CN101292160A

CN101292160A - Muc1-依赖性的抗-雌激素抗性的调节

Info

Publication number: CN101292160A
Application number: CNA2006800273375A
Authority: CN
Inventors: D·W·库夫
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2008-10-22
Also published as: CA2614307A1; WO2006127972A3; AU2006249801A1; WO2006127972A9; EP1910840A2; US20080311575A1; WO2006127972A2

Abstract

本发明提供了用于鉴定和使用调节MUC1和雌激素受体结合，并从而拮抗MUC1－相关的抗－雌激素治疗抗性的化合物的方法。

Description

Muc1-依赖性的抗-雌激素抗性的调节

本申请要求于2005年5月26日提交的系列号为60/685,052的美国临时专利申请的优先权，在此特别将其全部内容通过全文引入作为参考。

发明背景

按照由美国国家癌症研究所资助的基金CA097098和由美国陆军资助的基金BC022158，美国政府可能具有本发明的权利。

A.发明领域

本发明一般涉及癌治疗领域，并且更具体地涉及鉴定和使用调节MUC1和雌激素受体结合并因而拮抗MUC1-相关的抗-雌激素治疗抗性的化合物。

B.相关技术

MUC1跨膜糖蛋白通常表达于分泌性乳房上皮的顶部边缘上(Kufe等，1984)。随着转化(transformation)和极性的丧失，MUC1在乳腺癌细胞的胞质溶胶中和整个表面上异常过度表达(Kufe等，1984；Perey等，1992)。已经将MUC1基因座定位于人染色体1q21，位于在乳腺癌和其它癌中经常受遗传改变影响的区域(Merlo等，1989；Swallow等，1987)。MUC1在翻译单条多肽并在内质网中切割成两个亚基后表达为稳定的异二聚体(Ligtenberg等，1992)。MUC1 N-端亚基(MUC1 N-ter，MUC1-N)含有可变数目的20个氨基酸的串联重复，所述的串联重复广泛地受O-联聚糖修饰(Gendler等，1988；Siddiqui等，1988)。MUC1 C-端亚基(MUC1 C-ter，MUC1-C)由58个氨基酸的胞外结构域、28个氨基酸的跨膜结构域和72个氨基酸的胞质尾区组成(Merlo等，1989)。在细胞表面，MUC1-N延伸充分超出细胞被膜(glycocalyx)并通过MUC1-C系在细胞膜上。MUC1-C也在转化的细胞的胞质溶胶中积聚并被靶向至细胞核(Li 2003a；Li等，2003b；Li，等，2003c；Wen等，2003)和线粒体(Ren等，2004))。MUC1胞质结构域(CD)与连环蛋白(catenin)家族的成员(Li和Kufe2001；Yamamoto等，1997)以及与p53肿瘤抑制基因结合(Wei等，2005)。MUC1-CD也受到表皮生长因子受体(EGFR)(Li等，2001b)、c-Src(Li 2001a)和糖原合酶激酶3b(GSK3b)(Li等，1998)的磷酸化作用。MUC1与ErbB2相互作用这一发现进一步支持了MUC1在ErbB受体酪氨酸激酶和Wnt信号传导途径两者中的作用(Li等，2003c；Schroeder等，2001)。对乳腺癌中MUC1的异常调节潜在重要的是，其它研究已经显示MUC1过度表达足以赋予锚定不依赖性生长和致肿瘤性(Huang等，2003；Li 2003b；Schroeder等，2004)。

大多数人乳腺癌是雌激素依赖的并且对它们用雌激素拮抗剂，特别是它莫西芬(TAM)来治疗对死亡率已经有显著的效果(Ali和Coombes 2002)。雌激素作用由核受体家族的两个成员：雌激素受体α(ERα)和ERβ介导。这两种ER都含有结合雌激素响应元件(ERE)的中央的DNA-结合结构域(DBD)和C-端配体结合结构域(LBD)。ERα和ERβ在它们的DBD中具有充分的同源性并因而可以调节共同的一组基因。然而，与ERβ敲除的小鼠相反，ERα敲除的小鼠是不育的，说明了这些受体有不同的功能(Krege等，1998；Lubahn等，1993)。在缺少雌激素刺激时，ERα占据了雌激素-应答基因(estrogen-responsive gene)的启动子(Metivier等，2003；Metivier等，2002；Reid等，2003；Shang等，2000)。而且，一旦雌激素结合，ERα发生构象变化和二聚化，这增加了与ERE的结合。ERα介导的转录的激活通过N-端区中的激活功能1(AF-1)和LBD中的AF-2调节。AF1通过ErbB受体信号传导和MAP激酶途径激活，而AF-2需要雌激素依赖的转录激活(transactivation)。在响应雌激素时，靶启动子上的ERα转录复合物募集共激活因子，所述的共激活因子来自i)p160家族(SRC-1/NCoA-1、GRIP1/NCoA-2和AIB1/RAC3/ACTR)(Chen等，1997；Halachmi等，1994；Onate等，1995)，ii)非-p160蛋白(RIP140、mSUG1和TIF1)(Cavailles等，1995；Le Douarin等，1995；vom Baur等，1996)和iii)组蛋白乙酰化酶(p300和CBP)和p300/CBP相关因子pCAF(Chakravarti等，1996)。由雌激素结合至ERα LBD诱导的结构变化促进了p160共激活因子的募集(Shiau等，1998)。ERα也与基础转录因子相互作用来增加转录起始(Ing等，1992；Jacq等，1994)。值得注意地是，p160共激活因子的募集足够用于ERα-介导的基因激活和用于雌激素-诱导的生长刺激(Shang等，2000)与雌激素诱导的转录共激活因子募集相反，TAM募集了ERα转录复合物的辅阻遏物并因而阻断了生长和存活(Brzozowski等，1997；Halachmi等，1994；Shang等，2000)。然而，许多乳腺癌变得对TAM有抗性，常常尽管有持续的ERα表达，但机制还未理解清楚。

发明概述

本发明提供了用于鉴定调节MUC1与雌激素受体结合的化合物的方法。本发明的一个方面是用于筛选化合物调节MUC1胞质结构域多肽与雌激素受体结合的能力的方法，该方法包括：提供能结合DNA结合结构域的含有SEQ ID NO：7或其片段的第一种多肽；提供能结合MUC1CD的含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或其片段的第二种多肽；提供候选化合物；定量所述第一种多肽和所述第二种多肽之间的结合；并将所述第一种和所述第二种多肽之间的结合的所述定量与合适的对照(例如在缺少试验化合物时的结合)比较。

在一些实施方案中，将第一种多肽或第二种多肽通过连接至固定相而固定化。在一些实施方案中，第一种多肽和/或第二种多肽进一步包含荧光标记、放射标记或发色团。在一些实施方案中，第一种多肽和/或第二种多肽是融合蛋白。在其它实施方案中，所述方法进一步包括提供足以增加所述第一种和所述第二种多肽结合的量的17β-雌二醇。

本发明的另一方面是筛选特异性结合至能结合雌激素受体DNA结合结构域的、含有SEQ ID NO：7或其片段的多肽的化合物的方法，该方法包括：a)在合适的条件下将所述多肽与至少一种试验化合物合并，和b)检测所述试验化合物与多肽的结合，因而鉴定了特异性结合至所述多肽的化合物。

本发明的另一方面是用于筛选有效预防或抑制抗-雌激素抗性的化合物的方法，该方法包括鉴定降低MCU1胞质结构域与雌激素受体结合的化合物。

本发明的进一步方面是MUC1胞质结构域的全部或部分在用于检测用于预防和/或治疗乳腺癌患者中的抗-雌激素抗性的化合物的方法中的用途。在一些实施方案中，该方法包括：提供能结合ER DNA结合结构域的含有MUC1胞质结构域的全部或部分的第一种多肽；提供含有雌激素受体的DNA结合结构域的第二种多肽；提供试验化合物；定量所述第一种多肽和所述第二种多肽之间的结合；以及将所述第一种多肽和所述第二种多肽之间的结合的所述定量与合适的对照比较。

