KR20210072797A - 키메라 항원 수용체(car) 그룹 - Google Patents

Abstract

2개, 3개 또는 4개 CAR 분자로 구성되고, 키메라 항원 수용체(CAR) 그룹을 개시하고,
여기서 상기 CAR 그룹의 각 구성원은 아미노산 서열이 서로 상이하고,
여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자는 적어도 하나의 막관통 도메인 및 엑토도메인을 포함하고, 상기 엑토도메인은 하나 또는 2개의 항원 결합 모이어티 및/또는 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 각 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 하나 또는 2개의 결합 부위를 포함하고;
여기서 상기 그룹의 이의 일반적인 형태의 각 CAR 분자의 엑토도메인은 각각 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없고,
여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자는 적어도 하나의 이종이량체화 도메인을 포함하는,
키메라 항원 수용체(CAR) 그룹이 개시된다.

Description

키메라 항원 수용체(CAR) 그룹

본 발명은 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 키메라 항원 수용체(CAR) 그룹에 관한 것이다.

CAR T 세포, 즉 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 변형된 T 세포를 사용한 면역 요법은 암 치료에서 가장 유망한 접근법 중 하나이다. 현재까지, 이 치료 전략의 높은 잠재력은 B 세포 악성 종양 환자에서 인상적인 임상 반응을 통해 입증되었다. 그러나, 이 성공의 다른 종양에 대한 추가적인 트랜슬레이션은 현재 몇 가지 장애물로 인해 방해받는다(Lim and June, Cell. 2017; 168(4): 724; Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391). 예를 들어, 현재 CAR T 세포는 단일 정의된 종양 관련 항원에 대해 CAR에 의해 지시된다. 이 사실은 종양 관련 항원이 항상 건강한 세포에서도 발현되기 때문에 소위 온-타겟/오프-종양 독성이라고 하는, 즉, 이 항원을 발현하는 건강한 조직의 파괴를 초래한다. CAR 변형된 세포의 종양 특이성을 개선하기 위한 기존 전략은 제2 항원에 대한 키메라 공동-억제 또는 공동-자극 수용체의 공동-발현 또는 대안적으로 제2 항원에 대한 공동-발현 키메라 노치(Notch)-기반 수용체에 의한 CAR 발현의 전사적 조절에 기반한다(Roybal and Lim, Annu Rev Immunol. 2017;35:229; Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391).

WO 2017/180993 A1에는 샐비지(Salvage) 키메라 항원 수용체 시스템이 개시되어 있으며,

Lanitis 등(Cancer Immunol. Res. 1 (2013), 43-53)은 해리된 신호전달 도메인을 가진 키메라 항원 수용체 T 세포가 생체 내 독성에 대해 감소된 잠재력을 가진 집중된 항-종양 활성을 나타내는 것으로 보고하였고,

Kloss 등(Nat. biotechnol. 31 (2012), 71-75)은 균형 잡힌 신호전달을 통한 조합 항원 인식이 조작된 T 세포에 의한 선택적 종양 박멸을 촉진하는 것으로 보고하였다.

WO 2015/075468 A1에는 활성화 엔도도메인을 포함하는 CAR을 갖는 CAR 시스템이 개시되어 있고,

Wu 등(Science 350 (2015), 293 및 aab4077-1 ~ aab4077-10)은 소분자-게이트 키메라 수용체를 통한 치료 T-세포의 원격 제어를 기술하였다.

Ajina 등(Mol. cancer therap. 17 (2018), 1795-1815)은 CAR 강장(tonic) 신호를 다루는 전략을 리뷰하였다.

본 발명의 목적은 원하는 표적 세포를 인식함에 있어서 CAR 변형 세포의 특이성을 개선하기 위한 새로운 전략을 제공하는 것이다. 표적 세포에 대한 이러한 개선된 특이성은 표적 항원 조합의 특이적 인식, 즉, 조합 표적 항원 인식에 의해 달성된다. 보다 구체적으로, 새로운 CAR은 부작용의 위험이 없거나 적어도 부작용이 감소된 상태에서, 특히 인간 환자의 치료를 위해, 생체 내 적용 가능해야 한다. 추가적인 목적은 종양 치료를 위한 수단, 특히 종양 치료를 위한 면역 요법 개념을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 원하는 표적 세포를 인식함에 있어서 CAR 변형 세포의 특이성을 개선하기 위한 새로운 전략을 제공하는 것이다. 표적 세포에 대한 이러한 개선된 특이성은 표적 항원 조합의 특이적 인식, 즉, 조합 표적 항원 인식에 의해 달성된다. 보다 구체적으로, 새로운 CAR은 부작용의 위험이 없거나 적어도 부작용이 감소된 상태에서, 특히 인간 환자의 치료를 위해, 생체 내 적용 가능해야 한다. 추가적인 목적은 종양 치료를 위한 수단, 특히 종양 치료를 위한 면역 요법 개념을 제공하는 것이다.

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엔도도메인은, 각각의 CAR 분자가 엔도도메인을 포함하는 경우, 세포에서 발현되는 경우 세포막의 세포 내 측면에 위치하며, 여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엑토도메인은 세포에서 발현되는 경우 세포막의 세포 외 측면으로 전위(translocate)하고, 그리고 상기 그룹의 각 CAR 분자의 막관통 도메인은 세포에서 발현되는 경우 세포막에 위치하며;

여기서, 이의 일반적인 형태의 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엑토 도메인은 각각, 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없고, 그리고

여기서 상기 그룹의 다른 CAR 분자 및 상이한 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티는 서로 공유적으로 연결되지 않은 상이한 표적 항원에 특이적이고, 그리고

상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 각각의 표적 항원에 대한 친화성은 1mM 내지 100nM이고, 그리고

여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 각각의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 다른 폴리펩티드의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1mM 내지 100nM이고, 그리고

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자는 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 정의된 이종이량체화를 매개할 수 있는 적어도 하나의 이종이량체화 도메인을 포함한며, 여기서 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 이종이량체화는 조절 분자와 무관하게 발생하거나, 또는 조절 분자가 없을 때 발생하고 조절 분자에 의해 감소되거나, 또는 조절 분자에 의해 유도되고 선택적으로 다른 조절 분자에 의해 감소되고, 여기서 조절 분자는 생리적인 조건 하에서 한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 적어도 하나의 구성원에 결합할 수 있고 이종이량체화를 유도하거나 감소시킴으로써 2개, 3개 또는 4개 CAR 분자로 구성된 CAR의 비공유 복합체 그룹의 형성을 유도하거나 감소시킬 수 있다.

도 1은 CAR 그룹의 예시적인 아키텍처의 개략도를 나타낸다.
도 2는 인간 EGFR에 대한 상이한 rcSso7d-기반 항원 결합 모이어티의 K_d 값을 나타낸다.
도 3은 시스테인을 형성하는 세포 외 이황화 결합이 CAR 그룹의 AND 게이트 기능에 대한 항원항체결합력 효과의 이용을 억제할 수 있음을 보여준다.
도 4는 scFv-포함 CAR 분자의 이량체화/올리고머화가 AND 게이트 기능을 갖는 CAR 그룹을 생성하기 위해 항원항체결합력 효과의 이용을 억제함을 보여준다.
도 5는 HER2에 대해 지시된 아피바디(affibody)-기반 CAR 그룹의 생성 및 기능을 보여준다.
도 6은 생체 내에서 안정적으로 형질도입된 T 세포에서 발현된 CAR 그룹의 기능의 조절을 보여준다.
도 7은 생체 내 실험에 사용된 CAR 변형된 T 세포의 기능적 시험관 내 특성을 보여준다.
도 8은 VEGF에 의한 CAR 그룹의 항원항체결합력의 조절을 보여준다.
도 9는 EGFR 및 HER2에 대해 지시되고 조절 분자에 의해 제어될 수 있는 CAR 그룹의 기능을 보여준다.
도 10은 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹을 보여준다.
도 11은 구성 복합체 형성을 위한 이종이량체화 도메인을 포함하는 CAR 그룹의 기능을 보여준다.
도 12는 상이한 공동-자극 도메인을 포함하는 CAR 그룹을 보여준다.
도 13은 상이한 CAR 신호전달 백본에 융합된 상이한 rcSso7d 및 아피바디 기반 결합 모이어티를 포함하는 CAR 분자의 발현을 보여준다.
도 14는 상이한 CAR 분자의 디자인에 대한 개략도를 보여준다.
도 15는 상이한 CAR 분자의 아미노산 서열을 보여준다.

본 발명에 따른 조합 항원 인식의 기본 원리는 CAR 그룹으로, 상기 그룹의 개별적인 CAR 분자의 개별적인 항원 결합 모이어티는 각각의 표적 항원에 대해 낮은 친화성을 가지므로, 1가 상호작용(monovalent interaction)만이 CAR-발현 세포에서 약한 세포 내 신호전달만을 유발하거나 신호를 전혀 전달하지 않는다. 각각 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 추가적으로 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드를 사용하는 경우, 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티와 각각의 표적 항원 사이의 상호작용, 또는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자 상의 결합 부위 사이의 상호작용은, 낮은 친화성을 가져야 하며, 따라서 1가 상호작용은 CAR-발현 세포에서 세포 내 약한 신호전달만을 유발하거나 신호전달을 전혀 하지 않아야 한다. 그러나, 상이한 결합 특성을 갖는 상기 그룹의 2개, 3개 또는 4개 CAR 분자의 비공유 어셈블리는, 다른 폴리펩티드를 통해 직접 또는 간접적으로, 각각 두개, 최대 3개 또는 최대 4개의 상이한 표적 항원과 동시에 상호작용할 수 있는 다가(multivalent) CAR 복합체의 형성을 초래하고, 이들 각각은 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있다. 상이한 항원과의 이러한 다가 상호작용은 낮은 친화성, 즉 항원항체결합력의 상승적(synergistic) 증폭을 초래한다. 궁극적으로, 상이한 표적 항원의 선택된 조합과의 이러한 다가 상호작용은 상기 CAR 그룹을 발현하는 세포에서 강화된(enhanced) 신호전달을 유발한다.

따라서, 1가가 아닌 단지 다가 상호 작용만이 CAR의 복합 그룹을 효율적으로 촉발하도록 보장하기 위해, 상기 그룹의 CAR 분자의 이의 표적 항원에 대한 각 개별 항원 결합 모이어티의 친화성은 1 mM 내지 100 nM이고, 이의 표적 항원에 대한 다른 폴리펩티드의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 친화성 또는 대안적으로 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 이 다른 폴리펩티드의 친화성은 1 mM 내지 100 nM이다. 바람직한 구현에서, 이의 표적 항원에 대한 상기 그룹의 CAR 분자의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 친화성은 1 mM 내지 150 nM, 바람직하게는 1 mM 내지 200 nM, 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 300 nM, 특히 1 mM 및 400 nM이며, 그리고 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1 mM 내지 150 nM, 바람직하게는 1 mM 내지 200 nM, 더욱 바람직하게는 1 mM 내지 300 nM, 특히 1 mM 내지 400 nM이다. 다른 바람직한 구현에서, 상기 그룹의 CAR 분자의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500 μM 내지 100 nM, 바람직하게는 250 μM 내지 100 nM, 더욱 바람직하게는 125 μM 내지 100 nM, 특히 50 μM에서 100 nM 사이이고, 다른 폴리펩티드의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500 μM 내지 100 nM, 바람직하게는 250 μM 내지 100 nM, 더 바람직하게는 125 μM 내지 100 nM, 특히 50 μM 내지 100 nM이다. 다른 바람직한 구현에서, 상기 그룹의 CAR 분자의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500 μM 내지 150 nM, 바람직하게는 250 μM 내지 200 nM, 더욱 바람직하게는 125 μM 내지 300 nM, 특히 50 μM 내지 400 nM이고, 다른 폴리펩티드의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500 μM 내지 150 nM, 바람직하게는 250 μM 내지 200 nM, 더 바람직하게는 125 μM 내지 300 nM, 특히 50 μM 내지 400 nM이다. 본원에 제공된 임의의 친화성 값은, 예를 들어, 실시예 부분의 실시예 1 및 4에서 수행된 바와 같이, pH 7.4, 25℃에서 Biacore T200 장치(GE Healthcare)로 수행된 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정된 친화성을 의미한다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 AND 게이트(AND gate) 기능을 갖는 CAR를 생성하는 기본 원리는 CAR 그룹의 정의된 이종이량체화, 이종삼량체화 또는 이종사량체화에서 발견되었으며, 이 중 각 CAR 분자는 상이한 표적 항원의 낮은 친화성 인식을 매개한다. 표적 항원 결합(즉, 항원항체결합력(avidity) 효과)시 상이한 결합 모이어티의 낮은 친화성의 증폭은 효율적인 CAR 신호전달을 촉발할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 그룹의 각각의 CAR 분자 사이의 비공유 상호작용(상기 그룹의 CAR 분자의 이중(bi)-, 삼중(tri)- 또는 사중특이적(tetraspecific) 복합체 생성)은 구성적일 수 있거나 조절 분자의 존재 또는 부재에 의존할 수 있다. 중요한 것은, 예를 들어 분자간 세포 외 이황화 결합의 형성에 의해 매개되는, 동일한 표적 항원 특이성을 갖는 CAR 분자의 이량체화 또는 올리고머화는 단일 항원에 대한 친화성을 증폭시켜 본 발명에 따른 CAR 그룹의 AND 게이트(AND gate) 기능을 방지할 것이다. 이러한 CAR 분자의 이량체화 또는 올리고머화는 따라서 생물학적으로 가능한 한 최대한 방지되거나 적어도 최소화 되어야한다.

본 발명에 따른 CAR 그룹의 정의된 이종이량체화, 이종삼량체화 또는 이종 사량체화를 용이하게 하기 위해, CAR 그룹의 각 CAR 분자는 2개의 CAR 분자의 이종이량체화를 매개할 수 있고 이에 따라 구성적 또는 조건부 방식에서 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자의 정의된 비공유 복합체의 형성을 유도할 수 있는 적어도 하나의 도메인을 포함한다. 이는 CAR 그룹의 개별 분자가 세포에서 공동-발현되고 비공유 복합체로 조립되면 상기 CAR 그룹(선택적으로 하나 이상의 다른 폴리펩티드의 존재에 의존하고, 각각 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있음)은 표적 세포, 즉, 비-표적 세포에 대한 반응과 비교하여 2개 이상의 표적 항원의 선택된 조합을 발현하는 세포, 즉, 하나의 표적 항원 또는 선택된 표적 항원의 일부만을 발현하는 세포에 대한 반응으로 이들 세포의 강화된 활성화를 매개할 수 있다. 이는 또한 비공유적 복합체 CAR 그룹이, 예를 들어 다른 표적 항원에 대한 결합과 같은 여러 입력을, 예를 들어 상기 CAR 그룹을 발현하는 세포의 활성화로 정의된 출력 신호로 통합할 수 있음을 의미한다. 상기 CAR 그룹의 이러한 능력은 소위 논리 AND 게이트(logic AND gate) 기능을 나타내며 비-표적 세포(즉, 단지 하나의 항원만을 발현하는 세포)로부터 표적 세포(즉, 주어진 표적 조합을 발현하는 세포)를 구별하는데 놀랍도록 효율적이었다.

논리 AND 게이트 기능을 가진 CAR을 설계하기 위한 기존 개념은 상이한 표적 항원에 대한 개별 분자의 다중 결합 모이어티의 개별 친화성의 상승적 증폭을 이용(exploit)하지 않는다(Roybal and Lim, Annu Rev Immunol. 2017;35:229; Chen et al., Curr Opin Immunol. 2018;51:103-110; Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391). 그러나, 2개의 상이한 표적 항원(항원 A 및 B)에 대한 결합 모이어티가 종래의 CAR 백본(backbone)에 직렬로 융합, 즉 단일 폴리펩티드 사슬에 연속적으로 연결되는 전략이 있다. 이러한 CAR(탠덤(tandem)-CAR라고 함)은 논리 OR 게이트(logic OR gate) 기능을 매개하도록, 즉, 이러한 CAR은 항원 A, 또는(OR) 항원 B, 또는(OR) 두 항원 모두를 발현하는 표적 세포에 반응하여 상기 CAR을 발현하는 세포에서 강력한 신호를 유발하도록 설계되었다. 이는 결합 모이어티가 높은 친화성을 갖기 때문에 이러한 CAR이 1가 상호 작용 시에도 신호를 유발할 수 있다는 사실 때문이다 (Hegde et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2013;2:e105; Zah et al., Cancer Immunol Res. 2016;4(6):498-508; De Munter et al., Int J Mol Sci. 2018 Jan 30;19(2) pii: E403). 이러한 CAR의 예는 US20170107285 A1 및 US20180111992 A1에 개시되어 있다. 보고된 CAR 중 일부는 AND 게이트 기능도 갖는다(Hedge et al., J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052). 그러나 보고된 CAR의 AND 게이트 기능은 개별 결합 모이어티의 높은 친화성 및 현재 사용되는 CAR 백본의 적어도 일부가 세포에서 발현될 때 세포 외 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합으로 인해 동종이량체를 형성한다는 사실로 인해 매우 제한적이다.

상기 언급한 바와 같이, 동일한 표적 항원 특이성을 갖는 CAR 분자의 이량체화 또는 다중화의 예방 또는 최소화는 본 발명에 따라 AND 게이트 기능을 갖는 CAR 그룹을 생성하기 위한 필수 전제조건이다. 동일한 CAR 분자의 이량체화 또는 다중화는 동일한 표적 항원 특이성을 갖는 결합 모이어티의 친화성의 증폭을 초래하여 논리 AND 게이트 기능(즉, 항원 조합의 특이적 인식)에 대한 결합 효과의 이용(exploitation)을 방지한다.

이러한 이유로, 본 발명에 따르면, 상기 그룹의 이의 "일반적인 형태(prevalent conformation)"(즉, 본래 접힌 형태)의 각 CAR 분자의 엑토도메인은, 각각, 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없다. 즉, 본 발명에 따른 상기 그룹의 CAR 분자의 세포 외 도메인은 본래 접힌 형태의 CAR에 분자 내(즉, 상기 그룹의 주어진 CAR 분자 내에 형성된) 이황화 결합에 관여하지 않는 어느 시스테인을 함유하지 않아야 한다. 예를 들어, 본래 형태에서 분자간(즉, 상기 그룹의 다른 CAR 분자와의) 이황화 결합을 형성할 수 있는 CD8α의 힌지 영역에 있는 시스테인은, 예를 들어, 돌연변이 또는 결실에 의해 제외될 필요가 있다. 다른 한편으로, CAR 분자의 본래 형태의 분자 내 이황화 결합에 관여하는 시스테인 (따라서 다른 CAR 분자와의 분자간 결합의 형성에 접근할 수 없음)은 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR에 존재할 수 있다. 예를 들어, 분자 내 이황화 결합을 형성하는 항체 단편의 Ig 도메인 내의(예를 들어, scFv 내의) 시스테인은, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자에 존재할 수 있다. 예를 들어, scFv 내의 이러한 시스테인은 분자 내 이황화 결합에 관여하기 때문에, 분자간 이황화 결합에 사용할 수 없으므로 (CAR 분자가 이의 일반적인, 즉, 본래 형태로 존재하는 경우) 상기 그룹의 단독이량체(homodimeric) 또는 단독올리고머(homooligomeric) CAR 분자를 피한다.

더욱이, 현재 CAR의 항원 결합 모이어티는 일반적으로 개별 분자들 사이의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 도메인의 분자간 이종이량체화로 인해 올리고머화되는 경향이 있는 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 기반으로 한다(Hudson et al., J Immunol Methods. 1999; 231(1-2): 177-89; Long et al., Nat Med. 2015; 21(6): 581-90). 이 제어되지 않은 이량체화 또는 올리고머화는 동일한 CAR 분자 (즉, 동일한 항원 특이성을 가진 CAR 분자) 사이에서도 발생할 수 있으므로 잠재적으로 효율적인 AND 게이트 기능을 배제한다. 따라서, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 개별 분자는 바람직하게는 잠재적으로 원치 않는 및 제어되지 않은 상기 그룹의 CAR 분자의 공유 또는 비-공유 복합체 형성을 유도하는 scFv-기반 항원 결합 모이어티 또는 다른 분자 성분을 함유하지 않는다.

일반적으로, CAR 분자의 다른 도메인에 의해 매개되는 동일한 CAR 분자의 임의의 비공유 이량체화 또는 올리고머화는 본 발명에 따른 효율적인 AND 게이트 기능을 배제할 것이다. 따라서, 그러한 비공유 이량체화 또는 올리고머화는 그러한 도메인의 배제 또는 조작에 의해 생물학적으로 가능한 최대로 방지되거나 적어도 최소화되어야 한다.

탠덤(tandem)-CAR와 비교하여, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 기본 설계는 서로 다른 표적 항원 각각과의 효율적인 상호 작용을 위한 공간 요건을 최적화하기 위해 CAR 분자의 링커(linker) 및 스페이서(spacer)의 적응을 용이하게 한다. 본 발명에 따른 CAR 그룹의 구조는 CAR 분자와 표적 항원 사이의 당기는 힘의 기하학적 구조와 관련하여 CAR 분자의 최적화를 더욱 용이하게 한다. 이는 T 세포에 대해 아토미오신 세포골격에 의한 항원 인식 시 발생하는 기계적 힘이, 면역학적 시냅스의 조직에서 중요한 역할을 하고 T 세포 활성화 및 표적 세포 사멸의 효율성을 향상시키는 것이 알려져 있기 때문에 유리하다(Basu and Huse, Trends Cell Biol. 2017;27(4):241-254). 접착 스트립을 떼어내는 것과 유사하게 CAR 분자의 결합 모이어티를 통한 힘 전달의 기하학적 구조가 표적 항원과의 상호 작용 안정성에 영향을 미치고 이에 따라 CAR 분자의 신호 전달 효능에 영향을 미칠 것이라고 생각할 수 있다. 즉, 탠덤-CAR에서 당기는 힘은 막관통 도메인에 인접한 결합 모이어티에 대부분(또는 배타적으로) 작용하지만, 본 발명에 따른 CAR 그룹에서 당기는 힘은 상기 그룹의 각 CAR 분자에서 병렬로 전달되고, 따라서 CAR 분자의 결합 모이어티와 표적 항원 사이의 각 상호 작용이 전체 당기는 힘에 기여할 수 있도록 한다. 마지막으로, CAR 그룹의 구조는 단순히 개별 CAR 분자의 이종이량체화를 조건부로 만듦으로써 상기 CAR 그룹의 기능의 가역적 조절을 선택적으로 가능하게 한다. 따라서, CAR 엔지니어링의 최신 기술인 탠덤-CAR에 비해 본 발명에 따른 CAR 그룹은 몇 가지 중요한 이점을 제공한다: (i) 각 결합 모이어티에 대한 링커(linker) 길이를 개별적으로 최적화하는 능력, (ii) 당기는 힘의 전달 개선, 및 (iii) 조건부 이량체화, 삼량체화 또는 사량체화에 의해 CAR 기능을 조절하는 옵션.

본 발명에 따른 CAR 그룹의 분자 디자인의 기본 아키텍쳐는 논리 AND 게이트 기능 폐지(abrogate)하지 않고 특정 부위에서 변경될 수 있다. 이에 따라 시스템을 다양한 요구에 맞게 조정할 수 있다. 예를 들어, CAR 그룹은 항원항체결합력 효과를 강화 및/또는 각각 3개 또는 4개의 상이한 항원의 존재에 의존하는 AND 게이트 CAR 복합체를 생성하기 위해 또는 예를 들어, 항원 B 또는(OR) 항원 C와 조합하여 항원 A의 인식을 매개하기 위해, 논리 OR 게이트 기능을 CAR 그룹에 통합하기 위해 2개의 CAR 분자 또는, 대안적으로 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성될 수 있다. 즉, 이 예에서 CAR의 삼량체 그룹은 '항원 A 및(AND) B 또는(OR) 항원 A 및(AND) C', 즉 'A 및 (B 또는 C)'(A AND (B OR C))에 반응하기 때문에 이것은 AND/OR 게이트로 간주될 수 있다. 유사하게, CAR의 4량체 그룹은 '항원 (A 또는 B) 및 (C 또는 D)' ((A OR B) AND (C OR D)) 또는 '항원 A 및 (B 또는 C 또는 D)' (A AND (B OR C OR D))에 반응하도록 설계될 수 있다. CAR 그룹은 가용성 단백질 또는 소분자에 기능적으로 의존하도록 쉽게 설계할 수 있다.

CAR 기능의 조건부 조절을 위한 바람직한 구현에서, CAR 그룹은 각각 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 적어도 세포 외 결합 부위를 각각 포함하는 CAR 분자로 구성될 수 있다. 따라서 이러한 또 다른 폴리펩티드는 CAR 그룹에 속하지 않고 상기 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 다른 폴리펩티드에 대한 공유 변형을 통해 직접 또는 간접적으로 비공유적으로 결합할 수 있는, 예를 들어, 공유 결합된 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 분자와 같은 가용성 단백질로 정의된다. 이 바람직한 구현에서, 이 다른 폴리펩티드의 정의된 주입은 CAR 그룹의 기능의 제어를 가능하게 한다. CAR 분야에서 잘 알려져 있고(Cho et al., Cell. 2018;173(6):1426-1438; Ma et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(4):E450-458; Urbanska et al., Cancer Res. 2012;72(7):1844-1852) 현재 임상에서 테스트 되고 있는(Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2:377-391) 가용성 항원 결합 단백질을 투여함으로써 CAR 기능을 조절하는 이러한 전략은 또한 본 발명에 따른 CAR 그룹에 포함될 수 있다. 이 경우, 원칙적으로, 저친화성-결합은 반드시 다른 폴리펩티드의 항원 결합 부분을 통해 일어날 필요는 없지만, 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위를 통해 CAR 분자에서 발생할 수도 있다.

대안적으로, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 기능은 또한 조건부 이종이량체화, 이종삼량체화 또는 이종사량체화에 의해 조절될 수 있다. 따라서, 바람직한 구현에서 상기 그룹의 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자의 비공유 복합체의 형성은 생리학적 조건 하에서 CAR 그룹의 한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 적어도 하나의 구성원에 결합할 수 있는 하나 이상의 조절 분자에 의해 유도된다. 원칙적으로, 조절 분자는 적어도 하나의 이종이량체화 도메인에 결합하고 한 쌍의 이종이량체화 도메인 구성원의 상호 작용을 유도하거나 감소시킬 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 이러한 분자는 전형적으로 작은 분자이지만, 예를 들어, 종양의 기질에 축적되는 가용성 단백질일 수도 있으며, 이는 종종 천연적으로 이종이량체화되는 단백질 (예를 들어, IL-12와 같은, 이종이량체 사이토카인의 서브유닛)일 수 있다.

서로 다른 세포 간에 CAR 분자의 가교 결합에 의한 동족 피해(fratricide) 가능성을 배제하기 위해, 이종이량체화 도메인은 바람직하게는 CAR 그룹의 CAR 분자의 엔도도메인 및/또는 막관통 도메인에, 더욱 바람직하게는 엔도도메인에 통합된다.

세포에서 CAR 그룹을 안정적으로 발현하는데 사용되는 벡터의 페이로드(payload)를 감소시키기 위해, CAR 그룹은 바람직하게는 3개, 특히 2개의 CAR 분자를 포함한다. 추가적으로 복잡성(complexity)을 감소시키기 위해, 그룹의 각 CAR 분자는 바람직하게는 단지 단일 항원 결합 모이어티 또는 선택적으로 단지 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 단일 세포 외 결합 부위만을 포함하고, 여기서 상기 다른 폴리펩티드는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함한다.

예를 들어, 항원 B 또는 항원 C와 조합하여 항원 A의 인식을 매개하기 위해 CAR 그룹에서 OR 게이트 기능을 통합하기 위해, 그룹의 CAR 분자는 또한 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있고, 여기서 다른 폴리펩티드는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 두 개의 항원 결합 모이어티 또는 두 개의 세포 외 결합 부위를 포함할 수 있다.

CAR 분자의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해, CAR 그룹의 CAR 분자는 바람직하게는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 세포 외 결합 부위를 포함하고, 여기서 다른 폴리펩티드는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함한다.

CAR 기능의 조건부 조절이 필요하지 않은 응용(application)의 경우, 상기 그룹의 CAR 분자는 조절 분자의 존재를 필요로 하지 않는 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있어 구성적 복합체 형성을 초래한다. 선택적으로, 의도하지 않은 부작용의 경우 안전 수단으로서, CAR 분자는 구성적 이종이량체화를 매개하는 이종이량체화 도메인을 포함할 수 있지만, 이종이량체화 도메인의 해리를 유도하는 조절 분자에 추가적으로 결합할 수 있다.

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 그룹의 CAR 분자의 기본 아키텍쳐는 다양한 적용의 요구에 맞게 조정될 수 있다. 세포 외에서 세포 내 측으로 상기 그룹의 CAR 분자에서 도메인의 순서는 바람직하게는 세포 표면에서 다음과 같은 기본 아키텍쳐를 따른다: 항원 결합 모이어티 또는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위, 선택적으로 선택적인 제2 항원 결합 모이어티 또는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 또 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 선택적인 제2 결합 부위의 공간 최적화를 위한 링커, 바람직하게는 공간 최적화를 위한 힌지 영역 및 막관통 도메인. 막관통 도메인은 바람직하게는 적어도 하나의 CAR 분자에서 공동-자극 도메인을 포함하는 신호전달 영역에 의해 적어도 하나의 CAR 분자에 후속하며, 여기서 바람직하게 이 공동-자극 신호전달 영역, 또는 선택적으로 막관통 도메인은 적어도 하나의 이종이량체화 도메인이 뒤 따르며, 그리고 추가로, 적어도 하나의 CAR 분자에서, 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 신호전달 영역이 뒤 따르며, 여기서 공동-자극 및 ITAM-함유 신호전달 영역의 순서는 반전될 수 있다. ITAM을 포함하지 않는 CAR 분자는 공동-자극 신호전달 영역이 없거나, 또는 하나의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 두 개의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 심지어 더 많은 공동-자극 신호전달 영역을 포함하지만, 바람직하게는 최대 2개의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 보다 바람직하게 단지 하나의 공동-자극 신호전달 영역을 포함한다. 일반적으로, 상기 그룹의 각 CAR 분자에 대해 적어도 하나가 필수인 이종이량체화 도메인은 대안적으로 또는 추가적으로 엑토도메인 또는 막관통 도메인에 위치할 수 있지만, 바람직하게는 막관통 도메인과 신호전달 영역 사이, 및/또는 특히 2개의 신호전달 영역 사이 및/또는 특히 CAR 분자의 세포 내 말단에 위치할 수 있다. 마지막으로, 상기 그룹의 CAR 분자의 임의의 2개의 인접한 성분(항원 결합 모이어티, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위, 힌지 영역, 막관통 도메인, 신호전달 영역, 이량체화 도메인)은 선택적으로 링커로 구분될 수 있다.

표적 항원의 상이한 조합에 대해 지시된 상이한 상기 그룹의 CAR은 또한, 예를 들어, 표적 항원의 손실에 의해 촉발된 종양의 면역 탈출을 억제하기 위해 세포에서 공동-발현될 수 있다. CAR 그룹은 또한 주어진 세포에서 다른 단백질과 공동-발현될 수 있다.

1. 항원 결합 모이어티:

본 발명에 따른 CAR 그룹에 사용하기에 적합한 항원 결합 모이어티는 임의의 항원 결합 폴리펩티드일 수 있으며(Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2: 377-391), 이의 광범위한 범위가 당해 기술분야에 알려져 있다(Simeon et al., Protein Cell. 2017; Gilbreth et al., Curr Opin Struct Biol. 2012; 22(4): 413-420; Koide et al., ACS Chem Biol. 2009; 4(5): 325-334; Traxlmayr et al., J Biol Chem. 2016; 291(43): 22496-22508). 한편, 더 많은 비-항체 결합 단백질이 보고되었으며(Pluckthun, Alternative Scaffolds: Expanding the options of antibodies. In: Little M, ed. New York: Cambridge University Press; 2009: 244-271; Chapman et al., Cell Chem Biol. 2016; 23(5): 543-553; Binz et al., Nat Biotechnol. 2005; 23(10): 1257-1268; Vazquez-Lombardi et al., Drug Discov Today. 2015; 20(10): 1271-1283), 그리고, 실제로, 또한 합성 라이브러리 설계 및 선택은 잠재적으로 항원 결합 모이어티로서 역할을 할 수 있는 임의의 단백질에 적용될 수 있다(Pluckthun, Alternative Scaffolds: Expanding the options of antibodies. In: Little M, ed. New York: Cambridge University Press; 2009: 244-271).

일부 예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 사슬 Fv(scFv), cAb VHH(낙타류 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화 버전, IgNAR VH(상어 항체 가변 도메인) 및 이의 인간화 버전, sdAb VH(단일 도메인 항체 가변 도메인) 또는 "낙타화(camelized)" 항체 가변 도메인과 같은 다른 항체 기반 인식 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 단일 사슬 TCR(scTv, VaV를 함유하는 단일 사슬 2-도메인 TCR)과 같은 T-세포 수용체(TCR) 기반 인식 도메인이 또한 사용하기에 적합할 수 있다. 바람직하게, CAR 그룹의 각 분자의 항원 결합 모이어티는 단지 하나의 단백질 도메인, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 VH 또는 VL 단일 도메인 항체(나노바디) 또는 포도상구균의 단백질 A의 Z-도메인에 기초한 조작된 항원 결합 모이어티, 리포칼린, SH3 도메인, 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인, 노틴(knottins), Sso7d, rcSso7d, Sac7d, Gp2, DARPins 또는 유비퀴틴; 또는 저친화성 결합 및 동형 상호작용의 결여를 위해 선택되거나 조작된 리간드, 수용체 또는 공동-수용체를 포함한다. 리간드는 예를 들어, 사이토카인(예를 들어, IL-13 등); 성장 인자(예를 들어, 헤레굴린 등) 등을 포함한다. 리간드는 리간드의 수용체 결합 단편(예를 들어, HGF의 펩티드(Thayaparan et al., Oncoimmunology. 2014; 6(12): e1363137); 인테그린-결합 펩티드(예를 들어, Arg-Gly-Asp 서열을 포함하는 펩티드); 등)일 수 있다. 유사하게, 수용체는 수용체의 리간드 결합 단편일 수 있다. 적합한 수용체는, 예를 들어, 사이토카인 수용체(예를 들어, IL-13 수용체; IL-2 수용체 등); 세포 부착 분자(예를 들어, CD11a(Park et al., Sci Rep. 2017; 7(1): 14366); 등); PD-1; 등을 포함한다. CAR 그룹의 각 분자의 항원 결합 모이어티는 바람직하게 CAR 분자의 원하지 않는 응집을 유발하지 않는다. 위에서 논의된 바와 같이, 상기 그룹의 CAR 분자의 이러한 바람직하지 않은 이량체화 또는 올리고머화는 단일-양성 비-표적 세포와의 다가 상호작용을 유발할 수 있다. 이러한 이유로, 항원 결합 모이어티는 바람직하게 단일 클론 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편(scFv)이 아니다. 본 발명에 따른 CAR 그룹의 임상적 적용을 목적으로, 항원 결합 모이어티는 바람직하게 인간 단일 단백질 도메인(예를 들어, 피브로넥틴 III 형 도메인(FN3) 기반 모노바디)으로부터 유래된다.

2. 힌지 영역:

일부 구현에서, 상기 그룹의 CAR 분자의 엑토도메인은 항원 결합 모이어티 (또는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위)와 막관통 도메인 사이에 개재된 힌지 영역, 바람직하게 CD8 알파(UniProtKB/Swiss-Prot P01732-1에 따른 아미노산 서열 위치 138 ~ 182) 또는 CD28(UniProtKB/Swiss-Prot P10747에 따른 아미노산 서열 위치 114 ~ 152), 또는 PD-1(UniProtKB/Swiss-Prot Q15116에 따른 아미노산 서열 위치 146 ~ 170)에서 유래된 힌지 영역을 포함하며, 여기서 CD8 알파, CD28 또는 PD-1에서 유래된 서열은 N-말단 및/또는 C-말단 절단될 수 있고, 상기 서열 영역의 경계(border) 내에 임의의 길이를 가질 수 있으며, 그리고 CD8 알파 및 CD28에서 유래된 상기 힌지에서 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 원칙적으로, 가요성(flexible) 막관통 앵커 및 또한 더 많은 수용체의 다른 부분은 상기 그룹의 CAR 분자의 힌지 영역 및/또는 막관통 도메인에서 사용하기에 적합하며(Labanieh et al., Nat Biomed Eng. 2018; 2: 377-391), 단, 이것들은 본 발명에 따라 이량체화 방지를 위해 필요에 따라 변형된다.

선택된 표적 항원의 최적 결합을 위한 개별 구조적 요구 사항에 따라, CAR 분자의 힌지 영역은 약 2개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 예를 들어 약 4개 아미노산(aa) 내지 약 10 aa, 약 10 aa 내지 약 15 aa, 약 15 aa 내지 약 20 aa, 약 20 aa 내지 약 25 aa, 약 25 aa 내지 약 30 aa, 약 30 aa 내지 약 40 aa, 또는 약 40 aa ~ 약 50 aa의 길이를 가질 수 있다. 선택적으로, 힌지 영역은, 예를 들어 구조화된 도메인이 통합될 경우 (예를 들어, US2018/0094044 A1에 개시된 바와 같이 CAR 변형된 세포의 풍부(enrichment)를 촉진하기 위해 CD34 UniProt P28906-1 aa 42-140으로부터) 50개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

바람직하게, 또한 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 글리신 및 글리신-세린 폴리머가 힌지에 사용될 수 있는데, 이는 Gly 및 Ser 모두가 상대적으로 구조화되지 않아서 CAR 성분들 사이의 중성 테더(tether)로 작용할 수 있기 때문이다. 글리신은 심지어 알라닌보다 현저히 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고, 더 긴 측쇄를 가진 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 1992; 11173-11142). 따라서, 이들의 표적 항원에 대한 최적 결합을 위해 CAR 분자를 조정하기 위해, 항원 결합 모이어티(또는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위)와 막관통 도메인 사이에 개재된 힌지 영역은 글리신 폴리머 (G)n 및/또는 글리신-세린 폴리머 (GS)n, (GSGGS)n, (GGS)n (GGGS)n, (GGGGS)n(여기서 n은 적어도 1의 정수임)를 포함한다.

3. 막관통 도메인:

CAR 그룹의 각 분자는 진핵 세포막으로의 삽입을 위한 막관통 도메인을 포함한다. 진핵(예를 들어, 포유 동물) 세포의 세포막에 폴리펩티드를 삽입하기 위해 제공되는 임의의 막관통(TM) 도메인이 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 인간 CD8 알파(Uniprot P01732, 아미노산(aa) 183-206)의 TM 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC가 사용될 수 있다. 적합한 TM 서열의 추가 예는 다음을 포함한다: 인간 CD8 베타 유래: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC(Uniprot P10966, aa 173-195); 인간 CD4 유래: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC(Uniprot P01730, aa 398-422); 인간 CD3 제타 유래: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV(Uniprot P20963, aa 31-53); 인간 CD28 유래: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(Uniprot P10747, aa 154-179); 인간 CD134(OX40) 유래: VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(Uniprot P43489, aa 215-240); 인간 CD27 유래: ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH(Uniprot P26842, aa 192-212); 인간 CD278(ICOS) 유래: FWLPIGCAAFVVVCILGCILI(Uniprot Q9Y6W8, aa 141-161); 인간 CD279(PD-1) 유래: VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI(Uniprot Q15116, aa 171-191); 인간 DAP12 유래: GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV(Uniprot O43914, aa 41-61); 및 인간 CD7 유래: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA(Uniprot P09564, aa 178-201).

4. 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM):

본 발명에 따르면, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자는 적어도 하나의 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해 신호를 형질도입할 수 있는 엔도도메인을 함유한다. ITAM 모티프는 YX₁X₂L/I이며, 여기서 X₁ 및 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산이다. ITAM-함유 엔도도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 12 이상의 ITAM 모티프를 포함할 수 있다. 신호-형질도입 엔도도메인의 ITAM-함유 부분은 바람직하게는 임의의 ITAM-함유 단백질로부터 유래되고, 이들이 유래된 전체 단백질의 전체 서열을 함유할 필요는 없다. 적합한 ITAM-함유 폴리펩티드의 예는 다음을 포함한다: DAP12; FCERlG(Fc 엡실론 수용체 I 감마 사슬); CD3D(CD3 델타); CD3E(CD3 엡실론); CD3G(CD3 감마); CD3Z(CD3 제타); 및 CD79A(항원 수용체 복합체-관련 단백질 알파 사슬).

특히 바람직한 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자에서 적어도 하나의 신호전달 도메인은 T-세포 표면 글리코단백질 CD3 제타 사슬(CD3Z, T-세포 수용체 T3 제타 사슬, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ 등으로도 알려짐)의 세포질 도메인으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열들(2개의 이성체)

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (Uniprot P20963-3) 또는

MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (Uniprot P20963-1)

(여기서, ITAM 모티프는 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)

중 하나의 약 50 아미노산 내지 약 60 아미노산(aa), 약 60 aa 내지 약 70 aa, 약 70 aa 내지 약 80 aa, 약 80 aa 내지 약 90 aa, 약 90 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 110 aa, 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 160 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 CD3 제타 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열들

RVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNEL NLGRREE YDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMKGERRRGKGHDGL YQGL STATKDT YDAL HMQALPPR (Uniprot P20963-3 aa 52-163),

NQL YNEL NLGRREE YDVL DKR (Uniprot P20963-3 aa 69-89), EGL YNEL QKDKMAEA YSEI GMK (Uniprot P20963-3 aa 107-128), DGL YQGL STATKDT YDAL HMQ (Uniprot P20963-3 aa 138-158)

(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)

중 어느 것에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 T-세포 표면 글리코단백질 CD3 델타 사슬(CD3D; CD3-DELTA; T3D; CD3 항원, 델타 서브유닛; CD3 델타; CD3d 항원, 델타 폴리 펩티드(TiT3 복합체); OKT3, 델타 사슬; T 세포 수용체 T3 델타 사슬; T 세포 표면 당 단백질 CD3 델타 사슬 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 다음 아미노산 서열들 중 하나(2개의 이성체): Uniprot P04234-1; Uniprot P04234-2 중 하나의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 170 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 CD3 델타 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 DQV YQPL RDRDDAQ YSHL GGN (Uniprot P04234-1 aa 146-166)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 T-세포 표면 글리코단백질 CD3 입실론 사슬(CD3e, T-세포 표면 항원 T3/Leu-4 입실론 사슬, T-세포 표면 글리코단백질 CD3 입실론 사슬, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 Uniprot P07766-1의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 205 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 CD3 엡실론 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 NPD YEPI RKGQRDL YSGL NQR (Uniprot P07766-1 aa 185-205)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 T-세포 표면 글리코단백질 CD3 감마 사슬(CD3G, T-세포 수용체 T3 감마 사슬, CD3-GAMMA, T3G, 감마 폴리펩티드(TiT3 복합체) 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQL YQPL KDREDDQ YSHL QGNQLRRN (Uniprot P09693-1)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 또는 약 150 aa 내지 약 180 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 CD3 감마 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 DQL YQPL KDREDDQ YSHL QGN (Uniprot P09693-1 aa 157-177)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 DAP12(TYROBP; TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질; KARAP; PLOSL; DNAX-활성화 단백질 12; KAR-관련 단백질; TYRO 단백질 티로신 키나아제-결합 단백질; 킬러 활성화 수용체 관련 단백질; 킬러-활성화 수용체-관련 단백질 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 다음 아미노산 서열(4개의 이성체): Uniprot O43914-1; Uniprot O43914-2; Uniprot O43914-3; Uniprot X6RGC9-1 중 어느 것에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 DAP12 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 ESP YQEL QGQRSDV YSDL NTQ (Uniprot O43914-1 aa 88-108)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 FCER1G(FCRG; Fc 입실론 수용체 I 감마 사슬; Fc 수용체 감마-사슬; fc-엡실론 R1-감마; fcR감마; fceRI 감마; 고 친화성 면역글로불린 입실론 수용체 서브유닛 감마; 면역글로불린 E 수용체, 고 친화성, 감마 사슬 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열

MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGV YTGL STRNQET YETL KHEKPPQ (Uniprot P30273)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 FCER1G 아미노산 서열의 ITAM 모티프-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 DGV YTGL STRNQET YETL KHE (Uniprot P30273 aa 62-82)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

ITAM-함유 도메인은 또한 CD79A(B-세포 항원 수용체 복합체-관련 단백질 알파 사슬; CD79a 항원(면역글로불린-관련 알파); MB-1 막 글리코단백질; ig-알파; 막-결합 면역글로불린-관련 단백질; 표면 IgM-관련 단백질 등으로도 알려짐)으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열들(2개의 이성체)

MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL YEGL NLDDCSM YEDI SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (Uniprot P11912-1) 또는

MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENL YEGL NLDDCSM YEDI SRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (Uniprot P11912-2)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)

중 하나의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 200 aa, 또는 약 200 aa 내지 약 220 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

마찬가지로, 적합한 ITAM-함유 도메인은 전장 CD79A 아미노산 서열의 ITAM-함유 부분을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 ITAM-함유 도메인은 아미노산 서열 ENL YEGL NLDDCSM YEDI SRG (Uniprot P11912-1 aa 185-205)(여기서, ITAM은 굵은 글자체이면서 밑줄친 것임)에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르면, CAR 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자의 엔도도메인은 적어도 하나의 ITAM을 포함하고, 상기 ITAM은 바람직하게는 CD3 제타, DAP12, Fc-엡실론 수용체 l 감마 사슬, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, 및 CD79A(항원 수용체 복합체-관련 단백질 알파 사슬)로부터 선택된다.

