CN110678480A - 嵌合多肽和改变它们的在细胞膜中的定位的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了将蛋白质可逆地定位于细胞表面的外部部分的方法和组合物。基本上，除跨膜结构域外该蛋白质必须还包含激素受体，例如雌激素受体alpha或孕酮受体。本文提供的组合物可以包括编码感兴趣的多肽和核激素受体的配体结合结构域(LBD)的核酸。提供了医学应用，包括控制CAR T细胞的毒性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/477,733和2017年11月16日提交的美国临时专利申请系列号62/587,262的优先权；其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及嵌合多肽的细胞定位的调节。
发明背景
嵌合抗原受体(CAR)是单链和多链多肽的亚类。嵌合抗原受体通常包括例如抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ或其他信号传导结构域。已经研究了将CAR用于哺乳动物中不同癌症例如血液学癌症的临床治疗中，并相当成功。然而，限制因素一直是与CAR抗癌活性相关的不可控制的毒性。
核激素受体是一类包括几个结构域的多肽，其包括DNA结合基序和配体结合结构域。在配体不存在的情况下，天然存在的核激素受体与各种分子伴侣和其他相互作用蛋白缔合，将核激素受体隔离在细胞核之外。配体结合诱导核激素受体构象和相互作用配偶体的变化，并允许核激素靶基因的核易位和转录激活或抑制。虽然类固醇信号传导的经典观点认为这些激素结合充当配体激活的转录因子的细胞内受体，但据报道，类固醇也可以通过细胞表面处的非基因组机制起作用。
发明概述
本公开至少部分地基于以下发现：可以将包括跨膜结构域的嵌合多肽的可逆细胞外膜定位利用于医学应用中，其中期望在细胞外膜上可逆地表达感兴趣的蛋白质或肽。本公开的示例性特征是与CAR T细胞相关的毒性可以通过在其表面上可逆地表达CAR的抗原结合结构域来调节。
本公开进一步至少部分地基于以下发现：哺乳动物细胞中包括跨膜结构域和激素受体配体结合结构域的嵌合多肽的质膜定位或细胞外膜定位可以通过使哺乳动物细胞与激素或激素类似物接触来调节，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约700个氨基酸(例如1至约500个氨基酸)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽(例如，单链嵌合抗原受体)中。鉴于这一发现，本文提供：单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体；编码其的核酸；包括这些核酸的任一个的载体；包括这些载体的任一个的哺乳动物细胞；以及可逆地诱导细胞外膜定位的方法和改变这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合多肽的膜定位的方法。
在一些实施方案中，使用本文公开的一种或多种组合物或方法可逆地诱导多肽(例如单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)的质膜定位或细胞外膜定位在基于细胞的过继免疫疗法的领域中是有用的，其中从受试者分离的免疫细胞可以经修饰以表达合成蛋白，这使细胞在随后被转移回到受试者中之后能够执行新的治疗功能。此类合成蛋白的非限制性实例是嵌合抗原受体(CAR)和工程化T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，使用本文公开的一种或多种组合物或方法可逆地诱导多肽(例如单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)的质膜定位或细胞外膜定位在控制嵌合抗原T细胞(CAR-T细胞)的毒性作用中是有用的，通过调节细胞的质膜或细胞外膜上抗原结合部分的存在或不存在所述嵌合抗原T细胞(CAR-T细胞)参与消除癌细胞。
本文提供了单链嵌合多肽，其包括：跨膜结构域；和激素受体配体结合结构域，其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或约1至50个氨基酸)分隔。
本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的任何核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。
本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧。
还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与增加量的激素或激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平增加。
本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞(例如，选自下组的T细胞：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。
本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；激素受体配体结合结构域；共刺激结构域；和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是4-1BB或CD28。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，ITAM包括来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或1至50个氨基酸)分隔。
本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。
还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。
本文还提供了改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平降低。这些方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平增加。
本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。
本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域；跨膜结构域；和激素受体配体结合结构域；其中：跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸(例如1至250个氨基酸或1至50个氨基酸)分隔。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个多肽进一步包括共刺激结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域是4-1BB或CD28。
本文还提供了诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。
本文还提供了改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。
本文还提供了治疗受试者(例如人)中癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体或本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中抗原结合结构域与受试者中癌症表达的抗原特异性结合；(b)向受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导单链或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；(c)确定(b)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和(e)向受试者施用一定量的激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少25％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少50％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少75％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少100％。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。在这些方法的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。
本文还提供了单链嵌合多肽，其包括：细胞外激素受体配体结合结构域；和跨膜结构域，其中：激素受体配体结合结构域和细胞外跨膜结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。
在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何单链嵌合多肽的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。
本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合多肽的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧。
本文还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与增加量的激素或激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。
本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域；细胞外激素受体配体结合结构域；跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；其中：跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自4-1BB或CD28的细胞质共刺激结构域。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内ITAM包含来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。
在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。
本文还提供了包括编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸。本文还提供了包括包含编码本文所述的任何单链嵌合抗原受体的核苷酸序列的核酸的载体。本文还提供了包括本文所述的任何载体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
本文还提供了诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。
本文还提供了改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合抗原受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括：将编码单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。
本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域；细胞外激素受体配体结合结构域；和跨膜结构域；其中：跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，单一抗原是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，肿瘤抗原是CD19。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包括氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此直接邻接。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域由1至700个氨基酸(例如1至500个氨基酸、1至250个氨基酸、1至100个氨基酸、1至50个氨基酸或1至25个氨基酸)分隔。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个多肽进一步包括细胞内共刺激结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，细胞内共刺激结构域是来自4-1BB或CD28的细胞质共刺激结构域。
在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在本文所述的任何多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，至少一个第一多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。
本文还提供了编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸。本文还提供了一起编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的组。本文还提供了包括编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的哺乳动物细胞。本文还提供了包括一起编码本文所述的任何多链嵌合抗原受体的核酸的组的哺乳动物细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何哺乳动物细胞的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
本文还提供了诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧。
本文还提供了改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，其包括：(a)使表达本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导多链嵌合抗原结合受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平降低。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致细胞的质膜的细胞外侧的多链嵌合抗原结合受体的水平增加。本文所述的任何方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括：将编码多链嵌合抗原受体的核酸或一起编码多链嵌合受体的一组核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，受试者已鉴定或诊断为患有癌症。本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物中进行。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物患有癌症。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物中癌症的治疗。
本文还提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括：(a)向受试者施用表达本文所述的任何单链嵌合抗原受体或本文所述的任何多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中抗原结合结构域与受试者中癌症表达的抗原特异性结合；(b)向受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导单链或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；(c)确定(b)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和(e)向受试者施用一定量的激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少25％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少50％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少至少75％。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与步骤(b)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量减少100％。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。
在名词之前使用术语“一个”意指该特定名词的“一个或多个”。例如，短语“一个哺乳动物细胞”意指“一个或多个哺乳动物细胞”。
术语“单链嵌合多肽”意指包括第一连续氨基酸序列(例如，第一结构域)和第二连续氨基酸序列(例如，第二结构域)的单链多肽，其中第一连续氨基酸氨基酸序列和第二连续氨基酸序列不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。在一些实例中，第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列在单链嵌合多肽中彼此直接邻接。在一些实例中，第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列由一个或多个居间的氨基酸(例如，一个或多个结构域)分隔。术语“单链嵌合多肽”不意图以任何方式限制单链多肽中第一连续氨基酸序列和第二连续氨基酸序列的相对位置。本文描述了单链嵌合多肽(例如，单链嵌合抗原受体)的非限制性实例。单链嵌合多肽(例如，单链嵌合抗原受体)的另外的实例是本领域已知的。
术语“嵌合抗原受体”和“CAR”在本文可互换使用，并且是指能够触发或抑制免疫细胞活化的人工多模块分子，其通常但不排他地包含细胞外结构域(例如配体/抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域。CAR分子及其衍生物(例如CAR变体)描述于PCT申请号US2014/016527；Fedorov et al.Sci Transl Med(2013)；5(215):215ra172；Glienke et al.Front Pharmacol(2015)6:21；Kakarla&Gottschalk 52CancerJ(2014)20(2):151-5；Riddell et al.Cancer J(2014)20(2):141-4；Pegram etal.Cancer J(2014)20(2):127-33；Cheadle et al.Immunol Rev(2014)257(1):91-106；Barrett et al.Annu Rev Med(2014)65:333-47；Sadelain et al.Cancer Discov(2013)3(4):388-98；Cartellieri et al.,J BiomedBiotechnol(2010)956304中；其公开以其整体通过引用并入本文。
术语“多链嵌合多肽”意指包括两个或更多个单链多肽的多肽，其中两个或更多个单链多肽中的至少一个是如本文定义和描述的单链嵌合多肽。本文描述了多链嵌合多肽(例如，多链嵌合抗原受体)的非限制性实例。多链嵌合多肽(例如，多链嵌合抗原受体)的另外的实例是本领域已知的。
术语“跨膜结构域”意指包括至少一个连续氨基酸序列的多肽的结构域，所述连续氨基酸序列当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层。例如，跨膜结构域可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续氨基酸序列，当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时，其各自横穿脂质双层。如本领域中已知的，跨膜结构域可以例如包括至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中具有α-螺旋二级结构。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括两个或更多个(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时各自横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中形成β-桶二级结构。本文描述了跨膜结构域的非限制性实例。跨膜结构域的另外的实例是本领域已知的。
短语“质膜的细胞外侧”用于描述多肽的位置时意指多肽包括至少一个横穿质膜的跨膜结构域和至少一个定位于细胞外空间的结构域(例如，至少一个抗原结合结构域)。
术语“激素受体配体结合结构域”意指激素受体多肽中与激素或激素类似物特异性结合的结构域。本文描述了激素受体配体结合结构域(LBD)的非限制性实例。在一些情况下，核激素受体的LBD选自雌激素受体、蜕皮激素受体、PPARγ受体、糖皮质激素受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、盐皮质激素受体、孕酮受体、维生素D受体、PPAR受体α、PPARβ/δ受体、孕烷X受体、肝X受体、法尼酯X受体(farnesoid X receptor)、类视色素X受体(retinoidX receptor)、RAR相关的孤儿受体和视黄酸受体。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的单个LBD。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的多个(例如，两个或更多个)LBD。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的两个LBD。在一些情况下，本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的三个LBD。在本公开的异二聚体多肽的多肽链包含核激素受体的多个(例如，两个或更多个)LBD的情况下，在一些情况下，多个LBD包含相同的氨基酸序列。在一些情况下，两个或更多个LBD是串联的，直接地或通过接头(例如，本文所述的任何接头)分隔。
术语“抗原结合结构域”意指与靶抗原特异性结合的结构域。在一些实例中，抗原结合结构域可以由存在于单链多肽内的氨基酸形成。在其他实例中，抗原结合结构域可以由存在于第一单链多肽内的氨基酸和存在于一个或多个另外的单链多肽(例如，第二单链多肽)内的氨基酸形成。本文描述了抗原结合结构域的非限制性实例，其包括但不限于scFv或生长因子的LBD。抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。
如本文所用，术语“抗原”通常是指由本文所述的抗原结合结构域特异性识别的结合配偶体。示例性抗原包括不同类的分子，例如但不限于多肽及其肽片段、小分子、脂质、碳水化合物和核酸。本文描述了可以由任何抗原结合结构域特异性结合的一种或多种抗原的非限制性实例。可以由任何抗原结合结构域特异性结合的一种或多种抗原的另外的实例是本领域已知的。
术语“共刺激结构域”意指来自T淋巴细胞中表达的内源性共刺激跨膜多肽的信号传导结构域，其促进下游T细胞受体信号传导和/或T细胞活化。本文描述了共刺激域的非限制性实例。共刺激结构域的另外的是本领域已知的。参见，例如Chen et al.,NatureReviews Immunol.13:227-242,2013。
术语“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”或“ITAM”意指包括由两个其他氨基酸将一个酪氨酸与一个亮氨酸或异亮氨酸分隔的四氨基酸共有序列的氨基酸基序(YxxL/I)。四氨基酸共有序列中的酪氨酸残基在信号传导途径激酶(例如，淋巴细胞信号传导途径激酶)的相互作用后被磷酸化。本文描述了ITAM的非限制性实例。ITAM的另外的实例是本领域已知的。
术语“激素”意指与激素受体的配体结合结构域特异性结合并调节该激素受体的活性和/或位置的天然存在的分子。本文描述了激素的非限制性实例。激素的另外的实例是本领域已知的。
术语“激素类似物”意指模拟激素的结构并且与激素受体的配体结合结构域特异性结合的分子。本文描述了激素类似物的非限制性实例。激素类似物的另外的实例是本领域已知的。
短语“癌症的治疗”意指在患有癌症的受试者中减少一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)癌症症状的数量、频率或严重性。本文描述了癌症的非限制性症状。癌症的另外的症状是本领域已知的。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明中的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以其整体通过引用并入。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
根据以下发明详述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
图1是测试的不同构建体的示意图。细胞外和细胞内的标记是指相对于细胞膜，其在这些标记之间描绘为灰色框。指示了细胞外scFv结构域和细胞内共刺激(“Costim”)、CD3zeta和mCherry结构域。
图2是表达不同构建体之一的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/mL4-羟基他莫昔芬(“4-OHT”)处理。(A)用编码规范CAR的慢病毒载体或用含有v2、v3和v4 CAR构建体的抗CD19(FMC63)ERa-LBD转导的Jurkat T细胞。(B)用编码v4CAR构建体的慢病毒载体转导原代CD4和CD8人T细胞。
图3是用编码含有ERa-LBD的FMC63 CAR融合物的慢病毒载体转导的HEK-293T细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理。
图4是用编码FMC63 NHR LBD-CAR融合物和具有J6M0 scFv的NHR LBD-CAR的慢病毒载体转导的原代人CD4 T细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理。
图5A是缺乏共刺激和CD3zeta结构域的V5核激素受体配体结合结构域NHR-LBDCAR构建体的示意图，以及用编码V5构建体的慢病毒载体转导的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理。
图5B是未经转导的Jurkat T细胞或用编码CAR的慢病毒载体转导的Jurkat T细胞的一组流式细胞术示意图，所述CAR中用FLAG标签替换了scFv结构域。转导的细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理。
图6是用具有孕酮受体LBD的CAR构建体转导的Jurkat T细胞的一组流式细胞术示意图。细胞未经处理或用500ng/mL米非司酮(mifepristone)处理。
图7A是显示在与抗原阴性(K562细胞系)和抗原阳性(MM1S细胞系)靶标共培养过夜后，用编码J6M0-ERa-LBD CAR构建体的慢病毒载体转导的原代人T细胞的T细胞活化的图。
图7B是显示在与抗原阴性(K562细胞系)和抗原阳性(MM1S细胞系)靶标共培养过夜后，用编码J6M0-ERa-LBD CAR构建体的慢病毒载体转导的原代人T细胞的IFN-γ产生的图。
图8A是显示用编码V4 FMC63-ERa-LBD CAR或规范CAR对照的慢病毒载体转导的原代人CD4 T细胞的增殖的一组流式细胞术示意图，其与抗原阴性(K562细胞系)或抗原阳性(Raji细胞系)靶标共培养，并且使用渐增浓度的配体4-OHT。
图8B是显示使用渐增浓度的4-OHT，由用编码J6M0-ERa-LBD CAR构建体的慢病毒载体转导的原代人T细胞介导的抗原阳性靶标(MM1S细胞系)的裂解的图。
图9是显示在渐增浓度的4-OHT下，在相对于细胞膜的不同位置处具有LBD的各种CAR构建体的表面表达的图。
图10A是显示实验程序的时间线的图解。
图10B是显示与4-OHT共培养之前和之后各种CAR构建体的表面表达的柱状图。
图11A是显示用FLAG-ERa-LBD CAR转导，并且未经处理或用4-OHT处理15或120分钟的的Jurkat T细胞的一组流式细胞术示意图。
图11B是显示用编码FMC63-ERa-LBD CAR的慢病毒载体转导，并且未经处理或用4-OHT处理2小时、4小时或24小时的的人T细胞的一组流式细胞术示意图。
图12是表达具有ERa LBD的FMC63-CAR的原代人T细胞的一组流式细胞术示意图。细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理。一些样品用1μM布雷菲德菌素(Brefeldin)A预处理。
图13是测试的v2 CAR构建体和ECD.v1 CAR(也称为LBD-ECD CAR)构建体的示意图。细胞膜描绘为灰色框。描绘了细胞外scFv结构域、细胞外ERa LBD、跨膜结构域(嵌入细胞膜中)、细胞内4-1BB结构域和细胞内CD3γ结构域。
图14描绘了表达v2 CAR构建体或LBD-ECD CAR构建体的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理或用500ng/mL4-羟基他莫昔芬(“4-OHT”)处理。
图15是显示用编码LBD-ECD CAR构建体(ECD.v1)的慢病毒载体转导的T细胞破坏Nalm 6肿瘤细胞(％裂解)的图。用1.5ng/mL至500ng/mL的4-OHT处理细胞。阳性对照是用编码组成型CAR的慢病毒载体转导的T细胞。阴性对照是未经4-OHT处理的具有LBD-ECD CAR的T细胞。
图16描绘了表达组成型CAR、LBD-ECD CAR或v2 CAR的细胞的一组流式细胞术点图。细胞未经处理，或在流式细胞术之前用含有CD3/CD28的珠子刺激48小时。珠子，Dynabeads aCD3/aCD28，来自ThermoFisher。参见，Trickett et al.,J.Immunol.Methods275:251-255,2003。将每个构建体与cMyc标签融合。
图17是显示在4-羟基他莫昔芬存在(500ng/mL)或不存在的情况下将携带CAR的T细胞与NALM-6靶标共培养过夜后，从ECD.v1 CAR-T细胞或常规CAR-T细胞产生IL-2的图。
发明详述
本文提供了单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体(CAR)和多链嵌合抗原受体；编码其的核酸；包括这些核酸的任一个的载体；包括这些载体的任一个的哺乳动物细胞；以及可逆地诱导细胞外膜定位的方法和改变这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合多肽的膜定位的方法。
本文还提供了具有嵌合抗原受体(CAR)的经遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些情况下，经遗传修饰的哺乳动物细胞衍生自干细胞、祖细胞或衍生自干细胞或祖细胞的细胞。在一些情况下，哺乳动物细胞是T淋巴细胞或NK细胞。
这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体、核酸、载体、哺乳动物细胞和方法的非限制性方面描述如下，并且可以以任何组合使用而没有限制。这些单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体、核酸、载体、哺乳动物细胞和方法的另外的方面是本领域已知的。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和/或方法可以用于在存在与多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)中存在的LBD结合的激素或激素类似物的情况下选择性杀伤受试者中的癌细胞。在一些实施方案中，在存在激素或激素类似物的情况下，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面，在细胞的外部呈现抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的scFv或其他抗原结合结构域)。多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)可以识别与其结合的抗原，并因此可以选择性杀伤在其表面表达抗原的靶细胞(例如癌细胞)。
在一些实施方案中，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面可以在受试者中导致毒性。在一些实施方案中，由于激素或激素类似物诱导的多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面而经历毒性的受试者可以通过减少激素或激素类似物的剂量，或完全消除受试者的激素或激素类似物治疗来治疗或改善。此类剂量的减少或激素或激素类似物治疗的消除可以导致多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽)从细胞表面去除并减少或消除抗原结合结构域在细胞表面上的呈递，从而减少或消除受试者中的毒性。
单链嵌合多肽
单链嵌合多肽—细胞内激素受体LBD
本文提供的是包括跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)和激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)的单链嵌合多肽，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域直接彼此邻接域或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物(例如人)中同一(单个)内源性单链多肽中。
在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域直接邻接激素受体配体结合结构域(即，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间没有居间的氨基酸)。在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由以下分隔：1个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约5个氨基酸、约4个氨基酸或约3个氨基酸(包含在内)；约2个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约5个氨基酸或约4个氨基酸(包含在内)；约3个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约5个氨基酸(包含在内)；约4个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约6个氨基酸(包含在内)；约5个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约6个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸、约310个氨基酸、约300个氨基酸、约290个氨基酸、约280个氨基酸、约270个氨基酸、约260个氨基酸、约250个氨基酸、约240个氨基酸、约230个氨基酸、约220个氨基酸、约210个氨基酸、约200个氨基酸、约195个氨基酸、约190个氨基酸、约185个氨基酸、约180个氨基酸、约175个氨基酸、约170个氨基酸、约165个氨基酸、约160个氨基酸、约155个氨基酸、约150个氨基酸、约145个氨基酸、约140个氨基酸、约135个氨基酸、约130个氨基酸、约125个氨基酸、约120个氨基酸、约115个氨基酸、约110个氨基酸、约105个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约18个氨基酸、约16个氨基酸、约14个氨基酸、约12个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约8个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约52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基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸、约320个氨基酸或约310个氨基酸(包含在内)；约310个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸、约330个氨基酸或约320个氨基酸(包含在内)；约320个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸、约340个氨基酸或约330个氨基酸(包含在内)；约330个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸、约350个氨基酸或约340个氨基酸(包含在内)；约340个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸、约360个氨基酸或约350个氨基酸(包含在内)；约350个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸或约360个氨基酸(包含在内)；约360个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸、约380个氨基酸、约370个氨基酸(包含在内)；约370个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸、约390个氨基酸或约380个氨基酸(包含在内)；约380个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸、约400个氨基酸或约390个氨基酸(包含在内)；约390个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸、约410个氨基酸或约400个氨基酸(包含在内)；约400个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸、约420个氨基酸或约410个氨基酸(包含在内)；约410个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸、约440个氨基酸、约430个氨基酸或约420个氨基酸(包含在内)；约420个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约430个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸、约450个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约440个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸、约460个氨基酸或约450个氨基酸(包含在内)；约450个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸或约460个氨基酸(包含在内)；约460个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸、约480个氨基酸、约470个氨基酸(包含在内)；约470个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸、约490个氨基酸或约480个氨基酸(包含在内)；约480个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸、约500个氨基酸或约490个氨基酸(包含在内)；约490个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸、约520个氨基酸或约500个氨基酸(包含在内)；约500个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸、约540个氨基酸或约520个氨基酸(包含在内)；约520个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸、约560个氨基酸或约540个氨基酸(包含在内)；约540个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸、约580个氨基酸或约560个氨基酸(包含在内)；约560个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸、约600个氨基酸或约580个氨基酸(包含在内)；约580个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸、约620个氨基酸或约600个氨基酸(包含在内)；约600个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸、约640个氨基酸或约620个氨基酸(包含在内)；约620个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸、约660个氨基酸或约640个氨基酸(包含在内)；约640个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸、约680个氨基酸或约660个氨基酸(包含在内)；约660个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸、约700个氨基酸或约680个氨基酸(包含在内)；约680个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸、约720个氨基酸或约700个氨基酸(包含在内)；约700个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸、约740个氨基酸或约720个氨基酸(包含在内)；约720个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸、约760个氨基酸或约740个氨基酸(包含在内)；约740个氨基酸至约800个氨基酸、约780个氨基酸或约760个氨基酸(包含在内)；约760个氨基酸至约800个氨基酸或约780个氨基酸(包含在内)；或约780个氨基酸至约800个氨基酸(包含在内)。
在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是接头肽或者包括接头肽。在一些实施方案中，接头肽可以包括以下氨基酸序列的一个或多个：GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:20)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:21)、RSGSGSGS(SEQ ID NO:22)或GSGSGSGS(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，接头肽可以由以下核酸序列的一个或多个编码：GGATCCGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGC(SEQ ID NO:24)、GGATCTGGCTCTGGAAGCGGCAGC(SEQ ID NO:25)、AGATCCGGATCTGGAAGTGGCTCC(SEQ ID NO:26)或GGAAGTGGATCTGGGAGCGGCTCT(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，接头肽可以例如串联包括SEQ ID NO:20-23中任一个的一个或多个(例如，两个、三个或四个)拷贝。
在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是邻接内源性多肽中跨膜结构域的细胞内序列或者包括邻接内源性多肽中跨膜结构域的细胞内序列，所述跨膜结构域(例如本文所述的任何跨膜结构域)衍生自该内源性多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是一个或多个另外的结构域或者包括一个或多个另外的结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性另外的结构域)。在一些实施方案中，单链嵌合多肽可以是单链嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何单链嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，嵌合多肽可以进一步包括一个或多个另外的结构域。可以包括在单链嵌合多肽中的另外的结构域的非限制性实例包括以下的一个或多个：细胞外配体结合结构域(例如抗原结合结构域，例如本文所述的任何抗原结合结构域)、ITIM(例如，本领域已知的任何ITIM)、ITAM(例如，本文所述或本领域已知的任何ITAM)、二聚化结构域(例如，能够与哺乳动物细胞中表达的另一种多肽(例如重组多肽)中存在的另一种二聚化结构域二聚化，例如本领域已知的任何二聚化结构域)和肽标签(例如聚His标签)。
单链嵌合多肽—细胞外激素受体LBD
本文提供了包括细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)的单链嵌合多肽，其中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物(例如人)中单个内源性单链多肽中。
在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域直接邻接激素受体配体结合结构域(即跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间没有居间的氨基酸)。在单链嵌合多肽的一些实例中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由以下分隔：1个氨基酸至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是接头肽或者包括接头肽。在一些实施方案中，接头肽可以包括以下氨基酸序列的一个或多个：GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:20)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:21)、RSGSGSGS(SEQ ID NO:22)或GSGSGSGS(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，接头肽可以由以下核酸序列的一个或多个编码：GGATCCGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGC(SEQ ID NO:24)、GGATCTGGCTCTGGAAGCGGCAGC(SEQ ID NO:25)、AGATCCGGATCTGGAAGTGGCTCC(SEQ ID NO:26)或GGAAGTGGATCTGGGAGCGGCTCT(SEQ ID NO:27)。在一些实施方案中，接头肽可以例如串联包括SEQ ID NO:20-23中任一个的一个或多个(例如，两个、三个或四个)拷贝。在一些实施方案中，接头肽可以是SEQ ID NO:45、47、49、58、60、62和106的一个或多个或者可以包括SEQ ID NO:45、47、49、58、60、62和106的一个或多个。在一些实施方案中，接头肽可以是GS或者包括GS。
在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是邻接内源性多肽中跨膜结构域的序列或者包括邻接内源性多肽中跨膜结构域的序列，所述跨膜结构域(例如本文所述的任何跨膜结构域)衍生自该内源性多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个居间的氨基酸可以是一个或多个另外的结构域或者包括一个或多个另外的结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性另外的结构域)。在一些实施方案中，单链嵌合多肽可以是单链嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何单链嵌合抗原受体)。在一些实施方案中，嵌合多肽可以进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)另外的结构域。可以包括在单链嵌合多肽中的另外的结构域的非限制性实例包括以下的一个或多个：细胞外配体结合结构域(例如抗原结合结构域，例如本文所述的任何抗原结合结构域)、ITIM(例如，本领域已知的任何ITIM)、ITAM(例如，本文所述或本领域已知的任何ITAM)、二聚化结构域(例如，能够与哺乳动物细胞中表达的另一种多肽(例如重组多肽)中存在的另一种二聚化结构域二聚化，例如本领域已知的任何二聚化结构域)和肽标签(例如聚His标签)。
在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包括细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。
单链嵌合抗原受体
单链嵌合抗原受体—细胞内激素受体LBD
本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)、激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何共刺激结构域)和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，其中：跨膜结构域和激素配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一(单个)内源性单链多肽中。本文所述的单链嵌合抗原受体可以与本文所述的任何示例性抗原或本领域已知的任何其他抗原结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的示例性抗原的任何组合)特异性结合。
在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域邻接激素受体配体结合结构域。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，一个或多个共刺激结构域和/或一个或多个ITAM)。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列。
这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性共刺激结构域的任何组合)。这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案包括4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域之一或两者。
这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)ITAM(例如，本文所述或本领域已知的任何ITAM)。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，ITAM包括来自CD3ζ(例如，人CD3ζ)的细胞质信号传导序列。
在这些单链嵌合抗原受体的任一个的一些实施方案中，任何两个相邻的结构域可以由以下分隔：1个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸、约4个氨基酸或约3个氨基酸(包含在内)；约2个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约4个氨基酸(包含在内)；约3个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸、约6个氨基酸或约5个氨基酸(包含在内)；约4个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约6个氨基酸(包含在内)；约5个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸、约8个氨基酸或约7个氨基酸(包含在内)；约6个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸、约10个氨基酸或约8个氨基酸(包含在内)；约8个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸、约15个氨基酸或约10个氨基酸(包含在内)；约10个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸、约20个氨基酸或约15个氨基酸(包含在内)；约15个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸、约25个氨基酸或约20个氨基酸(包含在内)；约20个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸或约25个氨基酸(包含在内)；约25个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸或约30个氨基酸(包含在内)；约30个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸或约35个氨基酸(包含在内)；约35个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸(包含在内)；约40个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸或约45个氨基酸(包含在内)；约45个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸或约50个氨基酸(包含在内)；约50个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸或约55个氨基酸(包含在内)；约55个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸或约60个氨基酸(包含在内)；约60个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸或约65个氨基酸(包含在内)；约65个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸或约70个氨基酸(包含在内)；约70个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸或约75个氨基酸(包含在内)；约75个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸或约75个氨基酸(包含在内)；约75个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸或约80个氨基酸(包含在内)；约80个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸或约90个氨基酸(包含在内)；约100个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸或约110个氨基酸(包含在内)；约110个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸或约130个氨基酸(包含在内)；约130个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸或约140个氨基酸(包含在内)；约140个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸或约150个氨基酸(包含在内)；约150个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸或约160个氨基酸(包含在内)；约160个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸或约170个氨基酸(包含在内)；约170个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸、约190个氨基酸或约180个氨基酸(包含在内)；约180个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸、约200个氨基酸或约190个氨基酸(包含在内)；约190个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸、约220个氨基酸或约200个氨基酸(包含在内)；约200个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸、约240个氨基酸或约220个氨基酸(包含在内)；约220个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸、约260个氨基酸或约240个氨基酸(包含在内)；约240个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸、约280个氨基酸或约260个氨基酸(包含在内)；约260个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸、约300个氨基酸或约280个氨基酸(包含在内)；约280个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸、约320个氨基酸或约300个氨基酸(包含在内)；约300个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸、约340个氨基酸或约320个氨基酸(包含在内)；约320个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸、约360个氨基酸或约340个氨基酸(包含在内)；约340个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸、约380个氨基酸或约360个氨基酸(包含在内)；约360个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸、约400个氨基酸或约380个氨基酸(包含在内)；约380个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸、约420个氨基酸或约400个氨基酸(包含在内)；约400个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸、约440个氨基酸或约420个氨基酸(包含在内)；约420个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸、约460个氨基酸或约440个氨基酸(包含在内)；约440个氨基酸至约500个氨基酸、约480个氨基酸或约460个氨基酸(包含在内)；约460个氨基酸至约500个氨基酸或约480个氨基酸(包含在内)；或约480个氨基酸至约500个氨基酸(包含在内)。