术语“预防”、“抑制”或“减少”或这些术语的任何变体，当用于权利要求书和/或说明书时，包括任何可测量的降低或完全预防、减少或抑制而获得期望的结果。“抑制”和“预防”不要求完全抑制和预防MUC1 CD与ER的结合或MUC1-依赖性的抗-雌激素抗性。

当在权利要求书和/或说明书中连同术语“包含”使用时，单词“一”或“一个”的使用可表示“一个”，但是其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。特别是考虑包括实施例部分中描述的任何实施方案作为本发明的实施方案。

通过下面的详述，本发明的其它的目的、特征和优势将变得显而易见。然而应该理解，尽管说明了本发明的具体实施方案，但详述和特定实施例仅是以例证的方式给出，因为根据该详述在本发明的精神和范围内的多种改变和修饰对本领域技术人员将变得显而易见。

附图简述

下面的附图构成了本说明书的一部分并且包含在内以进一步说明本发明的某些方面。本发明可以通过参考一个或多个这些附图，结合在此说明的具体实施方案的详细描述来更好的理解。

图1A-D.MUC1与ERα结合。图1A和B.人MCF-7(A)和ZR-75-1(B)乳腺癌细胞在补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS的无酚红培养基中生长3天。然后让这些细胞不经处理或用100nM E2刺激3小时。让细胞溶解物接受使用抗-ERα和对照IgG的免疫沉淀法(IP)。通过使用抗-MUC1-C和抗-ERα的免疫印迹法(IB)分析免疫沉淀物。图1C和D.用100nM E2刺激表达Myc-MUC1-CD和ERα的COS-1细胞3小时。抗-ERα(C)或抗-Myc(D)IP用抗-MUC1-C或抗-ERα进行免疫印迹。不接受IP的细胞溶解物用抗-MUC1-C或抗-ERα进行免疫印迹(下边的图)。

图2A-D.MUC1-CD直接结合至ERα DNA结合结构域。图2A.描述MUC1-CD和ERα的结构的示意图。对于MUC1-CD，还显示了β-连环蛋白结合基序(方框内的)和c-Src、GSK3b和PKCd磷酸化位点。H：铰链区。图2B-D.图2(B)：将GST和GST-MUC1-CD(1-72)结合至谷胱甘肽琼脂糖并与³⁵S-标记的ERα或标明的Erα缺陷型突变体孵育。图2(C)：将结合至谷胱甘肽琼脂糖的GST、GST-MUC1-CD(1-72)或标明的GST-MUC1-CD缺陷型突变体与³⁵S-标记的ERα孵育。图2(D)：在缺少配体(对照)和存在100nM E2或100nM TAM时将GST-MUC1-CD与标明的³⁵S-标记的ERα蛋白孵育。洗涤后，洗脱结合的蛋白质并通过SDS-PAGE分离。将胶条固定、干燥并接受磷光影像分析仪(phosphoimager)分析。

图3A-F.MUC1占据雌激素-应答基因启动子。图3A和B.将细胞在补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS的无酚红培养基中生长3天。在用100nM E2处理1小时后，将细胞用1％甲醛交联并通过ChIP测定法监控。将来自对照和E2-处理过的MCF-7或ZR-75-1细胞的可溶性染色质用抗MUC1-C或对照IgG进行免疫沉淀。将最终的DNA提取物通过使用覆盖pS2(A)和组织蛋白酶D(B)基因启动子的标明的ERE或控制区(CR)的引物对进行PCR扩增。图3C和D.在Re-ChIP试验中，将来自标明的细胞的可溶性染色质用抗-MUC1-C免疫沉淀。通过与10mM DTT在37℃下孵育30分钟洗脱免疫复合物。离心后，用Re-ChIP缓冲液将上清液稀释30倍，随后用抗-ERα再次沉淀，并然后检测pS2(C)和组织蛋白酶D(D)基因启动子中的标明的ERE或CR。图3E.将MCF-7和ZR-75-1细胞用100nM E2处理标明的时间。可溶性染色质用抗-MUC1-C或抗-ERα免疫沉淀并分析pS2和组织蛋白酶D的ERE序列。

图4A-D.MUC1增加ERα占据并共激活了ERaα-介导的转录激活。图4A.将MCF-7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA-A细胞用100nM E2处理1小时。将可溶性染色质用抗-MUC1-C免疫沉淀并分析pS2和组织蛋白酶D的ERE序列。图4B.将MCF-7/MUC1siRNA-A(空心柱)和MCF-7/CsiRNA(实心柱)用500ng ERE-tk-Luc((Chen等，1999)、内部对照LacZ表达质粒(pCMV-LacZ)和标明的量的ERα表达质粒转染。转染18小时后，让细胞不受处理或用100nM E2刺激24小时。根据使用LacZ所获得的荧光酶活性来使荧光酶活性标准化，并表示为与泳道2中用图4的E2-刺激的MCF-7/MUC1siRNA细胞所获得的值(空心柱，标准化为1)相比较的相对荧光酶活性(3个独立试验的平均值±SD)。图4C.将ZR-75-1/载体和ZR-75-1/MUC1siRNA细胞用100nME2处理1小时。可溶性染色质用抗-MUC1-C免疫沉淀并分析pS2和组织蛋白酶D的ERE序列。图4D.如B中描述MCF-7细胞的，用ERE-tk-Luc、pCMV-LacZ和标明的ERα转染ZR-75-1/MUC1siRNA(空心柱)和ZR-75-1/载体(实心柱)，用E2刺激并分析荧光酶活性。

图5A-D.MUC1稳定ERα。图5A.将来自标明的MCF-7(左侧)和ZR-75-1(右侧)细胞的细胞溶解物用抗-ERα、抗-MUC1-C和抗-β-肌动蛋白进行免疫印迹。WT：野生型细胞。图5B和C.将标明的MCF-7(左侧)和ZR-75-1(右侧)细胞用5mM MG132处理24小时。将细胞溶解物用标明的抗体进行免疫印迹。图5B.将抗-ERα免疫沉淀物通过使用抗-Ub或抗-ERα的免疫印迹进行分析。图5C和D.将MCF-7/CsiRNA(n)和MCF-7/MUC1siRNA(o)用[³⁵S]-甲硫氨酸脉冲处理，洗涤并在存在10nM E2时孵育标明的时间。用抗-ERα免疫沉淀细胞溶解物并通过SDS-PAGE和放射自显影法分析沉淀物。将更高的量的MCF-7/MUC1siRNA细胞溶解物用于免疫沉淀法来增加ERα信号。将不接受免疫沉淀法的细胞溶解物用抗-β-肌动蛋白进行免疫印迹。通过光密度扫描测定的信号强度表示为随时间过去剩余的ERα相对于在0小时时的对照的百分比。

图6A-E.MUC1共激活ERα-介导的基因转录。图6A和C.将来自标明的保持未经处理、用100nM E2处理1小时或用1mM TAM处理1小时的细胞的可溶性染色质用抗-SRC-1或抗-GRIP1免疫沉淀，并且分析pS2(左侧)和组织蛋白酶D(右侧)基因启动子序列。图6B和D.将MCF-7/MUC1siRNA-A(图6B；空心柱)、MCF-7/CsiRNA(图6B；实心柱)、ZR-75-1/MUC1siRNA(图6D；空心柱)和ZR-75-1/载体(图6D；实心柱)细胞用500ng ERE-tk-Luc和10ng pCMV-LacZ转染。转染18小时后，让细胞保持未受处理或在缺少或存在1mM TAM时用100nM E2刺激24小时。相对的荧光酶活性表示为与用E2-刺激的MUC1-阴性细胞获得的活性(空心柱，标准化为1)比较的3个独立试验的平均值±SD。图6E.将标明的细胞保持未受处理、用100nM E2或1mM TAM处理24小时。用标明的抗体对细胞溶解物进行免疫印迹。