ITAM의 수는 CAR의 신호 전달 효율과 관련이 있기 때문에(James, Sci Signal. 2018; 11(531)), CAR 그룹은 바람직하게는 마지막 3개의 ITAM을 모두 포함하며, 여기서 ITAM은 상기 그룹의 단일 CAR 분자에만 국한될 수 있다. 대안적으로, 상기 그룹의 여러 또는 모든 CAR 분자는 적어도 하나의 ITAM을 포함할 수 있다. 일부 구현에서 상기 그룹의 CAR 분자의 상이한 엔도도메인에 있는 ITAM 함유 부분은 동일한 수용체로부터 유래되는 반면, 다른 구현에서 상기 그룹의 CAR 분자의 상이한 엔도도메인에 있는 ITAM 함유 부분은 상이한 수용체로부터 유래된다. 일부 구현에서 상기 CAR 그룹은 ITAM-함유 부분, 바람직하게는 CD3 제타로부터 유래된 ITAM-함유 부분을 포함하는 단지 하나의 분자를 포함한다. 다른 구현에서 상기 CAR 그룹은 2개의 분자로 구성되며, 여기서 둘 다 CD3 제타로부터 유래된 세포질 도메인의 일부를 포함한다. 벡터 페이로드와 관련하여, CAR 그룹의 총 ITAM 수는 바람직하게는 3 내지 6이다. 더욱이, ITAM 함유 서열은 바람직하게는 상동성 재조합의 위험을 최소화하기 위해 최소한의 뉴클레오티드 서열 상동성을 위해 선택 및/또는 조작된다.

5. 공동-자극 도메인:

바람직한 구현에서, 상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자의 엔도도메인은 4-1BB(CD137), CD28, ICOS, BTLA, OX-40, CD2, CD6, CD27, CD30, CD40, GITR 및 HVEM으로부터 유래된 공동-자극 도메인을 함유하는 신호전달 영역을 포함하며, 이에 의해 CAR 그룹에 포함된 공동-자극 도메인은 선택적으로 상이한 공동-자극 수용체로부터 유래될 수 있다.

CAR 그룹의 CAR 분자의 공동-자극 신호 전달 영역에 포함하기에 적합한 공동-자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 70 aa의 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어 공동-자극 도메인은 약 30 aa 내지 약 35 aa, 약 35 aa 내지 약 40 aa, 약 40 aa 내지 약 45 aa, 약 45 aa 내지 약 50 aa, 약 50 aa 내지 약 55 aa, 약 55 aa 내지 약 60 aa, 약 60 aa 내지 약 65 aa, 또는 약 65 aa 내지 약 70 aa의 길이를 가질 수 있다. 선택적으로, 공동-자극 도메인은 약 70 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 200 aa, 또는 200 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.

특히 바람직한 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 4-1BB(TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDw137; ILA 등으로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot Q07011 aa 214-255에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 CD28(Tp44로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot P10747 aa 177-220에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 ICOS(AILIM, CD278 및 CVID1로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot Q9Y6W8 aa 165-199에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 CD27(S 152, T14, TNFRSF7 및 Tp55로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래된다. 예를 들어, 적합한 공동 자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot P26842 aa 212-260에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 OX-40(TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX40, TXGP1L으로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot P43489 aa 241-277에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 BTLA(BTLA1 및 CD272로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot Q7Z6A9 aa 176-289에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 GITR(TNFRSF18, RP5-902P8.2, AITR, CD357 및 GITR-D로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot Q9Y5U5 aa 188-241에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 HVEM(TNFRSF14, RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR 및 TR2으로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 공동-자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot Q92956 aa 224-283에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

다른 구현에서, CAR 그룹의 적어도 하나의 분자에서 공동-자극 도메인은 막관통 단백질 CD30(TNFRSF8, D1S166E 및 Ki-1로도 알려짐)의 세포 내 부분으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 공동 자극 도메인은 아미노산 서열 Uniprot P28908 aa 409-595의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 또는 약 160 aa 내지 약 185 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

6. 링커:

CAR 그룹의 분자는 임의의 2개의 인접한 도메인(즉, CAR 분자의 구성 요소) 사이에 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 트랜스맴브레인 도메인과 신호 전달 영역 사이에 배치될 수 있다. 다른 예로서, 링커는 신호 전달 영역과 이종이량체화 도메인 사이에 배치될 수 있다. 다른 예로서, 링커는 2개의 이종이량체화 도메인 사이에 배치될 수 있다. 다른 예로서, 링커는 2개의 신호 전달 영역 사이에 배치될 수 있다. 다른 예로서, 링커는 막관통 도메인과 이종이량체화 도메인 사이에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 2개의 항원 결합 모이어티들 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 2개의 결합 부위 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 항원 결합 모이어티와 막관통 도메인 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위와 막관통 도메인 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 신호전달 서열과 항원 결합 모이어티 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 신호 서열과 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 신호전달 서열과 이종이량체화 도메인 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 이종이량체화 도메인과 항원 결합 모이어티 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 이종이량체화 도메인과 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다. 또 다른 예로서, 링커는 항원 결합 모이어티와 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위 사이의 CAR 분자의 엑토도메인에 배치될 수 있다.

링커는 약 1개 내지 약 40개의 아미노산 길이를 함유하는 펩티드일 수 있다. 연결 펩티드는 사실상 임의의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 적합한 링커는 바람직하게는 일반적으로 가요성 펩티드를 생성하는 서열을 갖는다는 것을 유의해야 한다. 글리신, 세린 및 알라닌과 같은 작은 아미노산은 바람직하게는 가요성 펩티드를 생성하는 데 사용된다. 이러한 서열의 생성은 당업자에게 통상적이다. 적합한 링커는 쉽게 선택될 수 있으며, 4개 아미노산 내지 10개 아미노산, 5개 아미노산 내지 9개 아미노산, 6개 아미노산 내지 8개 아미노산 또는 7개 아미노산 내지 8개 아미노산을 포함하는, 1개 아미노산(예를 들어, Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 아미노산 내지 15개 아미노산, 3개 아미노산 내지 12개 아미노산과 같이 길이가 다를 수 있으며, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 아미노산일 수 있다. 예시적인 가요성 링커에는 글리신 폴리머(G)n, 글리신-세린 폴리머(예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGS)n 및 (GGGS)n 포함, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 또는 또한 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세린 폴리머, 및 당업계에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 예시적인 가요성 링커는 GGSG(SEQ ID NO: 1), GGSGG (SEQ ID NO: 2), GSGSG (SEQ ID NO: 3), GSGGG(SEQ ID NO: 4), GGGSG(SEQ ID NO: 5), GSSSG(SEQ ID NO: 6) 등을 포함한다. 상술한 임의의 요소들에 컨쥬게이션된 펩티드의 디자인은, 상기 링커가 덜 가요성의 구조를 부여하는 하나 이상의 부분뿐만 아니라 가요성 링커를 포함할 수 있도록 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있다는 것이 당업자에게 인식될 것이다.

7. 추가 도메인:

CAR의 대상 그룹의 분자는 하나 이상의 추가 폴리펩티드 도메인을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 이러한 도메인은, 예를 들어, 신호 서열; 에피토프 태그; 및/또는 검출 가능한 신호를 생성하는 폴리펩티드를 포함한다. CAR의 대상 그룹에서 사용하기에 적합한 신호 서열은 자연 발생 신호 서열, 합성(예를 들어, 인공) 신호 서열 등을 포함하는 임의의 진핵생물의 신호 서열을 포함한다. 적합한 에피토프 태그는, 예를 들어, 헤마글루티닌(HA; 예를 들어, 아미노산 서열 YPYDVPDYA(SEQ ID NO: 7)), FLAG(예를 들어, 아미노산 서열 DYKDDDDK(SEQ ID NO: 8)) c-myc(예를 들어, 아미노산 서열 EQKLISEEDL(SEQ ID NO: 9)), Strep II(예를 들어, 아미노산 서열 NWSHPQFEK(SEQ ID NO: 81)), Hexahistidine 태그(6xHIS; 예를 들어, 아미노산 서열 HHHHHH(SEQ ID NO: 82)) 등을 포함한다. 적합한 검출 가능한 신호-생성 단백질은, 예를 들어, 형광 단백질 등을 포함한다. 적합한 형광 단백질은, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 이의 변이체, GFP의 청색 형광 변이체(BFP), GFP의 시안 형광 변이체(CFP), GFP의 황색 형광 변이체(YFP), 강화 GFP(EGFP), 강화 CFP(ECFP), 강화 YFP (EYFP), GFPS65T, Emerald, Topaz(TYFP), Venus, Citrine, mCitrine, GFPuv, 불안정화(destabilized) EGFP(dEGFP), 불안정화 ECFP(dECFP), 불안정화 EYFP(dEYFP), mCFPm, Cerulean, T-Sapphire, CyPet, YPet, mKO, HcRed, t-HcRed, DsRed, DsRed2, DsRed-monomer, J-Red, dimer2, t-dimer2(12), mRFPl, 포실로포린(pocilloporin), Renilla GFP, Monster GFP, paGFP, Kaede 단백질 및 kindling 단백질, 피코빌리단백질(Phycobiliproteins) 및 B-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin 및 Allophycocyanin을 포함하는 피코빌리단백질 접합체를 포함한다. 형광 단백질의 다른 예는 mHoneydew, mBanana, mOrange, dTomato, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mGrapel, mRaspberry, mGrape2, mPlum(Shaner et al. (2005) Nat. Methods 2: 905-909) 등을 포함한다. 예를 들어, Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17: 969-973에 기재되어 있는 Anthozoan 종들의 임의의 다양한 형광 및 컬러 단백질이 사용하기에 적합하다.

8. 이종이량체화 도메인:

2개의 CAR 분자를 포함하는 CAR 그룹의 복합체화는 CAR 분자당 단일 이종이량체화 도메인에 의해 매개될 수 있다. CAR 그룹이 3개 또는 4개의 CAR 분자를 포함하는 구현에서, 상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자는 바람직하게는 이종이량체화를 통해 삼량체 또는 사량체의 형성을 촉진하기 위해, 하나 이상의 이종이량체화 도메인을 함유한다. 이 경우, CAR 분자의 이종이량체화 도메인은 그룹의 2개 이상의 동일한 CAR 분자를 포함하는 복합체의 형성을 방지하기 위해 우선적으로 상이한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원이다. CAR 분자의 이러한 동형(homotype) 상호 작용의 예방은, 동형 상호 작용은 단일 유형의 표적 항원에 대해 높은 결합능을 생성하기 때문에 중요하다. 결과적으로 이것은 단일 유형의 표적 항원에 반응하여 CAR 그룹에 의한 효율적인 신호 전달을 유도하고, 이에 따라 상이한 표적 항원과의 다가 상호 작용에 대한 효율적인 신호 전달의 의존성을 폐지(abrogate)할 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 그룹의 CAR 분자에 통합된 이종이량체화 도메인은 구성적 이종이량체화를 매개할 수 있거나, 분자를 조절함으로써 임의로 조절될 수 있다. 예를 들어, 이종이량체화 도메인의 이종이량체화는 조절 분자의 존재에 의해 유도되거나 감소될 수 있다. 구성적 이종이량체화를 매개하는 도메인은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 코일드-코일(coiled-coil) 상호 작용 도메인 (Thompson et al., ACS Synth Biol. 2012; 1(4):118-29; Cho et al., Cell. 2018;173(6):1426-1438)과 같은 다른 응용에서 성공적으로 사용되나, 자연에는 더 많은 적합한 도메인이 존재한다. 일반적으로, 서로 결합하고 CAR 분자에서 발현될 수 있는 임의의 폴리펩티드 쌍은 본 발명에 따른 CAR 그룹의 두 CAR 분자의 구성 적 이종이량체화를 매개하는데 적합하다. 아래에, 조건부뿐 아니라 구성적 이종이량체화를 위해 설계될 수 있는 리포칼린-폴드 분자 기반 시스템이 설명되어 있다(8.1.2장). 코일드-코일 도메인과 달리, 리포칼린-폴드 분자 기반 시스템은 조절 분자에 의해 오프-스위칭 이종이량체화를 위해 더 쉽게 설계될 수 있다.

8.1. 조건부 이종이량체화를 위한 도메인:

8.1.1. 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 기반한 CAR 분자의 조건부 이종이량체화:

바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자는 핵 수용체로부터의 리간드 결합 도메인(LBD)인 하나의 구성원 및 공동-조절자(co-regulator) 펩티드인 제2의 구성원을 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 이종이량체화될 수 있다. 적절한 소분자(즉, 본 발명에 따른 조절 분자)의 결합시 핵 수용체로부터 유래된 LBD는 각각의 공동-조절 펩티드와 이종이량체화될 수 있다. 이 시스템은 관심 단백질의 이종이량체화에 사용할 수 있다. 적합한 조절 분자와 함께 LBD 및 공동-조절 펩티드의 적합한 서열은, 예를 들어, US 2017/0306303 A1에 개시되어 있다. 적합한 LBD는 ER-알파, ER-베타, PR, AR, GR, MR, RAR-알파, RAR-베타, RAR-감마, TR-알파, TR-베타, VDR, EcR, RXR-알파, RXR-베타, RXR-감마, PPAR-알파, PPAR-베타, PPAR-감마, LXR-알파, LXR-베타, FXR, PXR, SXR, 구성 아드로스트랜 수용체(Constitutive Adrostrane Receptor), SF-1, LRH-1, DAX-1, SHP, TLX, PNR, NGF1-B-알파, NGF1-B-베타, NGF1-B-감마, ROR-알파, ROR-베타, ROR-감마, ERR-알파, ERR-베타, ERR-감마, GCNF, TR2/4, HNF-4, COUP-TF-알파, COUP-TF-베타 및 COUP-TF-감마를 포함한 임의의 다양한 핵 수용체로부터 선택될 수 있다.

핵 수용체(핵 호르몬 수용체와 동의어)의 약어는 다음과 같다. ER: 에스트로겐 수용체; PR: 프로게스테론 수용체; AR: 안드로겐 수용체; GR: 글루코코르티코이드 수용체; MR: 미네랄 코르티코이드 수용체; RAR: 레티노산 수용체; TR-알파/베타: 갑상선 수용체; VDR: 비타민 D3 수용체; EcR: 엑디손 수용체; RXR: 레티노산 X 수용체; PPAR: 페록시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator Activated Receptor); LXR: 간 X 수용체; FXR: 파네소이드 X 수용체; PXR/SXR: Pregnane X 수용체/스테로이드 및 제노바이오틱 수용체; SF-1: 스테로이드 생성 인자 1; DAX-1: X 염색체, 유전자 1에서의 용량 민감성 성 역전-부신 저형성 선천성 임계 영역; LRH-1: 간 수용체 상동체 1; SHP: 소 이종이량체 파트너(Small Heterodimer Partner); TLX: 꼬리없는 유전자(Tail-less Gene); PNR: 광 수용체-특이적 핵 수용체(Photoreceptor-Specific Nuclear Receptor); NGF1-B: 신경 성장 인자; ROR: RAR 관련 고아 수용체(RAR related orphan receptor); ERR: 에스트로겐 관련 수용체; GCNF: 생식 세포 핵 인자; TR2/4: 고환 수용체; HNF-4: 간세포 핵 인자; COUP-TF: 닭 오발부민 업스트림 프로모터, 전사 인자.

8.1.1.1. LBD:

미네랄코르티코이드 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 미네랄코르티코이드 수용체(MR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 MR의 LBD(Uniprot P08235)에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, MR의 LBD는 Uniprot Q9IAC6.1 aa 112-359; Uniprot Q91573.1 aa 365-612; Uniprot Q157N1 aa 734-981; GenBank CAG11072.1 aa 173-501; PDB 2AA6_A aa 28-275; PDB 2AA2_A aa 28-275; PDB 2A3I_A aa 6-253; PDB 2OAX_A aa 9-256; PDB 1Y9R_A aa 8-255; PDB 2ABI_A aa 9-256의 임의의 아미노산 서열에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 250 아미노산의 길이; 예를 들어, 248 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, MR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P08235 aa 686-984에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 299 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 299 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, MR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P08235 aa 737-984에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 248 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, MR의 LBD는 S810L 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P08235 aa 686-984에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 냐자 299 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 299 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, MR의 LBD는 S810L 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P08235 aa 737-984에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 248 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 MR의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 SLTARHKILHRLLQEGSPSDI(Uniprot Q15788 aa 681-701)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 21 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 21 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 MR의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL(Uniprot Q9UBK2 aa 136-156)을 포함하는 공동- 조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드 약 21 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 21 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 MR의 LBD인 경우, 그 쌍의 두 번째 구성원은 아미노산 서열 SKVSQNPILTSLLQITGNGGS(Uniprot Q15648 aa 596-616)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 21 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 21 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

안드로겐 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 안드로겐 수용체(AR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 AR의 LBD(Uniprot P10275)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, AR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 619-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 690-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 또는 210 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 T877A 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 619-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 T877A 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 690-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 또는 210 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 F876L 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 619-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 F876L 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 690-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 또는 210 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 T877A 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 619-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 또는 275 아미노산 내지 301 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, AR의 LBD는 F876L 및 T877A 치환을 갖는 아미노산 서열 Uniprot P10275 aa 690-919에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 또는 210 아미노산 내지 230 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 AR의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 ESKGHKKLLQLLTCSSDDR(Uniprot Q9Y6Q9 aa 614-632)을 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 19 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 19 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

프로게스테론 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 프로게스테론 수용체(PR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 PR의 LBD(Uniprot P06401)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, PR의 LBD는 Uniprot Q8UVY3 aa 456-703; Uniprot P07812.1 aa 539-786; GenBank CAQ14518.1 aa 306-553; PDB 1SR7_A aa 12-259; PDB 1SQN_A aa 14-261; PDB 1E3K aa 11-258; PDB 1A28_A aa 9-256 아미노산 서열 중 어느 것에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 248 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, PR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P06401 aa 678-933에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 256 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 256 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어 256 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, PR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P06401 aa 686-933에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어 248 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 한 구성원이 PR의 LBD인 경우, 이량체화 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF(Uniprot O75376 aa 2251-2275)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 25 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

갑상선 호르몬 수용체-베타:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 갑상선 호르몬 수용체-베타(TR- 베타)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 TR-베타의 LBD(Uniprot P10828)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, TR-베타의 LBD는 Uniprot Q4T8V6 aa 223-502; Uniprot Q90382.1 aa 159-401; Uniprot P18115.2 aa 170-412; Uniprot Q9PVE4.2 aa 141-392; Uniprot P10828.2 aa 216-458; GenBank ABS11249.1 aa 179-419; NCBI REF SEQ XP_001185977.1 aa 186-416; PDB 1NAV_A aa 17-259; PDB 2PIN_A aa 8-250; PDB 3D57_A aa 22-264; PDB 1N46_A aa 13-255; PDB 1BSX_A aa 15-257 아미노산 서열 중 하나에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 230 아미노산, 230 아미노산 내지 240 아미노산, 또는 240 아미노산 내지 250 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, TR-베타의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10828 aa 202-461에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 260 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 260 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어 260 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, TR-베타의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10828 aa 216-461에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 246 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 246 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어 246 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 한 구성원이 TR-베타의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은, 예를 들어 아미노산 서열 Uniprot Q9Y6Q9 aa 627-829 또는 Uniprot Q9Y6Q9 aa 673-750 또는 Uniprot Q15596 aa 721-1021을 포함하는, NCOA3/SRC3 폴리펩티드일 수 있다.

에스트로겐 수용체-알파:

바람직한 구현에서, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 에스트로겐 수용체-알파(ER-알파)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 ER- 알파의 LBD(Uniprot P03372)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, ER-알파의 LBD는 Uniprot P06212.1 aa 304-541; Uniprot P81559.1 aa 302-539; Uniprot Q7ZU32 aa 280-517; GenBank ACB10649.1 aa 303-529; GenBank ABQ42696.1 aa 226-468; GenBank ACC85903.1 aa 141-375; PDB 1XP9_A aa 4-241; PDB 1YY4_A aa 1-236 아미노산 서열 중 어느 것에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 240 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 230 아미노산, 230 아미노산 내지 235 아미노산, 또는 235 아미노산 내지 240 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 305-533에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 180 아미노산 내지 229 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 180 아미노산 내지 200 아미노산, 또는 200 아미노산 내지 229 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 229 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 282-595에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 314 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산의 길이, 275 아미노산 내지 300 아미노산, 또는 300 아미노산 내지 314 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 314 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 310-547에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 238 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 220 아미노산, 또는 220 아미노산 내지 238 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 238 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 치환 D351Y를 갖는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 305-533에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 180 아미노산 내지 229 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 180 아미노산 내지 200 아미노산, 또는 200 아미노산 내지 229 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 229 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 치환 D351Y를 갖는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 282-595에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 314 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 275 아미노산 내지 300 아미노산, 또는 300 아미노산 내지 314 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 314 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-알파의 LBD는 치환 D351Y를 갖는 아미노산 서열 Uniprot P03372 aa 310-547에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 238 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 220 아미노산, 또는 220 아미노산 내지 238 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어 238 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 한 구성원이 ER-알파의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 DAFQLRQLILRGLQDD(SEQ ID NO: 10)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 16 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 16 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍 중 하나의 구성원이 ER-알파의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 SPGSREWFKDMLS(SEQ ID NO: 11)를 포함하는 공동-조절 자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동 조절자 펩티드는 약 13 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 13 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

에스트로겐 수용체-베타(ER-베타):

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 한 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 에스트로겐 수용체-베타(ER-베타)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 ER- 베타의 LBD(Uniprot Q92731)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, ER-베타의 LBD는 Uniprot P06212.1 aa 304-541; Uniprot P81559.1 aa 302-539; Uniprot Q7ZU32 aa 280-517; GenBank ACB10649.1 aa 303-529; GenBank ABQ42696.1 aa 226-468; GenBank ACC85903.1 aa 141-375; PDB 1XP9_A aa 4-241; PDB 1YY4_A aa 1-236 아미노산 서열 중 어느 것에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 243 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 230 아미노산, 230 아미노산 내지 235 아미노산, 또는 235 아미노산 내지 243 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, ER-베타의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot Q92731 aa 260-502에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 243 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 230 아미노산, 230 아미노산 내지 235 아미노산, 또는 235 아미노산 내지 243 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 한 구성원이 ER-베타의 LBD인 경우, 이량체화 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 PRQGSILYSMLTSAKQT(SEQ ID NO: 12)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 17 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 17 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

페록시좀 증식체-활성화 수용체-감마:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 한 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 페록시좀 증식체-활성화 수용체-감마(PPAR-감마)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 PPAR-감마의 LBD(Uniprot P37231)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, PPAR-감마의 LBD는 Uniprot Q4H2X4 aa 176-417; Uniprot P37233.1 aa 129-395; Uniprot Q7T029 aa 95-435; GenBank AAL26245.1 aa 95-435; NCBI REF SEQ XP_781750.1 aa 137-378; NCBI REF SEQ XP 784429.2 aa 219-478; NCBI REF SEQ NP_001001460.1 aa 207-474; PDB 2J14_A aa 17-284; PDB 1FM6_D aa 4-271 아미노산 서열 중 하나에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 269 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 250 아미노산, 또는 250 아미노산 내지 269 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, PPAR-감마의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P37231 aa 174-475에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 150 아미노산 내지 202 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 150 아미노산 내지 160 아미노산, 160 아미노산 내지 170 아미노산, 170 아미노산 내지 190 아미노산, 또는 190 아미노산 내지 202 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, PPAR-감마의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P37231 aa 181-475에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 269 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 250 아미노산, 또는 250 아미노산 내지 269 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, PPAR-감마의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P37231 aa 205-475에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 269 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 250 아미노산, 또는 250 아미노산 내지 271 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍 중 한 구성원이 PPAR-감마의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS(Uniprot Q15788-1 aa 676-700)를 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 25 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 25 아미노산 내지 28 아미노산, 28 아미노산 내지 29 아미노산, 29 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 PPAR-감마의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은 아미노산 서열 PKKENNALLRYLLDRDDPSDV(SEQ ID NO: 13) 또는 PKKKENALLRYLLDKDDTKDI(Uniprot Q15596-1 aa 737-757)을 포함하는 공동-조절자 펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 21 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 21 아미노산 내지 23 아미노산, 23 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

글루코코르티코이드 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot P04150-3을 갖는 GR의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, GR의 LBD는 Uniprot Q4RIR9 aa 110-356; Uniprot P49844.1 aa 530-776; NCBI REF SEQ NP_001032915.1 aa 526-772; PDB 1NHZ_A 34-280; PDB 1M2Z_A aa 11-257; PDB 3BQD_A aa 9-255; PDB 3CLD_A aa 13-259 아미노산 서열 중 하나에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 247 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 225 아미노산 내지 230 아미노산, 230 아미노산 내지 240 아미노산, 또는 240 아미노산 내지 247 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, GR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P04150-3 aa 532-778에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 200 아미노산 내지 247 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 225 아미노산, 또는 225 아미노산 내지 247 아미노산의 길이를 가짐; 예를 들어, 247 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 GR의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은, 예를 들어, 아미노산 서열 Uniprot Q15788 aa 1172-1441 또는 이의 단편, 또는 Uniprot Q15596 aa 320-1021 또는 이의 단편을 포함하는, NCOA2/SRC2 폴리펩티드일 수 있다.

비타민 D 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 비타민 D 수용체(VDR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 VDR의 LBD(Uniprot P11473)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, VDR의 LBD는 Uniprot O42392.1 aa 147-450; NCBI REF SEQ NP_001079288.1 aa 125-421; PDB 2HBH_A aa 5-301; PDB 1S0Z_A aa 11-262 아미노산 서열 중 하나에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 250 아미노산 내지 310 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 275 아미노산 내지 300 아미노산, 또는 300 아미노산 내지 310 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, VDR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P11473 aa 124-426에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 250 아미노산 내지 303 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 275 아미노산 내지 300 아미노산, 또는 300 아미노산 내지 303 아미노산의 길이를 가짐).

이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 VDR의 LBD인 경우, 그 쌍의 제2 구성원은, 예를 들어, 아미노산 서열 Uniprot Q15788 aa 1172-1441 또는 이의 단편, 또는 Uniprot Q15596 aa 320-1021 또는 이의 단편을 포함하는 NCOA1/SRC1 폴리펩티드일 수 있다.

예를 들어, 일부 경우에, 이종이량체화 도메인 쌍의 일 구성원이 VDR의 LBD 인 경우, 그 쌍의 다른 구성원은 아미노산 서열 Uniprot Q15596 aa 744-751을 포함하는 NCOA2/SRC2 폴리펩티드일 수 있으며, 여기서 공동-조절자 펩티드는 약 8 아미노산 내지 약 50 아미노산의 길이를 갖는다(예를 들어, 공동-조절자 펩티드는 약 8 아미노산 내지 10 아미노산, 10 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산에서 23 아미노산, 23 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가짐).

갑상선 호르몬 수용체-알파:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 갑상선 호르몬 수용체-알파(TR- 알파)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 TR- 알파의 LBD(Uniprot P10827-2)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, TR-알파의 LBD는 Uniprot Q4T8V6 aa 223-502; Uniprot Q90382.1 aa 159-401; Uniprot P18115.2 aa 170-412; Uniprot Q9PVE4.2 aa 141-392; Uniprot P10828.2 aa 216-458; GenBank ABS11249.1 aa 179-419; NCBI REF SEQ XP_001185977.1 aa 186-416; PDB 1NAV_A aa 17-259; PDB 2PIN_A aa 8-250; PDB 3D57_A aa 22-264; PDB 1N46_A aa 13-255; PDB 1BSX_A aa 15-257 아미노산 서열 중 하나에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 190 아미노산 내지 약 245 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 210 아미노산 내지 230 아미노산, 또는 230 아미노산 내지 245 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, TR-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10827-2 aa 162-404에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 190 아미노산 내지 약 243 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 210 아미노산, 210 아미노산 내지 230 아미노산, 또는 230 아미노산 내지 243 아미노산의 길이를 가짐).

TR-알파에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

레티노산 수용체-베타:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 레티노산 수용체-베타(RAR-베타)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 RAR- 베타의 LBD(Uniprot P10826-2)에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, RAR-베타의 LBD는 Uniprot Q4H2W2 aa 400-634; Uniprot P22448.2 aa 186-416; Uniprot P28699.2 aa 209-439; Uniprot Q91392.2 aa 176-406; NCBI REF SEQ XP_779976.2 aa 134-362; NCBI REF SEQ XP_002204386.1 aa 179-409; PDB 1XAP_A aa 32-262; PDB 1XDK_B aa 34-264; PDB 1DKF_B aa 5-235 아미노산 서열 중 하나에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 180 아미노산 내지 약 235 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 180 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 220 아미노산, 또는 220 아미노산 내지 235 아미노산의 길이를 가짐).

예를 들어, RAR-베타의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P10826-2 aa 179-409에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 그리고 약 180 아미노산 내지 약 231 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 180 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 220 아미노산, 또는 220 아미노산 내지 231 아미노산의 길이를 가짐).

RAR-베타에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원이 RAR-베타의 LBD인 경우, 이량체화쌍의 다른 구성원은, 예를 들어, 아미노산 서열 Uniprot Q15788 aa 1172-1441 또는 이의 단편을 포함하는 NCOA1/SRC1 폴리펩티드일 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 일 구성원이 RAR-베타의 LBD인 경우, 이량체화 쌍의 다른 구성원은, 예를 들어, 아미노산 서열 Uniprot Q15596 aa 320-1021 또는 이의 단편을 포함하는 NCOA2/SRC2 폴리펩티드일 수 있다.

파네소이드(Farnesoid) X 수용체:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 파네소이드 X 수용체(FXR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot Q96RI1-2를 갖는 FXR의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, FXR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot Q96RI1-2 aa 237-472에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 100 아미노산 내지 약 136 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 100 아미노산 내지 110 아미노산, 110 아미노산 내지 120 아미노산, 또는 120 아미노산 내지 136 아미노산의 길이를 가짐).

FXR에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

LXR-알파:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 간 X 수용체-알파(LXR-알파)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot Q13133-1을 갖는 LXR-알파의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, LXR-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot Q13133-1 aa 182-447에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 약 266 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 220 아미노산, 220 아미노산 내지 240 아미노산, 또는 240 아미노산 내지 266 아미노산의 길이를 가짐).

LXR-알파에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

ROR-감마:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 레티노이드-관련 고아 수용체 감마(ROR-감마)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot P51449-2를 갖는 ROR-감마의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, ROR-감마의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P51449-2 aa 237-497에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 200 아미노산 내지 약 261 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 200 아미노산 내지 220 아미노산, 220 아미노산 내지 240 아미노산, 또는 240 아미노산 내지 261 아미노산의 길이를 가짐).

ROR-감마에 적합한 공동-조절자 펩티드는 NCORNR 펩티드(CDPASNLGLEDIIRKALMGSFDDK, Uniprot Q7Z516-1 aa 2160-2182)일 수 있다.

ROR-감마에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

RXR-알파:

일부 경우에서, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 레티노이드-X 수용체-알파(RXR-알파)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot P19793-1을 갖는 RXR-알파의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, RXR-알파의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot P19793-1 aa 225-462에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 190 아미노산 내지 약 238 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 190 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 210 아미노산, 또는 210 아미노산 내지 238 아미노산의 길이를 가짐).

RXR-알파에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

PXR:

일부 경우에, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 일 구성원으로서 포함하기에 적합한 LBD는 프레그난(Pregnane) X 수용체(PXR)의 LBD일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot O75469-1을 갖는 PXR의 LBD에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, LBD는 아미노산 서열 Uniprot O75469-1의 아미노산 143-428에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, LBD는 Uniprot O75469-1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 205-434에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, PXR의 LBD는 아미노산 서열 Uniprot O75469-1 aa 130-434에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며; 그리고 약 250 아미노산 내지 약 302 아미노산의 길이를 가질 수 있다(예를 들어, 250 아미노산 내지 275 아미노산, 275 아미노산 내지 290 아미노산, 또는 290 아미노산 내지 302 아미노산의 길이를 가짐).

PXR에 적합한 공동-조절자 펩티드는 SRC1 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다(예를 들어, SRC1 폴리펩티드로부터 유래된 8 아미노산 내지 50 아미노산 길이의 펩티드).

8.1.1.2. 공동-조절자 폴리펩티드:

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 전장 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 합성 또는 재조합 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다.

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 50 아미노산, 예를 들어, 8 아미노산 내지 10 아미노산, 10 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 50 아미노산 내지 100 아미노산, 예를 들어 50 아미노산 내지 60 아미노산, 60 아미노산 내지 70 아미노산, 70 아미노산 내지 80 아미노산, 80 아미노산 내지 90 아미노산, 또는 90 아미노산 내지 100 아미노산의 길이를 가질 수 있다.. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 100 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 300 아미노산, 300 아미노산 내지 400 아미노산, 400 아미노산 내지 500 아미노산, 500 아미노산 내지 600 아미노산, 600 아미노산 내지 700 아미노산, 700 아미노산 내지 800 아미노산, 800 아미노산 내지 900 아미노산, 또는 900 아미노산 내지 1000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 1000 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

8.1.1.2. 공동-조절자 폴리펩티드:

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 전장 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 합성 또는 재조합 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다.

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 50 아미노산, 예를 들어, 8 아미노산 내지 10 아미노산, 10 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 50 아미노산 내지 100 아미노산, 예를 들어 50 아미노산 내지 60 아미노산, 60 아미노산 내지 70 아미노산, 70 아미노산 내지 80 아미노산, 80 아미노산 내지 90 아미노산, 또는 90 아미노산 내지 100 아미노산의 길이를 가질 수 있다.. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 100 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 300 아미노산, 300 아미노산 내지 400 아미노산, 400 아미노산 내지 500 아미노산, 500 아미노산 내지 600 아미노산, 600 아미노산 내지 700 아미노산, 700 아미노산 내지 800 아미노산, 800 아미노산 내지 900 아미노산, 또는 900 아미노산 내지 1000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 1000 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

8.1.1.2. 공동-조절자 폴리펩티드:

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 전장 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 자연발생 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 합성 또는 재조합 핵 호르몬 공동-조절자 폴리펩티드를 포함한다.

적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 8 아미노산 내지 50 아미노산, 예를 들어, 8 아미노산 내지 10 아미노산, 10 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 25 아미노산, 25 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 35 아미노산, 35 아미노산 내지 40 아미노산, 40 아미노산 내지 45 아미노산, 또는 45 아미노산 내지 50 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 50 아미노산 내지 100 아미노산, 예를 들어 50 아미노산 내지 60 아미노산, 60 아미노산 내지 70 아미노산, 70 아미노산 내지 80 아미노산, 80 아미노산 내지 90 아미노산, 또는 90 아미노산 내지 100 아미노산의 길이를 가질 수 있다.. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 100 아미노산 내지 200 아미노산, 200 아미노산 내지 300 아미노산, 300 아미노산 내지 400 아미노산, 400 아미노산 내지 500 아미노산, 500 아미노산 내지 600 아미노산, 600 아미노산 내지 700 아미노산, 700 아미노산 내지 800 아미노산, 800 아미노산 내지 900 아미노산, 또는 900 아미노산 내지 1000 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 적합한 공동-조절자 폴리펩티드는 1000 아미노산 내지 2000 아미노산의 길이를 가질 수 있다.

적합한 공동-조절자 펩티드의 예는 다음과 같다:

SRC1: (Uniprot Q15788-1 aa 676 - 700) CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS; SRC1-2: (Uniprot Q15788-1 aa 682 - 702; SNP rs1049021 E685A) SLTARHKILHRLLQEGSPSDI; SRC3-1: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614 - 632) ESKGHKKLLQLLTCSSDDR; SRC3: (SEQ ID NO: 13) PKKENNALLRYLLDRDDPSDV; PGC-1: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 138 - 154) AEEPSLLKKLLLAPANT; PGC1a: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 136 - 156) QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL; TRAP220-1: (Uniprot Q15648-1 aa 596 - 616) SKVSQNPILTSLLQITGNGGS; NCoR: (Uniprot O75376-1 aa 2251 - 2275) GHSFADPASNLGLEDIIRKALMGSF; NR0B1: (Uniprot P51843-1 aa 74 - 90) PRQGSILYSMLTSAKQT; NRIP1: (Uniprot P48552-1 aa 374 - 390) AANNSLLLHLLKSQTIP; TIF2: (Uniprot Q15596-1 aa 737 - 757) PKKKENALLRYLLDKDDTKDI; CoRNR Box: (SEQ ID NO: 14) DAFQLRQLILRGLQDD; abV: (SEQ ID NO: 11) SPGSREWFKDMLS; TRAP220-2: (Uniprot Q15648-1 aa 637 - 657) GNTKNHPMLMNLLKDNPAQDF; EA2: (SEQ ID NO: 15) SSKGVLWRMLAEPVSR; TA1: (SEQ ID NO: 16) SRTLQLDWGTLYWSR; EAB1: (SEQ ID NO: 17) SSNHQSSRLIELLSR; SRC2: (Uniprot Q15596-1 aa 683 - 701) LKEKHKILHRLLQDSSSPV; SRC1-3: (Uniprot Q15788-1 aa 1428 - 1441) QAQQKSLLQQLLTE; SRC1-1: (Uniprot Q15788-1 aa 625 - 645) KYSQTSHKLVQLLTTTAEQQL; SRC1-2: (Uniprot Q15788-1 aa 682 - 702; SNP rs1049021 E685A) SLTARHKILHRLLQEGSPSDI; SRC1-3: (Uniprot Q15788-1 aa 741 - 761) KESKDHQLLRYLLDKDEKDLR; SRC1-4a: (Uniprot Q15788-1 aa 1427 - 1441) PQAQQKSLLQQLLTE; SRC1-4b: (Uniprot Q15788-1 aa 1427 - 1441 L1435R) PQAQQKSLRQQLLTE; GRIP1-1: (Uniprot Q15596-1 aa 633 - 653) HDSKGQTKLLQLLTTKSDQME; GRIP1-2: (Uniprot Q15596-1 aa 682 - 702) SLKEKHKILHRLLQDSSSPVD; GRIP1-3: (Uniprot Q15596-1 aa 737 - 757) PKKKENALLRYLLDKDDTKDI; AIB1-1: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 613 - 633) LESKGHKKLLQLLTCSSDDRG; AIB1-2: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 677 - 697) LLQEKHRILHKLLQNGNSPAE; AIB1-3: (Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 730 - 750) KKKENNALLRYLLDRDDPSDA; PGC1a: (Uniprot Q9UBK2-1 aa 136 - 156) QEAEEPSLLKKLLLAPANTQL; PGC1b: (Uniprot Q86YN6-1 aa 148 - 168) PEVDELSLLQKLLLATSYPTS; PRC: (Uniprot Q5VV67-1 aa 156 - 176) VSPREGSSLHKLLTLSRTPPE; TRAP220-1: (Uniprot Q15648-1 aa 596 - 616) SKVSQNPILTSLLQITGNGGS; TRAP220-2: (Uniprot Q15648-1 aa 637 - 657) GNTKNHPMLMNLLKDNPAQDF; ASC2-1: (Uniprot Q14686-1 aa 879 - 899) DVTLTSPLLVNLLQSDISAGH; ASC2-2: (Uniprot Q14686-1 aa 1483 - 1503) AMREAPTSLSQLLDNSGAPNV; CBP-1: (Uniprot Q92793-1 aa 62 - 82) DAASKHKQLSELLRGGSGSSI; CBP-2: (Uniprot Q92793-1 aa 350 - 370) KRKLIQQQLVLLLHAHKCQRR; P300: (Uniprot Q09472-1 aa 73 - 93) DAASKHKQLSELLRSGSSPNL; CIA: (Uniprot Q9HCD5-1 aa 337 - 357) GHPPAIQSLINLLADNRYLTA; ARA70-1: (Uniprot Q13772-1 aa 84 - 104) TLQQQAQQLYSLLGQFNCLTH; ARA70-2: (Uniprot Q13772-1 aa 320 - 340) GSRETSEKFKLLFQSYNVNDW; TIF1: (Uniprot O15164-2 aa 718 - 738) NANYPRSILTSLLLNSSQSST; NSD1: (Uniprot Q96L73-1 aa 899 - 919) IPIEPDYKFSTLLMMLKDMHD; SMAP: (Uniprot Q9H0E9-2 aa 263 - 283) ATPPPSPLLSELLKKGSLLPT; Tip60: (Uniprot Q92993-1 aa 481 - 501) VDGHERAMLKRLLRIDSKCLH; ERAP140: (Uniprot Q8NI08-1 aa 514 - 534) HEDLDKVKLIEYYLTKNKEGP; Nix1: (Uniprot Q9BQI9-1 aa 236 - 256) ESPEFCLGLQTLLSLKCCIDL; LCoR: (Uniprot Q96JN0-1 aa 45 - 65) AATTQNPVLSKLLMADQDSPL; CoRNR1 (N-CoR): (Uniprot O75376-1 aa 239 - 268) MGQVPRTHRLITLADHICQIITQDFARNQV; CoRNR2 (N-CoR): (Uniprot O75376-1 aa 2260 - 2273) NLGLEDIIRKALMG; CoRNR1 (SMRT): (Uniprot Q9Y618-1 aa 2131 - 2170) APGVKGHQRVVTLAQHISEVITQDTYRHHPQQLSAPLPAP; CoRNR2 (SMRT): (Uniprot Q9Y618-1 aa 2347 - 2360) NMGLEAIIRKALMG; RIP140-C: (SEQ ID NO: 18) RLTKTNPILYYMLQKGGNSVA; RIP140-1: (Uniprot P48552-1 aa 13 - 33) QDSIVLTYLEGLLMHQAAGGS; RIP140-2: (Uniprot P48552-1 aa 125 - 145) KGKQDSTLLASLLQSFSSRLQ; RIP140-3: (Uniprot P48552-1 aa 177 - 197) CYGVASSHLKTLLKKSKVKDQ; RIP140-4: (Uniprot P48552-1 aa 258 - 278) KPSVACSQLALLLSSEAHLQQ; RIP140-5: (Uniprot P48552-1 aa 372 - 392) KQAANNSLLLHLLKSQTIPKP; RIP140-6: (Uniprot P48552-1 aa 493 - 513) NSHQKVTLLQLLLGHKNEENV; RIP140-7: (SEQ ID NO: 19) NLLERRTVLQLLLGNPTKGRV; RIP140-8: (Uniprot P48552-1 aa 811 - 831) FSFSKNGLLSRLLRQNQDSYL; RIP140-9: (Uniprot P48552-1 aa 928 - 948) RESKSFNVLKQLLLSENCVRD; PRIC285-1: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 458 - 518) ELNADDAILRELLDESQKVMV; PRIC285-2: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 541 - 561) YENLPPAALRKLLRAEPERYR; PRIC285-3: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 596 - 616) MAFAGDEVLVQLLSGDKAPEG; PRIC285-4: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 1435 - 1455) SCCYLCIRLEGLLAPTASPRP; 및 PRIC285-5: (Uniprot Q9BYK8-2 aa 1652 - 1672) PSNKSVDVLAGLLLRRMELKP.

일부 경우에, 주어진 LBD는 둘 이상의 상이한 공동-조절자 폴리펩티드와 쌍을 이룰 수 있다. 예를 들어, PPAR-감마(Uniprot P37231)는 SRC1 (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R), SRC2 (Uniprot Q15596-1 aa 683-701), SRC3 (SEQ ID NO: 13; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632), 또는 TRAP220 (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)와 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예로, ER-alpha (Uniprot P03372)는 CoRNR (Uniprot O75376-1 aa 239-268; Uniprot O75376-1 aa 2260-2273; Uniprot Q9Y618-1 aa 2131-2170; Uniprot Q9Y618-1 aa 2347-2360), alpha-betaV (SEQ ID NO: 11), 또는 TA1 (SEQ ID NO: 16)와 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예로, ER-beta (Uniprot Q92731)는 CoRNR (Uniprot O75376-1 aa 239-268; Uniprot O75376-1 aa 2260-2273; Uniprot Q9Y618-1 aa 2131-2170; Uniprot Q9Y618-1 aa 2347-2360), alpha-betaV (SEQ ID NO: 11), 또는 TA1(SEQ ID NO: 16)와 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예로, AR (Uniprot P10275)는 SRC1 (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R), SRC2 (Uniprot Q15596-1 aa 683-701), SRC3 (SEQ ID NO: 13; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632), 또는 TRAP220 (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)와 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예로, PR (Uniprot P06401)은 SRC1 (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R), SRC2 (Uniprot Q15596-1 aa 683-701), SRC3 (SEQ ID NO: 13; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632), TRAP220 (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657), NR0B1 (Uniprot P51843-1 aa 74-90), PGC1B (Uniprot Q86YN6-1 aa 148-168), NRIP1(Uniprot P48552-1 aa 374-390), EA2 (SEQ ID NO: 15), 또는 EAB1 (SEQ ID NO: 17)와 쌍을 이룰 수 있다. 다른 예로, TR-beta (Uniprot P10828)는 SRC1 (Uniprot Q15788-1 aa 625-645; Uniprot Q15788-1 aa 676-700; Uniprot Q15788-1 aa 682-702, SNP rs1049021 E685A; Uniprot Q15788-1 aa 741-761; Uniprot Q15788-1 aa 1428-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441; Uniprot Q15788-1 aa 1427-1441 L1435R), SRC2 (Uniprot Q15596-1 aa 683-701), SRC3 (SEQ ID NO: 13; Uniprot Q9Y6Q9-5 aa 614-632), 또는 TRAP220 (Uniprot Q15648-1 aa 596-616; Uniprot Q15648-1 aa 637-657)와 쌍을 이룰 수 있다.

8.1.1.3. LBD 기반 이종이량체화를 위한 조절 분자:

한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 일 구성원이 핵 호르몬 수용체의 LBD인 경우, 사용된 조절 분자 중 적어도 하나의 타입은 상기 그룹의 제1 CAR 분자에서 LBD에 결합할 수 있으며, 이후 상기 그룹의 제2 CAR 분자 내의 공동-조절자 펩트드로 이종이량체화할 수 있다.

