CN114641308A - B细胞靶向的平行CAR(pCAR)治疗剂 - Google Patents
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Abstract
本文提供了一种表达B细胞靶向的pCAR的免疫应答细胞，pCAR包括第二代嵌合抗原受体(CAR)和嵌合共刺激受体(CCR)。本文还提供了制备该免疫应答细胞的方法和用该免疫应答性细胞引导T细胞介导的免疫应答的方法。
Description
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)，有时被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体(cTCR)或嵌合免疫受体，是目前本领域中众所周知的工程受体。它们主要用于改造免疫效应细胞，特别是T细胞，以使这些细胞具有所需的工程特异性。在癌症治疗领域，使用CAR-T细胞的适应性细胞疗法尤其被聚焦研究。在这些疗法中，从患者身上取出T细胞，并对其进行改造，使其表达特异性识别特定癌症形式中发现的抗原的CAR。然后将能识别并杀死癌细胞的这些CAR-T细胞重新导回病人体内。
第一代CAR提供TCR样的信号，最常见的是使用CD3 zeta(z)胞内信号域，从而引发杀伤肿瘤的功能。然而，如果缺乏伴随的共刺激信号，CD3z链融合受体的参与可能不足以引起大量IL-2的分泌和/或T细胞增殖。在生理性T细胞反应中，最佳的淋巴细胞激活需要一个或多个共刺激受体如CD28或4-1BB的参与。
第二代CAR已被构建为除了抗原依赖的TCR样信号外，还可在人类原代T细胞中转导功能性抗原依赖的共刺激信号，这样除了允许T细胞增殖，还可保障杀瘤活性。第二代CAR最常见的是利用来自CD28或4-1BB的共刺激域(亦称共刺激信号区)提供共刺激。共刺激加上CD3 zeta信号的联合传递使第二代CAR在功能上明显优于第一代的同类产品(仅有CD3z信号)。第二代CAR的一个示例可参见美国专利号7,446,190，在此通过引用并入本文。
最近，所谓的第三代CAR已被制备。它们将多个共刺激域(亦称共刺激信号区)和顺式的TCR样信号域相结合，如CD28+4-1BB+CD3z或CD28+OX40+CD3z，以进一步增强效力。在所述第三代CAR中，这些共刺激结构域在CAR内域(endodomain)中串联排列，且通常位于CD3z或其等同物的上游。
然而总的来说，这些第三代CAR取得的结果令人失望，与第二代的构型相比仅略有改善，一些第三代CAR甚至不如于第二代构型。
我们最近描述了一种新的形式，其中免疫应答细胞如T细胞被工程化以平行表达两种构建体，即第二代CAR和嵌合共刺激受体(co-istimulatory receptor，CCR)。所述第二代CAR从C端到N端(从细胞内到细胞外)，包括以下结构域：(a)信号区；(b)共刺激信号区；(c)跨膜结构域；和(d)与第一靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件。CCR从C端到N端(从细胞内到细胞外)包括：(a)与CAR的共刺激信号区不同的共刺激信号区；(b)跨膜结构域；和(c)与靶抗原上的表位特异性相互作用的第二结合元件。所述CAR和CCR可识别相同的表位、同一抗原上的不同表位或两种不同抗原上的表位。与所述CAR不同，所述CCR缺乏TCR样信号区，如CD3z。与第一代CAR-T细胞、第二代CAR-T细胞和第三代CAR-T细胞相比，这些平行CAR(parallel CAR，pCAR)工程化T细胞表现出卓越的活性和抗衰竭能力。见美国预授权专利，公开号2019/0002521，在此通过引用将其全文并入本文。
pCAR-T细胞的这些特性使其成为治疗难治性恶性肿瘤的有吸引力的候选者，其中第一代、第二代和第三代CAR-T细胞由于T细胞衰竭而显示出有限的疗效。然而，还需要有抗原靶点组合，使这种技术的治疗应用更加广泛。
发明简述
申请人已经发现，使用构建体的组合可以诱导有效的T细胞应答，其中多个共刺激区被安排在不同的构建体中。具体地，本文提供了具有平行CAR(parallel CAR，pCAR)构建体的有效的pCAR-T细胞，所述构建体与源自B细胞系的靶细胞上存在的一个或多个抗原结合。在一些实施方案中，所述pCAR构建体包括CAR(嵌合抗原受体)，所述CAR包含特异性结合靶细胞上发现的CD19表位的结合元件；和结合CD19或另一个B细胞系的特性标志物的CCR(chimeric costimulatory receptor，嵌合共刺激受体)。后者的示例包括但不限于CD20、CD22、CD23、CD79a和CD79b。
因此，根据一些实施方案，本文提供一种免疫应答细胞，其表达：
i.第二代嵌合抗原受体(CAR)，所述第二代抗原嵌合受体包括：
a)信号区；
b)第一共刺激信号区；
c)第一跨膜结构域；和
d)与CD19靶抗原上的表位特异性相互作用的第一结合元件；以及
ii.嵌合共刺激受体(CCR)，所述嵌合共刺激受体包括：
e)第二共刺激信号区，其中所述第二共刺激信号区不同于所述第一共刺激信号区；
f)第二跨膜结构域；和
g)与第二靶抗原上的第二表位特异性地相互作用的第二结合元件，其中所述第二靶抗原为CD19或另一个B细胞相关的靶抗原。
当表达靶向B细胞pCAR构建体的T细胞结合表达一种或多种抗原(其具有两种表位靶点(对于CAR和CCR))的细胞时，CAR和CCR均发出刺激信号以增强T细胞的应答。
本发明类型的构建体可称为“平行嵌合激活受体(parallel chimericactivating receptor)”或“pCAR”。申请人已发现本文所述的pCAR在体外和体内实验中均优于具有相似元件的第二代CAR-T细胞。
此外，在用表达抗原的肿瘤细胞进行多轮反复的刺激中，T细胞的增殖、其保持细胞毒性效力的能力和释放IL-2的能力得以保持。
在一些实施方案中，由pCAR的CAR组分识别的第一表位是CD19靶抗原上的表位。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63抗体的互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15所示序列。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63抗体的可变重域(VH；GenBank登录号CAA74659.1)和可变轻域(VL；GenBank登录号CAA74660.1)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:16和17所示序列。在一些实施方案中，所述第一结合元件包括FMC63单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段(scFv)包括FMC63抗体的可变重域(VH)和可变轻域(VL)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:18或19所示序列。在一些实施方案中，FMC63 scFv表达自SEQ ID NO:118所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。
在一些优选的实施方案中，所述第一结合元件包括所述FMC63抗体或scFv的变体，所述变体在VH结构域的CDR3中引入了单一的G->A或Y->A突变，以具有SEQ ID NO:20、21、22、23、24、25和26所示序列的修饰的VH CDR3。在一些优选的实施方案中，所述突变的FMC63scFv表达自SEQ ID NO:119、120、121、122、123、124或125所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。
在一些实施方案中，由pCAR的嵌合共刺激受体(CCR)组分识别的第二表位也是CD19靶抗原上的表位。在一些实施方案中，第二结合元件包括FMC63抗体的互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有SEQ ID NO:10、11、12、13、14和15所示序列。在一些实施方案中，所述第二结合元件包括FMC63抗体的可变重域(VH)和可变轻域(VL)，并具有SEQ ID NO：16和17所示序列。在一些优选的实施方案中，所述第二结合元件包括FMC63抗体或scFv，所述FMC63抗体或scFv包括FMC63抗体的可变重域(VH)和可变轻域(VL)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:18或19所示序列。在一些优选的实施方案中，所述FMC63 scFv表达自SEQ ID NO:118所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。
在一些实施方案中，CAR和CCR结合CD19抗原内的相同表位。在一些优选的实施方案中，pCAR分别被命名为FBB/G01、FBB/G02、FBB/Y01、FBB/Y02、FBB/Y03、FBB/Y04和FBB/Y05，并具有SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52或53所示序列。命名法源于以下元件的缩写：CCR结合子(FMC63 scFv)，CCR信号域(4-1BB)/CAR结合子(分别为G01-Y05突变的scFv)。在一些实施方案中，FBB/G01、FBB/G02、FBB/Y01、FBB/Y02、FBB/Y03、FBB/Y04和FBB/Y05的所述CAR分别包括SEQ ID NO:56、58、59、60、61、62和63所示序列，且所述CCR包括SEQ ID NO:57所示序列。在一些优选的实施方案中，这些pCAR分别表达自SEQ ID NO:109、110、111、112、113、114或115所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。在一些实施方案中，pCAR是与SEQ IDNO:47、48、49、50、51、52或53所示序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述pCAR是与SEQ ID NO:47、48、49、50、51、52或53所示序列具有至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述CAR和CCR与CD19抗原内的不同表位结合。
在一些实施方案中，所述CAR与CD19结合，而所述CCR结合不同的B细胞系抗原，如CD20、CD22、CD23、CD79a或CD79b。