在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述跨膜结构域的同一内源性单链多肽的序列(例如，CD8α铰链区，例如SEQID NO:112)。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:42、55或112的序列定位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是抗体的铰链区序列或者包括抗体的铰链区序列，所述抗体例如但不限于人抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列，例如GS或本文所述的任何其他接头序列)。
在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在激素受体配体结合结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是ITAM。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述ITAM的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域和ITAM之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列或者包括来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述ITAM的同一内源性单链多肽的序列。
在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在激素受体配体结合结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是ITAM。在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在配体结合结构域之后，下一个结构域是ITAM，其后是共刺激结构域。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域与ITAM之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述ITAM的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，激素受体配体结合结构域和ITAM之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，ITAM和共刺激结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述ITAM或衍生所述共刺激结构域的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列，所述ITAM或共刺激结构域衍生自该内源性单链多肽。
在一些实施方案中，在两个或更多个共刺激结构域包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个共刺激结构域可以置于激素受体配体结合结构域和一个或多个ITAM之间。在本文所述的单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域和ITAM可以在单链嵌合抗原受体的一级氨基酸序列中交替。
本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以进一步包括二聚化结构域和/或肽标签。
在一些实例中，单链嵌合抗原受体可以包含与SEQ ID NO:31、33、35、37、39或52至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同的序列。
单链嵌合抗原受体–细胞外激素受体LBD
本文还提供了单链嵌合抗原受体，其包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何共刺激结构域)和基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，其中：跨膜结构域和细胞外激素配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。本文所述的单链嵌合抗原受体可以与本文所述的任何示例性抗原或本领域已知的任何其他抗原结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，单链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的示例性抗原的任何组合)特异性结合。
在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域邻接细胞外激素受体配体结合结构域。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，抗原结合结构域或另外的抗原结合结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列。
这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)共刺激结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性共刺激结构域的任何组合)。这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案包括4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域之一或两者。
这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)ITAM(例如，本文所述或本领域已知的任何ITAM)。在这些单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，ITAM包括来自CD3ζ(例如，人CD3ζ)的细胞质信号传导序列。
在这些单链嵌合抗原受体的任一个的一些实施方案中，任何两个相邻的结构域可以由1个氨基酸至约500个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。
在一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域或细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述跨膜结构域的同一内源性单链多肽的序列(例如，来自人CD8α的铰链序列，例如SEQ ID NO:112)。在一些实施方案中，包含SEQID NO:42、55或112的序列定位于细胞外激素受体配体结合结构域或细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域或细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是抗体的铰链区序列或者包括抗体的铰链区序列，所述抗体例如但不限于人抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域或细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包含接头序列(例如，非天然存在的接头序列，例如GS或本文所述的任何其他接头序列)。
在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在跨膜结构域之后，下一个结构域是共刺激结构域，其后是ITAM。在单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，在跨膜结构域之后，下一个结构域是ITAM，其后是共刺激结构域。在这些实施方案的一些中，跨膜结构域和共刺激结构域或ITAM之间的一个或多个氨基酸是来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述ITAM的同一内源性单链多肽的序列或者包括来自同一内源性单链多肽的序列。在这些实施方案的一些中，跨膜结构域和共刺激结构域或ITAM之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在这些实施方案的一些中，共刺激结构域和ITAM之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域和ITAM之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列或者包括来自衍生所述共刺激结构域或衍生所述ITAM的同一内源性单链多肽的序列。
在一些实施方案中，在两个或更多个共刺激结构域包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个共刺激结构域可以置于一个或多个ITAM之间。在一些实施方案中，在两个或更多个ITAM包括在单链嵌合抗原受体中的情况下，该两个或更多个ITAM可以置于一个或多个共刺激分子之间。在本文所述的单链嵌合抗原受体的一些实施方案中，共刺激结构域和ITAM可以在单链嵌合抗原受体的一级氨基酸序列中交替。
本文所述的任何单链嵌合抗原受体的一些实施方案可以进一步包括二聚化结构域和/或肽标签。
在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，单链嵌合抗原受体包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，单链嵌合多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域和ITAM。
在一些实例中，单链嵌合抗原受体可以包含与SEQ ID NO:98至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同的序列。
多链嵌合抗原受体
多链嵌合抗原受体—细胞内激素受体LBD
本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)和激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)，其中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于同一(单个)内源性单链多肽中。在这些多链嵌合抗原受体的任一个中由抗原结合结构域特异性结合的抗原可以是本文所述或本领域已知的任何抗原。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原的任何组合)特异性结合。
在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域彼此邻接。在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，1至约500个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)在至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性单链多肽。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。
在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域邻接激素受体配体结合结构域。在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。在其他实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或一个或多个ITAM(例如，本文所述的任何ITAM))。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。
在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽可以进一步包括以下的一个或多个(例如，两个或三个)：二聚化结构域(例如，本领域已知的任何二聚化结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或肽标签(例如，本领域已知的任何肽标签)。
这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案进一步包括第二多肽，其可以包括以下的一个或多个(例如，两个、三个或四个)：跨膜结构域(例如，本文所述的任何跨膜结构域)、二聚化结构域(例如，可以与哺乳动物细胞中至少一个第一多肽中的二聚化结构域相互作用的二聚化结构域)、一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和一个或多个ITAM(例如，本文所述的任何ITAM)。如本领域技术人员可以理解的，第二多肽中的一对或每对相邻的结构域可以彼此邻接或者可以由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是来自内源性单链多肽的序列，存在于第二多肽中的跨膜、共刺激结构域或ITAM衍生自该自内源性单链多肽。
多链嵌合抗原受体—细胞外激素受体LBD
本文还提供了多链嵌合抗原受体，其包括至少一个第一多肽，所述至少一个第一多肽包括：细胞外抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何抗原结合结构域)、细胞外激素受体配体结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何激素受体配体结合结构域)和跨膜结构域(例如，本文所述或本领域已知的任何跨膜结构域)，其中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔，并且跨膜结构域和激素受体配体结合结构域两者不存在于单个内源性单链多肽中。在这些多链嵌合抗原受体的任一个中由抗原结合结构域特异性结合的抗原可以是本文所述或本领域已知的任何抗原。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与单一抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原)特异性结合。在一些实施方案中，多链嵌合抗原受体与两种不同的抗原(例如，本文所述的任何示例性抗原的任何组合)特异性结合。
在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域彼此邻接。在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，1至约700个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)在至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是来自同一内源性单链多肽的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性单链多肽。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，细胞外激素受体配体结合结构域和抗原结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。
在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域邻接细胞外激素受体配体结合结构域。在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域由1至约800个氨基酸(例如，或本文所述的该范围的任何子范围)分隔。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸不包含结构域。
在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的氨基酸包括一个或多个居间的结构域(例如，抗原结合结构域)。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和抗原结合结构域之间的氨基酸包括来自同一内源性跨膜蛋白质的序列，所述跨膜结构域衍生自该内源性跨膜蛋白质。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中跨膜结构域和抗原结合结构域之间的氨基酸包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。在一些实施方案中，至少一个第一多肽的抗原结合结构域和跨膜结构域之间的一个或多个氨基酸是人抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的铰链区序列或者包括人抗体的铰链区序列。在一些实施方案中，至少一个第一多肽中抗原结合结构域和细胞外激素受体配体结合结构域之间的一个或多个氨基酸是接头序列或者包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。
在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外抗原结合结构域、细胞外激素受体配体结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以N末端至C末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，当以C末端至N末端方向移动时，至少一个第一多肽包含细胞外激素受体配体结合结构域、细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域。
在这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，至少一个第一多肽可以进一步包括以下的一个或多个(例如，两个或三个)：二聚化结构域(例如，本领域已知的任何二聚化结构域)、共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和/或肽标签(例如，本领域已知的任何肽标签)。
这些多链嵌合抗原受体的一些实施方案进一步包括第二多肽，其可以包括以下的一个或多个(例如，两个、三个或四个，以任何顺序或组合)：跨膜结构域(例如，本文所述的任何跨膜结构域)、二聚化结构域(例如，可以与哺乳动物细胞中至少一个第一多肽中的二聚化结构域相互作用的二聚化结构域)、一个或多个共刺激结构域(例如，本文所述的任何共刺激结构域)和一个或多个ITAM(例如，本文所述的任何ITAM)。如本领域技术人员可以理解的，第二多肽中的一对或每对相邻的结构域可以彼此邻接或者可以由1至约800个氨基酸(例如，本文所述的该范围的任何子范围)分隔。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是来自内源性单链多肽的序列，存在于第二多肽中的跨膜、共刺激结构域或ITAM衍生自该自内源性单链多肽。第二多肽中一对相邻的结构域之间的一个或多个氨基酸可以是接头序列或者可以包括接头序列(例如，非天然存在的接头序列)。
如本领域中可以理解的，存在于多链嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以经由彼此相互作用的结构域对(通过二聚化结构域)缔合。在一些实施方案中，二聚化结构域之间的相互作用可以通过添加小分子来触发。在一些实施方案中，存在于多聚嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以通过(例如，在二聚化结构域之间的缔合之间的)非共价相互作用缔合。在一些实施方案中，存在于多聚嵌合抗原受体中的两个或更多个多肽可以通过共价相互作用(例如，通过二硫键、通过酯键、通过酰胺键、通过硫酯键或其组合)。
跨膜结构域
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性多肽的跨膜结构域或其部分，其中内源性多肽选自下组：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28(也称为Tp44)、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37(也称为GP52-40或TSPAN26)、CD64(也称为FCGR1A)、CD80(也称为B7、B7-1、B7.1、BB1、CD28LG、CD28LG1和LAB7)、CD45(也称为PTPRC、B220、CD45R、GP180、L-CA、LCA、LY5、T200和蛋白酪氨酸磷酸酶、C型受体)、CD4、CD5(也称为LEU1和T1)、CD8α(也称为Leu2、MAL和p32)、CD9(也称为BTCC-1、DRAP-27、MIC3、MRP-1、TSPAN-29和TSPAN29)、CD16(也称为FCGR3和FCG3)、CD22(也称为SIGLEC-2和SIGLEC2)、CD86(也称为B7-2、B7.2、B70、CD28LG2和LAB72)、CD134(也称为TNFRSF4、ACT35、RP5-902P8.3、IMD16、OX40、TXGP1L和肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、CD137(也称为TNFRSF9、4-1BB、CDw137、ILA和肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、CD27(也称为S152、S152.LPFS2、T14、TNFRSF7和Tp55)、CD152(也称为CTLA4、ALPS5、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、PD1(也称为PDCD1、CD279、PD-1、SLEB2、hPD-1、hPD-l、hSLE1和程序性细胞死亡1)、ICOS(也称为AILIM、CD278和CVID1)、CD272(也称为BTLA和BTLA1)、CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)、GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)、HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)、DAP10和CD154(也称为CD40LG、CD40L、HIGM1、IGM、IMD3、T-BAM、TNFSF5、TRAP、gp39、hCD40L和CD40配体)。前句中的字母“CD”代表“分化群”。例如，CD3代表“分化群3”。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)多肽(例如，以上列出的任何多肽的哺乳动物或人同源物)的跨膜结构域或其部分。
用于将内源性多肽锚定在哺乳动物细胞的脂质双层(例如质膜)中的任何跨膜结构域或其部分适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人CD28的跨膜结构域或其部分，例如登录号P01747，例如SEQ ID NO:1的氨基酸153至179。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括与SEQ ID NO:1的氨基酸153至179或其部分至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以包含与SEQ ID NO:114(或其部分)至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
SEQ ID NO:1
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人CD3的跨膜结构域或其部分，例如登录号P20963，例如SEQ ID NO:2的氨基酸31至51。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸31至51至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。
SEQ ID NO:2
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括SEQ ID No.3-9的任一项的跨膜结构域或其部分。
LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC(SEQ ID NO:3)；
VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(SEQ ID NO:4)；
ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC(SEQ ID NO:5)；
LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV(SEQ ID NO:6)；
WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:7)；
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:8)；和
ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA(SEQ ID NO:9)。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID No.3-9的任一项至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:43、56或114至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少98％或至少99％相同)。
如本领域普通技术人员将理解的，某些内源性多肽具有至少在其一级多肽序列上不同的两个或更多个同等型。本文公开的单链嵌合多肽，单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包括来自内源性跨膜蛋白质(例如内源性哺乳动物，例如人跨膜蛋白质)的任何同等型的氨基酸的序列，其包括，例如以下的同等型(例如人同等型)：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137、CD27、CD152、PD1或CD154。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的跨膜结构域或其部分包括表现出与来自以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质的一个或多个的跨膜结构域至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列一致性的氨基酸的序列:T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137、CD27、CD152、PD1或CD154。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的跨膜结构域或其部分包括与以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质的跨膜结构域相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137、CD27、CD152、PD1或CD154。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽，单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括合成的跨膜结构域。在一些情况下，合成的跨膜结构域可以包括占主导地位的疏水残基，例如但不限于亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，合成的跨膜结构域在该结构域的每个末端处包括三联体的苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括跨膜结构域，所述跨膜结构域是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的跨膜结构域的部分的嵌合跨膜结构域，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽例如但不限于T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137、CD27、CD152、PD1和CD154，例如所述跨膜结构域的两个或更多个部分一起构成功能性跨膜结构域。在一些实施方案中，与野生型跨膜结构域的相应部分相比，此类嵌合跨膜结构域的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。
跨膜结构域可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个连续氨基酸序列，当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时，其各自横穿脂质双层。如本领域中已知的，跨膜结构域可以例如包括至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中具有α-螺旋二级结构。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括两个或更多个(当在哺乳动物细胞中表达时在相应的内源性多肽中存在时各自横穿脂质双层的)连续氨基酸序列，其在脂质双层中形成β-桶二级结构。跨膜结构域的另外的实例和特征是本领域已知的。
激素受体配体结合结构域
在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是雌激素受体配体结合结构域或其片段或者包含雌激素受体配体结合结构域或其片段。可以用于本文所述的任何多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)的激素受体配体结合结构域的另外的实例包括以下的配体结合结构域：例如，雌激素受体、蜕皮激素受体、PPARγ受体、糖皮质激素受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、盐皮质激素受体、孕酮受体、维生素D受体、PPAR受体α、PPARβ/δ受体、孕烷X受体、肝X受体、法尼酯X受体、类视色素X受体、RAR相关的孤儿受体和视黄酸受体。
人雌激素受体配体结合结构域的非限制性实例是SEQ ID NO:10的氨基酸10至247。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:10的氨基酸10至247至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:10(人)
雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:11的氨基酸4至241。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:11的氨基酸4至241至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:11(人)
在一些实施方案中，雌激素受体配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)氨基酸取代。在一些实施方案中，雌激素受体配体结合结构域具有野生型序列，除了其在氨基酸位置521(例如G521R取代)和537(例如G537F取代)之一或两者处包含氨基酸取代(每个相对于人雌激素受体的全长野生型序列，例如下面的SEQ ID NO:119进行编号)。
SEQ ID NO:119(人)
雌激素受体配体结合结构域的非限制性实例可以包括以下序列：所述序列与SEQID NO:110(或其片段)至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。
激素受体配体结合结构域的另外的非限制性实例是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:46、59或110至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。
雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:88的氨基酸314至551。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:88的氨基酸314至551至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:88(小鼠)
雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:89的氨基酸315至552。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:89的氨基酸315至552至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:89(大鼠)
雌激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:90的氨基酸310至547。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:90的氨基酸310至547至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:90(狒狒)
在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是孕酮受体配体结合结构域或其片段或者包含孕酮受体配体结合结构域或其片段。人孕酮受体配体结合结构域的非限制性实例是SEQ ID NO:12的氨基酸11至258。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:12的氨基酸11至258至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:12(人)
孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:13的氨基酸14至261。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:13的氨基酸14至261至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:13(人)
孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:91的氨基酸679至926。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:91的氨基酸679至926至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:91(小鼠)
孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:92的氨基酸676至923。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:92的氨基酸676至923至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:92(大鼠)
孕酮受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:93的氨基酸686至933。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:93的氨基酸686至933至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:93(狒狒)
在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是雄激素受体配体结合结构域或其片段或者包含雄激素受体配体结合结构域或其片段。人雄激素受体配体结合结构域的非限制性实例是SEQ ID NO:14的氨基酸2至247。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:14的氨基酸2至247至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:14(人)
雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:15的氨基酸34至279。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:15的氨基酸34至279至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:15(人)
雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:16的氨基酸19至264。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:16的氨基酸19至264至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:16(人)
雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:94的氨基酸652至897。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:94的氨基酸652至897至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:94(小鼠)
雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:95的氨基酸655至900。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:95的氨基酸655至900至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:95(大鼠)
雄激素受体配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:96的氨基酸648至893。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:96的氨基酸648至893至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:96(狒狒)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:28。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:28(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:29(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是蜕皮激素受体的配体结合结构域。例如，蜕皮激素受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:74的氨基酸256至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:74的氨基酸256至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:74(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是PPARγ受体的配体结合结构域。例如，PPARγ受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:75的氨基酸237至504。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:75的氨基酸237至504至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:75(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是糖皮质激素受体的配体结合结构域。例如，糖皮质激素受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:76的氨基酸531至777。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ IDNO:76的氨基酸531至777至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:76(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是甲状腺激素受体的配体结合结构域。例如，甲状腺激素受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:77的氨基酸162至370。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ IDNO:77的氨基酸162至370至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:77(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是盐皮质激素受体的配体结合结构域。例如，盐皮质激素受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:78的氨基酸737至984。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ IDNO:78的氨基酸737至984至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:78(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是维生素D受体的配体结合结构域。例如，维生素D受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:79的氨基酸124至426。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:79的氨基酸124至426至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:79(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是PPARα受体的配体结合结构域。例如，PPARα受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:80的氨基酸201至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:80的氨基酸201至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:80(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是PPARβ/δ受体的配体结合结构域。例如，PPARβ/δ受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:81的氨基酸173至440。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:81的氨基酸173至440至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:81(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是孕烷X受体的配体结合结构域。例如，孕烷X受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:82的氨基酸143至428。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:82的氨基酸143至428至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:82(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是肝X受体的配体结合结构域。例如，肝X受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:83的氨基酸20至255。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:83的氨基酸20至255至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:83(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是法尼酯X受体的配体结合结构域。例如，法尼酯X受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:84的氨基酸247至467。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:84的氨基酸247至467至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:84(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是RAR相关的孤儿受体A的配体结合结构域。例如，RAR相关的孤儿受体A的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:85的氨基酸217至456。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:85的氨基酸217至456至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:85(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是RAR相关的孤儿受体C的配体结合结构域。例如，RAR相关的孤儿受体C的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:86的氨基酸268至506。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:86的氨基酸268至506至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:86(人)
配体结合结构域的另一个非限制性实例是视黄酸受体的配体结合结构域。例如，视黄酸受体的配体结合结构域可以是SEQ ID NO:87的氨基酸156至385。在一些实施方案中，激素受体配体结合结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:87的氨基酸156至385至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
SEQ ID NO:87(人)
如本领域中可以理解的，在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同源物之间不保守的氨基酸更有可能在配体结合结构域的激素或激素类似物结合活性中不发挥重要作用，而在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同系物之间保守的那些氨基酸在配体结合结构域的激素或激素类似物结合活性中更可能发挥重要作用。一些配体结合结构域可以包括在激素受体配体结合结构域的不同哺乳动物同源物之间不保守的氨基酸的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)氨基酸取代。
抗原结合结构域
在单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，抗原结合结构域可以选自scFv、scFv-Fc、VHH结构域、VNAR结构域、(scFv)2和BiTE。可以用于单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体中的抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。
单链Fv或scFv片段包括单多肽链中的VH结构域和VL结构域。VH和VL通常通过肽接头连接。在其他实例中，接头可以是单氨基酸。在一些实例中，接头可以是化学键。参见，例如Pluckthun,Antibodies fromE.coli.In Rosenberg M.&Moore G.P.(Eds.),ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,pp.269-315,Spinger-Verlag,NewYork,1994。可以用于scFv中的示例性VL和VH序列显示于实施例中的SEQ ID NO:104和108中。可以在scFv中的VL和VH结构域之间使用的示例性接头可以是本文所述的任何示例性接头(例如，具有SEQ ID NO:106的序列的接头)。
Sc-Fv-Fc片段包括附接于Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以附接于例如scFv的C末端。Fc结构域可以跟随VL或VH，根据scFv中可变结构域的取向。Fc结构域可以是本领域已知的任何Fc结构域。在一些实例中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域)。
BiTE是在单个多肽中包括两个VL和两个VH(其一起形成两个scFv)的抗原结合结构域，所述scFv可以各自与相同抗原上的不同表位结合，或者各自与不同的抗原结合。参见，例如Baeuerle et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.11:22-30,2009；Wolf et al.,DrugDiscovery Today 10:1237-1244,2005；和Huehls et al.,Immunol.Cell Biol.93:290-296,2015。
VHH结构域是在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域，而VNAR结构域是在软骨鱼中发现的单个单体可变抗体结构域。VHH结构域和VNAR结构域描述于例如VanAudenhove et al.,EBioMedicine 8:40-48,2016；Krah et al.,Immunopharmacol.Immunotoxicol.38:21-28,2016；Cromie et al.,Curr.Top.Med.Chem.15:2543-2557,2016；Kijanka et al.,Nanomedicine 10:161-174,2015；Kovaleva et al.,Expert.Opin.Biol.Ther.14:1527-1539,2014；De Meyer et al.,Trends Biotechnol.32:263-270,2014；Mujic-Delic et al.,Trends Pharmacol.Sci.35:247-255,2014；Muyldermans,Ann.Rev.Biochem.82:775-797,2013；Vincke et al.,MethodsMol.Biol.911:15-26,2012；Rahbarizadeh et al.,Immunol.Invest.40:299-338,2011；Van Bockstaele et al.,Curr.Opin.Investig.Drugs10:1212-1224,2009；Wesolowski etal.,Med.Microbiol.Immunol.198:157-174,2009；De Genst et al.,Dev.Comp.Immunol.30:187-198,2006；Muyldermans,J.Biotechnol.74:277-302,2001；和Muyldermans et al.,Trends Biochem.Sci.26:230-235,2001中。
在多链嵌合抗原受体的一些实施方案中，组成多链嵌合抗原受体的多肽的至少两个可以一起相互作用以形成抗原结合结构域。在此类实施方案中，抗原结合结构域可以选自下组：抗原结合抗体片段、双亲和力重靶向抗体(DART)、Fab-scFv-Fc、triomab、crossmab、ortho-Fab IgG、IgG-scFv、scFv2-Fc、双纳米抗体、tanden抗体、DART-Fc、scFv-HAS-scFv、DNL-Fab3、DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、突出-进入-空穴(knobs-in-hole)共同LC、突出-进入-空穴组装、Fab臂交换抗体、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、scDiabody-Fc、Fcab、kλ-body、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)-IgG、IgG(L,H)-Fc、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、纳米抗体、纳米抗体-HSA、二价抗体、a TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、电荷配对抗体(charge pair antibody)、二价抗体-CH3、Cov-X-Bod、三价抗体(Triple Body)、微型抗体(miniantibody)、DVD-Ig、微抗体(minibody)、二合一IgG TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFV2、scFv-KIH、四价HCAb、二价抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体(intrabody)、对接并锁定(dock and lock)双特异性抗体、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HAS、串联scFv、IgG-IgG和scFv1-PEG-scFv2。