图7A-D.MUC1削弱抗-雌激素-诱导的存活率降低。图7A.将MCF-7细胞在补充有10％FBS和渐增浓度的TAM(0.05-1mM)的DMEM培养基中生长12个月。用标明的抗体对细胞溶解物进行免疫印迹。图7B.将来自标明的MCF-7细胞的可溶性染色质用抗-MUC1-C或抗-ERα进行免疫沉淀，并且分析pS2(左侧)和组织蛋白酶D(右侧)的启动子序列。图7C和D.让标明的细胞在37℃下在含有2ml/孔无酚红培养基的6-孔板(500/孔)中生长24小时，该培养基补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS。然后将细胞在存在100nM E2、1mM TAM或100nM ICI时培养10天。用结晶紫染色细胞集落并手动计数。结果表示为与用未经处理的细胞所获得的集落比较的百分比集落形成(3个独立试验的平均值±SD)。

图8.描述提出的MUC1和ERα之间的相互作用的示意图。

发明详述

A.MUC1和ER之间的相互作用

MUC1由大多数人乳腺癌异常过度表达(Kufe等，1984)。MUC1-N亚基连接至细胞膜上的MUC1-C。MUC1-C也在胞质溶胶中积聚并被靶向至细胞核或线粒体(Li等，2003a；Li等，2003b；Li等，2003c；Ren等，2004；Wen等，2003)。本发明证明了MUC1-C与ER结合并证明了MUC1和ERα的结合在组成上是可检测的并在响应E2刺激时增加。结果进一步证明，MUC1与ERα转录复合物在雌激素-应答pS2和组织蛋白酶D基因的启动子上存在。MUC1多肽，例如胞质结构域中的氨基酸9-46，直接结合至ERα DBD并增加了ERα占据雌激素-效应启动子。

在缺少和存在配体时，ERα都通过泛素-蛋白酶体途径降解(Lonard等，2000；Nawaz等，1999；Reid等，2003)。而且，E3连接酶和蛋白酶体的亚基的募集使雌激素效应启动子上的ERα循环周转(Reid等，2003)。当前的结果证明MUC1通过削弱其泛素化和降解来稳定ERα。因而，与稳定沉默MUC1表达后的ERα水平比较，MCF-7和ZR-75-1细胞中的ERα水平要高很多。ERα占据pS2和组织蛋白酶D启动子也通过MUC1-依赖机制得以增加，这与通过泛素-蛋白酶体途径的效应基因上的ERα的周转降低一致。E3连接酶Mdm2和E6AP募集至pS2启动子并因而可以有助于无配体结合的和有配体结合的ERα的泛素化(Reid 2003)。本发明人相信，本发明提供了直接与ERα相互作用并有助于ERα稳定化的蛋白质的第一个根据。

本发明证明MUC1表达与抗-雌激素抗性相关联。TAM与E2竞争结合至ERα并诱导ERα AF2结构域的构象变化，该变化阻断了p160共激活因子的募集(Brzozowski等，1997；Halachmi等，1994)。结果证明，MUC1削弱了TAM-诱导的ERα转录复合物中的SRC-1和GRIP1的减少。与这些发现一致，MUC1也削弱了TAM-诱导的ERα-介导的转录的阻遏。TAM诱导核基质蛋白/骨架附着因子HET/SAF-B结合至ERα DBD并因而抑制了ERα-介导的转录激活(Oesterreich等，2000)。因而，MUC1结合至ERα DBD可以干扰TAM-诱导的ERα和HET/SAF-B之间的相互作用。已经将其它机制与对TAM作用的抗性相关联。共激活因子的上调作用和/或辅阻遏物的下调作用可以有助于用TAM处理的细胞中的ERα激活(Smith等，1997；Webb等，1998)。ERα中的某些突变也可以有助于在存在TAM时ERα激活(Zhang等，1997)。其它研究已经表明，ErbB受体信号传导途径的激活以及因此的ERαAF1结构域的磷酸化可以赋予TAM抗性(Benz等，1993；Kurokawa等，2000；Nicholson等，2001)。在这一点上，MUC1作为EGFR和ErbB2的共同受体(coreceptor)起作用(Li等，2001b；Li等，2003c；Schroeder等，2001)；因而，本结果没有排除这样的可能性：除了直接结合至ERα DBD，MUC1也可通过ErbB信号传导途径而有助于TAM抗性。该结果进一步表明，MUC1可以阻断TAM-诱导的乳腺癌细胞死亡。在两种细胞类型中，TAM对凋萎的诱导都具有有限的效果(～10％或更少)(数据未显示)。因此进行集落测定法(Colony assay)作为对MUC1影响TAM-诱导的死亡的更有力测量。与证明MUC1削弱了TAM对募集p160共激活剂和ERα-介导的转录的影响一致，MUC1表达与TAM-诱导的集落存活率降低的削弱相关。MUC1也削弱了ICI-诱导的ERα的周转和ICI-诱导的细胞死亡。这些发现表明，MUC1赋予了抗-雌激素抗性。虽然不受任何特别的理论束缚，图8提供了提出的MUC1与ERα相互作用的示意图。

由MUC1赋予的ERα的稳定性因此可有助于～90％的过度表达MUC1的人乳腺癌的生长刺激和存活。大多数患有ERα-阳性转移性乳腺癌的患者对抗-雌激素不起反应，或者产生对抗-雌激素治疗的抗性，使得该失败成为乳腺癌治疗的主要障碍。本发明提供了在多数人乳腺癌中发现的MUC1过度表达可有助于对抗抗-雌激素的首次证据。这些发现提供了用于发展克服这种抗-雌激素治疗失败的潜在机制的策略的基础。

因此，本发明提供了筛选候选化合物调节MUC1和ER之间相互作用的能力的方法。抑制MUC1/ER相互作用的这些制剂将预防或减少MUC1-依赖性的抗-雌激素抗性。这种制剂可用于治疗已产生抗-雌激素抗性的个体，可在预防上用于预防或减少这种抗性的产生或相反增强对抗-雌激素治疗的应答性。

B.激素疗法

大多数晚期乳腺癌(ABC)患者的基本治疗选择是在细胞毒性化学疗法和内分泌疗法之间。对于患有激素-受体-阳性乳腺癌的患者，内分泌疗法是优选的疗法。化学疗法导致肿瘤退化比内分泌疗法更快，然而内分泌疗法的优势是其提供了抗肿瘤活性而没有与细胞毒性化学疗法相关的导致生活质量显著降的有害的不利事件。

对内分泌疗法起反应的最重要的指标是肿瘤中存在雌激素受体(ER)和孕酮受体(PgR)。虽然内分泌疗法在大约30％的未经选择的患者中产生应答，但在ER-阳性和/或PgR-阳性患者中，已观察到应答率＞80％(Buzdar & Hortobágyi 1998；Ravdin等，1992)。

自20世纪70年代以来，它莫西芬已成为最普遍使用的用于绝经后转移性乳腺癌的首要治疗的激素药剂。它莫西芬是一种选择性的ER调节剂(SERM)，其竞争性地抑制雌激素结合ER(Jordan & Dowse 1976)，并且这样一来，干扰了一系列的调节细胞复制的细胞机制。由它莫西芬引起的干扰改变了应答组织中的生长因子谱并导致细胞保持在细胞周期的G₁期(Osborne等，1983；Colletti等，1989)。这引起肿瘤细胞增殖和细胞死亡的改变，细胞增殖和细胞死亡的平衡导致观察到的抗肿瘤应答(Cameron等，2000；Cameron等，2001)和总的存活率提高(Yao & Jordan 1998)。

ER和PgR的表达水平已显示与对它莫西芬的总应答相关联。绝经后的患者具有比她们绝经前更高水平的ER和PgR表达。对于具有高的ER和PgR表达水平的那些患者，总应答率高达70％(Ravdin等，1992；Buzdar等，1998)。已经显示它莫西芬比垂体摘除术和氨鲁米特更好的耐受并显示提供了与垂体摘除术和氨鲁米特等效的效果(Kiang等，1980)，同时优于标准剂量的孕激素治疗(Muss等，1988)。结果，疾病复发和对它莫西芬治疗的抗性在许多患者中产生。由本发明提供的化合物可用于预防或治疗需要该治疗的患者中的抗-雌激素治疗。