在一些实施方案中，所述CAR与CD19结合，而所述CCR与CD20结合。在一些优选的实施方案中，引导CCR特异性的所述第二结合元件包括1F5抗体的互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有SEQ ID NO:27、28、29、30、31和32所示序列。在一些优选的实施方案中，所述第二结合元件包括1F5抗体的可变重域(VH；GenBank登录号AAL27650.1)和可变轻域(VL；GenBank登录号AAL27649.1)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:33和34所示序列。在一些优选的实施方案中，所述第二结合元件包括1F5 scFv，所述1F5 scFv包括1F5抗体的可变重域(VH)和可变轻域(VL)，并具有SEQ ID NO:35或36所示序列。在一些优选的实施方案中，1F5 scFv表达自SEQ ID NO:126所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。在一些优选的实施方案中，所述pCAR被命名为1BB/F，并具有SEQ ID NO:54所示序列。命名法源于以下元件的缩写：CCR结合子(1F5 scFv)，CCR信号域(4-1BB)/CAR结合子(FMC63 scFv)。在一些实施方案中，1BB/F的所述CAR包括SEQ ID NO:64所示序列，且1BB/F的所述CCR包括SEQ ID NO:65所示序列。在一些优选的实施方案中，所述1BB/F的pCAR表达自SEQ ID NO:116所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。在一些实施方案中，所述pCAR为具有与SEQ ID NO:54所示序列至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述pCAR为具有与SEQ ID NO:54所示序列至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述CAR与CD19结合，而所述CCR与CD22结合。在一些优选的实施方案中，引导CCR特异性的所述第二结合元件包括RFB4抗体的互补决定区(CDR)，所述互补决定区具有SEQ ID NO:37、38、39、40、41和42所示序列。在一些优选的实施方案中，所述第二结合元件包括RFB4抗体的可变重域(VH；GenBank登录号CAJ09937.1)和可变轻域(VL；GenBank登录号CAJ09936.1)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:43和44所示序列。在一些优选的实施方案中，所述第二结合元件包括RFB4 scFv，所述RFB4 scFv包括RFB4抗体的可变重域(VH)和可变轻域(VL)，所述可变重域和可变轻域具有SEQ ID NO:45或46所示序列。在一些优选的实施方案中，所述RFB4 scFv表达自SEQ ID NO:127所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。在一些优选的实施方案中，所述pCAR被命名为RBB/F，并具有SEQ ID NO:55所示序列。命名法源于以下元件的缩写：CCR结合子(RFB4 scFv)，CCR信号域(4-1BB)/CAR结合子(FMC63 scFv)。在一些实施方案中，1BB/F的所述CAR包括SEQ ID NO:64所示序列，且1BB/F的所述CCR包括SEQ ID NO:66所示序列。在一些优选的实施方案中，所述RBB/F的pCAR表达自SEQ ID NO:117所示序列的多核苷酸或多核苷酸组。在一些实施方案中，所述pCAR为与SEQ ID NO:55所示序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述pCAR为具有与SEQ ID NO:55所示序列至少约85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述免疫应答细胞为αβT细胞、γδT细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述T细胞为αβT细胞。在一些实施方案中，所述T细胞为γδT细胞。
在一些实施方案中，所述多核苷酸或多核苷酸组包括：(a)第一核酸，所述第一核酸编码与B细胞系抗原结合的CCR；(b)第二核酸，所述第二核酸编码与CD19结合的CAR。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸在单一载体中。在一些实施方案中，所述第一核酸和所述第二核酸在两个分开的载体中。
在一方面，本发明提供了一种制备所述免疫应答细胞的方法，所述方法包括将本文提供的多核苷酸或多核苷酸组转染或转导至免疫应答细胞中。
在另一个方面，本公开提供了一种在有需要的患者中引导T细胞介导的免疫应答至靶细胞的方法，所述方法包括向患者施用所述免疫应答细胞，其中所述靶细胞为B细胞。
在又一个方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的所述免疫应答细胞。在一些实施方案中，所示患者的癌症表达CD19。在一些实施方案中，所述患者患有产生于B细胞系的癌症。在一些实施方案中，所述患者患有选自由急性或慢性B细胞白血病或B细胞淋巴瘤组成的组中的癌症。
在另一个方面，本公开提供了所述免疫应答细胞在用于治疗或作为药物的应用。本公开进一步提供了免疫应答细胞在制备治疗病理性失调的药物中的应用。在一些实施方案中，所述病理性失调为癌症。
附图说明
附图不一定是按比例绘制的，重点放在说明本发明的各种实施方案的原理上。
图1A和1B-恶性B细胞系的流式细胞分析
图1A显示了CD19和CD20在一组人类淋巴瘤和白血病细胞系(Daudi、Nalm-6和Raji)上的表达情况。根据已发表的数据，该分析证实了在这些肿瘤细胞表面检测到的CD19水平很高，且在Raji和Daudi细胞系上均可检测到CD20。Nalm-6细胞系未检测到CD20的表达。
为了实现细胞和衍生异种移植物的生物发光和荧光成像，用编码萤火虫荧光素酶和红色荧光蛋白(RFP)、串联二聚体(td)Tomato的LT逆转录病毒载体转导肿瘤细胞系。如图1B所示，使用流式细胞仪确认了RFP的表达。
图2-CAR和pCAR的设计和构建
图2A-2E提供了示意图，显示了本文实验中使用的某些第二代CAR和pCAR构建体的显著特征。细胞膜以平行的水平线表示，细胞外结构域在膜的上方绘出，而细胞内结构域在膜的下方显示F-2为第二代CAR，与Kochenderfer等人，J.Immunother.32:689-702(2009)中描述的类似，在此通过引用将其全文并入本文。从C端到N端(细胞内到细胞外)，它包括CD3z信号区、CD28共刺激和跨膜结构域、包含嵌入的myc表位标签的CD28铰链/间隔结构域和靶向人类CD19的FMC63单链抗体(scFv)结构域。单独用F-2转导的细胞为标准的第二代CAR-T细胞，且其目的用于比较。
FMC63 scFv中VH结构域的CDR3区使用www.abysis.org鉴定。为了产生改变结合CD19能力的变体，用丙氨酸(A)残基取代所述VH结构域的CDR3区中的第一个或第二个甘氨酸(G01，G02)，或者可选地，取代第一个、第二个、第三个、第四个或第五个酪氨酸(Y01-Y05)，如图2A和2B所示。这些修饰的CD19特异性第二代CAR分别被命名为G01、G02、Y01、Y02、Y03、Y04和Y05。
1-2为第二代CAR，其使用1F5 scFv实现靶向，如Budde等人，PLoS One 8(12):e82742(2013)中所述，并通过引用全部内容纳入本文。从C端到N端(细胞内到细胞外)，它包括CD3z信号区、CD28共刺激和跨膜结构域、包含嵌入的myc表位标签的CD28铰链/间隔结构域和靶向人类CD20的1F5单链抗体(scFv)结构域。单独用1-2转导的细胞为标准的第二代CAR-T细胞，且其目的用于比较。
R-2为第二代CAR，其使用RFB4 scFv实现靶向，如James等人，J.Immunol.180(10):7028-38(2008)中所述，并通过引用全部内容并入本文。从C端到N端(细胞内到细胞外)，它包括CD3z信号区、CD28共刺激和跨膜结构域，包含嵌入的myc表位标签的CD28铰链/间隔结构域和靶向人类CD22的RFB4单链抗体(scFv)结构域。单独用R-2转导的细胞为标准的第二代CAR-T细胞，且其目的用于比较。
一系列B细胞靶向的pCAR(图2C、2D和2E)已通过使用上述结合分子的组合进行了工程化。命名法源于以下元件的依次缩写：CCR结合子，CCR信号域/CAR结合子。例如，1BB/F为pCAR，其中通过1F5 scFv靶向的且含有4-1BB内域的CCR与FMC63 scFv靶向的含CD28的第二代CAR共表达。FBB/Y01为pCAR，其中FMC63 scFv靶向的CCR与通过FMC63(Y01)scFv靶向的含CD28的第二代CAR共表达。类似地，FCr/Y05为对照pCAR，其中具有截短的信号域的FMC63scFv靶向的CCR与通过FMC63(Y05)scFv靶向的含CD28的第二代CAR共表达。图2C、2D和2E显示了B细胞靶向pCAR和截短对照的通用结构。图2F提供了CD19-CD22双靶向pCAR RBB/F、RBB/Y05和RBB/G02，以及分别靶向CD19和CD22的第二代CAR F-2和R-2的示意图。RBB/F为具有RBB CCR(CD22特异性RFB4 scFv通过CD8α间隔和跨膜结构域与4-1BB信号域融合)和CD19特异性含CD28的第二代CAR(F)的pCAR。RBB/Y05为pCAR，其中RFB4 scFv靶向的CCR与通过FMC63(Y05)scFv靶向的含CD28的第二代CAR共表达。RBB/G02为pCAR，其中RFB4 scFv靶向的CCR与通过FMC63(G02)scFv靶向的含CD28的第二代CAR共表达。
图3-CD19特异性CAR在人T细胞中的表达
图3A-3B显示了两个代表性示例，其中含有突变的FMC63 scFv的CD19特异性第二代CAR在人CAR T细胞中表达。使用9e10抗体检测细胞表面表达，所述9e10抗体与插入CAR的CD28间隔域的myc表位标签(EQKLISEEDL)结合。F-2第二代CAR作为对照表达。
图4-CD19特异性pCAR在人T细胞中的表达
图4A和4B显示了CD19特异性pCAR在人T细胞中表达的代表性示例。在所有CD19特异性的pCAR中，FBB CCR(CD19特异性的FMC63 scFv通过CD8间隔和跨膜结构域与4-1BB信号结构域融合)与CD19特异性含CD28的第二代CAR共表达，其中FMC63 VH链包含所示的CDR3突变。F-2第二代CAR在此作为对照表达。如上所述(图4A)，使用与myc表位标签(EQKLISEEDL)结合的9e10抗体检测CAR或pCAR的CAR组分的表达。使用FLAG表位标签(DYKDDDDK)特异性抗体细胞内染色检测pCAR的CCR组分的表达(图4B)。
图5-共靶向CD19和CD20的pCAR在人T细胞中的表达
图5显示了1BB/F pCAR在人T细胞中表达的代表性示例。在1BB/F中，1BB CCR(CD20特异性1F5 scFv通过CD8α间隔和跨膜结构域与4-1BB信号结构域融合)与CD19特异性含CD28的第二代CAR(F)共表达。在1Tr/F中，具有截短信号域的1BB CCR与CD19特异性含CD28的第二代CAR(F)共表达。1-2为结合CD20的含CD28的第二代CAR对照。F-2和1-2在此处均作为对照表达。如上所述，使用9e10抗体检测CAR或pCAR的CAR组分的表达。
图6-共靶向CD19和CD22的pCAR在人T细胞中的表达
图6显示了RBB/F pCAR在人T细胞中表达的代表性示例。在RBB/F中，RBB CCR(CD22特异性RFB4 scFv通过CD8α间隔和跨膜结构域与4-1BB信号结构域融合)与CD19特异性含CD28的第二代CAR(F)共表达。R-2为结合CD22的含CD28的第二代CAR对照。F-2和R-2均作为对照表达。如上所述，使用9e10 MYC表位标签特异性抗体检测CAR或pCAR的CAR组分的表达。使用FLAG表位标签特异性抗体细胞内染色检测pCAR的CCR组分的表达。
图7-CD19与亲本和CDR3 VH突变的基于FMC63的第二代CAR的结合
图7A-7D显示了代表性实验的结果，其中表达F-2、G01、G02、Y01、Y02、Y03、Y04或Y05第二代CAR的T细胞与两种浓度的可溶性CD19-Fc融合蛋白—0.5μg(图7A、图7C(右))和1.0μg(图7B、图7C(左))进行孵育。与Alexa-fluor 488偶联的抗人IgG孵育后用流式细胞仪测量结合情况。图3A显示了在每种情况下转导T细胞的百分比。在图7C中以柱状图的形式显示了用流式细胞仪测量的T细胞与CD19-Fc的结合情况，并以与CD19-Fc孵育后的结合百分比和平均荧光强度(MFI)量化(分别为图7D的左图和右图)。请注意，与F-2相比，突变CAR的结合效率范围从低(如G01，G02)到中等(如Y04)到提高(如Y05)。
图8-F-2和突变体衍生的第二代CAR T细胞的肿瘤细胞杀伤的滴定