抗原结合抗体片段的非限制性实例包括Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段和Fab'片段。抗原结合抗体片段的另外的实例是IgG的抗原结合片段(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)(例如，人或人源化的IgG(例如，人或人源化的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的抗原结合片段)；IgA的抗原结合片段(例如，IgA1或IgA2的抗原结合片段)(例如，人或人源化的IgA(例如，人或人源化的IgA1或IgA2)的抗原结合片段)；IgD的抗原结合片段(例如，人或人源化的IgD的抗原结合片段)；IgE的抗原结合片段(例如，人或人源化的IgE的抗原结合片段)；或IgM的抗原结合片段(例如，人或人源化的IgM的抗原结合片段)。
DVD-Ig的实例描述于例如，DiGiammarino et al.,Methods Mol.Biol.899:145-156,2012；Jakob et al.,MABs 5:358-363,2013；和美国专利号7,612,181；8,258,268；8,586,714；8,716,450；8,722,855；8,735,546；和8,822,645中。DART的实例描述于例如，Garber,Nature Reviews Drug Discovery13:799-801,2014中。triomab、具有普通LC的kihIgG、crossmab、ortho-Fab IgG、二合一IgG、IgG-ScFv、scFv2-Fc、双纳米抗体、tanden抗体、DART-Fc、scFv-HAS-scFv和DNL-Fab3的实例描述于例如，Kontermann et al.,DrugDiscovery Today 20:838-847,2015中。DAF(二合一或四合一)、DutaMab、DT-IgG、突出-进入-空穴共同LC、突出-进入-空穴组装、电荷配对抗体、Fab臂交换抗体、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、kλ-body、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)-IgG、IgG(L,H)-Fc、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、纳米抗体、纳米抗体-HSA、二价抗体、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、二价抗体-CH3、三价抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab')2-scFV2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、二价抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体、对接并锁定双特异性抗体、ImmTAC、HSAbody、scDiabody-HAS、串联scFv、IgG-IgG、Cov-X-Body和scFv1-PEG-scFv2的实例描述于例如Spiess et al.,Mol.Immunol.67:95-106,2015中。
本文所述的任何抗原结合结构域可以与抗原结合，其中解离平衡常数(KD)为小于1x 10-7M、小于1x 10-8M、小于1x 10-9M、小于1x 10-10M、小于1x 10-11M、小于1x 10-12M或小于1x 10-13M。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白复合物可以与第一和/或第二抗原结合，其中KD为约1x 10-4M至约1x 10-6M、约1x 10-5M至约1x 10-7M、约1x 10-6M至约1x 10- 8M、约1x 10-7M至约1x 10-9M、约1x 10-8M至约1x 10-10M或约1x 10-9M至约1x10-11M(包含在内)。可以使用本领域已知的多种不同方法来确定抗原结合结构域的KD值(例如，电泳迁移率变动测定、滤膜结合测定、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定等)。
抗原
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合结构域可以与单一抗原(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性抗原)结合。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合结构域可以与两种或更多种不同的抗原(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性抗原的两种或更多种)结合。抗原的非限制性实例包括：HER2、A33抗原、9-0-乙酰基-GD3、CA19-9标志物、BhCG、CA-125标志物、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、钙网蛋白、CCR5、CCR8、CD2、、CD3、CD5、CD16、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40L、CD44、CD44V6、CD63、CD70、CD84、CD96、CD100、CC123、CD133、CD137、CD138、CD150、CD152(CTLA-4)、CD160、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、CD229、CD244、CD272(BTLA)、CD274(PDL-1、B7H1)、CD279(PD-1)、CD319、CD352、CRTAM(CD355)、CD358、DR3、GITR(TNFRSF 18)、HVEM、ICOS、LIGHT、LTBR、OX40、KIR的活化形式、NKG2C、NKG2D、NKG2E、一种或多种天然细胞毒性受体、NTB-A、PEN-5、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、内皮唾液酸蛋白、肝配蛋白(ephrin)A2(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GM3、Globo H、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑色素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、间皮素、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5b、MUC7、MUC16、穆勒氏抑制物质(MIS)II型受体、浆细胞抗原、poly SA、PSCA、PSMA、音猬因子(sonic hedgehog)(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-α前体、2B4(CD244)、β2-整合素、KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL2、KIR-L、KLRGI、LAIR-1、NKG2A、NKR-P IA、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、TCRa、TCRB、TCR5y、TIM1、LAG3、LAIR1、PD-1H、TIGIT、TIM2和TIM3。抗原的另外的实例是本领域已知的。
共刺激结构域
在正常淋巴细胞中，T细胞活化由两类细胞内信号传导结构域介导。经由T细胞受体(例如TCR/CD3复合物)经由MHC介导的抗原依赖性激活来启动初级信号传导。次级或共刺激信号由不同的受体提供，所述受体包括以非抗原依赖性方式起作用的共刺激信号传导结构域。仅通过TCR的信号传导结构域生成的信号不足以用于完全T细胞活化；还需要共刺激信号。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的共刺激结构域或其部分，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽选自下组：CD27(也称为S152、S152.LPFS2、T14、TNFRSF7和Tp55)、CD28(也称为Tp44)、4-1BB(也称为TNFRSF9、CD137、CDw137、ILA和肿瘤坏死因子受体超家族成员9)、OX40(也称为TNFRSF4、ACT35、RP5-902P8.3、IMD16、CD134、TXGP1L和肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)、CD40L(也称为CD40LG、CD154、HIGM1、IGM、IMD3、T-BAM、TNFSF5、TRAP、gp39、hCD40L和CD40配体)、CD40(也称为Bp50、CDW40、TNFRSF5、p50、CD40(蛋白质)和CD40分子)、PD-1(也称为PDCD1、CD279、PD-1、SLEB2、hPD-1、hPD-l、hSLE1和程序性细胞死亡1)、PD-L1(也称为CD274、B7-H、B7H1、PD-L1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1、CD274分子和程序性细胞死亡1配体1)、ICOS(也称为AILIM、CD278和CVID1)、LFA-1(也称为淋巴细胞功能相关抗原1)、CD2(也称为LFA-2、SRBC、T11和CD2分子)、CD7(也称为GP40、LEU-9、TP41、Tp40和CD7分子)、CD160(也称为BY55、NK1、NK28和CD160分子)、LIGHT(也称为TNFSF14、CD258、HVEML、LIGHT、LTg、TR2、TNLG1D和肿瘤坏死因子超家族成员14)、BTLA(也称为CD272和BTLA1)、TIM3(也称为HAVCR2、HAVcr-2、KIM-3、TIM3、TIMD-3、TIMD3、Tim-3、CD366和甲型肝炎病毒细胞受体2)、CD244(也称为2B4、NAIL、NKR2B4、Nmrk、SLAMF4和CD244分子)、CD80(也称为B7、B7-1、B7.1、BB1、CD28LG、CD28LG1、LAB7和CD80分子)、LAG3(也称为CD223和淋巴细胞活化3)、NKG2C(也称为CD314、D12S2489E、KLR、NKG2-D、NKG2D和杀伤细胞凝集素样受体K1)、GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)、HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)、TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLRIO、CARDl l、CD54(ICAM)、CD83、DAP10、LAT、SLP76、TRIM、ZAP70和B7-H3(也称为CD276、4Ig-B7-H3、B7H3、B7RP-2和CD276分子)。前句中的字母“CD”代表“分化群”。例如，CD3代表“分化群3”。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽(例如，以上列出的任何多肽的哺乳动物或人同源物)的共刺激结构域或其部分。
用于提供共刺激信号的任何共刺激结构域或其部分都适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人CD28的共刺激结构域或其部分(例如登录号P01747，例如来自SEQ ID NO:18的氨基酸180至220)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或其片段或者包括以下序列或其片段：所述序列与SEQ ID NO:18的氨基酸180至220至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同(或者与其相同)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或其片段或者包括以下序列或其片段：所述序列与SEQ ID NO:116至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或者与其相同)。
SEQ ID NO:18
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人4-1BB的共刺激结构域或其部分(例如登录号Q07011，例如来自SEQ ID NO:19的氨基酸214至255)。在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQ ID NO:19的氨基酸214至255或其部分至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
SEQ ID NO:19
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
在一些实施方案中，共刺激结构域是以下序列或者包括以下序列：所述序列与SEQID NO:44、57或116或其部分至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括共刺激结构域，所述共刺激结构域包括来自具有共刺激结构域的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的任何同等型的氨基酸的序列，其包括例如，以下的同等型：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域或其部分包括表现出与以下共刺激结构域至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列一致性的氨基酸的序列：所述共刺激结构域来自哺乳动物(例如人)CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3的一个或多个。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域或其部分包括与以下内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的一个或多个的共刺激结构域相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括共刺激结构域，所述共刺激结构域是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的共刺激结构域的部分的嵌合共刺激结构域，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)，使得该跨膜结构域的两个或更多个部分一起构成功能性共刺激结构域。在一些实施方案中，与野生型共刺激结构域的相应部分相比，此类嵌合共刺激结构域的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。
本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的共刺激结构域可以是任何合适的长度。例如，共刺激结构域可以具有以下的长度：约20个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸、约30个氨基酸或约25个氨基酸(包含在内)；约25个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸、约35个氨基酸或约30个氨基酸(包含在内)；约30个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸、约40个氨基酸或约35个氨基酸(包含在内)；约35个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸、约45个氨基酸或约40个氨基酸(包含在内)；约40个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸、约50个氨基酸或约45个氨基酸(包含在内)；约45个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸、约55个氨基酸或约50个氨基酸(包含在内)；约50个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸、约60个氨基酸或约55个氨基酸(包含在内)；约55个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸、约65个氨基酸或约60个氨基酸(包含在内)；约60个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸、约70个氨基酸或约65个氨基酸(包含在内)；约65个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸、约80个氨基酸、约75个氨基酸或约70个氨基酸(包含在内)；约70个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸、约90个氨基酸、约85个氨基酸或约80个氨基酸(包含在内)；约80个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸、约100个氨基酸、约95个氨基酸或约90个氨基酸(包含在内)；约90个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸、约110个氨基酸或约100个氨基酸(包含在内)；约100个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸、约120个氨基酸或约110个氨基酸(包含在内)；约110个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸、约130个氨基酸或约120个氨基酸(包含在内)；约120个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸、约140个氨基酸或约130个氨基酸(包含在内)；约130个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸、约150个氨基酸或约140个氨基酸(包含在内)；约140个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸、约160个氨基酸或约150个氨基酸(包含在内)；约150个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸、约170个氨基酸或约160个氨基酸(包含在内)；约160个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸、约180个氨基酸或约170个氨基酸(包含在内)；约170个氨基酸至约200个氨基酸、约190个氨基酸或约180个氨基酸(包含在内)；约180个氨基酸至约200个氨基酸或约190个氨基酸(包含在内)；或约190个氨基酸至约200个氨基酸(包含在内)。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括两个或更多个共刺激结构域，例如两个、三个、四个或五个或更多个共刺激结构域。在一些实施方案中，该两个或更多个共刺激结构域是相同的(例如，它们具有相同的氨基酸序列)。在一些实施方案中，共刺激结构域是不相同的。例如，共刺激结构域可以选自不同的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽，其包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C或B7-H3(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。在一些实施方案中，该两个或更多个共刺激结构域可以通过一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸取代、缺失或添加而彼此不同。在一些实施方案中，两个或更多个共刺激结构域表现出与彼此至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列一致性。
基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)
ITAM包括通过任意两个其他氨基酸与一个亮氨酸或异亮氨酸分隔的酪氨酸，并因此可以表示为例如Tyr-X-X-Leu/Ile。ITAM通常在免疫系统的某些细胞表面蛋白质的细胞质尾中重复(例如两次或更多次)，并且通常由六至八个氨基酸分隔。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自内源性哺乳动物(例如人)多肽的ITAM或其部分，其中内源性哺乳动物(例如人)多肽选自下组：CD3ζ(也称为CD3 zeta)、CD3Δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD3γ(CD3gamma)、DAP12、FCεR1γ(Fc epsilon受体Igamma链)、FcRy、FcRft、CD35、CD22、CD79A(抗原受体复合物相关蛋白alpha链)、CD79B(抗原受体复合物相关蛋白beta链)和CD66d。前句中的字母“CD”代表“分化群”。例如，CD3代表“分化群3”。
用于介导内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质中信号传导的任何ITAM或其部分都适合根据本文公开的组合物和方法使用。在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括来自人CD3 zeta的ITAM或其部分(例如，登录号P20963，例如，存在于SEQ ID NO:17的氨基酸52-164的ITAM或其部分；或者SEQ ID NO:118或其部分)。在一些实施方案中，ITAM包含与以下序列至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％相同的序列：SEQ ID NO:17的氨基酸52-165的序列(或其部分)或者SEQ ID NO:118的序列(或其部分)。
SEQ ID NO:17
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
在一些实施方案中，ITAM包含作为以下序列的序列或者包括以下序列的序列：所述序列与SEQ ID NO:48、61或118或其部分至少80％(例如，至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％或100％)相同。
如本领域普通技术人员将理解的，某些多肽具有至少在其一级多肽序列上不同的两种或更多种同等型。例如，不同的同等型可以作为可变剪接的结果生成。本文公开的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体可以包括ITAM，所述ITAM包括来自具有ITAM的内源性哺乳动物跨膜多肽的任何同等型的氨基酸的序列，所述内源性哺乳动物跨膜多肽包括，例如以下的哺乳动物(例如人)同等型：CD3ζ、CD3D、CD3E、CD3G、DAP12、FCER1G、FcRy、FcRft、CD35、CD22、CD79A、CD79B或CD66d。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的ITAM或其部分包括与内源性哺乳动物(例如人)跨膜蛋白质(例如CD3ζ、CD3D、CD3E、CD3G、DAP12、FCER1G、FcRy、FcRft、CD35、CD22、CD79A、CD79B或CD66d)中一个或多个的ITAM的ITAM相比，具有一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸的序列。例如，ITAM的酪氨酸和亮氨酸或异亮氨酸可以保留，而将它们分隔的两个氨基酸可以用不同的氨基酸替换。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括ITAM，所述ITAM是具有来自两个或更多个内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽的ITAM的部分的嵌合ITAM，所述内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽包括但不限于CD3ζ、CD3D、CD3E、CD3G、DAP12、FCER1G、FcRy、FcRft、CD35、CD22、CD79A、CD79B或CD66d(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)，使得该两个或更多个ITAM部分一起构成功能性ITAM。在一些实施方案中，与野生型ITAM的相应部分相比，此类嵌合ITAM的部分可以包括一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。
在一些实施方案中，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体包括两个或更多个ITAM，例如两个、三个、四个或五个或更多个ITAM。在一些实施方案中，该两个或更多个ITAM是相同的(例如，它们具有相同的氨基酸序列)。在一些实施方案中，ITAM是不相同的。例如，ITAM可以选自不同的内源性哺乳动物(例如人)跨膜多肽，其包括但不限于CD3ζ、CD3D、CD3E、CD3G、DAP12、FCER1G、FcRy、FcRft、CD35、CD22、CD79A、CD79B(包括但不限于这些多肽的任一个的哺乳动物或人同源物)。在一些实施方案中，该两个或更多个ITAM可以通过一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而彼此不同。
核酸
本文还提供了编码任何单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和多链嵌合抗原受体的核酸。本文还提供了编码组成多链嵌合多肽的一个或多个单链多肽的一组核酸(例如，其中组成该多链嵌合多肽的至少一个单链多肽由组中的每个核酸编码)。
载体
本文提供了包括本文提供的任何核酸的载体。根据本公开的“载体”是能够诱导哺乳动物细胞中重组蛋白质(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)表达的多核苷酸。本文提供的载体可以是例如环形或线性化的形式。载体的非限制性实例包括质粒、SV40载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。载体的非限制性实例包括慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如gamma-逆转录病毒载体。参见，例如Carlens et al.,Exp.Hematol.28(10:1137-1146,2000；Park et al.,Trends Biotechnol.29(11):550-557,2011；和Alonso-Camino et al.,Mol.Ther.Nucleic Acids 2:e93,2013。逆转录病毒载体的非限制性实例包括衍生自以下的逆转录病毒载体：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurine leukemia virus)、骨髓增生性肉瘤病毒、鼠胚胎干细胞病毒、鼠干细胞病毒、脾病灶形成病毒(spleen focus forming virus)或腺相关病毒。逆转录病毒载体的非限制性实例描述于例如美国专利号5,219,740和6,207,453；Miller et al.,BioTechniques 7:980-990,1989；Miller,Human Gene Therapy1:5-14,1990；Scarpa et al.,Virology 180:849-852,1991；Burns et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:8033-8037,1993；和Boris-Lawrie et al.,Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109,1993中。示例性慢病毒载体描述于例如Wang et al.,J.Immunother.35(9):689-701,2003；Cooper et al.,Blood 101:1637-1644,2003；Verhoeyen et al.,Methods Mol.Biol.506:97-114,2009；和Cavalieri etal.,Blood102(2):497-505,2003中。
其中可以插入本文提供的任何核酸的示例性载体描述于例如，Ausubel et al.,Eds.“Current Protocols in Molecular Biology”Current Protocols,1993；和Sambrooket al.,Eds.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”2nd ed.,Cold Spring HarborPress,1989。
在一些实施方案中，载体进一步包括与本文所述的任何核酸可操作地连接的启动子和/或增强子。启动子的非限制性实例包括来自以下的启动子：人巨细胞病毒(CMV)、小鼠磷酸甘油酸激酶1、多瘤腺病毒、甲状腺刺激激素α、波形蛋白、猿猴病毒40(SV40)、肿瘤坏死因子、β-球蛋白、甲胎蛋白、γ-球蛋白、β-干扰素、γ-谷氨酰转移酶、人泛素C(UBC)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯氏肉瘤病毒、3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白、金属硫蛋白II(MTII)、淀粉酶、人EF1α、组织蛋白酶、MI毒蕈碱受体、逆转录病毒LTR(例如人T细胞白血病病毒HTLV)、AAV ITR、白介素2、胶原酶、血小板源生长因子、腺病毒E2、溶基质素、鼠MX、大鼠胰岛素、葡萄糖调节蛋白78、人免疫缺陷病毒、葡萄糖调节蛋白94、α-2-巨球蛋白、MHCI类、HSP70、增殖蛋白、免疫球蛋白轻链、T细胞受体、HLA DQα、HLA DQβ、白介素2受体、MHC II类、前白蛋白(运甲状腺素蛋白)、弹性蛋白酶I、白蛋白、c-fos、神经细胞粘附分子(NCAM)、H2B组蛋白、大鼠生长激素、人血清淀粉样蛋白(SAA)、肌肉肌酸激酶、肌钙蛋白I(TN I)和长臂猿猿白血病病毒(GALV)。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。启动子的另外的实例是本领域已知的。
在一些实例中，本文提供的载体进一步包括poly(A)序列，其可操作地连接并定位于编码单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或组成多链嵌合抗原受体的任何多肽的序列的3’端。poly(A)序列的非限制性实例包括衍生自以下的poly(A)序列：牛生长激素(Woychik etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(13):3944-3948,1984和美国专利号5,122,458)、小鼠β-球蛋白、小鼠α-球蛋白(Orkin et al.,EMBO J.4(2):453-456,1985)、人胶原、多瘤病毒(Batt et al.,Mol.Cell Biol.15(9):4783-4790,1995)、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVTK)、IgG重链基因聚腺苷酸化信号(美国专利申请公开号2006/0040354)、人生长激素(hGH)(Szymanski et al.,Mol.Therapy 15(7):1340-1347,2007)、SV40poly(A)位点，例如SV40后期和早期poly(A)位点(Schek et al.,Mol.Cell Biol.12(12):5386-5393,1992)。在一些实施方案中，poly(A)序列包括高度保守的上游元件(AATAAA)。该AATAAA序列可以例如用能够信号传导聚腺苷酸化的与AATAAA同源的其他六核苷酸序列取代，包括例如ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA和AATAAG。参见例如，WO 06012414A2)。
poly(A)序列可以例如是合成的聚腺苷酸化位点。参见，例如Levitt el al,GenesDev.3(7):1019-1025,1989)。在一些实例中，poly(A)序列可以是可溶性神经纤毛蛋白(neuropilin)-1的聚腺苷酸化信号：AAATAAAATACGAAATG。poly(A)序列的另外的实例是本领域已知的。载体的另外的实例和方面也是本领域已知的。
将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的方法
可以使用本领域已知的多种不同方法将本文公开的任何核酸和载体引入哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞，例如本文所述的任何T细胞(例如人T细胞))。可以用于将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的方法的非限制性实例包括脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树状聚合物的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、超声穿孔、光学转染、impalection、流体动力递送、磁转染、病毒转导(例如腺病毒和慢病毒转导)和纳米颗粒转染。将核酸或载体引入到哺乳动物细胞中的另外的方法是本领域已知的。
哺乳动物细胞
本文还提供了包括本文所述的任何核酸或载体的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞先前从受试者(例如，人受试者，例如，鉴定或诊断为患有癌症的人受试者)获得。
哺乳动物细胞的非限制性实例包括T细胞(例如人T细胞)。T细胞(例如人T细胞)的非限制性实例包括例如，未成熟的胸腺细胞、外周血淋巴细胞、初始T细胞、多能TH细胞前体、淋巴样祖细胞、Treg细胞、记忆T细胞、TH17细胞、TH22细胞、TH9细胞、TH2细胞、TH1细胞、TH3细胞、γδT细胞、αβT细胞、Treg细胞和肿瘤浸润性T细胞。T细胞(例如人T细胞)的另外的实例包括CD8+T细胞、CD4+T细胞和自然杀伤T细胞。哺乳动物细胞的另外的实例包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞。
激素和激素类似物
激素的非限制性实例包括雌激素(17β-雌二醇)、孕酮、睾酮和二氢睾酮。激素类似物的非限制性实例包括雌激素激素类似物，孕激素激素类似物和雄激素激素类似物。
雌激素类似物的非限制性实例包括：阿非昔芬(afimoxifene)(也称为4-羟基他莫昔芬、4-OHT、4-HT和OHTAM)；选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如氯米芬(clomifene)、奥美昔芬(ormeloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)和奥培米芬(ospemifene)；雌二醇；雌酮；雷洛昔芬；雌三醇；金雀异黄素(genistein)；植物雌激素(例如，异黄酮，如金雀异黄素、黄豆苷元(daidzein)、芒柄花黄素(formononetin)和黄豆黄素(glycitein)；coumestans，如拟雌内酯(coumestrol)和repensol andtrifoliol；和木脂素类(lignans)，如落叶松脂素(lariciresinol)、罗汉松树脂酚(matairesinol)、松脂醇(pinoresinol)、开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和五加前胡脂素(steganacin))；和外源性雌激素(xenoestrogen)(例如，己烯雌酚(diethylstilbestrol)、乙炔雌二醇、丁基羟基茴香醚、赤藓红(erythrosine)、樟脑(例如，4-甲基亚苄基樟脑)、对羟基苯甲酸酯类(parabens)(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯)、阿特拉津(atrazine)、二氯二苯基二氯乙烯、二氯二苯基三氯乙烷、甲氧氯、狄氏剂(dieldrin)、硫丹(endosulfan)、七氯、林丹(lindane)、酚类(例如，双酚A和壬基酚)、联苯类(例如，一氯联苯和二氯联苯)、邻苯二甲酸酯类(例如，邻苯二甲酸二-2-乙基己酯、邻苯二甲酸二异癸酯和邻苯二甲酸二异壬酯)和金属雌激素)。在一些实施方案中，雌激素类似物可以是例如，米非司酮(也称为RU-486)。在一些实施方案中，雌激素类似物可以是选择性孕酮受体调节剂(SPRM)，如奥那司酮(onapristone)(ZK98299)、罗那利桑(lonaprisan)(ZK230211，BAY86-5044)、APR19、EC304、WAY-255348、ORG31710、索普利尼(asoprisnil)(J867)、特拉司酮(telapristone)(Proellex，CDB-4124)和CDB-2914(醋酸乌利司他(ulipristal acetate))。
孕酮激素类似物的非限制性实例包括选择性孕酮受体调节剂(SPRM)，如奥那司酮(ZK98299)、罗那利桑(ZK230211，BAY86-5044)、APR19、EC304、WAY-255348、ORG31710、索普利尼(J867)、特拉司酮(Proellex，CDB-4124)和CDB-2914(醋酸乌利司他)。
雄激素类似物的非限制性实例包括依诺勃沙(enobosarm)(也称为ostarine、MK-2866、GTx-024和S-22)、BMS-564,929、LGD-4033(ligandrol)、AC-262,356、JNJ-28330835、LGD-2226、LGD-3303、S-40503、S-23、RAD140、acetothiolutamide、Andarine、LG-121071、TFM-4AS-1和YK-11。
如本领域中可以理解的，雌激素或雌激素激素类似物可以与包括雌激素受体配体结合结构域的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体一起使用。
组合物和试剂盒
本文还提供了包括本文所述的任何核酸、载体、核酸的组、载体的组或哺乳动物细胞的组合物(例如药物组合物)。例如，本文提供了包括本文所述的任何核酸或核酸的组，或本文提供的任何载体或载体的组以及药学上可接受的溶剂或载体的组合物。
在一些实施方案中，组合物可以是本文所述的任何哺乳动物细胞(例如，先前从受试者(例如，鉴定或诊断为患有癌症的受试者)获得的本文所述的任何哺乳动物细胞)，其包含编码本文所述的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的任一个的核酸。在包括本文所述的任何哺乳动物细胞的组合物中，该组合物可以进一步包括细胞培养基或药学上可接受的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)。包括本文所述的任何哺乳动物细胞的组合物可以配制用于静脉内或动脉内施用。
还提供了试剂盒，其包括本文所述的任何组合物的一个或多个。例如，试剂盒可以包括本文所述的任何组合物和配制用于向受试者施用的一种或多种剂量的激素或激素类似物(例如，配制用于口服、静脉内、肌内或皮下施用)。在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包括用于进行本文所述的任何方法的说明书。
诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位的方法
本文还提供了诱导哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)中单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的膜定位的方法，其包括：使表达单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽、单链嵌合抗原结合受体或多链嵌合抗原受体分别定位于细胞的质膜的细胞外侧。
这些方法的一些实施方案进一步包括将编码单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞(例如本文所述或本领域已知的任何哺乳动物细胞)中以分别生成表达单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在这些方法的一些实例中，哺乳动物细胞是T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞)。在一些实例中，哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)是先前从受试者(例如，已经鉴定或诊断为患有癌症，例如本文所述的任何癌症的受试者)中获得的哺乳动物细胞。这些方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。
在这些方法的任一个的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在这些方法的任一个的一些实施方案中，接触步骤哺乳动物(例如患有癌症(例如本文所述的任何癌症)的哺乳动物(例如人))中进行。在一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物(例如人)中癌症的治疗。
可以使用本文提供的任何方法治疗的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、卡波济肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增生性新生物、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌，感觉神经母细胞瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌(hypopharngeal cancer)、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性骨髓性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口癌(mouth cancer)、口腔癌(oral cancer)、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
在这些方法的任一个的一些实施方案中，该方法导致受试者中肿瘤负荷(例如，肿瘤质量和/或体积)减少。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中肿瘤负荷减少(例如，与治疗前的受试者中的肿瘤负荷相比)至少约1％至约99％(例如，约1％至约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约2％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约3％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％或约10％(包含在内)；约10％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％或约15％(包含在内)；约15％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％(包含在内)；约20％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％(包含在内)；约25％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％或约30％(包含在内)；约30％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％或约35％(包含在内)；约35％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％(包含在内)；约40％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％或约45％(包含在内)；约45％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％(包含在内)；约50％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％或约55％(包含在内)；约55％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％或约60％(包含在内)；约60％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％或约65％(包含在内)；约65％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％或约70％(包含在内)；约70％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％或约72％(包含在内)；约72％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％或约74％(包含在内)；约74％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％或约76％(包含在内)；约76％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％或约78％(包含在内)；约78％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％或约80％(包含在内)；约80％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％或约82％(包含在内)；约82％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％或约84％(包含在内)；约84％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％或约86％(包含在内)；约86％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％或约88％(包含在内)；约88％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％或约90％(包含在内)；约90％至约99％、约98％、约96％、约94％或约92％(包含在内)；约92％至约99％、约98％、约96％或约94％(包含在内)；约94％至约99％、约98％或约96％(包含在内)；或约96％至约99％或约98％(包含在内))。
在一些实施方案中，该方法导致受试者中癌症的进展速率降低。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中癌症的进展速率降低(例如，与治疗前的受试者中或者对照受试者或患有相同癌症且未施用治疗或施用不同治疗的受试者的对照群体中的癌症的进展速率相比)至少约1％至约99％(例如，约1％至约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约2％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约3％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％或约10％(包含在内)；约10％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％或约15％(包含在内)；约15％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％(包含在内)；约20％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％或约25％(包含在内)；约25％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％或约30％(包含在内)；约30％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％或约35％(包含在内)；约35％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％(包含在内)；约40％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％或约45％(包含在内)；约45％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％(包含在内)；约50％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％、约60％或约55％(包含在内)；约55％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％、约65％或约60％(包含在内)；约60％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％、约70％或约65％(包含在内)；约65％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％、约72％或约70％(包含在内)；约70％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％、约74％或约72％(包含在内)；约72％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％、约76％或约74％(包含在内)；约74％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％、约78％或约76％(包含在内)；约76％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％、约80％或约78％(包含在内)；约78％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％、约82％或约80％(包含在内)；约80％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％、约84％或约82％(包含在内)；约82％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％、约86％或约84％(包含在内)；约84％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％、约88％或约86％(包含在内)；约86％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％、约90％或约88％(包含在内)；约88％至约99％、约98％、约96％、约94％、约92％或约90％(包含在内)；约90％至约99％、约98％、约96％、约94％或约92％(包含在内)；约92％至约99％、约98％、约96％或约94％(包含在内)；约94％至约99％、约98％或约96％(包含在内)；或约96％至约99％或约98％(包含在内))。
在这些方法的任一个的一些实施方案中，该方法导致受试者中癌症的生存时间增加。例如，本文所述的任何方法可以导致受试者中癌症的生存时间增加(例如，与对照受试者或患有相同癌症且未接受治疗或者接受不同治疗的对照受试者的群体的生存时间相比)约1％至约800％(例如，约1％至约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％、约20％、约10％或约5％(包含在内)；约5％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％、约20％或约10％(包含在内)；约10％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％、约40％或约20％(包含在内)；约20％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％、约60％或约40％(包含在内)；约40％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％或约60％(包含在内)；约60％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％、约100％、约80％(包含在内)；约80％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％、约150％或约100％(包含在内)；约100％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％、约200％或约150％(包含在内)；约150％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％、约250％或约200％(包含在内)；约200％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％、约300％或约250％(包含在内)；约250％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％、约350％或约300％(包含在内)；约300％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％、约400％或约350％(包含在内)；约350％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％、约450％或约400％(包含在内)；约400％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％、约500％或约450％(包含在内)；约450％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％、约550％或约500％(包含在内)；约500％至约800％、约750％、约700％、约650％、约600％或约550％(包含在内)；约550％至约800％、约750％、约700％、约650％或约600％(包含在内)；约600％至约800％、约750％、约700％或约650％(包含在内)；约650％至约800％、约750％或约700％(包含在内)；约700％至约800％或约750％(包含在内)；或约750％至约800％(包含在内))。
可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位的方法
本文还提供了可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的膜定位的方法，其包括：(a)使表达单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链嵌合多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体定位于细胞的质膜的细胞外侧；和(b)使哺乳动物细胞与减少量的激素或激素类似物接触，其导致哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平降低(例如与步骤(a)中质膜的细胞外侧的水平相比)。在一些实施方案中，步骤(b)中降低的水平是步骤(a)中质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平至少5％降低、至少10％降低、至少15％降低、至少20％降低、至少25％降低、至少30％降低、至少35％降低、至少40％降低、至少45％降低、至少50％降低、至少55％降低、至少60％降低、至少65％降低、至少70％降低、至少75％降低、至少80％降低、至少85％降低、至少90％降低、至少95％降低或至少99％降低。在一些实施方案中，步骤(b)中降低的水平是步骤(a)中质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平100％降低。在一些实施方案中，步骤(b)中哺乳动物细胞不与任何激素或激素类似物激素接触。这些方法的一些实施方案进一步包括：(c)使哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞)与增加量的激素或激素类似物接触，其导致与步骤(b)中的水平相比，细胞的质膜的细胞外侧的单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的水平增加。