ICI 182,780是一种高度特异性的ER拮抗剂，其以商品名称Falsodex销售(Howell等，2000)。ICI 182,780用于治疗ER-依赖性肿瘤。

C.MUC1蛋白和多肽。

“全长”的MUC1蛋白显示出可变数量的串联重复并因此可以大小不同。因此，SEQ ID NO：1的1255个氨基酸序列表示具有一定范围序列长度的蛋白质，例如GenBank A35175[gi：11385307](1344个氨基酸残基)和A35887[gi：107111](1335个氨基酸残基)。

已经描述了许多MUC1剪接变体，包括保留跨膜结构域的几种变体。SEQ ID NO：2表示等价于“全长”MUC1(SEQ ID NO：1)的残基¹M至⁵³A和¹⁰⁵⁴F至¹²⁵⁵L的255个氨基酸序列。该序列已被称为MUC1/Y(Zirhan-Licht等，1994；GenBank S48146[gi：1085342])。SEQ ID NO：3表示等价于SEQ ID NO：1的¹M至⁵³A和¹⁰³⁶L至¹²⁵⁵L的273个氨基酸序列。已将该序列称为MUC1/Z(Oosterkamp等，1997；GenBankAAD10858[gi：4204967])和MUC1/X(Baruch 1997)。SEQ ID NO：4表示等价于SEQ ID NO：1的¹M至⁴⁶P和¹⁰⁶²S至¹²⁵⁵L的240个氨基酸序列。该序列已被称为MUC1/V(W09603502)。SEQ ID NO：5表示等价于SEQID NO：1的¹M至⁵³A、17个氨基酸的序列IPAPTTTKSCRETFLKW，以及SEQ ID NO：1的¹⁰⁹⁶P至¹²⁵⁵L的230个氨基酸序列。SEQ ID NO：5表示的该序列已被称为MUC1/X(GenBank AAD10856[gi：4204963])。为本发明的目的，术语“MUC1”一般适用于所有含跨膜结构域和胞质结构域(CD)的MUC1变体。

SEQ ID NO：6表示CD的72个氨基酸。SEQ ID NO：7表示CD的结合至ER DNA结合结构域的30个氨基酸片段。本发明的实施方案包括含有MUC1 CD片段的氨基酸序列，其中这种片段可具有从SEQ ID NO：6的氨基末端删除的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续氨基酸，其中该片段可具有从SEQ ID NO：6的羧基末端上删除的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸。因此，SEQ ID NO：7表示这样的片段：在该片段中8个连续氨基酸从SEQ ID NO：6的氨基末端上删除并且26个连续氨基酸从SEQ ID NO：6的羧基端删除。

本发明中使用的多肽或肽可通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准的分子生物学技术表达、从天然源分离多肽，或化学合成多肽。多种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列在先前已经公开，并且可在本领域一般技术人员已知的计算机化数据库中找到。一个这样的数据库是National Center for BiotechnologyInformation’s Genbank and GenPept databases(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这些已知基因的编码区可用在此公开的技术或本领域一般技术人员应该已知的技术扩增和/或表达。

备选地，蛋白质、多肽和肽的多种商业制备是本领域技术人员已知的。MUC1 CD片段结合ER的能力可如本说明书整篇一般性描述的进行，并更特别是如实施例3中举例说明的进行。

D.雌激素受体

雌激素的生物学作用是通过结合至两种特异性雌激素受体(ER)ERα或ERβ之一来介导，ERα或ERβ属于细胞核受体(NR)超家族，该超家族为配体-调节的转录因子家族(Pettersson & Gustafsson，2001)。配体-结合诱导受体的构象改变，导致二聚化、蛋白质-DNA相互作用、共调节蛋白质和其他转录因子的募集，以及最终形成起始前复合物(Rachez & Freedman，2001)。ER通过结合至它们的关联效应元件或通过与其他转录因子的蛋白质-蛋白质相互作用调节基因表达(Paech，1997)。

ERα和ERβ含有代表NR家族成员的进化保守的结构和功能结构域，包括参与DNA-结合、二聚化、配体结合以及转录激活的结构域(Nilsson等，2001)。ERα和ERβ在它们的DNA-结合结构域(DBD)内具有高度的序列同一性。P-box(DBD内对受体-DNA识别和特异性关键的基序)的氨基酸序列在这两种受体间是相同的。因此，这两种受体都以类似的特异性和亲和力结合雌激素效应元件(ERE)，尽管已经描述了对一亚组天然ERE的差别亚型亲和力和应答(Klinge等，2001)。配体-结合结构域(LBD)也是保守的，并且这两种受体都显示出对内源性雌激素17β-雌二醇(E2)相似的亲和力。然而，已经报导ERα和ERβ显示出不同的对一些天然化合物和新的亚型-特异性配体的亲和力(Kuiper等，1998；Sun等，1999)。鉴定缺乏ERα或ERβ或两者的小鼠已经证实，每种亚型在体内雌激素作用中具有相似而且唯一的作用。两种ER在整个身体中广泛分布，在各种组织中显示出不同的但重叠的表达模式(Pettersson & Gustafsson，2001；Couse & Korach，1999)。

NR DBD由具有两个不对称的锌指的高度保守的核心区和～30个氨基酸片段(称为C-端延伸(CTE))组成。在该核心DBD中，α-螺旋1在这两个锌指之间延伸并在效应元件的大沟中发生碱基特异性接触。第二条α-螺旋(螺旋2)不接触DNA，但对核心DBD的总体的折叠是重要的(Schwabe 1993)。所述CTE是不保守的并且根据细胞核受体的类型采用不同的结构基序(Khorasanizadeh & Rastinejad 2001；Senkus & Edwards 1996)。可是，不同受体的CTE似乎具有共同的功能性作用来通过扩大蛋白质-DNA接触面超过由核DBD产生的碱基-特异性接触面来稳定受体-DNA复合物。

ERα和ERβ的转录激活功能由两个单独的但不互相排斥的转录激活功能(AF)：非N-端配体-依赖性的激活功能(AF-1)，和位于LBD内的C-端配体-依赖性的激活功能(AF-2)介导，AF使得该受体能刺激雌激素-调节基因的转录(Nilsson等，2001)。AF有助于雌激素-介导的转录并介导细胞-和启动子-特异性。比较这两种ER的AF-1结构域已经显示，在多种雌激素反应启动子上的ERα中该结构域非常活跃，但在相同的条件下，在ERβ中AF-1的活性最小(Barkhem等，1998)。这两种受体也显示出对合成的雌激素拮抗剂它莫西芬和雷洛昔芬不同的应答。例如，这些配体是ERα的部分ER激动剂，但作为ERβ的纯的ER拮抗剂(Barkhem等，1998)。

ERα和ERβ是不同染色体上的不同基因的产物。ERα位于染色体位点6q25.1(Menasce等，1993)上，而ERβ发现处于位置14q22-24(Enmark等，1997)。

已经描述了几种ERα和ERβ剪接变体。人ERα mRNA转录物的产生是一个复杂的过程，涉及至少7个不同的启动子并显示出细胞系-依赖的启动子使用。大多数ERα变体仅在5’UTR中不同并导致全长66-kDa型的ERα表达(Reid等，2002)。然而，Flouriot及其同事已经确定了一种更短的46-kDa的ERα亚型，其由内部的ATG起始密码子产生(Flouriot等，2000)。这种更短的46-kDa的hERα亚型缺少外显子1并因而缺少N-端AF-1区(Flouriot等，2000)。该亚型存在于人成骨细胞和乳腺癌细胞系MCF-7中，并与野生型ERα异二聚化，从而抑制其AF-1-依赖性转录活性。