图8A-8D显示了三个实验，比较了F-2和突变体衍生的第二代CAR T细胞对表达CD19的恶性B细胞淋巴瘤细胞系Nalm-6(图8A和图8C)或Raji(图8B和图8D)的细胞毒性活性，并与未转导(UT)对照T细胞进行比较。
图9-体外细胞因子释放(24小时时)
图9A和9B显示了表明CD19特异性CAR-T细胞与Nalm-6细胞培养时释放IFN-γ(图9A)和IL-2(图9B)的汇集数据(pooled data)。图9C和9D显示了表明CD19特异性CAR-T细胞与Raji细胞培养时释放IFNγ(图9C)和IL-2(图9D)的汇集数据。与CD19特异性第二代CARF-2进行了比较。
图10-体外细胞因子释放(24小时时)
图10A和10B显示了表明CD19特异性CAR-T细胞与Nalm-6细胞(图10A)或Raji细胞(图10B)培养时释放IFN-γ的汇集数据。图10C和10D显示了表明CD19特异性CAR-T细胞与Nalm-6细胞(图10C)或Raji细胞(图10D)培养时释放IL-2的汇集数据。
图11-体外再刺激潜能
图11A显示了在通过添加Nalm-6细胞进行反复再刺激时，图3A的第二代CD19特异性CAR的肿瘤细胞杀伤活性。图11B和11C显示反复刺激的CAR T细胞产生的IFN-γ(图11B)和IL-2(图11C)。
图12-靶向抗CD19的CAR和pCAR T细胞对肿瘤细胞杀伤的滴定
图12显示了汇集的数据，其中CDR3 VH突变的基于FMC63的第二代CAR T细胞和pCAR T细胞通过Nalm-6白血病细胞进行了细胞毒性活性的滴定，与作为对照的F-2进行比较。
图13-CD19特异性pCAR T细胞的体外再刺激潜能
图13A显示了与表达CD19的LO68肿瘤细胞共培养进行重复再刺激时，CD19特异性pCAR T细胞的肿瘤细胞杀伤活性。图13B和13C分别显示反复刺激CAR-T和pCAR-T细胞时IFN-γ和IL-2的产生。
图14-CD19特异性CAR和pCAR T细胞的体内抗肿瘤活性(NSG小鼠)
图14A和14B显示了在NSG小鼠中，CD19特异性CAR或pCAR-T细胞对已建立的荧光素酶表达的Nalm-6白血病异种移植处理的评估结果。图14A显示接受CD19特异性CAR或pCAR-T细胞处理的小鼠的总发光通量，图14B显示了处理前后小鼠体重变化的百分比。
图15-共靶向CD19和CD20的pCAR T细胞的体外再刺激潜能和细胞毒性
图15A显示了转导的共靶向CD19(CAR)和CD20(CCR)的1BB/F pCAR T细胞与共表达CD19和CD20的LO68肿瘤细胞共培养后完成的再刺激周期数。每隔72小时，T细胞被转移到新鲜的单层LO68细胞上。图15B显示了1BB/F pCAR T细胞与LO68肿瘤细胞共培养的肿瘤细胞杀伤活性的汇集数据。图15C显示了每个刺激周期后释放的IFN-γ(左图)和IL-2(右图)的量。图15D显示了汇集实验，其中CAR和pCAR T细胞的细胞毒性活性用共表达CD19和CD20的LO68肿瘤细胞来滴定。图15E-15F显示了在效应子与靶标比例为1:1和1:4时，共培养24小时后释放的IFN-γ(图15E)和IL-2(图15F)的量。
图16-共靶向抗CD19和CD22的pCAR T细胞对肿瘤细胞杀伤的滴定
图16A-16B显示了共靶向CD19(CAR)和CD22(CCR)的RBB/F、RBB/G02和RBB/Y05pCAR T细胞对Nalm-6白血病细胞的细胞毒性活性。分别与第二代CD19和CD22靶向的第二代CAR，F-2和R-2进行比较。
图17-CD19特异性CAR-T细胞的结合亲和力
图17A-17D显示了在z-Movi微流控芯片中，CD19特异性CAR-T细胞与CD19+LO68肿瘤细胞的结合亲和力。T细胞被工程化表达CD19特异性F-2CAR或含有VH CDR3区突变的衍生物。在流式分选至纯度后，在z-Movi微流控芯片中，CAR T细胞在单层CD19+LO68肿瘤细胞上进行孵育。施加增强的流体力，以测定结合的T细胞百分比(中位数，n＝3)(图17A)。图17B显示了在应用最小的力来分离平均90％未转导的T细胞后，结合的T细胞的总平均百分比。图17C是一个柱状图，表示与未转导的T细胞相比，将T细胞从单层CD19+LO68肿瘤细胞中分离出来所需的亲合力(avidity)分数或平均rForce(黑色虚线代表未转导的T细胞的亲合力分数；红色虚线代表F-2CAR T细胞的亲合力分数)。图17D中的点状图显示了每个细胞从单层肿瘤细胞分离所需的rForce，其中每个点代表单个细胞。
图18-CD19特异性CAR或pCAR的表达
图18A-18B显示了通过流式细胞仪分析的CD19特异性CAR或pCAR在人T细胞中的表达。对人T细胞进行工程化，通过逆转录病毒转导来表达所示的CAR或pCAR。将T细胞与引导针对MYC(CAR)和FLAG(CCR)表位标签的抗体进行孵育，然后用流式细胞仪进行分析。数据代表三个独立重复实验(图18B)或多于七个独立重复实验(图18A)。
图19-体内抗肿瘤活性测试的实验设计(NSG小鼠)
图19显示了在体内测试工程化的CD19特异性CAR-T或pCAR-T细胞的实验设计。将RFP/ffLuc+Nalm6细胞(5x105个细胞)静脉注射到NSG小鼠体内。通过BLI将小鼠分为疾病负担相同的组。在第5天，静脉注射5x105个所示的CAR或pCAR T细胞。从第8天起通过BLI监测疾病负担。
图20A和20B-CD19特异性CAR-T或pCAR-T细胞的体内抗肿瘤活性
图20A和20B显示了CD19特异性CAR-T或pCAR-T细胞在NSG小鼠中的抗肿瘤活性，该小鼠携带已建立的荧光素酶表达的Nalm6白血病异种移植物。图20A显示了用所示的CD19特异性CAR-T或pCAR-T细胞处理的小鼠的总发光通量(如白血病负担)。图20B显示了选定的pCAR与其相应的在VH CDR3区有突变的2G CAR的p值，以及2G CAR F-2与所示的在VH CDR3区有突变的2G CAR的p值。
图21A、21B、21C和21D-用CD19特异性CAR-T或pCAR-T细胞处理的NSG小鼠的存活率
图21A、21B、21C和21D显示了PBS、CD19特异性CAR-T细胞CD19特异性pCAR-T细胞处理组的存活曲线。图21A显示了PBS、F-2CAR-T细胞、Y04 CAR-T细胞和FBB/Y04 pCAR-T细胞处理组的存活曲线。图21B显示了PBS、F-2CAR-T细胞、Y05 CAR-T细胞和FBB/Y05 pCAR-T细胞处理组的存活曲线。图21C显示了PBS、F-2CAR-T细胞、G02 CAR-T细胞和FBB/G02 pCAR-T细胞治疗组的存活曲线。图21D显示了图21A-21C所示各处理组的中位存活率。
发明详述
本发明的各种实施方案的细节在下面的描述中列出。根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将变得显而易见。
1、定义
除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义。如本文所使用的，以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，术语"变体(variant)"是指天然产生的基础序列的多态形式以及合成变体多肽序列，其中链内插入、移除或替换一个或多个氨基酸。然而，该变体产生的生物学效应与基础序列相似。例如，人CD3 zeta链的胞内结构域的变体将以类似于人CD3 zeta链的胞内结构域的方式发挥作用。氨基酸替换可被视为“保守的”，即一个氨基酸被具有大体相似性质的同一类(class)的不同氨基酸取代。非保守的替换是指用不同类型或类别(class)的氨基酸替换。
正如本领域技术人员所熟知的，通过保守取代改变肽的一级结构可能不会显著改变多肽的活性，因为插入序列中的氨基酸的侧链可能能够形成与被替换掉的氨基酸的侧链类似的键和接触。即使替换位于决定肽构象的关键区域，情况也是如此。非保守性替换也是可能的，只要这些替换不扰乱上述多肽的功能。广义上讲，可以进行较少的非保守替换而不改变多肽的生物活性。一般而言，变体将具有与基础序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)至少70％，例如至少71％、75％、79％、81％、84％、87％、90％、93％、95％、96％或98％相同的氨基酸序列。在这种情况下，可使用BLASTP计算机程序确定SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其片段的同一性，具体地是下文所述片段为基础序列。BLAST软件为公众可获得的。
如本文所用，术语“抗原”是指将与结合元件结合的特异性结合对的任何成员。该术语包括靶细胞上的受体。
如本文所使用的以及关于与靶分子的结合元件，术语“结合”、“特异性的结合”、“特异性结合”、“特异性相互作用”、“特异性的”、“选择性结合”、“选择性地相互作用”和“选择性地针对”特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位意味着明显不同于非特异性或非选择性相互作用(例如，与非靶标分子)的结合。特异性结合可以测量，例如通过测量与靶分子的结合并将其与非靶标分子的结合进行比较。特异性结合也可以通过与模拟靶分子上识别的表位的对照分子竞争来确定。
本文使用的术语“pCAR”是指平行嵌合抗原受体，所述pCAR包括第二代嵌合抗原受体(CAR)和平行的嵌合共刺激受体(CCR)的组合。pCAR已在WO2017/021701中描述，通过引用将其全文并入本文。
2、其他解释性常用语
在权利要求中，除非有相反的指示或从上下文中显而易见，诸如“一”、和“所述的”的冠词可以指一个或多个。如果同一组中的一个、多个、或者全部成员存在于、运用于或以其他方式与给定的产品或方法相关，则同一组中的一个或多个成员之间含有“或者”的权利要求或说明书是满足的，除非有相反的指示或从上下文中显而易见。本发明包括一些实施方案，其中组中的一个成员正好存在于、运用于或以其他方式与给定的产品或方法相关。本发明包括一些实施方案，其中组中的多个或全部成员存在于、运用于或以其他方式与给定的产品或方法相关。
还需要注意的是，术语“包括”旨在开放的，允许但不要求包含额外的元素或步骤。当本文使用术语“包括”时，术语“由……组成”也因此被包含和公开。
如果给出范围，则包括端点。此外，应理解的是，除非另有说明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，在本发明的不同实施方案中，表示为范围的数值可以认为是所述范围内的任何具体数值或子范围，直至所述范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
所有引用的来源，例如参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本申请中引用的技术，都通过引用并入本文，即使在引用中没有明确说明。如果所引用的来源和本申请的陈述有冲突，应以本申请的陈述为准。
章节和表格的标题不是限制性的。
3、免疫应答细胞
在第一方面，提供了免疫应答细胞。所述免疫应答细胞表达pCAR，所述pCAR包括第二代嵌合抗原受体(CAR)和并行的嵌合共刺激受体(CCR)的组合。
从C端到N端(如在免疫应答细胞内表达，从细胞内到细胞外)，所述CAR包括：(a)信号区；(b)第一共刺激信号区；(c)第一跨膜结构域；和(d)与CD19靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件。
从C端到N端(，如在免疫应答细胞内表达，从细胞内到细胞外)，所述CCR包括，(e)与CAR的第一共刺激信号区不同的第二共刺激信号区；(f)第二跨膜结构域；和(g)与第二抗原上的第二表位特异性相互作用的第二结合元件。所述第二表位可以与第一表位相同或不同。所述第二抗原可以为CD19或另一种B细胞系特异性抗原。
3.1.细胞
在代表性实施方案中，所述免疫应答细胞是T细胞。