这些方法的任一个的一些实施方案进一步包括将编码单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞(例如，本文所述的任何哺乳动物细胞)中以生成表达单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，哺乳动物细胞是T细胞(例如人T细胞)。在一些实施方案中，T细胞(例如人T细胞)选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是先前从受试者(例如人)获得的哺乳动物细胞。在一些实例中，受试者(例如人)已鉴定或诊断为患有癌症(例如，本文所述的任何类型的癌症)。一些实施方案进一步包括从受试者获得哺乳动物细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，接触步骤在体外进行。在一些实施方案中，接触步骤在哺乳动物(例如，受试者)中进行。在一些实施方案中，接触步骤导致哺乳动物(例如人)中癌症的治疗。
可以使用本文提供的任何方法治疗的癌症的非限制性实例包括：急性淋巴母细胞白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、卡波济肉瘤、淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、类癌瘤、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓增生性新生物、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、胆管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌，感觉神经母细胞瘤(esthesioneuroblastoma)、尤文肉瘤、眼癌、输卵管癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝癌、下咽癌(hypopharngeal cancer)、胰腺癌、肾癌、喉癌、慢性骨髓性白血病、唇和口腔癌、肺癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、口癌、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、阴茎癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
通过可逆地改变单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合多肽的膜定位来控制其在哺乳动物细胞中的毒性的方法
在一些实施方案中，本文公开的组合物和/或方法可以用于在存在与多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)中存在的LBD结合的激素或激素类似物的情况下选择性杀伤受试者(例如人)中的癌细胞。在一些实施方案中，在存在激素或激素类似物的情况下，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于哺乳动物细胞的细胞外表面，在细胞的外部呈现其抗原结合结构域(例如，本文所述或本领域已知的scFv或其他抗原结合结构域)。然后多肽可以识别与其结合的抗原，并因此可以选择性杀伤在其表面表达抗原的靶细胞。
在一些实施方案中，多肽(例如，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体或多链嵌合抗原受体)定位于细胞外表面可以在受试者中导致毒性。此类毒性可以由例如细胞因子风暴(也称为高细胞因子血症或细胞因子释放综合征)引起。在一些实施方案中，由于激素或激素类似物诱导的多肽定位于细胞外表面而经历毒性的受试者可以通过减少施用于该受试者的激素或激素类似物的剂量，或完全消除激素或激素类似物治疗来治疗。此类剂量的减少或激素或激素类似物治疗的消除可以导致多肽从细胞表面去除并减少或消除抗原结合结构域在细胞表面上的呈递，从而减少或消除受试者中的毒性。
毒性的示例性症状包括但不限于高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿(脑肿胀)。在一些实施方案中，可以通过在向受试者施用一种或多种剂量的激素或激素类似物之后评价受试者中这些症状的一种或多种的存在或严重性来确定受试者中的毒性。在一些实施方案中，与毒性相关的这些或其他症状的一种或多种可以在将包括具有LBD的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如T细胞)以及结合LBD的激素或激素类似物引入到受试者中后确定。在一些实施方案中，可以将与毒性相关的这些或其他症状的一种或多种的确定的水平与缺乏毒性或毒性水平降低相关的基线水平进行比较。此类基线水平可以是例如在施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者之前受试者中这些或其他症状的一种或多种的水平。另外地或替代地，此类基线水平可以是未施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者的不同受试者中这些或其他症状的一种或多种的水平。本领域普通技术人员将知道合适的临床和实验室方法来确定与毒性相关的一种或多种症状的水平。
在一些实施方案中，毒性可以是细胞因子风暴的结果。经历细胞因子风暴的受试者的血清中促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子两者均升高。在经历细胞因子风暴的受试者的血清中升高的细胞因子的非限制性实例包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。在一些实施方案中，与细胞因子风暴相关的这些或其他细胞因子的一种或多种在将包括具有LBD的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如T细胞)以及结合LBD的激素或激素类似物引入到受试者中后确定。在一些实施方案中，可以将与细胞因子风暴相关的这些或其他细胞因子的一种或多种的确定的水平与缺乏细胞因子风暴或细胞因子风暴水平降低相关的基线水平进行比较。此类基线水平可以是例如在施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者之前受试者中这些或其他细胞因子的一种或多种的水平。另外地或替代地，此类基线水平可以是未施用哺乳动物细胞、激素或激素类似物或两者的不同受试者中这些或其他细胞因子的一种或多种的水平。细胞因子的水平(例如，向受试者施用哺乳动物细胞和激素或激素类似物后的细胞因子的水平和/或细胞因子的基线水平)可以通过多种方法和技术的任一种来确定，包括但不限于ELISA、Western印迹、抗体阵列板、多重阵列、Elispot测定法、免疫组织化学或可用于确定细胞因子水平的各种商业测定法的任一种。
在一些实施方案中，提供了治疗受试者(例如哺乳动物，例如人)中癌症(例如本文所述的多种癌症的任一种)的方法。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括：(a)向受试者施用包括编码具有激素受体LBD的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的核酸的哺乳动物细胞(例如T细胞)，(b)向受试者施用结合LBD的激素或激素类似物，；(c)确定与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，(d)将确定的与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子水平与症状或细胞因子的基线水平比较和(e)减少施用于受试者的激素或激素类似物的量，使得确定的与毒性相关的一种或多种症状的水平和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子水平降低。在一些实施方案中，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的水平降低了100％(例如，步骤(e)中没有哺乳动物细胞施用于受试者)。在一些实施方案中，在步骤(b)中施用激素或激素类似物之后，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体以可逆的方式定位于哺乳动物细胞的细胞外表面。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体从细胞外表面去除，从而降低毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)降低了100％(例如，受试者不经历毒性或者仅经历基线水平的毒性)。在一些实施方案中，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性(例如，与毒性相关的一种或多种症状和/或与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子)正常化至毒性的基线水平(例如，与缺乏细胞因子风暴或细胞因子风暴水平降低相关的水平)。例如，在减少步骤(e)中施用于受试者的激素或激素类似物的量之后，毒性可以正常化至以下水平：小于毒性的基线水平的10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍或小于毒性的基线水平。
在一些实施方案中，可以通过向受试者施用包括具有LBD的单链嵌合多肽(例如本文所述的任何单链多肽)、单链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何单链嵌合抗原受体)和/或多链嵌合抗原受体(例如本文所述的任何多链嵌合抗原受体)的哺乳动物细胞(例如T细胞)以及结合LBD的激素或激素类似物治疗受试者。可以监测受试者中毒性的水平，并且可以通过本文所述的任何方法来降低毒性，例如，通过降低激素或激素类似物的水平。在毒性降低后(例如降低至基线水平，或高于基线水平的足够低的水平)，可以随后增加激素或激素类似物的水平以提高治疗的功效。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平多次降低并随后提高以控制毒性，同时仍提供有效的治疗过程。在一些实施方案中，激素的水平随后提高至最初施用激素或激素类似物所处的水平的100％。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平随后提高至最初施用激素或激素类似物所处的水平的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，激素或激素类似物的水平随后增加至高于最初施用激素或激素类似物所处的水平的水平。例如，随后施用的激素或激素类似物可以以最初施用激素或激素类似物所处的水平的至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％的水平施用。
在一些实施方案中，可以通过向受试者施用第二激素或激素类似物来降低在向受试者施用第一激素或激素类似物之后产生的毒性。例如，第二激素或激素类似物可以对存在于单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体中的LBD具有降低的亲和力，使得与第一激素或激素类似物所促进的质膜定位相比，单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体的质膜定位减少。在一些实施方案中，第二激素或激素类似物在促进单链嵌合多肽、单链嵌合抗原受体和/或多链嵌合抗原受体的质膜定位方面可以不如第一激素或激素类似物有效。在一些实施方案中，第二激素或激素类似物与第一激素或激素类似物竞争结合LBD。
在一些实施方案中，除了降低激素或激素类似物的水平以降低毒性之外，或作为替代方案，可以通过施用灭活或隔离(sequester)激素或激素类似物的组合物来进一步降低毒性。例如，可以向受试者施用外源LBD(例如，作为药学上可接受的制剂)以隔离先前施用于受试者的激素或激素类似物。作为另一个实例，可以向受试者施用灭活、降解或以其他方式隔离所施用的激素或激素类似物的组合物。此类组合物的非限制性实例是结合所施用的激素或激素类似物并使其无法穿透细胞膜，使其无法结合LBD或促进其降解的抗体或抗体片段。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1—构建体的生成
规范嵌合抗原受体(“规范CAR”，图1，左)经修饰以在蛋白质内各个位置处包括雌激素受体alpha(“ERa”)配体结合结构域(“ERa-LBD”，绿色且由箭头指示)。在CAR中不同位置处引入ERa-LBD(图1，右)以创建不同版本的ERa-LBD，分别表示为：“v.2”(也表示为“v2”或“V2”)、“v.3”(也表示为“v3”或“V3”)和“v.4”(也表示为“v4”或“V4”)。mCherry融合蛋白也包括在内以允许追踪含有经工程化的蛋白质的细胞。下文提供了v.2的核酸和多肽序列(分别为SEQ ID NO:30和31)，v.3的核酸和多肽序列(分别为SEQ ID NO:32和33)和v.4的核酸和多肽序列(分别为SEQ ID NO:34和35)。
SEQ ID NO:30
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCTGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACAACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCAACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACCCTGTACTGCGGATCCAAGCGGGGCAGAAAGAAACTGCTGTACATCTTTAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGCGATAGAAGAGGCGGCAGAATGCTGAAACACAAGCGGCAGAGGGACGACGGGGAAGGCAGAGGCGAAGTGGGATCTGCCGGCGATATGAGAGCCGCCAACCTGTGGCCTAGCCCCCTGATGATCAAGCGGAGCAAGAAGAACTCCCTGGCCCTGAGCCTGACCGCCGACCAGATGGTGTCTGCCCTGCTGGATGCCGAGCCCCCCATCCTGTACAGCGAGTACGACCCCACCAGACCCTTCAGCGAGGCCAGCATGATGGGCCTGCTGACCAACCTGGCCGACCGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCCAAGCGGGTGCCCGGCTTCGTGGATCTGACACTGCACGACCAGGTGCACCTGCTGGAATGCGCTTGGCTGGAAATCCTGATGATCGGCCTCGTGTGGCGGAGCATGGAACACCCTGGCAAGCTGCTGTTCGCCCCCAACCTGCTGCTGGACCGGAACCAGGGCAAATGCGTGGAAGGCATGGTGGAAATCTTCGACATGCTGCTGGCCACCTCCAGCCGGTTCCGGATGATGAACCTGCAGGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTGAAGTCCATCATCCTGCTGAATAGCGGCGTGTACACCTTCCTGAGCAGCACCCTGAAAAGCCTGGAAGAAAAGGACCACATCCACCGGGTGCTGGACAAGATCACCGACACCCTGATTCACCTGATGGCCAAGGCCGGACTGACCCTGCAGCAGCAGCATCAGAGACTGGCTCAGCTGCTGCTGATCCTGTCCCACATCCGGCACATGAGCAACAAGCGGATGGAACATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCTCTGTTCGATCTGCTGCTGGAAATGCTGGACGCCCACAGGCTGCACGCCCCAACATCCAGATCCGGATCTGGAAGTGGCTCCCTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGAGGAAGTGGATCTGGGAGCGGCTCTATGGTGTCTAAGGGGGAAGAGGACAACATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAAGGCTCCGTGAATGGCCACGAATTCGAGATCGAGGGGGAGGGCGAGGGCAGACCTTATGAGGGAACCCAGACCGCCAAGCTGAAAGTGACCAAGGGCGGACCCCTGCCTTTCGCCTGGGATATCCTGTCTCCCCAGTTTATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACCTGAAGCTGAGCTTCCCTGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGAGTGATGAATTTCGAGGACGGCGGAGTCGTGACAGTGACCCAGGATAGCTCTCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAAGTGAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCCAGCGACGGACCCGTGATGCAGAAAAAGACCATGGGCTGGGAGGCCAGCTCCGAGAGAATGTACCCAGAGGACGGGGCCCTGAAGGGGGAGATCAAGCAGCGGCTGAAACTGAAGGATGGCGGCCACTACGACGCAGAAGTGAAAACCACCTACAAGGCCAAGAAACCTGTGCAGCTGCCTGGCGCCTACAATGTGAACATCAAGCTGGACATTACCAGCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGGGCCGAGGGCAGGCATTCTACAGGCGGAATGGATGAACTGTATAAGTGCGTGACCGACTAG
SEQ ID NO:31
MALPVTALLLPLALLLHAARPEQKLISEEDLDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSGSGSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSRSGSGSGSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
SEQ ID NO:32
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCTGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACAACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCAACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACCCTGTACTGCGGATCCAAGCGGGGCAGAAAGAAACTGCTGTACATCTTTAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGATCCGGATCTGGAAGTGGCTCCCTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGAGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGCGATAGAAGAGGCGGCAGAATGCTGAAACACAAGCGGCAGAGGGACGACGGGGAAGGCAGAGGCGAAGTGGGATCTGCCGGCGATATGAGAGCCGCCAACCTGTGGCCTAGCCCCCTGATGATCAAGCGGAGCAAGAAGAACTCCCTGGCCCTGAGCCTGACCGCCGACCAGATGGTGTCTGCCCTGCTGGATGCCGAGCCCCCCATCCTGTACAGCGAGTACGACCCCACCAGACCCTTCAGCGAGGCCAGCATGATGGGCCTGCTGACCAACCTGGCCGACCGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCCAAGCGGGTGCCCGGCTTCGTGGATCTGACACTGCACGACCAGGTGCACCTGCTGGAATGCGCTTGGCTGGAAATCCTGATGATCGGCCTCGTGTGGCGGAGCATGGAACACCCTGGCAAGCTGCTGTTCGCCCCCAACCTGCTGCTGGACCGGAACCAGGGCAAATGCGTGGAAGGCATGGTGGAAATCTTCGACATGCTGCTGGCCACCTCCAGCCGGTTCCGGATGATGAACCTGCAGGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTGAAGTCCATCATCCTGCTGAATAGCGGCGTGTACACCTTCCTGAGCAGCACCCTGAAAAGCCTGGAAGAAAAGGACCACATCCACCGGGTGCTGGACAAGATCACCGACACCCTGATTCACCTGATGGCCAAGGCCGGACTGACCCTGCAGCAGCAGCATCAGAGACTGGCTCAGCTGCTGCTGATCCTGTCCCACATCCGGCACATGAGCAACAAGCGGATGGAACATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCTCTGTTCGATCTGCTGCTGGAAATGCTGGACGCCCACAGGCTGCACGCCCCAACATCCGGATCTGGCTCTGGAAGCGGCAGCATGGTGTCTAAGGGGGAAGAGGACAACATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAAGGCTCCGTGAATGGCCACGAATTCGAGATCGAGGGGGAGGGCGAGGGCAGACCTTATGAGGGAACCCAGACCGCCAAGCTGAAAGTGACCAAGGGCGGACCCCTGCCTTTCGCCTGGGATATCCTGTCTCCCCAGTTTATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACCTGAAGCTGAGCTTCCCTGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGAGTGATGAATTTCGAGGACGGCGGAGTCGTGACAGTGACCCAGGATAGCTCTCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAAGTGAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCCAGCGACGGACCCGTGATGCAGAAAAAGACCATGGGCTGGGAGGCCAGCTCCGAGAGAATGTACCCAGAGGACGGGGCCCTGAAGGGGGAGATCAAGCAGCGGCTGAAACTGAAGGATGGCGGCCACTACGACGCAGAAGTGAAAACCACCTACAAGGCCAAGAAACCTGTGCAGCTGCCTGGCGCCTACAATGTGAACATCAAGCTGGACATTACCAGCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGGGCCGAGGGCAGGCATTCTACAGGCGGAATGGATGAACTGTATAAGTGCGTGACCGACTAG
SEQ ID NO:33
MALPVTALLLPLALLLHAARPEQKLISEEDLDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRSGSGSGSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGSGSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
SEQ ID NO:34
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCTGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACAACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCAACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACCCTGTACTGCGGATCCGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGCGATAGAAGAGGCGGCAGAATGCTGAAACACAAGCGGCAGAGGGACGACGGGGAAGGCAGAGGCGAAGTGGGATCTGCCGGCGATATGAGAGCCGCCAACCTGTGGCCTAGCCCCCTGATGATCAAGCGGAGCAAGAAGAACTCCCTGGCCCTGAGCCTGACCGCCGACCAGATGGTGTCTGCCCTGCTGGATGCCGAGCCCCCCATCCTGTACAGCGAGTACGACCCCACCAGACCCTTCAGCGAGGCCAGCATGATGGGCCTGCTGACCAACCTGGCCGACCGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCCAAGCGGGTGCCCGGCTTCGTGGATCTGACACTGCACGACCAGGTGCACCTGCTGGAATGCGCTTGGCTGGAAATCCTGATGATCGGCCTCGTGTGGCGGAGCATGGAACACCCTGGCAAGCTGCTGTTCGCCCCCAACCTGCTGCTGGACCGGAACCAGGGCAAATGCGTGGAAGGCATGGTGGAAATCTTCGACATGCTGCTGGCCACCTCCAGCCGGTTCCGGATGATGAACCTGCAGGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTGAAGTCCATCATCCTGCTGAATAGCGGCGTGTACACCTTCCTGAGCAGCACCCTGAAAAGCCTGGAAGAAAAGGACCACATCCACCGGGTGCTGGACAAGATCACCGACACCCTGATTCACCTGATGGCCAAGGCCGGACTGACCCTGCAGCAGCAGCATCAGAGACTGGCTCAGCTGCTGCTGATCCTGTCCCACATCCGGCACATGAGCAACAAGCGGATGGAACATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCTCTGTTCGATCTGCTGCTGGAAATGCTGGACGCCCACAGGCTGCACGCCCCAACATCCGGATCTGGCTCTGGAAGCGGCAGCAAGCGGGGCAGAAAGAAACTGCTGTACATCTTTAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCTCCTGCAGATTCCCCGAGGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAGCTGAGATCCGGATCTGGAAGTGGCTCCCTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGAGGAAGTGGATCTGGGAGCGGCTCTATGGTGTCTAAGGGGGAAGAGGACAACATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAAGGCTCCGTGAATGGCCACGAATTCGAGATCGAGGGGGAGGGCGAGGGCAGACCTTATGAGGGAACCCAGACCGCCAAGCTGAAAGTGACCAAGGGCGGACCCCTGCCTTTCGCCTGGGATATCCTGTCTCCCCAGTTTATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACCTGAAGCTGAGCTTCCCTGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGAGTGATGAATTTCGAGGACGGCGGAGTCGTGACAGTGACCCAGGATAGCTCTCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAAGTGAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCCAGCGACGGACCCGTGATGCAGAAAAAGACCATGGGCTGGGAGGCCAGCTCCGAGAGAATGTACCCAGAGGACGGGGCCCTGAAGGGGGAGATCAAGCAGCGGCTGAAACTGAAGGATGGCGGCCACTACGACGCAGAAGTGAAAACCACCTACAAGGCCAAGAAACCTGTGCAGCTGCCTGGCGCCTACAATGTGAACATCAAGCTGGACATTACCAGCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGGGCCGAGGGCAGGCATTCTACAGGCGGAATGGATGAACTGTATAAGTGCGTGACCGACTA
SEQ ID NO:35
MALPVTALLLPLALLLHAARPEQKLISEEDLDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGSGSGSGSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSGSGSGSGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRSGSGSGSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
实施例2—含有NHR-LBD的抗CD19嵌合抗原受体表现出配体诱导的CAR的表面表
达。
用编码规范CAR的慢病毒载体或用实施例1中所述的含有v2、v3和v4CAR构建体的抗CD19(FMC63)ERa-LBD转导Jurkat T细胞。然后细胞未经处理或用ERa-LBD的配体处理。药物处理一小时后，将细胞用蛋白质L-生物素染色(蛋白质L与细胞外scFv结合)，然后用链霉亲和素-BV421染色以检测CAR的表面表达。随后通过流式细胞术分析细胞的mCherry表达和细胞表面上CAR的存在(图2A)。无论药物存在或不存在，规范CAR均以相同的水平在表面上表达(图2A，“规范CAR”标题下的点图)。相反，含有ERa-LBD的v2和v4 CAR(本文所述的示例性单链嵌合抗原受体)在存在配体的情况下表达(如通过mCherry阳性表达测定)，但在不存在配体的情况下，在细胞表面上未检测到CAR(图2A，顶行，蛋白质L染色，“v2”和“v4”标题下的点图)。用500ng/mL4-OHT处理后，以与对照CAR相当的水平在细胞表面上检测到CAR(图2A，底行，蛋白质L染色)。值得注意的是，并非所有设计表现相同：在不存在配体的情况下，v3具有一些CAR的基础表面表达(图2A，“v3”标题下的顶部点图)，且表达在添加配体后进一步增加(图2A，“v3”标题下的底部点图)。
用编码v4 CAR构建体的慢病毒载体转导原代CD4和CD8人T细胞。如本实施例中所述处理细胞，并使用抗cMyc抗体染色以检测细胞表面上的cMyc标记的scFv。将T细胞与500ng/mL 4-OHT配体共培养后，在CD4和CD8 T细胞两者中均观察到了表面诱导(图2B)，表明表面诱导表型从Jurkat延伸至原代人T细胞。
实施例3—NHR-LBD融合蛋白在多种细胞类型中表现出配体诱导的表面表达。
用实施例1中所述的编码含有ERa-LBD的FMC63 CAR融合物的慢病毒载体转导HEK-293T细胞。细胞未经处理，或与500ng/mL 4-OHT温育2小时，然后对表面CAR表达进行染色。与实施例2中证明的Jurkat细胞和原代T细胞中的ERa-LBD结果一致，几种ERa-LBD-CAR融合物在不存在配体的情况下表现出最小的CAR表面表达，并且在配体处理后强烈上调表面CAR(图3)。这些数据表明，配体诱导的NHR-LBD CAR融合物的表面表达在多种细胞类型中起作用，包括永生化细胞(Jurkat和HEK-293T)和原代细胞(人CD4和CD8 T细胞)，以及淋巴样(Jurkat和人T细胞)和非淋巴样(HEK-293T)细胞类型。
实施例4—配体诱导的NHR LBD-CAR融合物的表面表达在不同的scFv之间是保守
的。
为了证明NHR LBD-CAR融合蛋白的保守的功能和模块性，用识别B细胞成熟抗原(“BCMA”)的不同scFv(J6M0)替换V4中的FMC63 scFv。用编码NHR-LBD CAR融合物的慢病毒载体转导原代人CD4 T细胞，将其未经处理或用500ng/mL的ERa配体4-OHT处理。与FMC63NHR LBD-CAR融合物相似，具有J6M0 scFv的NHR LBD-CAR显示出配体诱导的表面表达(图4)。
实施例5—配体诱导的NHR LBD融合蛋白的表面运输不需要来自规范CAR的scFv或
细胞内结构域。
实施例2中测试的LBD-CAR融合物除NHR LBD结构域外还含有一些蛋白质基序，包括CD137细胞内结构域、CD3z细胞内信号传导结构域和scFv结构域。为了确定CAR构建体的细胞内部分(CD137细胞内结构域和CD3z细胞内结构域)是否参与配体诱导的表面运输，生成了缺乏这些区域的构建体(“v5”，图5A，左)，并在原代人T细胞中进行了测试。构建体v5包括scFv结构域和mCherry结构域。构建体v5表现出与实施例2中的构建体v2和v4相当的配体诱导的运输，表明CAR细胞内基序不负责配体诱导的运输(图5A，右)。v5的核苷酸(SEQ IDNO:36)和氨基酸(SEQ ID NO:37)序列如下所示。
SEQ ID NO:36
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCTGAGCAGAAGCTGATCTCCGAAGAGGACCTGGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGATAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCAGACTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCATCTCAGTCTCTGAGCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGACTATGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGAGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACAAGCGTGACCGTGTCTAGCACAACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCAACCCCAGCCCCTACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCAGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACATGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTCGTGATCACCCTGTACTGCGGATCCGGCAGCGGATCTGGCAGTGGAAGCGATAGAAGAGGCGGCAGAATGCTGAAACACAAGCGGCAGAGGGACGACGGGGAAGGCAGAGGCGAAGTGGGATCTGCCGGCGATATGAGAGCCGCCAACCTGTGGCCTAGCCCCCTGATGATCAAGCGGAGCAAGAAGAACTCCCTGGCCCTGAGCCTGACCGCCGACCAGATGGTGTCTGCCCTGCTGGATGCCGAGCCCCCCATCCTGTACAGCGAGTACGACCCCACCAGACCCTTCAGCGAGGCCAGCATGATGGGCCTGCTGACCAACCTGGCCGACCGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCCAAGCGGGTGCCCGGCTTCGTGGATCTGACACTGCACGACCAGGTGCACCTGCTGGAATGCGCTTGGCTGGAAATCCTGATGATCGGCCTCGTGTGGCGGAGCATGGAACACCCTGGCAAGCTGCTGTTCGCCCCCAACCTGCTGCTGGACCGGAACCAGGGCAAATGCGTGGAAGGCATGGTGGAAATCTTCGACATGCTGCTGGCCACCTCCAGCCGGTTCCGGATGATGAACCTGCAGGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTGAAGTCCATCATCCTGCTGAATAGCGGCGTGTACACCTTCCTGAGCAGCACCCTGAAAAGCCTGGAAGAAAAGGACCACATCCACCGGGTGCTGGACAAGATCACCGACACCCTGATTCACCTGATGGCCAAGGCCGGACTGACCCTGCAGCAGCAGCATCAGAGACTGGCTCAGCTGCTGCTGATCCTGTCCCACATCCGGCACATGAGCAACAAGCGGATGGAACATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCTCTGTTCGATCTGCTGCTGGAAATGCTGGACGCCCACAGGCTGCACGCCCCAACATCCGGATCTGGCTCTGGAAGCGGCAGCATGGTGTCTAAGGGGGAAGAGGACAACATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAAGGCTCCGTGAATGGCCACGAATTCGAGATCGAGGGGGAGGGCGAGGGCAGACCTTATGAGGGAACCCAGACCGCCAAGCTGAAAGTGACCAAGGGCGGACCCCTGCCTTTCGCCTGGGATATCCTGTCTCCCCAGTTTATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACCTGAAGCTGAGCTTCCCTGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGAGTGATGAATTTCGAGGACGGCGGAGTCGTGACAGTGACCCAGGATAGCTCTCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAAGTGAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCCAGCGACGGACCCGTGATGCAGAAAAAGACCATGGGCTGGGAGGCCAGCTCCGAGAGAATGTACCCAGAGGACGGGGCCCTGAAGGGGGAGATCAAGCAGCGGCTGAAACTGAAGGATGGCGGCCACTACGACGCAGAAGTGAAAACCACCTACAAGGCCAAGAAACCTGTGCAGCTGCCTGGCGCCTACAATGTGAACATCAAGCTGGACATTACCAGCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGGGCCGAGGGCAGGCATTCTACAGGCGGAATGGATGAACTGTATAAGTGCGTGACCGACTAG
SEQ ID NO:37
MALPVTALLLPLALLLHAARPEQKLISEEDLDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGSGSGSGSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
为了测试细胞外scFv是否参与配体诱导的表面表达，生成了缺乏scFv的构建体；在其位置上插入FLAG标签以允许蛋白质的表面检测(该构建体的核酸和多肽序列分别如下显示为SEQ ID NO:38和39)。用编码ERa-LBD融合蛋白的慢病毒载体转导Jurkat T细胞，并在存在和不存在ERa配体4-OHT的情况下对多肽的表面表达进行染色。配体处理诱导多肽的稳健表面检测(图5B)，表明NHR-LBD介导的表面表达不需要scFv，并且该技术可广泛推广至各种多肽。
SEQ ID NO:38
ATGATCCACCTGGGACACATCCTGTTTTTGCTGCTGCTGCCAGTGGCTGCCGCCgattacaaagacgacgatgataaaCAGACAACACCAGGCGAGAGATCTAGCCTGCCCGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCTCTTGTTCTGGCTGTGGCAGCCTGTCTCTGCCCatctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgcAAAAGGGGCCGGAAAAAGCTGCTGTATATTTTCAAACAGCCTTTTATGAGGCCTGTGCAGACAACACAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGTCGGTTCCCCGAAGAGGAAGAGGGGGGCTGCGAACTGggatcaggcagtggctctggcagcGATAGAAGAGGCGGCAGAATGCTGAAACACAAGCGGCAGAGGGACGACGGGGAAGGCAGAGGCGAAGTGGGATCTGCCGGCGATATGAGAGCCGCCAACCTGTGGCCTAGCCCCCTGATGATCAAGCGGAGCAAGAAGAACTCCCTGGCCCTGAGCCTGACCGCCGACCAGATGGTGTCTGCCCTGCTGGATGCCGAGCCCCCCATCCTGTACAGCGAGTACGACCCCACCAGACCCTTCAGCGAGGCCAGCATGATGGGCCTGCTGACCAACCTGGCCGACCGGGAACTGGTGCACATGATCAACTGGGCCAAGCGGGTGCCCGGCTTCGTGGATCTGACACTGCACGACCAGGTGCACCTGCTGGAATGCGCTTGGCTGGAAATCCTGATGATCGGCCTCGTGTGGCGGAGCATGGAACACCCTGGCAAGCTGCTGTTCGCCCCCAACCTGCTGCTGGACCGGAACCAGGGCAAATGCGTGGAAGGCATGGTGGAAATCTTCGACATGCTGCTGGCCACCTCCAGCCGGTTCCGGATGATGAACCTGCAGGGCGAAGAGTTCGTGTGTCTGAAGTCCATCATCCTGCTGAATAGCGGCGTGTACACCTTCCTGAGCAGCACCCTGAAAAGCCTGGAAGAAAAGGACCACATCCACCGGGTGCTGGACAAGATCACCGACACCCTGATTCACCTGATGGCCAAGGCCGGACTGACCCTGCAGCAGCAGCATCAGAGACTGGCTCAGCTGCTGCTGATCCTGTCCCACATCCGGCACATGAGCAACAAGCGGATGGAACATCTGTACAGCATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCTCTGTTCGATCTGCTGCTGGAAATGCTGGACGCCCACAGGCTGCACGCCCCAACATCCaGATCCggatctggaagtggctccCTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGAggaagtggatctgggagcggctctatggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgacTAG
SEQ ID NO:39
MIHLGHILFLLLLPVAAADYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSGSGSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSRSGSGSGSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
SEQ ID NO:39的多肽包括以下结构域：Dap10信号肽(MIHLGHILFLLLLPVAAA，SEQID NO:40)、flag标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO:41)、Dap10细胞外结构域(QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP，SEQ ID NO:42)、CD8跨膜结构域(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC，SEQ ID NO:43)、4-1BB共刺激结构域(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，SEQ ID NO:44)、第一接头(GSGSGSGS，SEQ ID NO:45)、经修饰的ERa结构域(DRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTS，SEQ ID NO:46)、第二接头(RSGSGSGS，SEQ ID NO:47)、CD3 zeta信号传导结构域(LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，SEQ ID NO:48)、第三接头(GSGSGSGS，SEQ IDNO:49)、mCherry(MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD，SEQ ID NO:50)。
实施例6—配体诱导的NHR-LBD融合构建体的表面表达延伸至包括孕酮受体(PR)
在内的不同NHR
为了测试孕酮受体(“PR”)LBD融合物是否表现出配体诱导的表面表达，生成了构建体(v33)(该构建体的核酸和多肽序列分别显示为SEQ ID NO:51和52)。测试的构建体含有用于表面检测的N末端FLAG标签。用编码该构建体的慢病毒载体转导Jurkat T细胞，将其未经处理或用500ng/mL米非司酮(PR配体)处理。药物处理两个小时后，对细胞进行表面蛋白质表达染色。如通过流式细胞术检测到的，该构建体表现出多肽的配体诱导的表面表达(图6)，表明其他NHR-LBD(除ERa外)可以用于生成具有配体诱导的表面表达的构建体，并且该配体诱导的NHR-LBD融合蛋白的表面表达是可推广的现象。
SEQ ID NO:51
ATGATCCACCTGGGACACATCCTGTTTTTGCTGCTGCTGCCAGTGGCTGCCGCCgattacaaagacgacgatgataaaCAGACAACACCAGGCGAGAGATCTAGCCTGCCCGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCTCTTGTTCTGGCTGTGGCAGCCTGTCTCTGCCCatctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgcAAAAGGGGCCGGAAAAAGCTGCTGTATATTTTCAAACAGCCTTTTATGAGGCCTGTGCAGACAACACAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGTCGGTTCCCCGAAGAGGAAGAGGGGGGCTGCGAACTGggatcaggcagtggctctggcagcGGGCAAGACATTCAGCTCATACCTCCTTTGATAAATTTGCTGATGTCTATAGAACCAGATGTCATATACGCTGGTCACGACAATACGAAACCGGACACATCTTCATCTTTGCTTACCTCTCTGAATCAACTGGGTGAACGACAGCTCCTGAGTGTTGTTAAGTGGTCTAAAAGCCTCCCGGGCTTCAGGAATTTGCACATAGACGACCAAATCACGCTCATCCAATATTCCTGGATGAGTCTCATGGTCTTTGGTCTCGGTTGGCGCAGCTATAAGCACGTCTCTGGCCAGATGTTGTATTTCGCACCAGACCTGATCCTGAACGAACAGAGGATGAAGGAATCAAGCTTTTACTCTCTCTGCTTGACTATGTGGCAAATCCCCCAAGAATTCGTGAAACTTCAAGTTTCCCAAGAAGAATTCCTCTGCATGAAAGTCCTTCTTTTGCTCAACACGATTCCCCTGGAAGGCTTGAGGTCTCAAACGCAATTCGAGGAGATGCGGAGTAGCTATATACGCGAACTCATCAAGGCCATCGGTTTGCGGCAAAAGGGAGTGGTCTCTAGTAGCCAACGATTTTACCAGCTGACTAAGCTCCTTGACAACCTTCACGATCTCGTCAAACAACTGCACCTGTACTGTCTTAACACATTTATACAATCACGGGCACTTTCTGTAGAGTTCCCAGAGATGATGTCTGAGGTCATCGCAGCCCAACTTCCGAAAATTCTTGCAGGAATGGTGAAGCCACTTCTGTTCCATAAGAAAaGATCCggatctggaagtggctccCTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGAggaagtggatctgggagcggctctatggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac
SEQ ID NO:52
MIHLGHILFLLLLPVAAADYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGSGSGSGSGQDIQLIPPLINLLMSIEPDVIYAGHDNTKPDTSSSLLTSLNQLGERQLLSVVKWSKSLPGFRNLHIDDQITLIQYSWMSLMVFGLGWRSYKHVSGQMLYFAPDLILNEQRMKESSFYSLCLTMWQIPQEFVKLQVSQEEFLCMKVLLLLNTIPLEGLRSQTQFEEMRSSYIRELIKAIGLRQKGVVSSSQRFYQLTKLLDNLHDLVKQLHLYCLNTFIQSRALSVEFPEMMSEVIAAQLPKILAGMVKPLLFHKKRSGSGSGSLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGSGSGSMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD
SEQ ID NO:52的多肽包括以下结构域：Dap10信号肽(MIHLGHILFLLLLPVAAA，SEQID NO:53)、flag标签(DYKDDDDK，SEQ ID NO:54)、Dap10细胞外结构域(QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP，SEQ ID NO:55)、CD8跨膜结构域(IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC，SEQ ID NO:56)、4-1BB共刺激结构域(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL，SEQ ID NO:57)、第一接头(GSGSGSGS，SEQ ID NO:58)、孕酮受体LBD(GQDIQLIPPLINLLMSIEPDVIYAGHDNTKPDTSSSLLTSLNQLGERQLLSVVKWSKSLPGFRNLHIDDQITLIQYSWMSLMVFGLGWRSYKHVSGQMLYFAPDLILNEQRMKESSFYSLCLTMWQIPQEFVKLQVSQEEFLCMKVLLLLNTIPLEGLRSQTQFEEMRSSYIRELIKAIGLRQKGVVSSSQRFYQLTKLLDNLHDLVKQLHLYCLNTFIQSRALSVEFPEMMSEVIAAQLPKILAGMVKPLLFHKK，SEQ ID NO:59)、第二接头(RSGSGSGS，SEQ ID NO:60)、CD3zeta信号传导结构域(LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，SEQ ID NO:61)、第三接头(GSGSGSGS，SEQ ID NO:62)和mCherry(MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYKCVTD，SEQ ID NO:63)。
SEQ ID NO:51的核苷酸序列包括编码所指示的结构域的以下序列：Dap10信号肽(ATGATCCACCTGGGACACATCCTGTTTTTGCTGCTGCTGCCAGTGGCTGCCGCC，SEQ ID NO:63)、flag标签(gattacaaagacgacgatgataaa，SEQ ID NO:64)、Dap10细胞外结构域(CAGACAACACCAGGCGAGAGATCTAGCCTGCCCGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCTCTTGTTCTGGCTGTGGCAGCCTGTCTCTGCCC，SEQ ID NO:65)、CD8跨膜结构域(atctatatttgggcacccctggctggaacctgcggagtgctgctgctgtctctcgtgattacactgtattgc，SEQ ID NO:66)、4-1BB共刺激结构域(AAAAGGGGCCGGAAAAAGCTGCTGTATATTTTCAAACAGCCTTTTATGAGGCCTGTGCAGACAACACAGGAAGAGGACGGCTGTAGCTGTCGGTTCCCCGAAGAGGAAGAGGGGGGCTGCGAACTG，SEQ ID NO:67)、第一接头(ggatcaggcagtggctctggcagc，SEQ ID NO:68)、孕酮受体LBD(GGGCAAGACATTCAGCTCATACCTCCTTTGATAAATTTGCTGATGTCTATAGAACCAGATGTCATATACGCTGGTCACGACAATACGAAACCGGACACATCTTCATCTTTGCTTACCTCTCTGAATCAACTGGGTGAACGACAGCTCCTGAGTGTTGTTAAGTGGTCTAAAAGCCTCCCGGGCTTCAGGAATTTGCACATAGACGACCAAATCACGCTCATCCAATATTCCTGGATGAGTCTCATGGTCTTTGGTCTCGGTTGGCGCAGCTATAAGCACGTCTCTGGCCAGATGTTGTATTTCGCACCAGACCTGATCCTGAACGAACAGAGGATGAAGGAATCAAGCTTTTACTCTCTCTGCTTGACTATGTGGCAAATCCCCCAAGAATTCGTGAAACTTCAAGTTTCCCAAGAAGAATTCCTCTGCATGAAAGTCCTTCTTTTGCTCAACACGATTCCCCTGGAAGGCTTGAGGTCTCAAACGCAATTCGAGGAGATGCGGAGTAGCTATATACGCGAACTCATCAAGGCCATCGGTTTGCGGCAAAAGGGAGTGGTCTCTAGTAGCCAACGATTTTACCAGCTGACTAAGCTCCTTGACAACCTTCACGATCTCGTCAAACAACTGCACCTGTACTGTCTTAACACATTTATACAATCACGGGCACTTTCTGTAGAGTTCCCAGAGATGATGTCTGAGGTCATCGCAGCCCAACTTCCGAAAATTCTTGCAGGAATGGTGAAGCCACTTCTGTTCCATAAGAAA，SEQ ID NO:69)、第二接头(ggatctggaagtggctcc，SEQ ID NO:70)、CD3zeta信号传导结构域(CTGAGAGTGAAGTTTAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAACCTGGGCAGGCGGGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGAGGCGGGGCAGGGACCCTGAAATGGGCGGCAAACCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGACATGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA，SEQ ID NO:71)、第三接头(ggaagtggatctgggagcggctct，SEQ IDNO:72)和mCherry(atggtgtctaagggggaagaggacaacatggccatcatcaaagaattcatgcggttcaaggtgcacatggaaggctccgtgaatggccacgaattcgagatcgagggggagggcgagggcagaccttatgagggaacccagaccgccaagctgaaagtgaccaagggcggacccctgcctttcgcctgggatatcctgtctccccagtttatgtacggcagcaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacctgaagctgagcttccctgagggcttcaagtgggagagagtgatgaatttcgaggacggcggagtcgtgacagtgacccaggatagctctctgcaggacggcgagttcatctacaaagtgaagctgcggggcaccaacttccccagcgacggacccgtgatgcagaaaaagaccatgggctgggaggccagctccgagagaatgtacccagaggacggggccctgaagggggagatcaagcagcggctgaaactgaaggatggcggccactacgacgcagaagtgaaaaccacctacaaggccaagaaacctgtgcagctgcctggcgcctacaatgtgaacatcaagctggacattaccagccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcaggcattctacaggcggaatggatgaactgtataagtgcgtgaccgac，SEQ ID NO:73)。