LBD-기반 이종이량체화 시스템에 적합한 조절 분자는 당업계에 공지되어 있다. LBD 기반 이종이량체화 시스템에 대한 조절 분자의 예는 다음을 포함한다:

코르티코스테론((8S,9S,10R,11S,13S,14S,17S)-11-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 데옥시코르티코스테론((8S,9S,10R,13S,14S,17S)-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 코르티솔((8S,9S,10R,11S,13S,14S,17R)-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 11-데옥시코르티솔((8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 코르티손((8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,11-디온); 18-히드록시코르티코스테론((8S,9S,10R,11S,13R,14S,17S)-11-히드록시-17-(2-히드 록시아세틸)-13-(히드록시메틸)-10-메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 1알파-히드록시코르티코스테론((1S,8S,9S,10R,11S,13S,14S,17S)-1,11-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 알도스테론((8S,9S,10R,11S,13R,14S,17S)-11-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10-메틸-3-옥소-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-13-카르바알데히드); 안드로스텐디온((8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디온); 4-히드록시-안드로스테네디온((8R,9S,10R,13S,14S)-4-히드록시-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디온); 11베타-히드록시안드로스테네디온((8S,9S,10R,11S,13S,14S)-11-히드록시-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디온); 안드로스탄디올((3R,5S,8R,9S,10S,13S,14S)-10,13-디메틸-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 안드로스테론((3R,5S,8R,9S,10S,13S,14S)-3-히드록시-10,13-디메틸-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16-테트라데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-온); 에피안드로스테론((3S,5S,8R,9S,10S,13S,14S)-3-히드록시-10,13-디메틸-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16-테트라데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-온); 아드레노스테론((8S,9S,10R,13S,14S)-10,13-디메틸 -1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,11,17-트리온); 디히드로에피안드로스테론((3S,8R,9S,10R,13S,14S)-3-히드록시-10,13-디메틸-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-온; 디히드로에피안드로스테론 설페이트([(3S,8R,9S,10R,13S,14S)-10,13-디메틸-17-옥소-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-일] 히드로겐 설페이트; 테스토스테론((8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-히드록시-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 에피테스토스테론((8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-히드록시-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 5알파-디히드로테스토스테론((5S,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-히드록시-10,13-디메틸-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 5베타-디히드로테스토스테론((5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-히드록시-10,13-디메틸-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 5베타-디히드로테스토스테론((5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-히드록시-10,13-디메틸-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 11베타-히드록시테스토스테론((8S,9S,10R,11S,13S,14S,17S)-11,17-디히드록시-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 11-케토테스토스테론((8S,9S,10R,13S,14S,17S)-17-히드록시-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,12,14,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,11-디온); 에스트론((8R,9S,13S,14S)-3-히드록시-13-메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-17-온); 에스트라디올((8R,9S,13S,14S,17S)-13-메틸-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 에스트리올((8R, 9S, 13S, 14S, 16R, 17R)-13-메틸-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,16,17-트리올); 프레그네놀론(1-[(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-3-히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일]에타논); 17-히드록시프레그네놀론(1-[(3S,8R,9S,10R,13S,14S,17R)-3,17-디히드록시-10,13-디메틸-1,2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-일]에타논); 프로게스테론((8S,9S,10R,13S,14S,17S)-17-아세틸-10,13-디메틸-1,2,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 17-히드록시프로게스테론((8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-아세틸-17-히드록시-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); T3((2S)-2-아미노-3-[4-(4-히드록시-3-요오도페녹시)-3,5-디요오도페닐]프로판산); T4((2S)-2-아미노-3-[4-(4-히드록시-3,5-디요오도페녹시)-3,5-디요오도페닐]프로판산); 스피로놀락톤(S-[(7R,8R,9S,10R,13S,14S,17R)-10,13-디메틸-3,5'-디옥소스피로[2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-7-일]에탄티오에이트); 에플레레논(PubChem CID 443872); 시프로테론 아세테이트(PubChem CID 9880); 히드록시플루타미드(2-히드록시-2-메틸-N-[4-니트로-3-(트리플루오로메틸)페닐]프로판아미드); 엔잘루타마이드(4-[3-[4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐]-5,5-디메틸-4-옥소-2-설파닐리덴이미다졸리딘-1-일]-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드); ARN-509(4-[7-[6-시아노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일]-8-옥소-6-설파닐리덴-5,7-디아자스피로[3.4]옥탄-5-일]-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드); 3,3'-디인돌릴메탄(DIM)(3-(1H-인돌-3-일메틸)-1H-인돌); 벡슬로스테라이드((4aR, 10bR)-8-클로로-4-메틸-1,2,4a,5,6,10b-헥사히드로벤조[f]퀴놀린-3-온); 비칼루타미드(N-[4-시아노-3-(트리플루오로메틸)페닐]-3-(4-플루오로페닐)설포닐-2-히드록시-2-메틸프로판아미드); N-부틸벤젠-설폰아미드(NBBS)(N-부틸벤젠설폰아미드); 두타스테라이드((1S,3aS,3bS,5aR,9aR,9bS,11aS)-N-[2,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]-9a,11a-디메틸-7-옥소-1,2,3,3a,3b,4,5,5a,6,9b,10,11-도데카히드로인데노[5,4-f]퀴놀린-1-카르복스아미드); 에프리스테라이드((8S,9S,10R,13S,14S,17S)-17-(tert-부틸카르바모일)-10,13-디메틸-2,7,8,9,11,12,14,15,16,17-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-카르복실산); 피나스테라이드((1S,3aS,3bS,5aR,9aR,9bS,11aS)-N-tert-부틸-9a,11a-디메틸-7-옥소-1,2,3,3a,3b,4,5,5a,6,9b,10,11-도데카히드로인데노[5,4-f]퀴놀린-1-카르복스아미드); 플루타미드(2-메틸-N-[4-니트로-3-(트리플루오로메틸)페닐]프로판아미드); 이존스테라이드((4aR,10bR)-8-[(4-에틸-1,3-벤조티아졸-2-일)설파닐]-4,10b-디메틸-2,4a,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]퀴놀린-3-온); 케토코나졸(1-[4-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-디클로로페닐)-2-(이미다졸-1-일메틸)-1,3-디옥솔란-4-일]메톡시]페닐]피페라진-1-일]에타논); N-부틸벤젠-설폰아미드(N-부틸벤젠설폰아미드); 닐루타마이드(5,5-디메틸-3-[4-니트로-3-(트리플루오로메틸)페닐]이미다졸리딘-2,4-디온); 메게스트롤((8R,9S,10R,13S,14S,17R)-17-아세틸-17-히드록시-6,10,13-트리메틸-2,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 투로스테라이드((1S,3aS,3bS,5aR,9aR,9bS,11aS)-6,9a,11a-트리메틸-7-옥소-N-프로판-2-일-N-(프로판-2-일카르바모일)-2,3,3a,3b,4,5,5a,8,9,9b,10,11-도데카히드로-1H-인데노[5,4-f]퀴놀린-1-카르복스아미드); 미페프리스톤((8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-13-메틸-17-프로프-1-이닐-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 릴로프리스톤((8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-17-[(Z)-3-히드록시프로프-1-에닐]-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 오나프리스톤((8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-17-(3-히드록시프로필)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 아소프리닐((8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-히드록시이미노메틸]페닐]-17-메톡시-17-(메톡시메틸)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); J912((8S,11R,13S,14S,17S)-17-히드록시-11-[4-[(Z)-히드록시이미노메틸]페닐]-17-(메톡시메틸)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); CDB-2914((8S,13S,14S,17R)-17-아세틸-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); JNJ-1250132([(8S,11R,13S,14S,17R)-17-아세틸-13-메틸-3-옥소-11-(4-피페리딘-1-일페닐)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-일]아세테이트); ORG-31710((6R,8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-6,13-디메틸스피로[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-3-온); ORG-33628((8S,11R,13S,14S,17R)-11-(4-아세틸페닐)-13-메틸-3'-메틸리덴스피로[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-3-온); ORG-31806((7S,8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-7,13-디메틸스피로[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-3-온); ZK-112993((8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-아세틸페닐)-17-히드록시-13-메틸-17-프로프-1-이닐-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); ORG-31376((8S,11R,13S,14R,17S)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-13-메틸스피로[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-3-온); ORG-33245((8S,13S,14S,17R)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-13-메틸-3'-메틸리덴스피로[1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-17,2'-옥솔란]-3-온); ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753(3-(2,2,4-트리메틸-1H-퀴놀린-6-일)벤조니트릴); LG120830(3-플루오로-5-(2,2,4-트리메틸-1H-퀴놀린-6-일)벤조니트릴); LG1447; LG121046; CGP-19984A(소듐; 메틸[(2Z)-3-메틸-2-[(Z)-[5-메틸-3-(2-메틸프로프-2-에닐)-4-옥소-1,3-티아졸리딘-2-일리덴]히드라지닐리덴]-4-옥소-1,3-티아졸리딘-5-일]포스페이트); RTI-3021-012(8S,11R,13S,14S,17R)-17-아세틸-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); RTI-3021-022((8S,11R,13S,14S,17R)-17-아세틸-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); RTI-3021-020; RWJ-25333((3,4-디클로로페닐)-(6-페닐-4,5-디히드로-3H-피리다진-2-일)메탄온); ZK-136796; ZK-114043((8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-아세틸페닐)-17-히드록시-17-[(E)-3-히드록시프로프-1-에닐]-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); ZK-230211((8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-아세틸페닐)-17-히드록시-13-메틸-17-(1,1,2,2,2-펜타플루오로에틸)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734((8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-히드록시-17-[(Z)-3-히드록시프로프-1-에닐]-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); ZK-137316; 아소프리닐((8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-히드록시이미노메틸]페닐]-17-메톡시-17-(메톡시메틸)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1-(E)-[O-(에틸아미노)카르보닐]옥심; (Z)-6'-(4-시아노페닐)-9,11α-디히드로-17β-히드록시-17α-[4-(1-옥소-3-메틸부톡시)-1-부테닐]4'H-나프토[3',2',1'; 10,9,11]estr-4-en-3-온; 11β-(4-아세틸페닐)-17β-히드록시-17α-(1,1,2,2,2-펜타-플루오로에틸)에스트라-4,9-디엔-3-온; 11β-(4-아세틸페닐)-19,24-디노르-17,23-에폭시-17알파-콜라-4,9,20-트리-n-3-온; (Z)-11베타,19-[4-(3-피리디닐)-o-페닐렌]-17베타-히드록시-17α-[3-히드록시-1-프로페닐]-4-안드로스텐-3-온; 11베타-[4-(1-메틸에테닐)페닐]-17α-히드록시-17베타-β-히드록시프로필)-13α-에스트라-4,9-디엔-3-온; 4',5'-디히드로-11베타-[4-(디메틸아미노)페닐]-6베타-메틸스피로[에스트라-4,-9-디엔-17베타, 2'(3'H)-푸란]-3-온; 드로스피레논(PubChem CID 68873); T3((2S)-2-아미노-3-[4-(4-히드록시-3-요오도페녹시)-3,5-디요오도페닐]프로판산); KB-141(2-[3,5-디클로로-4-(4-히드록시-3-프로판-2-일페녹시)페닐]아세트산); 소베티롬(2-[4-[(4-히드록시-3-프로판-2-일페닐)메틸]-3,5-디메틸페녹시]아세트산); GC-24(2-[4-[(3-벤질-4-히드록시페닐)메틸]-3,5-디메틸페녹시]아세트산); 4-OH-PCB106(2-클로로-4-(2,3,4,5-테트라클로로페닐)페놀); 에프로티롬(3-[3,5-디브로모-4-(4-히드록시-3-프로판-2-일페녹시)아닐리노]-3-옥소프로판산); MB07811(PubChem CID 15942005); QH2(2-[(2E)-3,7-디메틸옥타-2,6-디에닐]-5,6-디메톡시-3-메틸벤젠-1,4-디올); MB07344([4-[(4-히드록시-3-프로판-2-일페닐)메틸]-3,5-디메틸페녹시]메틸포스폰산); 타목시펜(2-[4-[(Z)-1,2-디페닐부트-1-에닐]페녹시]-N,N-디메틸에탄아민); 4-OH-타목시펜(4-[(Z)-1-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2-페닐부트-1-에닐]페놀); 랄록시펜([6-히드록시-2-(4-히드록시페닐)-1-벤조티오펜-3-일]-[4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐]메탄온); 라소폭시펜((5R, 6S)-6-페닐-5-[4-(2-피롤리딘-1-일에톡시)페닐]-5,6,7,8-테트라히드로나프탈렌-2-올); 바제독시펜(1-[[4-[2-(아제판-1-일)에톡시]페닐]메틸]-2-(4-히드록시페닐)-3-메틸인돌-5-올); 팔소덱스((7R,8R,9S,13S,14S,17S)-13-메틸-7-[9-(4,4,5,5,5-펜타플루오로펜틸설피닐)노닐]-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 클로미펜(2-[4-[(E)-2-클로로-1,2-디페닐에테닐]페녹시]-N,N-디에틸에탄아민); 페마렐레(); 오르멜록시펜(1-[2-[4-[(3R,4R)-7-메톡시-2,2-디메틸-3-페닐-3,4-디히드로크로멘-4-일]페녹시]에틸]피롤리딘); 토레미피엔(2-[4-[(Z)-4-클로로-1,2-디페닐부트-1-에닐]페녹시]-N,N-디메틸에탄아민); 오스페미펜(2-[4-[(Z)-4-클로로-1,2-디페닐부트-1-에닐]페녹시]에탄올); 및 에티닐 에스트라디올((8R,9S,13S,14S,17R)-17-에티닐-13-메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 에스트라디올((8R,9S,13S,14S,17S)-13-메틸-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 에티닐 에스트라디올((8R,9S,13S,14S,17R)-17-에티닐-13-메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올); 티아졸리딘디온: (예, 로시글리타존(5-[[4-[2-[메틸(피리딘-2-일)아미노]에톡시]페닐]메틸]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온); 피오글리타존(5-[[4-[2-(5-에틸피리딘-2-일)에톡시]페닐]메틸]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온); 로베글리타존(5-[[4-[2-[[6-(4-메톡시페녹시)피리미딘-4-일]-메틸아미노]에톡시]페닐]메틸]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온); 트로글리타존(5-[[4-[(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-3,4-디히드로크로멘-2-일)메톡시]페닐]메틸]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온)), 파글리타자르((2S)-2-(2-벤조일아닐리노)-3-[4-[2-(5-메틸-2-페닐-1,3-옥사졸-4-일)에톡시]페닐]프로판산); 알레글리타자르((2S)-2-메톡시-3-[4-[2-(5-메틸-2-페닐-1,3-옥사졸-4-일)에톡시]-1-벤조티오펜-7-일]프로판산); 및 페노피브르산(2-[4-(4-클로로벤조일)페녹시]-2-메틸프로판산); 벤조피라노퀴놀린 A 276575, 마프라코랏((2R)-1,1,1-트리플루오로-4-(5-플루오로-2,3-디히드로-1-벤조푸란-7-일)-4-메틸-2-[[(2-메틸퀴놀린-5-일)아미노]메틸]펜탄-2-올); ZK 216348(4-(2,3-디히드로-1-벤조푸란-7-일)-2-히드록시-4-메틸-N-(4-메틸-1-옥소-2,3-벤족사진-6-일)-2-(트리플루오로메틸)펜탄아미드); 55D1E1; 덱사메타손((8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-플루오로-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-6,7, 8,11,12,14,15,16-옥타히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 프레드니솔론((8S,9S,10R,11S,13S,14S,17R)-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 프레드니손((8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-6,7,8,9,12,14,15,16-옥타히드로시클로펜타[a]페난트렌-3,11-디온; 메틸프레드니솔론((6S,8S,9S,10R,11S,13S,14S,17R)-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-6,10,13-트리메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 플루티카손 프로피오네이트([(6S,8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-6,9-디플루오로-17-(플루오로메틸설파닐카르보닐)-11-히드록시-10,13,16-트리메틸-3-옥소-6,7,8,11,12,14,15,16-옥타히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-일]프로파노에이트); 베클로메타손-17-모노프로피오네이트([(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-클로로-11-히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-3-옥소-6,7,8,11,12,14,15,16-옥타히드로시클로펜타[a]페난트렌-17-일]프로파노에이트); 베타메타손((8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-플루오로-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-6,7,8,11,12,14,15,16-옥타히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 리멕솔론((8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17S)-11-히드록시-10,13,16,17-테트라메틸-17-프로파노일-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 파라메타손((6S,8S,9S,10R,11S,13S,14S,16R,17R)-6-플루오로-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-7,8,9,11,12,14,15,16-옥타히드로-6H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 및 히드로코르티손((8S,9S,10R,11S,13S,14S,17R)-11,17-디히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-온); 1,25-디히드록시비타민 D3(칼시트리올)((1R,3S,5Z)-5-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(2R)-6-히드록시-6-메틸헵탄)-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1,3-디올), 파리칼리톨((1R,3R)-5-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(E,2R,5S)-6-히드록시-5,6-디메틸헵트-3-엔-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]시클로헥산-1,3-디올), 독세르칼시페롤((1R,3S,5Z)-5-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(E,2R,5R)-5,6-디메틸헵트-3-엔-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1,3-디올), 25-히드록시비타민 D3(칼시페디올)((1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(2R)-6-히드록시-6-메틸헵탄-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1-올), 콜레칼시페롤((1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-7a-메틸-1-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1-올), 에르고칼시페롤((1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(E,2R,5R)-5,6-디메틸헵트-3-엔-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1-올), 타칼시톨((1R,3S,5Z)-5-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(2R,5R)-5-히드록시-6-메틸헵탄-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1,3-디올), 22-디히드로에르고칼시페롤((1S,3Z)-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(2R,5S)-5,6-디메틸헵탄-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-4-메틸리덴시클로헥산-1-올), (6Z)-타칼시올((1S)-3-[(Z)-2-[(1R,7aR)-7a-메틸-1-[(2R)-6-메틸헵탄-2-일]-1,2,3,3a,6,7-헥사히드로인덴-4-일]에테닐]-4-메틸시클로헥스-3-엔-1-올), 2-메틸렌-19-노르-20(S)-1α-히드록시-비스호모프레그나칼시페롤((1R,3R)-5-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-1-[(2S)-부탄-2-일]-7a-메틸-2,3,3a,5,6,7-헥사히드로-1H-인덴-4-일리덴]에틸리덴]-2-메틸리덴시클로헥산-1,3-디올), 19-노르-26,27-디메틸렌-20(S)-2-메틸렌-1α,25-디히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-1α,25-디히드록시-(17E)-17(20)-데히드로-19-노르-비타민 D3, 2-메틸렌-19-노르-(24R)-1α,25-디히드록시비타민 D2, 2-메틸렌-(20R,25S)-19,26-디노르-1α,25-디히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-19-노르-1α-히드록시-프레그나칼시페롤, 1α-히드록시-2-메틸렌-19-노르-호모프레그나칼시페롤, (20R)-1α-히드록시-2-메틸렌-19-노르-비스호모프레그나칼시페롤, 2-메틸렌-19-노르-(20S)-1α-히드록시-트리스호모프레그나칼시페롤, 2-메틸렌-23,23-디플루오로-1α-히드록시-19-노르-비스호모프 레그나칼시페로-1, 2-메틸렌-(20S)-23,23-디플루오로-1α-히드록시-19-노르-비스호모프레그난-칼시페롤, (2-(3' 히드록시프로필-1', 2'-이덴)-19,23,24-트리노르-(20S)-1α-히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-18,19-디노르-(20S)-1α,25-디히드록시비타민 D3 등.

레티노산((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔산), 올-트랜스-레티노산((2E,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔산), 9-시스-레티노산((2E,4E,6Z,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔산), 타미바로틴(4-[(5,5,8,8-테트라메틸-6,7-디히드로나프탈렌-2-일)카르바모일]벤조산), 13-시스-레티노산((2Z,4E,6E,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔산), (2E,4E,6Z,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸-1-시클로헥세닐)노나-2,4,6,-8-테트라엔산, 9-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸-페닐)-3,7-디메틸-노나-2,4,6,8-테트라엔산, 6-[3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐]-2-나프토산, 4-[1-(3,5,5,8,8-펜타메틸-테트라린-2-일)에테닐]벤조산, 레티노벤조산(4-[(5,5,8,8-테트라메틸-6,7-디히드로나프탈렌-2-일)카르바모일]벤조산), 에틸 6-[2-(4,4-디메틸티오크로만-6-일)에티닐]피리딘-3-카르복실레이트, 레티노일 t-부티레이트, 레티노일 피나콜 및 레티노일 콜레스테롤.

오베티콜산((4R)-4-[(3R,5S,6R,7R,8S,9S,10S,13R,14S,17R)-6-에틸-3,7-디히드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일]펜탄산), LY2562175(6-(4-((5-시클로프로필-3-(2,6-디클로로페닐)이속사졸-4-일)메톡시)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인돌-3-카르복실산), 및 GW4064(3-[2-[2-클로로-4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-(1-메틸에틸)-4-이속사졸릴-]메톡시]페닐]에테닐]벤조산); T0901317(N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-N-[4-[2,2,2-트리플루오로-1-히드록시-1-(트리플루오로메틸)에틸]페닐]벤젠설폰아미드), GW3965(3-[3-[[[2-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]메틸](2,2-디페닐에틸)아미노]프로폭시]벤젠아세트산 히드로클로라이드), 및 LXR-623(2-[(2-클로로-4-플루오로페닐))메틸]-3-(4-플루오로페닐)-7-(트리플루오로메틸)인다졸); GNE-3500(27, 1-{4-[3-플루오로-4-((3S,6R)-3-메틸-1,1-디옥소-6-페닐-[1,2]티아지난-2-일-메틸)-페닐]-피페라진-1-일}-에타논); 7베타, 27-디히드록시콜레스테롤((3S,7R,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(2R)-7-히드록시-6-메틸헵탄-2-일]-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,7-디올), 및 7알파, 27-디히드록시콜레스테롤((3S,7S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(2R)-7-히드록시-6-메틸헵탄-2-일]-10,13-디메틸-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-도데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3,7-디올); 9-시스레티노산((2E,4E,6Z,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸시클로헥센-1-일)노나-2,4,6,8-테트라엔산), LGD100268(6-[1-(3,5,5,8,8-펜타메틸-6,7-디히드로나프탈렌-2-일)시클로프로필]피리딘-3-카르복실산), CD3254(3-[4-히드록시-3-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)-페닐]-2-프로펜산), 및 CD2915(Sorensen et al.(1997) Skin Pharmacol. 10: 144).

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 미네랄코르티코이드 수용체(MR)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 스피로놀락톤(spironolactone) 및 에플레레논(eplerenone)을 포함한다. 스피로놀락톤은 하루에 10 내지 35mg 범위, 예를 들어 하루에 25mg의 용량으로 투여될 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 안드로겐 수용체(AR)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩타이드를 포함하는 경우, 적절한 조절 분자는 시프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 히드록시플루타마이드(hydroxyflutamide), 엔잘루타마이드(enzalutamide), ARN-509, 3,3'-디인돌릴메탄(DIM), 벡슬로스테라이드(bexlosteride), 비칼루타마이드(bicalutamide), N-부틸벤젠-설폰아미드(N-butylbenzene-sulfonamide(NBBS)), 두타스테라이드(dutasteride), 에프리스테라이드(epristeride), 피나스테라이드(finasteride), 플루타마이드(flutamide), 이존스테라이드(izonsteride), 케토코나졸(ketoconazole), N-부틸벤젠-설폰아미드(N-butylbenzene-sulfonamide), 닐루타마이드(nilutamide), 메게스트롤(megestrol), 스테로이드 항안드로겐(steroidal antiandrogen) 및 투로스테라이드(turosteride)를 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 프로게스테론 수용체(PR)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 미페프리스톤(RU-486; 11베타-[4N,N-디메틸아미노페닐]-17베타-히드록시-17-(1-프로피닐)-에스트라-4,9-디엔-3-온); 릴로프리스톤(11베타-(4N,N-디메틸아미노페닐)-17베타-히드록시-17-((Z)-3-히드록시프로페닐)에스트라-4,9-디엔-3-온); 오나프리스톤(11베타-(4N,N-디메틸아미노페닐)-17알파-히드록시-17-(3-히드록시프로필)-13알파-에스트라-4,9-디엔-3-온); 아소프리닐(벤즈알데히드, 4-[(11베타, 17베타)-17-메톡시-17-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11-일]-1-(E)-옥심; J867); J912(4-[17베타-히드록시-17알파-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11베타-일]벤즈알데히드-(1E)-옥심); 및 CDB-2914(17알파-아세톡시-11베타-(4-N,N-디메틸아미노페닐)-19-노르프레그나-4,9-디엔-3,20-디온)을 포함한다. 다른 적합한 이량체화제는 예를 들어, JNJ-1250132, (6알파, 11베타, 17베타)-11-(4-디메틸아미노페닐)-6-메틸-4', 5'-디-히드로스피로[에스트라-4,9-디엔-17,2'(3'H)-푸란]-3-온(ORG-31710); (11베타, 17알파)-11-(4-아세틸페닐)-17,23-에폭시-19,24-디노르콜라-4,9-,20-트리엔-3-온(ORG-33628); (7베타, 11베타, 17베타)-11-(4-디메틸아미노페닐-7-메틸]-4',5'-디히드로스피로[에스트라-4,9-디엔-17,2'(3'H)-푸란]-3-온(ORG-31806); ZK-112993; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; ZK-137316; 4-[17베타-메톡시-17알파-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11베타-일]벤즈알데히드-1-(E)-옥심; 4-[17베타-메톡시-17알파-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11베타-일]벤즈알데히드-1-(E)-[O-(에틸아미노)카르보닐]옥심; 4-[17베타-메톡시-17알파-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11베타-일]벤즈알데히드-1-(E)-[O-(에틸티오)카르보닐]옥심; (Z)-6'-(4-시아노페닐)-9,11알파-디히드로-17베타-히드록시-17알파-[4-(1-옥소-3-메틸부톡시)-1-부테닐]4'H-나프토[3',2',1'; 10,9,11]estr-4-엔-3-온; 11베타-(4-아세틸페닐)-17베타-히드록시-17알파-(1,1,2,2,2-펜타-플루오로에틸)에스트라-4, 9-디엔-3-온; 11베타-(4-아세틸페닐)-19,24-디노르-17,23-에폭시-17알파-콜라-4,9,20-트리엔-3-온; (Z)-11베타, 19-[4-(3-피리디닐)-o-페닐렌]-17베타-히드록시-17알파-[3-히드록시-1-프로페닐]-4-안드로스텐-3-온; 11베타-[4-(1-메틸에테닐)페닐]-17알파-히드록시-17베타-베타-히드록시프로필)-13알파-에스트라-4,9-디엔-3-온; 4',5'-디히드로-11베타-[4-(디메틸아미노)페닐]-6베타-메틸스피로[에스트라-4,-9-디엔 -17베타,2'(3'H)-푸란]-3-온, 및 드로스피레논을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 갑상선 수용체-베타(TR- 베타)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 T3(3,5,3'-트리요오도-L-티로닌); KB-141(3,5-디클로로-4-(4-히드록시-3-이소프로필페녹시)페닐아세트산); 소베티롬(GC-1로도 알려짐)(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)-페녹시아세트산); GC-24(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-벤질)벤질페녹시아세트산); 4-OH-PCB106(4-OH-2',3,3',4',5'-펜타클로로비페닐); 에프로티롬(eprotirome); MB07811((2R,4S)-4-(3-클로로페닐)-2-[(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)페녹시)메틸]-2-옥시도-[1,3,2]-디옥사포스포난); QH2; 및 (3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)페녹시)메틸포스폰산(MB07344)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 에스트로겐 수용체-알파(ER-알파)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 타목시펜, 4-OH-타목시펜, 랄록시펜, 라소폭시펜, 바제독시펜, 팔소덱스, 클로미펜, 페마렐레(femarelle), 오르멜록시펜(ormeloxifene), 토레미피엔(toremifiene), 오스페미펜(ospemifene) 및 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 에스트로겐 수용체-베타(ER-베타)의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 에스트라디올(E2; 또는 17- 베타-에스트라디올) 및 에티닐 에스트라디올을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 PPAR-감마의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 티아졸리딘디온(예를 들어, 로시글리타존, 피오글리타존, 로베글리타존, 트로글리타존), 파르글리타자르, 알레글리타자르 및 페노피브르산을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 GR의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 선택적 GR 작용제(SEGRA) 또는 선택적 GR 조절제(SEGRM)일 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 PPAR-감마의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 티아졸리딘디온(예를 들어, 로시글리타존, 피오글리타존, 로베글리타존, 트로글리타존), 파르글리타자르, 알레글리타자르 및 페노피브르산을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 GR의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 선택적 GR 작용제(SEGRA) 또는 선택적 GR 조절제(SEGRM)일 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 VDR의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 1,25-디히드록시 비타민 D3(칼시트리올), 파리칼리톨, 독세르칼시페롤, 25-히드록시 비타민 D3(칼시페디올), 콜레칼시페롤, 에르고칼시페롤, 타칼시올, 22-디히드로에르고칼시페롤, (6Z)-타칼시올, 2-메틸렌-19-노르-20(S)-1알파-히드록시-비스호모프레그나칼시페롤, 19-노르-26,27-디메틸렌-20(S)-2-메틸렌-1알파, 25-디히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-1알파, 25-디히드록시-(17E)-17(20)-디히드로(dehydro)-19-노르-비타민 D3, 2-메틸렌-19-노르-(24R)-1알파, 25-디히드록시비타민 D2, 2-메틸렌-(20R,25S)-19,26-디노르-1알파, 25-디히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-19-노르-1알파-히드록시-프레그나칼시페롤, 1알파-히드록시-2-메틸렌-19-노르-호모프레그나칼시페롤, (20R)-1알파-히드록시-2-메틸렌-19-노르-비스호모프레그나칼시페롤, 2-메틸렌-19-노르-(20S)-1알파-히드록시-트리스호모프레그나칼시페롤, 2-메틸렌-23,23-디플루오로-1알파-히드록시-19-노르-비스호모프레그나칼시페로-1, 2-메틸렌-(20S)-23,23-디플루오로-1알파-히드록시-19-노르-비스호모프레그나-n-칼시페롤, (2-(3'히드록시프로필-1',2'-이덴)-19,23,24-트리노르-(20S)-1알파-히드록시비타민 D3, 2-메틸렌-18,19-디노르-(20S)-1알파, 25-디히드록시비타민 D3 등일 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 RAR-베타의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 레티노산, 올-트랜스-레티노산, 9-시스-레티노산, 타미바로텐, 13-시스-레티노산, (2E,4E,6Z,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸-1-시클로헥세닐)노나-2,4,6,-8-테트라엔산, 9-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸-페닐)-3,7-디메틸-노나-2,4,6,8-테트라엔산, 6-[3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐]-2-나프토산, 4-[1-(3,5,5,8,8-펜타메틸-테트랄린-2-일)에테닐]벤조산, 레티노벤조산, 에틸6-[2-(4,4-디메틸티오크로만-6-일)에티닐]피리딘-3-카르복실레이트, 레티노일t-부티레이트, 레티노일피나콜 및 레티노일 콜레스테롤일 수 있다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 FXR 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 오베티콜산(obeticholic acid), LY2562175(6-(4-((5-시클로프로필-3-(2,6-디클로로페닐)이속사졸-4-일)메톡시)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인돌-3-카르복실산), 및 GW4064(3-[2-[2-클로로-4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-(1-메틸에틸)-4-이속사졸릴-]메톡시]페닐]에테닐]벤조산)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 LXR-알파의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 T0901317(N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-N-[4-[2,2,2-트리플루오로-1-히드록시-1-(트리플루오로메틸)에틸]페닐]벤젠설폰아미드), GW3965(3-[3-[[[2-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]메틸](2,2-디페닐에틸)아미노]프로폭시]벤젠아세트산 히드로클로라이드) 및 LXR-623(2-[(2-클로로-4-플루오로페닐)메틸]-3-(4-플루오로페닐)-7-(트리플루오로메틸)인다졸)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 ROR-감마의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 GNE-3500(27, 1-{4-[3-플루오로-4-((3S,6R)-3-메틸-1,1-디옥소-6-페닐-[1,2]티아지난-2-일-메틸)-페닐]-피페라진-1-일}-에타논)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 ROR-감마의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 7베타, 27-디히드록시콜레스테롤 및 7알파, 27-디히드록시콜레스테롤을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 RXR-알파의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 9-시스 레티노산, LGD100268, CD3254(3-[4-히드록시-3-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)-페닐]-2-프로펜산) 및 CD2915(Sorensen et al. (1997) Skin Pharmacol. 10: 144)을 포함한다.

한 쌍의 이종이량체화 도메인이 PXR의 LBD 및 상응하는 공동-조절자 펩티드를 포함하는 경우, 적합한 조절 분자는 리팜피신, 클로트리마졸 및 로바스타틴일 수 있다.

8.1.2. 리포칼린-폴드 분자에 기초한 CAR 분자의 조건부 이종이량체화:

다른 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자는 리포칼린-폴드 분자인 하나의 구성원 및 2017년 12월 20일에 출원된 EP17208924.5에 개시된 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너인 제2 구성원을 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 이종이량체화될 수 있다. 바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 기반 이종이량체화 시스템은

(a) 리포칼린-폴드 분자

(b) 1500 Da 이하의 저분자량을 갖는 리포칼린-폴드 리간드, 및

(c) 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너

를 포함하며,

여기서 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드 리간드에 결합할 수 있고; 그리고

여기서 리포칼린-폴드 리간드에 결합된 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드 리간드에 결합되지 않은 리포칼린-폴드 분자의 친화성보다 적어도 10배 더 높은 친화성으로 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너에 결합하며,

그리고 여기서 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너는 임의의 리포칼린-폴드 리간드의 존재 하에 임의의 자연발생 리포칼린-폴드 분자에 대해 <10μM의 친화성을 갖는 자연발생 단백질이 아니다.

추가의 바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 기반 이종이량체화 시스템은

(a) 리포칼린-폴드 분자

(b) 1500 Da 이하의 저분자량을 갖는 리포칼린-폴드 리간드, 및

(c) 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너

를 포함하며,

여기서 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드 리간드가 리포칼린-폴드 분자에 결합되지 않을 때 적어도 제1 입체형태(conformation) 및 리포칼린-폴드 리간드가 리포칼린-폴드 분자에 결합될 때 적어도 제2 입체형태를 가지며; 그리고

여기서 제2 입체형태에서 리포칼린-폴드 리간드에 결합된 리포칼린-폴드 분자는 제1 입체형태의 리포폴린-폴드 리간드에 결합되지 않은 리포칼린-폴드 분자의 친화성보다 적어도 10배 더 높은 친화성으로 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너에 결합하며,

그리고 여기서 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너는 임의의 리포칼린-폴드 리간드의 존재 하에 임의의 자연발생 리포칼린-폴드 분자에 대해 <10μM의 친화성을 갖는 자연발생 단백질이 아니다.

조건부 이종이량체화를 위한 이 리포칼린-폴드 분자 기반 시스템은 일반적으로 리포칼린-폴드 리간드가 결합되는지 여부에 따라 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너에 대한 리포칼린-폴드 분자의 친화성의 실질적인 차이에 의존한다. 친 화도 윈도우(즉, 각각, 리포칼린-폴드 리간드에 결합되거나 결합되지 않은 리포칼린-폴드 분자에 대한 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너의 친화성)는 생리학적 조건 하에서 이종이량체화의 조절을 허용하는 합리적인 친화성 범위에 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 리간드-결합 상태의 리포칼린-폴드 분자에 대한 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너의 친화성은 10μM 미만, 바람직하게는 2μM 미만, 특히 400nM 미만인 것이 바람직하다.

리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너가 리포칼린-폴드 리간드로 하전된 또는 리포칼린-폴드 리간드로 하전되지 않은 리포칼린-폴드 분자에 결합하도록 설계되었는지 여부에 따라, 리포칼린-폴드 분자 기반 시스템을 각각, 조건부 이종이량체화를 위해(즉, 온-스위칭을 위해) 또는 구성적 이종이량체화를 위해 사용할 수 있다. 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너는 또한 리포칼린-폴드 리간드의 존재 하에서 아니라 부재 하에 리포칼린-폴드 분자에 결합하도록 설계될 수 있기 때문에, 그 시스템은 또한 이종이량체화를 조건부로 방지하기 위해(즉, 오프-스위칭) 사용할 수 있다. 원칙적으로, 리포칼린-폴드 분자 기반 시스템은 또한 적어도 2개의 상이한 리포칼린-폴드 리간드를 결합하기 위해 선택적으로 조작될 수 있으며, 여기서 이에 따라 선택된 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너는 2개의 차별적으로 유도된 입체형태 상태들 사이를 구별할 수 있으며, 이는 2개의 다른 리포칼린-폴드 리간드들을 순차적으로 추가함으로써 조건부 온- 및 오프-스위칭을 가능하게 한다.

본 발명에 따라 이종이량체화 도메인으로 사용될 수는 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드 리간드가 결합하고 (또는 여기서), 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너에 리포칼린-폴드 분자의 결합을 가능하게 하는 리포칼린-폴드의 구조적 모티프를 함유하는 임의의 단백질일 수 있다.

리포칼린-폴드 분자는 SCOP 데이터베이스(버전 1.75)에서 리포칼린 상과로 분류된 자연발생 분자, 또는 이의 돌연변이로 정의된다. 그러나, 제한된 수의 아미노산만 교환하는 것이 바람직하다.

바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 분자는 자연발생 iLBP(세포내 지질 결합 단백질), 자연발생 리포칼린 또는 안티칼린과 동일한 분자, 및 1-30 아미노산 교환을 갖는 이들 분자의 어느 유도체 및 이의 단편과 동일한 분자이다. 다른 바람직한 구현에서, 리포칼린-폴드 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 또는 30 아미노산 교환을 갖는 자연발생 리포칼린 또는 iLBP의 유도체이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드 리간드 결합을 최적화하기 위해 하나 이상의 아미노산 교환, 삽입 및/또는 결실에 의해 조작된다. 바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 분자는 β-배럴 구조에서 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 자연발생 또는 (이의 아미노산 서열에 의해) 달리 개시된 리포칼린-폴드 분자의 유도체이며, 이에 따라 이 β-배럴 구조는 바람직하게는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 대응하는 영역으로 정의된다.

- (PDB 엔트리 RBP4에서 아미노산 잔기 번호 넘버링 체계에 따른) 인간 RBP4의 아미노산 잔기 21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120 및 132-138로서, 이는 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 눈물 리포칼린(TLC; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102 및 111-117로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 아포리포프로틴 M(ApoM; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137 및 142-148로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 세포 레티노산 결합 단백질 II(CRABPII; PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124 및 129-135로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 지방산 결합 단백질 1(FABP1; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114 및 119-125로서, 이는 인간 FABP1에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함.

바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 분자는 적어도 리포폴린-폴드의 구조적으로 보존된 β-배럴 구조를 커버하는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 100, 특히 적어도 120 아미노산의 길이를 갖는 자연발생 리포칼린 또는 이의 유도체의 단편이거나, 또는 여기서 리포칼린-폴드 분자는 적어도 리포폴린-폴드의 구조적으로 보존된 β-배럴 구조를 커버하는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 85, 특히 적어도 90 아미노산의 길이를 갖는 자연발생 iLBP 또는 이의 유도체의 단편이며, 여기서. 여기서 구조적으로 보존된 β-배럴 구조는 바람직하게는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 상응하는 아미노산 위치를 포함하거나 또는 이로 구성된다.

- (PDB 엔트리 1RBP에서 아미노산 잔기 번호 넘버링 체계에 따른) 인간 RBP4의 아미노산 잔기 21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120 및 132-138로서, 이는 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 눈물 리포칼린(TLC; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102 및 111-117로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 아포리포프로틴 M(ApoM; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137 및 142-148로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 세포 레티노산 결합 단백질 II(CRABPII; PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124 및 129-135로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 지방산 결합 단백질 1(FABP1; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114 및 119-125로서, 이는 인간 FABP1에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의하며; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름).

추가의 바람직한 구현에 따르면, 리포칼린-폴드 분자는 구조적으로 보존된 β-배럴 구조, 바람직하게는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 대응하는 구조적으로 보존된 β-배럴 구조의 외부에 최대 15, 최대 30, 또는 최대 50 아미노산 결실 및/또는 최대 15, 최대 30, 또는 최대 50 아미노산 삽입을 갖는 자연발생 리포칼린 또는 iLBP의 유도체이다.

- 인간 RBP4의 아미노산 잔기 1-20, 31-40, 48-51, 59-70, 79-84, 89-101, 110-113, 121-131 및 139-183으로서, 이는 PDB 엔트리 1RBP에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 TLC에서 아미노산 잔기 1-13, 24-36, 44-47, 55-61, 70-75, 80-83, 92-95, 103-110 및 118-158로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 ApoM에서 아미노산 잔기 1-43, 54-68, 76-80, 88-95, 104-109, 114-118, 127-130, 138-141 및 149-188로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 CRABPII에서 아미노산 잔기 1-4, 13-40, 46-49, 55-60, 66-70, 74-80, 88-92, 97-107, 113-118, 125-128 및 136-137로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 FABP1에서 아미노산 잔기 1-4, 13-38, 44-47, 53-58, 64-68, 72-78, 86-90, 95-98, 104-108, 115-118 및 126-127로서, 이는 인간 FABP1에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함.

다른 바람직한 구현에서, 리포칼린-폴드 분자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 아미노산 교환을 갖는 리포칼린 수퍼 패밀리의 자연발생 구성원의 유도체이다.

더욱 바람직한 구현에 따르면, 본 발명에 따른 이종이량체화 도메인으로 사용되는 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린, 즉, 8번째 β-스트랜드의 C-말단 끝 후에 α-헬릭스가 후속하는, +1 토폴로지로 배열된 8-스트랜드 상하(up-and-down) β-배럴을 함유하는 단백질이다.

본 발명에 따른 조절 분자로 사용될 수 있는 리포칼린-폴드 리간드는, 예를 들어, 리포칼린-폴드 분자와 같은 폴리펩티드 및 단백질에 비해 "작은(small)" "소분자(small molecule)"이다. 따라서, 리포칼린-폴드 리간드는 1500 Da 이하, 바람직하게는 1000 Da 이하, 특히 750 Da 이하의 몰중량을 갖는다. 리포칼린-폴드 리간드의 바람직한 Mw 범위는 50 내지 1500 Da, 바람직하게는 75 내지 1500 Da, 특히 150 내지 750 Da이다. 바람직하게, 리포칼린-폴드 리간드는 배럴에 의해 형성된 리포칼린-폴드 분자의 칼릭스 및 리포칼린-폴드 구조의 루프 영역에서 결합할 수 있다.

리포칼린-폴드 리간드는 1mM 미만, 바람직하게는 100μM 미만, 특히 10μM 미만의 리포칼린-폴드 분자에 대한 친화성을 갖는 것이 바람직하다. 리포칼린-폴드 리간드와 리포칼린-폴드 분자 사이의 이러한 친화성은 Kd(해리 상수) 값으로 정의되며, 바람직하게는 자동화 MicroCal PEAQ-ITC 기기(Malvern Instruments)를 사용하는 등온 적정 열량계(ITC)에 의해 측정된다.

리포칼린-폴드 리간드의 예는 다음으로부터 선택될 수 있다:

8.1.3. 조건부 이종이량체화를 위한 추가 시스템:

본 발명에 따르면, 예를 들어, CAR 그룹의 두 CAR 분자의 이종이량체화를 위한 한 쌍의 이종이량체화 도메인은 또한 다음으로부터 선택될 수 있다:

a) FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질(FRB, 돌연변이 T82L)

b) GAI 및 GID1

c) FKBP 및 칼시뉴린(calcineurin) 촉매 서브유닛 A(CnA)

d) FKBP 및 시클로필린(cyclophilin)

e) PYL 및 ABI

이들 이종이량체화 도메인의 서열 및 이들 이종이량체화 도메인의 이량체화에 적합한 조절 분자는 당업계에 잘 알려져 있으며(Rutkowska et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2012; 51(33): 8166), 예를 들어 WO2014127261에 개시되어 있다.

GAI, GID1, FKBP, CnA, 시클로필린, PYL 및 ABI로부터 선택된 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원은 약 50 아미노산 내지 약 300 아미노산 이상의 길이를 가질 수 있으며; 예를 들어, 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 구성원은 약 50 aa 내지 약 100 aa, 약 100 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 200 aa, 약 200 aa 내지 약 250 aa, 약 250 aa 내지 약 300 aa, 또는 300 aa 초과의 길이를 가질 수 있다.

예를 들어, 바람직한 이종이량체화 도메인은 FKBP로부터 유래될 수 있으며, 아미노산 서열 Uniprot P62942-1에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 칼시뉴린 촉매 서브유닛 A(PPP3CA; CALN; CALNA; CALNA1; CCN1; CNA1; PPP2B; CAM-PRP 촉매 서브유닛; 칼시뉴린 A 알파; 칼모듈린-의존성 칼시뉴린 A 서브유닛 알파 아이소폼; 단백질 포스파타아제 2B, 촉매 서브유닛, 알파 아이소폼 등으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있으며, 아미노산 서열 Uniprot Q08209-1 아미노산(aa) 56-347(PP2Ac 도메인)에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 시클로필린(시클로필린 A, PPIA, CYPA, CYPH, PPIase A 등으로도 알려짐)으로부터 유래될 수 있으며, 아미노산 서열 Uniprot P62937-1에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 MTOR(FKBP-라파마이신 관련 단백질; FK506 결합 단백질 12-라파마이신 관련 단백질 1; FK506 결합 단백질 12-라파마이신 관련 단백질 2; FK506-결합 단백질 12-라파마이신 복합체-관련 단백질 1; FRAP; FRAP1; FRAP2; RAFT1; 및 RAPT1으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있으며, 그리고 아미노산 서열 Uniprot P42345-1 aa 2021-2113("Frb": Fkbp-라파마이신 결합 도메인으로도 알려짐)에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 PYL 단백질(앱시스산 수용체 및 RCAR로도 알려짐)으로부터 유래될 수 있으며, PYL10 (Uniprot Q8H1R0-1); PYL11 (Uniprot Q9FJ50); PYL12 (Uniprot Q9FJ49-1); PYL13 (Uniprot Q9SN51-1); PYL1 (Uniprot Q8VZS8-1); PYL2 (Uniprot O80992-1); PYL3 (Uniprot Q9SSM7-1); PYL4 (Uniprot O80920-1); PYL5 (Uniprot Q9FLB1-1); PYL6 (Uniprot Q8S8E3-1); PYL7 (Uniprot Q1ECF1-1); PYL8 (Uniprot Q9FGM1-1); PYL9 (Uniprot Q84MC7-1); PYR1 (Uniprot O49686-1) 아미노산 서열 중 어느 것에 대해 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 ABI 단백질(Abscisic Acid-Insensitive(앱시스산-무감성)으로도 알려짐)로부터 유래될 수 있으며, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana): ABI1(ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 1, 단백질 포스파타아제 2C 56, AtPP2C56, P2C56 및 PP2C ABI1로도 알려짐) 및/또는 ABI2(P2C77, 단백질 포스파타아제 2C 77, AtPP2C77, ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 2, 단백질 포스파타아제 2C ABI2, 및 PP2C ABI2로도 알려짐)의 것들과 같은 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 이종이량체화 도메인은 ABI1(Uniprot P49597-1); ABI2(Uniprot O04719-1) 아미노산 서열 중 어느 것의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 약 160 aa 내지 약 170 aa, 약 170 aa 내지 약 180 aa, 약 180 aa 내지 약 190 aa, 또는 약 190 aa 내지 약 200 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 GAI 아라비돕시스 탈리아나 단백질(지베렐린산 무감성(Gibberellic Acid Insensitive), 및 DELLA 단백질 GAI로도 알려짐)으로부터 유래될 수 있으며, Uniprot Q9LQT8-1 아미노산 서열의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 약 160 aa 내지 약 170 aa, 약 170 aa 내지 약 180 aa, 약 180 aa 내지 약 190 aa, 또는 약 190 aa 내지 약 200 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 이종이량체화 도메인은 GID1 아라비돕시스 탈리아나 단백질(지베렐린 수용체 GID1로도 알려짐)으로부터 유래될 수 있으며, GID1A(Uniprot Q9MAA7-1); GID1B(Uniprot Q9LYC1-1); GID1C(Uniprot Q940G6-1) 아미노산 서열 중 어느 것의 약 100 아미노산 내지 약 110 아미노산(aa), 약 110 aa 내지 약 115 aa, 약 115 aa 내지 약 120 aa, 약 120 aa 내지 약 130 aa, 약 130 aa 내지 약 140 aa, 약 140 aa 내지 약 150 aa, 약 150 aa 내지 약 160 aa, 약 160 aa 내지 약 170 aa, 약 170 aa 내지 약 180 aa, 약 180 aa 내지 약 190 aa, 또는 약 190 aa 내지 약 200 aa의 연속 스트레치에 대해, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

8.1.3에 기술된 이종이량체화 도메인의 이종이량체화는 (이종이량체화 도메인 쌍 다음의 괄호 안에 표시된) 다른 조절 분자에 의해 달성될 수 있다:

b) FKBP 및 CnA(라파 마이신);

c) FKBP 및 시클로필린(라파마이신);

d) FKBP 및 FRG(라파마이신);

h) PYL 및 ABI(앱시스산);

j) GAI 및 GID1(지베렐린 또는 지베렐린 유사체 GA-3M).