在某些实施方案中，所述免疫应答细胞是αβT细胞。在特定的实施方案中，所述免疫应答细胞是细胞毒性αβT细胞。在特定的实施方案中，所述免疫应答细胞是αβ辅助T细胞。在特定的实施方案中，所述免疫应答细胞是调节性αβT细胞(Treg)。
在某些实施方案中，所述免疫应答细胞是γδT细胞。在特定的实施方案中，免疫应答细胞是Vδ2+γδT细胞。在特定的实施方案中，所述免疫应答细胞是Vδ2-T细胞。在特定的实施方案中，所述Vδ2-T细胞是Vδ1+细胞。
在某些实施方案中，所述免疫应答细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，所述免疫应答细胞不表达额外的外源蛋白。在其他实施方案中，所述免疫应答细胞被工程化以表达额外的外源蛋白，例如细胞因子、受体或其衍生物。
在一些实施方案中，所述免疫应答细胞从外周血单核细胞(PBMC)中获得。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞从肿瘤中获得。在特定的实施方案中，所述的从肿瘤中获得的免疫应答细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。在具体的实施方案中，所述TIL是αβT细胞。在其他具体的实施方案中，所述TIL是γδT细胞，尤其是Vδ2+或Vδ2-γδT细胞。
4、嵌合抗原受体结构
4.1.信号区
CAR构建体在其C端包括一个信号区。在一些实施方案中，该信号区包括免疫受体-酪氨酸激活基序(Immune-receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif，ITAM)，例如由Love等人，Cold Spring Harbor Perspect.Biol.2(6)1a002485(2010)所述。在一些实施方案中，所述信号区包括人类CD3 zeta链的胞内结构域(例如在美国专利号7,446,190中描述的，在此通过引入并入本文)或其变体。在特定的实施方案中，所述信号区包括涵盖全长人CD3 zeta链的52-163氨基酸残基的结构域。CD3 zeta链有许多已知的多态形式(例如，Sequence ID：gb|AAF34793.1和gb|AAA60394.1)，所有这些在此都是有用的，并分别以SEQID NO:1和2所示。
RVKFSADAPAYQQGQNQLYNELLGREYDVLDKRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRGKGHDGLESTATKDTYDALMQALPPR(SEQ ID NO:1)；
RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:2)。
CD3 zeta结构域的可选信号区包括其他含有ITAM的单元，如Fcεr1γ、CD3ε、DAP12和多ITAM。见Eshhar Z等人，“细胞毒性淋巴细胞通过嵌合单链的特异性激活和靶向，所述嵌合单链由抗体结合结构域以及免疫球蛋白和T细胞受体的γ或ζ亚单位组成”，Proc NatlAcad Sci U S A 90:720-724(1993)；Nolan等人，“旁路免疫：针对表达癌胚抗原(CEA)的肿瘤和缺乏可溶性CEA抑制的“设计T细胞”优化设计”，Clin Cancer Res 5:3928-3941(1999)；Zhao等人，“A herceptin-based chimeric antigen receptor with modifiedsignaling domains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes andantitumor activity”，J Immunol 183:5563-5574(2009)；
等人，DAP12-basedactivating chimeric antigen receptor for NK cell tumor immunotherapy，JImmunol 194:3201-3212(2015)；和James JR，“Tuning ITAM multiplicity on T cellreceptors can control potency and selectivity to ligand density”，Sci Signal11(531)eaan1088(2018)，这些公开在此通过引用将其全文并入本文。
4.2.共刺激信号区
在CAR中，所述共刺激信号区适当地位于信号区和跨膜结构域之间，并远离所述结合元件。
在CCR中，所述共刺激信号区适当地位于跨膜结构域邻近，并远离所述结合元件。
合适的共刺激信号区为本领域所熟知，包括B7/CD28家族成员的共刺激信号区，如B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA、CD28、CTLA-4、Gi24、ICOS、PD-1、PD-L2或PDCD6；或ILT/CD85家族蛋白，如LILRA3、LILRA4、LILRB1、LILRB2、LILRB3或LILRB4；或肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，如4-1BB、BAFF、BAFF R、CD27、CD30、CD40、DR3、GITR、HVEM、LIGHT、淋巴毒素-α、OX40、RELT、TACI、TL1A、TNF-α、或TNF RII；或SLAM家族的成员，如2B4、BLAME、CD2、CD2F-10、CD48、CD8、CD84、CD229、CRACC、NTB-A或SLAM；或TIM家族成员，如TIM-1、TIM-3或TIM-4；或其他共刺激分子，如CD7、CD96、CD160、CD200、CD300a、CRTAM、DAP12、Dectin-1、DPPIV、EphB6、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3或TSLP R。见Mondino A等人，“Surface proteins involved in T cell costimulation”，J LeukocBiol，55:805-815(1994)；Thompson CB；“Distinct roles for the costimulatoryligands B7-1 and B7-2 in T helper cell differentiation？”Cell.81:979-982(1995)；Somoza C和Lanier LL；“T-cell costimulation via CD28-CD80/CD86 and CD40-CD40 ligand interactions,”Res Immunol,146:171-176(1995)；Rhodes DA等人；“Regulation of immunity by butyrophilins,”Annu Rev Immunol.34:151-172(2016)；Foell J等人；“T cell costimulatory and inhibitory receptors as therapeutictargets for inducing anti-tumor immunity,”Curr Cancer Drug Targets.7:55-70(2007)；Greenwald RJ等人,Annu Rev Immunol；“The B7 family revisited,”23:515-548(2005)；Flem-Karlsen K等人；“B7-H3 in cancer–beyond immune regulation,”TrendsCancer.4:401-404(2018)；Flies DB等人；“The new B7s:playing a pivotal role intumor immunity,”J Immunother.30:251-260(2007)；Gavrieli M等人；“BTLA and HVEMcross talk regulates inhibition and costimulation,”Adv Immunol.92:157-185(2006)；Zhu Y等人；“B7-H5 costimulates human T cells via CD28H,”Nat Commun.4:2043(2013)；Omar HA等人；“Tacking molecular targets beyond PD-1/PD-L1:Novelapproaches to boost patients’response to cancer immunotherapy,”Crit Rev OncolHematol.135:21-29(2019)；Hashemi M等人；“Association of PDCD6 polymorphismswith the risk of cancer:Evidence from a meta-analysis,”Oncotarget.9:24857-24868(2018)；Kang X等人；“Inhibitory leukocyte immunoglobulin-like receptors:Immune checkpoint proteins and tumor sustaining factors,”Cell Cycle.15:25-40(2016)；Watts TH；“TNF/TNFR family members in costimulation of T cellresponses,”Annu Rev Immunol.23:23-68(2005)；Bryceson YT等人；“Activation,coactivation,and costimulation of resting human natural killer cells,”ImmunolRev.214:73-91(2006)；Sharpe AH；“Analysis of lymphocyte costimulation in vivousing transgenic and‘knockout’mice,”Curr Opin Immunol.7:389-395(1995)；WingrenAG等人；“T cell activation pathways:B7,LFA-3,and ICAM-1shape unique T cellprofiles,”Crit Rev Immunol.15:235-253(1995)，其公开在此通过引用将其全文并入本文。
可以根据免疫应答细胞的特定用途来选择共刺激信号区。具体是，选择共刺激信号区以共同发挥额外或协同作用。在一些实施方案中，共刺激信号区选自CD28、CD27、ICOS、4-1BB、OX40、CD30、GITR、HVEM、DR3和CD40的共刺激信号区。
在特定的实施方案中，pCAR的一个共刺激信号区为CD28的共刺激信号区，另一个为4-1BB的共刺激信号区。在具体的实施方案中，所述CAR的共刺激信号区为CD28的共刺激信号区，所述CCR的共刺激信号区为4-1BB的共刺激信号区。
在特定的实施方案中，pCAR的一个共刺激信号区为CD28的共刺激信号区，另一个为CD27的共刺激信号区。在具体的实施方案中，所述CAR的共刺激信号区是CD28的共刺激信号区，所述CCR的共刺激信号区为CD27的共刺激信号区。
4.3.跨膜结构域
所述CAR和CCR构建体的跨膜结构域可以相同或不同。在目前优选的实施方案中，当CAR和CCR构建体表达自单一载体时，所述CAR和CCR的跨膜结构域是不同的，以确保构建体在细胞表面分离。选择不同的跨膜结构域也可以提高表达载体的稳定性，因为在病毒载体中包含直接重复的核酸序列使其容易重排，直接重复之间的序列会缺失。在pCAR的CAR和CCR的跨膜结构域被选为相同的实施方案中，这种风险可以通过修饰或“摆动(wobbling)”选择用于编码相同蛋白质序列的密码子来降低。
适合的跨膜结构是本领域已知的，包括例如CD8α、CD28、CD4或CD3z的跨膜结构域。选择CD3z作为跨膜结构域可使CAR或CCR与TCR/CD3复合物的其他元件关联。这种关联可以招募更多的ITAM，但也可能导致CAR/CCR和内源性TCR/CD3之间的竞争。
