys Asp Pro Arg His Leu His Ile Leu Ile Gly Thr Ser Val Val Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Ile Leu Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Leu Trp Cys Ser

20 25 30

Asn Lys Lys Asn Ala Ala Val Met Asp Gln Glu Pro Ala Gly Asn Arg

35 40 45

Thr Ala Asn Ser Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Glu Glu Val Thr

50 55 60

Tyr Ala Gln Leu Asp His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys Ile Thr Arg

65 70 75 80

Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ile Leu Tyr Thr

85 90 95

Glu Leu Pro Asn Ala Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Ser Cys Pro

100 105 110

<210> 57

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KIR3DL3 胞内域

<400> 57

Lys Asp Pro Gly Asn Ser Arg His Leu His Val Leu Ile Gly Thr Ser

1 5 10 15

Val Val Ile Ile Pro Phe Ala Ile Leu Leu Phe Phe Leu Leu His Arg

20 25 30

Trp Cys Ala Asn Lys Lys Asn Ala Val Val Met Asp Gln Glu Pro Ala

35 40 45

Gly Asn Arg Thr Val Asn Arg Glu Asp Ser Asp Glu Gln Asp Pro Gln

50 55 60

Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asn His Cys Val Phe Thr Gln Arg Lys

65 70 75 80

Ile Thr Arg Pro Ser Gln Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Asp Thr Ser

85 90 95

Val

<210> 58

<211> 807

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PTPN6-CD45 融合蛋白

<400> 58

Trp Tyr His Gly His Met Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Leu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Leu Ser Gln

20 25 30

Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp Gln Pro Lys Ala Gly

35 40 45

Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys Val Met Cys Glu Gly

50 55 60

Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe Asp Ser Leu Thr Asp

65 70 75 80

Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu Glu Ala Ser Gly Ala

85 90 95

Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys

100 105 110

Arg Ser Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp

115 120 125

Glu Lys Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu

130 135 140

Glu Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala

145 150 155 160

Glu Phe Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe Pro Ile Lys Glu

165 170 175

Ala Arg Lys Pro Phe Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr Val Asp Ile Leu

180 185 190

Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile Asn Gly Asp Ala

195 200 205

Gly Ser Asn Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly Phe Lys Glu Pro

210 215 220

Arg Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu Thr Val Asp Asp

225 230 235 240

Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val Ile Val Met Val

245 250 255

Thr Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala Glu Tyr Trp Pro

260 265 270

Ser Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Gly Asp Val Val Val Lys Ile

275 280 285

Asn Gln His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln Lys Leu Asn Ile

290 295 300

Val Asn Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val Thr His Ile Gln

305 310 315 320

Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp Pro His Leu Leu

325 330 335

Leu Lys Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn Phe Phe Ser Gly

340 345 350

Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr

355 360 365

Ile Gly Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala Glu Asn Lys Val

370 375 380

Asp Val Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln Arg Cys Leu Met

385 390 395 400

Val Gln Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln Ala Leu Val Glu

405 410 415

Tyr Asn Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser Glu Leu His Pro

420 425 430

Tyr Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser Glu Pro Ser Pro

435 440 445

Leu Glu Ala Glu Phe Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg Ser Trp Arg Thr

450 455 460

Gln His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Ser Lys Asn Arg Asn Ser

465 470 475 480

Asn Val Ile Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Leu Lys His Glu Leu Glu

485 490 495

Met Ser Lys Glu Ser Glu His Asp Ser Asp Glu Ser Ser Asp Asp Asp

500 505 510

Ser Asp Ser Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ile Asn Ala Ser Phe Ile Met

515 520 525

Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys

530 535 540

Glu Thr Ile Gly Asp Phe Met Ile Gln Arg Lys Val Lys Val Ile Val

545 550 555 560

Met Leu Thr Glu Leu Lys His Gly Asp Gln Glu Ile Cys Ala Gln Tyr

565 570 575

Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr Gly Asp Ile Glu Val Asp Leu Lys

580 585 590

Asp Thr Asp Lys Ser Ser Thr Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg

595 600 605

His Ser Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr

610 615 620

Asn Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Ile Ser

625 630 635 640

Met Ile Gln Val Val Lys Gln Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser Glu

645 650 655

Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys Arg Asp

660 665 670

Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Glu

675 680 685

Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln Val Val Lys Ala

690 695 700

Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr Phe Glu Gln Tyr Gln

705 710 715 720

Phe Leu Tyr Asp Val Ile Ala Ser Thr Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln

725 730 735

Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp Lys Ile Glu Phe Asp Asn Glu

740 745 750

Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly Ala

755 760 765

Pro Glu Lys Leu Pro Glu Ala Lys Glu Gln Ala Glu Gly Ser Glu Pro

770 775 780

Thr Ser Gly Thr Glu Gly Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala Ser

785 790 795 800

Pro Ala Leu Asn Gln Gly Ser

805

<210> 59

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PTPN6-CD148 融合物

<400> 59

Glu Thr Leu Leu Gln Ala Lys Gly Glu Pro Trp Thr Phe Leu Val Arg

1 5 10 15

Glu Ser Leu Ser Gln Pro Gly Asp Phe Val Leu Ser Val Leu Ser Asp

20 25 30

Gln Pro Lys Ala Gly Pro Gly Ser Pro Leu Arg Val Thr His Ile Lys

35 40 45

Val Met Cys Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Val Gly Gly Leu Glu Thr Phe