위에서 언급한 바와 같이, 라파마이신(PubChem CID 5284616)은 조절 분자로서 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 라파마이신 유도체 또는 유사체가 사용될 수 있다. 예를 들어, W096/41865; WO99/36553; WO01/14387; 및 Ye et al(1999) Science 283:88-91 참조. 예를 들어, 라파마이신과 구조적으로 관련된 유사체, 동족체, 유도체 및 다른 화합물("라팔로그(rapalogs)")은, 그 중에서도, 라파 마이신에 비해 다음 변형 중 하나 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함한다: C7, C42 및/또는 C29에서 메톡시의 디메틸화, 제거 또는 대체; CI 3, C43 및/또는 C28에서 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원(reduction), 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및 시클로헥실 고리상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 추가 정보는 미국특허 제5,525,610호; 제5,310,903호; 제5,362,718호; 및 제5,527,907호에 제공된다. C-28 히드록실기의 선택적 에피머화가 기술되었다; 예를 들어, WO01/14387 참조. 라파마이신의 대안으로 사용하기에 적합한 추가 합성 조절 분자는 미국특허 공개번호 제2012/0130076호에 기재된 것들, 예를 들어 28-에피라파마이신(PubChem CID 131668123)을 포함한다.

또한, 라팔로그로 적합한 것은 다음 화학식의 화합물이다:

(예를 들어, US7067526B1에 개시된 바와 같이) 여기서 n은 1 또는 2이고; R²⁸ 및 R⁴³은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 지방족 또는 아실 모이어티이고; R^7a 및 R^7b 중 하나는 H이고, 다른 하나는 할로, R^A, OR^A, SR^A, -OC(O)R^A, -OC(O)NR^AR^B, -NR^AR^B, -NR^BC(OR)R^A, NR^BC(O)OR^A, -NR^BSO₂R^A 또는 NR^BSO₂NR^AR^B'이거나; 또는 R^7a 및 R^7b는 함께 취해져 테트라엔 모이어티에서 H이다:

여기서 R^A는 H 또는 치환된 또는 비치환된 지방족, 헤테로 지방족, 아릴, 또는 헤테로아릴 모이어티이고, R^B 및 R^B'는 독립적으로 H, OH, 또는 치환된 또는 비치환된 지방족, 헤테로 지방족, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티이다.

8.1.4. 분비된 가용성 인자에 의한 세포외 이량체화:

본 발명에 따른 CAR 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 비공유 복합체화는 또한 분비된 가용성 인자, 예를 들어 종양 스트로마에 축적되는 단백질에 의해 유도될 수 있으며, 이에 따라 종종 이들 단백질은 그 자체로 동종-또는 이종이량제화될 수 있다. 이 경우, 이들 가용성 인자는 본 발명에 따른 조절 분자로서 역할을 한다. 이량체화 도메인은, 예를 들어, 가용성 인자가 결합할 수 있는 천연 수용체(또는 그로부터 유도된 짧은 펩티드; 예를 들어 Young et al., J Biol Chem. 2004; 279(46):47633-42)의 도메인이거나, 또는 선택된 가용성 인자(예를 들어, Dotor et al., Cytokine. 2007;39(2):106-15; Lobner et al., MAbs. 2017;9(7):1088-1104)에 결합하도록 조작된 임의의 항원 결합 폴리펩티드(챕터 1 "항원 결합 모이어티(Antigen binding moiety)"에서 이미 설명됨)일 수 있다(실시예 6에서 CAR 그룹의 복합체화에 사용된 VEGF-결합 도메인).

9. 표적 항원:

본 발명에 따른 바람직한 구현에서, CAR 그룹 및 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 각각의 항원 결합 모이어티는 세포 상에 존재하는 표적 항원, 바람직하게는 고형 표면, 또는 지질 이중층 상의 세포의 표적 항원에 결합한다.

본 발명에 따르면, CAR 그룹의 항원 결합 모이어티에 의해, 또는 대안적으로 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티에 의해 특이적으로 인식되는 특정 표적 항원은 자연발생 세포 표면 항원 또는 폴리펩티드, 탄수화물 또는 자연발생 세포 표면 항원에 결합된 지질일 수 있다.

CAR 그룹의 항원 결합 모이어티, 및 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 또 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 예는, 예를 들어, CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD30, CD33, CD35, CD38, CD40, CD42c, CD43, CD44, CD44v6, CD47, CD49D, CD52, CD53, CD56, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD82, CD85A, CD85B, CD85D, CD85H, CD85K, CD96, CD107a, CD112, CD115, CD117, CD120b, CD123, CD146, CD148, CD155, CD185, CD200, CD204, CD221, CD271, CD276, CD279, CD280, CD281, CD301, CD312, CD353, CD362, BCMA, CD16V, CLL-1, Ig kappa, TRBC1, TRBC2, CKLF, CLEC2D, EMC10, EphA2, FR-a, FLT3LG, FLT3, Lewis-Y, HLA-G, ICAM5, IGHA1/IgA1, IL-1RAP, IL-17RE, IL-27RA, MILR1, MR1, PSCA, PTCRA, PODXL2, PTPRCAP, ULBP2, AJAP1, ASGR1,CADM1, CADM4, CDH15, CDH23, CDHR5, CELSR3, CSPG4, FAT4, GJA3, GJB2, GPC2, GPC3, IGSF9, LRFN4, LRRN6A/LINGO1, LRRC15, LRRC8E, LRIG1, LGR4, LYPD1, MARVELD2, MEGF10, MPZLI1, MTDH, PANX3, PCDHB6, PCDHB10, PCDHB12, PCDHB13, PCDHB18, PCDHGA3, PEP, SGCB, 베자틴(vezatin), DAGLB, SYT11, WFDC10A, ACVR2A, ACVR2B, 아나플라스틱 림포마 키나아제(anaplastic lymphoma kinase), 카데린(cadherin) 24, DLK1, GFRA2, GFRA3, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EFNB1, EPOR, FGFR2, FGFR4, GALR2, GLG1, GLP1R, HBEGF, IGF2R, UNC5C, VASN, DLL3, FZD10, KREMEN2, TMEM169, TMEM198, NRG1, TMEFF1, ADRA2C, CHRNA1, CHRNB4, CHRNA3, CHRNG, DRD4, GABRB3, GRIN3A, GRIN2C, GRIK4, HTR7, APT8B2, NKAIN1, NKAIN4, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1I, CACNG8, CACNG4, CLCN7, KCNA4, KCNG2, KCNN3, KCNQ2, KCNU1, PKD1L2, PKD2L1, SLC5A8, SLC6A2, SLC6A6, SLC6A11, SLC6A15, SLC7A1, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC9A1, SLC10A3, SLC10A4, SLC13A5, SLC16A8, SLC18A1, SLC18A3, SLC19A1, SLC26A10, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A5, SLC35E2, SLC38A6, SLC38A9, SLC39A7, SLC39A8, SLC43A3, TRPM4, TRPV4, TMEM16J, TMEM142B, ADORA2B, BAI1, EDG6, GPR1, GPR26, GPR34, GPR44, GPR56, GPR68, GPR173, GPR175, LGR4, MMD, NTSR2, OPN3, OR2L2, OSTM1, P2RX3, P2RY8, P2RY11, P2RY13, PTGE3, SSTR5, TBXA2R, ADAM22, ADAMTS7, CST11, MMP14, LPPR1, LPPR3, LPPR5, SEMA4A, SEMA6B, ALS2CR4, LEPROTL1, MS4A4A, ROM1, TM4SF5, VANGL1, VANGL2, C18orf1, GSGL1, ITM2A, KIAA1715, LDLRAD3, OZD3, STEAP1, MCAM, CHRNA1, CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB4, KIAA1524, NRM.3, RPRM, GRM8, KCNH4, 멜라노코르틴 1 수용체(Melanocortin 1 receptor), PTPRH, SDK1, SCN9A, SORCS1, CLSTN2, 엔도텔린 전환효소 유사-1(Endothelin converting enzyme like-1), 리소포스파틱산 수용체 2(Lysophosphatic acid receptor 2), LTB4R, TLR2, 뉴로트로픽 티로신 키나아제 1(Neurotropic tyrosine kinase 1), MUC16, B7-H4, 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR), ERBB2, HER3, EGFR variant III(EGFRvIII), HGFR, FOLR1, MSLN, CA-125, MUC-1, 전립선-특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen)(PSMA), 메소텔린(mesothelin), 상피세포 부착분자(epithelial cell adhesion molecule)(EpCAM), L1-CAM, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, VEGFR1, VEGFR2, 고분자량-멜라노마 관련 항원(high molecular weight-melanoma associated antigen)(HMW-MAA), MAGE-A l, IL-13R-α2, 디시알로갱글리오사이드(disialogangliosides)(GD2 및 GD3), 종양-관련 탄수화물 항원(tumour-associated carbohydrate antigens)(CA-125, CA-242, Tn 및 sialyl-Tn), 4-1BB, 5T4, BAFF, 카보닉 안하이드라아제 9(carbonic anhydrase 9)(CA-IX), C-MET, CCR1, CCR4, FAP, 피브로넥틴 엑스트라 도메인 - B(fibronectin extra domain-B)(ED-B), GPNMB, IGF-1 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, ITB5, ITGAX, 엠비긴(embigin), PDGF-Rα, ROR1, 신데칸 1(Syndecan 1), TAG-72, 테나신 C(tenascin C), TRAIL-R1, TRAIL-R2, NKG2D-리간드, 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자 제시 종양-특이 펩티드 에피토프, 바람직하게 PR1/HLA-A2, 계통-특이적(lineage-specific) 또는 조직-특이적(tissue-specific) 조직 항원, 바람직하게 CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD25, CD34, CD80, CD86, CD133, CD138, CD152, CD319, 엔도글린(endoglin), MHC 분자 등을 포함한다.

10. 핵산, 세포 준비, 치료 용도:

본 발명의 또 다른 견지는 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산은 일부 구현에서, 예를 들어, 발현 벡터를 포함하는 DNA 또는 RNA일 것이다. 본 발명에 따른 핵산은, 또한, 예를 들어, 바이러스 벡터로, 다른 형태로 제공될 수 있다. 핵산은 세포에서 활성 또는 조건부 활성일 수 있으며, 일부 구현에서 RNA, 예를 들어, 시험관 내 합성된 RNA로서 존재한다. RNA 또는 DNA를 숙주 세포에 도입하는 것은 시험관 내 또는 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포(예를 들어, NK 세포, 세포독성 T 림프구 등)는 CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA로 시험관 내 또는 생체 외 전기천공될 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 핵산은 2개, 또는 3개 또는 4개 CAR 분자로 구성된 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 핵산은 각각 2개, 3개 또는 4개 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 1 분자를 코딩하는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 개별 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

CAR 그룹의 CAR 분자가 상이한 핵산 분자에 의해 코딩되는 경우, 본 발명은 CAR 그룹의 1개, 2개, 3개 또는 4개 분자를 코딩하는 적어도 2개의 핵산의 키트를 제공하며, 여기서, 또한, 핵산은 바람직하게는 DNA, RNA 또는 시험관 내 전사된 RNA로부터 선택된다.

본 발명은, 또한, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는(즉, CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는) 벡터 및/또는 핵산(CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는)의 키트를 제공한다.

이러한 벡터는 선택 가능한 마커, 복제 기점 및 벡터의 복제 및/또는 유지를 위해 제공하는 기타 특징을 포함할 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 알려져 있다; 본 발명에 따른 재조합 구조물을 생성하기 위해 많은 것이 상업적으로 이용 가능하다. 다음 벡터는 예시로 제공된다. 박테리아: pBs, 파지 스크립트, PsiX l74, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5(Pharmacia, Uppsala, 스웨덴). 진핵 생물: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL(Pharmacia). 벡터는 이종 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치한 편리한 제한 부위를 가질 수 있다. 발현 숙주에서 작동하는 선택 가능한 마커가 존재할 수 있다. 적합한 벡터는 바이러스 벡터(예, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스 벡터(예, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 골수증식성 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus) 및 유방 종양 바이러스(mammary tumor virus)와 같은 뮤린 루케이마 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로 바이러스 유래 벡터); 등에 기초한 바이러스 벡터)를 포함한다. 형질도입된 세포의 게놈에 효율적으로 통합하는 능력에 기인하는 바람직한 벡터는 레트로바이러스 벡터, 특히 감마-레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터, 즉 레트로바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터이다. 바람직한 레트로바이러스 벡터의 예는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(Milone et al., Mol Ther. 2009;17(8):1453-1464에 제공됨)이다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어, Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX^TM 벡터 시스템 등을 포함한다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터도 이용 가능하며, 당업자에게 알려져 있다. 형질 감염된 세포의 게놈에 효율적으로 통합될 수 있는 다른 유형의 바람직한 벡터는 트랜스포손 벡터, 바람직하게는 PiggyBAC-기반 벡터 및 슬리핑 뷰티-기반 벡터(Sleeping beauty-based vector)이다. 관심 유전자를 세포의 게놈에 통합하기 위한 추가의 중요한 비-바이러스 전략은 부위-특이 뉴클레아제 기술에 기반(예, 징크-핑거 뉴클레아제(Zinc-finger nuclease)(ZFN) 또는 전사 활성인자-성 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN) 기반)하거나 또는 CRISPR/Cas-기술(예를 들어, Gaj et al., Trends Biotechnol. 2013;31(7):397-405; 및 Ren et al., Protein Cell 2017;8(9):634-643에 의해 기술된 바와 같음)에 기반한다. 이러한 기술은 어느 DNA 분자(단일 스트랜드 DNA 또는 이중 스트랜드 DNA, 벡터, PCR 앰플리콘 등의 형태)에서 정의된 뉴클레오티드 서열의 통합을 허용하며, (예를 들어, Eyquem 등, Nature. 2017;543(7643):113-117에 의해 기술된 바와 같이) 관심있는 유전자가 내인성 프로모터의 게놈 하류에 통합될 수 있기 때문에 매력적이다.

본 발명은 또한 적어도 2개의 벡터의 키트를 제공하며, 여기서 각각의 벡터는 본 발명에 따른 CAR 그룹의 1개, 2개, 3개 또는 4개 CAR 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 벡터는 동일하거나 상이한 숙주 시스템(예를 들어, 벡터로 형질전환 또는 증식 후 벡터가 CAR 분자를 발현하는 적합한 세포)에서 발현을 달성하기 위해 동일하거나 상이한 조절 서열과 함께 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터 또는 벡터의 키트에서, CAR 그룹의 CAR 분자를 코딩하는 핵산은 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어, 발현 벡터를 생성할 수 있다. 이러한 전사 조절 요소는 프로모터, 인핸서 등일 수 있으며, 여기서 적합한 프로모터 및 인핸서 요소는 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터는 lacl, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc를 포함한다. 진핵 세포에서의 발현을 위해, 적합한 프로모터는 경쇄 및/또는 중쇄 면역 글로불린 유전자 프로모터 및 인핸서 요소, 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 즉시 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복에 존재하는 프로모터(예, 감마 레트로바이러스의 5'-LTR 또는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV)의 5'-LTR의 하위요소 R 및 U3를 포함하는 프로모터 서열), 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)에 존재하는 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 인트론이 있거나 없는 EF1- 알파, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK)의 프로모터, 및 다양한 당업계에 알려진 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 가역성 유도성 프로모터를 포함하는 적합한 가역성 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 가역성 프로모터는 예를 들어, 진핵 생물 및 원핵 생물과 같은 많은 유기체로부터 분리되고 유래될 수 있다. 제2 유기체에서 사용하기 위한 제1 유기체로부터 유래된 가역성 프로모터의 변형, 예를 들어, 제1 원핵 생물과 제2 진핵 생물, 제1 진핵 생물과 제2 원핵 생물 등은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 가역성 프로모터, 및 이러한 가역성 프로모터를 기반으로 하지만 추가 제어 단백질도 포함하는 시스템은 알코올 조절 프로모터(예, 알코올 디히드로게나아제 I(alcA) 유전자 프로모터, 알코올 트랜스액티베이터 단백질(AlcR) 등에 반응하는 프로모터), 테트라시클린 조절 프로모터(예, TetActivators, TetON, TetOFF 등을 포함한 프로모터 시스템), 스테로이드 조절 프로모터(예, 랫트 글루코코르티코이드 수용체 프로모터 시스템, 인간 에스트로겐 수용체 프로모터 시스템, 레티노이드 프로모터 시스템, 갑상선 프로모터 시스템, 엑 디손 프로모터 시스템, 미페프리스톤 프로모터 시스템 등), 금속 조절 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터 시스템 등), 병인-관련 조절 프로모터(예, 살리실산 조절 프로모터, 에틸렌 조절 프로모터, 벤조티아디아졸 조절 프로모터 등), 온도 조절 프로모터(예, 열 충격 유도성 프로모터(예, HSP-70, HSP-90, 소이빈 열 충격 프로모터 등)), 광 조절 프로모터, 합성 유도성 프로모터 등을 포함한다.

일부 예에서, 적절한 프로모터를 포함하는 유전자좌 또는 구조물 또는 트랜스진은 유도성 시스템의 유도를 통해 비가역적으로 스위칭될 수 있다. 비가역 스위치의 유도에 적합한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 비가역 스위치의 유도는 Cre-lox-매개 재조합을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 리콤비나아제, 엔도뉴클레아제, 리가아제, 재조합 부위 등의 임의의 적합한 조합이 비가역적으로 스위칭 가능한 프로모터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 부위-특이적 재조합을 수행하기 위한 방법, 메커니즘 및 요건은 비가역적으로 스위칭된 프로모터 생성시의 사용을 찾아내며, 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 경우에, 프로모터는 CD8 세포-특이적 프로모터, CD4 세포-특이적 프로모터, 뉴트로필-특이적 프로모터, 또는 NK-특이적 프로모터이다. 예를 들어, CD4 유전자 프로모터를 사용할 수 있다. 또 다른 예로서, CD8 유전자 프로모터가 사용될 수 있다. NK 세포 특이적 발현은 Neri(p46) 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. 일부 구현에서, 예를 들어, 효모 세포에서의 발현을 위해 적합한 프로모터는 ADHl 프로모터, PGK l 프로모터, ENO 프로모터, PYK l 프로모터와 같은 구성적 프로모터; 또는 GALl 프로모터, GALlO 프로모터, ADH2 프로모터, PH05 프로모터, CUPl 프로모터, GAL7 프로모터, MET25 프로모터, MET3 프로모터, CYCl 프로모터, HIS3 프로모터, ADHl 프로모터, PGK 프로모터, GAPDH 프로모터, ADCl 프로모터, TRPl 프로모터, URA3 프로모터, LEU2 프로모터, ENO 프로모터, TPl 프로모터, 및 AOX l (즉, 피치아(Pichia)에 사용하기 위한)와 같은 조절 가능한 프로모터이다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 통상의 기술자의 수준 내에 있다. 원핵 숙주 세포에 사용하기 적합한 프로모터는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터; trp 프로모터; lac 오페론 프로모터와 같은 프로모터를 포함하고; 하이브리드 프로모터, 예를 들어 lac/tac 하이브리드 프로모터, tac/trc 하이브리드 프로모터, trp/lac 프로모터, T7/lac 프로모터; trc 프로모터; tac 프로모터, 등; araBAD 프로모터; 생체 내 조절 프로모터s, 예를 들어 ssaG 프로모터 또는 연관된 프로모터, pagC 프로모터, nirB 프로모터, 등; sigma70 프로모터, 예를 들어 컨센선스(consensus) sigma70 프로모터 (예를 들어, GenBank Accession Nos. AX798980, AX798961, 및 AX798183); 정지 상 프로모터, 예를 들어 dps 프로모터, spv 프로모터, 등; 병원성 섬 SPI-2로부터 유래된 프로모터; actA 프로모터; rpsM 프로모터; tet 프로모터; SP6 프로모터; 등을 포함한다. 대장균과 같은 원핵 생물에 사용하기 적합한 강력한 프로모터는 Trc, Tac, T5, T7, 및 PLambda를 포함한다. 박테리아 숙주 세포에서 사용하기 위한 오퍼레이터의 예로는 락토오스 프로모터 오퍼레이터(락토오스와 접촉한 경우 Laci 억제 단백질이 형태를 변형하여, 이로 인해 Laci 억제 단백질이 오퍼레이터에 결합하는 것을 방지함), 트립토판 프로모터 오퍼레이터(트립토판과 복합체를 형성할 때, TrpR 억제 단백질은 오퍼레이터에 결합하는 구조를 가짐; 트립토판 부재 시, TrpR 억제 단백질은 오퍼레이터에 결합하지 않는 구조를 가짐), 및 tac 프로모터 오퍼레이터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 벡터 또는 적어도 2개의 벡터 키트는 T 림프구-특이적 프로모터 또는 NK 세포-특이적 프로모터 또는 EF1-알파 프로모터를 포함하여 CAR 그룹의 CAR 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.

추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 CAR 그룹의 모든 CAR 분자를 생산하도록 변형된 유전적으로 변형된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 플라스미드 상청액으로서)를 생산하는데 사용될 수 있으며, 여기서 그것들은 추가로 정제되고 증폭 및 정제된 형태로 이들 벡터를 제공할 수 있다.

바람직한 구현에 따르면, 세포는 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자를 생산하도록 유전적으로 변형된 포유 동물 세포이다. 바람직한 포유 동물 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 또는 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 유래된 세포, 바람직하게는 림프구이다. 본 발명에 따라 유전적으로 변형되는 추가적으로 바람직한 세포는 1차 세포 및 불멸화 된 세포주이다. 제약 용도의 경우, 인간 세포, 특히 림프구가 특히 바람직하다. 그러나, 또한 비-인간 1차 세포 및 세포주는 특히 본 발명에 따른 시스템으로 과학적 질문을 해결하기 위해 적합한 세포 유형, 예를 들어, 비-인간 영장류 세포주, 설치류(예를 들어, 마우스, 렛트) 세포주 등일 수 있다.

본 발명에 따른 추가적으로 바람직한 세포는 HeLa 세포 (예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO 세포 (예를 들어, ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포 (예를 들어, ATCC No. CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예를 들어, ATCC No. CCLlO), PC12 세포 (ATCC No. CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC No. CRL1651), RATl 세포, 마우스 L 세포 (ATCC No. CCLl.3), 인간 배아 신장(HEK) 세포 (ATCC No. CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, Jurkat, HL-60, NK 세포주 (예를 들어, NKL, NK92, 및 YTS), 등일 수 있다. 일부 바람직한 예에서, 본 발명에 따른 세포는 불멸화 된 세포주가 아니라 대신 개체로부터 얻은 세포 (예를 들어, 1차 세포)이다. 예를 들어, 어떤 경우에는, 세포는 개체로부터 얻은 면역 세포이다. 예를 들어, 세포는 개체로부터 얻은 T림프구이다. 또 다른 예로서, 세포는 개체로부터 얻은 세포 독성 세포이다. 또 다른 예로서, 세포는 개체로부터 얻은 줄기 세포 또는 전구 세포이다.

특히 바람직한 구현에 따르면, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 암호화하는 벡터 또는 적어도 2 개의 벡터의 키트로 형질 전환된 본 발명에 따른 포유 동물 세포는, T 세포 또는 NK 세포이다.

추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 핵산 키트, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 본 발명에 따른 세포 또는 세포 키트를 포함하는 약학적 제제에 관한 것이다.

본 개시는 조합(combinatorial) 항원 인식이 가능한 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 벡터, 또는 벡터 키트, 또는 본 개시 내용의 CAR 그룹의 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA (예를 들어, 시험관 내 전사된 RNA)로 포유 동물 세포를 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다. 유전자 변형(genetic modification)은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 수행될 수 있다. 세포는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포), 줄기 세포, 전구 세포 등일 수 있다.

유전자 변형은 바람직하게는 생체 외에서 수행된다. 예를 들어, T 림프구 (즉, T 세포), 줄기 세포, 또는 NK 세포는 개체로부터 얻을 수 있고 개체로부터 얻은 세포는 본 개시 내용에 따라 CAR 그룹을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 어떤 경우에는, 유전적으로 변형된 세포가 생체 외에서 활성화된다. 유전적으로 변형된 세포가 개체 (예를 들어, 세포를 얻은 개체)에게 도입되는 경우, 유전적으로 변형된 세포는 개체의 세포 표면에서 생리학적 발현 수준에서 존재하는 표적 항원의 선택된 조합과 접촉할 때 생체 내에서 활성화된다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포가 T 림프구 또는 NK 세포인 경우, 유전적으로 변형된 세포는 CAR 그룹 (및/또는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티)이 결합한 표면에서 생리학적 발현 수준에서 표적 항원의 선택된 조합을 제시하는 세포에 대해 세포 독성을 나타낼 수 있다. 조건부 활성 CAR 그룹의 경우, 유전적으로 변형된 세포는 개체의 생리적 발현 수준에서 세포 표면에 존재하는 표적 항원의 선택된 조합과 접촉하고, 하나 이상의 조절 분자 및/또는 각각 CAR 그룹의 분자의 결합 부위에 결합할 수 있고 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 개체에게 투여할 때만 효율적으로 활성화된다. 일부 다른 경우에, 개체의 생리적 발현 수준에서 세포 표면에 존재하는 표적 항원과 접촉할 때 유전적으로 변형된 세포의 활성화는 조절 분자를 개체에게 투여할 때 감소된다.

본 개시 내용은 CAR의 대상 그룹을 사용하는 다양한 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 CAR 그룹은, T 림프구 또는 NK 세포에 존재할 때, 표적 세포에 대한 세포 독성을 매개할 수 있다. 본 발명에 따른 비공유적으로 복합체화된 CAR 그룹은, 일부 경우에 표적 항원(들)에 결합하는 (또)다른 폴리펩티드(들)의 존재에 의존하고, 표적 세포에 존재하는 표적 항원의 선택된 조합에 결합할 수 있고, 이에 의해 CAR 그룹을 생성하도록 유전적으로 변형된 T 림프구 또는 NK 세포에 의한 표적 세포의 사멸을 매개한다.

표적 세포는 암세포를 포함한다. 따라서, 본 개시 내용은 표적 암 세포를 사멸시키거나 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 표적 암 세포를 CAR의 대상자 그룹을 생성하도록 유전적으로 변형된 세포 독성 면역 이펙터(effector) 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포, 또는 NK 세포)와 접촉시켜, T 림프구 또는 NK 세포가 표적 암세포의 표면상에 존재하는 표적 항원의 선택된 조합을 인식하고, 표적 세포의 사멸을 매개하도록 하는 것을 포함한다.

본 개시 내용은 암에 걸린 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현에서, 상기 방법은 i) 개체로부터 수득된 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 본 발명에 따른 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터로 유전자(genetically) 변형시키는 단계로서, 상기 CAR 그룹의 항원 결합 모이어티는 개체의 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 그리고 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 단계; ii) 유전자 변형 세포를 개체에 도입하는 단계; 및 iii) 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하거나 감소시키고, 바람직하게는 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하기 위해 유효량의 적어도 하나의 조절 분자를 개체에게 투여하여, CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도하거나 감소시키고, 바람직하게는 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도하고, 상기 비공유적으로 복합체화 된 CAR 그룹은, 생리적 발현 수준에서 각각의 표적 항원 조합을 발현하는 암 세포와 접촉시 유전적으로 변형된 세포의 활성화를 매개하여, 암세포를 사멸시켜 암 치료를 가능하게 하는, 단계를 포함한다. 다른 바람직한 구현에서 방법은 i) 개체로부터 수득된 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 본 발명에 따른 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터로 유전적으로 변형시키는 단계로서, 상기 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티, 및/또는 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티는, 개체의 암세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않으며, 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는, 단계; ii) 유전자 변형 세포를 개체에 도입하는 단계; 및 iii) 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합 할 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하는 단계로, 이는, 각각의 표적 항원 조합을 생리적 발현 수준으로 발현하는 암 세포와 접촉시 유전적으로 변형된 세포의 활성화를 매개하여, 암세포를 사멸시켜 암 치료를 가능하게 하는, 단계를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현에서 방법은 i) 개체로부터 수득된 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 본 발명에 따른 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터로 유전적으로 변형시키는 단계로서, 상기 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티는 개체의 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않으며, 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는, 단계; ii) 유전적으로 변형된 세포를 개체에 도입하는 단계로, 암세포를 사멸시켜 암을 치료한다.

본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 암종은 식도 암종(esophageal carcinoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma (피부암의 한 형태)), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma (다양한 조직)), 전이 세포 암종(transitional cell carcinoma)을 포함하는 방광 암종(bladder carcinoma), (방광의 악성 신생물(neoplasm)), 기관지 암종(bronchogenic carcinoma), 결장암종(colon carcinoma), 결장 직장암종(colorectal carcinoma), 위암종(gastric carcinoma), 폐의 소세포암(small cell carcinoma) 및 비-소세포암(non-small cell carcinoma)을 포함하는 폐암종(lung carcinoma), 부신피질 암종(adrenocortical carcinoma), 갑상선암종(thyroid carcinoma), 췌장암종(pancreatic carcinoma), 유방암종(breast carcinoma), 난소암종(ovarian carcinoma), 전립선암종(prostate carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 땀샘암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma), 유두암종(papillary carcinoma), 유두선암종(papillary adenocarcinoma), 낭포암종(cystadenocarcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 관내상피암(ductal carcinoma in situ) 또는 담관암종(bile duct carcinoma), 융모암종(choriocarcinoma), 정상피종seminoma), 배아암종(embryonal carcinoma), 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암종(cervical carcinoma), 자궁암종(uterine carcinoma), 고환암종(testicular carcinoma), 골형성암종(osteogenic carcinoma), 상피암종(epithelial carcinoma), 및 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma)을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 육종은 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 척색종(chordoma), 골원성육종(osteogenic sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 혈관육종(angiosarcoma0, 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendothelio-sarcoma), 윤활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 및 기타 연조직 육종을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 고형 종양은 신경아교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상피종(ependymoma), 송과선종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 음향신경종(acoustic neuroma), 희소돌기교종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 흑색종(melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 및 망막모세포종(retinoblastoma)을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 백혈병은 a) 만성 골수증식 증후군(다능성 조혈 줄기 세포의 신생물성(neoplastic) 장애); b) 급성 골수성 백혈병 (다능성 조혈 줄기 세포 또는 제한된 계통 잠재력의 조혈 세포의 종양성 형질 전환; c) 만성 림프구성 백혈병(CLL; 면역학적 미성숙 및 기능적으로 무능한 작은 림프구의 클론 증식)으로, B-세포 CLL, T-세포 CLL 전림프구성 백혈병 및 털 세포 백혈병을 포함하고; 및 d) 급성 림프모세포성 백혈병 (림프 모세포의 축적을 특징으로 함)을 포함한다. 대상 방법을 사용하여 치료할 수 있는 림프종은 B-세포 림프종(예를 들어, 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)); 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma); 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 등을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 암은 비정형 수막종(atypical meningioma)(뇌), 섬 세포 암종(islet cell carcinoma)(췌장), 수질 암종(medullary carcinoma)(갑상선), 간엽종(mesenchymoma)(장), 간세포암종(hepatocellular carcinoma)(간), 간모세포종(hepatoblastoma)(간), 투명 세포 암종(clear cell carcinoma)(신장), 및 신경섬유종 종격동(neurofibroma mediastinum)을 포함한다.

본 방법은 또한 염증 상태 및 자가 면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. CAR의 대상 그룹은 면역 조절 방법에 사용하기 위해 T-헬퍼 세포 또는 조절 T (Treg) 세포에서 발현될 수 있다. 면역 조절 방법은 예를 들어, 포유류 대상체에서 병원체에 대한 면역 반응을 향상시키는 것; 면역이 약화된 피험자의 면역 반응을 강화시키는 것; 염증 반응 감소; 예를 들어, 자가 면역 질환을 치료하기 위해 자가 항원에 걸린 포유 동물 개체에서 면역 반응을 감소시키는 것; 및 장기 또는 조직 거부 반응을 감소시키기 위해, 이식된 장기 또는 조직에 대한 포유 동물의 면역 반응을 감소시키는 단계를 포함한다. 상기 방법이 자가 항원에 대한 면역 반응을 감소시키는 것을 포함하는 경우, CAR 그룹을 활성화하는 데 사용되는 표적 항원 중 적어도 하나는 바람직하게는 자가 항원이다. 상기 방법이 이식된 장기 또는 조직에 대한 면역 반응을 감소시키는 것을 포함하는 경우, CAR 그룹을 활성화하는 데 사용되는 항원 중 적어도 하나는 바람직하게는 이식된 장기에 특이적인 항원이다.

위에서 논의된 바와 같이, 바람직한 경우의 본 개시 내용의 치료 방법은 유효량의 하나 이상의 상이한 조절 분자 및/또는 하나 이상의 상이한 다른 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 각각의 다른 폴리펩티드는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹의 CAR 분자의 세포 외 결합 부위에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 CAR 그룹을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포("이펙터 세포")를 받은 이를 필요로 하는 개체에게 투여되는 각 조절 분자의 필수 유효량은, 각각의 필수 조절 분자의 존재 대 부재 하에 각각의 항원 조합을 발현하는 표적 세포와의 접촉 시 이러한 효과기 세포의 상이한 반응에 의해 정의된다. 이러한 효과기 세포의 반응은 이에 의해 인터페론-감마(interferon-gamma), 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1)(MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B(granzyme B), 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4, 및/또는 이펙터 세포 탈과립에 의한 분비에 의해 정의되고, 상기 세포 탈과립은 CD107a를 표면 상으로 전위시키는 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되며, 즉, CD107a-양성 이펙터 세포의 백분율은 세포 당 각 표적 항원의 100,000개 이상의 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후, 선택적으로 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 각각의 필요한 다른 폴리펩티드의 유효 농도의 존재 하에 탈과립 분석을 사용한 유세포 분석에 의해 검출된다(예를 들어, Proff et al., Front Micro-biol. 2016;7:844에 설명됨). 바람직한 구현에서, 각각의 필수 조절 분자의 유효 농도의 존재 대 부재에 대한 이펙터 세포의 반응은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 100% 차이가 나고, 상기 각각의 필수 조절 분자의 유효 농도는 이를 필요로 하는 개체에게 1회 이상의 용량으로 각각의 필수 조절 분자의 유효량을 투여함으로써 달성되는 농도이다. 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹에 결합할 수 있는 각각의 필요한 다른 폴리펩티드의 유효 농도는, 세포 당 각 표적 항원의 100,000개 이상의 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후, 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹에 결합할 수 있는 필요한 다른 폴리펩티드의 존재 대 부재 하에, 완전히 복잡한 대상 CAR 그룹의 반응에 의해 정의되고(즉, CAR 그룹에 포함된 모든 이량체화 도메인이 이량체화 됨), 상기 반응은 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 100% 차이가 있고, 상기 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드를 필요로 하는 각각의 유효 농도는 대상 CAR 그룹을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포를 받은 이를 필요로 하는 개체에게 1회 이상의 용량으로 각각의 다른 폴리펩티드 각각의 유효량을 투여하여 달성된 농도이다.

본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 조절 분자 및 항원-특이적인 다른 폴리펩티드 둘 다는 이후 함께 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"로 지칭된다.

본 방법에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(agent specifically binding to the group of CARs)"는 원하는 치료 효과 또는 진단 효과를 초래할 수 있는 임의의 편리한 수단을 사용하여 숙주에 투여될 수 있다. 따라서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)"는 치료적 투여를 위한 다양한 제형에 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 적절한 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 제약 조성물로 제제화 될 수 있고, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제 및 에어로졸의 제제로 제제화 될 수 있다. 약학적 투여형에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있거나, 또한 단독으로 또는 적절한 조합으로 사용될 수 있으며, 다른 약제학적 활성 화합물과 조합하여 사용될 수도 있다. 다음 방법 및 부형제는 단지 예시일 뿐이다:

적합한 부형제 비이클은 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합일 수 있다. 또한, 원하는 경우, 비이클은 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있거나 명백할 것이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985 참조. 투여될 조성물 또는 제형은, 어떠한 경우에도, 치료되는 대상체에서 원하는 상태를 달성하기에 적절한 양의 필요한 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)"를 함유할 것이다. 비이클, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 제약상 허용되는 부형제는 공중이 쉽게 이용 가능하다. 더욱이, pH 조절 및 완충제, 긴장성 조절제, 안정제, 습윤제 등과 같은 약학적으로 허용되는 보조 물질은 공중이 쉽게 이용 가능하다. 경구 제제의 경우, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 제조하기 위해 단독으로 또는 적절한 첨가제와 함께 사용될 수 있고, 예를 들어, 락토스, 만니톨, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 기존 첨가제; 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 옥수수 전분, 감자 전분 또는 소듐 카복시메틸 셀룰로오스와 같은 붕해제; 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제와 함께; 및 원하는 경우 희석제, 완충제, 보습제, 보존제 및 향미제와 함께 사용할 수 있다.

"CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 식물성 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방족 산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜와 같은 수성 또는 비수성 용매에 이들을 용해, 현탁 또는 유화시키고; 및 원한다면, 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정제 및 보존제와 같은 전통적인 첨가제와 함께 주사용 제제로 제형화 할 수 있다.

"CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"를 포함하는 제약 조성물은 원하는 순도를 갖는 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)"를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 안정화제, 계면활성제, 완충제 및/또는 긴장성 제제와 혼합하여 제조할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제는 바람직하게는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 포스페이트(phosphate), 시트레이트(citrate) 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브 산, 글루타티온, 시스테인, 메티오닌 및 구연산을 포함한 항산화제; 보존제 (예를 들어 에탄올, 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, p-클로르-m-크레졸, 메틸 또는 프로필 파라벤, 벤잘코늄 클로라이드 또는 이들의 조합); 아르기닌, 글리신, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트 산, 이소류신, 류신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린 및 이들의 조합과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 젤라틴 또는 혈청 알부민과 같은 단백질; EDTA와 같은 킬레이트제; 트레할로스(trehalose), 수크로스, 락토오스, 글루코스, 만노스, 말토오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 소르보스, 라피노스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민 및 뉴라민 산과 같은 당; 및/또는 Tween, Brij Pluronics, Triton-X 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면 활성제를 포함한다.

약학 조성물은 액체 형태, 동결 건조 형태 또는 동결 건조 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있으며, 상기 동결 건조 제제는 투여 전에 멸균 용액으로 재구성되어야 한다. 약학 조성물은 액체 형태, 동결 건조 형태 또는 동결 건조 형태로부터 재구성된 액체 형태일 수 있으며, 상기 동결 건조 제제는 투여 전에 멸균 용액으로 재구성되어야 한다. 동결 건조된 조성물을 재구성하는 표준 절차는 일반적으로 순수한 물을 다시 추가하는 것이고(일반적으로 동결 건조 중에 제거된 부피와 동등); 그러나 항균제를 포함하는 용액이 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물의 생산에 사용될 수 있다; Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54 참조.

"CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 또한 제어 방출 제제로 선택적으로 제제화 될 수 있다. 서방형 제제는 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 매트릭스가 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태인 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)"를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리 에스테르, L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드로 겔, 폴리락타이드, 분해성 젖산-글리콜산 코폴리머 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르 산을 포함한다. 적절한 첨가제를 사용하고 수분 함량을 조절하고 특정 고분자 매트릭스 조성물을 개발함으로써, 생물학적 활성의 손실 가능성을 방지할 수 있다.

적절한 투여량은 다양한 임상 요인에 따라, 주치의 또는 기타 자격을 갖춘 의료진이 결정할 수 있다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 사이즈, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)", 환자의 성별, 시간, 및 투여 경로, 일반 건강, 및 기타 동시에 투여되는 약물을 포함한 많은 요인에 달려있다. "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 용량 당 1 ng/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 예를 들어, 0.1 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중, 예를 들어, 0.5 mg/kg 체중 내지 5 mg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있고; 그러나, 특히 전술한 요인을 고려하여 이 예시적 범위 이하 또는 이상의 용량이 계획된다. 방식이 연속 주입인 경우 분당 체중 1kg 당 1μg 내지 10mg 범위일 수도 있다.

당업자는 용량 수준이 특정 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"의 기능, 증상의 중증도 및 부작용에 대한 대상체의 감수성에 따라 달라질 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 주어진 화합물에 대한 바람직한 투여량은 다양한 수단에 의해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

하나 이상의 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 생체 내 및 생체 외 방법뿐만 아니라 전신 및 국소 투여 경로를 포함하여 약물 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 방법 및 경로를 사용하여 개체에게 투여될 수 있다. 통상적이고 약학적으로 허용되는 투여 경로는 종양 내, 종양 주위, 근육 내, 기관 내, 두개 내, 피하, 피내, 국소 적용, 정맥 내, 동맥 내, 직장, 비강, 경구 및 기타 장 및 비경구 투여 경로를 포함한다. 투여 경로는 원한다면 조합되거나, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)" 및/또는 원하는 효과에 따라 조정될 수 있다. "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 조건부 활성 CAR 그룹을 갖는 바람직한 구현에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 경구로 또는 대안적으로 정맥 내로 투여될 수 있다. 다른 구현에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 흡입 경로를 통해 투여될 수 있다. 또 다른 구현에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 비강 내로, 국소적으로, 또는 또한 종양 내로 투여될 수 있다. 또 다른 구현에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 종양 주위로 투여될 수 있다. 뇌종양의 치료를 위한 조건부 활성 CAR 그룹을 갖는 바람직한 구현에서, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 두개 내 투여될 수 있다.

"CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제(들)"는 전신 또는 국소 경로를 포함하여 통상적인 약물의 전달에 적합한 임의의 이용 가능한 통상적인 방법 및 경로를 사용하여 숙주에 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의해 고려되는 투여 경로는 장내, 비경구 또는 흡입 경로를 포함한다. 흡입 투여 이외의 비경구 투여 경로는 국소, 경피, 피하, 근육 내, 안와 내, 피막 내, 척추 내, 흉골 내, 종양 내, 종양 주위 및 정맥 내 경로를 포함한다. 비경구 투여를 수행하여 "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"의 전신 또는 국소 전달을 수행할 수 있다. 전신 전달이 필요한 경우, 투여는 일반적으로 약학적 제제의 침습적 또는 전신 흡수된 국소 또는 점막 투여를 포함한다. "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 또한 장내 투여에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 장내 투여 경로에는 경구 및 직장 (예를 들어, 좌약 사용) 전달이 포함된다.

치료는 적어도 숙주를 괴롭히는 병리학적 상태와 관련된 증상의 개선을 의미하며, 개선은 적어도 파라미터, 예를 들어 암과 같은, 치료중인 병리학적 상태와 관련된 증상의 크기의 감소를 지칭하기 위해 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병리학적 상태, 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제되는, 예를 들어 발생하지 못하거나, 중지되거나, 예를 들어 종결됨으로써 숙주가 더이상 병리학적 상태 또는 적어도 병리학적 상태를 특징짓는 증상을 겪지 않도록 하는 상황을 포함한다.

"CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 주사 및/또는 전달에 의해, 예를 들어 뇌 동맥의 부위에 또는 뇌 조직으로 직접 투여될 수 있다. "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 또한 표적 부위에 직접, 예를 들어, 직접 주사에 의해, 삼투 펌프 또는 서방성 입자와 같은 약물 전달 장치의 이식, 표적 부위로의 생물학적 전달 등에 의해, 투여될 수 있다. 더욱이, "CAR 그룹에 특이적으로 결합하는 제제"는 표준 암 요법에 대한 보조 요법으로서 투여될 수 있다. 표준 암 치료법에는 수술 (예를 들어, 암 조직의 외과적 제거), 방사선 치료, 골수 이식, 화학 요법 치료, 항체 치료, 생물학적 반응 조절제 치료 및 이들의 특정 조합이 포함된다.

다양한 대상체가 암을 치료하는 대상 방법으로 치료하기에 적합하다. 적합한 대상체는 임의의 개체, 예를 들어, 암에 걸리거나, 암 진단을 받거나, 암 발병 위험이 있거나, 암에 걸렸고 암 재발 위험이 있거나, 다른 치료제로 치료를 받았지만 그러한 치료에 반응하지 않았거나 그러한 치료에 대한 초기 반응 후에 재발한 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.

본 면역 조절 방법으로 치료하기에 적합한 대상체는 자가 면역 장애가 있는 개체; 장기 또는 조직 이식 수혜자인 개체; 등; 면역이 약화된 개체; 및 병원체에 감염된 개체를 포함한다.