实施例7—配体诱导的NHR-LBD CAR T细胞活化是抗原和药物依赖性的。
用编码J6M0-ERa-LBD CAR构建体的慢病毒载体转导原代人T细胞。在存在渐增浓度的4-OHT的情况下，与抗原阴性(K562细胞系)和抗原阳性(MM1S细胞系)靶标共培养过夜后，通过对规范T细胞活化标志物CD69的表面染色来评价T细胞活化(图7A)。对于每种构建体，观察到独特的剂量依赖性T细胞应答，其中LBD与细胞膜的接近与背景激活(在不存在配体的情况下的激活)和对配体的敏感性相关。在不断增加药物浓度的情况下，所有构建体均显示出与阳性对照(规范CAR)相当的活化水平。
J6M0-ERa-LBD CAR细胞产生炎性细胞因子的能力经由对共培养上清液的IFN-γELISA进行评价，所述共培养上清液分离自T细胞与抗原阴性(K562细胞系)和抗原阳性(MM1S细胞系)靶标在存在渐增浓度的4-OHT的情况下的过夜共培养物。IFN-γ产生显示为剂量依赖性，其中在配体浓度渐增的情况下所有NHR-LBD构建体均产生细胞因子(图7B)。
实施例8—配体诱导的NHR-LBD CAR T细胞增殖和杀伤是抗原和配体依赖性的。
用编码V4 FMC63-ERa-LBD CAR或规范CAR对照的慢病毒载体转导原代人CD4 T细胞。在与抗原阴性(K562细胞系)或抗原阳性(Raji细胞系)靶标共培养之前，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(“CFSE”)标记细胞。还将细胞与渐增浓度的配体(4-OHT)共培养。共培养后三天，经由流式细胞仪分析细胞，并通过CD4+T细胞上的CFSE染料稀释来评价增殖。FMC63-ERa-LBD CAR T细胞仅在存在抗原和配体的情况下增殖(图8A)。
用实施例7中所述的编码J6M0-ERa-LBD CAR构建体的慢病毒载体转导原代人T细胞。携带J6M0-ERa-LBD CAR构建体的T细胞以药物依赖方式杀伤抗原阳性靶标(MM1S细胞系)的能力经由基于流式细胞术的杀伤测定法进行评价。共培养之前用CFSE标记靶细胞，并且共培养后每个孔中剩余的细胞数经由使用Intellicyt流式细胞仪定量固定的体积来确定。通过将每实验孔剩余的靶标数与含有靶标和非抗原特异性常规CAR T细胞(-CTRL)的对照孔中剩余的靶标数进行比较来确定特异性裂解。特异性裂解报告为源自以下方程式的百分比：1-(#事件每实验孔/#平均事件-CTRL孔)。靶细胞杀伤依赖于配体的剂量，其中所有构建体在较高的药物剂量下都能以与常规CAR(+CTRL)相当的水平消除抗原阳性靶标(图8B)。
实施例9—LBD在CAR多肽内的位置决定了对配体诱导的NHR-LBD CAR的表面表达
的敏感性。
在Jurkat T细胞中比较了图1中所示的V2、V3和V4构建体的剂量反应性。与4-OHT配体在图9的x轴上指示的浓度下温育1小时后，进行对Jurkat T细胞上NHR-LBD CAR蛋白的表面表达的检测。使用抗cMyc抗体检测表面受体表达，并报告为报告物-阳性细胞的百分比(由mCherry表达确定)。对于每个构建体，检测到的表面表达的配体剂量对应于每个构建体的LBD相对于表面膜的位置。带有紧邻表面膜的LBD的构建体V4在不存在配体的情况下未显示可检测的表面表达，其中仅在较高浓度的4-OHT下检测到了表面表达。相反，当LBD定位离膜较远时(参见例如V2)，检测到较高的表面表达的基础水平(～20％)，并且观察到对4-OHT的敏感性增强。用PMA/离子霉素激活Jurkat T细胞不导致非配体依赖性NHR-LBD CAR表面表达，表明单独激活T细胞(例如通过内源性TCR)不导致受体运输至细胞表面。
实施例10—NHR-LBD CAR表面表达的持续时间取决于LBD在多肽中的位置。
用FMC63-ERa-LBD CAR转导T细胞，并将其暴露于35ng/mL的4-OHT中1小时，然后使用抗cMyc抗体对其表面表达进行染色，或者在不存在药物的情况下洗涤并培养过夜(时间线如图10A中所示)。
表达表面蛋白质的细胞数报告为报告物阳性细胞的百分比(由mCherry表达确定)。对于构建体V2、V3和V4，细胞表面上NHR-LBD CAR表达的持续时间得以确定。配体去除后24小时，带有最接近膜的LBD的构建体(V4)显示出最快速且最完全的回到基线(图10B，标有“V4”的条)。
实施例11—添加配体后NHR-LBD-CAR构建体的表面表达的动力学。
用实施例5中使用的FLAG-ERa-LBD构建体转导的Jurkat T细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT处理15分钟或120分钟，并在配体处理后检测表面表达。配体处理在15分钟内诱导了表面表达，并且随着时间的推移观察到进一步的上调(图11A)。
用编码FMC63-ERa-LBD CAR(如图1中所示的v2)的慢病毒载体转导人T细胞。在所指示的持续时间内，用ERa配体4-OHT处理细胞，然后对CAR的表面表达进行染色(图11B)。图11B中的数据显示出与针对Jurkat T细胞观察到的相似的配体处理诱导的表面表达的动力学。
实施例12—布雷菲德菌素A处理阻断配体诱导的NHR LBD融合物的表面运输。
表达具有ERa LBD融合物的FMC63-CAR的原代人T细胞未经处理或用500ng/mL 4-OHT配体处理2小时以诱导CAR的表面表达。在4-OHT处理之前，将一半的细胞用1uM布雷菲德菌素A预处理(图12，底部两幅图)以抑制蛋白质从高尔基体输出。布雷菲德菌素A预处理防止4-OHT诱导的表面蛋白质表达增加。不希望受理论的束缚，这些数据表明，增加的表面表达起因于在不存在配体的情况下细胞内隔离的多肽的池的重新定位。
实施例13—构建体的生成
常规嵌合抗原受体(“常规CAR”，图13，左)经修饰以在蛋白质的细胞内部分(如实施例1中所述的v2 CAR)或在蛋白质的细胞外部分(“隐蔽携带CARECD.v1”或“LBD-ECDCAR”)包括雌激素受体alpha(“ERa”)配体结合结构域(“ERa LBD，”图1，绿色)。将点突变引入到v2 CAR和ECD.v1 CAR两者的ERa LBD结构域中。下文提供了v2CAR的核酸和多肽序列(如上所示为SEQ ID NO:30和31)和ECD.v1(SEQ ID NO:97和98)的核酸和多肽序列。
SEQ ID NO:97(ECD v.1CAR)
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgattcctgaacagaagctgataagtgaggaggacttggacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgatagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagcagactgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcaaggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcacaggcggcggaggatctggcggaggcggaagtggcggagggggatctgaagtgaaactgcaggaaagcggccctggcctggtggccccatctcagtctctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcctgactatggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggagtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaactccaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcacaagcgtgaccgtgtctagcggatccgatagaagaggcggcagaatgctgaaacacaagcggcagagggacgacggggaaggcagaggcgaagtgggatctgccggcgatatgagagccgccaacctgtggcctagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaactccctggccctgagcctgaccgccgaccagatggtgtctgccctgctggatgccgagccccccatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggaactggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggatctgacactgcacgaccaggtgcacctgctggaatgcgcttggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggcggagcatggaacaccctggcaagctgctgttcgcccccaacctgctgctggaccggaaccagggcaaatgcgtggaaggcatggtggaaatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaagagttcgtgtgtctgaagtccatcatcctgctgaatagcggcgtgtacaccttcctgagcagcaccctgaaaagcctggaagaaaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgattcacctgatggccaaggccggactgaccctgcagcagcagcatcagagactggctcagctgctgctgatcctgtcccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacatctgtacagcatgaagtgcaagaacgtggtgcctctgttcgatctgctgctggaaatgctggacgcccacaggctgcacgccccaacatccggatccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctag
SEQ ID NO:98(ECD v.1CAR)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEQKLISEEDLDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGSDRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKNVVPLFDLLLEMLDAHRLHAPTSGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ECD.v1中从N末端至C末端的ECD.v1中每个结构域的蛋白质和核酸序列如下所示。
SEQ ID NO:99(CSF2RA信号肽)
atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgattcct
SEQ ID NO:100(CSF2RA信号肽)
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO:101(cMyc标签)
gaacagaagctgataagtgaggaggacttg
SEQ ID NO:102(cMyc标签)
EQKLISEEDL
SEQ ID NO:103(FMC63 VL)
gacatccagatgacccagaccaccagcagcctgagcgccagcctgggcgatagagtgaccatcagctgcagagccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaaacccgacggcaccgtgaagctgctgatctaccacaccagcagactgcacagcggcgtgcccagcagattttctggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgctacctacttctgtcagcaaggcaacaccctgccctacaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaca
SEQ ID NO:104(FMC63 VH)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
SEQ ID NO:105(VL和VH之间的(G4S)3接头)
ggcggcggaggatctggcggaggcggaagtggcggagggggatct
SEQ ID NO:106(VL和VH之间的(G4S)3接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:107(FMC63 VH)
gaagtgaaactgcaggaaagcggccctggcctggtggccccatctcagtctctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcctgactatggcgtgtcctggatcagacagccccccagaaagggcctggaatggctgggagtgatctggggcagcgagacaacctactacaacagcgccctgaagtcccggctgaccatcatcaaggacaactccaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcacaagcgtgaccgtgtctagc
SEQ ID NO:108(FMC63 VH)
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
VH结构域和雌激素受体alpha配体结合结构域之间的GS接头
ggatcc
VH结构域和雌激素受体alpha配体结合结构域之间的GS接头
GS
SEQ ID NO:109(雌激素受体alpha配体结合结构域)(编码铰链的序列加下划线，编码螺旋12的序列以粗体显示)
gatagaagaggcggcagaatgctgaaacacaagcggcagagggacgacggggaaggcagaggcgaagt gggatctgccggcgatatgagagccgccaacctgtggcctagccccctgatgatcaagcggagcaagaagaactccctggccctgagcctgaccgccgaccagatggtgtctgccctgctggatgccgagccccccatcctgtacagcgagtacgaccccaccagacccttcagcgaggccagcatgatgggcctgctgaccaacctggccgaccgggaactggtgcacatgatcaactgggccaagcgggtgcccggcttcgtggatctgacactgcacgaccaggtgcacctgctggaatgcgcttggctggaaatcctgatgatcggcctcgtgtggcggagcatggaacaccctggcaagctgctgttcgcccccaacctgctgctggaccggaaccagggcaaatgcgtggaaggcatggtggaaatcttcgacatgctgctggccacctccagccggttccggatgatgaacctgcagggcgaagagttcgtgtgtctgaagtccatcatcctgctgaatagcggcgtgtacaccttcctgagcagcaccctgaaaagcctggaagaaaaggaccacatccaccgggtgctggacaagatcaccgacaccctgattcacctgatggccaaggccggactgaccctgcagcagcagcatcagagactggctcagctgctgctgatcctgtcccacatccggcacatgagcaacaagcggatggaacatctgtacagcatgaagtgcaagaac
SEQ ID NO:110(雌激素受体alpha配体结合结构域)(铰链加下划线，螺旋12以粗体显示)
DRRGGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSKKNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKRMEHLYSMKCKN
雌激素受体alpha配体结合结构域和CD8 alpha铰链区之间的GS接头
ggatcc
雌激素受体alpha配体结合结构域和CD8 alpha铰链区之间的GS接头
GS
SEQ ID NO:111(CD8 alpha铰链)
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
SEQ ID NO:112(CD8 alpha铰链)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC
SEQ ID NO:113(CD8 alpha跨膜结构域)
gatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
SEQ ID NO:114(CD8 alpha跨膜结构域)
DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:115(4-1BB共刺激结构域)
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaa
SEQ ID NO:116(4-1BB共刺激结构域)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE
SEQ ID NO:117(CD3 zeta信号传导结构域)
ctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
SEQ ID NO:118(CD3 zeta信号传导结构域)
LRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
实施例14—LBD-ECD在不存在配体的情况下降低了CAR在细胞表面的背景定位
如所示，用编码CC.v2或LBD ECD.v1构建体的慢病毒载体转导原代人T细胞。细胞未经处理或用500ng/mL的4-OHT处理。处理的持续时间如图14中所示。随后使用抗MycAlexaFluor 647抗体针对嵌合受体的表面表达对细胞进行染色。
相对于当LBD置于CAR的细胞内部分时，将LBD放置于CAR的细胞外部分降低当未加入配体时CAR表面表达的背景水平(图14)。当加入500ng/ml4-OHT时，v2 CAR和ECD.v1两者均在细胞的表面表达。
实施例15—LBD-ECD CAR以药物依赖性方式杀伤细胞
如所示，用编码LBD ECD.v1或对照CAR构建体的慢病毒载体转导原代人T细胞。扩增后允许T细胞休息，并随后与表达萤光素酶的Nalm6肿瘤细胞以如图15中所示的效应物:靶标比例共培养。共培养24小时后，细胞被裂解并加入萤光素酶底物以定量存活的肿瘤细胞数。
LBD ECD.v1 CAR以药物依赖性方式杀伤细胞。加入渐增量的4-OHT导致更高水平的细胞裂解(在500ng/mL 4-OHT时大约50％裂解)(图15)。
实施例16—在活化的T细胞中LBD-ECD CAR定位于细胞内
如所示，用编码LBD_ECD、CC.v2或组成型对照CAR构建体的慢病毒载体转导原代人T细胞。细胞休息后，用aCD3/aCD28 dynabeads再刺激细胞48小时。随后用抗Myc抗体对细胞进行染色以检测CAR的表面表达，并经由流式细胞仪进行分析。
具有细胞外LBD的CAR(LBD ECD v1)在暴露于CD3/CD28珠子时得以活化的T细胞中定位于细胞内。具有细胞内LBD的CAR(v2 CAR)在活化的T细胞中显示一些定位于细胞表面(图16)。
实施例17—ECD.v1 CAR(LBD_ECD)产生细胞因子IL-2
在存在(500ng/mL)或不存在4-羟基他莫昔芬的情况下将携带CAR的T细胞与NALM-6靶标过夜共培养后，将来自ECD.v1 CAR T细胞的IL-2产生与常规CAR+对照进行比较(图16)。依赖于4-羟基他莫昔芬，来自ECD.v1 CAR受体的IL-2产生(图13)与常规CAR对照相当，并且在不存在药物的情况下不可检测。
其他实施方案
应当理解，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 细胞设计实验室股份有限公司
<120> 嵌合多肽和改变它们的在细胞膜中的定位的方法
<130> 43159-0064WO1
<150> US 62/587,262
<151> 2017-11-16
<150> US 62/477,733
<151> 2017-03-28
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
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Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
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Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
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Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
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Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
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Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
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Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
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Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
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Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
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Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
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Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
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Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly
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Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
20
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Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp
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Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met
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Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu
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Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu
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Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr
145 150 155 160
Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His
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Arg Val Leu Asp Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys
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Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu
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Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His
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Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu
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Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala
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Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu
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Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser
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Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu
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Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile
195 200 205
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Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala
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Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu
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Met Met Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人
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Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
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100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
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<400> 18
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
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Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 19
<211> 255
<212> PRT
<213> 人
<400> 19
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 20
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 21
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 22
Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 23
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 24
ggatccggca gcggatctgg cagtggaagc 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 25
ggatctggct ctggaagcgg cagc 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 26
agatccggat ctggaagtgg ctcc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 27
ggaagtggat ctgggagcgg ctct 24
<210> 28
<211> 297
<212> PRT
<213> 人
<400> 28
Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp Asp
1 5 10 15
Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser
35 40 45
Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp
50 55 60
Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu
85 90 95
Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp
100 105 110
Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu
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Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys
145 150 155 160
Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser
165 170 175
Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys
180 185 190
Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys
210 215 220
Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu
225 230 235 240
Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His
245 250 255
Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys
260 265 270
Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp
275 280 285
Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser
290 295
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<211> 256
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Gly Gln Asp Ile Gln Leu Ile Pro Pro Leu Ile Asn Leu Leu Met Ser
1 5 10 15
Ile Glu Pro Asp Val Ile Tyr Ala Gly His Asp Asn Thr Lys Pro Asp
20 25 30
Thr Ser Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Asn Gln Leu Gly Glu Arg Gln
35 40 45
Leu Leu Ser Val Val Lys Trp Ser Lys Ser Leu Pro Gly Phe Arg Asn
50 55 60
Leu His Ile Asp Asp Gln Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser Trp Met Ser
65 70 75 80
Leu Met Val Phe Gly Leu Gly Trp Arg Ser Tyr Lys His Val Ser Gly
85 90 95
Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Ile Leu Asn Glu Gln Arg Met
100 105 110
Lys Glu Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Cys Leu Thr Met Trp Gln Ile Pro
115 120 125
Gln Glu Phe Val Lys Leu Gln Val Ser Gln Glu Glu Phe Leu Cys Met
130 135 140
Lys Val Leu Leu Leu Leu Asn Thr Ile Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser
145 150 155 160
Gln Thr Gln Phe Glu Glu Met Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Ala Ile Gly Leu Arg Gln Lys Gly Val Val Ser Ser Ser Gln Arg
180 185 190
Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Asn Leu His Asp Leu Val Lys
195 200 205
Gln Leu His Leu Tyr Cys Leu Asn Thr Phe Ile Gln Ser Arg Ala Leu
210 215 220
Ser Val Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu Val Ile Ala Ala Gln Leu
225 230 235 240
Pro Lys Ile Leu Ala Gly Met Val Lys Pro Leu Leu Phe His Lys Lys
245 250 255
<210> 30
<211> 3183
<212> DNA
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<220>
<223> v.2构建体
<400> 30
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cctgagcaga agctgatctc cgaagaggac ctggacatcc agatgaccca gaccaccagc 120
agcctgagcg ccagcctggg cgatagagtg accatcagct gcagagccag ccaggacatc 180
agcaagtacc tgaactggta tcagcagaaa cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac 240
cacaccagca gactgcacag cggcgtgccc agcagatttt ctggcagcgg ctccggcacc 300
gactacagcc tgaccatctc caacctggaa caggaagata tcgctaccta cttctgtcag 360
caaggcaaca ccctgcccta caccttcggc ggaggcacca agctggaaat cacaggcggc 420
ggaggatctg gcggaggcgg aagtggcgga gggggatctg aagtgaaact gcaggaaagc 480
ggccctggcc tggtggcccc atctcagtct ctgagcgtga cctgtaccgt gtccggcgtg 540
tccctgcctg actatggcgt gtcctggatc agacagcccc ccagaaaggg cctggaatgg 600
ctgggagtga tctggggcag cgagacaacc tactacaaca gcgccctgaa gtcccggctg 660
accatcatca aggacaactc caagagccag gtgttcctga agatgaacag cctgcagacc 720
gacgacaccg ccatctacta ctgcgccaag cactactact acggcggcag ctacgccatg 780
gactactggg gccagggcac aagcgtgacc gtgtctagca caaccacccc tgcccctaga 840
cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc cagcctctgt ctctgaggcc cgaggcttgt 900
agaccagctg ctggcggagc cgtgcacacc agaggactgg atttcgcctg cgacatctac 960
atctgggccc ctctggccgg cacatgtggc gtgctgctgc tgagcctcgt gatcaccctg 1020
tactgcggat ccaagcgggg cagaaagaaa ctgctgtaca tctttaagca gcccttcatg 1080
cggcccgtgc agaccaccca ggaagaggac ggctgctcct gcagattccc cgaggaagaa 1140
gaaggcggct gcgagctggg cagcggatct ggcagtggaa gcgatagaag aggcggcaga 1200
atgctgaaac acaagcggca gagggacgac ggggaaggca gaggcgaagt gggatctgcc 1260
ggcgatatga gagccgccaa cctgtggcct agccccctga tgatcaagcg gagcaagaag 1320
aactccctgg ccctgagcct gaccgccgac cagatggtgt ctgccctgct ggatgccgag 1380
ccccccatcc tgtacagcga gtacgacccc accagaccct tcagcgaggc cagcatgatg 1440
ggcctgctga ccaacctggc cgaccgggaa ctggtgcaca tgatcaactg ggccaagcgg 1500
gtgcccggct tcgtggatct gacactgcac gaccaggtgc acctgctgga atgcgcttgg 1560
ctggaaatcc tgatgatcgg cctcgtgtgg cggagcatgg aacaccctgg caagctgctg 1620
ttcgccccca acctgctgct ggaccggaac cagggcaaat gcgtggaagg catggtggaa 1680
atcttcgaca tgctgctggc cacctccagc cggttccgga tgatgaacct gcagggcgaa 1740
gagttcgtgt gtctgaagtc catcatcctg ctgaatagcg gcgtgtacac cttcctgagc 1800
agcaccctga aaagcctgga agaaaaggac cacatccacc gggtgctgga caagatcacc 1860
gacaccctga ttcacctgat ggccaaggcc ggactgaccc tgcagcagca gcatcagaga 1920
ctggctcagc tgctgctgat cctgtcccac atccggcaca tgagcaacaa gcggatggaa 1980
catctgtaca gcatgaagtg caagaacgtg gtgcctctgt tcgatctgct gctggaaatg 2040
ctggacgccc acaggctgca cgccccaaca tccagatccg gatctggaag tggctccctg 2100
agagtgaagt ttagcagaag cgccgacgcc cctgcctatc agcagggaca gaaccagctg 2160
tataacgagc tgaacctggg caggcgggaa gagtacgacg tgctggataa gaggcggggc 2220
agggaccctg aaatgggcgg caaacccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtacaac 2280
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgg 2340
cggagaggca agggacatga tggcctgtac cagggcctgt ccaccgccac caaggacacc 2400
tatgacgccc tgcacatgca ggccctgcct ccaagaggaa gtggatctgg gagcggctct 2460
atggtgtcta agggggaaga ggacaacatg gccatcatca aagaattcat gcggttcaag 2520
gtgcacatgg aaggctccgt gaatggccac gaattcgaga tcgaggggga gggcgagggc 2580
agaccttatg agggaaccca gaccgccaag ctgaaagtga ccaagggcgg acccctgcct 2640
ttcgcctggg atatcctgtc tccccagttt atgtacggca gcaaggccta cgtgaagcac 2700
cccgccgaca tccccgacta cctgaagctg agcttccctg agggcttcaa gtgggagaga 2760
gtgatgaatt tcgaggacgg cggagtcgtg acagtgaccc aggatagctc tctgcaggac 2820
ggcgagttca tctacaaagt gaagctgcgg ggcaccaact tccccagcga cggacccgtg 2880
atgcagaaaa agaccatggg ctgggaggcc agctccgaga gaatgtaccc agaggacggg 2940
gccctgaagg gggagatcaa gcagcggctg aaactgaagg atggcggcca ctacgacgca 3000
gaagtgaaaa ccacctacaa ggccaagaaa cctgtgcagc tgcctggcgc ctacaatgtg 3060
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cgggccgagg gcaggcattc tacaggcgga atggatgaac tgtataagtg cgtgaccgac 3180
tag 3183
<210> 31
<211> 1060
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> v.2构建体
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
340 345 350
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
355 360 365
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Arg Arg Gly Gly Arg
385 390 395 400
Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu
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Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro
420 425 430
Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr
435 440 445
Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu
450 455 460
Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met
465 470 475 480
Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn
485 490 495
Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln
500 505 510
Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu
515 520 525
Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn
530 535 540
Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu
545 550 555 560
Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn
565 570 575
Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn
580 585 590
Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu
595 600 605
Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile
610 615 620
His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg
625 630 635 640
Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn
645 650 655
Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro
660 665 670
Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His Ala
675 680 685
Pro Thr Ser Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Arg Val Lys Phe
690 695 700
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
705 710 715 720
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
725 730 735
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
740 745 750
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
755 760 765
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
770 775 780
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
785 790 795 800
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ser
805 810 815
Gly Ser Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile
820 825 830
Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn
835 840 845
Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu
850 855 860
Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro
865 870 875 880
Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala
885 890 895
Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe
900 905 910
Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly
915 920 925
Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile
930 935 940
Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val
945 950 955 960
Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr
965 970 975
Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu
980 985 990
Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala
995 1000 1005
Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys
1010 1015 1020
Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln
1025 1030 1035
Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu
1040 1045 1050
Leu Tyr Lys Cys Val Thr Asp
1055 1060
<210> 32
<211> 3183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> v.3构建体
<400> 32
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cctgagcaga agctgatctc cgaagaggac ctggacatcc agatgaccca gaccaccagc 120
agcctgagcg ccagcctggg cgatagagtg accatcagct gcagagccag ccaggacatc 180
agcaagtacc tgaactggta tcagcagaaa cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac 240
cacaccagca gactgcacag cggcgtgccc agcagatttt ctggcagcgg ctccggcacc 300
gactacagcc tgaccatctc caacctggaa caggaagata tcgctaccta cttctgtcag 360
caaggcaaca ccctgcccta caccttcggc ggaggcacca agctggaaat cacaggcggc 420
ggaggatctg gcggaggcgg aagtggcgga gggggatctg aagtgaaact gcaggaaagc 480
ggccctggcc tggtggcccc atctcagtct ctgagcgtga cctgtaccgt gtccggcgtg 540
tccctgcctg actatggcgt gtcctggatc agacagcccc ccagaaaggg cctggaatgg 600
ctgggagtga tctggggcag cgagacaacc tactacaaca gcgccctgaa gtcccggctg 660
accatcatca aggacaactc caagagccag gtgttcctga agatgaacag cctgcagacc 720
gacgacaccg ccatctacta ctgcgccaag cactactact acggcggcag ctacgccatg 780
gactactggg gccagggcac aagcgtgacc gtgtctagca caaccacccc tgcccctaga 840
cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc cagcctctgt ctctgaggcc cgaggcttgt 900
agaccagctg ctggcggagc cgtgcacacc agaggactgg atttcgcctg cgacatctac 960
atctgggccc ctctggccgg cacatgtggc gtgctgctgc tgagcctcgt gatcaccctg 1020
tactgcggat ccaagcgggg cagaaagaaa ctgctgtaca tctttaagca gcccttcatg 1080
cggcccgtgc agaccaccca ggaagaggac ggctgctcct gcagattccc cgaggaagaa 1140
gaaggcggct gcgagctgag atccggatct ggaagtggct ccctgagagt gaagtttagc 1200
agaagcgccg acgcccctgc ctatcagcag ggacagaacc agctgtataa cgagctgaac 1260
ctgggcaggc gggaagagta cgacgtgctg gataagaggc ggggcaggga ccctgaaatg 1320