在某些实施方案中，pCAR的一个跨膜结构域为CD28的跨膜结构域，另一个为CD8α的跨膜结构域。在一个特定的pCAR实施方案中，CAR的跨膜结构域为CD28的跨膜结构域，CCR的跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域。
4.4.共刺激信号域和跨膜结构域
在CAR或CCR的共刺激信号区是或包括CD28的共刺激信号区的实施方案中，CD28跨膜结构域代表了跨膜结构域的一个合适的、通常是优选的选择。全长的CD28蛋白为SEQ IDNO:3所示的220个氨基酸的蛋白，其中跨膜结构域用粗体字显示：
在一些实施方案中，共刺激信号区的之一基于铰链区，并且适当地也基于CD28的跨膜结构域和内域。在一些实施方案中，共刺激信号区包括SEQ ID NO:3所示的114-220氨基酸，以下显示为SEQ ID NO:4。
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:4)。
在特定的实施方案中，共刺激信号区之一为SEQ ID NO:4所示的修饰形式，其包括SEQ ID NO:5所示的c-myc标签：
EQKLISEDL(SEQ ID NO:5)。
c-myc标签可以通过插入到外域(ectodomain)中或通过替换外域中的区域以添加到共刺激信号区中，因此该标签在SEQ ID NO:3所示的1-152氨基酸区域内。
在一个特别优选的实施方案中，c-myc标签取代了CD28序列中的MYPPPY模体。该模体代表了一个潜在的有害序列。它负责CD28与其天然配体CD80和CD86之间的相互作用，因此当CAR-T细胞或pCAR-T细胞遇到表达这两种配体之一的靶细胞时，提供了潜在的脱靶毒性。通过用上文所述的标签序列替换该模体，降低了产生不需要的副作用的可能性。因此，在特定的实施方案中，CAR构建体的共刺激信号区包括SEQ ID NO:6。
EVEQKLISEDLLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPPLFPGPSKPFWVLVVGGVLACYSLLVTVFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNTPRRPGPTRKHYQPYAPDFAAYRS(SEQ ID NO:6)。
此外，包含c-myc表位有助于使用c-myc表位的单克隆抗体来检测pCAR-T细胞。因为使用一些可用的抗体时，流式细胞仪检测已被证明不可靠，因此这个方法非常有用。
再者，提供c-myc表位标签可以促进靶向CAR-T细胞的抗原非依赖性扩增，例如通过使用合适的单克隆抗体在溶液中或固定在固相(如袋子(bag))上与CAR交联。
此外，抗人c-myc抗体9e10的表位在TCR的可变区中的表达先前已被证明足以使抗体介导的和补体介导的细胞毒性在体外和体内得以实现。见Kieback等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(2)623-8(2008)。因此，提供这样的表位标签也可用作"自杀系统"，据此，在发生毒性时，可使用抗体在体内耗尽pCAR-T细胞。
在一些实施方案中，共刺激信号区之一为基于4-1BB的内域。在一些实施方案中，共刺激信号区包括如以下SEQ ID NO:7所示的4-1BB的214-255氨基酸。
KRGRKLYIFKQPFMRPVQTTQEDGSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:7)。
在特定的实施方案中，共刺激信号区之一为SEQ ID NO:7的修饰形式，其包括SEQID NO:8所示的FLAG表位标签。
DYKDDDDK(SEQ ID NO:8)。
在特别优选的实施方案中，FLAG表位标签附于4-1BB内域的C端。因此，在特定的实施方案中，CCR的共刺激信号区包括SEQ ID NO:9。
KRGRKLYIFKQPFMRPVQTQeedGSCRFPEEEEGGCELDYDDK(SEQ ID NO:9)。
4.5.嵌合抗原受体结合元件
pCAR的CAR和CCR构建体的结合元件分别结合可能相同或不同的第一表位和第二表位。
在一些实施方案中，所述CAR和CCR构建体的结合元件是相同的。然而更常见的是，这些结合元件彼此不同。
在各种实施方案中，所述CAR和CCR的结合元件特异性地与同一抗原的第一表位和第二表位结合。在其中某些实施方案中，CAR和CCR的结合元件特异性地与同一抗原的相同、重叠或不同的表位结合。在第一和第二表位相同或重叠的实施方案中，CAR和CCR上的结合元件可以竞争结合。在这样的实施方案中，可采用具有不同亲和力的结合元件，以实现pCAR的CAR和CCR组分的信号传导的最佳平衡。
在各种实施方案中，pCAR的CAR和CCR组分的结合元件与不同的抗原结合。在某些实施方案中，所述抗原是不同的，但可能与相同的疾病相关，例如源于B细胞系的相同的特定癌症。
在优选的实施方案中，CAR与CD19结合，而CCR与CD19或另一个B细胞系特异性标志物结合。后者的实例包括，但不限于CD20、CD22、CD23、CD79a和CD79b。
因此，合适的结合元件可以是任何提供pCAR能够识别的感兴趣的靶点元件。本发明的pCAR所指向的靶点可以是任何临床感兴趣的、希望引导T细胞应答到的靶点。
在各种实施方案中，本文所述的CAR和CCR中使用的结合元件为抗体的抗原结合位点(antigen binding sites，ABS)。在代表性实施方案中，用作结合元件的ABS为scFv形式或者是来自骆驼、人类或其他物种的单域抗体。
可选地，pCAR的结合元件可以包括与感兴趣的表面蛋白结合的配体。
或者，pCAR的结合元件可以包括与感兴趣的表面蛋白结合的肽。
在一些实施方案中，结合元件与有助于在细胞表面表达的前导序列相关。许多前导序列是本领域已知的，包括巨噬细胞集落刺激因子受体(FMS)前导序列、CD8α前导序列或CD124前导序列。
5、靶向抗B细胞抗原的平行CAR
5.1.用于pCAR的结合元件
在特定的实施方案中，所述CAR的结合元件或CCR的结合元件特异性地与CD19靶抗原上的表位相互作用。CD19是由CD19基因编码的B淋巴细胞抗原，存在于B细胞的表面。它是治疗B细胞恶性肿瘤如白血病或非霍奇金淋巴瘤的已知靶点。它还与自身免疫性疾病有关，因此可能是治疗此类疾病的靶点。
在一些实施方案中，所述CAR的结合元件特异性地与CD19抗原上的表位相互作用。在某些实施方案中，所述CCR的结合元件特异性地与CD19靶抗原上的表位相互作用。在某些实施方案中，所述CAR的结合元件特异性地与CD19抗原上的表位相互作用，且所述CCR的结合元件特异性地与CD19靶抗原上的相同、重叠或不同的表位相互作用。
在目前优选的实施方案中，所述CAR和/或CCR结合元件特异性地与CD19靶抗原上的第一表位相互作用。在一些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括FMC63抗体的抗原结合位点。在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括FMC63抗体的CDR。FMC63抗体的CDR序列使用www.abysis.org测定，如下SEQ ID NO:10-15所示。
VH CDR1 GVSLPD(SEQ ID NO:10)。
VH CDR2 WGSET(SEQ ID NO:11)。
VH CDR3 HYYYGGSYAMDY(SEQ ID NO:12)。
VL CDR1 RASQDISKYLN(SEQ ID NO:13)。
VL CDR2 HTSRLHS(SEQ ID NO:14)。
VL CDR3 QQGNTLPYT(SEQ ID NO:15)。
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括FMC63抗体的VH和VL结构域。FMC63抗体的VH和VL结构域序列如下SEQ ID NO:16-17所示。
VH：
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
(SEQ ID NO:16)。
VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT(SEQ ID NO:17)。
在特别优选的实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括形式为scFv的FMC63抗体的抗原结合位点，以VH-连接子-VL或VL-连接子-VH排列。这些序列以如下SEQ ID NO:18和19所示。在每种情况下，VH和VL结构域之间的连接子序列用下划线和斜体表示。
VH-VL：
VL-VH：
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括与FMC63抗体的scFv序列(如SEQID NO:18或19所示)70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在特别优选的实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括FMC63 scFv变体的CDR3区。具体而言，该变体包括FMC VH结构域(SEQ ID NO:12)内的突变，以改变scFv对CD19的亲和力。特别优选的实施方案包含将VH结构域的CDR3内用丙氨酸(A)替代酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)。这些变体如下显示为SEQ ID NO:20-26。
在一些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件特异性地与CD20抗原上的表位相互作用。在一些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括1F5抗体，所述1F5抗体与CD20结合。见Ledbetter和Clark,Hum.Immunol.15(1):30-43(1986)，在此通过引用并入全文。CD20为表达在所有B细胞表面的完整膜蛋白，从祖B细胞期开始浓度逐渐增加直至B细胞成熟。在人类中，CD20由MS4A1基因编码。靶向CD20的抗体被用于治疗B细胞淋巴瘤和白血病，以及治疗自身免疫性疾病，如关节炎，特别是类风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)和系统性红斑狼疮。在某些实施方案中，所述CCR结合元件包括1F5抗体的CDR。1F5抗体的CDR序列使用www.abysis.org测定，并如下显示为SEQ ID NO:27-32。
VH CDR1 GYTFTY(SEQ ID NO:27)。
VH CDR2 YPGNGD(SEQ ID NO:28)。
VH CDR3 SHYGSNYVDYFDY(SEQ ID NO:29)。
VL CDR1 RASSSLSFMH(SEQ ID NO:30)。
VL CDR2 ATSLAS(SEQ ID NO:31)。
VL CDR3 HQWSSNPLT(SEQ ID NO:32)。
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括1F5抗体的VH和VL结构域。1F5抗体的VH和VL结构域序列如下SEQ ID NO:33-34所示。
VH:
QVQLRQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSHYGSNYVDYFDYWGQGTLVTVSTG(SEQ ID NO:33).
VL:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSLSFMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYFCHQWSSNPLTFGAGTKVEIKRK(SEQ ID NO:34).