실시예:

도 1: CAR 그룹의 예시적인 아키텍처의 개략도. 도 1a는 항원 결합 모이어티가 CAR 분자에 통합된 버전(좌측) 및 CAR 분자가 예를 들어, 하나의 항원 결합 모이어티 또는 2개의 항원 결합 모이어티 (다른 표적 항원에 대해 지시됨)을 포함하는 다른 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하는 결합 부위를 포함하는 버전에서 CAR 그룹의 CAR 분자의 기본 아키텍처를 개략적으로 보여준다. 저친화성 상호작용은 항원 결합 모이어티와 표적 항원 사이에 또는 CAR 분자의 결합 부위와 상기 CAR 분자의 결합 부위에 결합하는 다른 폴리펩티드의 결합 부위 사이에서 발생한다. CAR 그룹의 CAR 분자 중 적어도 하나는 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함해야 한다. CAR 분자의 제시된 예에서, 엔도도메인은 예시적으로 단일 신호전달 영역을 포함한다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다. 이종이량체화 도메인 (이중 적어도 하나는 상기 그룹의 각 CAR 분자에 필수임) 및 선택적 추가 도메인 또는 구성 요소는 표시되지 않는다.

도 1b는 2개의 항원 결합 모이어티, 또는 적어도 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 2개의 결합 부위, 또는 항원 결합 모이어티와 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위의 조합을 포함하는 CAR 분자의 버전을 개략적으로 예시한다. CAR 분자의 제시된 예에서, 엔도도메인은 예시적으로 단일 신호전달 영역을 포함한다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다. 이종이량체화 도메인 및 선택적 추가 도메인 또는 구성 요소는 표시되지 않는다.

도 1c는 2개, 3개, 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹에서 얼마나 많은 CAR 분자가 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함할 수 있는지를 개략적으로 예시한다(주어진 CAR 분자의 신호전달 영역의 총합은 흰 박스로 표시됨). 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함하는 CAR 분자의전부 또는 일부이지만, 적어도 하나의 CAR 분자는 적어도 하나의 ITAM을 포함한다. 단순화를 위해, 엑토도메인, 이종이량체화 도메인 및 선택적 추가 도메인 또는 구성 요소는 표시되지 않는다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다.

도 1d는 2개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 예를 사용하여 신호전달 영역의 배열을 개략적으로 예시한다. 도시된 예는 상이한 배열들의 가능한 조합 중 일부만 보여준다. 예를 들어, CAR 분자는 둘 이상의 ITAM-함유 신호전달 영역 또는 둘 이상의 공동-자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 단순화를 위해 엑토도메인, 이종이량체화 도메인 및 선택적 추가 도메인 또는 구성 요소는 표시되지 않는다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다.

도 1e-1k는 이종이량체화 도메인이 CAR 그룹의 비공유 복합체화에 어떻게 사용될 수 있는지를 개략적으로 예시한다. 도시된 예는 가능한 배열들 중 일부만 보여준다. 도시된 예에서, 이종이량체화 도메인의 상이한 쌍은 각각 예시적으로 1 또는 2개의 신호전달 영역을 포함하는 CAR 분자의 상이한 위치에 표시된다. 단순화를 위해, 예시는 신호전달 영역, 막횡단 도메인 및 이종이량체화 도메인만 보여준다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다. 이종이량체화 도메인의 유사한 배열이 또한 세포 외로 통합될 수 있다.

도 1l은 조절 분자로서 작용하는 세포 외 가용성 인자에 의한 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 예시한다. 조절 분자는 본래 이종이량체화 단백질과 함께 개략적으로 예시된다. 표시된 CAR 분자는 예시적으로 단 하나의 신호전달 영역 및 단 하나의 항원 결합 모이어티 또는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 하나의 결합 부위를 포함한다. 선택적 추가 이종이량체화 도메인 및 선택적 추가 도메인 또는 구성 요소는 표시되지 않는다. 항원 결합 도메인(또는 결합 부위) 및 이량체화 도메인의 순서는 또한 반전될 수 있다. 즉, 항원 결합 도메인(또는 결합 부위)은 또한 이종이량체화 도메인보다 플라즈마막에 더 근접할 수 있다. 표시된 CAR 분자의 각 구성 요소 사이의 선은 선택적 링커를 나타낸다.

도 2는 3가지 상보적인 방법에 의해 측정된 인간 EGFR에 대한 상이한 rcSso7d-기반 항원 결합 모이어티(슈퍼폴더 GFP(sfGFP)에 융합됨)의 K_d 값을 나타낸다: (a) 높은 수준의 절단된 EGFR(tEGFR)을 발현하는 Jurkat T 세포에 결합된 상이한 sfGFP-융합 단백질의 양에 대한 유세포 분석 정량화, (b) 및 (c) IgG1의 Fc 도메인에 융합된 EGFR의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 EGFR 단백질로 코팅된 매트릭스를 사용한 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석. 친화성은 동역학 (b) 또는 정상-상태 분석 모드 (c)에서 측정되었다.

도 3: 시스테인을 형성하는 세포 외 이황화 결합은 AND 게이트 기능에 대한 결합 효과의 이용(exploitation)을 방지한다. (A) 각각 이황화 결합 형성이 가능하거나 하지 않은, S-8ser-BB-3z("Cys")에 대한 "Cys" 및 S-8ser-BB-3z ("Ser")에 대한 "Ser" CAR 신호전달 백본의 아키텍처에 대한 개략도. 이러한 신호전달 백본은 다른 rcSso7d-기반 항원 결합 모이어티에 융합되고 1차 인간 T 세포에서 기능 테스트를 위해 발현된다. (b) 1차 인간 T 세포에서 5μg의 mRNA의 전기천공 20시간 후에 전형적인 CAR 발현("Cys"또는 "Ser" CAR 백본에 융합된 rcSso7d 변형 "E11.4.1-WT"로 표시됨). 트랜스진을 발현하지 않는 ("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. (c) 3 μg tEGFR-인코딩 mRNA의 전기천공 20시간 후, 표적 세포로 사용된 Jurkat 세포에서 tEGFR의 발현. 구조물이 없는 Jurkat T 세포 ("구조물 없음") 및 각각의 iso형 대조군 ("iso형 대조군")이 음성 대조군으로 사용되었다. CAR의 기능은 표적 세포 사멸 (d) 및 IFN-γ 생산 (e)을 위해 상이한 CAR로 변형된 1차 인간 T 세포의 능력을 측정함으로써 테스트되었다. 4개의 서로 다른 공여자(상이한 기호로 표시됨)의 T 세포를 표시된 CAR 구조물의 5μg mRNA로 전기천공하고 다음날 Jurkat T 세포(tEGFR-mRNA 3 μg로 전기천공됨)와 함께 37℃에서 4시간 동안 이펙터:표적 (E:T) 비율 2:1로 공동-배양했다. CAR이 없는 T 세포 ("CAR 없음")는 음성 대조군으로 사용되었다.

도 4: scFv-포함 CAR 분자의 이량체화/다량체화는 AND 게이트 기능에 대한 항원항체결합력 효과의 이용을 방지한다. (a) 실험에 사용된 CAR의 도식적 표현. (b, c 및 d) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 인간 1차 T 세포에서 CAR 구성조의 발현. CAR이 없는("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. (e) 5μg tEGFR-코딩 mRNA의 전기천공 20시간 후, 표적 세포로 사용된 Jurkat 세포에서 tHER2의 발현. 구조물이 없는 Jurkat T 세포("구조물 없음")는 음성 대조군으로 사용되었다. CAR T 세포는 2:1의 E:T 비율로 37℃에서 4시간 동안 Jurkat-tHER2 세포와 공동-배양되었다. 도 4f 및 4g는 scFv 4D5-5가 2개의 상이한 CAR 신호 전달 백본(이황화 결합 형성이 가능하거나 하지 않음, 즉, 4D5-5-8cys-BB-3z에 대한 "Cys"(SEQ ID NO: 61) 및 4D5-5-8ser-BB-3z에 대한 "Ser"(SEQ ID NO: 62))에 융합되어 세포 독성 (g) 및 IFN-γ 생산 (f)을 촉발하는 CAR의 능력을 나타낸다. V_H 및 V_L이 2개의 개별 폴리펩티드("V_H 및 V_L"; 4D5-5(스플릿)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z (SEQ ID NO: 58 및 SEQ ID NO: 59))에 융합된 CAR의 기능은 (h)에 표시된다. 단량체 신호전달 백본이 4D5-5-scFv에 융합된 CAR 4D5-5-8ser-BB-3z (SEQ ID NO: 62)를 발현하는 1차 T 세포는 양성 대조군으로 사용되었다. 3개의 서로 다른 공여자(상이한 기호로 표시됨)의 CAR T 세포를 4:1:1의 E:T 비율(T 세포: tHER2^pos Jurkat 세포: tHER2^neg Jurkat 세포)로 37℃에서 4시간 동안 tHER2-형질 감염 및 비-형질 감염 Jurkat T 세포의 혼합물과 함께 공동-배양하고, 생존 가능한 tHER2^pos 및 tHER2^neg 표적 세포의 비율을 유세포 분석에 의해 측정했다. 이량체화를 유도하기 위해 T 세포를 이량체화제 AP20187 (10 nM, 30 분, 37℃)로 전처리했다. 동일한 농도의 DMSO를 사용한 처리가 대조군 조건으로 사용되었다. CAR이 없는 T 세포 ("CAR 없음") 및 V_H 사슬만을 발현하는 T 세포("4D5-5(VH)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z" (SEQ ID NO: 59))는 음성 대조군으로 사용되었다.

도 5: 본 발명에 따른 CAR 그룹에서 사용하기에 적합한 아피바디-기반 결합 모이어티의 스크리닝. 아피바디 zHER2-WT의 친화성은 에피토프 결합에 잠재적으로 관여하는 모든 아미노산을 알라닌으로 대체함으로써 감소되었다. zHER2-WT의 상이한 변이체는 조건부 이량체화를 위해 세포 내 동종이량체화 도메인 FKBP(F36V)를 함유하는 CAR 신호전달 백본 8ser-BB-FKBP(36V)-3z에 융합되었다. 이러한 CAR의 아키텍처는 (a)에 표시된다. (b 및 c) 각각, Jurkat T 세포에서 표적 항원 tHER2의 발현 및 1차 T 세포에서 아피바디-기반 CAR의 발현. 1차 T 세포와 Jurkat T 세포는 각각의 구성물을 코딩하는 5μg mRNA로 전기천공되었고, 전기천공 20시간 후 발현이 측정되었다. 구조물을 발현하지 않는 1차 T 세포 및 Jurkat T 세포 (각각 "CAR 없음" 및 "구조물 없음")를 음성 대조군으로 사용했다. (d) 1차 T 세포에서 13개의 상이한 아피바디-기반 CAR(각각, “L9A”, “R10A”, “Q11A”, “Y13A”, “W14A”, “Q17A”, “W24A”, “T25A”, “S27A”, “R28A”, “R32A”, “Y35A” 및 “zHER2-WT”)의 발현 (CAR 신호전달 백본에 융합된 아피바디 기반 항원 결합 모이어티의 서열은 SEQ ID NO:26 내지 SEQ ID NO:38에 기술된다). 1차 T 세포는 각각의 구성물을 코딩하는 5μg mRNA로 전기천공되었고, 발현은 전기천공 후 20시간에 결정되었다. 구조물을 발현하지 않는 T 세포 ("CAR 없음")를 음성 대조군으로 사용했다. (e) 아피바디-기반 CAR의 이량체화-유도 활성화. 두 공여자 (상이한 기호로 표시됨)의 1차 T 세포를 각 구조물에 대해 5μg으로 전기천공했다. 표적 세포의 특이적 용해는 tHER2-형질감염된 상이한 CAR T 세포를 공동-인큐베이션(2:1의 E:T 비율에서 37℃에서 4시간)한 후 루시퍼라아제-기반 세포 독성 분석에서 검출되었다). CAR의 이량체화는 T 세포를 AP20187 (10 nM, 30 분, 37℃)로 전처리하여 유도되었다. 동일한 농도의 DMSO를 사용한 처리가 대조군 조건으로 제공되었다. CAR가 없는 T 세포("CAR 없음")는 음성 대조군으로 제공되었다. 도 5f는 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 HER2의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 HER2 단백질로 코팅 된 매트릭스를 사용하여 SPR 분석에 의해 측정된 인간 HER2에 대한 각각의 아피바디-기반 결합 모이어티(슈퍼폴더 GFP(sfGFP)에 융합됨)의 K_d 값을 보여준다. 친화성은 동적 측량(kinetic mode)에서 측정되었다.

도 6: NSG 마우스 모델에서 생체 내에서 안정적으로 형질도입된 CAR T 세포의 기능 조절. (a) 생체 내 NSG 마우스 모델에서 이량체화 유도된 CAR의 활성. 9-16 주령 NSG 마우스에 루시퍼라아제 및 tEGFR ("Nalm6-tEGFR-fLuc")을 코딩하는 벡터로 안정적으로 형질도입된 0.5x10⁶ Nalm6 세포를 정맥 내 주사했다. 3일 후, NSG 마우스는 10x10⁶ CAR T 세포의 정맥 투여로 처리되었다 (항-CD3/CD28-항체 코팅된 비드에 의한 활성화 14일 후, 즉, 안정한 형질 도입 13일 후). 인산염 완충 식염수 (PBS) 주사는 대조군 조건으로 사용되었다. 4마리의 마우스로 구성된 S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z (SEQ ID NO: 49)로 처리된 그룹을 제외하고 각 처리 그룹에 대해 5개의 NSG 마우스를 사용하였다. 11일 (투여일은 화살표로 표시됨)의 기간에 걸쳐 2 mg/kg의 동종이량체화제 AP20187을 복강 내 투여하여 이량체화를 유도하였다. 이량체화 제제를 받지 않은 그룹은 대조군 조건으로 각 비이클 용액을 복강 내로 받았다. 종양 크기 (각 치료 그룹의 평균)는 NSG 마우스의 전체 몸을 포함하는 관심 영역 내에서 측정된 총 광자 흐름으로 표시된다. (b) S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z (SEQ ID NO: 46) CAR T 세포로 처리했지만 11일까지 이량체화제 AP20187을 받지 않아 결과적으로 효율적인 CAR 활성화 및 종양 성장 제어된 마우스에서 이량체의 연기된 투여를 나타낸다.

도 7: 시험관 내에서 안정적으로 형질도입된 CAR T 세포의 기능 조절. (a) 실시예 5에서 생체 내 실험에 사용된 동종이량체화 된 CAR 분자의 도식적 표현. (b) 항-CD3/CD28-항체 코팅된 비드에 의한 활성화 후 14일 (즉, 각각의 CAR 구조물로 안정적인 형질도입 후 13일)에1차 인간 T 세포에서, EGFR에 대해 높거나 낮은 친화성을 갖는 항원 결합 모이어티를 포함하는 CAR 분자(즉, 각각, S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z “E11.4.1-WT” (SEQ ID NO: 49) 및 S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z “E11.4.1-G32A” (SEQ ID NO: 46))의 발현. CAR가 없는 ("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 제공되었다. (d) 항-CD3/CD28-항체 코팅된 비드에 의한 활성화 후 14일(즉, 안정적인 형질도입 후 13일)에 1차 인간 T 세포에서, 항-CD19 CAR CD19-8cys-BB-3z "CD19-BBz"(SEQ ID NO: 60)의 발현. CAR가 없는 ("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 제공되었다. (d 및 e) 각각 Nalm6-fLuc 및 Nalm6-tEGFR-fLuc 세포에서 tEGFR의 발현. 염색되지 않은 세포와 각각의 아이소타입 대조군은 음성 대조군으로 제공되었다. (f 및 g) 상이한 CAR 분자를 발현하는 1차 인간 T 세포에 의한 Nalm6-fLuc 및 Nalm6-tEGFR-fLuc 세포의 용해. 3명의 공여자 (상이한 기호로 표시됨)의 1차 T 세포는 rcSso7d-기반 CAR(S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z “E11.4.1-WT”와 S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z “E11.4.1-G32A”) 또는 양성 대조군으로 제공된 CD19에 대한 scFv-기반 CAR(CD19-8cys-BB-3z “CD19-BBz”)을 코딩하는 벡터로 안정적으로 형질도입 되었다. CAR가 없는 T 세포("CAR 없음")는 음성 대조군으로 제공되었다. AP20187은 “E11.4.1-WT” (S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z) 및 “E11.4.1-G32A” (S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z)의 비공유 이량체화를 위한 조절 분자로서 제공되었다. 이량체화는 37℃에서 30분 동안 10 nM AP20187로 T 세포를 전처리 함으로써 유도되었다. 동일한 농도의 DMSO를 사용한 처리가 대조군 조건으로 제공되었다. 변형된 T 세포의 세포 독성은 10:1의 E:T 비율로 37℃에서 4시간 동안 공동-배양한 후 생존 가능한, 루시퍼라아제 발현 표적 세포를 정량화함으로써 측정되었다.

도 8: 종양 미세환경에 축적되는 세포 외 인자의 예로서 VEGF에 의해 조절될 수 있는 CAR의 생성. 제시된 예에서 가용성 인자 VEGF는 조절 분자로 사용되었고, EGFR-특이적 항원 결합 모이어티 E11.4.1-G32A가 항원 결합 모이어티로 사용되었다. 각 CAR의 아키텍처의 개략도는 (a) 및 (b)에 나타나 있다. 5μg의 mRNA를 전기 천공 후 20시간에 Jurkat T 세포에서 표적 항원 tEGFR의 발현이 (c)에 묘사되어 있다. 1차 인간 T 세포에서 두 폴리펩티드의 발현은 항-IgG1-항체를 사용하여 검출되었다(d). 항-Strep II-태그 항체는 VEGF 결합 부위를 포함하는 CAR 분자 (막관통 도메인이 없는 Janus-CT6-Fc 도메인) 및 IgG-Fc 도메인이 없는 대조군 CAR의 검출에 추가로 사용되었다. 1차 T 세포에서 상이한 CAR에 의해 촉발된 세포 독성은 FACS-기반 세포 독성 분석 (e)에서 측정되었다. 세 명의 상이한 공여자 (상이한 기호로 표시)의 CAR T 세포를 tEGFR-형질감염된 Jurkat 세포와 4시간 동안 37℃에서 4:1:1(T 세포: tEGFR^pos Jurkat 세포: tEGFR^neg Jurkat 세포)의 E:T 비율로 공동-배양했다. CAR의 이량체화는 T 세포를 VEGF로 전처리(표시된 농도, 30분, 37℃)함으로써 유도되었다. CAR가 없는 T 세포 ("CAR 없음")는 음성 대조군으로 사용되었으며 CAR S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z가 있는 T 세포는 양성 대조군으로 사용되었다.

도 9: EGFR 및 HER2를 공동-발현하는 표적 세포를 특이적으로 인식할 수 있는 CAR T 세포의 기능적 특성 감별. (a) 세포 외 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 신호 전달 백본에 융합된 저친화성 결합 모이어티 E11.4.1-G32A (EGFR를 표적화) 및 zHER2-R10A (HER2를 표적화)를 포함하는 CAR 그룹 “S(G32A)-8ser-BB-FKBP-3z + A(R10A)-8ser-BB-FRB-3z” (SEQ ID NO: 48 및 SEQ ID NO: 54)의 개략도. 관련되지 않은 두 개의 에피토프 태그 (FLAG 태그 및 Strep II 태그)를 사용하면 두 사슬의 발현을 효율적으로 감지할 수 있다. 이종이량체화 도메인 FKBP 및 FRB는 조절 분자 AP21967을 통해 CAR 분자의 특이적 이종이량체화를 매개한다. (b) 2개의 상이한 저친화성 결합 모이어티 (E11.4.1-G32A 및 zHER2-R10A)가 단일 CAR 분자의 엑토 도메인에 직렬로 통합(가요성 있는 2xG4S-링커를 통해) 있는 탠덤-CAR “A(R10A)-S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” (SEQ ID NO: 71)의 개략도. (c 및 d) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 인간 1차 T 세포에서 CAR 구조물의 발현. CAR이 없는 ("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. (e 및 f) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 Jurkat T 세포에서 tEGFR 또는 tHER2 또는 둘 모두의 발현. 이식 유전자를 발현하지 않는 Jurkat T 세포 ("구조물 없음")는 음성 대조군으로 사용되었다. 조절 분자 AP21967의 존재 및 부재 하에 CAR 그룹의 기능은 (g)에 나타나 있다. CAR 그룹 "S(G32A)-8ser-BB-FKBP-3z 플러스(plus) A(R10A)-8ser-BB-FRB-3z" 또는 탠덤-CAR “A(R10A)-S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” 또는 CAR 없음(표시된 대로)를 발현하는 3개의 서로 다른 공여자 (상이한 기호로 표시됨)의 T 세포는 tEGFR("EGFR") 또는 tHER("HER2") 또는 둘 다 ("EGFR/HER2")를 발현하는 Jurkat T 세포와 공동-배양되었다. T 세포와 공동-배양한 후(4시간 동안 37℃에서 E:T 비율 4:1:1(T 세포:트랜스진^pos Jurkat 세포:트랜스진^neg Jurkat 세포)) Jurkat 세포를 발현하는 표적 항원의 용해는 유세포 분석에 의해 정량화되었다. 상기 그룹의 CAR 분자의 이량체화는 37℃에서 30분 동안 500nM AP21967로 T 세포를 전처리함으로써 유도되었다. 동일한 농도의 에탄올을 사용한 처리가 제어 조건으로 사용되었다. CAR이 없는 ("CAR 없음") T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다.

도 10: 3개 및 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 기능적 특성. (a 및 b) 각각, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 개략도. (c 및 d) 5μg mRNA의 각 구조물의 전기천공 후 20시간에 Jurkat T 세포에서 CAR의 삼량체 및 사량체 그룹의 발현. 구조물을 발현하지 않는 Jurkat T 세포 ("CAR 없음")는 음성 대조군으로 사용되었다.

도 11: 구성적 복합체 형성을 위한 이종이량체화 도메인을 포함하는 CAR 그룹의 기능적 특성화. (a) 각각 류신-지퍼 기반 이종이량체화 도메인 ("EE"및 "RR")을 포함하는 2개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 개략도. (b 및 c) 각 구조물의 5μg mRNA의 전기 천공 후 20시간에 Jurkat T 세포에서 CAR 그룹의 발현. 구조물을 발현하지 않는 Jurkat T 세포 ("CAR 없음")를 음성 대조군으로 사용했다. (d 및 e) 각 구조물의 5μg mRNA의 전기 천공 후 20시간에 1차 인간 T 세포에서 CAR 그룹의 발현. 구조물을 발현하지 않는 1차 인간 T 세포 ("CAR 없음")를 음성 대조군으로 사용했다. 4개의 서로 다른 공여자 (상이한 기호로 표시됨)의 1차 인간 T 세포에서 CAR 그룹의 기능은 (f)에 나타나 있다. EGFR과 HER2, 또는 EGFR만 또는 HER2만을 발현하는 표적 세포에 대한 T 세포의 세포 독성은 FACS-기반 세포 독성 분석을 사용하여 측정되었다. 구조물을 발현하지 않는 T 세포 ("CAR 없음") 및 표시된 구조물을 발현하는 CAR T 세포를 각각의 Jurkat T 세포(“tEGFR”, “tHER2” 또는 “tEGFR/tHER2”)와 함께 37℃에서 4:1:1의 E:T 비율로 4시간 동안 공동-배양했다(T 세포: 트랜스진^pos Jurkat 세포: 트랜스진^neg Jurkat 세포). 통계적 유의성은 일원 ANOVA (GraphPad PRISM 소프트웨어 사용)을 사용하여 계산되었다 (* = p <0.05; ns = p> 0.05).

도 12: 상이한 공동-자극 분자를 포함하는 CAR 그룹의 발현 및 기능. (a) 공동-자극 신호전달 영역에 각각 CD28 또는 ICOS 또는 OX40의 공동-자극 도메인을 포함하는 2개의 CAR 분자로 구성된 CAR 그룹의 개략도. (b 및 d) 각각 Jurkat T 세포 또는 1차 인간 T 세포에서 5μg mRNA의 전기천공 후 20시간에 CAR 분자 (적색 히스토그램)의 발현. 구조물을 발현하지 않는("CAR 없음") Jurkat T 세포 또는 1차 인간 T 세포를 각각 음성 대조군 (채워진 파란색 히스토그램)으로 사용했다. (d) S(G32A)-8ser-OX40-FKBP(36V)-3z를 코딩하는 5μg의 mRNA로 전기천공된 Jurkat T 세포에서 NF-κB 및 NF-AT 프로모터의 유도. 이들 세포는 5μg의 tEGFR 암호화하는 mRNA로 전기 천공된 Jurkat T 세포와 AP20187의 존재 또는 부재 하에 추가적인 20시간 동안 공동-배양되거나 그렇지 않았다. CAR 발현 리포터 세포에서 NF-κB 및 NF-AT 프로모터의 유도는 각각 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 및 GFP(CFP)의 시안색(cyan) 형광 변이체의 발현에 대한 유세포 분석에 의해 검출되었다. 표시된 CAR 분자를 발현하는 1차 인간 T 세포의 세포 독성은 (e)에 나타냈다. 각각의 CAR 분자를 코딩하는 5μg mRNA의 전기 천공 후 20시간에, T 세포는 4:1:1의 E:T 비율로 37℃에서 추가적인 4 또는 20시간 동안 표적 세포와 공동-배양되었다(T 세포: tEGFR^pos Jurkat 세포: tEGFR^neg Jurkat 세포). 상기 그룹의 CAR 분자의 이량체화는 37℃에서 30 분 동안 10 nM AP20187로 Jurkat 세포 (d) 및 1차 인간 T 세포 (e)를 전처리함으로써 유도되었다. 동일한 농도의 DMSO를 사용한 처리가 대조군 조건으로 사용되었다.

도 13: 상이한 CAR 신호전달 백본에 융합된 rcSso7d 및 아피바디 기반 결합 모이어티를 포함하는 CAR 분자의 발현. (a) 각각의 mRNA 5μg의 전기 천공 후 20시간에 1차 인간 T 세포에서 CAR 구조물 “Myc-S(18.4.2)-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 39), “S(18.4.2)-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 40) 및 “S(18.4.2)-G4S-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 41)의 발현. CAR이 없는 1차 T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다(채워진 히스토그램). 인간 EGFR의 세포 외 도메인과 IgG1의 Fc 도메인 및 항-인간-IgG1-항체로 구성된 융합 단백질을 사용하여 발현을 검출하였다. (b) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 1차 인간 T 세포에서 CAR 구조물 “S(WT)-G4S-myc-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 42), “S(WT)-G4S-StrepII-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 43) 및 “S(WT)-G4S-his-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 45)의 발현. CAR이 없는 1차 T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다 (채워진 히스토그램). CAR 발현은 각각 항-c-myc 항체, 항-Strep II 항체 또는 항-헥사히스티딘 항체를 사용하여 검출되었다. (c) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 인간 1차 T 세포에서 CAR 구조물“S(WT)-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 79), “S(G25A)-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 77), “S(G32A)-8cys-BB-3z” (SEQ ID NO: 43), “S(WT)-8ser-BB-3z” (SEQ ID NO: 80), “S(G25A)-8ser-BB-3z” (SEQ ID NO: 78), “S(G32A)-8ser-BB-3z” (SEQ ID NO: 44)의 발현. CAR이 없는 1차 T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다 (채워진 히스토그램). 항-Strep II 항체를 사용하여 발현을 검출했다. (d) 각각의 mRNA 5μg의 전기천공 후 20시간에 1차 인간 T 세포에서 CAR 구조물 “S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” (SEQ ID NO: 46), “S(G32A)-8ser-BB-FRB-3z” (SEQ ID NO: 47), “S(G32A)-8ser-BB-FKBP-3z” (SEQ ID NO: 48), “A(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” (SEQ ID NO: 52), “A(WT)-8ser-BB-FRB-3z” (SEQ ID NO: 53), “A(R10A)-8ser-BB-FRB-3z” (SEQ ID NO: 54)의 발현. CAR이 없는 1차 T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다 (채워진 히스토그램). 표시된 바와 같이 항-FLAG 항체, 항-Strep II 항체 또는 항-헥사히스티딘 항체를 사용하여 발현을 검출했다.

도 14는 상이한 CAR 분자의 디자인에 대한 개략도를 보여준다. 상응하는 아미노산 서열은 도 15에 나타나 있다.

도 15는 상이한 CAR 분자의 아미노산 서열을 나타낸다.

실시예 1: 본 발명에 따른 CAR 그룹에서 사용하기 위한 rcSso7d 기반 저친화성 단일 도메인 항원 결합 모이어티의 생성

1번째 실시예는 본 발명에 따라 CAR 그룹에서 항원 결합 모이어티로 사용하기에 적합한 낮은 친화성을 갖는 항원 결합 모이어티를 생성하기 위한 전략을 나타낸다. 환원된 전하 Sso7d (rcSso7d)는 고세균 Sulfolobus solfataricus에서 추출한 작은 (~7 kDa) DNA-결합 단백질의 전하 감소 버전이다. 전하-환원은 정전기 상호 작용 감소로 인한 비특이적 결합을 최소화한다. rcSso7d는 높은 열 안정성과 단량체 거동을 가진 단일 도메인 단백질 항원 결합 모이어티이므로 적합한 결합 스캐폴드의 예이다. 19 nM의 Kd로 인간 EGFR에 결합하는 잘 특성화 된 항원 결합 모이어티 rcSso7d E11.4.1에서 시작하여(Traxlmayr et al., J Biol Chem. 2016;291(43):22496-22508), 발명자들들은 알라닌에 의해 에피토프 결합에 잠재적으로 관련된 모든 아미노산을 대체하는 알라닌 스캔을 수행하여 저친화성 돌연변이체를 생성했고, 즉, 각 돌연변이체에서 항원 결합에 관련된 한 위치가 알라닌으로 돌연변이 되었다. rcSso7d E11.4.1의 돌연변이는 sfGFP에 융합되고 박테리아 발현 시스템에서 가용성 단백질로 발현되었다. 융합 단백질의 구조에 대한 개략도가 도 14g에 나타나 있다. 결합 친화성은 (i) 각각의 표적 항원 EGFR의 높은 수준을 발현하도록 mRNA 전기천공에 의해 조작된 Jurkat T 세포에서 sfGFP와 결합 모이어티의 가용성 융합 단백질의 적정 실험을 수행하고, (ii) IgG-Fc에 융합된 EGFR의 세포 외 도메인이 로딩된 단백질 A 칩에 대한 SPR 실험을 수행하여 측정했다. 알라닌 스캔의 결과와 얻은 항원 결합 모이어티의 친화성은 도 2에 나타나 있다.

단백질 항원 결합 모이어티의 알라닌 스캐닝:

제조업체의 지침에 따라, QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Genomics)를 사용하여 에피토프 결합과 관련된 모든 아미노산의 부위-지정 돌연변이 유발을 수행했다. 프라이머는 QuikChange Primer Design 소프트웨어 (Agilent Genomics)를 사용하여 설계되었으며 올리고 뉴클레오티드는 Biomers에 의해 합성되었다.

rcSso7d 기반 항원 결합 모이어티의 발현 및 정제:

결합 스캐폴드는 pE-SUMO 벡터(Life Sensors)를 사용하여 sfGFP 융합 단백질 (N-말단 헥사히스티딘 태그 다음에 rcSso7d 또는 Affibody 및 sfGF로 구성됨)으로 발현되었다. sfGFP 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Addgene (플라스미드 #54737)에서 얻었다. 간단히 말해서, 대장균 세포 (Tuner DE3)를 열 충격(heat shock) 형질 전환을 사용하여 서열-검증된 플라스미드로 형질 전환시켰다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 배양액을 TB(terrific broth) 배지 (12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4% 글리세롤, 2.31g/L KH₂PO₄ 및 16.43g/L K₂HPO₄*3H₂O)에서 1:100으로 희석하고 카나마이신(50 μg/mL)을 보충하고 진탕(shaking)하면서 37℃에서 배양했다. 배양이 대략 2의 A₆₀₀에 도달했을 때, 1mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 트랜스진의 발현을 유도하고 세포를 20℃에서 밤새 더 배양하였다. 세포를 원심 분리 (5000g, 20분, 4℃)로 수확하고, 초음파 처리 버퍼(50mM 인산 나트륨, 300mM NaCl, 3% 글리세롤, 1% Triton X-100, pH 8.0)에 재현탁하고 초음파 처리 (2x90초, 듀티 사이클 50%, 진폭은 5로 설정) 다시 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거했다. TALON 금속 친화성 수지(Clontech Laboratories)를 사용하여 조세포 추출물에서 헥사히스티딘-태그된 융합 단백질을 정제했다. 10mM 이미다졸을 첨가한 후, 초음파 처리된 상청액을 수지에 두 번 적용한 다음, 증가량의 이미다졸(5 - 15mM)을 사용하여 평형 버퍼(50mM 인산 나트륨, 300mM NaCl, pH 8.0)로 세척 단계를 수행했다. 결합 스캐폴드는 250mM 이미다졸이 보충된 평형 버퍼를 적용하여 용출되었다. Amicon Ultra-15 10K 원심 분리 필터(Merck Millipore)를 사용하여 PBS로 버퍼를 교환한 후, 각 몰 흡수 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하고 마지막으로 단백질을 -80℃에서 직접 동결했다.

인간 세포주의 유지:

Jurkat T 세포는 어린이 암 연구소(CCRI)의 Sabine Strehl 박사로부터 기증 받아, 10% FCS (Sigma Aldrich) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Scientific)이 보충된 RPMI-1640(Thermo Scientific)에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 유세포 분석기-기반 세포 계수 플랫폼인 AccuCheck 계수 비드(Thermo Scientific)로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit (Ambion)를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼 (Qiagen), 에탄올 (Merck) 및 2-mercaptoethanol (Merck)의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물(Thermo Scientific)로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공 될 때까지 -80 ℃에서 동결했다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, Jurkat T 세포는 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공되었다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석:

Jurkat T 세포를 FACS 버퍼 (PBS (Thermo Scientific), 0.2% 인간 알부민 (CSL Behring) 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4℃에서 10 분 동안 처리했다. 세포는 4℃에서 25 분 동안 각각의 1 차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. 조작된 표적 항원 tEGFR의 발현은 PE- 또는 APC- 접합된 항-EGFR 항체 (클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

세포막에 대한 결합 친화성 측정:

Jurkat T 세포는 높은 수준의 각각의 종양 항원을 발현하도록 조작되었다. 따라서, tEGFR을 코딩하는 3μg의 mRNA를 이펙터 세포와의 공동-배양 하루 전에 Jurkat T 세포로 전기천공했다. PBS로 세척한 후, 세포를 0.1% BSA (Sigma Aldrich)를 포함하는 PBS에 재현탁하고 각 종양 항원에 대한 항원 결합 모이어티의 친화성을 측정하기 위해 sfGFP에 융합된 다양한 농도의 결합제 단백질과 함께 배양했다. 진탕하면서 4℃에서 1시간 동안 배양한 후, 플레이트를 원심 분리 (450g, 7분, 4℃)하고 상청액(supernatant)을 버리고 BD LSRFortessa로 세포를 획득했다. 세포는 엔도사이토시스(endocytosis)를 피하기 위해 얼음에 보관되었다. Kd는 Microsoft Excel (Microsoft Corporation)을 사용하여 곡선 피팅하여 얻었다.

표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 결합 친화성 측정:

SPR 실험은 Biacore T200 기기 (GE Healthcare)로 수행되었다. 모든 실험은 25℃에서 0.1% BSA 및 0.05% Tween-20 (Merck Millipore)을 포함하는 탈기 및 여과된 PBS, pH 7.4에서 수행되었다. hEGFR-Fc (R&D)는 6.67 μg/mL 농도에서 60초 동안 10 μL/min의 유속으로 Protein A 센서 칩 (GE Healthcare)에 고정되었다. rcSso7d 기반 항원 결합 모이어티의 친화성을 측정하기 위해 각 단백질의 5가지 농도 (항원 결합 모이어티의 예상 K_d에 따름)를 단일-주기 운동 모드에서 15 초 동안 30 μL/min의 유속으로 주입하고 분리 단계 (30초)가 이어졌다. K_d는 Biacore T200 평가 소프트웨어 (GE Healthcare)를 사용하여 곡선 피팅으로 얻었다.

실시예 2: 세포 외 이황화 결합-형성 시스테인은 CAR 그룹의 AND 게이트 기능을 위한 결합 효과의 완전한 이용(exploitation)을 방지함

세포 외 힌지 영역에서 시스테인을 형성한 세포 외 이황화-결합, 예를 들어, CD8α는 본 발명에 따른 결합 효과의 악용을 방지할 수 있다. 이는 실시예 1의 결합 모이어티 "E11.4.1 G32A"의 저친화성 돌연변이가 CD8α의 힌지 영역에 있는 2 개의 세포 외 시스테인 잔기 (UniProt ID P01732, 위치 C164 및 C181)가 각각 세린 잔기로 치환되거나 그렇지 않은 CAR 신호전달 백본에 융합된 실시예 2에서 입증된다. 시스테인 함유 CAR-변이체 ("Cys")가 표적 세포에 대한 반응으로 T 세포 활성화를 효율적으로 촉발한 반면, 세린-함유 변이체 ("Ser")는 T 세포를 촉발하지 않았거나 저조하게 촉발하였다. 따라서 이 실시예는 본 발명에 따른 CAR 그룹에서 사용하기에 적합한 CAR 분자를 생성하기 위해 이황화-결합 형성을 방지하는 것의 중요성을 설명한다. 도 3a의 개략도는 테스트된 구조의 디자인을 보여준다. 도 3b 및 3c는 CAR 및 표적 항원의 발현을 나타낸다. 1 차 인간 T 세포는 각 구조물에 대해 5 μg mRNA로 전기천공되었고 CAR 발현은 Strep II 태그를 통해 전기천공 20 시간 후에 검출되었다. Jurkat T 세포는 EGFR(tEGFR)의 절단된(truncated) 버전을 코딩하는 3μg mRNA로 전기천공되었다. 전체 길이 EGFR은 N- 말단과 C- 말단 모두 절단되어 천연 리간드 EGF에 결합할 수 없고 키나제 도메인의 부재로 인해 이량체화 특성이 감소된 기능적으로 불활성인 인간 폴리펩티드를 생성했다 (Wang et al., Blood. 2011 ; 118 (5) : 1255-1263). 생성된 트랜스진은 과립구-대식세포 콜로니-자극인자 2 수용체 알파 서브유닛(GM-CSF-Ra)의 선도 서열과 인간 EGFR의 아미노산 334 내지 675(Uniprot P00533)로 구성되었으며, 두 개의 세포 외 막-근위 도메인과 막관통 도메인을 포함한다. 트랜스진 발현은 EGFR에 대한 항체를 통해 전기천공 20 시간 후에 검출되었다. T 세포의 전기천공 20 시간 후, CAR의 기능은 루시페라아제-기반 세포독성 분석 (도 3d)을 사용하고 ELISA를 사용하여 T 세포에서 방출된 사이토카인을 정량화하여 측정되었다 (도 3e). 도 3d 및 3e는 가장 낮은 시험된 친화성을 갖는 항원 결합 모이어티가 표적 세포와의 2가 상호작용, 즉 CD8α 힌지 ("Cys")에 시스테인을 포함하는 CAR에 융합될 때만 T 세포를 촉발할 수 있음을 나타내지만, 이러한 시스테인이 세린 ("Ser")으로 대체된 CAR에 융합될 때 촉발하지 않거나 또는 저조함을 보여준다. 반면, 증가된 친화성을 갖는 항원 결합 모이어티 (E11.4.1-WT 및 E11.4.1-G25A)는 1가 상호 작용, 즉 "Ser" CAR 백본에 융합될 때에도 강력한 세포 독성을 촉발했다. 함께, 이 실시예는 시스테인을 포함하는 CAR 분자가 동종이량체화되어 단일-양성 표적 세포(즉, 하나의 항원만을 발현하는 표적 세포)에 의한 CAR-활성화를 초래할 수 있음을 입증한다. 그러나, 본 발명의 목적은 주어진 항원 조합 (즉, AND 게이트 CAR 기능)을 발현하는 표적 세포를 특이적으로 인식하는 CAR 그룹을 구축하는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 각 CAR 분자의 엑토도메인에는 각각 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없다.

인간 세포주의 유지:

1 차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액으로부터 얻어졌다(오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트). RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3^pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO (Sigma Aldrich)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드 (Thermo Scientific)로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2 (Peprotech)로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1 차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14 일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사로부터 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1 차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: 1 차 T 세포(정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포(정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼(PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4℃에서 25분 동안 각각의 1 차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 항-Strep II 태그 항체(클론 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 1차 항체로 사용하고 PE- 또는 APC-접합된 2차 항체 (eBioscience)를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tEGFR의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EGFR 항체(클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축:

신호 펩티드 CD33, 인간 CD8α 힌지, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3ζ ITAM 신호 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GenScript에 의해 합성되었다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. Strep II 태그 (NWSHPQFEK) 및 가요성 링커의 삽입은 PCR에 의해 수행되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs)를 사용하여 수행되었다. 회로도와 시퀀스는 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

루시페라아제-기반 세포 독성 분석:

루시페라아제-발현 종양 세포는 페놀이 없는 RPMI (Thermo Scientific), 10% FCS, 1% L-글루타민 (Thermo Scientific) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 세포독성 분석 배지에서 37℃에서 4시간 동안 흰색 둥근-바닥 96 웰 플레이트(Sigma Aldrich)에서 10,000개의 표적 세포/웰과 2:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양되었다. 마지막으로, 남은 살아있는 세포는 공동-배양의 잔류 루시페라아제 활성을 측정하여 정량화되었다. 10 분 동안 실온으로 평형을 이룬 후, 루시페린을 세포 현탁액 (150 μg/mL 최종 농도; Perkin Elmer)에 첨가하고 20 분 후에 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정했다. 특이적 용해의 백분율은 다음 식으로 측정되었다: % 특이적 용해 = 100 - ((이펙터와 표적 세포 공동-배양 웰의 RLU) / (표적 세포만 있는 웰의 RLU) x 100)).

CAR T 세포에 의한 사이토카인 방출:

1 차 CAR T 세포의 사이토카인 분비는 37℃에서 4시간 또는 24시간 동안 평평한-바닥 96 웰 플레이트에서 1:1 또는 2:1의 E:T 비율로 표적 세포와 공동-배양하여 평가되었다. 일부 실험에서, 방출된 사이토카인은 세포 독성을 측정하기 위한 공동-배양 실험의 상청액에서 정량화되었다. 상청액을 원심 분리 (1600rpm, 7분, 4℃)하여 남아있는 세포와 잔해물을 제거하고 그 후 -80℃에서 냉동했다. 분비된 IFN-γ의 분석을 위해, ELISA는 제조업체의 지침에 따라 Human IFN 감마 ELISA Ready-SET-Go! ® 키트 (eBioscience)를 사용하여 수행되었다. 측정은 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 수행되었다.

실시예 3: 단일-사슬 가변 단편 (scFv)은 세포막에서 CAR 클러스터링을 촉발하여 특이적 항원 조합 인식을 위한 결합 효과의 이용을 방지할 수 있다.

3번째 실시예는 CAR 분자에서 scFv-기반 결합 모이어티의 통합이 항원 조합의 특정 인식에 대한 결합능 효과의 이용을 방지할 수 있음을 보여준다. 도 4a에 나타낸 CAR 구조물의 개략도는 시험된 CAR 변이체(4D5-5-8cys-BB-3z, 4D5-5-8ser-BB-3z, 4D5-5(split)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z)의 디자인을 예시한다. 나타낸 실시예에서, HER2에 대해 지시된 scFv 4D5-5는 항원 결합 모이어티로 사용되었고, 단량체 ("Ser") 또는 이량체 ("Cys") CAR 신호전달 백본 중 하나로 통합되었다. 도 4b는 1차 T 세포에서 CAR의 발현을 나타낸다. scFv 4D5-5에 대한 효과적인 결합 친화성은 1.1 μM로 보고되었으며 (Liu et al., Cancer Res. 2015;75(17):3596-3607), 이는 E11.4.1-G32A의 친화성과 비슷하다. 절단된 형태의 HER2 (tHER2)를 발현하는 Jurkat T 세포는 표적 세포주로 사용되었다 (도 4e). CAR T 세포에 의한 IFN-γ 분비 (도 4f) 및 세린-함유 CAR "4D5-5-8ser-BB-3z"에 의해 촉발된 표적 세포의 용해 (도 4g)는, 실시예 2의 CAR S(G32A)-8ser-BB-3z (SEQ ID NO: 44))에서 저친화성rcSso7d-기반 항원 결합 모이어티를 사용한 관찰(도 3)과는 극명하게 대조되는, 저친화성 scFv에도 불구하고, 시스테인 함유 CAR “4D5-5-8cys-BB-3z”에 비해 약간만 감소된다. 디아바디(diabody) 형성에서 관찰된 바와 같이, T 세포 표면의 scFv에서 함께 연결된 VH 및 VL은 동일한 단일-사슬 분자 내 (즉, 동일한 CAR 분자 내) 내에서 이량체화 될 수 있을 뿐만 아니라 분자간 연결 (즉, 서로 다른 CAR 분자 사이)도 형성할 수 있다. 이것은 정제된 scFv 단백질 (Atwell et al., Protein Eng. 1999;12(7):597-604)에 대해 보고된 이량체화 또는 심지어 올리고머화를 매개하고 이전에 관찰된 CAR 클러스터링을 설명할 것이다 (Long et al., Nat Med. 2015;21(6):581-590). 궁극적으로, scFv의 이 이량체화 또는 올리고머화는 단량체 CAR 백본을 기반으로 하는 경우에도 2가 또는 다가 CAR의 형성을 초래한다. 따라서, VH와 VL 사이의 링커를 절단하면 올리고머화를 방지할 수 있으므로 단량체 CAR 백본을 기반으로 하는 저친화성 CAR의 활성화를 방지할 수 있다. 발명자들은 나아가 링커가 없는 VH 및 VL 도메인이 여전히 T 세포 표면에서 적어도 부분적으로 이종이량체화하여 기능적 VH/VL-이종이량체 (즉, Fv들)를 형성할 수 있다고 추정했다. Fv들간에 비특이적인 끈적임이 없는 경우, 저친화성 (4D5-5의 경우 Kd 1.1 μM)으로 인한 이러한 Fv들은 두 Fv의 조절된 이량체화 (VH 운반 사슬에 세포 내 융합된 FKBP F36V-를 통해)시에만 T 세포 활성화를 촉발할 수 있어야한다. 실제로, 도 4h는 저친화성 scFv 4D5-5의 VH 및 VL을 2 개의 분리된 막-고정 분자 (SEQ ID NO: 58 및 SEQ ID NO: 59)로 분리함으로써 알 수 있는 바와 같이 이것이 사실임을 보여준다. 예측된 바와 같이, 이들 구조물을 발현하는 CAR T 세포 (도 4c 및 4d)는 tHER2^pos 표적 세포에 의해 활성화되지 않았다. 그러나 T 세포는 VH 구조물이 AP20187에 의해 동종 이량체화 되었을 때 해당 표적 세포에 의해 활성화되었다 (도 4Hh). 이량체화제(dimerizer)의 존재 하에 이 T 세포 활성화는 두 개의 분리된 구조가 실제로 T 세포 표면에 기능적 Fv들을 형성하고, 이량체화제 부재시 활성화의 부족이 Fv의 1가 특성 때문이라는 것을 확인했다. 이는 4D5-5의 낮은 친화성 및 실시예 2에서 rcSso7d-기반 항원 결합 모이어티로 얻은 관찰과 일치한다. 비교를 위해 발명자들은 scFv-버전 (즉, 링커 "218"에 의해 연결된 VH 및 VL)의 발현을 VH 구조 (도 4C)로 얻은 발현 수준으로 대략 조정했는데, 낮은 발현에도 불구하고 여전히 CAR T 세포의 강력한 활성화를 가져왔다 (도 4H). 함께, 도 4의 데이터는 적어도 특정 버전의 scFv가 T 세포 표면의 인접한 분자 사이에서 VH 및 VL의 분자간 이종이량체화에 의해 부분적으로 이량체화 (또는 올리고머화)됨을 강력하게 제안한다. 시스테인 아미노산 잔기에 의해 촉발된 이량체화 또는 올리고머화 (위에서 논의됨)와 유사하게, 적어도 특정 scFv 변이체에 의해 매개되는 CAR 분자의 제어되지 않은 이량체화 또는 올리고머화는 동일한 CAR 분자의 동종이량체화를 촉발할 수 있다. 이는, 차례로, 단일 양성 세포를 만날 때 결합 효과를 초래할 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 CAR 그룹에 의한 표적 세포에 대한 항원 조합의 원하는 특정 인식을 배제할 수 있다. 따라서, 바람직한 구현에서, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티 또는 그룹의 CAR 분자에 결합하는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티는 scFv가 아니다.