ggcggcaaac ccagacggaa gaacccccag gaaggcctgt acaacgaact gcagaaagac 1380
aagatggccg aggcctacag cgagatcgga atgaagggcg agcggcggag aggcaaggga 1440
catgatggcc tgtaccaggg cctgtccacc gccaccaagg acacctatga cgccctgcac 1500
atgcaggccc tgcctccaag aggcagcgga tctggcagtg gaagcgatag aagaggcggc 1560
agaatgctga aacacaagcg gcagagggac gacggggaag gcagaggcga agtgggatct 1620
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gagcccccca tcctgtacag cgagtacgac cccaccagac ccttcagcga ggccagcatg 1800
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ctgttcgccc ccaacctgct gctggaccgg aaccagggca aatgcgtgga aggcatggtg 2040
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cctgagggct tcaagtggga gagagtgatg aatttcgagg acggcggagt cgtgacagtg 2820
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Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
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Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
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Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
965 970 975
Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly
980 985 990
Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala
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ctgattcacc tgatggccaa ggccggactg accctgcagc agcagcatca gagactggct 1800
cagctgctgc tgatcctgtc ccacatccgg cacatgagca acaagcggat ggaacatctg 1860
tacagcatga agtgcaagaa cgtggtgcct ctgttcgatc tgctgctgga aatgctggac 1920
gcccacaggc tgcacgcccc aacatccgga tctggctctg gaagcggcag catggtgtct 1980
aagggggaag aggacaacat ggccatcatc aaagaattca tgcggttcaa ggtgcacatg 2040
gaaggctccg tgaatggcca cgaattcgag atcgaggggg agggcgaggg cagaccttat 2100
gagggaaccc agaccgccaa gctgaaagtg accaagggcg gacccctgcc tttcgcctgg 2160
gatatcctgt ctccccagtt tatgtacggc agcaaggcct acgtgaagca ccccgccgac 2220
atccccgact acctgaagct gagcttccct gagggcttca agtgggagag agtgatgaat 2280
ttcgaggacg gcggagtcgt gacagtgacc caggatagct ctctgcagga cggcgagttc 2340
atctacaaag tgaagctgcg gggcaccaac ttccccagcg acggacccgt gatgcagaaa 2400
aagaccatgg gctgggaggc cagctccgag agaatgtacc cagaggacgg ggccctgaag 2460
ggggagatca agcagcggct gaaactgaag gatggcggcc actacgacgc agaagtgaaa 2520
accacctaca aggccaagaa acctgtgcag ctgcctggcg cctacaatgt gaacatcaag 2580
ctggacatta ccagccacaa cgaggactac accatcgtgg aacagtacga gcgggccgag 2640
ggcaggcatt ctacaggcgg aatggatgaa ctgtataagt gcgtgaccga ctag 2694
<210> 37
<211> 897
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> v.5构建体
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp
20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
340 345 350
Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp Asp
355 360 365
Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala
370 375 380
Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser
385 390 395 400
Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp
405 410 415
Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe
420 425 430
Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu
435 440 445
Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp
450 455 460
Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu
465 470 475 480
Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys
485 490 495
Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys
500 505 510
Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser
515 520 525
Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys
530 535 540
Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr
545 550 555 560
Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys
565 570 575
Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu
580 585 590
Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His
595 600 605
Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys
610 615 620
Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp
625 630 635 640
Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
645 650 655
Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu
660 665 670
Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu
675 680 685
Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln
690 695 700
Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp
705 710 715 720
Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys
725 730 735
His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly
740 745 750
Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr
755 760 765
Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val
770 775 780
Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys
785 790 795 800
Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp
805 810 815
Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly
820 825 830
Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro
835 840 845
Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr
850 855 860
Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu
865 870 875 880
Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Cys Val Thr
885 890 895
Asp
<210> 38
<211> 2391
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FLAG构建体的ERa-LBD融合蛋白
<400> 38
atgatccacc tgggacacat cctgtttttg ctgctgctgc cagtggctgc cgccgattac 60
aaagacgacg atgataaaca gacaacacca ggcgagagat ctagcctgcc cgccttctac 120
cctggcacca gcggctcttg ttctggctgt ggcagcctgt ctctgcccat ctatatttgg 180
gcacccctgg ctggaacctg cggagtgctg ctgctgtctc tcgtgattac actgtattgc 240
aaaaggggcc ggaaaaagct gctgtatatt ttcaaacagc cttttatgag gcctgtgcag 300
acaacacagg aagaggacgg ctgtagctgt cggttccccg aagaggaaga ggggggctgc 360
gaactgggat caggcagtgg ctctggcagc gatagaagag gcggcagaat gctgaaacac 420
aagcggcaga gggacgacgg ggaaggcaga ggcgaagtgg gatctgccgg cgatatgaga 480
gccgccaacc tgtggcctag ccccctgatg atcaagcgga gcaagaagaa ctccctggcc 540
ctgagcctga ccgccgacca gatggtgtct gccctgctgg atgccgagcc ccccatcctg 600
tacagcgagt acgaccccac cagacccttc agcgaggcca gcatgatggg cctgctgacc 660
aacctggccg accgggaact ggtgcacatg atcaactggg ccaagcgggt gcccggcttc 720
gtggatctga cactgcacga ccaggtgcac ctgctggaat gcgcttggct ggaaatcctg 780
atgatcggcc tcgtgtggcg gagcatggaa caccctggca agctgctgtt cgcccccaac 840
ctgctgctgg accggaacca gggcaaatgc gtggaaggca tggtggaaat cttcgacatg 900
ctgctggcca cctccagccg gttccggatg atgaacctgc agggcgaaga gttcgtgtgt 960
ctgaagtcca tcatcctgct gaatagcggc gtgtacacct tcctgagcag caccctgaaa 1020
agcctggaag aaaaggacca catccaccgg gtgctggaca agatcaccga caccctgatt 1080
cacctgatgg ccaaggccgg actgaccctg cagcagcagc atcagagact ggctcagctg 1140
ctgctgatcc tgtcccacat ccggcacatg agcaacaagc ggatggaaca tctgtacagc 1200
atgaagtgca agaacgtggt gcctctgttc gatctgctgc tggaaatgct ggacgcccac 1260
aggctgcacg ccccaacatc cagatccgga tctggaagtg gctccctgag agtgaagttt 1320
agcagaagcg ccgacgcccc tgcctatcag cagggacaga accagctgta taacgagctg 1380
aacctgggca ggcgggaaga gtacgacgtg ctggataaga ggcggggcag ggaccctgaa 1440
atgggcggca aacccagacg gaagaacccc caggaaggcc tgtacaacga actgcagaaa 1500
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggaatgaagg gcgagcggcg gagaggcaag 1560
ggacatgatg gcctgtacca gggcctgtcc accgccacca aggacaccta tgacgccctg 1620
cacatgcagg ccctgcctcc aagaggaagt ggatctggga gcggctctat ggtgtctaag 1680
ggggaagagg acaacatggc catcatcaaa gaattcatgc ggttcaaggt gcacatggaa 1740
ggctccgtga atggccacga attcgagatc gagggggagg gcgagggcag accttatgag 1800
ggaacccaga ccgccaagct gaaagtgacc aagggcggac ccctgccttt cgcctgggat 1860
atcctgtctc cccagtttat gtacggcagc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc 1920
cccgactacc tgaagctgag cttccctgag ggcttcaagt gggagagagt gatgaatttc 1980
gaggacggcg gagtcgtgac agtgacccag gatagctctc tgcaggacgg cgagttcatc 2040
tacaaagtga agctgcgggg caccaacttc cccagcgacg gacccgtgat gcagaaaaag 2100
accatgggct gggaggccag ctccgagaga atgtacccag aggacggggc cctgaagggg 2160
gagatcaagc agcggctgaa actgaaggat ggcggccact acgacgcaga agtgaaaacc 2220
acctacaagg ccaagaaacc tgtgcagctg cctggcgcct acaatgtgaa catcaagctg 2280
gacattacca gccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg ggccgagggc 2340
aggcattcta caggcggaat ggatgaactg tataagtgcg tgaccgacta g 2391
<210> 39
<211> 796
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FLAG构建体的ERa-LBD融合蛋白
<400> 39
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gln Thr Thr Pro Gly Glu
20 25 30
Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser
35 40 45
Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
50 55 60
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70 75 80
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
85 90 95
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
100 105 110
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg
130 135 140
Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg
145 150 155 160
Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys
165 170 175
Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu
180 185 190
Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg
195 200 205
Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp
210 215 220
Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe
225 230 235 240
Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp
245 250 255
Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro
260 265 270
Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly
275 280 285
Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr
290 295 300
Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys
305 310 315 320
Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser
325 330 335
Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu
340 345 350
Asp Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu
355 360 365
Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu
370 375 380
Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met
405 410 415
Leu Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Ser Gly Ser Gly
420 425 430
Ser Gly Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
435 440 445
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
450 455 460
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
465 470 475 480
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
485 490 495
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
500 505 510
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
515 520 525
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
530 535 540
Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Val Ser Lys
545 550 555 560
Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
565 570 575
Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
580 585 590
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys
595 600 605
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
610 615 620
Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile
625 630 635 640
Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
645 650 655
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser
660 665 670
Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr
675 680 685
Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
690 695 700
Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly
705 710 715 720
Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala
725 730 735
Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly
740 745 750
Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
755 760 765
Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr
770 775 780
Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Cys Val Thr Asp
785 790 795
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 40
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG标签
<400> 41
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人
<400> 42
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
20 25 30
<210> 43
<211> 24
<212> PRT
<213> 人
<400> 43
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 44
<211> 42
<212> PRT
<213> 人
<400> 44
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 45
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的ERa配体结合结构域
<400> 46
Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp Asp
1 5 10 15
Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser
35 40 45
Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp
50 55 60
Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu
85 90 95
Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp
100 105 110
Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu
115 120 125
Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys
145 150 155 160
Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser
165 170 175
Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys
180 185 190
Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys
210 215 220
Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu
225 230 235 240
Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His
245 250 255
Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys
260 265 270
Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp
275 280 285
Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser
290 295
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 47
Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人
<400> 48
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 49
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 50
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 50
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Cys Val Thr Asp
225 230 235 240
<210> 51
<211> 2265
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PR配体结合结构域构建体
<400> 51
atgatccacc tgggacacat cctgtttttg ctgctgctgc cagtggctgc cgccgattac 60
aaagacgacg atgataaaca gacaacacca ggcgagagat ctagcctgcc cgccttctac 120
cctggcacca gcggctcttg ttctggctgt ggcagcctgt ctctgcccat ctatatttgg 180
gcacccctgg ctggaacctg cggagtgctg ctgctgtctc tcgtgattac actgtattgc 240
aaaaggggcc ggaaaaagct gctgtatatt ttcaaacagc cttttatgag gcctgtgcag 300
acaacacagg aagaggacgg ctgtagctgt cggttccccg aagaggaaga ggggggctgc 360
gaactgggat caggcagtgg ctctggcagc gggcaagaca ttcagctcat acctcctttg 420
ataaatttgc tgatgtctat agaaccagat gtcatatacg ctggtcacga caatacgaaa 480
ccggacacat cttcatcttt gcttacctct ctgaatcaac tgggtgaacg acagctcctg 540
agtgttgtta agtggtctaa aagcctcccg ggcttcagga atttgcacat agacgaccaa 600
atcacgctca tccaatattc ctggatgagt ctcatggtct ttggtctcgg ttggcgcagc 660
tataagcacg tctctggcca gatgttgtat ttcgcaccag acctgatcct gaacgaacag 720
aggatgaagg aatcaagctt ttactctctc tgcttgacta tgtggcaaat cccccaagaa 780
ttcgtgaaac ttcaagtttc ccaagaagaa ttcctctgca tgaaagtcct tcttttgctc 840
aacacgattc ccctggaagg cttgaggtct caaacgcaat tcgaggagat gcggagtagc 900
tatatacgcg aactcatcaa ggccatcggt ttgcggcaaa agggagtggt ctctagtagc 960
caacgatttt accagctgac taagctcctt gacaaccttc acgatctcgt caaacaactg 1020
cacctgtact gtcttaacac atttatacaa tcacgggcac tttctgtaga gttcccagag 1080
atgatgtctg aggtcatcgc agcccaactt ccgaaaattc ttgcaggaat ggtgaagcca 1140
cttctgttcc ataagaaaag atccggatct ggaagtggct ccctgagagt gaagtttagc 1200
agaagcgccg acgcccctgc ctatcagcag ggacagaacc agctgtataa cgagctgaac 1260
ctgggcaggc gggaagagta cgacgtgctg gataagaggc ggggcaggga ccctgaaatg 1320
ggcggcaaac ccagacggaa gaacccccag gaaggcctgt acaacgaact gcagaaagac 1380
aagatggccg aggcctacag cgagatcgga atgaagggcg agcggcggag aggcaaggga 1440
catgatggcc tgtaccaggg cctgtccacc gccaccaagg acacctatga cgccctgcac 1500
atgcaggccc tgcctccaag aggaagtgga tctgggagcg gctctatggt gtctaagggg 1560
gaagaggaca acatggccat catcaaagaa ttcatgcggt tcaaggtgca catggaaggc 1620
tccgtgaatg gccacgaatt cgagatcgag ggggagggcg agggcagacc ttatgaggga 1680
acccagaccg ccaagctgaa agtgaccaag ggcggacccc tgcctttcgc ctgggatatc 1740
ctgtctcccc agtttatgta cggcagcaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 1800
gactacctga agctgagctt ccctgagggc ttcaagtggg agagagtgat gaatttcgag 1860
gacggcggag tcgtgacagt gacccaggat agctctctgc aggacggcga gttcatctac 1920
aaagtgaagc tgcggggcac caacttcccc agcgacggac ccgtgatgca gaaaaagacc 1980
atgggctggg aggccagctc cgagagaatg tacccagagg acggggccct gaagggggag 2040
atcaagcagc ggctgaaact gaaggatggc ggccactacg acgcagaagt gaaaaccacc 2100
tacaaggcca agaaacctgt gcagctgcct ggcgcctaca atgtgaacat caagctggac 2160
attaccagcc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgggc cgagggcagg 2220
cattctacag gcggaatgga tgaactgtat aagtgcgtga ccgac 2265
<210> 52
<211> 755
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PR配体结合结构域构建体
<400> 52
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gln Thr Thr Pro Gly Glu
20 25 30
Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly Thr Ser Gly Ser Cys Ser
35 40 45
Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
50 55 60
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
65 70 75 80
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
85 90 95
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
100 105 110
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Ser Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Gln Asp Ile Gln Leu Ile Pro Pro Leu Ile Asn Leu Leu
130 135 140
Met Ser Ile Glu Pro Asp Val Ile Tyr Ala Gly His Asp Asn Thr Lys
145 150 155 160
Pro Asp Thr Ser Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Asn Gln Leu Gly Glu
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Ser Val Val Lys Trp Ser Lys Ser Leu Pro Gly Phe
180 185 190
Arg Asn Leu His Ile Asp Asp Gln Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser Trp
195 200 205
Met Ser Leu Met Val Phe Gly Leu Gly Trp Arg Ser Tyr Lys His Val
210 215 220
Ser Gly Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Ile Leu Asn Glu Gln
225 230 235 240
Arg Met Lys Glu Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Cys Leu Thr Met Trp Gln
245 250 255
Ile Pro Gln Glu Phe Val Lys Leu Gln Val Ser Gln Glu Glu Phe Leu
260 265 270
Cys Met Lys Val Leu Leu Leu Leu Asn Thr Ile Pro Leu Glu Gly Leu
275 280 285
Arg Ser Gln Thr Gln Phe Glu Glu Met Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Glu
290 295 300
Leu Ile Lys Ala Ile Gly Leu Arg Gln Lys Gly Val Val Ser Ser Ser
305 310 315 320
Gln Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Asn Leu His Asp Leu
325 330 335
Val Lys Gln Leu His Leu Tyr Cys Leu Asn Thr Phe Ile Gln Ser Arg
340 345 350
Ala Leu Ser Val Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu Val Ile Ala Ala
355 360 365
Gln Leu Pro Lys Ile Leu Ala Gly Met Val Lys Pro Leu Leu Phe His
370 375 380
Lys Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser
385 390 395 400
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
420 425 430
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
435 440 445
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
450 455 460
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
465 470 475 480
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
485 490 495
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ser Gly
500 505 510
Ser Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile
515 520 525
Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly
530 535 540
His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly
545 550 555 560
Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe
565 570 575
Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr
580 585 590
Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro
595 600 605
Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val
610 615 620
Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr
625 630 635 640
Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met
645 650 655
Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro
660 665 670
Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys
675 680 685
Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys
690 695 700
Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp
705 710 715 720
Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg
725 730 735
Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Cys
740 745 750
Val Thr Asp
755
<210> 53
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 53
Met Ile His Leu Gly His Ile Leu Phe Leu Leu Leu Leu Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Ala
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG标签
<400> 54
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 55
<211> 30
<212> PRT
<213> 人
<400> 55
Gln Thr Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Leu Pro Ala Phe Tyr Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Cys Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ser Leu Pro
20 25 30
<210> 56
<211> 24
<212> PRT
<213> 人
<400> 56
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 57
<211> 42
<212> PRT
<213> 人
<400> 57
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 58
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 59
<211> 256
<212> PRT
<213> 人
<400> 59
Gly Gln Asp Ile Gln Leu Ile Pro Pro Leu Ile Asn Leu Leu Met Ser
1 5 10 15
Ile Glu Pro Asp Val Ile Tyr Ala Gly His Asp Asn Thr Lys Pro Asp
20 25 30
Thr Ser Ser Ser Leu Leu Thr Ser Leu Asn Gln Leu Gly Glu Arg Gln
35 40 45
Leu Leu Ser Val Val Lys Trp Ser Lys Ser Leu Pro Gly Phe Arg Asn
50 55 60
Leu His Ile Asp Asp Gln Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser Trp Met Ser
65 70 75 80
Leu Met Val Phe Gly Leu Gly Trp Arg Ser Tyr Lys His Val Ser Gly
85 90 95
Gln Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Ile Leu Asn Glu Gln Arg Met
100 105 110
Lys Glu Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Cys Leu Thr Met Trp Gln Ile Pro
115 120 125
Gln Glu Phe Val Lys Leu Gln Val Ser Gln Glu Glu Phe Leu Cys Met
130 135 140
Lys Val Leu Leu Leu Leu Asn Thr Ile Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser
145 150 155 160
Gln Thr Gln Phe Glu Glu Met Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Ala Ile Gly Leu Arg Gln Lys Gly Val Val Ser Ser Ser Gln Arg
180 185 190
Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Asn Leu His Asp Leu Val Lys
195 200 205
Gln Leu His Leu Tyr Cys Leu Asn Thr Phe Ile Gln Ser Arg Ala Leu
210 215 220
Ser Val Glu Phe Pro Glu Met Met Ser Glu Val Ile Ala Ala Gln Leu
225 230 235 240
Pro Lys Ile Leu Ala Gly Met Val Lys Pro Leu Leu Phe His Lys Lys
245 250 255
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 60
Arg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 61
<211> 113
<212> PRT
<213> 人
<400> 61
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 62
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 63
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dap10信号
<400> 63
atgatccacc tgggacacat cctgtttttg ctgctgctgc cagtggctgc cgcc 54
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FLAG标签
<400> 64
gattacaaag acgacgatga taaa 24
<210> 65
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dap10细胞外结构域
<400> 65
cagacaacac caggcgagag atctagcctg cccgccttct accctggcac cagcggctct 60
tgttctggct gtggcagcct gtctctgccc 90
<210> 66
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8跨膜结构域
<400> 66
atctatattt gggcacccct ggctggaacc tgcggagtgc tgctgctgtc tctcgtgatt 60
acactgtatt gc 72
<210> 67
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 67
aaaaggggcc ggaaaaagct gctgtatatt ttcaaacagc cttttatgag gcctgtgcag 60
acaacacagg aagaggacgg ctgtagctgt cggttccccg aagaggaaga ggggggctgc 120
gaactg 126
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 68
ggatcaggca gtggctctgg cagc 24
<210> 69
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 孕酮受体配体结合结构域
<400> 69
gggcaagaca ttcagctcat acctcctttg ataaatttgc tgatgtctat agaaccagat 60
gtcatatacg ctggtcacga caatacgaaa ccggacacat cttcatcttt gcttacctct 120
ctgaatcaac tgggtgaacg acagctcctg agtgttgtta agtggtctaa aagcctcccg 180
ggcttcagga atttgcacat agacgaccaa atcacgctca tccaatattc ctggatgagt 240
ctcatggtct ttggtctcgg ttggcgcagc tataagcacg tctctggcca gatgttgtat 300
ttcgcaccag acctgatcct gaacgaacag aggatgaagg aatcaagctt ttactctctc 360
tgcttgacta tgtggcaaat cccccaagaa ttcgtgaaac ttcaagtttc ccaagaagaa 420
ttcctctgca tgaaagtcct tcttttgctc aacacgattc ccctggaagg cttgaggtct 480
caaacgcaat tcgaggagat gcggagtagc tatatacgcg aactcatcaa ggccatcggt 540
ttgcggcaaa agggagtggt ctctagtagc caacgatttt accagctgac taagctcctt 600
gacaaccttc acgatctcgt caaacaactg cacctgtact gtcttaacac atttatacaa 660
tcacgggcac tttctgtaga gttcccagag atgatgtctg aggtcatcgc agcccaactt 720
ccgaaaattc ttgcaggaat ggtgaagcca cttctgttcc ataagaaa 768
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 70
ggatctggaa gtggctcc 18
<210> 71
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CD3 zeta信号传导结构域的序列
<400> 71
ctgagagtga agtttagcag aagcgccgac gcccctgcct atcagcaggg acagaaccag 60
ctgtataacg agctgaacct gggcaggcgg gaagagtacg acgtgctgga taagaggcgg 120
ggcagggacc ctgaaatggg cggcaaaccc agacggaaga acccccagga aggcctgtac 180
aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggaat gaagggcgag 240
cggcggagag gcaagggaca tgatggcctg taccagggcc tgtccaccgc caccaaggac 300
acctatgacg ccctgcacat gcaggccctg cctccaaga 339
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 72
ggaagtggat ctgggagcgg ctct 24
<210> 73
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 73
atggtgtcta agggggaaga ggacaacatg gccatcatca aagaattcat gcggttcaag 60
gtgcacatgg aaggctccgt gaatggccac gaattcgaga tcgaggggga gggcgagggc 120
agaccttatg agggaaccca gaccgccaag ctgaaagtga ccaagggcgg acccctgcct 180
ttcgcctggg atatcctgtc tccccagttt atgtacggca gcaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cctgaagctg agcttccctg agggcttcaa gtgggagaga 300
gtgatgaatt tcgaggacgg cggagtcgtg acagtgaccc aggatagctc tctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaagt gaagctgcgg ggcaccaact tccccagcga cggacccgtg 420
atgcagaaaa agaccatggg ctgggaggcc agctccgaga gaatgtaccc agaggacggg 480
gccctgaagg gggagatcaa gcagcggctg aaactgaagg atggcggcca ctacgacgca 540
gaagtgaaaa ccacctacaa ggccaagaaa cctgtgcagc tgcctggcgc ctacaatgtg 600
aacatcaagc tggacattac cagccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag 660
cgggccgagg gcaggcattc tacaggcgga atggatgaac tgtataagtg cgtgaccgac 720
<210> 74
<211> 480
<212> PRT
<213> 人
<400> 74
Met Glu Arg Asp Glu Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gly Phe Leu Glu Pro Pro Ala Ala Leu Pro Pro Pro Pro Arg
20 25 30
Asn Gly Phe Cys Gln Asp Glu Leu Ala Glu Leu Asp Pro Gly Thr Ile
35 40 45
Ser Val Ser Asp Asp Arg Ala Glu Gln Arg Thr Cys Leu Ile Cys Gly