在特别优选的实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括格式化为scFv的1F5抗体的抗原结合位点，可以排列为VH-连接子-VL或VL-连接子-VH。这些序列如下SEQ ID NO:35和36所示。在每种情况下，VH和VL结构域之间的连接子序列用下划线和斜体表示。
VH-VL：
VL-VH：
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括1F5抗体的scFv变体。该变体与如上所示的SEQ ID NO:35或36有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件特异性地与CD22抗原上的表位相互作用。在一些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件是RFB4抗体，所述RFB4抗体与CD22结合。见Campana等人，J.Immunol.134(3):1524-30(1985)，在此通过引用并入全文。CD22是一种135kDa的B细胞特异性粘附分子，在60％至90％的B细胞恶性肿瘤细胞上表达。但它不在造血干细胞或任何其他非淋巴造血细胞或非造血细胞上表达。RFB4抗体的CDR序列使用www.abysis.org测定，并如下显示为SEQ ID NO:37-42。
VH CDR1 GFAFSIY(SEQ ID NO:37)。
VH CDR2 SSGGGG(SEQ ID NO:38)。
VH CDR3 HSGYGSSYGVLFAY(SEQ ID NO:39)。
VL CDR1 RASQDISNYLN(SEQ ID NO:40)。
VL CDR2 YTSILHS(SEQ ID NO:41)。
VL CDR3 QQGNTLPWT(SEQ ID NO:42)。
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括RFB4抗体的VH和VL结构域。RFB4抗体的VH和VL结构域序列如下所示，即SEQ ID NO:43-44。
VH:
EVQLESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGTPYDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYCARHSYGSSYGVLFAYWGQGTLVTS(SEQ ID NO:43)。
VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:44)。
在特别优选的实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括形式为scFv的RFB4抗体的抗原结合位点，以VH-连接子-VL或VL-连接子-VH排列。这些序列如下SEQ ID NO:45和46所示。在每种情况下，VH和VL结构域之间的连接子序列都用下划线和斜体表示。
VH-VL：
VL-VH：
在某些实施方案中，所述CAR或CCR结合元件包括RFB4抗体的scFv的变体。该变体与如上所示的SEQ ID NO:45或46有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％相同。
5.2.编码B细胞特异性pCAR序列的代表实施例
上述B细胞抗原特异性结合元件的组合已被用于构建pCAR，其中CAR和CCR元件结合CD19内相同的表位，或结合CD19和第二系特异性B细胞抗原上发现的不同表位。在本领域中，许多特异性地与CD19和其他系特异性B细胞抗原结合的其他分子是已知的，这意味着可以用类似的方法构建出大量的B细胞特异性pCAR。因此，以下的pCAR实施例只是为了说明目的，并不用于限制本发明的范围。pCAR的命名源于以下顺序：CCR结合子、CCR信号域/CAR结合子。
FBB/G01 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:47。该FBB/G01 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元素的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第一个甘氨酸已被丙氨酸取代("G01"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动(codon wobbling)用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
FBB/G02 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:48。该FBB/G02 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元素的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第二个甘氨酸被丙氨酸取代("G02"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
FBB/Y01 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:49。该FBB/Y01 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第一个酪氨酸被丙氨酸取代("Y01"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
FBB/Y02 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:50。该FBB/Y02 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第二个酪氨酸被丙氨酸取代("Y02"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
LPPR(SEQ ID NO:50)。
FBB/Y03 pCAR的蛋白序列如下所示，即SEQ ID NO:51。FBB/Y03 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第三个酪氨酸被丙氨酸取代("Y03"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
FBB/Y04 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:52。FBB/Y04 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第四个酪氨酸被丙氨酸取代("Y04"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
FBB/Y05 pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:53。FBB/Y05 pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、FMC63 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("FBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽；FMC63 scFv的变体，其中FMC63 scFv的VH CDR3中的第五个酪氨酸被丙氨酸取代("Y05"；VL-VH排列)；含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子；CD28跨膜和内域；CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和P2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
1BB/F pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:54。1BB/F pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、1F5 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("1BB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽、FMC63 scFv(VL-VH排列)、含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子、CD28跨膜和内域、CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和T2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。出于相同目的，在两个scFv中都使用了替代的间隔子。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
RBB/F pCAR的蛋白质序列如下所示，即SEQ ID NO:55。RBB/F pCAR包括：
(i)CCR，所述CCR包括以下元件的线性融合：巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽、RFB4 scFv结合域(VL-VH排列)、CD8α间隔子和跨膜结构域、4-1BB共刺激内域、FLAG表位标签("RBB")和；
(ii)第二代CAR，所述CAR包括以下元件的线性融合：CD8α前导肽、FMC63 scFv(VL-VH排列)、含有嵌入myc表位标签的CD28间隔子、CD28跨膜和内域、CD3z内域。
CCR和CAR由furin切割位点、Ser-Gly连接子(SGSG)和T2A核糖体跳肽连接。密码子摆动用于最小化scFv模块内的直接重复。出于相同目的，在两个scFv中都使用了替代的间隔子。scFv序列的VH和VL结构域用下划线和粗体表示。表位标签为斜体。
6、核酸和制备pCAR-T细胞的方法
本文还提供了编码如上所述的第二代CAR的第一核酸和编码如上所述的CCR的第二核酸的组合。如上所述，为方便起见，本文中将CAR和CCR组合称为单个的pCAR，尽管CAR和CCR是分离的、共表达的蛋白质。基于以上对CAR和CCR的描述，合适的核酸序列对技术人员来说是显而易见的。这些序列可以被优化以用于所需的免疫应答细胞。然而，在某些情况下，如上文所讨论的，密码子可以与最优化不同或"摆动(wobbling)"，以避免重复序列。这种核酸的特定实例将编码上述的优选实施方案。在一些实施方案中，B细胞特异性pCAR包括选自SEQ ID NO:47-55所示序列的多肽。在一些实施例中，编码pCAR的核酸选自由SEQ IDNO:109-117组成的组。
在一些实施方案中，编码pCAR的CCR组分的核酸选自由SEQ ID NO:128、129和130组成的组。
在一些实施方案中，编码pCAR的CAR组分的核酸选自由SEQ ID NO:101-108组成的组。
为实现转导，编码pCAR的核酸被适当地引入一个或多个载体，例如质粒、逆转录病毒或慢病毒载体，或非病毒载体。这样的载体，包括质粒载体，或含有它们的细胞系，构成本发明的另一个方面。
在代表性的实施方案中，对免疫应答细胞进行基因修饰，例如通过逆转录病毒或慢病毒介导的转导，将CAR和CCR的编码核酸引入宿主T细胞基因组，从而允许稳定的pCAR表达。之后细胞可以重新引入患者，可选在扩增后，然后将它们重新引入患者体内以提供有益的治疗效果，如下所述。
编码CAR和CCR的第一和第二核酸可以表达自同一载体或从不同载体。包含其的载体或多个载体可以组合在试剂盒中，提供该试剂盒以产生本文第一方面公开的免疫应答细胞。
在一些实施方案中，T细胞还可被工程化以共表达嵌合细胞因子受体，如4αβ，所述4αβ包括融合的IL-4受体-α的外域和共享的IL-2/15受体-β链的跨膜和内域。在这种情况下，扩增步骤可包括在培养基中离体培养步骤，所述培养基含有细胞因子，例如对于4αβ，所述培养基为包含IL-4作为唯一细胞因子支持的培养基。可选地，嵌合细胞因子受体可包括通过具有不同性质的常规γ细胞因子，如IL-7与受体内域连接的IL-4受体-α链的外域。在这些情况下，在含IL-4的培养基中细胞扩增可能会导致细胞分化减少。通过这种方式，可以确保具有所需分化状态的基因工程T细胞的选择性扩增和富集。
6、使用靶向抗B细胞抗原的pCAR T细胞进行治疗的方法
如上所述，免疫应答pCAR细胞在治疗中可用于引导T细胞介导的免疫应答至靶细胞。因此，在另一个方面，提供了在有需要的患者中引导T细胞介导的免疫应答至靶细胞的方法。所述方法包括向患者施用如上所述的免疫应答细胞群，其中所述结合元件对靶细胞具有特异性。在一些实施方案中，靶细胞表达CD19和/或其他B细胞抗原。
在另一个方面，提供了在有需要的患者中治疗癌症的方法。该方法包括向患者施用如上所述的免疫应答细胞群，其中所述结合元件对靶细胞具有特异性。在一些实施方案中，靶细胞表达CD19和/或其他B细胞抗原。在一些实施方案中，患者患有急性或慢性B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在各种实施方案中，向患者施用治疗有效量的免疫应答细胞。在一些实施方案中，免疫应答细胞通过静脉输注给药。在一些实施方案中，免疫应答细胞通过瘤内注射给药。在一些实施方案中，免疫应答细胞通过瘤周注射给药。在一些实施方案中，免疫应答细胞通过选自静脉注射、瘤内注射和瘤周注射的多种途径给药。
实施例
下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例仅用于说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所使用的数字(如数量、温度等)的准确性，但当然应允许存在一些实验误差和偏差。
1、方法
1.1.细胞系的培养
所有的肿瘤细胞和293T细胞都在补充有L-谷氨酰胺和10％FBS的DMEM中生长。如所说明的，肿瘤细胞被转导以表达萤火虫荧光素酶和串联二聚体Tomato红色荧光蛋白(LT)SFG载体，然后进行红色荧光蛋白表达的流式分选。LO68 CD19+细胞和LO68 CD19+/CD20+细胞是通过用编码人CD19和/或人CD20的SFG逆转录病毒载体转导LO68-LT细胞产生的。
1.2.逆转录病毒的产生