50 55 60

Asp Ser Leu Thr Asp Leu Val Glu His Phe Lys Lys Thr Gly Ile Glu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Gly Ala Phe Val Tyr Leu Arg Gln Pro Tyr Arg Lys Lys

85 90 95

Arg Lys Asp Ala Lys Asn Asn Glu Val Ser Phe Ser Gln Ile Lys Pro

100 105 110

Lys Lys Ser Lys Leu Ile Arg Val Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Phe Lys

115 120 125

Lys Gln Gln Ala Asp Ser Asn Cys Gly Phe Ala Glu Glu Tyr Glu Asp

130 135 140

Leu Lys Leu Val Gly Ile Ser Gln Pro Lys Tyr Ala Ala Glu Leu Ala

145 150 155 160

Glu Asn Arg Gly Lys Asn Arg Tyr Asn Asn Val Leu Pro Tyr Asp Ile

165 170 175

Ser Arg Val Lys Leu Ser Val Gln Thr His Ser Thr Asp Asp Tyr Ile

180 185 190

Asn Ala Asn Tyr Met Pro Gly Tyr His Ser Lys Lys Asp Phe Ile Ala

195 200 205

Thr Gln Gly Pro Leu Pro Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Arg Met Val

210 215 220

Trp Glu Lys Asn Val Tyr Ala Ile Ile Met Leu Thr Lys Cys Val Glu

225 230 235 240

Gln Gly Arg Thr Lys Cys Glu Glu Tyr Trp Pro Ser Lys Gln Ala Gln

245 250 255

Asp Tyr Gly Asp Ile Thr Val Ala Met Thr Ser Glu Ile Val Leu Pro

260 265 270

Glu Trp Thr Ile Arg Asp Phe Thr Val Lys Asn Ile Gln Thr Ser Glu

275 280 285

Ser His Pro Leu Arg Gln Phe His Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly

290 295 300

Val Pro Asp Thr Thr Asp Leu Leu Ile Asn Phe Arg Tyr Leu Val Arg

305 310 315 320

Asp Tyr Met Lys Gln Ser Pro Pro Glu Ser Pro Ile Leu Val His Cys

325 330 335

Ser Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Ile Ala Ile Asp Arg Leu

340 345 350

Ile Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Asn Thr Val Asp Val Tyr Gly Ile Val

355 360 365

Tyr Asp Leu Arg Met His Arg Pro Leu Met Val Gln Thr Glu Asp Gln

370 375 380

Tyr Val Phe Leu Asn Gln Cys Val Leu Asp Ile Val Arg Ser Gln Lys

385 390 395 400

Asp Ser Lys Val Asp Leu Ile Tyr Gln Asn Thr Thr Ala Met Thr Ile

405 410 415

Tyr Glu Asn Leu Ala Pro Val Thr Thr Phe Gly Lys Thr Asn Gly Tyr

420 425 430

Ile Ala

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的COMP卷曲螺旋结构域

<400> 60

Cys Asp Ala Cys Gly

1 5

<210> 61

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的COMP卷曲螺旋结构域

<400> 61

Gln Gln Val Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asn Thr Val Met Glu Cys

1 5 10 15

Asp Ala Cys Gly

20

<210> 62

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 弗林蛋白酶切割位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何天然发生的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是Arg或Lys

<400> 62

Arg Xaa Xaa Arg

1

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 共有烟草蚀刻病毒 (TEV) 切割位点

<400> 63

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ITIM保守序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可以是Ser, Ile, Val或Leu

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何天然发生的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> Xaa 可以是任何天然发生的氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa 可以是Ile, Val或Leu

<400> 64

Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa

1 5

Claims (38)

1.细胞，其包含第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一和第二CAR结合相同配体上的不同表位。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述配体是可溶性配体。

3.根据权利要求2的细胞，其中所述配体是细胞因子、趋化因子或代谢物。

4.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中每个CAR包含

(i)抗原结合结构域；

(ii)间隔区；和

(iii)跨膜结构域

其中所述第一和第二CAR的间隔区是不同的。

5.根据前述权利要求中任一项的细胞，其中每个CAR包含

(i)抗原结合结构域；

(ii)间隔区；和

(iii)跨膜结构域

其中所述第一和/或第二CAR的间隔区是三聚的或多价的。

6.根据前述权利要求中任一项的细胞，其包含结合细胞表面抗原的第三CAR。

7.根据权利要求6的细胞，其中所述第一和/或第二和第三CAR各自包含：

(i)抗原结合结构域；

(ii)跨膜结构域；和

(iii)胞内域

其中所述第三CAR和所述第一和/或第二CAR的胞内域是互补的，使得当所述第一和第二CAR结合所述配体且所述第三CAR结合所述细胞表面抗原时，发生细胞活化。

8.根据权利要求7的细胞，其中所述第三CAR包含CD3zeta胞内域，且所述第一和/或第二CAR包含CD28胞内域和OX40或41BB胞内域。

9.根据权利要求6至8中任一项的细胞，其中所述第三CAR结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)而所述第一和第二CAR结合前列腺特异性抗原(PSA)。