50 55 60
Asp Arg Ala Thr Gly Leu His Tyr Gly Ile Ile Ser Cys Glu Gly Cys
65 70 75 80
Lys Gly Phe Phe Lys Arg Ser Ile Cys Asn Lys Arg Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Ser Arg Asp Lys Asn Cys Val Met Ser Arg Lys Gln Arg Asn Arg Cys
100 105 110
Gln Tyr Cys Arg Leu Leu Lys Cys Leu Gln Met Gly Met Asn Arg Lys
115 120 125
Ala Ile Arg Glu Asp Gly Met Pro Gly Gly Arg Asn Lys Ser Ile Gly
130 135 140
Pro Val Gln Ile Ser Glu Glu Glu Ile Glu Arg Ile Met Ser Gly Gln
145 150 155 160
Glu Phe Glu Glu Glu Ala Asn His Trp Ser Asn His Gly Asp Ser Asp
165 170 175
His Ser Ser Pro Gly Asn Arg Ala Ser Glu Ser Asn Gln Pro Ser Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Ser Ser Ser Arg Ser Val Glu Leu Asn Gly Phe Met
195 200 205
Ala Phe Arg Glu Gln Tyr Met Gly Met Ser Val Pro Pro His Tyr Gln
210 215 220
Tyr Ile Pro His Leu Phe Ser Tyr Ser Gly His Ser Pro Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gln Gln Ala Arg Ser Leu Asp Pro Gln Ser Tyr Ser Leu Ile His Gln
245 250 255
Leu Leu Ser Ala Glu Asp Leu Glu Pro Leu Gly Thr Pro Met Leu Ile
260 265 270
Glu Asp Gly Tyr Ala Val Thr Gln Ala Glu Leu Phe Ala Leu Leu Cys
275 280 285
Arg Leu Ala Asp Glu Leu Leu Phe Arg Gln Ile Ala Trp Ile Lys Lys
290 295 300
Leu Pro Phe Phe Cys Glu Leu Ser Ile Lys Asp Tyr Thr Cys Leu Leu
305 310 315 320
Ser Ser Thr Trp Gln Glu Leu Ile Leu Leu Ser Ser Leu Thr Val Tyr
325 330 335
Ser Lys Gln Ile Phe Gly Glu Leu Ala Asp Val Thr Ala Lys Tyr Ser
340 345 350
Pro Ser Asp Glu Glu Leu His Arg Phe Ser Asp Glu Gly Met Glu Val
355 360 365
Ile Glu Arg Leu Ile Tyr Leu Tyr His Lys Phe His Gln Leu Lys Val
370 375 380
Ser Asn Glu Glu Tyr Ala Cys Met Lys Ala Ile Asn Phe Leu Asn Gln
385 390 395 400
Asp Ile Arg Gly Leu Thr Ser Ala Ser Gln Leu Glu Gln Leu Asn Lys
405 410 415
Arg Tyr Trp Tyr Ile Cys Gln Asp Phe Thr Glu Tyr Lys Tyr Thr His
420 425 430
Gln Pro Asn Arg Phe Pro Asp Leu Met Met Cys Leu Pro Glu Ile Arg
435 440 445
Tyr Ile Ala Gly Lys Met Val Asn Val Pro Leu Glu Gln Leu Pro Leu
450 455 460
Leu Phe Lys Val Val Leu His Ser Cys Lys Thr Ser Val Gly Lys Glu
465 470 475 480
<210> 75
<211> 505
<212> PRT
<213> 人
<400> 75
Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asp Thr Leu Ser Ala Asn Ile Ser Gln Glu Met Thr Met Val
20 25 30
Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val
35 40 45
Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro
50 55 60
Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp
65 70 75 80
Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp
85 90 95
Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser
100 105 110
Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu
115 120 125
Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Gly Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys
145 150 155 160
Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys
165 170 175
Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr
180 185 190
Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile
195 200 205
Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu
210 215 220
Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg
225 230 235 240
Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu
245 250 255
Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys
260 265 270
Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp
275 280 285
Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu
290 295 300
Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala
305 310 315 320
Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn
325 330 335
Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu
340 345 350
Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu
355 360 365
Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu
370 375 380
Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile
405 410 415
Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys
420 425 430
Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln
435 440 445
Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu
450 455 460
Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu
465 470 475 480
Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu
485 490 495
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Glu Glu Glu Tyr Val Leu Met Gln Ala Ile Ser Leu Phe Ser Pro Asp
340 345 350
Arg Pro Gly Val Leu Gln His Arg Val Val Asp Gln Leu Gln Glu Gln
355 360 365
Phe Ala Ile Thr Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Cys Asn Arg Pro Gln Pro
370 375 380
Ala His Arg Phe Leu Phe Leu Lys Ile Met Ala Met Leu Thr Glu Leu
385 390 395 400
Arg Ser Ile Asn Ala Gln His Thr Gln Arg Leu Leu Arg Ile Gln Asp
405 410 415
Ile His Pro Phe Ala Thr Pro Leu Met Gln Glu Leu Phe Gly Ile Thr
420 425 430
Gly Ser
<210> 83
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<212> PRT
<213> 人
<400> 83
Gly Ser His Met Ser Gln Gly Ser Gly Glu Gly Glu Gly Val Gln Leu
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Thr Ala Ala Gln Glu Leu Met Ile Gln Gln Leu Val Ala Ala Gln Leu
20 25 30
Gln Cys Asn Lys Arg Ser Phe Ser Asp Gln Pro Lys Val Thr Pro Trp
35 40 45
Pro Leu Gly Ala Asp Pro Gln Ser Arg Asp Ala Arg Gln Gln Arg Phe
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Ala His Phe Thr Glu Leu Ala Ile Ile Ser Val Gln Glu Ile Val Asp
65 70 75 80
Phe Ala Lys Gln Val Pro Gly Phe Leu Gln Leu Gly Arg Glu Asp Gln
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Ile Ala Leu Leu Lys Ala Ser Thr Ile Glu Ile Met Leu Leu Glu Thr
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Ala Arg Arg Tyr Asn His Glu Thr Glu Cys Ile Thr Phe Leu Lys Asp
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Phe Thr Tyr Ser Lys Asp Asp Phe His Arg Ala Gly Leu Gln Val Glu
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Phe Ile Asn Pro Ile Phe Glu Phe Ser Arg Ala Met Arg Arg Leu Gly
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Leu Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Leu Leu Ile Ala Ile Asn Ile Phe Ser
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Gln Pro Tyr Val Glu Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Arg Ile Lys Arg Pro
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Gln Asp Gln Leu Arg Phe Pro Arg Met Leu Met Lys Leu Val Ser Leu
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Arg Thr Leu Ser Ser Val His Ser Glu Gln Val Phe Ala Leu Arg Leu
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Gln Asp Lys Lys Leu Pro Pro Leu Leu Ser Glu Ile Trp Asp Val His
245 250 255
Glu
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<212> PRT
<213> 人
<400> 84
Met Gly Ser Lys Met Asn Leu Ile Glu His Ser His Leu Pro Thr Thr
1 5 10 15
Asp Glu Phe Ser Phe Ser Glu Asn Leu Phe Gly Val Leu Thr Glu Gln
20 25 30
Val Ala Gly Pro Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Glu Pro Tyr Ser Gln
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Gln Phe Pro Gln Val Gln Pro Gln Ile Ser Ser Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ser Pro Gly Ile Tyr Glu Leu Arg Arg Met Pro Ala Glu Thr Leu
85 90 95
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100 105 110
Arg Met Gly Ala Ser Ala Gly Arg Ile Lys Gly Asp Glu Leu Cys Val
115 120 125
Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys
130 135 140
Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile Thr Lys Asn Ala Val
145 150 155 160
Tyr Lys Cys Lys Asn Gly Gly Asn Cys Val Met Asp Met Tyr Met Arg
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Leu Leu Gly Arg Leu Thr Glu Leu Arg Thr Phe Asn His His His Ala
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Leu Cys Glu Ile Trp Asp Val Gln
465 470
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<212> PRT
<213> 人
<400> 85
Met Met Tyr Phe Val Ile Ala Ala Met Lys Ala Gln Ile Glu Ile Ile
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Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln Gln Ser
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Gln Ile Asp Gly
465
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<212> PRT
<213> 人
<400> 86
Met Asp Arg Ala Pro Gln Arg Gln His Arg Ala Ser Arg Glu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Ile Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Ile His Tyr Gly Val Ile Thr Cys
35 40 45
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Tyr Ser Cys Thr Arg Gln Gln Asn Cys Pro Ile Asp Arg Thr Ser Arg
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355 360 365
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385 390 395 400
Phe Asp Phe Ser His Ser Leu Ser Ala Leu His Phe Ser Glu Asp Glu
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Pro Val Gly Leu Ser Lys
515
<210> 87
<211> 431
<212> PRT
<213> 人
<400> 87
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1 5 10 15
Gln Leu Pro Val Ser Gly Tyr Ser Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ile Glu
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Thr Gln Ser Ser Ser Ser Glu Glu Ile Val Pro Ser Pro Pro Ser Pro
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Pro Pro Leu Pro Arg Ile Tyr Lys Pro Cys Phe Val Cys Gln Asp Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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Arg Asn Asp Arg Asn Lys Lys Lys Lys Glu Val Pro Lys Pro Glu Cys
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Ala Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Ala Cys Leu Asp Ile Leu Ile
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Leu Arg Ile Cys Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Gln Asp Thr Met Thr Phe
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Ser Asp Gly Leu Thr Leu Asn Arg Thr Gln Met His Asn Ala Gly Phe
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Gly Pro Leu Thr Asp Leu Val Phe Ala Phe Ala Asn Gln Leu Leu Pro
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Leu Arg Ser Ile Ser Ala Lys Gly Ala Glu Arg Val Ile Thr Leu Lys
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Arg Asp Gly Gly Gly Leu Ala Pro Pro Pro Gly Ser Cys Ser Pro Ser
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Leu Ser Pro Ser Ser Asn Arg Ser Ser Pro Ala Thr His Ser Pro
420 425 430
<210> 88
<211> 599
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 88
Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His
1 5 10 15
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20 25 30
Met Pro Met Glu Arg Ala Leu Gly Glu Val Tyr Val Asp Asn Ser Lys
35 40 45
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50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala Pro Val Tyr Gly Gln Ser
65 70 75 80
Gly Ile Ala Tyr Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Ser Ala Asn
85 90 95
Ser Leu Gly Ala Phe Pro Gln Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu
100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser
225 230 235 240
Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys
245 250 255
Gly Gly Ile Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys
260 265 270
Arg Gln Arg Asp Asp Leu Glu Gly Arg Asn Glu Met Gly Ala Ser Gly
275 280 285
Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Val Ile Lys His
290 295 300
Thr Lys Lys Asn Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val
305 310 315 320
Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Met Ile Tyr Ser Glu Tyr Asp
325 330 335
Pro Ser Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn
340 345 350
Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val
355 360 365
Pro Gly Phe Gly Asp Leu Asn Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu
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Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met
385 390 395 400
Glu His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg
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595
<210> 89
<211> 600
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 89
Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His
1 5 10 15
Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys
20 25 30
Met Pro Met Glu Arg Ala Leu Gly Glu Val Tyr Val Asp Asn Ser Lys
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50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ala Pro Val Tyr Gly Gln
65 70 75 80
Ser Ser Ile Thr Tyr Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ala
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Asn Ser Leu Gly Ala Phe Pro Gln Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro
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Asn Arg Arg Gln Asn Gly Arg Glu Arg Leu Ser Ser Ser Ser Glu Lys
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Cys Asn Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu
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Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr
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Met Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys
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Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ile Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His
260 265 270
Lys Arg Gln Arg Asp Asp Leu Glu Gly Arg Asn Glu Met Gly Thr Ser
275 280 285
Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Val Ile Lys
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His Thr Lys Lys Asn Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met
305 310 315 320
Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Leu Ile Tyr Ser Glu Tyr
325 330 335
Asp Pro Ser Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr
340 345 350
Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg
355 360 365
Val Pro Gly Phe Gly Asp Leu Asn Leu His Asp Gln Val His Leu Leu
370 375 380
Glu Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser
385 390 395 400
Met Glu His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp
405 410 415
Arg Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met
420 425 430
Leu Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu
435 440 445
Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr
450 455 460
Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile
465 470 475 480
His Arg Val Leu Asp Lys Ile Asn Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala
485 490 495
Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Arg Arg Leu Ala Gln Leu
500 505 510
Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu
515 520 525
His Leu Tyr Asn Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu
530 535 540
Leu Leu Glu Met Leu Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Ala Ser Arg
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Met Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Ser Gln Ser Gln Leu Thr Thr Thr
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Ser Ser Thr Ser Ala His Ser Leu Gln Thr Tyr Tyr Ile Pro Pro Glu
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Ala Glu Gly Phe Pro Asn Thr Ile
595 600
<210> 90
<211> 595
<212> PRT
<213> 东非狒狒
<400> 90
Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His
1 5 10 15
Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys
20 25 30
Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Val Asp Ser Ser Lys
35 40 45
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50 55 60
Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr
65 70 75 80
Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly
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115 120 125
Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala
130 135 140
Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly
145 150 155 160
Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met
165 170 175
Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe
195 200 205
Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr
210 215 220
Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys
225 230 235 240
Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg
245 250 255
Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp
260 265 270
Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala
275 280 285
Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys His Ser Lys Lys Asn
290 295 300
Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
305 310 315 320
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
325 330 335
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
340 345 350
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
355 360 365
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
370 375 380
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
385 390 395 400
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
405 410 415
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
435 440 445
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
450 455 460
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
485 490 495
Leu Gln Gln Gln His Arg Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
500 505 510
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met
515 520 525
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
530 535 540
Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Pro Met
545 550 555 560
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565 570 575
His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Asp Ala Glu Gly Phe Pro
580 585 590
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595
<210> 91
<211> 866
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 91
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1 5 10 15
Ala Ser Pro Ser Pro Pro His Ile Gly Ser Pro Leu Leu Ala Arg Leu
20 25 30
Asp Ser Gly Pro Phe Gln Gly Ser Gln His Ser Asp Val Ser Ser Val
35 40 45
Val Ser Pro Ile Pro Ile Ser Leu Asp Gly Leu Leu Phe Pro Arg Ser
50 55 60
Cys Arg Gly Pro Glu Leu Pro Asp Gly Lys Thr Gly Asp Gln Gln Ser
65 70 75 80
Leu Ser Asp Val Glu Gly Ala Phe Ser Gly Val Glu Ala Thr His Arg
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115 120 125
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Gly Pro Glu Leu Pro Glu Asp Pro Arg Ser Val Pro Ala Thr Lys Gly
145 150 155 160
Leu Leu Ser Pro Leu Met Ser Arg Pro Glu Ile Lys Ala Gly Asp Ser
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Asn Ala Ala Ser Ala Ala Pro Gly Gly Val Thr Leu Val Pro Lys Glu
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Asp Ser Arg Phe Ser Ala Pro Arg Val Ser Leu Glu Gln Asp Ser Pro
275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
Leu Lys Ile Lys Glu Glu Glu Glu Gly Ala Asp Ala Ala Val Arg Ser
385 390 395 400
Pro Arg Pro Tyr Leu Ser Ala Gly Ala Ser Ser Ser Thr Phe Pro Asp
405 410 415
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420 425 430
Glu Ala Ala Val Ala Gly Gly Pro Ser Ser Ala Ala Val Ser Pro Ala
435 440 445
Ser Ser Ser Gly Ser Ala Leu Glu Cys Ile Leu Tyr Lys Ala Glu Gly
450 455 460
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865
<210> 92
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<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 92
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1 5 10 15
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<210> 93
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<212> PRT
<213> 东非狒狒
<400> 93
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930
<210> 94
<211> 899
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 94
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1 5 10 15
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Lys Asp Ile Leu Asn Glu Ala Gly Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln Gln
165 170 175
Gln Gln Gln Gln Gln His Gln Gln Gln His Gln Gln His Gln Gln Gln
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195 200 205
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Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg Arg Lys Asn Cys Pro
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Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr Leu Gly Ala
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Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu Gln Glu Glu Gly Glu
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675 680 685
Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro Gly
690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro Gln Glu Phe
770 775 780
Leu Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly
785 790 795 800
Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn Tyr Ile Lys
805 810 815
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Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser Val Gln Pro
835 840 845
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885 890 895
His Thr Gln
<210> 95
<211> 902
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 95
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Ala Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ile Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Cys Leu Gln Gln Arg Gln Glu Thr Ser Pro Arg Arg
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Gln Gln Gln Ser Ala Ser Glu Gly His Pro Glu Ser Gly Cys Leu Pro
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Glu Pro Gly Ala Ala Thr Ala Pro Gly Lys Gly Leu Pro Gln Gln Pro
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Pro Ala Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Ala Ala Pro Ser Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Gly Thr Met Gln Leu Leu Gln Gln Gln
165 170 175
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
180 185 190
Gln Gln Gln Glu Val Ile Ser Glu Gly Ser Ser Ser Val Arg Ala Arg
195 200 205
Glu Ala Thr Gly Ala Pro Ser Ser Ser Lys Asp Ser Tyr Leu Gly Gly
210 215 220
Asn Ser Thr Ile Ser Asp Ser Ala Lys Glu Leu Cys Lys Ala Val Ser
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Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His Leu Ser Pro Gly
245 250 255
Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala Glu Cys Lys Gly
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Leu Ser Leu Asp Glu Gly Pro Gly Lys Gly Thr Glu Glu Thr Ala Glu
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Tyr Ser Ser Phe Lys Gly Gly Tyr Ala Lys Gly Leu Glu Gly Glu Ser
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Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ser Glu Ala Gly Ser Ser Gly Thr Leu Glu
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Ile Pro Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Val Asp Glu Ala
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Ala Ala Tyr Gln Asn Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro Leu Ala Leu Ser
355 360 365
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370 375 380
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Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly Gly Ser Val Ala
405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Ser Gln Glu Gly Asp Phe Ser
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Ala Ser Glu Val Trp Tyr Pro Gly Gly Val Val Asn Arg Val Pro Tyr
485 490 495
Pro Ser Pro Ser Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met Glu Asn
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Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Asp Ser Thr Arg Asp His
515 520 525
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530 535 540
Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr Cys Gly
545 550 555 560
Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln Lys Tyr
565 570 575
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580 585 590
Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly Met Thr
595 600 605
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645 650 655
Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala Gly His
660 665 670
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705 710 715 720
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725 730 735
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Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val
755 760 765
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770 775 780
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900
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<211> 895
<212> PRT
<213> 阿拉伯狒狒
<400> 96
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100 105 110
Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Gly Lys Gly Leu
115 120 125
Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala Pro
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Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser Cys
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Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln Leu
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275 280 285
Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu Glu
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Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser Gly
305 310 315 320
Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala Leu
325 330 335
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340 345 350
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cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc 420
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accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1980
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ECD v.1 CAR
<400> 98
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115 120 125
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
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245 250 255
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
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Ser Ser Gly Ser Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg
275 280 285
Gln Arg Asp Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp
290 295 300
Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser
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Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser
325 330 335