已报导了几种备选的ERβ剪接变体，一些具有延伸的N-末端，其他在C-端LBD中具有平截和/或插入(Enmark等，1997)。许多这些亚型的表达水平在人乳腺组织中比野生型ERβ的表达水平高，并且有数据支持几种ERβ亚型的蛋白质表达(Fuqua等，1999；Saji等，2002)。雌激素受体ERβ cx蛋白在ERα-阳性乳腺癌中的表达与孕酮受体特异性相关联(Saji等，2002)。初始的ERβ克隆编码485个氨基酸的蛋白质(Mosselman 1996)，然而，额外的N-端序列的克隆延伸了N-端，产生了530个氨基酸的蛋白质(Xux等，2003)。这些蛋白质称为ERβ1 long(530aa)和ERβ1 short(485aa)，并且ERβ1 long型目前被认为是全长的野生型ERβ。

ERα的595个氨基酸序列提供为SEQ ID NO：8。DBD(核心区和CTE两者)由氨基酸180至287表示，它的序列提供为SEQ ID NO：9。全长的530个氨基酸的野生型ERβ提供为SEQ ID NO：10。DBD(核心区和CTE两者)由氨基酸142至251表示，它的序列提供为SEQ ID NO：11。ERα和ERβ的核苷酸序列分别在GenBank登记号NM000125和NM001437处，将两者在这里通过引入作为参考。

本发明的实施方案包括含有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的多肽序列，这些序列包括足以结合至MUC1 CD多肽或其有效片段的SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：10及其片段。

E.筛选方法

1.结合测定法

本发明提供了用于鉴定调节，并且优选抑制MUC1与ER(包括ERα和ERβ)相互作用的化合物的方法。结合是在含有有效用于结合至ER的CD序列或其片段，例如由SEQ ID NO：6表示的序列和合适的片段如SEQ ID NO：7的MUC1多肽之间。

在一个实施方案中，筛选方法采用体外竞争性结合测定，其中测定试验化合物抑制含有MUC1 CD衍生序列的多肽的结合的能力，所述MUC1 CD衍生序列足以结合所提供的多肽，所述提供的多肽含有足以结合含MUC1 CD衍生序列的多肽的ERα DBD序列或ERβ DBD序列。在这样一种测定中，含有MUC1 CD衍生序列的所述多肽可含有SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7。本发明的MUC1和ER多肽，例如含有MUC1 CD衍生序列的多肽可缀合至另一蛋白质或作为融合蛋白(例如在这里例举的GST-MUC1 CD和Myc-MUC1 CD融合蛋白)产生。其他合适的缀合物和融合蛋白可由本领域技术人员利用本领域已知的方法制备。含有ER或MUC1 CD序列的多肽可用放射性同位素或荧光标记(例如藻胆蛋白，如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红)来标记。备选地，可使用酶(例如过氧化物酶)并通过生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素系统直接或间接缀合。这种多肽可固定在合适的固定相上，例如多孔平板的表面、微珠或柱填充物上。经合适标记的多肽可通过本领域通常已知的方法测量。与合适的对照比较，在引入试验化合物时结合减少表明该制剂抑制或减少MUC1 CD结合至ER。含MUC CD衍生序列的多肽或含ERα DBD序列或ERβ DBD序列的多肽上的表位的特异性合适抗体也可用于适合的结合测定。因此，可适宜使用本领域普遍已知的合适的ELISA测定法。体外筛选测定还可以进一步包括有效量的17β-雌二醇(E2)。

2.计算机筛选

筛选MUC1 CD与ER结合的小分子拮抗剂可通过计算机分析进行。术语“计算机”指用计算机实施的任何方法或步骤。术语“计算机分析”指在计算机上实施的任意类型的分子相互作用的测定或分析，例如计算机分析包括计算机筛选、高通量计算机筛选、计算机结合、计算机对接、计算机亲和力测定、计算机分子模拟、计算机退火、计算机先导物鉴定、计算机先导物优化、计算机ADMET等。

通过使结合位点的构象变体聚类来计算机分析小分子与蛋白质结合位点的结合在美国专利申请案2004/0015299中公开，在这里通过将它的全文引入作为参考。用于产生虚拟组合库的方法和用于计算机对接的方法在美国专利No.6,253,168中公开，通过它的全文引入作为参考。计算机方法包括产生一组MUC1 CD ER结合区的构象变体并用聚类算法使该组内形成多个相关构象变体的簇，以及从所述多个簇的每个中选择代表性的结构。

构象变体组从经验数据获得，例如从晶体结构、NMR结构，或者从其他根据经验-确定的数据获得。该方法将包括使用聚类算法，其可基于环绕类似划分(partitioning around medoids)；或使用“模糊”或系统聚类法。计算机分析可利用计算机筛选、计算机对接、计算机先导物发现和计算机先导物优化。例如，计算机分析可以包括筛选对抗分子的多种配体。该方法包括评估多种配体对靶分子的活性(例如，结合活性、对接活性等)。

小分子配体与MUC1 CD ER结合位点的相互作用可用一个或多个现有的分子对接程序研究。这样的程序的实例包括，但不限制于：AMBER(www.amber.ucsf.edu/amber/amber.html-)、AMMP(http://www.cs.gsu.edu/.about.cscrwh/ammp/ammp.html)、CHARMM(www.yuri.harvard.edu/)、Dalton Quantum Chemistry Program(www.kjemi.uio.no/software/dalton/dalton.html)、Deep Viewer(www.expasy.cbr.nrc.ca/spdbv/)、FTDock(www.bmm.icnet.uk/dockin-g/)、TINKER(www.dasher.wustl.edu/tinker/)等。MUC1 CD结合位点描述作为一个固定结构处理，可商业获得的对接程序相对该固定结构执行其函数，旨在测定所给定配体和所给定蛋白质之间相互作用的性质。

本发明的一方面提供了产生计算机可读数据库的方法，所述数据库包含MUC1胞质结构域的ER结合口袋的三维分子结构坐标，所述方法包括：a)从所述MUC1胞质结构域的晶体中获得定义所述蛋白质的所述结合口袋的三维结构坐标；和b)将所述结构坐标输入计算机中以产生含所述结合口袋的分子结构坐标的数据库。

本发明的其他实施方案提供了产生计算机可读数据库的方法，所述数据库含有能结合MUC1胞质结构域的ER结合位点的化合物的三维分子结构坐标，所述的方法包括：a)向计算机程序输入一个计算机可读数据库；b)在所述的计算机程序中产生所述MUC1胞质结构域的活性位点或结合口袋的三维示意图；c)在所述的活性位点或结合口袋的示意图上叠合至少一个结合的试验化合物的三维模型；d)评估所述试验化合物模型是否在空间上能匹配进所述MUC1胞质结构域的结合口袋中。

另外的实施方案包括用于确定化合物是否结合MUC1胞质结构域的方法，该方法包括：a)给计算机模拟程序提供分子的一组结构坐标或三维构象，所述分子含有晶体MUC1胞质结构域的结合口袋；b)给所述的计算机模拟程序提供化学个体的一组结构坐标；c)用所述的计算机模拟程序评价所述化学个体和所述结合口袋之间的可能的结合或干扰相互作用；以及d)确定所述化学个体是否可能结合或干扰所述的MUC1胞质结构域。

实施方案还包括产生计算机可读数据库的方法，所述数据库包含能结合MUC1胞质结构域的结合口袋的化合物的描述，所述方法包括：a)向计算机程序导入计算机可读数据库；b)确定与所述结合口袋相互作用的化学部分；c)计算机筛选多种化合物以确定哪种化合物含有所述的部分作为所述化合物的亚结构；以及d)将含有所述亚结构的所述化合物的描述存储进计算机可读数据库中。

如在前面的实施方案中使用的，术语“MUC1胞质结构域”包括含有能够结合至雌激素受体DNA结合结构域的胞质结构域序列或其片段的MUC1蛋白质或其片段，而且还包括能结合至雌激素受体DNA结合结构域的分离的MUC1胞质结构域序列或其片段。