인간 세포주의 유지:

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액(오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자사로부터 얻어진 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사로부터 기증받았으며, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1 차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: 1 차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼(PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4℃에서 25분 동안 각각의 1차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 1차 항체로 항-Strep II 태그 항체(클론 5A9F9, Genscript)를 사용하여 Strep II 태그를 또는 항-FLAG 태그 항체(클론 L5, BioLegend)를 사용하여 FLAG 태그를 통해 검출되었고 Strep II 태그 항체의 경우 PE- 또는 APC-접합된 2차 항체를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tHER2의 발현은 PE-접합된 항-HER2 항체(클론 24D2, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축:

GM-CSF-Ra 신호 펩티드, 항-인간 CD19 scFv FMC63, 인간 CD8α 힌지, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인과 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 은 GenScript에 의해 합성되었다. 신호 펩티드 IgGk, 항-인간 HER2 scFv 4D5-5 및 이량체화 도메인 FKBP F36V를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. HER2의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #16257)에서 얻었다. Strep II 태그 (NWSHPQFEK) 또는 FLAG 태그 (DYKDDDDK) 및 가요성 링커의 삽입은 PCR에 의해 수행되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나 있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

루시페라아제-기반 세포 독성 분석:

루시페라아제-발현 종양 세포는 페놀이 없는 RPMI, 10% FCS, 1% L- 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 세포독성 분석 배지에서 37℃에서 4시간 동안 흰색 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 10,000개의 표적 세포/웰과 2:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양되었다. 마지막으로, 남은 살아있는 세포는 공동-배양의 잔류 루시페라아제 활성을 측정하여 정량화되었다. 10 분 동안 실온으로 평형을 이룬 후, 루시페린을 세포 현탁액 (150 μg/mL 최종 농도)에 첨가하고 20 분 후에 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정했다. 특이적 용해의 백분율은 다음 공식으로 측정되었다: % 특이적 용해 = 100 - ((이펙터와 표적 세포 공동-배양 웰의 RLU) / (표적 세포만 있는 웰의 RLU) x 100)).

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2 개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고 37℃에서 4 시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만(targets only)"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리(5 분, 1600rpm, 4℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 공식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

CAR T 세포에 의한 사이토카인 방출:

1차 CAR T 세포의 사이토카인 분비는 37℃에서 4시간 또는 24시간 동안 평평한-바닥 96 웰 플레이트에서 1:1 또는 2:1의 E:T 비율로 표적 세포와 공동-배양하여 평가되었다. 일부 실험에서, 방출된 사이토카인은 세포 독성을 측정하기 위한 공동-배양 실험의 상청액에서 정량화되었다. 상청액을 원심 분리 (1600 rpm, 7분, 4℃)하여 남아있는 세포와 잔해물을 제거하고 그 후 -80 ℃에서 냉동했다. 분비된 IFN-γ의 분석을 위해, ELISA는 제조업체의 지침에 따라 Human IFN 감마 ELISA Ready-SET-Go! ® 키트 (eBioscience)를 사용하여 수행되었다. 측정은 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 수행되었다.

트랜스진의 시험관 내 이량체화:

트랜스진의 이량체화는 공동-배양 실험 전에 유도되었다. 1차 T 세포는 각 세포 배양 배지에서 최종 세포 농도로 희석되었다. 동종이량체화 제제 AP20187 (MedChemExpress)을 세포 배양 배지에 희석하고 10 nM 최종 농도로 첨가했다. 동일한 농도에서 각각의 비이클 제어 DMSO를 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하여 트랜스진의 효율적인 이량체화를 확실히 하고, 이어서 시험관 내 실험에 사용했다.

실시예 4: HER2에 대한 아피바디-기반 CAR 그룹의 생성 및 기능

4번째 실시예에서, 본 발명에 따른 CAR 그룹에서 사용하기에 적합한 HER2에 대한 아피바디 기반 결합 모이어티를 생성하고 확인했다. 다시, 발명자들은 인간 HER에 대한 고친화성 결합을 위해 조작된 잘 특성화된 존재하는 항원 결합 모이어티에서 시작했다(Wikman et al., Protein Eng Des Sel. 2004;17(5):455-462). 잠재적인 N-글리코실화 부위를 제거하고 IgG 결합을 감소시키기 위해, 2개의 점 돌연변이(N23A 및 S33K)를 결합 스캐폴드의 프레임워크 영역에 도입하여(Feldwisch et al., J. Mol. Biol. 2010;398(2):232-47) 항원 결합 모이어티 "zHER2-WT"를 생성했다. 항원 결합에 관여하는 모든 아미노산을 알라닌에 연속적으로 돌연변이시켜 "zHER2-WT"의 알라닌-스캔을 수행하여 저친화성 돌연변이체를 생성하여 각각 하나의 알라닌-돌연변이를 포함하는 다양한 돌연변이체를 생성했다. 대장균에서 13개의 돌연변이를 발현하고 적절한 항원 결합 모이어티의 선택에 대한 친화성을 측정하는 대신, 모든 돌연변이를 조건부로 동종이량체화 될 수 있는 CAR 백본(SEQ ID NO: 52에서 바인더 zHER2-WT (WT)로 예시됨)에 직접 통합하여 기능적 스크리닝을 수행했다(도 5a). 이러한 방식으로, tHER2를 코딩하는 5 μg mRNA로 전기천공된 Jurkat T 세포와 공동-배양에서 동종이량체의 존재 및 부재 하에서 상이한 CAR을 발현하는 T 세포는 활성화를 위해 직접적으로 스크리닝 될 수 있다. 도 5b는 Jurkat 세포에서 tHER2의 발현을 나타낸다. 1차 인간 T 세포는 각 CAR 구조물에 대해 5μg mRNA로 전기천공되었고 발현은 헥사히스티딘 태그를 통해 전기천공 20 시간 후에 검출되었다 (도 5c). 13 개의 서로 다른 아피바디-기반 CAR의 발현은 모두 비슷했다 (도 5d). 구조물을 발현하지 않는 1차 T 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 기능적 스크리닝을 위해, CAR T 세포를 Jurkat T 세포와 공동-배양하기 전에 37℃에서 30분 동안 10 nM의 AP20187로 CAR T 세포를 처리하여 CAR 분자의 이량체화를 유도했다. 비이클 제어 DMSO의 추가가 대조군 역할을 했다. 2:1의 E:T 비율로 37℃에서 4시간 동안 공동-배양 한 후, 루시페라아제-기반 세포 독성 분석을 수행하여 세포 독성을 촉발하는 CAR의 능력을 측정했다. 10 nM AP20187의 존재 또는 부재 하에 T 세포에서 세포 독성을 촉발하는 상이한 CAR의 능력은 도 5e에 나타나 있다. 고친화성 아피바디 항원 결합 모이어티 zHER2-WT는 AP20187의 존재와 무관하게 효율적인 표적 세포 용해를 촉발시켰다. 유사하게, 돌연변이체 Q11A, Q17A, W24A, T25A, S27A 및 R28A를 포함하는 CAR은 이량체화제의 존재에 대한 유의한 의존성을 나타내지 않았다. Y13A 및 W14A가 치환된 아피바디 항원 결합 모이어티를 포함하는 CAR에 의해 세포 독성이 촉발되지 않은 반면, Y35A는 낮은 수준에서 세포 독성을 촉발하였다. 이량체화-유도 활성화는 돌연변이 L9A-, R10A- 및 R32A에서 관찰되었으며, 따라서 본 발명에 따라 CAR 분자로의 통합에 적합한 결합 모이어티를 나타낸다.

인간 세포주의 유지:

1 차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액으로부터 얻어졌다(오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트). CD3^pos T 세포는 RosetteSep 인간 T 세포 농축(Enrichment) 칵테일(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 농축되었다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2가 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1 차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14 일 동안 배양되었다. A431 표피 암종 세포는 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM (Thermo Scientific)에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며, 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고, 10% 인간 혈청으로 4℃에서 10분 동안 처리했다. 세포를 각 1차 항체로 4℃에서 25분 동안 염색하였다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 2차 항체로 4℃에서 25분 동안 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 AF647-접합된 항-펜타히스티딘 태그 항체(Qiagen)를 사용하여 헥사히스티딘 태그를 통해 검출하였다. 조작된 표적 항원 tHER2의 발현은 PE-접합 항-HER2 항체 (클론 24D2, BioLegend)로 검출하였다. 분석은 FlowJo 소프트웨어로 수행되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1 차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

트랜스진 구조물의 구축:

CD33 신호 펩티드, 아피바디 zHER2-WT, 헥사히스티딘 태그, 가요성 G₄S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 이량체화 도메인 FKBP F36V 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. HER2의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #16257)에서 얻었다. 가요성 링커의 삽입은 PCR에 의해 수행되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나 있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

단백질 항원 결합 모이어티의 알라닌-스캐닝:

제조업체의 지침에 따라 QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 에피토프 결합과 관련된 모든 아미노산의 부위-지정 돌연변이화를 수행했다. 프라이머는 QuikChange Primer Design 소프트웨어 (Agilent Genomics)를 사용하여 설계되었고 올리고뉴클레오티드는 Biomers에 의해 합성되었다.

루시페라아제-기반 세포 독성 분석:

루시페라아제-발현 종양 세포를 페놀이 없는 RPMI(Thermo Scientific), 10% FCS, 1% L-글루타민(Thermo Scientific) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 세포 독성 분석 배지에서 37℃에서 4 시간 동안 흰색 둥근-바닥 96 웰 플레이트(Sigma Aldrich)에서 10,000 개의 표적 세포/웰로 2:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양하였다. 마지막으로, 남은 살아있는 세포는 공동-배양의 잔류 루시페라아제 활성을 측정하여 정량화되었다. 10분 동안 실온과 평형을 이룬 후, 루시페린을 세포 현탁액 (150 μg/mL 최종 농도)에 첨가하고 20분 후에 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정하였다. 특이적 용해의 백분율은 다음 식으로 측정되었다:

% 특이적 용해 = 100 - ((이펙터와 표적 세포 공동-배양 웰의 RLU) / (표적 세포만 있는 웰의 RLU) x 100)).

트랜스진의 시험관 내 이량체화:

트랜스진의 이량체화는 공동-배양 실험 전에 유도되었다. 1차 T 세포는 각 세포 배양 배지에서 최종 세포 농도로 희석되었다. 동종이량체화제 AP20187을 세포 배양 배지에 희석하고 10 nM 최종 농도로 첨가했다. 동일한 농도에서 비이클 제어 DMSO를 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 트랜스진의 효율적인 이량체화를 확실히 하기 위해 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하고, 후속적으로 시험관 내 실험에 사용했다.

아피바디-기반 항원 결합 모이어티의 발현 및 정제:

결합 스캐폴드는 pE-SUMO 벡터를 사용하여 sfGFP 융합 단백질(N-말단 헥사히스티딘 태그 다음에 rcSso7d 또는 아피바디 및 sfGFP로 구성됨)으로 표현되었다. 융합 단백질의 구조에 대한 개략도는 도 14g에 나타나 있다. 아피바디-기반 결합제 zHER2의 상이한 돌연변이체를 도 14g에 표시된 것과 동일한 방식으로 sfGFP에 융합시켰다. sfGFP 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Addgene (플라스미드 #54737)에서 얻었다. 간단히 말해서, 대장균(Escherichia coli) 세포 (Tuner DE3)를 열 충격 형질 전환을 사용하여 서열-검증된 플라스미드로 형질 전환시켰다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 배양 물을 카나마이신(50 μg/mL)이 보충된 TB 배지(12g/L 트립톤, 24g/L 효모 추출물, 4% 글리세롤, 2.31g/L KH₂PO₄ 및 16.43g/L K₂HPO₄ * 3H₂O)에서 1:100으로 희석했고 37℃에서 진탕(shaking)하면서 배양했다. 배양이 대략 2의 A₆₀₀에 도달했을 때, 1mM의 IPTG를 첨가하여 트랜스진의 발현을 유도하고 세포를 20℃에서 밤새 더 배양하였다. 세포를 원심 분리(5000g, 20분, 4℃)로 수확하고, 초음파 처리 버퍼 (50mM 소듐 포스페이트, 300mM NaCl, 3% 글리세롤, 1% Triton X-100, pH 8.0)에 재현탁하고, 초음파 처리하고(2x 90초, 듀티 사이클 50%, 진폭은 5로 설정) 다시 원심분리하여 세포 잔해물을 제거했다. TALON 금속 친화성 수지를 사용하여 조세포 추출물에서 헥사히스티딘 태그가 붙은 융합 단백질을 정제하였다. 10mM 이미다졸을 첨가한 후, 초음파 처리된 상청액을 수지에 두 번 적용한 다음, 증가량의 이미다졸(5 - 15mM)을 사용하여 평형 버퍼 (50mM 소듐 포스페이트, 300mM NaCl, pH 8.0)로 세척 단계를 수행했다. 결합 스캐폴드는 250mM 이미다졸이 보충된 평형 버퍼를 적용하여 용출되었다. Amicon Ultra-15 10K 원심분리 필터를 사용하여 PBS로 버퍼를 교환한 후, 각각의 몰 흡수 계수를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하고 마지막으로 단백질을 -80℃에서 직접 동결했다.

표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 결합 친화성 측정:

SPR 실험은 Biacore T200 기기로 수행되었다. 모든 실험은 25℃에서 0.1% BSA 및 0.05% Tween-20 (Merck Millipore)을 함유하는 탈기(degassed) 및 여과된 PBS, pH 7.4에서 수행되었다. hHER2-Fc (R&D)는 4 μg/mL 농도에서 60초 동안 10 μL/min의 유속으로 Protein A 센서 칩에 고정되었다. 아피바디-기반 항원 결합 모이어티의 친화성을 측정하기 위해, 각 단백질의 5가지 농도 (항원 결합 모이어티의 예상 K_d에 따름)를 단일-주기 운동 모드에서 15초(zHER2-R10A 및 zHER2 -R32A) 또는 60초(zHER2-WT) 동안 30 μL/min의 유속으로 주입한 후, 해리 단계 (zHER2-R10A 및 zHER2-R32A의 경우 60초, zHER2-WT의 경우 180초)를 수행했다. 재생은 10mM 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하여 30μL/min의 유속으로 30초 동안 수행되었다. K_d는 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 곡선 피팅으로 얻었다.

실시예 5: 결합능이 약물 투여에 의해 제어될 수 있는 CAR 그룹을 발현하는 안정적으로 형질 도입된 T 세포로 종양 보유 마우스의 치료

실시예 5에서 발명자들은 면역 결핍 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WJI/SzJ (NSG) 마우스가 있는 백혈병 모델에서 종양 성장이 조절 분자의 부재가 아닌 존재 하에 저친화성 CAR “S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” (SEQ ID NO: 46)를 발현하는 렌티 바이러스로 형질 도입된 T 세포에 의해 효율적으로 억제될 수 있음을 보여준다. 현재 생체 내 장기(long-term) 실험에 적합한 조건부 이종이량체화에 사용할 수 있는 시스템이 없기 때문에, 발명자들은 CAR 분자의 결합력 조절로 T 세포의 기능을 조절하는 생체 내 개념 증명을 입증하기 위해 동종이량체화를 위한 FKBP-기반 시스템을 사용했다. 이것은 단일특이적(monospecific) 저친화성 CAR "S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z"이 이의 복합체, 즉 이량체 상태에서 2가 항-EGFR/EGFR-CAR를 나타내고 원칙적으로 이중 양성 표적 세포 (즉, 2가 상호 작용)를 인식하는 항-EGFR/HER2-CAR과 비교된다는 결론에 기반한다.

생체 내 모델의 경우 생체 발광(bioluminescence) 이미징을 사용하여 종양 성장의 생체 내 정량화를 위해 tEGFR (약 1x106 tEGFR 분자/세포) 및 반딧불이 루시페라아제의 고 발현을 위한 벡터로 형질도입된 B-ALL 세포주 Nalm6을 사용했다. 0.5x106 Nalm6-tEGFR-fLuc 세포를 NSG 마우스에 정맥 내 (i.v.) 주사하면 처리되지 않은 마우스에서 지수적인 종양 성장이 발생했다. 그러나 도 6a는 NSG 마우스에서 이 세포주의 성장이 항-CD19 CAR CD19-8cys-BB-3z (SEQ ID NO: 60) 또는 고친화성 항-EGFR CAR "S(WT)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z" (SEQ ID NO: 49)을 발현하는 10x10⁶ T 세포가 종양 세포 주사 후 3일 후에 정맥 내 주사된 경우 효율적으로 억제되었음을 보여준다. 중요하게도, 저친화성 EGFR-CAR “S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z” (SEQ ID NO: 46)를 가진 T 세포는 백혈병 발생을 억제했지만 동종이량체 AP20187, 즉, 조절 분자는 정기적으로 투여되었으며 (도 6a), CAR S(G32A)-ser8-BB-FKBP(36V)-3z는 이량체 상태에서만 완전히 활성임을 입증한다 (즉, CAR의 복합 그룹 = ON-상태). 이량체화제가 없는 경우 (즉, 비-복합 CAR = OFF-상태) 중간 정도의 성장 억제만 관찰했다 (도 6a). 이량체화제, 즉, 조절 분자가 T 세포 주입 11일 후에 이 후자의 마우스 그룹에 투여되었을 때, CAR 분자의 촉발된 복합체화는 2마리 마우스에서 종양 부담을 강하게 감소시키고, 다른 3마리 마우스에서 중간 정도의 억제를 초래하였다(도 6b).

함께, 이러한 생체 내 실험은 발명자들의 시험관 내 데이터를 확인하고, 저친화성 항원 결합 모이어티를 가진 CAR 분자를 발현하는 세포가 CAR 분자가 CAR 그룹으로 복합체화 (즉, 어셈블링)되어 결합능을 초래하는 경우에만 효율적으로 촉발됨을 보여준다.

CAR의 발현은 rcSso7-기반 CAR의 경우 항-Strep II 태그 항체로, CD19-특이적 CAR의 경우 단백질 L로 검출되었습니다 (각각 도 7a 및 7b). 시험관 내 기능적 특성화를 위해, CAR T 세포는 EGFR ("Nalm6-fLuc")을 발현하지 않거나 높은 수준의 EGFR ("Nalm6-tEGFR-fLuc")을 발현하지 않는 Nalm6 세포와 10:1의 E:T 비율로 37℃에서 4시간 동안 공동-배양되었다 (도 7e 및 7f). CAR 동종이량체화는 표적 세포와 공동-배양하기 전에 T 세포에 10 nM AP20187을 첨가하여 유도되었다. 비이클 제어 DMSO의 추가가 대조군 역할을 했다. 도 7c 및 7d는 각각 Nalm6-fLuc 또는 Nalm6-EGFR-fLuc 세포와 공동-배양된 CAR T 세포의 세포 용해 능력을 보여준다.

인간 세포주의 유지:

1 차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3^pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1 차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14 일 동안 배양되었다. 1 차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14 일 동안 배양되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

T 세포 및 세포주의 형질 도입:

범친화성 VSV-G 슈도타입 렌티바이러스(pantropic VSV-G pseudotyped lentivirus)의 바이러스 생산은 3세대 퓨로마이신-선택가능(selectable) pCDH 트랜스진 벡터 및 2세대 바이러스 패키징 플라스미드 pMD2.G 및 psPAX2(둘 다 Addgene, 플라스미드 #12259 및 #12260에서 각각 획득)로 Lenti-X 293T 세포(Clontech Laboratories)에서 수행되었다. 공동-형질 주입은 제조업체의 지침에 따라 Purefection 형질 주입 시약을 사용하여 수행되었다. 형질 주입 1일 및 2일 후 상청액을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 Lenti-X 농축기를 사용하여 농축했다.

렌티 바이러스 형질 도입 24 시간 전에 제조업체의 지침에 따라, 항-CD3/28 비드를 사용하여 1 차 T 세포를 활성화했다. 제조업체의 지침에 따라, 세포 배양 플레이트를 RetroNectin으로 코팅하여 렌티 바이러스와 1 차 T 세포의 공동-국소화를 촉진했다. 세포를 농축된 렌티 바이러스 상청액에 하루 동안 노출시킨 후 바이러스 입자를 제거했다. 3일 후, T 세포를 1 μg/mL 퓨로마이신으로 처리하여 트랜스진의 높고 균일한 발현을 보장했다. T 세포는 2% Octaplas, 1% L-글루타민, 2.5% HEPES 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2이 보충된 AIM-V 로 구성된 T 세포 형질 도입 배지에서 증식되었다.

형질 도입 시점에서 지수 세포 성장을 보장하기 위해 렌티 바이러스 형질 도입 24시간 전에 세포주를 분할하였다. 세포는 하루 동안 다양한 농도의 렌티 바이러스 상청액에 노출되었다. 퓨로마이신 선택은 비-형질 도입 세포를 제외하기 위해 1 내지 8 μg/mL의 농도로 형질 도입 3일 후에 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축:

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSso7d 변이체 E11.4.1-G32A, Strep II 태그 (NWSHPQFEK), 가요성 G₄S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 이량체화 도메인 FKBP F36V 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. GM-CSF-Ra 신호 펩티드 및 항-인간 CD19 scFv FMC63을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GenScript에 의해 합성되었다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4℃에서 25분 동안 각각의 1차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 항-Strep II 태그 항체 (클론 5A9F9, Genscript)를 사용하거나 CD19-BBz CAR의 경우 1 차 항체 및 PE- 또는 APC-접합 2차 항체로 단백질 L을 사용하여 Strep II 태그를 통해 검출되었다. 발현 EGFR은 PE-접합된 항-EGFR 항체 (클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

루시페라아제 기반 세포 독성 분석:

루시페라아제-발현 종양 세포를 페놀이 없는 RPMI, 10% FCS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성된 세포 독성 분석 배지에서 37 ℃에서 4시간 동안 흰색 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 10,000개의 표적 세포/웰로 2:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양하였다. 마지막으로, 남은 살아있는 세포는 공동-배양의 잔류 루시페라아제 활성을 측정하여 정량화되었다. 10분 동안 실온과 평형을 이룬 후, 루시페린을 세포 현탁액 (150 μg/mL 최종 농도)에 첨가하고 20분 후에 ENSPIRE Multimode plate reader를 사용하여 루시페라아제 활성을 측정했다. 특이적 용해의 백분율은 다음 식으로 측정되었다:

% 특이적 용해 = 100 - ((이펙터와 표적 세포 공동-배양 웰의 RLU)/(표적 세포만 있는 웰의 RLU) x 100)).

트랜스진의 시험관 내 이량체화:

트랜스진의 이량체화는 공동-배양 실험 전에 유도되었다. 1차 T 세포는 각 세포 배양 배지에서 최종 세포 농도로 희석되었다. 동종이량체화제 AP20187을 세포 배양 배지에 희석하고 10 nM 최종 농도로 첨가했다. 동일한 농도에서 각각의 비이클 제어 DMSO를 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 트랜스진의 효율적인 이량체화를 확실히 하기 위해 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하고 이어서 시험관 내 실험에 사용했다.

생체 내 표적 세포 사멸:

NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1WJI /SzJ (NSG) 마우스는 동물 육종을 위해 Anna Spiegel 시설에 보관되었다. 후속 실험을 위해 마우스는 비엔나 의과 대학의 전임상 연구 실험실 (PIL)로 옮겨졌다. 모든 절차는 비엔나 Magistratsabteilung 58에 의해 승인된 대로 (GZ: 813267/2015/24) 수행되었다.

1차 T 세포는 "T 세포 및 세포주의 형질도입"에 묘사된 프로토콜을 사용하여 CD19-특이적 대조군 CAR (CD19-BBz), EGFR-특이적 고친화성 및 저친화성 CAR (각각 "E11.4.1-WT"및 "E11.4.1-G32A")을 발현하도록 조작되었다. 형질도입 후, CAR T 세포는 충분한 세포 수를 생성하기 위해 생체 내 실험 전에 14 일 이상 동안 증식되었다.

동종이량화제 AP20187 (Clontech Laboratories)은 제조업체의 지침에 따라 비이클 용액에 용해되었다. 간단히 말해서, AP20187은 처음에는 철저한 와류로 에탄올에 12.5mg/mL의 농도로 용해되었다. 이어서 화합물을 물에서 PEG-400 (Sigma Aldrich) 및 Tween-80 (Sigma Aldrich)의 적절한 혼합물을 사용하여 0.5 mg/mL의 최종 작업 농도로 희석시켰다. 생성된 비이클 용액은 주사용 증류수에 4% 에탄올, 10% PEG-400 및 1.7% Tween-80으로 구성되었다. AP20187의 작업 스톡은 주사 직전에 준비하고 멸균-여과하여 30분 이내에 사용했다.

높은 수준의 tEGFR-FKBP 및 fLuc ("Nalm6-tEGFR-fLuc")를 발현하도록 조작된 Nalm6 세포를 PBS에 재현탁하고 35 μm 세포 여과기(Corning Falcon)를 통해 여과하고 최종 농도를 5x10⁶/mL로 설정했다. 0.5x10⁶ 개의 세포를 각 NSG 마우스 (수컷 및 암컷 마우스의 혼합, Jackson Laboratory)의 꼬리-정맥에 정맥 내 (i.v.) 주사했다. 3일 후, 마우스를 각각의 CAR T 세포 (꼬리-정맥 내로 10x10⁶ CAR T 세포 i.v.)로 처리한 후, 복강 내 (i.p.) 주사를 사용하여 동종이량체 제제 AP20187 (2 mg/kg 용량) 또는 비이클 대조군을 주사했다. 이량체화 제제 AP20187 (2mg/kg) 또는 비이클 대조군은 지시된 경우 0일 (T 세포 주사 직후), 1일, 2일, 4일, 7일, 9일 및 11일에 투여되었다. 모든 대조군 조건은 각각의 비이클 대조군 (주사용 증류수 중 4% 에탄올, 10% PEG-400 및 1.7% Tween-80)으로 처리되었다. 종양 성장 및 제어는 생물 발광 이미징 (BLI)에 의해 모니터링 되었다. 마우스는 실험이 끝날 때 경추 탈구에 의해 희생되었다.

생물 발광 이미징 (BLI):

종양 성장의 BLI 이미징은 IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer)을 사용하여 비엔나 의과 대학의 전임상 연구 실험실 (PIL)에서 수행되었다. D-루시페린 기질 (Perkin Elmer)을 PBS에 최종 농도 15mg/mL로 용해시키고 멸균 여과하였다. 마우스를 이소플루란으로 마취하고, 루시페린 작업 스톡을 복강 내(i.p.) 주사했다 (최종 투여량 150mg/kg 체중). 15-20분 후, 1-3 마리의 마우스를 IVIS 이미징 시스템으로 옮기고, 1 초에서 2 분의 획득 시간에 중간 비닝(binning) 모드에서 생물 발광을 측정하여 불포화 이미지를 얻었다. 루시페라아제 활성은 Living Image Software (Caliper)로 분석되었고 광자 플럭스는 마우스 몸 전체를 포함하는 관심 영역 내에서 측정되었다.

실시예 6: VEGF에 의한 CAR 그룹의 항원항체결합력 조절

6번째 실시예는 세포 외 가용성 인자에 의해 복합체를 형성할 수 있는 CAR 그룹을 생성하는 전략을 보여주며, 이 경우 본 발명에 따른 조절 분자 역할을 한다. 나타낸 실시예에서 VEGF는 CAR S(G32A)-J.CT6-8ser-BB-3z (SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67)의 동종이량체화를 위한 잠재적인 이량체화 제제(즉, 조절 분자)로 사용되었다.

이를 위해, 조작된 CH2-CH3-IgG1-Fc 도메인을 CAR 분자의 엑토도메인 (SEQ ID NO: 67)에 통합하고 VEGF에 대한 고친화성 결합을 위해 조작되었으며(Lobner et al., MAbs. 2017;9(7):1088-1104) CAR 분자의 엑토도메인에 있는 CH2-CH3-Fc 도메인과의 이황화 가교 형성을 통해 공유적으로 이종이량체화되는 CH2-CH3-Fc 도메인 "Janus CT6" (SEQ ID NO: 66)을 포함하는 가용성 구조물과 공동-발현했다. 두 구조물의 CH2-CH3 도메인은 동종이량체화를 최소화하기 위해 조작되었다 (Lobner et al., MAbs. 2017;9(7):1088-1104). 주어진 예에서 E11.4.1-G32A는 협동 결합에 대한 의존성으로 인해 항원 결합 모이어티로 사용되었다. 도 8a는 2개의 구조물 (SEQ ID NO: 66 및 SEQ ID NO: 67)을 포함하는 VEGF-의존성 EGFR-특이적 CAR의 개략도를 나타내고, 도 8b는 VEGF의 첨가 효과를 나타낸다. Jurkat T 세포는 tEGFR에 대해 5 μg mRNA로 전기천공되었고 발현은 전기천공 20시간 후에 검출되었다 (도 8c). 1 차 인간 T 세포는 각 구조물에 대해 5 μg mRNA로 전기천공되었다. T 세포는 이어 Janus-CT6-Fc 도메인에 융합되고 막관통 도메인(SEQ ID NO: 66)을 포함하지 않는 저친화성 E11.4.1-G32A 결합 모이어티를 포함하는 구조물과 결합하는 단량체성 2세대 CAR 신호전달 백본 (SEQ ID NO: 67)을 포함하는 CAR 분자를 발현시켰다. 2개의 구조물을 발현하는 CAR T 세포 (도 8d)를 다양한 양의 VEGF로 처리하고 높은 수준의 tEGFR을 발현하는 Jurkat T 세포와 공동-배양하였다 (도 8c). 도 8e는 FACS-기반 세포 독성 분석을 사용하여 측정된 세포 독성을 촉발하는 능력을 나타낸다. 도 8e는 CAR 그룹이 VEGF(즉, 조절 분자)-의존 방식으로 표적 세포에 대한 T 세포 세포 독성을 촉발했음을 나타낸다. 이는 VEGF와 같은 세포 외 가용성 인자가 조절 분자로 작용하여, 본 발명에 따른 CAR 그룹의 복합체화를 촉진할 수 있음을 입증한다.

인간 세포주의 유지:

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3^pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS(Sigma Aldrich) 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사로부터 기증받았으며, 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4 ℃에서 25분 동안 각각의 1 차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4 ℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 항-Strep II 태그 항체 (클론 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 또는 비오틴화 항-인간-IgG1-항체(클론 JDC-10, Biozol)를 사용하는 Fc 도메인을 1차 항체로 및 2차 염색 시약으로 PE-접합된 스트렙타비딘을 사용하여 검출되었다. 조작된 표적 항원 tEGFR의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EGFR 항체 (클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축:

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSso7d 변이체 E11.4.1-G32A, Strep II 태그 (NWSHPQFEK), 가요성 G₄S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. CH2-CH3-Fc 도메인 "Janus CT6" 및 돌연변이된 "WT" CH2-CH3-Fc 도메인을 포함하는 플라스미드는 비엔나의 천연 자원 및 생명 과학 대학의 Elisabeth Lobner로부터 친절하게 기증받았다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리 (5분, 1600rpm, 4℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

VEGF의 재조합 발현 및 정제:

절단된 형태의 인간 VEGF의 재조합 발현은 이전에 (Lobner et al., MAbs. 2017; 9 (7): 1088-1104)에 의해 설명되었다.

실시예 7: EGFR 및 HER2에 대해 지시되고 조절 분자에 의해 제어될 수 있는 CAR 그룹의 생성

실시예 7에서, 발명자들은 조절 분자 AP21967에 의해 조건부로 복합체화될 수 있고 표적 세포에서 EGFR 및 HER2의 조합된 발현의 특이적 인식을 허용하는 CAR 그룹을 생성하기 위한 전략을 예시했다. 이러한 목적을 위해, 발명자들은 2개의 상이한 단일 도메인 결합 스캐폴드, 즉 rcSso7d 기반 EGFR-특이적 항원 결합 모이어티 E11.4.1(Traxlmayr et al., J Biol Chem. 2016;291(43):22496-22508) 및 아피바디-기반 HER2-특이적 항원 결합 모이어티(Wikman et al., Protein Eng Des Sel. 2004;17(5):455-462)의 저친화성 돌연변이체를 이종이량체화 도메인 FKBP 또는 FRB를 포함하는 2세대 신호전달 백본, 즉 각각 “S(G32A)-8ser-BB-FKBP-3z” (SEQ ID NO: 48) 및 “A(R10A)-ser8-BB-FRB-3z” (SEQ ID NO: 54)에 이식하였다(도 9a). 또한, 발명자들은 두 결합 모이어티가 단일 CAR 분자 "A(R10A)-S(G32A)-8ser-BB-FKBP(36V)-3z"(SEQ ID NO: 71)의 엑토도메인에 직렬로 통합된 (가요성 2xG₄S-링커로 분리됨) 탠덤(Tandem)-CAR를 생성했다(도 9b). 1차 T 세포는 각 구조물에 대해 5μg으로 전기천공되었고 발현은 전기천공 후 20시간 후에 검출되었다 (도 9c 및 도 9d). tEGFR의 경우 5μg mRNA, tHER2의 경우 5μg mRNA 또는 두 구조물의 5μg로 전기천공된 Jurkat T 세포를 표적 세포로 사용했다. 도 9e 및 도 9f는 전기천공 20 시간 후 Jurkat T 세포에서 두 트랜스진의 발현을 도시한다. 37 ℃ 및 4:1:1의 E:T 비율에서 4시간 동안 공동-배양한 후, FACS-기반 세포 독성 분석을 사용하여 세포 독성을 촉발하는 능력을 측정했다. 도 9g는 각각 EGFR 및 HER2에 특이적인 2개의 CAR 분자를 발현하는 1차 T 세포가 AP21967에 의해 복합체화 될 때 tEGFR 및 tHER2를 발현하는 Jurkat T 세포에서 세포 사멸을 효율적으로 촉발할 수 있지만 두 표적 항원 중 단지 하나만 발현하는 Jurkat 세포에서는 그렇지 않음을 나타낸다. AP21967이 없는 경우, 즉 비-복합체화 상태에서, CAR 그룹은 이중 양성 표적 세포에 대한 반응으로도 비활성이었다. 탠덤-CAR은 양성 표적 세포를 두 배로 늘리는 중간 정도의 활성을 나타냈으며 AP21967의 존재에 의존하지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 본 발명에 따른 CAR의 비공유 복합체 그룹이 표적 세포에서 항원-조합을 특이 적으로 인식함을 확인한다. 더욱이, 이들 데이터는 또한 CAR 그룹의 활성이 조건부 이종이량체화에 의해 임의로 조절될 수 있음을 나타낸다.

인간 세포주의 유지:

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3^pos T 세포를 농축했이다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO(Sigma Aldrich)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드(Thermo Scientific)로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2(Peprotech)로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사의 선물이었으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공:

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 각 세포 유형에 대해 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석:

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4 ℃에서 25분 동안 각각의 1차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 항-Strep II 태그 항체(clone 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 통해 또는 항-FLAG 항체(clone L5, BioLegend)를 1차 항체 및 PE- 또는 APC- 접합된 2차 항체(eBioscience)로 사용하는 FLAG 태그를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tEGFR 및 tHER2의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EGFR 항체(clone AY13, BioLegend) 또는 PE-접합된 항-HER2 항체 (clone 24D2, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축:

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSsso7d 변이체 E11.4.1-G32A, 저친화성 아피바디 변이체 zHER2-R10A, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 이량체화 도메인 FKBP F36V 및 FRB 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. 이량체화 도메인 FKBP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genscript에 의해 합성되었다. EGFR 및 HER2의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (각각 플라스미드 #11011 및 #16257)에서 얻었다. 가요성 링커, FLAG 태그 및 Strep II 태그는 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 삽입되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs)를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리 (5분, 1600rpm, 4℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 공식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

트랜스진의 시험관 내 이량체화:

트랜스진의 이량체화는 공동-배양 실험 전에 유도되었다. 1차 T 세포 및 Jurkat T 세포는 각 세포 배양 배지에서 최종 세포 농도로 희석되었다. 이종이량체화 제제 AP21967(Clontech Laboratories)을 세포 배양 배지에 희석하고 500 nM 농도로 첨가했다. 대조군 조건은 동일한 농도의 에탄올로 처리되었다(비이클 제어). 트랜스진의 효율적인 이량체화를 확실히 하기 위해 세포를 37℃에서 30분 동안 배양하 시험관 내 실험에 사용했다.

실시예 8: 3 개 또는 4 개의 CAR 분자를 포함하는 CAR 그룹의 생성

2개의 직교 이량체화 플랫폼(AP21967를 사용하는 FKBP/FRB; AP20187를 사용하는 FKBP F36V/FKBP F36V)과 저친화성 항원 결합 모이어티 E11.4.1-G32A를 사용하여, 발명자들은 복합 상태의 3개(두 개의 구조물 (SEQ ID NO: 69) 및 (SEQ ID NO: 48)을 포함함) 또는 4개의 CAR 분자(두 개의 구조물 (SEQ ID NO: 70) 및 (SEQ ID NO: 48)을 포함함)를 포함하는 조건부 활성 CAR 그룹을 생성하는 전략을 예시한다. 도 10a 및 도 10b는 각각 삼량체 및 사량체 CAR의 개략도를 나타낸다. Jurkat T 세포를 CAR의 삼량체 또는 사량체 그룹의 두 개의 분리된 사슬을 코딩하는 5μg의 mRNA로 전기천공하고, CAR 발현은 각각의 신호전달 사슬에 따라 Strep II 태그 또는 FLAG 태그를 통해 전기천공 20시간 후에 검출되었다. 도 10C는 CAR의 삼량체 및 사량체 그룹의 발현을 나타낸다. 본 실시예에서 CAR 그룹은 EGFR에 대해서만 지시되었다. 본 발명에 따른 CAR 그룹에서, CAR의 복합체 그룹 내의 모든 CAR 분자는 상이한 표적 항원에 대해 지시된다.

인간 세포주의 유지

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3^pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3^pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. NF-κB-의존성 eGFP 유전자 및 NF-AT-의존성 CFP 유전자로 조작된 Jurkat T 리포터 세포주는 비엔나 의과 대학의 Peter Steinberger 박사로부터 친절하게 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지된다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석

1차 인간 T 세포 및 Jurkat T 세포를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4 ℃에서 25 분 동안 각각의 1차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4 ℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 1차 항체로 항-Strep II 태그 항체(클론 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 통해 또는 항-FLAG 태그 항체(클론 L5, BioLegend) 를 사용하는 FLAG 태그를 통해 검출되었고 항-Strep II 태그 항체의 경우 PE- 또는 APC-접합된 2차 항체를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tHER2의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EFGR 항체 (클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSso7d 변이체 E11.4.1-G32A, Strep II 태그, 가요성 G₄S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 이량체화 도메인 FKBP F36V 및 FRB 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. 이량체화 도메인 FKBP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Genscript에 의해 합성되었다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. 가요성 링커와 FLAG 태그는 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 삽입되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

Jurkat T 리포터 세포주에 의한 전사 인자 활성 측정

Jurkat T 리포터 세포주는 동일한 웰 내에서 각각의 종양 항원을 발현하는 Jurkat T 리포터 세포 및 Jurkat T 표적 세포의 효율적인 분화를 가능하게 하기 위해 별개의 형광 단백질로 구별되어 표지된다. 적합한 형광 단백질은 dKeima (Addgene #54618), mAmetrine (Addgene #54505) 또는 리포터 단백질에 대한 최소 혼선(cross-talk)을 갖는 유사한 단백질일 수 있다. 각각의 CAR을 발현하는 Jurkat T 리포터 세포에서 전사 인자 NFAT 및 NFκB의 활성은 0.25:1, 0.5:1, 1:1 또는 2:1의 E:T 비율로 37 ℃에서 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 표적 세포와의 공동-배양에 의해 평가된다. BD LSRFortessa를 사용하여 세포를 획득하고 Jurkat T 리포터 세포의 활성화는 각 리포터 단백질의 형광 강도의 기하학적 평균 또는 리포터 단백질 양성 세포의 백분율을 측정하여 검출된다.

트랜스진의 시험관 내 이량체화

트랜스진의 이량체화는 공동-배양 실험 전에 유도되었다. 1차 T 세포 및 Jurkat T 세포는 각 세포 배양 배지에서 최종 세포 농도로 희석되었다. 동종이량체화 제제 AP20187 및 이종이량체화 제제 AP21967을 세포 배양 배지에 희석하고 각각 10 nM 및 500nM 최종 농도로 첨가했다. 동일한 농도에서 각각의 비이클 제어 DMSO 또는 에탄올을 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 세포를 37 ℃에서 30분 동안 배양하여 트랜스진의 효율적인 이량체화를 보장하고, 이어서 시험관 내 실험에 사용했다.

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고, 37℃에서 4시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리 (5분, 1600rpm, 4 ℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 공식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

실시예 9: 구성적 복합체 형성을 위한 이종이량체화 도메인을 포함하는 CAR 그룹의 생성

이종이량체화하는 류신 지퍼(Moll et al., Protein Sci. 2001;10(3):649-655) 및 저친화성 항원 결합 모이어티 E11.4.1-G32A 및 zHER2-R10A를 사용하여, 발명자들은 조절 분자의 존재와 무관하게 효율적으로 이종이량체화 할 수 있는 도메인을 포함하는 CAR 분자에 의해 형성된 CAR 그룹을 생성하기 위한 전략을 예시한다. 도 11a는 구조물 S(G32A)-8Ser-BB-RR-3z (SEQ ID NO: 72) 및 A(R10A)-8ser-BB-EE-3z (SEQ ID NO: 73)를 포함하는 CAR 그룹의 개략도를 나타낸다. Jurkat T 리포터 세포 및 1차 T 세포는 2개의 개별 CAR 분자를 코딩하는 5 μg mRNA로 전기천공되었고, CAR 발현은 Strep II 태그 또는 FLAG 태그를 통해 전기천공 20시간 후에 검출되었다 (그림 11B-E에 나타냄). 도 11f는 EGFR 및 HER2의 조합된 인식을 위해 CAR의 이 그룹을 발현하는 1차 인간 T 세포가 EGFR 또는 HER2만을 발현하는 동일한 유형의 표적 세포(즉, Jurkat 세포)에 비해 두 표적 항원 (즉, EGFR 및 HER2)을 발현하는 표적 세포에서 세포 사멸을 더 효율적으로 유도할 수 있음을 입증한다.

인간 세포주의 유지

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사로부터 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. NFκB-의존성 eGFP 유전자 및 NFAT-의존성 CFP 유전자로 조작된 Jurkat T 리포터 세포주는 비엔나 의과 대학의 Peter Steinberger 박사로부터 친절하게 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지된다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석

1차 인간 T 세포 또는 종양 세포주를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10% 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4 ℃에서 25 분 동안 각각의 1 차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4 ℃에서 25분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 항-Strep II 태그 항체의 경우, 항-Strep II 태그 항체(clone 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 통해 또는 항-FLAG 항체(clone L5, BioLegend)를 1차 항체 및 PE- 또는 APC- 접합된 2차 항체(eBioscience)로 사용하는 FLAG 태그를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tEGFR 및 tHER2의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EGFR 항체(clone AY13, BioLegend) 또는 PE-접합된 항-HER2 항체 (clone 24D2, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSso7d 변이체 E11.4.1-G32A, Strep II 태그, 가요성 G4S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. EE 및 RR 류신 지퍼를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 Biocat에 의해 합성되었다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. 가요성가요성 링커 및 FLAG 태그는 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 삽입되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고 37℃에서 4 시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리 (5분, 1600rpm, 4 ℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 공식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

실시예 10: CAR 분자의 공동-자극 신호전달 영역에 상이한 공동-자극 도메인을 포함하는 CAR 그룹의 생성

지난 20년 동안 다른 공동-자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR 분자가 T 세포를 효율적으로 활성화할 수 있다는 것이 입증되었다. 실시예 10은 그들의 공동-자극 신호전달 영역에 상이한 공동-자극 도메인을 포함하는 CAR 분자가 또한 표적 항원과의 1가 및 다가 상호작용을 구별하기 위해 본 발명의 CAR 그룹의 맥락에서 작동함을 나타낸다. 도 12a는 공동-자극 신호전달 영역에 CD28 또는 ICOS 또는 OX40을 포함하는FGFR-특이적 CAR 분자 S(G32A)-8ser-28-FKBP(36V)-3z (SEQ-ID NO: 74), S(G32A)-8ser-ICOS-FKBP(36V)-3z (SEQ-ID NO: 75) 및 S(G32A)-8ser-OX40-FKBP(36V)-3z (SEQ-ID NO: 76)의 구조를 나타낸다. Jurkat 세포 및 1차 인간 T 세포에서 이들 CAR 분자의 발현은 각각 도 12b 및 c에 예시되어 있다. 발현은 각각의 mRNA 5 μg의 전기천공 20시간 후에 통합된 Strep II 태그를 통해 유세포 분석으로 분석되었다. Jurkat 세포에서 프로모터 NF-κB 및 NF-AT를 활성화하고 1차 인간 T 세포에서 세포 독성 이펙터 기능을 촉발하는 비-복합 (즉, 1가) 및 복합 (즉, 2가) 상태의 CAR 분자의 능력이 도 12d 및 e에 나타나있다. 도 12D는 S(G32A)-8ser-OX40-FKBP(36V)-3z가 NF-κB 및 NF-AT 리포터로 안정적으로 형질 도입된 Jurkat 세포에서 발현될 때, 조절 분자 AP20187에 의해 CAR의 2가 그룹으로 복합화 되고 복합화되지 않은 1가 상태가 아닐 때 NF-κB 및 NF-AT를 효율적으로 촉발할 수 있음을 예시한다. 유사하게, 특이적 용해는 CAR 분자가 AP20187에 의해 각각 CAR 그룹으로 복합화되는 경우에만(도 12e) CAR 분자 S(G32A)-8ser-ICOS-FKBP(36V)-3z 및 S(G32A)-8ser-OX40-FKBP(36V)-3z에 의해 1차 인간 T 세포에서 효율적으로 촉발되었다. 함께, 이것은 본 발명의 CAR 그룹의 CAR 분자의 공동-자극 신호전달 영역에서 공동-자극 도메인의 유형이 다양할 수 있음을 확인한다.