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Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu
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435 440 445
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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<220>
<223> CSF2RA信号序列
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<212> DNA
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<220>
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 雌激素受体alpha配体结合结构域
<400> 109
gatagaagag gcggcagaat gctgaaacac aagcggcaga gggacgacgg ggaaggcaga 60
ggcgaagtgg gatctgccgg cgatatgaga gccgccaacc tgtggcctag ccccctgatg 120
atcaagcgga gcaagaagaa ctccctggcc ctgagcctga ccgccgacca gatggtgtct 180
gccctgctgg atgccgagcc ccccatcctg tacagcgagt acgaccccac cagacccttc 240
agcgaggcca gcatgatggg cctgctgacc aacctggccg accgggaact ggtgcacatg 300
atcaactggg ccaagcgggt gcccggcttc gtggatctga cactgcacga ccaggtgcac 360
ctgctggaat gcgcttggct ggaaatcctg atgatcggcc tcgtgtggcg gagcatggaa 420
caccctggca agctgctgtt cgcccccaac ctgctgctgg accggaacca gggcaaatgc 480
gtggaaggca tggtggaaat cttcgacatg ctgctggcca cctccagccg gttccggatg 540
atgaacctgc agggcgaaga gttcgtgtgt ctgaagtcca tcatcctgct gaatagcggc 600
gtgtacacct tcctgagcag caccctgaaa agcctggaag aaaaggacca catccaccgg 660
gtgctggaca agatcaccga caccctgatt cacctgatgg ccaaggccgg actgaccctg 720
cagcagcagc atcagagact ggctcagctg ctgctgatcc tgtcccacat ccggcacatg 780
agcaacaagc ggatggaaca tctgtacagc atgaagtgca agaacgtggt gcctctgttc 840
gatctgctgc tggaaatgct ggacgcccac aggctgcacg ccccaacatc c 891
<210> 110
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雌激素受体alpha配体结合结构域
<400> 110
Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp Asp
1 5 10 15
Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser
35 40 45
Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp
50 55 60
Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu
85 90 95
Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp
100 105 110
Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu
115 120 125
Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys
130 135 140
Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys
145 150 155 160
Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser
165 170 175
Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys
180 185 190
Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp Lys
210 215 220
Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu
225 230 235 240
Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser His
245 250 255
Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met Lys
260 265 270
Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Phe Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asp
275 280 285
Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser
290 295
<210> 111
<211> 207
<212> DNA
<213> 人
<400> 111
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207
<210> 112
<211> 44
<212> PRT
<213> 人
<400> 112
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
35 40
<210> 113
<211> 75
<212> DNA
<213> 人
<400> 113
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 60
atcacccttt actgc 75
<210> 114
<211> 25
<212> PRT
<213> 人
<400> 114
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20 25
<210> 115
<211> 123
<212> DNA
<213> 人
<400> 115
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaa 123
<210> 116
<211> 41
<212> PRT
<213> 人
<400> 116
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40
<210> 117
<211> 339
<212> DNA
<213> 人
<400> 117
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 118
<211> 113
<212> PRT
<213> 人
<400> 118
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 119
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雌激素受体配体结合结构域
<400> 119
Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His
1 5 10 15
Gln Ile Gln Gly Asn Glu Leu Glu Pro Leu Asn Arg Pro Gln Leu Lys
20 25 30
Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys
35 40 45
Pro Ala Val Tyr Asn Tyr Pro Glu Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Asn Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr
65 70 75 80
Gly Pro Gly Ser Glu Ala Ala Ala Phe Gly Ser Asn Gly Leu Gly Gly
85 90 95
Phe Pro Pro Leu Asn Ser Val Ser Pro Ser Pro Leu Met Leu Leu His
100 105 110
Pro Pro Pro Gln Leu Ser Pro Phe Leu Gln Pro His Gly Gln Gln Val
115 120 125
Pro Tyr Tyr Leu Glu Asn Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Val Arg Glu Ala
130 135 140
Gly Pro Pro Ala Phe Tyr Arg Pro Asn Ser Asp Asn Arg Arg Gln Gly
145 150 155 160
Gly Arg Glu Arg Leu Ala Ser Thr Asn Asp Lys Gly Ser Met Ala Met
165 170 175
Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala
180 185 190
Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe
195 200 205
Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr
210 215 220
Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys
225 230 235 240
Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg
245 250 255
Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp
260 265 270
Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala
275 280 285
Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn
290 295 300
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
305 310 315 320
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
325 330 335
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
340 345 350
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
355 360 365
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
370 375 380
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
385 390 395 400
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
405 410 415
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
435 440 445
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
450 455 460
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
485 490 495
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
500 505 510
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met
515 520 525
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
530 535 540
Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val
545 550 555 560
Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser
565 570 575
His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro
580 585 590
Ala Thr Val
595
Claims (231)
1.单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含：
跨膜结构域；和
激素受体配体结合结构域，
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
2.权利要求1的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
3.权利要求1的单链嵌合多肽，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
4.权利要求3的单链嵌合多肽，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
5.权利要求1-4中任一项的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
6.权利要求1-4中任一项的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
7.权利要求6的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
8.权利要求7的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
9.核酸，其包含编码权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的核苷酸序列。
10.载体，其包含权利要求9的核酸。
11.哺乳动物细胞，其包含权利要求10的载体。
12.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
13.可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求1-8中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与减少量的所述激素或所述激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致所述哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平降低。
14.权利要求13的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与增加量的所述激素或所述激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平增加。
15.权利要求12-14中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
18.权利要求12-17中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
20.权利要求18或19的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
21.权利要求12-20中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
22.权利要求12-20中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
23.单链嵌合抗原受体，其中所述单链嵌合抗原受体包含：
细胞外抗原结合结构域；
跨膜结构域；
激素受体配体结合结构域；
共刺激结构域；和
基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
24.权利要求23的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
25.权利要求24的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
26.权利要求23-25中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
27.权利要求26的单链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
28.权利要求27的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
29.权利要求28的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
30.权利要求23的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
31.权利要求23-30中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
32.权利要求23-31中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
33.权利要求32的单链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
34.权利要求23-33中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
35.权利要求34的单链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是4-1BB或CD28。
36.权利要求23-35中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述ITAM包含来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
37.权利要求23-36中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
38.权利要求23-36中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
39.权利要求38的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
40.权利要求39的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
41.核酸，其包含编码权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的核苷酸序列。
42.载体，其包含权利要求41的核酸。
43.哺乳动物细胞，其包含权利要求42的载体。
44.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
45.改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平降低。
46.权利要求45的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致与(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平增加。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
49.权利要求48的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
50.权利要求44-49中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
51.权利要求50的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
52.权利要求50或51的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
53.权利要求44-52中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
54.权利要求44-52中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
55.权利要求54的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
56.权利要求55的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
57.多链嵌合抗原受体，其中所述多链嵌合抗原受体包含至少一个第一多肽，所述第一多肽包含：
细胞外抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
激素受体配体结合结构域；
其中：
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至500个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中同一内源性单链多肽中。
58.权利要求57的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
59.权利要求58的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
60.权利要求57-59中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
61.权利要求60的多链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
62.权利要求61的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
63.权利要求62的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
64.权利要求57的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
65.权利要求57-64中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
66.权利要求57-65中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
67.权利要求66的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
68.权利要求57-67中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域彼此直接邻接。
69.权利要求57-67中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至500个氨基酸分隔。
70.权利要求69的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至250个氨基酸分隔。
71.权利要求70的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和所述激素受体配体结合结构域由1至50个氨基酸分隔。
72.权利要求57-71中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述至少一个多肽进一步包含共刺激结构域。
73.权利要求72的多链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
74.权利要求33的多链嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是4-1BB或CD28。
75.诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
使表达权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
76.改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平降低。
77.权利要求76的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平增加。
78.权利要求75-77中任一项的方法，其进一步包括：
将编码所述单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
79.权利要求78的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
80.权利要求79的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
81.权利要求75-80中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
82.权利要求81的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
83.权利要求81或82的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
84.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
85.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
86.权利要求85的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
87.权利要求86的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
88.治疗受试者中癌症的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用表达权利要求23-40中任一项的单链嵌合抗原受体或权利要求57-74中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中所述抗原结合结构域与所述受试者中癌症表达的抗原特异性结合；
(b)向所述受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导所述单链或多链嵌合抗原受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；
(c)确定(b)之后的所述受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；
(d)将所述确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，所述确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和
(e)向所述受试者施用一定量的所述激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低所述细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的所述受试者中所述与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。
89.权利要求88的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少25％。
90.权利要求89的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少50％。
91.权利要求90的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少75％。
92.权利要求91的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少100％。
93.权利要求88的方法，其中所述与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。
94.权利要求88的方法，其中所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。
95.单链嵌合多肽，其中所述单链嵌合多肽包含：
细胞外激素受体配体结合结构域；和
跨膜结构域，
其中：
所述激素受体配体结合结构域和所述细胞外跨膜结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。
96.权利要求95的单链嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
97.权利要求95的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
98.权利要求97的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
99.权利要求98的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。
100.权利要求99的单链嵌合多肽，其中所述人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
101.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域彼此直接邻接。
102.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至700个氨基酸分隔。
103.权利要求102的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至500个氨基酸分隔。
104.权利要求103的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至250个氨基酸分隔。
105.权利要求104的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至100个氨基酸分隔。
106.权利要求105的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至50个氨基酸分隔。
107.权利要求106的单链嵌合多肽，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至25个氨基酸分隔。
108.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
109.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
110.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
111.权利要求95-100中任一项的单链嵌合多肽，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
112.核酸，其包含编码权利要求95-111中任一项的单链嵌合多肽的核苷酸序列。
113.载体，其包含权利要求112的核酸。
114.哺乳动物细胞，其包含权利要求113的载体。
115.权利要求114的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
116.权利要求115的哺乳动物细胞，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
117.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求95-111中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
118.可逆地改变哺乳动物细胞中单链嵌合多肽的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求95-111中任一项的单链嵌合多肽的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合多肽定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与减少量的所述激素或所述激素类似物接触，所述减少量的激素或激素类似物导致所述哺乳动物细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平降低。
119.权利要求118的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与增加量的所述激素或所述激素类似物接触，所述增加量的激素或激素类似物导致与步骤(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合多肽的水平增加。
120.权利要求117-119中任一项的方法，其在步骤(a)之前进一步包括：
将编码所述单链嵌合多肽的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合多肽的哺乳动物细胞。
121.权利要求117-120中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
122.权利要求121的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
123.权利要求117-122中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
124.权利要求123的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
125.权利要求123或124的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
126.权利要求117-125中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
127.权利要求117-125中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
128.单链嵌合抗原受体，其中所述单链嵌合抗原受体包含：
细胞外抗原结合结构域；
细胞外激素受体配体结合结构域；
跨膜结构域；
细胞内共刺激结构域；和
细胞内基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)；
其中：
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。
129.权利要求128的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
130.权利要求129的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
131.权利要求128-130中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
132.权利要求131的单链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
133.权利要求132的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
134.权利要求133的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
135.权利要求128的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
136.权利要求135的单链嵌合抗原受体，其中所述两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。
137.权利要求136的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
138.权利要求137的单链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
139.权利要求128-138中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
140.权利要求128-139中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
141.权利要求140的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
142.权利要求141的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。
143.权利要求142的单链嵌合抗原受体，其中所述人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
144.权利要求128-143中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
145.权利要求144的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞内共刺激结构域是来自4-1BB或CD28的细胞质共刺激结构域。
146.权利要求128-145中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞内ITAM包含来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
147.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域彼此直接邻接。
148.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至700个氨基酸分隔。
149.权利要求148的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至500个氨基酸分隔。
150.权利要求149的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至250个氨基酸分隔。
151.权利要求150的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至100个氨基酸分隔。
152.权利要求151的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至50个氨基酸分隔。
153.权利要求152的单链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至25个氨基酸分隔。
154.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合抗原受体包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述跨膜结构域、所述细胞内共刺激结构域和所述ITAM。
155.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合抗原受体包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述跨膜结构域、所述细胞内共刺激结构域和所述ITAM。
156.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述单链嵌合抗原受体包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域、所述跨膜结构域、所述细胞内共刺激结构域和所述ITAM。
157.权利要求128-146中任一项的单链嵌合抗原受体，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述单链嵌合多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域、所述跨膜结构域、所述细胞内共刺激结构域和所述ITAM。
158.核酸，其包含编码权利要求128-157中任一项的单链嵌合抗原受体的核苷酸序列。
159.载体，其包含权利要求158的核酸。
160.哺乳动物细胞，其包含权利要求159的载体。
161.权利要求160的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
162.权利要求161的哺乳动物细胞，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
163.诱导哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求128-157中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
164.改变哺乳动物细胞中单链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求128-157中任一项的单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述单链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平降低。
165.权利要求164的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，其导致与(b)中的水平相比，所述细胞的质膜的细胞外侧的所述单链嵌合抗原受体的水平增加。
166.权利要求163-165中任一项的方法，其在步骤(a)之前进一步包括：
将编码所述单链嵌合抗原受体的核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述单链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
167.权利要求166的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
168.权利要求167的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
169.权利要求163-168中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
170.权利要求169的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
171.权利要求169或170的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
172.权利要求163-171中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
173.权利要求163-171中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
174.权利要求173的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
175.权利要求174的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
176.多链嵌合抗原受体，其中所述多链嵌合抗原受体包含至少一个第一多肽，所述第一多肽包含：
细胞外抗原结合结构域；
细胞外激素受体配体结合结构域；和
跨膜结构域；
其中：
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域彼此直接邻接或者由1至700个氨基酸分隔；和
所述跨膜结构域和所述细胞外激素受体配体结合结构域两者不存在于哺乳动物中单个内源性单链多肽中。
177.权利要求176的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域选自下组：scFv、(scFv)2、VHH结构域和VNAR结构域。
178.权利要求177的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。
179.权利要求176-178中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与单一抗原特异性结合。
180.权利要求179的多链嵌合抗原受体，其中所述单一抗原是肿瘤抗原。
181.权利要求180的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
182.权利要求181的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
183.权利要求179的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外抗原结合结构域与两种不同的抗原特异性结合。
184.权利要求183的多链嵌合抗原受体，其中所述两种不同的抗原的至少一种是肿瘤抗原。
185.权利要求184的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原选自下组：CD19、WT-1、CD22、L1-CAM、ROR-1、CD30、CD125、AFP、CEA、ETA、MAGE和MUC16。
186.权利要求185的多链嵌合抗原受体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
187.权利要求176-186中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域是来自以下的跨膜结构域：T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的ζ链、CD28、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD33、CD37、CD64、CD80、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD86、CD134、CD137或CD154。
188.权利要求176-187中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体、孕酮受体或雄激素受体的配体结合结构域。
189.权利要求188的多链嵌合抗原受体，其中所述激素受体配体结合结构域是来自雌激素受体的配体结合结构域。
190.权利要求189的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域是来自人雌激素受体的配体结合结构域。
191.权利要求190的多链嵌合抗原受体，其中所述人雌激素受体的配体结合结构域具有野生型序列，除了其包含氨基酸位置521处的取代和氨基酸位置537处的取代之一或两者，每个相对于人激素受体的全长野生型序列进行编号。
192.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域彼此直接邻接。
193.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至700个氨基酸分隔。
194.权利要求193的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至500个氨基酸分隔。
195.权利要求194的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至250个氨基酸分隔。
196.权利要求195的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至100个氨基酸分隔。
197.权利要求196的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至50个氨基酸分隔。
198.权利要求197的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域由1至25个氨基酸分隔。
199.权利要求176-198中任一项的多链嵌合抗原受体，其中所述至少一个多肽进一步包含细胞内共刺激结构域。
200.权利要求199的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞内共刺激结构域是来自以下的细胞质共刺激结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C和B7-H3。
201.权利要求200的多链嵌合抗原受体，其中所述细胞内共刺激结构域是来自4-1BB或CD28的细胞质共刺激结构域。
202.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述至少一个第一多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
203.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述至少一个第一多肽包含所述细胞外抗原结合结构域、所述细胞外激素受体配体结合结构域和所述跨膜结构域。
204.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中，当以N末端至C末端方向移动时，所述至少一个第一多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
205.权利要求176-191中任一项的多链嵌合抗原受体，其中，当以C末端至N末端方向移动时，所述至少一个第一多肽包含所述细胞外激素受体配体结合结构域、所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域。
206.核酸，其编码权利要求176-205中任一项的多链嵌合受体。
207.一组核酸，其一起编码权利要求176-205中任一项的多链嵌合受体。
208.哺乳动物细胞，其包含权利要求206的核酸。
209.哺乳动物细胞，其包含权利要求207的核酸的组。
210.权利要求208或209的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
211.权利要求210的哺乳动物细胞，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
212.诱导哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求176-205中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧。
213.改变哺乳动物细胞中多链嵌合抗原受体的质膜定位的方法，所述方法包括：
(a)使表达权利要求176-205中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞与一定量的激素或激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量足以诱导所述多链嵌合抗原结合受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；和
(b)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平降低。
214.权利要求213的方法，其进一步包括：
(c)使所述哺乳动物细胞与一定量的所述激素或所述激素类似物接触，所述激素或激素类似物的量导致所述细胞的质膜的细胞外侧的所述多链嵌合抗原结合受体的水平增加。
215.权利要求212-214中任一项的方法，其在步骤(a)之前进一步包括：
将编码所述多链嵌合抗原受体的核酸或一起编码所述多链嵌合受体的一组核酸引入到哺乳动物细胞中以生成表达所述多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞。
216.权利要求215的方法，其中所述哺乳动物细胞是T细胞。
217.权利要求216的方法，其中所述T细胞选自下组：CD8+T细胞、CD4+T细胞、记忆T细胞、Treg细胞和自然杀伤T细胞。
218.权利要求212-217中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞是先前从受试者获得的哺乳动物细胞。
219.权利要求218的方法，其中所述受试者已鉴定或诊断为患有癌症。
220.权利要求218或219的方法，其进一步包括：
从所述受试者获得所述哺乳动物细胞。
221.权利要求212-220中任一项的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
222.权利要求212-220中任一项的方法，其中所述接触步骤在哺乳动物中进行。
223.权利要求222的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
224.权利要求223的方法，其中所述接触步骤导致所述哺乳动物中所述癌症的治疗。
225.治疗受试者中癌症的方法，其包括：
(a)向所述受试者施用表达权利要求128-157中任一项的单链嵌合抗原受体或权利要求176-205中任一项的多链嵌合抗原受体的哺乳动物细胞，其中所述抗原结合结构域与所述受试者中癌症表达的抗原特异性结合；
(b)向所述受试者施用一定量的激素或激素，所述激素或激素的量足以诱导所述单链或多链嵌合抗原受体定位于所述细胞的质膜的细胞外侧；
(c)确定(b)之后的所述受试者中与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性，与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者；
(d)将所述确定的与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者所述确定的与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者与对照比较；和
(e)向所述受试者施用一定量的所述激素或激素类似物，所述激素或激素类似物的量足以降低所述细胞的质膜的细胞外侧的单链或多链嵌合抗原受体的水平，使得(e)之后的所述受试者中所述与毒性相关的一种或多种症状的存在或严重性或者所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子的水平，或两者降低。
226.权利要求225的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少25％。
227.权利要求226的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少50％。
228.权利要求227的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少至少75％。
229.权利要求228的方法，其中与步骤(b)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的水平相比，步骤(e)中施用于所述受试者的所述激素或激素类似物的量减少100％。
230.权利要求225的方法，其中所述与毒性相关的一种或多种症状选自下组：高烧、肿胀、发冷、低血压、心动过速、无力、头痛、皮疹、喉咙发痒、呼吸困难、发红、极度疲乏、恶心和脑水肿。
231.权利要求225的方法，其中所述与细胞因子风暴相关的一种或多种细胞因子选自下组：包括肿瘤坏死因子alpha、IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5。
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