3.间接测定法

评价作为MUC1 CD和ER结合的拮抗剂的小分子也可通过评价MUC1与ER结合导致的下游效应来进行。该测定法可适宜在无细胞系统或细胞系统中进行。用于测量的合适参数包括ER稳定性、ER与ERE结合以及雌激素-应答基因的激活。该测定法也可用作用于通过结合测定法或计算机分析确定的配体的确证测定。

E.抗体

术语“抗体”以最广范的意义使用并特别是涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们显示出期望的生物活性。

用于产生多克隆抗体的方法是本领域熟知的。简而言之，多克隆抗体通过用免疫源性组合物免疫动物并从该受免疫动物中收集抗血清制备。许多动物类型可用于产生抗血清，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和山羊。经免疫动物的血清可按原状用于多种用途，或者期望的抗体片段可通过熟知的方法纯化，例如通过使用结合至固相的另一抗体或肽的亲合色谱法纯化。

单克隆抗体(MAb)可容易地通过使用熟知的技术制备，例如在美国专利4,196,265中举例说明的那些技术，在这里通过将该专利引入作为参考。典型地，该技术涉及用选择的免疫源组合物，例如经纯化或部分纯化表达的多肽免疫合适的动物。将该免疫源性组合物以有效刺激抗体产生细胞的方式施用，其可包括，但不限于施用MUC1-CD衍生的肽或表达MUC1-CD的转基因细胞。

用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常按照与用于制备多克隆抗体的那些方法相同的方法开始。使用大鼠可提供某些有利条件(Goding，1986)，但小鼠是优选的，因为BALB/c小鼠是最常规使用的并且通常产生更高比率的稳定融合。人抗体可如美国专利No.6,075,181和美国专利No.6,150,584描述的从经免疫的xenomice制备，将这两个专利在这里通过引入作为参考。

在免疫后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，尤其是B淋巴细胞(B细胞)用于产生MAb的方法。这些细胞可从活检的脾、扁桃体或淋巴结获得，或从外周血样获得。脾细胞和外周血细胞是优选的。通常，将免疫一组动物并移出具有最高抗体滴定度的动物的脾用于从该脾获得淋巴细胞。

然后将来自经免疫动物的抗体-产生B淋巴细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞的细胞(通常为与被免疫动物相同的物种的其中一种)融合。适合用于杂交瘤-产生融合过程的骨髓瘤细胞系优选是非抗体产生的，具有高的融合效力，并具有酶缺陷，该酶缺陷使得它们不能够在只支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中生长。将选择的杂交瘤连续稀释并克隆进单独的抗体-产生细胞系中，其随后可无限增殖以提供MAb。

根据本发明，本发明的单克隆抗体的片段可以通过包括用酶例如胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶消化和/或通过化学还原裂解二硫键的方法，从如上描述产生的单克隆抗体获得。备选地，本发明包含的单克隆抗体片段可用自动化合成仪合成，或通过在大肠杆菌或其他重组微生物和细胞系中表达全长基因或基因片段获得。

本发明还包括多种抗体缀合物。经标记的缀合物可用于多种筛选和诊断用途，例如流式细胞计量术、免疫组织化学和免疫-定量方法如ELISA方法。用于适用于筛选和诊断用途的标记形式的本发明抗体的标记包括可直接检测到的部分，例如荧光染料和放射标记，以及必须经反应或衍生而被检测到的部分，例如酶。这些标记的实例是³²P、¹²⁵I、³H、¹⁴C、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰(dansyl)、伞形酮、荧光素(luciferia)、2，3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。抗体可根据已知方法用这些标记物标记。例如，偶联剂如醛、碳化二亚胺、二马来酰亚胺(dimaleimide)、酰胺(imidate)、琥珀酰亚胺、双偶氮联苯胺等可用于用上面描述的荧光标记、化学发光标记和酶标记来标记抗体。抗体也可用磁珠标记用于磁分选方案。

具有放射性核素的缀合物还可用于制备治疗性抗体。可用于该缀合物的放射性核素包括¹³¹I、⁹⁰Y、¹⁰⁵Rh、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、²¹²Bi、²¹¹At、¹⁸⁸Re、¹⁰⁹Pd、⁴⁷Sc、²¹²Pb和¹⁵³Sm等，如Gansow，1991中描述的，将其在这里通过引入作为参考。也可以将本发明的治疗性抗体偶联至常规的化学治疗剂例如抗代谢剂、蒽环类抗生素、长春花生物碱、抗菌素或烷化剂。可偶联至用于靶向的抗体的药物包括化合物例如阿霉素(doxorubicin)、环磷酰胺、顺铂、阿霉素(adriamycin)、雌氮芥、氟尿嘧啶、乙炔雌二醇、米托蒽醌、甲氨蝶呤、非那司提、紫杉酚和甲地孕酮。偶联方法可以是通过共价键直接偶联，或通过连接分子间接偶联，并且通常将是关于所选择的特殊药物的领域中已知的，并且用多种双官能蛋白偶联剂完成。这种试剂的实例是SPDP、IT、亚氨酸酯的双官能衍生物如二甲基己二亚酰胺化物HCl、活化酯如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)、醛如戊二醛、双叠氮基(bisazido)化合物如双(R-叠氮基苯甲酰)己二胺、双重氮(bisdiazonium)衍生物如双(R-重氮基苯甲酰)乙二胺、二异氰酸盐(diisocyanate)如苯亚甲基2，6-二异氰酸盐(tolylene2，6-diisocyanate)，以及双-活性氟化合物(bis-active fluorinecompound)如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。(参见，Thorpe等，1982，将其在这里通过引入作为参考)。

本发明的单链FV’或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽连接物，该连接物使sFv能形成期望的结构用于抗原结合(参见Pluckthun，1994)。

G.MUC1-CD与ER结合的拮抗剂

本发明的方面包括MUC1-CD与ER结合的拮抗剂。这种拮抗剂包括通过在此公开的筛选方法确定的化合物。拮抗剂还包括结合至MUC1-CD和ER-DBD的相应位点的抗体，所述MUC1-CD和ER-DBD包含这两种肽之间结合的各自的结合位点。因此，合适的MUC1-CD多肽片段包含SEQ ID NO：7和在此公开的其他这种片段。其他拮抗剂包括含有MUC1-CD与ER结合的各自的结合位点的多肽。这种肽可与野生型配体适当竞争。因此，可适宜使用MUC1-CD片段例如SEQ ID NO：7和在此公开的其他片段。竞争性肽也可包含合适的MUC1-CD片段或ER-DBD片段和内化的肽序列，即增加相应的MUC1-CD片段或ER-DBD片段的跨膜运输的肽。合适的内化肽可适宜含有至少一部分触角蛋白(Antennapedia protein)或其同系物(Derossi等，1994；Console等，2003；Pescarolo等，2001)、HIV转录激活蛋白(TAT)(Wender等，2000；Futaki等，2001)、促生长激素神经肽或黄蜂毒素嵌合(chimera)序列(Pooga等，1998；Soomets等，2000)，或其他合适的内化序列。

H.制剂和治疗

可以将调节MUC1和ER结合的化合物制备成多种常规的药物制剂并通过任意一种常规使用的药物施用途径，包括经口、静脉内、动脉内、肠胃外或腹膜内途径，施用给需要治疗的癌症患者。

对于经口施用，本发明的组合物可例如用惰性稀释剂或用可同化的可食用载体制备，或包装于硬壳胶囊或软壳胶囊中，或压缩成片剂，或直接与膳食食物混合。对于经口的治疗性施用，可将活性化合物与赋形剂混合并以可吸收的片剂、含片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式施用。当然，这种组合物和制剂可以不同并且可便利地为约2％至约60％的单位重量之间。这种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是将获得合适剂量的量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以包含下列物质：粘合剂，黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸氢钙；崩解剂例如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及可加入甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精或增香剂例如薄荷、冬青油或樱桃香料。当剂量单位是指胶囊时，除了上述类型的物质，它还可含有液体载体。多种其他的物质可以表现为包衣或用以修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可用虫胶、糖或两者包被。糖浆剂或酏剂可在活性化合物中含有蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和香料，例如樱桃或橙香料。当然，用于制备剂量单位形式的任何物质应该在药学上是纯的并且使用的量是基本无毒的。此外，可将其他化学治疗化合物掺入缓释制备物和制剂中。