인간 세포주의 유지

1차 인간 T 세포는 채취 후 개인정보가 제거된 건강한 공여자의 혈액 (오스트리아, 비엔나, 오스트리아 적십자에서 온 버피 코트)에서 채취했다. RosetteSep 인간 T 세포 Enrichment Cocktail(STEMCELL Technologies)을 사용하여 음성 선택에 의해 CD3pos T 세포를 농축했다. 분리 및 정제된 T 세포는 사용하기 전까지 20% FCS 및 10% DMSO가 보충된 RPMI-1640 배지에서 냉동 보존되었다. CD3pos T 세포는 제조업체의 지침에 따라 항-CD3/CD28 비드로 활성화되었고, 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 200 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 RPMI-1640으로 구성된 인간 T 세포 배지에서 증식되었다. 1차 T 세포는 실험이 수행되기 전에 적어도 14일 동안 배양되었다. Jurkat T 세포는 CCRI의 Sabine Strehl 박사로부터 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. NFκB-의존성 eGFP 유전자 및 NFAT-의존성 CFP 유전자로 조작된 Jurkat T 리포터 세포주는 비엔나 의과 대학의 Peter Steinberger 박사로부터 친절하게 기증받았으며 10% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640에서 유지된다. 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 정기적으로 테스트되었으며 인증은 독일의 Multiplexion에서 수행되었다. 세포 밀도는 AccuCheck 계수 비드로 모니터링되었다.

mRNA의 시험관 내 전사 및 전기천공

제조업체의 지침에 따라 mMessage mMachine T7 Ultra Kit를 사용하여 시험관 내 전사를 수행했다. 50-200 ng의 컬럼 정제된 PCR 산물을 반응 주형으로 사용했다. 생성된 mRNA는 RNeasy 컬럼 정제 키트를 사용하여 적응된 프로토콜로 정제되었다. 간단히 말해서, mRNA 용액은 RLT 버퍼, 에탄올 및 2-머캅토에탄올의 혼합물로 희석되었다. 혼합물을 RNeasy 컬럼에 로딩하고 제조업체의 지침에 따라 정제를 수행했다. 뉴클레아제가 없는 물로 용출을 수행하고 정제된 mRNA를 전기천공될 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. 일시적인 트랜스진 발현을 위해, 1차 T 세포 또는 Jurkat T 세포를 Gene Pulser (Biorad)를 사용하여 각 mRNA의 다양한 양으로 전기천공했다. 다음 프로토콜을 사용했다: 1차 T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 5ms 및 4mm 큐벳), Jurkat T 세포 (정방형파 프로토콜, 500V, 3ms 및 4mm 큐벳).

항체 및 유세포 분석

1차 인간 T 세포 및 Jurkat T 세포를 FACS 버퍼 (PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드)에 재현탁하고 10 % 인간 혈청으로 4 ℃에서 10분 동안 처리했다. 세포는 4 ℃에서 25분 동안 각각의 1차 항체로 염색되었다. 염색된 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척한 다음 4 ℃에서 25 분 동안 2차 항체로 염색하거나 BD LSRFortessa로 직접 처리했다. CAR 구조물의 발현은 1차 항체로 항-Strep II 태그 항체(클론 5A9F9, Genscript)를 사용하는 Strep II 태그를 통해 및 PE- 또는 APC-접합된 2차 항체를 통해 검출되었다. 조작된 표적 항원 tHER2의 발현은 PE- 또는 APC-접합된 항-EFGR 항체 (클론 AY13, BioLegend)로 검출되었다. FlowJo 소프트웨어에 의해 분석이 수행되었다.

트랜스진 구조물의 구축

CD33 신호 펩티드, 저친화성 rcSso7d 변이체 E11.4.1-G32A, Strep II 태그, 가요성 G4S 링커, 인간 단량체 CD8α 힌지 (UniProt ID P01732, C164S 및 C181S) 및 CD8α 막관통 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 이량체화 도메인 FKBP F36V 및 CD3ζ ITAM 신호전달 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 GeneArt (Thermo Scientific)에 의해 합성되었다. CD28, ICOS 및 OX40의 세포 내 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 cDNA 클론 (Sino Biological)에서 유래되었다. EGFR의 세포 외 및 막관통 도메인을 코딩하는 서열은 Addgene (플라스미드 #11011)에서 얻었다. 가요성 링커는 각각의 PCR 프라이머를 사용하여 삽입되었다. 뉴클레오티드 서열을 기능적 트랜스진으로 어셈블링하는 것은 제조업체의 지침에 따라 Gibson Assembly Master Mix를 사용하여 수행되었다. 개략도와 서열은 각각 도 14 및 15에 나타나 있다. 생성된 구조물은 PCR에 의해 증폭된 후 시험관 내 전사에 사용되었다.

Jurkat T 리포터 세포주에 의한 전사 인자 활성 측정

Jurkat T 리포터 세포주는 동일한 웰 내에서 각각의 종양 항원을 발현하는 Jurkat T 리포터 세포 및 Jurkat T 표적 세포의 효율적인 분화를 가능하게 하기 위해 별개의 형광 단백질로 구별되어 표지된다. 적합한 형광 단백질은 dKeima (Addgene #54618), mAmetrine (Addgene #54505) 또는 리포터 단백질에 대한 최소 혼선(cross-talk)을 갖는 유사한 단백질일 수 있다. 각각의 CAR을 발현하는 Jurkat T 리포터 세포에서 전사 인자 NFAT 및 NFκB의 활성은 0.25:1, 0.5:1, 1:1 또는 2:1의 E:T 비율로 37 ℃에서 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 표적 세포와의 공동-배양에 의해 평가된다. BD LSRFortessa를 사용하여 세포를 획득하고 Jurkat T 리포터 세포의 활성화는 각 리포터 단백질의 형광 강도의 기하학적 평균 또는 리포터 단백질 양성 세포의 백분율을 측정하여 검출된다.

FACS-기반 세포 독성 분석:

FACS-기반 세포 독성 분석을 위해 2개의 표적 세포 집단이 생성되었다: (i) eGFP를 코딩하는 mRNA 및 각각의 표적 항원을 코딩하는 RNA로 전기천공된 Jurkat 세포, 및 (ii) mCherry를 코딩하는 mRNA로만 전기천공된 Jurkat 세포. 이 두 집단을 1:1 비율로 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 둥근-바닥 96 웰 플레이트에서 20,000 개의 표적 세포/웰과 4:1:1의 E:T 세포 비율로 CAR T 세포와 공동-배양했다. CAR T 세포를 추가하지 않은 표적 세포는 대조군 조건으로 사용되었다 ("표적만"). 배양 기간 후, 공동-배양물을 원심 분리 (5분, 1600rpm, 4 ℃)하고, 이어 사이토카인 측정을 위해 상청액을 수집하고, 나머지 세포를 PBS, 0.2% 인간 알부민 및 0.02% 소듐 아지드로 구성된 100μL의 FACS 버퍼에 재현탁했다. BD LSRFortessa 유세포 분석기를 사용하여 표적 항원^pos 및 표적 항원^neg 세포 집단의 생존력을 측정하고 다음 식을 사용하여 특이적 용해를 계산했다:

% 특이적 용해 = (1-(((% 샘플의 eGFP^pos 세포)/(% 샘플의 mCherry^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 eGFP^pos 세포)/(% "표적만" 대조군의 mCherry^pos 세포))))*100.

따라서 본 발명은 다음의 바람직한 구현을 개시한다:

1. 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성되는 키메라 항원 수용체(CAR) 그룹으로서, 여기서 상기 CAR 그룹의 각 구성원은 아미노산 서열이 서로 상이하고,

여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자는 적어도 하나의 막관통 도메인 및 항원 결합 모이어티 또는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 상기 엑토도메인은 1개 또는 2개의 항원 결합 모이어티 및/또는 각각 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 1개 또는 2개의 결합 부위를 포함하고,

여기서 상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자는 추가적으로 적어도 하나의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 통해 신호를 전달할 수 있는 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함하는 엔도도메인을 포함하고,

여기서 각 CAR 분자가 엔도도메인을 포함하는 경우, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엔도도메인이 세포에서 발현되면, 세포막의 세포 내 측에 위치하며, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엑토도메인이 세포에서 발현되면, 세포막의 세포 외 측으로 전위되고, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 막관통 도메인이 세포에서 발현되는 경우, 세포막에 위치하고;

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엑토도메인은 일반적인(prevalent) 형태로 각각 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없고, 상기 그룹의 상이한 CAR 분자 및 상이한 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티는 서로 공유적으로 연결되지 않은 상이한 표적 항원에 대해 특이적이고,

여기서 각각의 표적 항원에 대한 상기 그룹의 CAR 분자의 친화성은 1 mM 내지 100 nM이고,

여기서 각각의 표적 항원에 대한 상기 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 각 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1 mM 내지 100 nM이고,

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자는 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 정의된 이종이량체화를 매개할 수 있는 적어도 하나의 이종이량체화 도메인을 포함하고, 여기서 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 이 이종이량체화는 조절 분자와 무관하게 발생하고, 또는 조절 분자의 부재 하에 발생하고, 조절 분자에 의해 감소되고, 또는 조절 분자에 의해 유도되고, 선택적으로 또 다른 조절 분자에 의해 감소되고, 여기서 조절 분자는 생리적 조건 하에서 한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 적어도 하나의 구성원에 결합할 수 있고, 이종이량체화를 유도하거나 감소시킴으로써 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR의 비공유 복합체 그룹의 형성을 유도하거나 감소시킬 수 있는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 그룹.

2. 구현 1에 있어서,

상기 항원 결합 모이어티는 단지 하나의 단백질 도메인을 포함하는, CAR 그룹.

3. 구현 1 또는 2에 있어서,

상기 항원 결합 모이어티는 단지 하나의 단백질 도메인을 포함하고, 인간 세포 표면에서 발현될 때 상기 그룹의 CAR 분자의 이량체화 또는 올리고머화를 유발하지 않으며, 여기서 상기 단백질 도메인은 바람직하게는 인간 또는 비-인간 VH 또는 VL 단일 도메인 항체(나노바디) 또는 포도상구균 단백질 A의 Z-도메인, 리포칼린, SH3 도메인, 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인, 노트틴, Sso7d, Sac7d, Gp2, DARPins, 유비퀴틴, 수용체, 수용체의 리간드 또는 공동-수용체를 기반으로 하는 조작된 항원 결합 모이어티로 구성된 그룹으로부터 선택되는, CAR 그룹.

4. 구현 1 내지 3 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 1mM 내지 150nM, 바람직하게는 1mM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 1mM 내지 300nM, 특히 1mM 내지 400nM이고, 그리고

여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1mM 내지 150nM, 바람직하게는 1mM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 1mM 내지 300nM, 특히 1mM 내지 400nM인, CAR 그룹.

5. 구현 1 내지 3 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500μM 내지 100nM, 바람직하게는 250μM 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 100nM, 특히 50μM 내지 100nM이고, 그리고

여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500μM 내지 100nM, 바람직하게는 250μM 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 100nM, 특히 50μM 내지 100nM인, CAR 그룹CAR 그룹.

6. 구현 1 내지 3 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500μM 내지 150nM, 바람직하게는 250μM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 300nM, 특히 50μM 내지 400nM이고, 그리고

여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500μM 내지 150nM, 바람직하게는 250μM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 300nM, 특히 50μM 내지 400nM인, CAR 그룹.

7. 구현 1 내지 6 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹 또는 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티에 의해 특이적으로 인식되는 상기 표적 항원은 자연 발생 세포 표면 항원 또는 자연 발생 세포 표면 항원에 결합된 폴리펩티드, 탄수화물 또는 지질인, CAR 그룹.

8. 구현 1 내지 7 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹 및 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티가 세포 상에 존재하는 적어도 2개의 상이한 표적 항원에 결합하고, 바람직하게는 고체 표면, 또는 지질 이중층 상의 세포의 적어도 2개의 상이한 표적 항원인, CAR 그룹.

9. 구현 1 내지 8 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹 또는 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티가 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 표적 항원은, 바람직하게는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD30, CD33, CD35, CD38, CD40, CD42c, CD43, CD44, CD44v6, CD47, CD49D, CD52, CD53, CD56, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD82, CD85A, CD85B, CD85D, CD85H, CD85K, CD96, CD107a, CD112, CD115, CD117, CD120b, CD123, CD146, CD148, CD155, CD185, CD200, CD204, CD221, CD271, CD276, CD279, CD280, CD281, CD301, CD312, CD353, CD362, BCMA, CD16V, CLL-1, Ig kappa, TRBC1, TRBC2, CKLF, CLEC2D, EMC10, EphA2, FR-a, FLT3LG, FLT3, Lewis-Y, HLA-G, ICAM5, IGHA1/IgA1, IL-1RAP, IL-17RE, IL-27RA, MILR1, MR1, PSCA, PTCRA, PODXL2, PTPRCAP, ULBP2, AJAP1, ASGR1, CADM1, CADM4, CDH15, CDH23, CDHR5, CELSR3, CSPG4, FAT4, GJA3, GJB2, GPC2, GPC3, IGSF9, LRFN4, LRRN6A/LINGO1, LRRC15, LRRC8E, LRIG1, LGR4, LYPD1, MARVELD2, MEGF10, MPZLI1, MTDH, PANX3, PCDHB6, PCDHB10, PCDHB12, PCDHB13, PCDHB18, PCDHGA3, PEP, SGCB, 베자틴(vezatin), DAGLB, SYT11, WFDC10A, ACVR2A, ACVR2B, 아나플라스틱 림포마 키나아제(anaplastic lymphoma kinase), 카데린(cadherin) 24, DLK1, GFRA2, GFRA3, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EFNB1, EPOR, FGFR2, FGFR4, GALR2, GLG1, GLP1R, HBEGF, IGF2R, UNC5C, VASN, DLL3, FZD10, KREMEN2, TMEM169, TMEM198, NRG1, TMEFF1, ADRA2C, CHRNA1, CHRNB4, CHRNA3, CHRNG, DRD4, GABRB3, GRIN3A, GRIN2C, GRIK4, HTR7, APT8B2, NKAIN1, NKAIN4, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1I, CACNG8, CACNG4, CLCN7, KCNA4, KCNG2, KCNN3, KCNQ2, KCNU1, PKD1L2, PKD2L1, SLC5A8, SLC6A2, SLC6A6, SLC6A11, SLC6A15, SLC7A1, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC9A1, SLC10A3, SLC10A4, SLC13A5, SLC16A8, SLC18A1, SLC18A3, SLC19A1, SLC26A10, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A5, SLC35E2, SLC38A6, SLC38A9, SLC39A7, SLC39A8, SLC43A3, TRPM4, TRPV4, TMEM16J, TMEM142B, ADORA2B, BAI1, EDG6, GPR1, GPR26, GPR34, GPR44, GPR56, GPR68, GPR173, GPR175, LGR4, MMD, NTSR2, OPN3, OR2L2, OSTM1, P2RX3, P2RY8, P2RY11, P2RY13, PTGE3, SSTR5, TBXA2R, ADAM22, ADAMTS7, CST11, MMP14, LPPR1, LPPR3, LPPR5, SEMA4A, SEMA6B, ALS2CR4, LEPROTL1, MS4A4A, ROM1, TM4SF5, VANGL1, VANGL2, C18orf1, GSGL1, ITM2A, KIAA1715, LDLRAD3, OZD3, STEAP1, MCAM, CHRNA1, CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB4, KIAA1524, NRM.3, RPRM, GRM8, KCNH4, 멜라노코르틴 1 수용체(Melanocortin 1 receptor), PTPRH, SDK1, SCN9A, SORCS1, CLSTN2, 엔도텔린 전환효소 유사-1(Endothelin converting enzyme like-1), 리소포스파틱산 수용체 2(Lysophosphatic acid receptor 2), LTB4R, TLR2, 뉴로트로픽 티로신 키나아제 1(Neurotropic tyrosine kinase 1), MUC16, B7-H4, 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR), ERBB2, HER3, EGFR variant III(EGFRvIII), HGFR, FOLR1, MSLN, CA-125, MUC-1, 전립선-특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen)(PSMA), 메소텔린(mesothelin), 상피세포 부착분자(epithelial cell adhesion molecule)(EpCAM), L1-CAM, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, VEGFR1, VEGFR2, 고분자량-멜라노마 관련 항원(high molecular weight-melanoma associated antigen)(HMW-MAA), MAGE-A l, IL-13R-α2, 디시알로갱글리오사이드(disialogangliosides)(GD2 및 GD3), 종양-관련 탄수화물 항원(tumour-associated carbohydrate antigens)(CA-125, CA-242, Tn 및 sialyl-Tn), 4-1BB, 5T4, BAFF, 카보닉 안하이드라아제 9(carbonic anhydrase 9)(CA-IX), C-MET, CCR1, CCR4, FAP, 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B(fibronectin extra domain-B)(ED-B), GPNMB, IGF-1 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, ITB5, ITGAX, 엠비긴(embigin), PDGF-Rα, ROR1, 신데칸 1(Syndecan 1), TAG-72, 테나신 C(tenascin C), TRAIL-R1, TRAIL-R2, NKG2D-리간드, 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자 제시 종양-특이 펩티드 에피토프, 바람직하게 PR1/HLA-A2, 계통-특이적(lineage-specific) 또는 조직-특이적(tissue-specific) 조직 항원, 바람직하게 CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD25, CD34, CD80, CD86, CD133, CD138, CD152, CD319, 엔도글린(endoglin), 및 MHC 분자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 분자를 포함하는, CAR 그룹.

10. 구현 1 내지 9 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자의 엑토도메인이 항원 결합 모이어티와 막관통 도메인 사이에 개재된(interposed) 구조적으로 가요성 힌지 영역을 포함하고, 바람직하게는 CD8 알파 (UniProtKB / Swiss-Prot P01732-1에 따른 아미노산 서열 위치 138 ~ 182), 또는 CD28 (UniProtKB/Swiss-Prot P10747에 따른 아미노산 서열 위치 114 ~ 152), 또는 PD-1(UniProtKB/Swiss-Prot Q15116에 따른 아미노산 서열 위치 146 ~ 170)에서 유래된 힌지 영역을 포함하며, 여기서 CD8 알파, CD28 또는 PD-1에서 유래된 서열은 N-말단 및/또는 C-말단 절단될 수 있고, 상기 서열 영역의 경계(border) 내에 임의의 길이를 가질 수 있으며, 그리고 여기서 CD8 알파 및 CD28에서 유래된 상기 힌지에서 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 대체되는, CAR 그룹.

11. 구현 1 내지 10 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 분자의 도메인은 상이한 단백질로부터 유래되고, 여기서 이들 도메인 중 적어도 2개는 아미노산 링커 서열을 통해 연결되고, 여기서 상기 링커는 바람직하게 1 내지 40 길이의 아미노산을 포함하는, CAR 그룹.

12. 구현 1 내지 11 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자, 바람직하게는 상기 그룹의 모든 CAR 분자의 이종이량체화 도메인의 이종이량체화가 조절 분자의 결합에 의해 강화되는(enhanced), CAR 그룹.

13. 구현 1 내지 12 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자, 바람직하게는 그룹의 모든 CAR 분자의 이종이량체화 도메인의 이종이량체화는 조절 분자의 결합을 필요로 하지 않는, CAR 그룹.

14. 구현 1 내지 13 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 분자 내의 적어도 2개의 이종이량체화 도메인의 경우, 해당 CAR 분자의 이종이량체화 도메인은 세포막에 의해 분리되고, 그리고/또는 이종이량체화 도메인의 상이한 쌍의 구성원으로 조절 분자의 존재 및 부재 하에서 상기 그룹의 둘 이상의 동일한 CAR 분자를 포함하는 복합체의 형성을 방지하기 위해 서로 결합할 수 없는, CAR 그룹.

15. 구현 1 내지 14 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 각 CAR 분자는 적어도 하나의 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해 신호를 전달할 수 있는 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함하는, CAR 그룹.

16. 구현 1 내지 15 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화 도메인은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12, FKBP), FKBP-라파마이신 관련 단백질(FRB) 돌연변이 T82L, 칼시뉴린 촉매 서브유닛 A(CnA), 시클로필린(cyclophilin), GAI, GID1, PYL 및 ABI로부터 선택되는, CAR 그룹.

17. 구현 1 내지 16 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화는 FKBP 및 FKBP-라파마이신 관련 단백질(FRB, 돌연변이체 T82L) 및/또는 상호작용하는 코일드-코일(coiled-coil) 도메인 쌍을 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되는, CAR 그룹.

18. 구현 1 내지 17 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화는 핵 수용체로부터의 리간드 결합 도메인 및 공동-조절자 펩티드를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되는, CAR 그룹.

19. 구현 1 내지 18 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화가 리포칼린-폴드 분자 및 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되는, CAR 그룹.

20. 구현 1 내지 19 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화가 핵 수용체로부터의 리간드 결합 도메인 및 공동-조절자 펩티드를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되고, 여기서 핵 수용체로부터의 리간드 결합 도메인은 에스트로겐 수용체, 엑디손 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 안드로겐 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 미네랄코르티코이드 수용체, 프로게스테론 수용체, 비타민 D 수용체, PPARγ 수용체, PPARβ 수용체, PPARα 수용체, 프레그난 X 수용체, 레티노이드 X 수용체, RAR-연관 고아 수용체, 레티노산 수용체 및 SRC1, GRIP1, AIB1, PGC1a, PGC1b, PRC, TRAP220, ASC2, ASC2-1, ASC2-2, CBP, CBP-1, CBP-2, P300, CIA, ARA70, ARA70-1, ARA70-2, NSD1, SMAP, Tip60, ERAP140, Nix1, LCoR, N-CoR, SMRT, RIP140, RIP140-1, RIP140-2, RIP140-3, RIP140-4, RIP140-5, RIP140-6, RIP140-7, RIP140-8, RIP140-9, PRIC285, PRIC285-1, PRIC285-2, PRIC285-3, PRIC285-4, PRIC285-5, SRC1-1, SRC1-2, SRC1-3, SRC1-4a, SRC1-4b, SRC2, SRC3, SRC3-1, PGC1, TRAP220-1, TRAP220-2, NR0B1, NRIP1, TIF1, TIF2, CoRNR Box, CoRNR1, CoRNR2, aβV, EA2, TA1, EAB1, GRIP1-1, GRIP1-2, GRIP1-3, AIB1-1, AIB1-2, AIB1-3, PGC1a, PGC1b로부터 선택되는 핵 수용체의 각 호환 가능한 공동-조절자로부터 선택되는, CAR 그룹.

21. 구현 1 내지 20 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화가 리포칼린-폴드 분자 및 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되고, 여기서 상기 리포칼린-폴드 분자는 구조적으로 보존된 β-배럴 구조, 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 대응하는 구조적으로 보존된 β-배럴 구조의 외부에 최대 15, 최대 30, 또는 최대 50 아미노산 결실 및/또는 최대 15, 최대 30, 또는 최대 50 아미노산 삽입을 갖는 자연 발생 리포칼린 또는 iLBP의 유도체인, CAR 그룹:

- 인간 RBP4의 아미노산 잔기 1-20, 31-40, 48-51, 59-70, 79-84, 89-101, 110-113, 121-131 및 139-183으로서, 이는 PDB 엔트리 1RBP에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 TLC에서 아미노산 잔기 1-13, 24-36, 44-47, 55-61, 70-75, 80-83, 92-95, 103-110 및 118-158로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 ApoM의 아미노산 잔기 1-43, 54-68, 76-80, 88-95, 104-109, 114-118, 127-130, 138-141 및 149-188로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 CRABPII에서 아미노산 잔기 1-4, 13-40, 46-49, 55-60, 66-70, 74-80, 88-92, 97-107, 113-118, 125-128 및 136-137로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드에 인접한 영역을 정의함;

- (PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따른) 인간 FABP1에서 아미노산 잔기 1-4, 13-38, 44-47, 53-58, 64-68, 72-78, 86-90, 95-98, 104-108, 115-118 및 126-127로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-가닥에 인접한 영역을 정의함.

22. 구현 1 내지 21 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화가 리포칼린-폴드 분자 및 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되고, 여기서 상기 리포칼린-폴드 분자는 β-배럴 구조에서 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80%, 특히 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 자연 발생 리포칼린 또는 iLBP의 유도체이고, 이에 따라 β-배럴 구조는 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 대응하는 영역으로서 정의되는, CAR 그룹:

- (PDB 엔트리 1RBP에서 아미노산 잔기 번호 넘버링 체계에 따른) 인간 RBP4의 아미노산 잔기 21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120 및 132-138로서, 이는 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 눈물 리포칼린(TLC; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102 및 111-117로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 아포리포프로틴 M(ApoM; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137 및 142-148로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 세포 레티노산 결합 단백질 II(CRABPII; PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124 및 129-135로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 지방산 결합 단백질 1(FABP1; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114 및 119-125로서, 이는 인간 FABP1에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함.

23. 구현 1 내지 22 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 이종이량체화가 리포칼린-폴드 분자 및 리포칼린-폴드 결합 상호작용 파트너를 포함하는 한 쌍의 이종이량체화 도메인에 의해 매개되고, 상기 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드의 적어도 구조적으로 보존된 β-배럴 구조를 덮는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 100, 특히 적어도 120 아미노산 길이의 자연발생 리포칼린 또는 이의 유도체의 단편이거나, 또는 여기서 상기 리포칼린-폴드 분자는 리포칼린-폴드의 적어도 구조적으로 보존된 β-배럴 구조를 덮는 적어도 80, 바람직하게는 적어도 85, 특히 적어도 90 아미노산 길이의 자연발생 iLBP의 단편 또는 이의 유도체이고,

여기서 상기 구조적으로 보존된 β-배럴 구조는 바람직하게는 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기의 영역에 구조적으로 대응하는 아미노산 위치를 포함하거나 그로 구성되는, CAR 그룹:

- (PDB 엔트리 1RBP에서 아미노산 잔기 번호 넘버링 체계에 따른) 인간 RBP4의 아미노산 잔기 21-30, 41-47, 52-58, 71-78, 85-88, 102-109, 114-120 및 132-138로서, 이는 인간 RBP4에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 눈물 리포칼린(TLC; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 14-23, 37-43, 48-54, 62-69, 76-79, 84-91, 96-102 및 111-117로서, 이는 인간 TLC에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 아포리포프로틴 M(ApoM; Schiefner et al., Acc Chem Res. 2015;48(4):976-985에 의해 정의됨)에서 아미노산 잔기 44-53, 69-75, 81-87, 96-103, 110-113, 119-126, 131-137 및 142-148로서, 이는 인간 ApoM에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 세포 레티노산 결합 단백질 II(CRABPII; PDB 엔트리 2FS6에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 41-45, 50-54, 61-65, 71-73, 81-87, 93-96, 108-112, 119-124 및 129-135로서, 이는 인간 CRABPII에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의함;

- 인간 지방산 결합 단백질 1(FABP1; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름)에서 아미노산 잔기 5-12, 39-43, 48-52, 59-63, 69-71, 79-85, 91-94, 99-103, 109-114 및 119-125로서, 이는 인간 FABP1에서 구조적으로 보존된 β-스트랜드를 정의하며; PDB 엔트리 2F73에서 아미노산 잔기 넘버링 체계에 따름).

24. 구현 1 내지 23 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 조절 분자는 인체의 생리적 환경에서, 또는 세포의 표면에서, 세포 내의 생리적 조건 하에서 또는 표준화된 생리적 조건 하에서, 바람직하게는 PBS 조건으로서 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ 및 18 mM KH₂PO₄인 PBS 조건에서, 달성될 수 있는 농도에서 가용성인 분자인, CAR 그룹.

25. 구현 1 내지 24 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 적어도 하나의 조절 분자는 라파마이신(rapamycin), 라파마이신-유사체(analog), 앱시스산(abscisic acid), 지베렐린(gibberellin), 또는 지베렐린-유사체 GA3-AM로부터 선택되는 것인, CAR 그룹.

26. 구현 1 내지 25 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 적어도 하나의 조절 분자는 핵 수용체로부터의 리간드 결합 도메인에 결합하고, 코르티코스테론(corticosterone)(11베타,21-디히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 디옥시코르티코스테론(deoxycorticosterone)(21-히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 코르티솔(cortisol)(11베타,17,21-트리히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 11-디옥시코르티솔(11-deoxycortisol)(17,21-디히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 코르티손(17,21-디히드록시-4-프레그넨-3,11,20-트리온); 18-히드록시코르티코스테론(18-hydroxycorticosterone)(11베타,18,21-트리히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 1.알파.-히드록시코르티코스테론(1.alpha.-hydroxycorticosterone)(1 알파,11베타,21-트리히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 11베타,21-디히드록시-3,20-디옥소-4-프레그넨-18-a1의 알도스테론 18,11-헤미아세탈; 안드로스텐디온(androstenedione)(4-안드로스텐-3,17-디온); 4-히드록시-안드로스텐디온; 11β-히드록시안드로스텐디온(11β-hydroxyandrostenedione)(11 베타-4-안드로스텐-3,17-디온); 안드로스텐디올(androstanediol)(3-베타,17-베타-안드로스텐디올); 안드로스테론(androsterone)(3알파-히드록시-5알파-안드로스탄-17-온); 에피안드로스테론(epiandrosterone)(3베타-히드록시-5알파-안드로스탄-17-온); 아드레노스테론(4-안드로스텐-3,11,17-트리온); 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone)(3베타-히드록시-5-안드로스텐-17-온); 디히드로에피안드로스테론 설페이트(dehydroepiandrosterone sulphate)(3베타-설폭시-5-안드로스텐-17-온); 테스토스테론(testosterone)(17베타-히드록시-4-안드로스텐-3-온); 에피테스토스테론(epitestosterone)(17알파-히드록시-4-안드로스텐-3-온); 5α-디히드로테스토스테론(5α-dihydrotestosterone)(17베타-히드록시-5알파-안드로스탄-3-온 5β-디히드로테스토스테론; 5-베타-디히드록시 테스토스테론(5-beta-dihydroxy testosterone)(17베타-히드록시-5베타-안드로스탄-3-온); 11β-히드록시테스토스테론(11β-hydroxytestosterone) (11베타,17베타-디히드록시-4-안드로스텐-3-온); 11-케토테스토스테론(11-ketotestosterone)(17베타-히드록시-4-안드로스텐-3,17-디온); 에스트론(estrone)(3-히드록시-1,3,5(10)-에스트라트리엔-17-온); 에스트라디올(estradiol)(1,3,5(10)-에스트라트리엔-3,17베타-디올); 에스트리올(estriol) 1,3,5(10)-에스트라트리엔-3,16알파,17베타-트리올; 프레그네놀론(pregnenolone)(3-베타-히드록시-5-프레그넨-20-온); 17-히드록시프레그네놀론(17-hydroxypregnenolone)(3-베타,17-디히드록시-5-프레그넨-20-온); 프로게스테론(progesterone)(4-프레그넨-3,20-디온); 17-히드록시프로게스테론(17-hydroxyprogesterone)(17-히드록시-4-프레그넨-3,20-디온); 프로게스테론(progesterone)(프레그느-4-엔-3,20-디온)(pregn-4-ene-3,20-dione); T3; T4; 스피로노락톤(spironolactone); 에플레레논(eplerenone); 사이프로테론 아세테이트(cyproterone acetate), 히드록시플루타미드(hydroxyflutamide); 엔잘루타마이드(enzalutamide); ARN-509; 3,3'-디인돌릴메탄(3,3'-diindolylmethane)(DIM); 벡슬로스테라이드(bexlosteride); 바이칼루타마이드(bicalutamide); N-부틸벤젠-설폰아마이드(N-butylbenzene-sulfonamide)(NBBS); 두타스테라이드(dutasteride); 에프리스테라이드(epristeride); 피나스테라이드(finasteride); 플루타마이드(flutamide); 이존스테라이드(izonsteride); 케토코나졸(ketoconazole); N-부틸벤젠-설폰아마이드(N-butylbenzene-sulfonamide); 닐루타미드(nilutamide); 메게스트롤(megestrol); 투로스테라이드(turosteride); 미페프리스톤(mifepristone)(RU-486; 11β-[4 N,N-디메틸아미노페닐]-17β-히드록시-17-(1-프로피닐)-에스트라-4,9-디엔-3-온); 릴로프리스톤(Lilopristone)(11β-(4 N,N-디메틸아미노페닐)-17β-히드록시-17-((Z)-3-히드록시프로페닐)에스트라-4,9-디엔-3-온); 오나프리스톤(onapristone)(11β-(4 N,N-디메틸아미노페닐)-17α-히드록시-17-(3-히드록시프로필)-13α-에스트라-4,9-디엔-3-온); 아소프리스닐(asoprisnil)(벤즈알데히드, 4-[(11β,17β)-17-메톡시-17-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11-일]-1-(E)-옥심); J867); J912(4-[17β-히드록시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-(1E)-옥심); CDB-2914(17α-아세톡시-11β-(4-N,N-디메틸아미노페닐)-19-노르프레그나-4,9-디엔-3,20-디온); JNJ-1250132(6α,11β,17β)-11-(4-디메틸아미노페닐)-6-메틸-4',5'-디히드로스피로[에스트라-4,9-디엔-17,2'(3'H)-퓨란]-3-온(ORG-31710); (11β,17α)-11-(4-아세틸페닐)-17,23-에폭시-19,24-디노르콜라-4,9-,20-트리엔-3-온(ORG-33628); (7β,11β,17β)-11-(4-디메틸아미노페닐-7-메틸]-4',5'-디히드로스피로[에스트라-4,9-디엔-17,2'(3'H)-퓨란]-3-온(ORG-31806); ZK-112993; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; ZK-137316; 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1-(E)-옥심; 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1-(E)-[O-(에틸아미노)카보닐]옥심; 4-[17β-메톡시-17α-(메톡시메틸)-3-옥소에스트라-4,9-디엔-11β-일]벤즈알데히드-1-(E)-[O-(에틸티오)카보닐]옥심; (Z)-6'-(4-시아노페닐)-9,11α-디히드로-17β-히드록시-17α-[4-(1-옥소-3-메틸부톡시)-1-부테닐]4'H-나프토[3',2',1';10,9,11]에스트르-4-엔-3-온; 11β-(4-아세틸페닐)-17β-히드록시-17α-(1,1,2,2,2-펜타-플루오로에틸)에스트라-4,9-디엔-3-온; 11β-(4-아세틸페닐)-19,24-디노르-17,23-에폭시-17알파-콜라-4,9,20-트리에-n-3-온; (Z)-11베타,19-[4-(3-피리디닐)-o-페닐렌]-17베타-히드록시-17α-[3-히드록시-1-프로페닐]-4-안트로스텐-3-온; 11베타-[4-(1-메틸에테닐)페닐]-17α-히드록시-17베타-β-히드록시프로필)-13α-에스트라-4,9-디엔-3-온; 4',5'-디히드로-11베타-[4-(디메틸아미노)페닐]-6베타-메틸스피로[에스트라-4,-9-디엔-17베타,2'(3'H)-퓨란]-3-온; 드로스피레논; T3(3,5,3'-트리이오도-L-티로닌); KB-141(3,5-디클로로-4-(4-히드록시-3-이소프로필페녹시)페닐아세트산); 소베티롬(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)-페녹시 아세트산); GC-24(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-벤질)벤질페목시아세트산); 4-OH-PCB106(4-OH-2',3,3',4',5'-펜타클로로비페닐); 에프로티롬(eprotirome); MB07811((2R,4S)-4-(3-클로로페닐)-2-[(3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)페녹시)메틸]-2-옥시도-[1,3,2]-디옥사포스포난); QH2; (3,5-디메틸-4-(4'-히드록시-3'-이소프로필벤질)페녹시)메틸포스폰산(MB07344); 타목시펜(tamoxifen); 4-OH-타목시펜; 랄록시펜(raloxifene); 라소폭시펜(lasofoxifene), 바제독시펜(bazedoxifene); 팔소덱스(falsodex); 클로미펜(clomifene); 페마렐(femarelle); 오르멜록시펜(ormeloxifene); 토레미피엔(toremifiene); 오스페미펜(ospemifene); 에스트라디올(17-베타-에스트라이올); 에티닐 에스트라디올; 티아졸리디네디온(바람직하게 로시글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), 로베글리타존(lobeglitazone), 트로글리타존(troglitazone)); 파르글리타자르(farglitazar); 알레글리타자르(aleglitazar); 페노피브릭산(fenofibric acid); 벤조피라노퀴놀린(benzopyranoquinoline) A 276575; 마프라코라트(Mapracorat); ZK 216348; 55D1E1; 덱사메타손(dexamethasone); 프레드니솔론(prednisolone); 프레드니손(prednisone); 메틸프레드니솔론(methylprednisolone); 플루티카손(fluticasone) 프로피오네이트(propionate); 베클로메타손-17-모노프로피오네이트(beclomethasone-17-monopropionate); 베타메타손(betamethasone); 리멕솔론(rimexolone); 파라메타손(paramethasone); 히드로코르티손(hydrocortisone); 1,25―디히드록시비타민 D3(칼시트리올)(1,25-dihydroxyvitamin D3) (calcitriol); 파리칼리톨(paricalitol); 독세르칼시페롤(doxercalciferol); 25-히드록시비타민 D3(칼시페디올)(25-hydroxyvitamin D3)(calcifediol); 콜레칼시페롤(cholecalciferol); 에르고칼시페롤(ergocalciferol); 타칼시올(tacalciol); 22-디히드로에르고칼시페롤(22-dihydroergocalciferol); (6Z)-타칼시올((6Z)-Tacalciol); 2-메틸렌-19-노르-20(S)-1α-히드록시-비스호모프레그나칼시페롤(2-methylene-19-nor-20(S)-1α-hydroxy-bishomopregnacalciferol); 19-노르-26,27-디메틸렌-20(S)-2-메틸렌-1α,25-디히드록시비타민 D3(19-nor-26,27-dimethylene-20(S)-2-methylene-1α,25-dihydroxyvitamin D3); 2-메틸렌-1α,25-디히드록시-(17E)-17(20)-디히드로-19-노르-비-타민 D3(2-methylene-1α,25-dihydroxy-(17E)-17(20)-dehydro-19-nor-vi-tamin D3); 2-메틸렌-19-노르-(24R)-1α,25-디히드록시비타민 D2(2-methylene-19-nor-(24R)-1α,25-dihydroxyvitamin D2); 2-메틸렌-(20R,25S)-19,26-디노르-1α,25-디히드록시비타민 D3(2-methylene-(20R,25S)-19,26-dinor-1α,25-dihydroxyvitamin D3); 2-메틸렌-19-노르-1α-히드록시-프레그나칼시페롤(2-methylene-19-nor-1α-hydroxy-pregnacalciferol); 1α-히드록시-2-메틸렌-19-노르-호모프레그나칼시페롤(1α-hydroxy-2-methylene-19-nor-homopregnacalciferol); (20R)-1α-히드록시-2-메틸렌-19-노르-비스호모프레그나칼시페롤((20R)-1α-hydroxy-2-methylene-19-nor-bishomopregnacalciferol); 2-메틸렌-19-노르-(20S)-1α-히드록시-트리스호모프레그나칼시페롤(2-methylene-19-nor-(20S)-1α-hydroxy-trishomopregnacalciferol); 2-메틸렌-23,23-디플루오로-1α-히드록시-19-노르-비스호모프레그나칼시페로-1(2-methylene-23,23-difluoro-1α-hydroxy-19-nor-bishomopregnacalcifero-1); 2-메틸렌-(20S)-23,23-디플루오로-1α-히드록시-19-노르-비스호모프레그난-칼시페롤(2-methylene-(20S)-23,23-difluoro-1α-hydroxy-19-nor-bishomopregnan-calciferol); (2-(3′ 히드록시프로필-1′,2′-이덴)-19,23,24-트리노르-(20S)-1α-히드록시비타민 D3((2-(3′ hydroxypropyl-1′,2′-idene)-19,23,24-trinor-(20S)-1α-hydroxyvitamin D3); 2-메틸렌-18,19-디노르-(20S)-1α,25-디히드록시비타민 D3(2-methylene-18,19-dinor-(20S)-1α,25-dihydroxyvitamin D3); 레티노산(retinoic acid); 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid); 9-시스-레티노산(9-cis-retinoic acid); 타미바로텐(tamibarotene); 13-시스-레티노산(13-cis-retinoic acid); (2E,4E,6Z,8E)-3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸-1-시클로헥세닐)노나-2,4,6,-8-테트라엔산((2E,4E,6Z,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexeneyl)nona-2,4,6,-8-tetraenoic acid); 9-(4-메톡시-2,3,6-트리메틸-페닐)-3,7-디메틸-노나-2,4,6,8-테트라엔산(9-(4-methoxy-2,3,6-trimethyl-phenyl)-3,7-dimethyl-nona-2,4,6,8-tetraenoic acid); 6-[3-(1-아다만틸)-4-메톡시페닐]-2-나프토산(6-[3-(1-adamantyl)-4-methoxyphenyl]-2-napthoic acid); 4-[1-(3,5,5,8,8-펜타메틸-테트랄린-2-일)에테닐]벤조산(4-[1-(3,5,5,8,8-pentamethyl-tetralin-2-yl)ethenyl]benzoic acid; 레티노벤조산(retinobenzoic acid); 에틸 6-[2-(4,4-디메틸티오크로만-6-일)에티닐]피리딘-3-카복실레이트(ethyl 6-[2-(4,4-dimethylthiochroman-6-yl)ethynyl]pyridine-3-carboxylate); 레티노일 t-부티레이트(retinoyl t-butyrate); 레티노일 피나콜(retinoyl pinacol); 레티노일 콜레스테롤(retinoyl cholesterol); 오베티콜릭 산(obeticholic acid); LY2562175 (6-(4-((5-시클로프로필-3-(2,6-디클로로페닐)이속사졸-4-일)메톡시)피페리딘-1-일)-1-메틸-1H-인돌-3-카복실산)(6-(4-((5-cyclopropyl-3-(2,6-dichlorophenyl)isoxazol-4-yl)methoxy)piperidin-1-yl)-1-methyl-1H-indole-3-carboxylic acid); GW4064 (3-[2-[2-클로로-4-[[3-(2,6-디클로로페닐)-5-(1-메틸에틸)-4-이속사졸일]메톡시]페닐]에테닐]벤조산)(3-[2-[2-Chloro-4-[[3-(2,6-dichlorophenyl)-5-(1-methylethyl)-4-isoxazolyl]methoxy]phenyl]ethenyl]benzoic acid); T0901317 (N-(2,2,2-트리플루오로에틸)-N-[4-[2,2,2-트리플루오로-1-히드록시-1-(트리플루오로메틸)에틸]페닐]벤젠설폰아미드)(N-(2,2,2-Trifluoroethyl)-N-[4-[2,2,2-trifluoro-1-hydroxy-1-(trifluoromethyl)ethyl]phenyl]benzenesulfonamide); GW3965 (3-[3-[[[2-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]메틸](2,2-디페닐에틸)아미노]프로폭시]벤젠아세트산 히드로클로라이드)(3-[3-[[[2-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]methyl](2,2-diphenylethyl)amino]propoxy]benzeneacetic acid hydrochloride); LXR-623; GNE-3500 (27, 1-{4-[3-플루오로-4-((3S,6R)-3-메틸-1,1-디옥소-6-페닐-[1,2]티아지난-2-일메틸)-페닐]-피페라진-1-일}-에탄온)(27, 1-{4-[3-fluoro-4-((3S,6R)-3-methyl-1,1-dioxo-6-phenyl-[1,2]thiazinan-2-ylmethyl)-phenyl]-piperazin-1-yl}-ethanone); 7β, 27-디히드록시콜레스테롤(7β, 27-dihydroxycholesterol); 7α, 27-디히드록시콜레스테롤(7α, 27-dihydroxycholesterol); 9-cis 레티노산(9-cis retinoic acid); LGD100268; CD3254 (3-[4-히드록시-3-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)페닐]-2-프로펜산)(3-[4-Hydroxy-3-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethyl-2-naphthalenyl)phenyl]-2-propenoic acid); CD2915(Sorensen et al. (1997) Skin Pharmacol. 10:144); 리팜피신(rifampicin); 클로트리마졸(chlotrimazole); 및 로바스타틴(lovastatin)으로부터 선택되는, CAR 그룹.

27. 구현 1 내지 26 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 적어도 하나의 조절 분자는 타목시펜이고, 핵 수용체, 바람직하게는 에스트로겐 수용체 알파 또는 에스트로겐 수용체 베타로부터의 리간드 결합 도메인에 결합하는 것인, CAR 그룹.