如制造商所推荐，293T细胞在Genejuice(MilliporeSigma，Merck KGaA，Darmstadt，德国)中用(i)编码所示的CAR/pCAR的SFG逆转录病毒载体、(ii)编码RD114包膜的RDF质粒和(iii)编码gag-pol的Peq-Pam质粒进行三重转染。在100mm的平板中对1.5x106个293T细胞进行转染，使用4.6875μg SFG逆转录病毒载体、4.6875μg Peq-Pam质粒和3.125μg RDF质粒。转染后48和72小时后，收集含有病毒载体的培养基，速冻并储存在-80℃。在某些情况下，通过用逆转录病毒转导293VEC GALV细胞来创建稳定的包装细胞系。从任一来源制备的病毒都可互换用于转导靶细胞。
1.3.T细胞的培养和转导
通过使用Ficoll-Paque(伦理批准号18/WS/0047)进行密度梯度离心，从健康供体的外周血样本中分离出外周血单核细胞(PBMC)。在补充有5％人AB血清和与GlutaMax的RPMI中培养T细胞。T细胞的活化是通过在基因转移之前，细胞在IL-2(100U/mL)中再生长24小时后，在5μg/mL植物凝集素(phytohemagglutinin leucoagglutinin，PHA-L)的存在下培养24-48小时来实现的。根据制造商的说明书，使用RetroNectin(Takara Bio)包被板实现T细胞转导。在RetroNectin包被的6孔板上，每孔加入活化的PBMC(1x106个细胞)。然后每孔加入100U/mL IL2的含逆转录病毒的培养基(3mL)。
1.4.细胞毒性试验
肿瘤细胞以2x104或1x105个细胞/孔接种在24或96孔板中，并与T细胞以特定的靶点和效应子比例进行培养。在某些情况下，T细胞对肿瘤细胞的破坏是用MTT试验来定量的。为了达到这个目的，在D10培养基中加入500μg/ml MTT(Sigma)，在37℃、5％CO2条件下培养2小时。去除上清液后，将甲
晶体重新悬浮在100μL DMSO中。在560纳米处测量吸光度。可选地，通过荧光素酶试验监测肿瘤细胞的存活能力。在发光读数前，立即加入150mg/mL的D-荧光素(PerkinElmer,Waltham MA)。在这两种情况下，肿瘤细胞存活能力的计算如下：(与T细胞培养的肿瘤细胞的吸光度或发光度/未经处理的单层细胞的吸光度或发光度)x100％。
1.5.通过流式细胞仪检测CAR和CCR的表达
使用9e10抗体检测CAR的表达，所述9e10抗体与myc表位标签(EQKLISEEDL)结合，然后使用PE偶联的羊抗鼠抗体。使用PE偶联的抗体通过细胞内染色检测pCAR的CCR组分的表达，所述PE偶联的抗体与FLAG表位标签(DYKDDDDK)结合。
1.6.通过ELISA检测IFN-γ和IL-2
在24小时后收集肿瘤细胞与CAR T细胞共培养物的上清液。根据制造商的说明书，使用人IFN-γ(Bio-Techne)或人IL-2ELISA试剂盒(Invitrogen)对细胞因子水平进行定量。
1.7.重复抗原刺激试验
悬浮的肿瘤细胞与CAR-T/pCAR-T细胞以初始效应子:靶点(E:T)的比例为1:1共同培养72-96h。然后通过荧光素酶试验评估残留的肿瘤细胞活力。在发光读数前，立即加入150mg/mL的D-荧光素(PerkinElmer)。然后加入新鲜的肿瘤细胞(105个细胞)，重复这一步骤，直到T细胞培养物无法增殖。
可选地，在加入T细胞前24小时，在24孔培养板中以每孔1×105个细胞的比例平铺贴壁LO68肿瘤细胞系三次。CAR-T/pCAR-T细胞以1:1的效应子:靶点比例加入。48-72小时后，用使用如上所述的MTT试验测量肿瘤细胞杀伤。然后收集T细胞，并通过添加到新的单层肿瘤细胞中进行再刺激，条件是与未处理的细胞相比>20％肿瘤细胞被杀死。肿瘤细胞存活能力的计算如5.1.4节所述。
1.8.体内研究
对来自健康供体的PBMC工程化以表达所示的CAR/pCAR，或不转导。在IL-2(100U/mL，每2-3天添加一次)中扩增11天后，通过流式细胞仪分析细胞如上所述CAR和CCR的表达。向雌性NSG小鼠静脉注射5x105细胞Nalm-6 LT细胞。4天后，静脉注射5x105个溶于200μl的PBS中的CAR+(或未转导的)T细胞，以PBS作为对照组进行比较。注射溶于200μl PBS中的StayBriteTMD-荧光素钾盐(150mg/kg)20分钟后，在异氟醚麻醉下，通过生物发光成像(BLI)监测肿瘤状态。使用
Lumina III(PerkinElmer)和Living Image软件(PerkinElmer)在所示的时间点进行图像采集，设置为自动优化曝光时间、分档和F/stop。当到达实验终点时，动物被人道杀死。
1.9.CD19 CAR结合研究-z-Movi
将CD19工程化的L068肿瘤细胞接种在z-Movi微流控芯片中并培养16小时。第二天，在初始化3分钟的线性力斜坡之前，流式分选的CAR-T细胞在芯片中连续流动，并与靶细胞孵育5分钟。使用实验后的图像分析技术来确定细胞的分离。
2、实施例1：CD19特异性CAR-T细胞的体外活性
通过逆转录病毒转导对T细胞进行工程化，以表达命名为F-2的含CD28的第二代CAR，或命名为Y01、Y02、Y03、Y04、Y05、G01或G02的VH CDR3突变衍生物，或不进行转导(图3A和3B)。
为了测试与CD19的结合，将转导的T细胞与CD19-Fc以0.5μg(图7A)和1.0μg(图7B)两种不同的浓度孵育。在与PE偶联的抗人IgG孵育后，用流式细胞仪检测CD19-Fc与CAR的结合情况。图7A-7D显示，F-2的CDR3变体表现出结合CD19的不同效率。
为了进一步测试2G CAR、F-2及其突变衍生物的相对CD19结合能力，在z-Movi微流控芯片中，在单层CD19+LO68肿瘤细胞上孵育工程化CAR-T细胞。施加越来越大的流体力，测定结合的T细胞的百分比(中位数，n＝3)。表达VH CDR3突变的CAR的T细胞呈现出与CD19的结合活性谱。与2G CAR F相比，大多数VH CDR3突变的衍生物表现出降低的对CD19的结合活性。图17A-17D显示了代表性实验的数据。数据以中位数rForce(median rForce)表示，即引起细胞分离所需的相对力，用10μM聚苯乙烯珠校准。由于数据不是正态分布，因此用中位数rForce表示，它是引起细胞分离所需的相对力，用10μM的聚苯乙烯珠校准。图17B显示了应用使平均90％未转导的T细胞分离所需的最小的rForce(210pN)后结合的T细胞的总体平均百分比。所示数据为平均值+标准误差(n＝11次运行，3个独立供体)。图17C显示了与未转导的T细胞相比，每个VH CDR3突变衍生物的亲合力分数(例如，每个细胞从单层CD19+LO68肿瘤细胞中分离T细胞所需的平均rForce的比例)。黑色虚线代表未转化的T细胞的亲合力分数；红色虚线代表F-2CAR T细胞的亲合力分数。图17D显示了每个细胞从单层肿瘤细胞分离所需的rForce，点状图中的每个点代表一个细胞。条形图表示中位数+四分位数范围。统计分析采用Kruskal-Wallis检验和Dunnett多重比较检验，其中p＝<0.0001(****)，0.0007(***)或0.005(**)。为了清楚起见，绘制了一个健康供体的单独代表性态势，其中每个点代表一个细胞。这些点共同产生了图17A中所示的亲合力曲线。因此，亲合力曲线显示了每个供体的1000多个单细胞观察结果。
为了评估抗肿瘤活性，将转导的T细胞与Nalm-6 LT或Raji LT细胞体外共培养，这两种细胞自然表达CD19(图1A)。E:T比例的范围从10到0.31，包括5、2.5、1.25和0.63。图8A-8B显示了使用来自三个代表性供体的细胞获得的数据。72小时后，通过荧光素酶试验对共培养后残留存活的癌细胞进行了定量。图8A和8B分别显示了与CAR-T细胞共培养后，Nalm-6和Raji肿瘤细胞的存活百分比。
为了进一步评估细胞毒性活性，将2x104个转导的T细胞与相等数量的Nalm-6(图8C)或Raji(图8D)细胞共培养两次。72小时后，通过荧光素酶试验对肿瘤细胞的活力进行定量。图8C-8D显示了存活的癌细胞的平均水平的平均值+标准误差(n＝3次生物重复)。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析，然后进行Tukey多重比较检验，其中p<0.0001(****)，≤0.001(***)，或≤0.01(**)。
将转导的T细胞与Nalm-6 LT(图9A-9B)或Raji LT细胞(图9C-9D)在体外共培养，效应子：靶点的比例为1.25肿瘤细胞:1表达CAR的T细胞。图9A-9D显示了24小时后收集的上清液中IFN-和IL-2浓度的平均水平的平均值+标准误差(n＝3次生物重复)。在每种情况下，使用双向方差分析(two-way ANOVA)和Tukey多重比较试验进行统计分析，其中p＝0.033(*)，0.002(**)，0.0002(***)或<0.0001(****)。NS-不显著。
在上述共培养实验后(图8C-8D所示的数据)，在24小时后收集细胞上清液并通过ELISA分析IFN-γ(图10A-10B)和IL-2(图10C-10D)。显示的数据是平均值+标准误差(n＝3次生物重复)。统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Tukey多重比较试验，其中p<0.0001(****)，≤0.001(***)，≤0.01(**)，或≤0.05(*)。NS-不显著。
在缺乏外源细胞因子IL-2的情况下，对转导的T细胞进行连续几轮的抗原(Ag)刺激。通过添加105个Nalm-6肿瘤细胞，每周两次重新刺激含有105个工程化T细胞的三份培养物。图11A显示了在每次肿瘤细胞攻击后72小时通过荧光素酶检测测量的肿瘤细胞存活率。图11B和11C分别显示了每次肿瘤细胞攻击后24小时收集的上清液中的IFN-γ和IL-2水平。
3、实施例2：CD19特异性pCAR-T细胞的体外活性
图4A-4B和图18A-18B显示了一组CD19特异性pCAR在人类T细胞中的表达，并与第二代对照CAR，(F-2)进行比较。pCAR的命名源于以下元件的有序缩写：CCR结合子(FMC63scFv)，CCR信号域(4-1BB)/CAR结合子(分别为G01-Y05)。用9e10抗体孵育细胞后，通过流式细胞仪检测每个pCAR内含CD28的CAR的细胞表面表达，所述9e10抗体抗体与CAR外域中的myc表位标签结合。用抗FLAG抗体对透化的细胞进行细胞内染色，检测每个pCAR中CCR组分的表达，FLAG抗体与位于CCR内域的远端位置的FLAG表位标签结合。图2C-2F中示意性地说明了表位标签的位置。
图12显示了来自五个生物学重复实验的汇集数据，每个实验重复两次，其中CDR3VH突变的基于FMC63的第二代CAR和pCAR T细胞在体外与Nalm-6 LT肿瘤细胞共培养，并与亲本第二代CAR T细胞(F-2)进行对比。在每个实验中，都建立了T细胞与2x104个肿瘤细胞共培养的培养物。E:T的比例范围从1:1到1:128，包括1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64。72小时后，通过荧光素酶试验对残留的存活癌细胞进行定量。与CAR-T细胞共培养后，示出了Nalm-6肿瘤细胞的存活百分比(平均值+平均值的标准误差，n＝10个数据点)。统计分析采用双向方差分析(two-way ANOVA)和Tukey多重比较试验，其中p＝0.033(*)，0.002(**)，0.0002(***)或<0.0001(****)。NS-不显著。一些CDR3 VH突变的基于FMC63的第二代CAR的表现优于亲本第二代CAR，F-2。观察到具有相同突变的VH CDR3的衍生的pCAR的细胞毒性等同或进一步增强。
图13A-13C显示了来自实验的代表性数据，其中在缺乏外源细胞因子的情况下，在表达CD19的单层LO68肿瘤上重复刺激了105个pCAR-T细胞。图13A显示了肿瘤细胞的存活能力，每轮刺激后24小时通过荧光素酶试验测定。图13B和图13C分别显示了每轮刺激后24小时收集的上清液中IFN-γ和IL-2的水平。请注意，与第二代CAR的亲本F-2相比，一些pCAR变体的抗肿瘤活性更高。
4、实施例3：CD19特异性pCAR-T细胞在NSG小鼠体内的活性
在携带已建立的Nalm-6白血病异种移植的NSG小鼠体内，评估了CD19特异性CAR-T和pCAR-T细胞的抗肿瘤活性。
将RFP/ffLuc+Nalm6细胞(5x105个细胞)静脉注射到NSG小鼠体内。在第5天，将动物分成5-10只疾病负担相同的小鼠的组(根据BLI)。然后用5x105个所示的CAR或pCAR T细胞处理小鼠，静脉注射给药。用PBS进行比较。从第8天开始测量每个处理方法的白血病异种移植的汇集生物发光发射(“总通量”)(图19)。在所采用的适度的T细胞剂量(5x105个细胞)下，F-2CAR T细胞引起了疾病进展的短暂迟滞，而突变的2G衍生物Y05和G02则实现了优越的抗白血病活性。所有测试的pCAR，FBB/Y04、FBB/Y05和FBB/G02，都实现了对疾病控制的进一步加强(图14A、图20A和20B)。测试的pCAR FBB/Y04、FBB/Y05和FBB/G02也实现了优越的处理后存活率(图21A-21D)，且没有体重下降(图14B)。
这些结果表明，在建立白血病负担的NSG小鼠体内，与2G CAR-T细胞相比，CD19特异性的pCAR-T细胞具有优越的抗肿瘤活性。
6、实施例4：共靶向CD19和CD20的pCAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
T细胞被工程化为表达CD19或CD20特异性的第二代CAR T细胞(分别为F-2和1-2)或1BB/FpCAR。1x105个转导的CAR或pCAR T细胞与相同数量的LO68-CD19+CD20+肿瘤细胞共培养，一式三份。72小时后，将T细胞转移到新鲜的单层LO68-CD19+CD20+细胞中。图15A中的数据显示了每个共培养条件下完成的再刺激周期数。当肿瘤细胞存活能力为80％或更高时，终止培养。
图15B显示了105个1BB/F pCAR-T细胞与相同数量的共表达CD19和CD20的LO68肿瘤细胞相结合的数据。在缺乏外源细胞因子的情况下建立培养物。与CD19或CD20特异性第二代CAR T细胞(分别为F-2和1-2)或未转导的T细胞进行比较。72小时后用MTT试验评估肿瘤细胞的细胞毒性。通过与105个肿瘤细胞共培养，每周两次重新刺激T细胞，72小时后进行MTT试验以评估肿瘤细胞存活能力。重复这一步骤，直到T细胞培养失败。所示数据为平均值±SEM，n＝4。每个刺激周期后一天从共培养物中取出上清液，并用ELISA分析IFN-γ和IL-2的释放情况(图15C)。所示数据为平均值+标准误差(n＝4)。
在图15D中，T细胞与105个共表达CD19和CD20的LO68肿瘤细胞在体外共培养72小时。效应子:靶点(T细胞:肿瘤细胞)的比例范围从1:1到1:128，包括1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64。在缺乏外源细胞因子的情况下建立培养物。72小时后，用MTT试验对残留的存活的癌细胞进行定量。在体外观察到CAR-和pCAR-工程化T细胞有类似的抗肿瘤活性。所示数据为平均值±SEM，n＝4。