对于含有寡核苷酸的制剂，可将胶态分散系统用作递送载体用以增强所述寡核苷酸的体内稳定性和/或将该寡核苷酸靶向至特殊的器官、组织或细胞类型。胶态分散系统包括(但不限于)大分子复合物、毫微型胶囊、微球、珠和基于脂质的系统包括水包油型乳剂、胶束、混合微胶粒、脂质体和未表征结构的脂质：寡核苷酸复合物。

适合可注射施用的本发明组合物的药物制剂包括无菌含水溶液剂或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。在所有情形中，所述形式必须是无菌的，并且应该是达到每种可注射性存在的程度的流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须进行防腐对抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含溶剂或分散介质的载体，例如通过利用包被物如卵磷脂、在分散的情形中通过保持所需的粒子大小，以及通过使用表面活化剂。对微生物作用的预防可通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情形中，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射用组合物的延长吸收可通过在该组合物中使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

无菌可注射用溶液剂通过这样制备：将所需量的本发明组合物与上面列举的多种其它成分一起合并进合适的溶剂中，根据需要，之后过滤灭菌。通常，分散剂通过将多种灭菌的活性成分合并进无菌载体制备，所述载体含有基本的分散介质和所需的来自上面列举的那些的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术产生活性物质加上任何来自其事先无菌-过滤的溶液的额外所需成分的粉末。

如在此使用的，“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或制剂外，考虑将它们用于治疗性组合物中。辅助性的活性成分也可合并进该组合物中。

可适合用本发明方法治疗的肿瘤是雌激素敏感性的那些肿瘤。在典型的实施方案中，肿瘤是乳腺肿瘤。

用本发明化合物的治疗可在抗-雌激素治疗(例如它莫西芬)之前、之后，或与其相伴使用。

I.与化学治疗剂组合

本发明包括将本发明的化合物与抗-雌激素化合物组合使用外，还与化学治疗剂组合使用。在这一方面，本发明的组合物将可用于治疗抗化学治疗剂的癌细胞，包括在癌症化学治疗后剩余或复发的残余癌。前述的意思还关于将本发明的组合物与电离辐射组合。

可用于本发明方法中的化学治疗剂包括已知在杀死和/或抑制癌细胞生长中有活性的所有组合物和化合物。通过作用机制分组的化学治疗剂包括DNA-相互作用剂、抗代谢剂、微管蛋白相互作用剂、抗激素剂、抗病毒剂、ODC抑制剂和其他细胞毒素例如羟基脲。任意的这些制剂适合用于本发明方法中。本发明组合物也可与HER-2的抗体，例如曲妥单抗(Herceptin(H))组合使用。另外，本发明还包括将本发明化合物与表皮生长因子受体-相互作用剂例如酪氨酸激酶抑制剂一起使用。酪氨酸激酶抑制剂适宜包括伊马替尼(Norvartis)、OSI-774(OSI Pharmaceuticals)、ZD-1839(AstraZeneca)、SU-101(Sugen)和CP-701(Cephalon)。

当在本发明的治疗方法中使用时，考虑可将选择的化学治疗剂便利地用于目前可商业获得的任何制剂中，并且以低于或在批准的用于单剂使用的标明用量范围内的量使用。

J.与电离辐射组合

在本发明中，术语“电离辐射”表示包括粒子或光子的辐射，所述粒子或光子具有足够的能量或可通过核相互作用产生足够的能量用于产生电离(得到或失去电子)。一种示例性的且优选的电离辐射是X射线。用于递送X射线至靶组织或细胞的方法是本领域熟知的。给定细胞所需要的电离辐射量通常取决于那种细胞的性质。用于确定辐射的有效量的方法是本领域熟知的。在此使用的，术语电离辐射的“有效量”表示在与本发明的SPX多肽联合使用，任选进一步与化学治疗剂组合时，产生细胞损伤或死亡的电离辐射的剂量。

X射线的剂量范围从长的时间周期(3至4周)的50-200伦琴的日剂量，到2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型，以及赘生细胞的吸收。

除了外部施用手段，用于递送辐射至组织的任何合适的方法可用于本发明。例如，可通过首先提供与肿瘤抗原发生免疫反应的放射标记的抗体，之后递送有效量的放射标记的抗体至肿瘤来递送辐射。此外，放射性同位素可用于递送电离辐射至组织或细胞。

实施例

实施例1：试验步骤

细胞培养.让MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞和COS-1细胞在Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中生长，所述培养基具有10％热灭活胎牛血清(HI-FBS)、100mg/ml的链霉素、100单位/ml青霉素和2mM L-谷酰胺。将人ZR-75-1乳腺癌细胞和用对照逆转录病毒载体稳定感染的那些细胞(ZR-75-1/载体)或用表达MUC1siRNA的载体稳定感染的那些细胞(ZR-75-1/MUC1siRNA)(Ren等，2004)在RPMI 1640培养基中培养，所述培养基补充有10％HI-FBS、100mg/ml链霉素、100单位/ml的青霉素和2mM L-谷氨酰胺。在用E2(Sigma，St.Louis，MO)、TAM(Sigma)、MG132(Peptides InternationalInc.)或ICI182,780(ICI；Tocris，Washington，DC)处理之前，让细胞在补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS的无酚红培养基中生长3天。

免疫共沉淀和免疫印迹将如所描述的从亚汇合细胞制备的细胞溶解物(Wei等，2003)接受使用抗-ERα(D-12；Santa CruzBiotechnology)、抗-Myc(Ab-1；Oncogene Research Products)或抗-PCNA(F-2；Santa Cruz Biotechnology)的免疫沉淀。免疫印迹分析用抗-MUC1-C(Ab-5；NeoMarkers)、抗ERα、抗-β-肌动蛋白(Sigma)、抗-Ub(Santa Cruz Biotechnology)、抗-SRC-1、抗-GRIP1(Upstate Biotechnology Inc.)、抗-pS2(Santa CruzBiotechnology)、抗-组织蛋白酶D(E-7；Santa Cruz Biotechnology)或抗-PCNA进行。免疫复合物用增强化学发光(ECL；PerkinElmer LifeSciences)检测。

质粒构建和转染。将从作为模板的pIRESpuro2-MUC1(Li等，2001b)制备的PCR产物克隆进pCMV-Myc(Invitrogen)中以产生Myc-MUC1-CD。也将该PCR产物用BamHI/NotI消化并克隆进pGEX-4T-3的相应位点以产生GST-MUC1-CD。通过用pcDNA3.1-ERα(Shao等，2002)作为模板的PCR并将产物克隆进pcDNA3.1(Invitrogen)的BamHI和XhoI位点产生表达ERα的载体。用于免疫共沉淀研究的瞬时转染用Fugene-6(Roche Applied Science)在60-mm的碟中进行。将MDA-MB-231细胞用pIRESpuro2或pIRESpuro2-MUC1转染并在存在嘌呤霉素(Calbiochem Novabiochem)时选择。将单细胞克隆通过有限稀释分离并扩展用于分析。

GST沉降试验(GST pull-down assay)。将ERα在体外转录/翻译(TNT)反应(Promega)中用³⁵S标记，并将其在4℃下与经纯化的GST或GST-MUC1-CD融合蛋白一同孵育2小时。洗涤后，将吸附的蛋白质用SDS-PAGE解析并通过磷光成像(Molecular Dynamics)检测。