28. 구현 1 내지 27 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 적어도 하나의 조절 분자는 리포칼린-폴드 분자에 결합하고 펜레티니드(fenretinide)(Pubchem CID 5288209), N-에틸레티나미드(Pubchem CID 5288173), 올-트랜스 레티노산(Pubchem CID 444795), 악세로프텐(axerophthene)(Pubchem CID 5287722), A1120 (Pubchem CID 25138295) 및 이의 유도체(Cioffi et al., J Med Chem. 2014;57(18):7731-7757; Cioffi et al., J Med Chem. 2015;58(15):5863-5888), 1,4-부탄디올(Pubchem CID 8064), 스핑고신-1-포스페이트(Pubchem CID 5283560), 테트라데카노산(tetradecanoic acid)(Pubchem CID 11005), 인디카잔틴(indicaxanthin)(Pubchem CID 6096870 및 12310796), 불가잔틴 I(vulgaxanthin I)(Pubchem CID 5281217), 몬테루카스트(Montelukast)(Pubchem CID 5281040), 시클란델레이트(Cyclandelate)(Pubchem CID 2893), 옥솔아민(Oxolamine)(Pubchem CID 13738), 마자티콜(Mazaticol)(Pubchem CID 4019), 부톡타미드(Butoctamid)(Pubchem CID 65780), 토나베르셋(Tonabersat)(Pubchem CID 6918324), 노바진(Novazin)(Pubchem CID 65734), 디페니돌(Diphenidol)(Pubchem CID 3055), 알로클아마이드(Alloclamide)(Pubchem CID 71837), 디아세톨롤(Diacetolol)(Pubchem CID 50894), 아코티아미드(Acotiamide)(Pubchem CID 5282338), 아코지보롤(Acoziborole)(Pubchem CID 44178354), 아큐마피모드(Acumapimod)(Pubchem CID 11338127), 아팔루타마이드(Apalutamide)(Pubchem CID 24872560), ASP3026 (Pubchem CID 25134326), AZD1480 (Pubchem CID 16659841), BIIB021 (Pubchem CID 16736529), 브라나플람(Branaplam)(Pubchem CID 89971189), 브리퀴나르(Brequinar)(Pubchem CID 57030), 클로르프로구아닐(Chlorproguanil)(Pubchem CID 9571037), 클린다마이신(Clindamycin)(Pubchem CID 446598), 엠리카산(Emricasan)(Pubchem CID 12000240), 에나시데닙(Enasidenib)(Pubchem CID 89683805), 에놀리캄(Enolicam)(Pubchem CID 54679203), 플루라제팜(Flurazepam)(Pubchem CID 3393), ILX-295501 (Pubchem CID 127737), 인디불린(Indibulin)(Pubchem CID 2929), 메토클로프라미드(Metoclopramide)(Pubchem CID 4168), 메바스타틴(Mevastatin)(Pubchem CID 64715), MGGBYMDAPCCKCT-UHFFFAOYSA-N (Pubchem CID 25134326), MK0686 (Pubchem CID 16102897), 나바릭신(Navarixin)(Pubchem CID 11281445), 네파조돈(Nefazodone)(Pubchem CID 4449), 판토프라졸(Pantoprazole)(Pubchem CID 4679), 파비네탄트(Pavinetant)(Pubchem CID 23649245), 프록사졸(Proxazole)(Pubchem CID 8590), SCYX-7158 (Pubchem CID 44178354), 시카닌(Siccanin)(Pubchem CID 71902), 설파구아놀(Sulfaguanole)(Pubchem CID 9571041), 수니티닙(Sunitinib)(Pubchem CID 5329102), 수보렉선트(Suvorexant)(Pubchem CID 24965990), 티아프라이드(Tiapride)(Pubchem CID 5467), 토나베르셋(Tonabersat)(Pubchem CID 6918324), VNBRGSXVFBYQNN-UHFFFAOYSA-N (Pubchem CID 24794418), YUHNXUAATAMVKD-PZJWPPBQSA-N (Pubchem CID 44548240), 울리모렐린(Ulimorelin)(Pubchem CID 11526696), 지파마이드(Xipamide)(Pubchem CID 26618), 트로페신(Tropesin)(Pubchem CID 47530), 트리클라벤다졸(Triclabendazole)(Pubchem CID 50248), 트리클라벤다졸 설폭시드(Triclabendazole sulfoxide)(Pubchem CID 127657), 트리클라벤다졸 설폰(Triclabendazole sulfone)(Pubchem CID 10340439) 및 트라메티닙(Trametinib)(Pubchem CID 11707110)으로부터 선택되는, CAR 그룹.

29. 구현 1 내지 28 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 적어도 하나의 조절 분자는 라파마이신, 라파마이신-유사체, 타목시펜, 엠리카산 및 A1120로부터 선택되는, CAR 그룹.

30. 구현 1 내지 29 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자 내에서 도메인의 순서는 세포 표면에서 세포 외로부터 세포 내측으로: 항원 결합 모이어티 또는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위, 선택적으로 선택적인 제2 항원 결합 모이어티 또는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 선택적인 제2 결합 부위의 공간 최적화를 위한 링커, 바람직하게는 공간 최적화를 위한 힌지 영역, 및 막관통 도메인이며,

여기서 막관통 도메인은 바람직하게 적어도 하나의 CAR 분자에서 공동-자극 도메인을 포함하는 신호전달 영역이 뒤따르고, 여기서 바람직하게 이 공동-자극 신호전달 영역, 또는 선택적으로 막관통 도메인 다음에 적어도 하나의 이종이량체화 도메인이 뒤따르고, 추가적으로, 적어도 하나의 CAR 분자에서, 적어도 하나의 ITAM을 포함하는 신호전달 영역이 뒤따르고, 여기서 상기 공동-자극 및 ITAM-포함 신호전달 영역의 순서는 역전될 수 있고, 여기서 ITAM을 포함하지 않는 CAR 분자는 공동-자극 신호전달 영역이 결여되거나, 또는 하나의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 2개의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 더 많은 공동-자극 신호전달 영역을 포함하나, 바람직하게는 2개 이하의 공동-자극 신호전달 영역, 또는 더욱 바람직하게는 단지 하나의 공동-자극 신호전달 영역을 포함하고,

상기 CAR 분자의 임의의 2개의 인접한 성분은 선택적으로 링커에 의해 분리될 수 있으며,

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자에 대해 적어도 하나가 필수인 이종이량체화 도메인은 대안적으로 또는 추가적으로 엑토도메인 또는 막관통 도메인에 위치할 수 있고, 그러나, 바람직하게는 막관통 도메인과 신호전달 영역 사이, 및/또는 특히 2개의 신호전달 영역 사이 및/또는 특히 CAR 분자의 세포 내 말단에 위치하는, CAR 그룹.

31. 구현 1 내지 30 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 이종이량체화 도메인은 상기 그룹의 CAR 분자의 엔도도메인 및/또는 막관통 도메인, 바람직하게는 엔도도메인에 위치하는, CAR 그룹.

32. 구현 1 내지 30 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 2개의 CAR 분자의 엑토도메인은 바람직하게는 단지 하나의 단백질 도메인을 포함하는 이종이량체화 도메인을 포함하고, 여기서 상기 조절 분자는 세포로부터 분비되는 분자이고 상기 이량체화 도메인의 이량체화를 유도하는, CAR 그룹.

33. 구현 1 내지 32 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자는 적어도 하나의 ITAM을 통해 신호를 전달할 수 있는 신호전달 영역을 함유하는 엔도 도메인을 포함하고, 여기서 상기 CAR 그룹은 바람직하게는 적어도 3개의 ITAM을 포함하는, CAR 그룹.

34. 구현 1 내지 33 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자의 엔도도메인은 적어도 하나의 ITAM을 포함하고, 상기 ITAM은 CD3 제타(zeta), DAP12, Fc-엡실론(epsilon) 수용체 I 감마(gamma) 사슬, CD3 델타(delta), CD3 엡실론, CD3 감마, 및 CD79A(항원 수용체 복합체-관련 단백질 알파 사슬)로부터 선택되고, 바람직하게는 CD3 제타(zeta)인, CAR 그룹.

35. 구현 1 내지 34 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자의 엔도도메인에서 공동-자극 신호전달 영역의 공동-자극 도메인이 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, BTLA, OX-40, CD2, CD6, CD27, CD30, CD40, GITR, 및 HVE, 바람직하게는 4-1BB 및 ICOS로부터 유래되는, CAR 그룹.

36. 구현 1 내지 35 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹은 2개 또는 3개의 CAR 분자, 바람직하게는 2개의 CAR 분자로 구성되는, CAR 그룹.

37. 구현 1 내지 36 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 각 CAR 분자의 엑토도메인은 단일 항원 결합 모이어티 또는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 단일 결합 부위를 포함하고, 상기 다른 폴리펩티드는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는, CAR 그룹.

38. 구현 1 내지 36 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 각 CAR 분자의 엑토도메인은 하나 또는 2개의 항원 결합 모이어티, 바람직하게는 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는, CAR 그룹.

39. 구현 1 내지 36 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 그룹의 CAR 분자는 항원 결합 모이어티를 포함하지 않지만, 각각 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고, 상기 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 결합을 통해 단지 간접적으로만 표적 항원에 결합할 수 있고,

여기서 상기 그룹의 각 CAR 분자는 엔도도메인에 적어도 하나의 이종이량체화 도메인을 포함하고, 여기서 상기 이종이량체화 도메인의 이종이량체화는 바람직하게는 조절 분자의 존재를 필요로 하지 않는, CAR 그룹.

40. 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 또는 시험관 내 전사된 RNA로부터 선택되는, 핵산 분자.

41. 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 키트로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 또는 시험관 내 전사된 RNA로부터 선택되는, 핵산 분자 키트.

42. 구현 41에서,

상기 핵산 분자는 벡터에 존재하고, 바람직하게는 DNA 또는 RNA로서 감염성 바이러스 입자 내에 패키징되는, 핵산 분자 키트.

43. 구현 40 내지 42 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 핵산 서열은 림프구에서 강력하고 안정적인 트랜스진 발현을 매개하는 서열에 연결되고, 상기 이러한 서열은 바람직하게는 감마 레트로바이러스의 5’-LTR 또는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukaemia virus, MMLV)의 5’-LTR의 하위요소 R 및 U3 또는 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV)의 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase, PGK)의 프로모터 또는 더욱 더 바람직하게는 인간 신장 인자 1(human elongation factor 1, EF-1) 알파 프로모터인, 핵산 분자 또는 핵산 분자 키트.

44. 구현에 41 내지 43 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 제1 핵산은 상기 그룹의 제1 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제2 핵산은 상기 그룹의 제2 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로, 여기서 상기 키트는 제3 핵산을 추가로 포함하고, 상기 제3 핵산은 CAR 그룹이 적어도 3개의 상이한 CAR 분자로 구성되는 경우 상기 그룹의 제3 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로, 여기서 상기 키트는 제4 핵산을 추가로 포함하고, 상기 제4 핵산은 CAR 그룹이 4개의 상이한 CAR 분자로 구성되는 경우 상기 그룹의 제4 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자 키트.

45. 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 벡터 키트로서, 상기 핵산은 DNA, RNA인, 벡터 또는 벡터 키트.

46. 구현 45에 있어서,

상기 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 (recombinant adeno-associated virus, rAAV) 벡터 또는 트랜스포존 벡터이고, 바람직하게는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존 벡터 또는 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 벡터이거나, 또는 여기서 벡터는 레트로바이러스 벡터이고, 바람직하게는 감마-레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터 또는 벡터 키트.

47. 구현 45 또는 46에 있어서,

상기 벡터는 발현 벡터, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열이 림프구에서 강력하고 안정적인 트랜스진 발현을 매개하는 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터이고, 상기 이러한 서열은 바람직하게는 감마 레트로바이러스의 5’-LTR 또는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukaemia virus, MMLV)의 5’-LTR의 하위요소 R 및 U3 또는 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV)의 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase, PGK)의 프로모터 또는 더욱 더 바람직하게는 인간 신장 인자 1(human elongation factor 1, EF-1) 알파 프로모터인, 벡터 또는 벡터 키트.

48. 구현 45 내지 47 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 제1 벡터는 상기 그룹의 제1 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 상기 제2 벡터는 상기 그룹의 제2 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로, 여기서 상기 키트는 제3 벡터를 추가로 포함하고, 상기 제3 벡터는 CAR 그룹이 적어도 3개의 상이한 CAR 분자로 구성되는 경우 상기 그룹의 제3 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택적으로, 여기서 상기 키트는 제4 벡터를 추가로 포함하고, 상기 제4 벡터는 CAR 그룹이 4개의 상이한 CAR 분자로 구성되는 경우 상기 그룹의 제4 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터 키트.

49. 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 생산하기 위해, 구현 40 내지 44 중 어느 한 구현에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 키트 또는 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트를 사용하여 시험관 내 또는 생체 외에서 변형된 세포, 또는 2개 이상의 상기 변형된 세포를 포함하는 키트.

50. 구현 49에 있어서,

상기 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 조혈 줄기 세포(HSC), 또는 HSC로부터 유래된 세포, 더욱 바람직하게는 NK 세포 또는 T 세포, 특히 T 세포인, 세포 또는 세포 키트.

51. 구현 49 또는 50에 있어서,

상기 세포는 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트로 형질감염되거나 형질도입된 것인, 세포 또는 세포 키트.

52. 구현 49 내지 51 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 세포는 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이의 게놈 내로 안정적으로 통합시킨, 세포 또는 세포 키트.

53. 구현 49 내지 51 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 세포는 부위 지정 뉴클레아제 기술(site directed nuclease technology)을 사용하여, 바람직하게는 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN, 또는 더욱 더 바람직하게는 CRISPR/Cas 기술을 사용하여 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 이의 게놈에 안정적으로 통합시킨, 세포 또는 세포 키트.

54. 구현 40 내지 44 중 어느 한 구현에 따른 핵산 또는 핵산 키트, 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포 또는 세포 키트를 포함하는, 약학 제제.

55. 구현 54에 있어서,

상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 감염성 바이러스 입자에 함유되는, 약학 제제.

56. 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 구현 40 내지 44 중 어느 한 구현에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 키트, 또는 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트를 세포 내로 도입하는 것을, 바람직하게는 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법.

57. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹으로서, 상기 방법은

i) 개체로부터 획득한 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 상기 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 상기 CAR 그룹의 항원 결합 모이어티는 개체에서 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 여기서 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행하는, 단계;

ii) 유전자 변형된 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및

iii) 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 이에 의해 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도하는 단계로서, 여기서 상기 비공유적으로 복합체화된 CAR 그룹은, 생리적 발현 수준에서 각각의 표적 항원 조합을 발현하는 암 세포와 접촉시, 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계

를 포함하는, CAR 그룹.

58. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 1 내지 11, 13 내지 15, 17, 19, 21 내지 23, 30, 31 또는 33 내지 39 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹으로서, 상기 방법은

i) 개체로부터 획득한 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 상기 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 유전자 변형시키는 단계로서, 여기서 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티, 및/또는 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티는 개체에서 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않고, 여기서 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행하는, 단계;

ii) 유전자 변형된 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및

iii) 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하고, 이는 생리적 발현 수준에서 각각의 표적 항원 조합을 발현하는 암 세포와 접촉시, 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계

를 포함하는, CAR 그룹.

59. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 1 내지 11, 13 내지 15, 17, 19, 21 내지 23, 30, 31 또는 33 내지 38 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹으로서, 상기 방법은

i) 개체로부터 획득한 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 상기 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 유전자 변형하며, 여기서 상기 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티는 개체에서 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않고, 상기 유전적 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행하는, 단계;

ii) 유전자 변형된 세포를 개체 내에 도입하고, 이는 암 세포를 사멸시킬 수 있고, 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 단계

를 포함하는, CAR 그룹.

60. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포로서, 상기 CAR 그룹의 항원 결합 모이어티는 개체의 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 상기 방법은

i) 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및

ii) 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 이에 의해 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화를 유도하고, 상기 CAR의 비공유 복합체는 각각의 표적 항원을 발현하는 암 세포와의 접촉시, 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계

를 포함하는, 세포.

61. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포로서, 상기 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티 및/또는 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티는 개체에서 암 세포 상의 표적 항원들에 특이적이고, 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않고, 상기 방법은

i) 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및

ii) 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 엑토도메인의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 각각의 표적 항원을 발현하는 암 세포와의 접촉시, 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계

를 포함하는, 세포.

62. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포로서, 상기 그룹의 CAR 분자의 항원 결합 모이어티는 개체의 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화는 조절 분자의 투여를 필요로 하지 않고, 여기서 상기 방법은 세포를 개체에게 도입하는 단계를 추가적으로 포함하고, 이는 암 세포를 사멸시킬 수 있고, 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 단계

를 포함하는, 세포.

63. - 1개, 2개 또는 3개의 조절 분자, 바람직하게는 2개, 더욱 더 바람직하게는 1개의 조절 분자, 및

- 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹, 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포 또는 세포 키트

를 포함하는 키트.

64. 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹, 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포 또는 세포 키트를 포함하는 키트.

65. - 적어도 하나의 조절 분자 및/또는 상기 그룹의 CAR 분자의 각각의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드, 및

- 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹, 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포 또는 세포 키트

를 포함하는 키트.

66. 세포 상의 표적 항원들에 T 림프구 또는 NK 세포를 결합시킬 필요성을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한, 바람직하게는 종양 환자, 특히 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 골육종(osteosarcoma, 골원성육종(osteogenic sarcoma, 중피종(mesothelioma), 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피세포육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관 혈관내피세포육종(lymphangioendotheliosarcoma, 윤활막종(synovioma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 흑색종(melanoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 망막아종(retinoblastoma), 희소돌기아세포종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma, 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 만성 골수증식 질환(chronic myeloproliferative syndromes), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemias), B세포 CLL을 포함하는 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemias)(CLL), T세포 CLL, 전림프성 백혈병(prolymphocytic leukemia) 및 모세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemias), B세포 림프종(B-cell lymphomas), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 기저 세포암(basal cell carcinoma), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 방광암종(bladder carcinoma), 이행세포암종(transitional cell carcinoma), 기관지원성암종(bronchogenic carcinoma), 결장암종(colon carcinoma), 결직장암(colorectal carcinoma, 위암종(gastric carcinoma), 폐의 소세포암종(small cell carcinoma) 및 비소세포암종(non-small cell carcinoma)을 포함하는 폐암종(lung carcinoma, 부신 피질 암종(adrenocortical carcinoma), 갑상선암종(thyroid carcinoma), 췌장암종(pancreatic carcinoma), 유방암종(breast carcinoma), 난소암종(ovarian carcinoma), 전립선암종(prostate carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma, 유두암종(papillary carcinoma), 유두샘암종(papillary adenocarcinoma), 낭샘암종cystadenocarcinoma), 수질암종medullary carcinoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 유관암종(ductal carcinoma), 담관암종(bile duct carcinoma), 융모막암종choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아성암종(embryonal carcinoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암종(cervical carcinoma), 자궁암종(uterine carcinoma), 고환암종(testicular carcinoma), 골원성 암종(osteogenic carcinoma), 내피세포암종(epithelial carcinoma), 및 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma), 불규칙적인 수막종(atypical meningioma), 섬세포암종(islet cell carcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 간엽세포종(mesenchymoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma), 투명세포암종(clear cell carcinoma), 및 신경섬유종(neurofibroma mediastinum)으로부터 선택되는 종양이 있는 종양 환자의 치료에 사용하기 위한 구현 1 내지 39 또는 67 내지 71 중 어느 한 구현에 따른 CAR 그룹, 구현 45 내지 48 중 어느 한 구현에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 구현 49 내지 53 중 어느 한 구현에 따른 세포 또는 세포 키트, 특히 T 림프구 또는 NK 세포, 또는 구현 41 내지 48 또는 63 또는 65 중 어느 한 구현에 따른 키트.

67. 구현 1 내지 37 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹은, NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구에서 발현될 때, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹에 포함된 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 각 필요한 다른 폴리펩티드의 존재 하에, 표적 항원 발현 표적 세포와 접촉시 숙주 세포에서의 반응을 이의 비공유적으로 복합체화한 상태로 유도하고, 여기서 이 반응은 인터페론-감마, 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B, 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4의 분비 후, 및/또는 세포 탈과립에 의해 정의되며, 여기서 세포 탈과립은 바람직하게는 CD107a 양성 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되고, 여기서 상기 이 반응은 CAR 분자 및 상기 CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드에 포함된 이의 항원 결합 모이어티를 통해 상기 CAR 그룹에 의해 인식되는 각 표적 항원의 적어도 100,000 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후, CAR 분자 및 상기 CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드에 포함된 이의 항원 결합 모이어티를 통해 상기 CAR 그룹에 의해 인식되는 그 표적 항원들 중 단지 하나의 동일한 수의 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후의 반응에 비해, 적어도 20% 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 더 높은, CAR 그룹.

68. 구현 1 내지 38 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹은, NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구에서 발현될 때, 표적 항원 발현 표적 세포와 접촉시 숙주 세포에서 반응을 이의 비공유적으로 복합체화한 상태로 유도하고, 여기서 이 반응은 인터페론-감마, 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B, 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4의 분비 후, 및/또는 세포 탈과립에 의해 정의되며, 여기서 세포 탈과립은 바람직하게는 CD107a 양성 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되고, 여기서 상기 그룹의 CAR 분자 내의 항원 결합 모이어티들을 통해 표적 항원들과 독점적으로 상호 작용하는 상기 CAR 그룹에 의해 인식되는 각 표적 항원의 적어도 100,000 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후, 상기 CAR 그룹에 의해 인식되는 그 표적 항원들 중 단지 하나의 동일한 수의 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후의 반응에 비해, 적어도 20% 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 더 높은, CAR 그룹.

69. 구현 1 내지 37 및 39 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹은, NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구에서 발현될 때, 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 CAR 그룹에 포함된 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 각각의 필요한 다른 폴리펩티드의 존재 하에, 표적 항원 발현 표적 세포와 접촉시 숙주 세포에서의 반응을 이의 비공유적으로 복합체화한 상태로 유도하고, 상기 반응은 인터페론-감마, 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B, 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4의 분비 후, 및/또는 세포 탈과립에 의해 정의되고, 상기 세포 탈과립은 바람직하게는 CD107a 양성 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되고, 상기 CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드에 포함된 항원 결합 모이어티들을 통해 간접적으로 표적 항원들과 독점적으로 상호 작용하는 상기 CAR 그룹에 의해 인식되는 각 표적 항원의 적어도 100,000 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후, 이 CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티들에 의해 인식되는 표적 항원들 중 단지 하나의 동일한 수의 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉한 후의 반응에 비해, 적어도 20% 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 더 높은, CAR 그룹.

70. 구현 1 내지 38 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹은 이의 CAR 분자에 포함된 항원 결합 모이어티들을 통해 단지 직접적으로 이의 표적 항원들과 상호 작용하고, 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화는 하나 이상의 종류의 조절 분자의 유효 농도의 존재를 필요로 하고, 상기 CAR 그룹은, NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구에서 발현될 때, CAR 그룹에 의해 인식되는 각 표적 항원의 적어도 100,000 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉시 숙주 세포에서 비공유적으로 복합체화한 상태로 반응을 유도하고, 상기 반응은 인터페론-감마, 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B, 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4의 분비, 및/또는 세포 탈과립에 의해 정의되며, 여기서 상기 세포 탈과립은 바람직하게는 CD107a 양성 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되며, 여기서 상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화에 필요한 모든 조절 분자의 유효 농도의 존재 하에 유도된 반응은 임의의 조절 분자의 부재 하에 유도되는 반응에 비해 적어도 20 % 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 더 높으며, 여기서 각각의 필요한 조절 분자의 유효 농도는 이를 필요로 하는 개체에게 1회 이상의 용량으로 각각의 필요한 조절 분자의 유효량을 투여함으로써 달성되는 농도인, CAR 그룹.

71. 구현 1 내지 38 중 어느 한 구현에 있어서,

상기 CAR 그룹은 이의 CAR 분자에 결합할 수 있는 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 포함된 항원 결합 모이어티들을 통해 단지 독점적으로 간접적으로 이의 표적 항원들과 상호 작용하고, 상기 CAR 그룹은 임의의 조절 분자의 부재 하에 비공유적으로 복합체화되고, 상기 CAR 그룹은, NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구에서 발현될 때, CAR 그룹에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드에 의해 인식되는 각 표적 항원의 적어도 100,000 분자를 발현하는 표적 세포와 접촉시 숙주 세포에서 반응을 유도하고, 상기 반응은 인터페론-감마, 및/또는 대식세포 염증성 단백질-1(Macrophage inflammatory protein-1, MIP-1) 알파, 및/또는 MIP-1 베타, 및/또는 그랜자임 B, 및/또는 IL-2, 및/또는 TNF, 및/또는 IL-10, 및/또는 IL-4의 분비, 및/또는 세포 탈과립에 의해 정의되고, 여기서 상기 세포 탈과립은 바람직하게는 CD107a 양성 이펙터 세포의 백분율에 의해 검출되며,

상기 CAR 그룹의 비공유 복합체화에 필요한, CAR 그룹에 결합할 수 있고 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는, 모든 다른 폴리펩티드의 유효 농도의 존재 하에 유도되는 반응은, CAR 그룹에 결합할 수 있고 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는, 임의의 다른 폴리펩티드의 부재 시 유도되는 반응에 비해 20% 더 높고, 바람직하게는 적어도 50% 더 높고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 더 높고, 여기서 각각의 필요한 다른 폴리펩티드의 유효 농도는 이를 필요로 하는 개체에게 1회 이상의 용량으로 각각의 필요한 다른 폴리펩티드의 유효량을 투여함으로써 달성되는 농도인, CAR 그룹.

SEQUENCE LISTING <110> ST. ANNA KINDERKREBSFORSCHUNG UNIVERSITAT FUR BODENKULTUR WIEN <120> A group of chimeric antigen receptors (CARs) <130> R 75558 <150> EP 18198843.7 <151> 2018 10 05 <150> EP 19175975.2 <151> 2019 05 22 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 4 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 5 Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 6 Gly Ser Ser Ser Gly 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 7 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 8 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 9 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 10 Asp Ala Phe Gln Leu Arg Gln Leu Ile Leu Arg Gly Leu Gln Asp Asp 1 5 10 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 11 Ser Pro Gly Ser Arg Glu Trp Phe Lys Asp Met Leu Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 12 Pro Arg Gln Gly Ser Ile Leu Tyr Ser Met Leu Thr Ser Ala Lys Gln 1 5 10 15 Thr <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 13 Pro Lys Lys Glu Asn Asn Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Leu Asp Arg Asp 1 5 10 15 Asp Pro Ser Asp Val 20 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 14 Asp Ala Phe Gln Leu Arg Gln Leu Ile Leu Arg Gly Leu Gln Asp Asp 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 15 Ser Ser Lys Gly Val Leu Trp Arg Met Leu Ala Glu Pro Val Ser Arg 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 16 Ser Arg Thr Leu Gln Leu Asp Trp Gly Thr Leu Tyr Trp Ser Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 17 Ser Ser Asn His Gln Ser Ser Arg Leu Ile Glu Leu Leu Ser Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 18 Arg Leu Thr Lys Thr Asn Pro Ile Leu Tyr Tyr Met Leu Gln Lys Gly 1 5 10 15 Gly Asn Ser Val Ala 20 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 19 Asn Leu Leu Glu Arg Arg Thr Val Leu Gln Leu Leu Leu Gly Asn Pro 1 5 10 15 Thr Lys Gly Arg Val 20 <210> 20 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 20 Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Lys Trp Val Ile Arg Trp Gly Gln His Ile Ala Phe Lys 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Trp Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 21 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 21 Ala Ala Val Lys Leu Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Lys Tyr Val Asp Arg Ala Gly Gln Phe Ile Trp Phe Glu 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Gly Gly Ala Leu Gly Thr Gly Trp Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 22 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 22 Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Arg Ile Ala Phe Gly 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 23 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 23 Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Ala Gly Gln Arg Ile Ala Phe Gly 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 24 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 24 Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Ala Ile Ala Phe Gly 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 25 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 25 Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Arg Ile Ala Phe Ala 20 25 30 Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu Lys 35 40 45 Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln 50 55 60 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 26 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 27 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ala Arg Gln Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 28 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ala Gln Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 29 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Ala Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 30 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 30 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Ala Trp Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 31 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 31 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Ala Glu Ile 1 5 10 15 Gln Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 32 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Arg Gln Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Ala Leu Pro Asn Leu Ala Trp Thr Gln Ser Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 33 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide 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Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Phe Glu 130 135 140 Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu 145 150 155 160 Gly Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser 165 170 175 Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr 180 185 190 Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu Thr Ser Ser Arg Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser 210 215 220 Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val 225 230 235 240 His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg 245 250 255 Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile 260 265 270 Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala 275 280 285 Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro 290 295 300 Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu 305 310 315 320 Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Val Lys 325 330 335 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln 340 345 350 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 355 360 365 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 370 375 380 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 385 390 395 400 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 405 410 415 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 420 425 430 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 445 <210> 76 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 76 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Arg Ile Ala Phe 35 40 45 Ala Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 85 90 95 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Ile Tyr 130 135 140 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala 165 170 175 His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu 180 185 190 Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Ser Arg Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly 210 215 220 Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr 225 230 235 240 Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg 245 250 255 Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly 260 265 270 Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu 275 280 285 Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile 290 295 300 Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu 305 310 315 320 Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser 325 330 335 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 340 345 350 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 355 360 365 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 370 375 380 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 385 390 395 400 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 405 410 415 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 420 425 430 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 <210> 77 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 77 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Ala Gly Gln Arg Ile Ala Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 85 90 95 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 130 135 140 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 165 170 175 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 180 185 190 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 195 200 205 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 210 215 220 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 245 250 255 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 260 265 270 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 275 280 285 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 290 295 300 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 305 310 315 320 <210> 78 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 78 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Ala Gly Gln Arg Ile Ala Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 85 90 95 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Ile Tyr 130 135 140 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 165 170 175 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 180 185 190 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 195 200 205 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 210 215 220 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 245 250 255 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 260 265 270 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 275 280 285 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 290 295 300 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 305 310 315 320 <210> 79 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 79 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Arg Ile Ala Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 85 90 95 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 130 135 140 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 165 170 175 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 180 185 190 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 195 200 205 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 210 215 220 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 245 250 255 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 260 265 270 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 275 280 285 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 290 295 300 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 305 310 315 320 <210> 80 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 80 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Met Ala Thr Val Lys Phe Thr Tyr Gln Gly Glu Glu Lys Gln Val Asp 20 25 30 Ile Ser Lys Ile Met Tyr Val Ile Arg Gly Gly Gln Arg Ile Ala Phe 35 40 45 Gly Tyr Asp Glu Gly Asp Gly Ala Trp Gly Asp Gly Ile Val Ser Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys Gln Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu 85 90 95 Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 100 105 110 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Ile Tyr 130 135 140 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 145 150 155 160 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 165 170 175 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 180 185 190 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 195 200 205 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 210 215 220 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 245 250 255 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 260 265 270 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 275 280 285 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 290 295 300 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 305 310 315 320 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 81 Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 82 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <400> 82 His His His His His His 1 5

Claims (15)

1. 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성되는 키메라 항원 수용체(CAR) 그룹으로서,
   여기서 상기 CAR 그룹의 각 구성원은 아미노산 서열이 서로 상이하고,
   여기서 상기 그룹의 각각의 CAR 분자는 적어도 하나의 막관통 도메인, 및 항원 결합 모이어티 또는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 결합 부위를 포함하는 엑토도메인을 포함하고, 상기 엑토도메인은 1개 또는 2개의 항원 결합 모이어티 및/또는 각각 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하는 다른 폴리펩티드가 결합할 수 있는 1개 또는 2개의 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 그룹의 적어도 하나의 CAR 분자는 추가적으로 적어도 하나의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해 신호를 전달할 수 있는 적어도 하나의 신호전달 영역을 포함하는 엔도도메인을 포함하고,
   여기서 각 CAR 분자가 엔도도메인을 포함하는 경우, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엔도도메인이 세포에서 발현되면, 세포막의 세포 내 측에 위치하며, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 엑토도메인이 세포에서 발현되면, 세포막의 세포 외 측으로 전위되고, 상기 그룹의 각 CAR 분자의 막관통 도메인이 세포에서 발현되는 경우, 세포막에 위치하고;
   여기서 상기 그룹의 이의 일반적인 형태(prevalent conformation)의 각 CAR 분자의 엑토도메인은 각각 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 아미노산 모이어티가 없고,
   여기서 상기 그룹의 상이한 CAR 분자 및 상이한 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티는 서로 공유적으로 연결되지 않은 상이한 표적 항원에 대해 특이적이고,
   상기 그룹의 CAR 분자의 각각의 개별 항원 모이어티의 이의 각 표적 항원에 대한 친화성은 1mM 내지 100nM이고,
   상기 다른 폴리펩티드의 각각의 개별 항원 결합 모이어티의 각 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1mM 내지 100nM이고,
   상기 그룹의 각 CAR 분자는 상기 그룹의 다른 CAR 분자와 정의된 이종이량체화를 매개할 수 있는 적어도 하나의 이종이량체화 도메인을 포함하고, 여기서 한 쌍의 이종이량체화 도메인의 이 이종이량체화는 조절 분자와 무관하게 발생하거나, 또는 조절 분자의 부재 하에 발생하고, 조절 분자에 의해 감소되고, 또는 조절 분자에 의해 유도되고 선택적으로 또 다른 조절 분자에 의해 감소되고, 여기서 조절 분자는 생리적 조건 하에서 한 쌍의 이종이량체화 도메인 중 적어도 하나의 구성원에 결합할 수 있고, 이종이량체화를 유도하거나 감소시킴으로써 2개, 3개 또는 4개의 CAR 분자로 구성된 CAR의 비공유 복합체 그룹의 형성을 유도하거나 감소시킬 수 있는,
   키메라 항원 수용체 (CAR) 그룹.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 1mM 내지 150nM, 바람직하게는 1mM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 1mM 내지 300nM, 특히 1mM 내지 400nM이고, 그리고
   여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 1mM 내지 150nM, 바람직하게는 1mM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 1mM 내지 300nM, 특히 1mM 내지 400nM인, CAR 그룹.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500μM 내지 100nM, 바람직하게는 250μM 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 100nM, 특히 50μM 내지 100nM이고, 그리고
   여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500μM 내지 100nM, 바람직하게는 250μM 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 100nM, 특히 50μM 내지 100nM인, CAR 그룹.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 그룹의 CAR 분자의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성은 500μM 내지 150nM, 바람직하게는 250μM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 300nM, 특히 50μM 내지 400nM이고, 그리고
   여기서 다른 폴리펩티드의 각 개별 항원 결합 모이어티의 이의 표적 항원에 대한 친화성 또는 대안적으로 이 다른 폴리펩티드의 이의 각각의 CAR 분자의 결합 부위에 대한 친화성은 500μM 내지 150nM, 바람직하게는 250μM 내지 200nM, 더욱 바람직하게는 125μM 내지 300nM, 특히 50μM 내지 400nM인, CAR 그룹.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 CAR 그룹 또는 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드의 항원 결합 모이어티에 의해 특이적으로 인식되는 상기 표적 항원들은 자연발생 세포 표면 항원 또는 자연발생 세포 표면 항원들에 결합된 폴리펩티드, 탄수화물 또는 지질인, CAR 그룹.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 CAR 그룹 및 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티가 세포 상에 존재하는 적어도 2개의 상이한 표적 항원에 결합하고, 바람직하게는 고체 표면, 또는 지질 이중층 상의 세포의 적어도 2개의 상이한 표적 항원에 결합하고, 특히 여기서 적어도 하나의 표적 항원은 바람직하게는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD28, CD30, CD33, CD35, CD38, CD40, CD42c, CD43, CD44, CD44v6, CD47, CD49D, CD52, CD53, CD56, CD70, CD72, CD73, CD74, CD79A, CD79B, CD80, CD82, CD85A, CD85B, CD85D, CD85H, CD85K, CD96, CD107a, CD112, CD115, CD117, CD120b, CD123, CD146, CD148, CD155, CD185, CD200, CD204, CD221, CD271, CD276, CD279, CD280, CD281, CD301, CD312, CD353, CD362, BCMA, CD16V, CLL-1, Ig kappa, TRBC1, TRBC2, CKLF, CLEC2D, EMC10, EphA2, FR-a, FLT3LG, FLT3, Lewis-Y, HLA-G, ICAM5, IGHA1/IgA1, IL-1RAP, IL-17RE, IL-27RA, MILR1, MR1, PSCA, PTCRA, PODXL2, PTPRCAP, ULBP2, AJAP1, ASGR1, CADM1, CADM4, CDH15, CDH23, CDHR5, CELSR3, CSPG4, FAT4, GJA3, GJB2, GPC2, GPC3, IGSF9, LRFN4, LRRN6A/LINGO1, LRRC15, LRRC8E, LRIG1, LGR4, LYPD1, MARVELD2, MEGF10, MPZLI1, MTDH, PANX3, PCDHB6, PCDHB10, PCDHB12, PCDHB13, PCDHB18, PCDHGA3, PEP, SGCB, 베자틴(vezatin), DAGLB, SYT11, WFDC10A, ACVR2A, ACVR2B, 아나플라스틱 림포마 키나아제(anaplastic lymphoma kinase), 카데린(cadherin) 24, DLK1, GFRA2, GFRA3, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EFNB1, EPOR, FGFR2, FGFR4, GALR2, GLG1, GLP1R, HBEGF, IGF2R, UNC5C, VASN, DLL3, FZD10, KREMEN2, TMEM169, TMEM198, NRG1, TMEFF1, ADRA2C, CHRNA1, CHRNB4, CHRNA3, CHRNG, DRD4, GABRB3, GRIN3A, GRIN2C, GRIK4, HTR7, APT8B2, NKAIN1, NKAIN4, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1I, CACNG8, CACNG4, CLCN7, KCNA4, KCNG2, KCNN3, KCNQ2, KCNU1, PKD1L2, PKD2L1, SLC5A8, SLC6A2, SLC6A6, SLC6A11, SLC6A15, SLC7A1, SLC7A5P1, SLC7A6, SLC9A1, SLC10A3, SLC10A4, SLC13A5, SLC16A8, SLC18A1, SLC18A3, SLC19A1, SLC26A10, SLC29A4, SLC30A1, SLC30A5, SLC35E2, SLC38A6, SLC38A9, SLC39A7, SLC39A8, SLC43A3, TRPM4, TRPV4, TMEM16J, TMEM142B, ADORA2B, BAI1, EDG6, GPR1, GPR26, GPR34, GPR44, GPR56, GPR68, GPR173, GPR175, LGR4, MMD, NTSR2, OPN3, OR2L2, OSTM1, P2RX3, P2RY8, P2RY11, P2RY13, PTGE3, SSTR5, TBXA2R, ADAM22, ADAMTS7, CST11, MMP14, LPPR1, LPPR3, LPPR5, SEMA4A, SEMA6B, ALS2CR4, LEPROTL1, MS4A4A, ROM1, TM4SF5, VANGL1, VANGL2, C18orf1, GSGL1, ITM2A, KIAA1715, LDLRAD3, OZD3, STEAP1, MCAM, CHRNA1, CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB4, KIAA1524, NRM.3, RPRM, GRM8, KCNH4, 멜라노코르틴 1 수용체(Melanocortin 1 receptor), PTPRH, SDK1, SCN9A, SORCS1, CLSTN2, 엔도텔린 전환효소 유사-1(Endothelin converting enzyme like-1), 리소포스파틱산 수용체 2(Lysophosphatic acid receptor 2), LTB4R, TLR2, 뉴로트로픽 티로신 키나아제 1(Neurotropic tyrosine kinase 1), MUC16, B7-H4, 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)(EGFR), ERBB2, HER3, EGFR variant III(EGFRvIII), HGFR, FOLR1, MSLN, CA-125, MUC-1, 전립선-특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen)(PSMA), 메소텔린(mesothelin), 상피세포 부착분자(epithelial cell adhesion molecule)(EpCAM), L1-CAM, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, VEGFR1, VEGFR2, 고분자량-멜라노마 관련 항원(high molecular weight-melanoma associated antigen)(HMW-MAA), MAGE-A l, IL-13R-α2, 디시알로갱글리오사이드(disialogangliosides)(GD2 및 GD3), 종양-관련 탄수화물 항원(tumour-associated carbohydrate antigens)(CA-125, CA-242, Tn 및 sialyl-Tn), 4-1BB, 5T4, BAFF, 카보닉 안하이드라아제 9(carbonic anhydrase 9)(CA-IX), C-MET, CCR1, CCR4, FAP, 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B(fibronectin extra domain-B)(ED-B), GPNMB, IGF-1 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, ITB5, ITGAX, 엠비긴(embigin), PDGF-Rα, ROR1, 신데칸 1(Syndecan 1), TAG-72, 테나신 C(tenascin C), TRAIL-R1, TRAIL-R2, NKG2D-리간드, 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자 제시 종양-특이 펩티드 에피토프, 바람직하게 PR1/HLA-A2, 계통-특이적(lineage-specific) 또는 조직-특이적(tissue-specific) 조직 항원, 바람직하게 CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD24, CD25, CD34, CD80, CD86, CD133, CD138, CD152, CD319, 엔도글린(endoglin), 및 MHC 분자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 분자를 포함하는, CAR 그룹.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 또는 시험관 내 전사된 RNA로부터 선택되는, 핵산 분자.
   
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 키트로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 또는 시험관 내 전사된 RNA로부터 선택되는, 핵산 분자 키트.
   
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 벡터 키트로서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인, 벡터 또는 벡터 키트.
   
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹의 개별 CAR 분자를 생산하기 위해, 제7항 또는 제8항에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자 키트를 사용하여, 또는 제9항에 따른 벡터 또는 벡터 키트를 사용하여 시험관 내 또는 생체 외 변형된 세포, 또는 2개 이상의 상기 변형된 세포를 포함하는 키트.
    
11. 제7항 또는 제8항에 따른 핵산 또는 핵산 키트, 제9항에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 제10항에 따른 세포 또는 세포 키트를 포함하는, 약학 제제.
    
12. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹으로서, 상기 방법은
    i) 개체로부터 획득한 NK 세포 또는 바람직하게는 T 림프구를 상기 CAR 그룹의 각각의 CAR 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 벡터로 유전자(genetically) 변형시키는 단계로서, 여기서 상기 CAR 그룹의 항원 결합 모이어티 및/또는 상기 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티는 개체에서 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 여기서 상기 유전자 변형은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행하는, 단계;
    ii) 유전자 변형된 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및 선택적으로
    iii) 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드의 유효량을 개체에게 투여하고, 및/또는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 여기서 상기 비공유적으로 복합체화된 CAR 그룹은, 생리적 발현 수준에서 각각의 표적 항원 조합을 발현하는 암 세포와 접촉시 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계
    를 포함하는, CAR 그룹.
    
13. 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제10항에 따른 세포로서, 상기 CAR 그룹의 항원 결합 모이어티 및/또는 그룹의 CAR 분자에 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드(들)의 항원 결합 모이어티는 개체의 암 세포 상의 표적 항원에 특이적이고, 상기 방법은
    i) 세포를 개체 내에 도입하는 단계; 및 선택적으로
    ii) 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 및/또는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도 또는 감소시키고, 바람직하게는 상기 그룹의 각각의 CAR 분자의 이종이량체화를 유도하는 적어도 하나의 조절 분자의 유효량을 개체에게 투여하고, 여기서 상기 비공유적으로 복합체화된 CAR 그룹은, 각각의 표적 항원을 발현하는 암 세포와 접촉시 암세포의 사멸을 유도하고 이에 따라 암을 치료할 수 있는, 유전자 변형된 세포의 활성화를 매개하는, 단계
    를 포함하는, 세포.
    
14. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹, 제9항에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 제10항에 따른 세포 또는 세포 키트, 및
    - 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함하고 상기 CAR 그룹의 CAR 분자의 결합 부위에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 폴리펩티드, 및/또는 적어도 하나의 조절 분자
    를 포함하는 키트.
    
15. 세포 상의 표적 항원에 T 림프구 또는 NK 세포를 결합시킬 필요성을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한, 바람직하게는 종양 환자, 특히 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 골육종(osteosarcoma, 골원성육종(osteogenic sarcoma, 중피종(mesothelioma), 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피세포육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관 혈관내피세포육종(lymphangioendotheliosarcoma, 윤활막종(synovioma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 흑색종(melanoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 망막아종(retinoblastoma), 희소돌기아세포종(oligodendroglioma), 수막종(menangioma), 두개인두종(craniopharyngioma), 상의세포종(ependymoma), 송과체종(pinealoma, 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 만성 골수증식 질환(chronic myeloproliferative syndromes), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemias), B세포 CLL을 포함하는 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemias)(CLL), T세포 CLL, 전림프성 백혈병(prolymphocytic leukemia) 및 모세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemias), B세포 림프종(B-cell lymphomas), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 기저 세포암(basal cell carcinoma), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 방광암종(bladder carcinoma), 이행세포암종(transitional cell carcinoma), 기관지원성암종(bronchogenic carcinoma), 결장암종(colon carcinoma), 결직장암(colorectal carcinoma, 위암종(gastric carcinoma), 폐의 소세포암종(small cell carcinoma) 및 비소세포암종(non-small cell carcinoma)을 포함하는 폐암종(lung carcinoma, 부신 피질 암종(adrenocortical carcinoma), 갑상선암종(thyroid carcinoma), 췌장암종(pancreatic carcinoma), 유방암종(breast carcinoma), 난소암종(ovarian carcinoma), 전립선암종(prostate carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 한선암종(sweat gland carcinoma), 피지선암종(sebaceous gland carcinoma, 유두암종(papillary carcinoma), 유두샘암종(papillary adenocarcinoma), 낭샘암종cystadenocarcinoma), 수질암종medullary carcinoma), 신세포암종(renal cell carcinoma), 유관암종(ductal carcinoma), 담관암종(bile duct carcinoma), 융모막암종choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아성암종(embryonal carcinoma), 빌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암종(cervical carcinoma), 자궁암종(uterine carcinoma), 고환암종(testicular carcinoma), 골원성 암종(osteogenic carcinoma), 내피세포암종(epithelial carcinoma), 및 비인두암종(nasopharyngeal carcinoma), 불규칙적인 수막종(atypical meningioma), 섬세포암종(islet cell carcinoma), 수질암종(medullary carcinoma), 간엽세포종(mesenchymoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 간모세포종(hepatoblastoma), 투명세포암종(clear cell carcinoma), 및 신경섬유종(neurofibroma mediastinum)으로부터 선택되는 종양이 있는 종양 환자의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 CAR 그룹, 제9항에 따른 벡터 또는 벡터 키트, 또는 제10항에 따른 세포 또는 세포 키트, 특히 T 림프구 또는 NK 세포, 또는 제8항, 제9항 또는 제14항 중 어느 한 항에 따른 키트.
    

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