CAR或pCAR T细胞与LO68-CD19+CD20+肿瘤细胞共同培养，效应子:靶点(T细胞:肿瘤细胞)比例为1:1和1:4。共培养24小时后收集上清液以分析IFN-γ(图15E)和IL-2(图15F)。
7、实施例5：共靶向CD19和CD22的pCAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
图6A-6B显示了共靶向CD19和CD22的RBB/F pCAR在人类T细胞中的表达，与CD19或CD22特异性第二代CAR T细胞(分别为F-2和R-2)或未转导的T细胞进行比较。用9e10抗体孵育细胞后，通过流式细胞仪检测CAR或pCAR中CAR组分的表达，9e10抗体与CAR外域中的myc表位标签结合。用抗FLAG抗体对透化的细胞进行细胞内染色，检测pCAR中CCR组分的表达，FLAG抗体与位于CCR内域的远端位置的FLAG表位标签结合。图2F中示意性地说明了表位标签的位置。
图16A显示了RBB/F pCAR T细胞对Nalm-6白血病细胞的细胞毒性活性，与CD19特异性(F-2)或CD22特异性(R-2)第二代CAR T细胞进行比较。T细胞在体外与肿瘤细胞共同培养72小时。效应子:靶点(T细胞:肿瘤细胞)的比例范围从1:1到1:128，包括1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64。然后通过荧光素酶试验对残留的存活癌细胞进行定量。注意到较低的E:T比例下，pCAR T细胞的抗肿瘤活性增强。所示数据为平均值+SEM，n＝5。统计分析采用双向方差分析(two-way ANOVA)，然后进行Tukey事后检验。p＝0.0216(*)，0.0021(**)，0.0002(***)，＜0.0001(****)。
图16B显示了RBB/G02和RBB/Y05 pCAR T细胞对Nalm-6白血病细胞的细胞毒性活性，并与RBB/F pCAR T细胞和CD19特异性(F-2)或CD22特异性(R-2)第二代CAR T细胞进行了比较。实验按上述方法进行，共培养72小时后，用荧光素酶法定量靶细胞的存活能力。所示数据为平均值+标准误差(n＝3-7次生物学重复)。
序列
7.等同物和范围
本领域的技术人员将认识到，或者说不需要通过常规实验就能确定，根据本发明所述的特定实施方案的许多等同物。本发明的范围并不局限于上述说明书，而是如所附的权利要求书中所限定的。
Claims (40)
1.一种免疫应答细胞，其表达：
i.第二代嵌合抗原受体(CAR)，所述第二代嵌合抗原受体包括：
a)信号区；
b)第一共刺激信号区；
c)第一跨膜结构域；和
d)与CD19靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件；以及
ii.嵌合共刺激受体(CCR)，所述嵌合共刺激受体包括：
e)第二共刺激信号区，其中所述第二共刺激信号区不同于所述第一共刺激信号区；
f)第二跨膜结构域；和
g)与第二靶抗原上的第二表位特异性相互作用的第二结合元件，其中所述第二靶抗原为CD19或另一个B细胞系特异性靶抗原。
2.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：
CDR1 VH，所述CDR1 VH包含SEQ ID NO:10所示序列，
CDR2 VH，所述CDR2 VH包含SEQ ID NO:11所示序列，
CDR3 VH，所述CDR3 VH包含选自SEQ ID NO:20-26所示的序列中的一个，
CDR1 VL，所述CDR1 VL包含SEQ ID NO:13所示序列，
CDR2 VL，所述CDR2 VL包含SEQ ID NO:14所示序列，和
CDR3 VL，所述CDR3 VL包含SEQ ID NO:15所示序列。
3.如权利要求2所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：
VH，所述VH包含SEQ ID NO:16所示序列的变体，其中所述变体在SEQ ID NO:16的CDR3VH区有G到A或Y到A的单氨基酸突变，以包含选自SEQ ID NOs:20-26所示序列中的一个，和
VL，所述VL包含SEQ ID NO:17所示序列。
4.如权利要求2或3所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含选自SEQ ID NO:18-19所示序列中的一个的变体，其中所述变体在CDR3 VH区有G到A或Y到A的单氨基酸突变，以包含选自SEQ ID NO:20-26所示序列中的一个。
5.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括：
CDR1 VH，所述CDR1 VH包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR2 VH，所述CDR2 VH包含SEQ ID NO:11所示的序列，
CDR3 VH，所述CDR3 VH包含SEQ ID NO:12所示的序列，
CDR1 VL，所述CDR1 VL包含SEQ ID NO:13所示的序列，
CDR2 VL，所述CDR2 VL包含SEQ ID NO:14所示的序列，和
CDR3 VL，所述CDR3 VL包含SEQ ID NO:15所示的序列。
6.如权利要求5所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括具有SEQ ID NO:16所示序列的VH区和具有SEQ ID NO:17所示序列的VL区。
7.如权利要求5或6所述的免疫应答细胞，其中所述第一结合元件包括具有SEQ ID NO:18或19所示序列的单链可变片段(scFv)。
8.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中包含所述第二表位的所述第二靶抗原为选自由CD19、CD20、CD22、CD23、CD79a和CD79b组成的组中的B细胞系特异性抗原。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括：
CDR1 VH，所述CDR1 VH包含SEQ ID NO:10所示的序列，
CDR2 VH，所述CDR2 VH包含SEQ ID NO:11所示的序列，
CDR3 VH，所述CDR3 VH包含SEQ ID NO:12所示的序列，
CDR1 VL，所述CDR1 VL包含SEQ ID NO:13所示的序列，
CDR2 VL，所述CDR2 VL包含SEQ ID NO:14所示的序列，和
CDR3 VL，所述CDR3 VL包含SEQ ID NO:15所示的序列。
10.如权利要求9所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包含具有SEQ ID NO:16所示序列的VH区和具有SEQ ID NO:17所示序列的VL区。
11.如权利要求9或10所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ IDNO:18或19所示序列的单链可变片段(scFv)。
12.如权利要求1至8中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括：
CDR1 VH，所述CDR1 VH包含SEQ ID NO:27所示的序列，
CDR2 VH，所述CDR2 VH包含SEQ ID NO:28所示的序列，
CDR3 VH，所述CDR3 VH包含SEQ ID NO:29所示的序列，
CDR1 VL，所述CDR1 VL包含SEQ ID NO:30所示的序列，
CDR2 VL，所述CDR2 VL包含SEQ ID NO:31所示的序列，和
CDR3 VL，所述CDR3 VL包含SEQ ID NO:32所示的序列。
13.如权利要求12所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ ID NO:33所示序列的VH区和具有SEQ ID NO:34所示序列的VL区。
14.如权利要求12或13所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ IDNO:35或36所示序列的单链可变片段(scFv)。
15.如权利要求1至8中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括：
CDR1 VH，所述CDR1 VH包含SEQ ID NO:37所示的序列，
CDR2 VH，所述CDR2 VH包含SEQ ID NO:38所示的序列，
CDR3 VH，所述CDR3 VH包含SEQ ID NO:39所示的序列，
CDR1 VL，所述CDR1 VL包含SEQ ID NO:40所示的序列，
CDR2 VL，所述CDR2 VL包含SEQ ID NO:41所示的序列，和
CDR3 VL，所述CDR3 VL包含SEQ ID NO:42所示的序列。
16.如权利要求15所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ ID NO:43所示序列的VH区和具有SEQ ID NO:44所示序列的VL区。
17.如权利要求15或16所述的免疫应答细胞，其中所述第二结合元件包括具有SEQ IDNO:45或46所示序列的单链可变片段(scFv)。
18.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第二代CAR包含SEQ ID NO:56、58、59、60、61、62或63所示的序列，所述CCR包含SEQ ID NO:57所示的序列。
19.如权利要求1所述的免疫应答细胞，其中所述第二代CAR包含SEQ ID NO:64所示的序列，所述CCR包含SEQ ID NO:65或66所示的序列。
20.如前述权利要求中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞为αβT细胞、γδT细胞或自然杀伤(NK)细胞。
21.如权利要求20所述的免疫应答细胞，其中所述T细胞为αβT细胞。
22.如权利要求20所述的免疫应答细胞，其中所述T细胞为γδT细胞。
23.一种多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸或多核苷酸组包括：
i.编码第二代嵌合抗原受体(CAR)的第一核酸，所述第一核酸包括：
a)信号区；
b)第一共刺激信号区；
c)第一跨膜结构域；和
d)与CD19靶抗原上的第一表位特异性相互作用的第一结合元件；以及
ii.编码嵌合共刺激受体(CCR)的第二核酸，包括：
e)第二共刺激信号区，其中所述第二共刺激信号区不同于所述第一共刺激信号区；
f)第二跨膜结构域；和
g)与第二靶抗原上的第二表位特异性地相互作用的第二结合元件，其中所述第二靶抗原为CD19或另一个B细胞系特异性靶抗原。
24.如权利要求23所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述第一结合元件由选自SEQID NO:118-125所示序列中的一个编码。
25.如权利要求23所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述第一核酸包括选自SEQ IDNO:101-108所示序列中的一个。
26.如权利要求23所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述第二结合元件由选自SEQID NO:118、126和127所示序列中的一个编码。
27.如权利要求23所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述第二核酸包括选自SEQ IDNO:128-130所示序列中的一个。
28.如权利要求23至27中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述第一核酸和所述第二核酸由单一载体表达。
29.如权利要求23至28中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组，所述多核苷酸或多核苷酸组包括选自SEQ ID NO:109-117所示序列中的一个。
30.编码一种pCAR的如权利要求23所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述pCAR包括与选自SEQ ID NO:47-55所示序列中的一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。
31.如权利要求30所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述pCAR包括与选自SEQ IDNO:47-55所示序列中的一个具有至少95％序列同一性的多肽。
32.如权利要求31所述的多核苷酸或多核苷酸组，其中所述pCAR包括选自SEQ ID NO:47-55所示序列的一条多肽。
33.一种免疫应答细胞，其包括如权利要求23-32中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组。
34.一种制备如权利要求1至22中任一项所述的免疫应答细胞的方法，所述方法包括将如权利要求23至32中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组转染或转导至免疫应答细胞。
35.一种在有需要的患者中引导T细胞介导的免疫应答至靶细胞的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1至22或33中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述靶细胞表达CD19。
36.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的如权利要求1至22或33中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述患者的癌症表达CD19。
37.一种用于(i)疗法或作为药物或(ii)治疗癌症患者的如权利要求1至22中任一项所述的免疫应答细胞。
38.如权利要求36所述的方法或如权利要求37所述的免疫应答细胞，其中所述患者患有一种产生于B细胞系的癌症。
39.如权利要求38所述的方法或免疫应答细胞，其中所述患者患有急性或慢性B细胞白血病。
40.如权利要求38所述的方法或免疫应答细胞，其中所述患者患有B细胞淋巴瘤。
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