10.根据权利要求6的细胞，其中所述第一和/或第二CAR包含抑制性胞内域，使得当所述第一和第二CAR结合所述配体时，由所述第三CAR结合所述细胞表面抗原导致的细胞活化被抑制。

11.根据权利要求2的细胞，其中所述第一CAR包含两个抗原结合结构域：一个结合所述可溶性配体；且一个结合细胞表面抗原。

12.根据权利要求1至5中任一项的细胞，其中所述第二CAR包含抑制性胞内域，使得当所述第一和第二CAR结合所述可溶性配体时，由所述第一CAR结合所述细胞表面抗原导致的细胞活化被抑制。

13.根据权利要求10或12的细胞，其中所述抑制性胞内域是或包含PTPN6的催化结构域或基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。

14.根据权利要求10至13中任一项的细胞，其中所述第一和第二CAR结合IL-6。

15.根据权利要求6的细胞，其中所述第一和/或第二CAR包含抑制性胞内域，使得：

在不存在所述配体的情况下，由所述第三CAR结合所述细胞表面抗原导致的细胞活化被抑制；和

在存在配体的情况下，所述第一和第二CAR聚集并与所述第三CAR隔离，使得当所述第三CAR结合所述细胞表面抗原时能发生信号传导。

16.根据权利要求15的细胞，其中所述抑制性胞内域是或包含CD45或CD148的胞内域。

17.根据权利要求11的细胞，其中所述第一CAR缺乏功能性胞内域且其中所述第二CAR是单体的并包含功能性胞内域，使得所述可溶性配体的结合导致所述第一和第二CAR的共定位且当所述第一CAR结合所述细胞表面抗原时T细胞信号传导能够发生。

18.根据权利要求17的细胞，其中所述第二CAR包含单体间隔区。

19.根据权利要求18的细胞，其中所述单体间隔区包含一个或多个来自CD22的Ig结构域。

20.根据权利要求17至19中任一项的细胞，其中所述第二CAR上的功能性胞内域包含CD3-zeta胞内域。

21.核酸构建体，其包含编码如权利要求1至20中任一项定义的第一CAR的第一核酸序列，和编码如权利要求1至20中任一项定义的第二CAR的第二核酸序列。

22.根据权利要求21的核酸构建体，其具有以下结构：

AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2

其中

AgB1是编码所述第一CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer1是编码所述第一CAR的间隔区的核酸序列；

TM1是编码所述第一CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo1是编码所述第一CAR的胞内域的核酸序列；

coexpr是使得两个CAR能够共表达的核酸序列；

AgB2是编码所述第二CAR的抗原结合结构域的核酸序列；

spacer2是编码所述第二CAR的间隔区的核酸序列；

TM2是编码所述第二CAR的跨膜结构域的核酸序列；

endo2是编码所述第二CAR的胞内域的核酸序列；

所述核酸构建体当在T细胞中表达时编码多肽，所述多肽在切割位点被切割使得所述第一和第二CAR在所述T细胞表面共表达。

23.根据权利要求22的核酸构建体，其中所述coexpr编码包含自切割肽的序列。

24.根据权利要求22或23的核酸构建体，其中为了避免同源重组，在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用替换密码子。

25.根据权利要求21至24中任一项的核酸构建体，其还包含编码如权利要求6至10，15和16中任一项定义的第三CAR的核酸序列。

26.载体，其包含根据权利要求21至25中任一项的核酸构建体。

27.根据权利要求26的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。

28.试剂盒，其包含

i)载体，其包含编码如权利要求1至5中任一项定义的第一CAR的核酸序列；和

ii)载体，其包含编码如权利要求1至5中任一项定义的第二CAR的核酸序列。

29.根据权利要求28的试剂盒，其还包含包括编码如权利要求6中定义的第三CAR的核酸序列的载体。

30.制备根据权利要求1至20中任一项的细胞的方法，其包括将以下项引入细胞的步骤：根据权利要求权利要求21至25中任一项的核酸构建体；根据权利要求26或27的载体；或根据权利要求28或29的载体的试剂盒。

31.根据权利要求30的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。

32.药物组合物，其包括多个根据权利要求1至20中任一项的细胞。

33.治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求32的药物组合物施用至受试者的步骤。

34.根据权利要求33的方法，其包括以下步骤：

(i)从受试者分离含细胞的样品；

(ii)使用以下项转导或转染细胞：根据权利要求权利要求21至25中任一项的核酸构建体；根据权利要求26或27的载体；或根据权利要求28或29的载体的试剂盒；和

(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。

35.根据权利要求34的方法，其中所述样品是含T细胞的样品。

36.根据权利要求34或35的方法，其中所述疾病是癌症。

37.根据权利要求32的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。

38.根据权利要求1至20中任一项的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。