报告物测定法。用磷酸钙方法(Invitrogen)将生长于无酚红培养基中的MCF-7和ZR-75-1细胞用ERE-tk-Luc(Shao等，2002)和ERα转染，所述培养基补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS。在转染18小时后，用E2或TAM处理细胞24小时并用荧光素酶活性测定系统(Promega)检测细胞的荧光素酶活性。根据使用对照LacZ载体(pCMV-LacZ)的转染率，将荧光素酶活性标准化(Wei等，2001)。

染色质免疫沉淀(ChIP)。ChIP测定如所描述的进行(Shang等，2000)。对于Re-ChIP测定，将来自初次的ChIP的复合物在37℃下用10mM DTT洗脱30分钟，以1∶30稀释于1％20mM Tris-HCl，pH8.1、Triton X-100、2mM EDTA、150mM NaCl中，并用抗-ERα、抗-SRC-1(1135；Upstate Biotechnology Inc)或抗-GRIP1(CT；Upstate Biotechnology Inc)抗体再次免疫沉淀。对于PCR，用来自50ml DNA萃取物的2ml，进行25-35循环的扩增。

脉冲-追踪试验。将细胞用无甲硫氨酸培养基洗涤两次，并随后在37℃下于含50mCi/ml [³⁵S]-甲硫氨酸(New England Nuclear)的无甲硫氨酸培养基中孵育60分钟。然后洗涤细胞并将其在含10％活性炭-葡聚糖处理过的FBS和10nM E2的培养基中培养。在追踪过程中的不同时间点，收获细胞并用抗-ERα免疫沉淀细胞溶解物。通过SDS-PAGE和放射自显影法分析沉淀物。

集落形成测定。在37℃下，让500细胞/孔的等分试样在含有2ml/孔的无酚红培养基的6-孔板中生长24小时，该培养基补充有10％的活性炭-葡聚糖处理过的FBS。用100nM E2、1mM TAM或100nM ICI处理细胞10天。用结晶紫染色产生的集落并手动计数。

实施例2：MUC1与ERα结合

研究人MCF-7乳腺癌细胞以确定MUC1是否与ERα相互作用。在MCF-7和其他细胞类型中，MUC1C-端亚基(MUC1-C)可以表达为～20-25kDa的蛋白质，并且在较小程度上可以表达为～17-12kDa的片段。用与MUC1胞质结构域(MUC1-CD)反应的抗体对抗-ERα免疫沉淀物进行的免疫印迹分析证明ERα与MUC1-C共沉淀(图1A)。作为对照，在用IgG制备的沉淀物中不存在可检测的MUC1-C(图1A)。该结果也证明ERα和MUC1-C之间的结合通过17β-雌二醇(E2)刺激增强(图1A)。用ZR-75-1乳腺癌细胞进行的类似研究证实ERα与MUC1-C结合，并证实该结合受E2刺激(图1B)。与在用抗-ERα免疫沉淀细胞溶解物后获得的MUC1信号比较，从全部细胞溶解产物获得的MUC1信号的光密度扫描表明：在对照和E2-刺激的MCF-7细胞中分别是总MUC1-C的～3和5％与ERα结合。在ZR-75-1细胞中，在没有和存在E2时分别是总MUC1-C的～4和6％与ERα结合。作为对照，用对抗增殖细胞核抗原(PCNA)的抗体免疫沉淀细胞溶解产物。在来自MCF-7或ZR-75-1细胞的抗-PCNA沉淀物中不存在可检测到的MUC1-C。为了确定负责相互作用的MUC1-C的区域，将Myc-标记的MUC1胞质结构域(Myc-MUC1-CD)在COS-1细胞中与ERα共表达。用抗-MUC1-CD对抗-ERα沉淀物的免疫印迹分析证明MUC1-CD足以与ERα结合(图1C)。而且，用E2刺激COS-1细胞增强了ERα和Myc-MUC1-CD的结合(图1C)。该结合在其中抗-Myc免疫沉淀物用抗-ERα进行免疫印迹的互易试验(reciprocal experiment)中得以证实(图1D)。这些发现表明MUC1组成性地结合ERα，并表明这种相互作用在响应E2时增强。

实施例3：MUC1-CD直接结合至ERα

为了确定负责相互作用的MUC1-CD的区域(72个氨基酸)和ERα的区域(595个氨基酸)(图2A)，将GST或GST-MUC1-CD融合蛋白在体外与³⁵S-标记的ERα孵育。分析谷胱甘肽珠上的吸附物证明全长的ERα(1-595)结合至GST-MUC1-CD而不是GST(图2B)。相反，没有可检测到的MUC1-CD与含AF1结构域的ERα(1-185)结合(图2B)。而且，证明MUC1-CD结合至ERα(1-282)表明涉及DNA结合结构域(DBD)(图2B)。与这些结果一致，发现MUC1-CD与ERα(185-595)结合，但不与缺少DBD的ERα(282-595)或ERα(Δ186-281)结合(图2B)。为了定位MUC1-CD内与ERα相互作用的区域，将³⁵S-标记的全长ERα与MUC1-CD的缺失型突变体孵育。结果证明ERα结合至全长的MUC1-CD和MUC1-CD(1-51)两者，说明MUC1-CD的N-端区域足以用于相互作用(图2C)。与那些结果一致，MUC1-CD氨基酸9-46的缺失破坏了与ERα的结合(图2C)。还比较了在没有和存在E2时的体外结合。结果显示了MUC1-CD与全长ERα的结合的E2-依赖性增强(图2D)。比较而言，TAM对MUC1-CD-ERα复合物的形成没有显著作用(图2D)。这些发现表明MUC1-CD(9-46)直接结合至ERα DBD，并表明该相互作用受E2刺激。

实施例4：MUC1占据雌激素-应答基因启动子

为了确定MUC1是否存在于ERα转录复合物中，我们用抗-MUC1-C实施染色质免疫沉淀(ChIP)测定。pS2基因的启动子中的雌激素效应区(ERE)(-353至-30)的免疫沉淀(Giamarchi等，1999)通过半定量的PCR分析。在MCF-7和ZR-75-1细胞两者中，MUC1占据pS2启动子在缺少E2时是可检测的并且通过E2刺激而增强(图3A)。作为对照，在用IgG实施的免疫沉淀中没有可检测的pS2启动子序列(图3A)。也没有可检测的与ERE上游的pS2启动子的控制区(CR；-2446至-2125)结合的MUC1(图3A)。进一步分析染色质免疫沉淀物的组织蛋白酶D基因启动子的雌激素-效应区(-295至-54)(Augereau等，1994)。与用pS2启动子发现的一样，在MCF-7细胞中MUC1占据组织蛋白酶D启动子是组成上可检测的并且通过E2刺激而增强(图3B)。比较而言，在组织蛋白酶D启动子的控制区(CR；-4346至-4105)中MUC1占据是不可检测的(图3B)。在ZR-75-1细胞中获得类似的结果(图3B)。为了评估MUC1与ERα占据pS2启动子，将抗-MUC1复合物释放，用抗-ERα再次免疫沉淀并随后通过PCR分析(Re-ChIP)。如在MCF-7和ZR-75-1两种细胞中显示的，抗-ERα使pS2启动子在从抗-MUC1释放后沉淀，表明MUC1存在于由ERα转录复合物占据的区域中(图3C)。该结果也证明组织蛋白酶D启动子在从抗-MUC1释放后经抗ERα免疫沉淀(图3D)。与E2刺激ERα和MUC1结合这一论证一致，Re-ChIP测定进一步显示E2暴露增加了pS2启动子和组织蛋白酶D启动子上的ERα和MUC1的复合物(图3C和D)。MUC1占据ERE的动力学也通过在E2刺激的不同时间间隔实施ChIP评估。类似ERα，MUC1对pS2和组织蛋白酶D的ERE的占据增加可在15至30分钟的E2暴露时检测到(图3E)。此外，MUC1和ERα两者的最大占据在细胞经E2刺激1至3小时时观察到(图3E)。值得注意的并如先前显示的(Metivier等，2003；Metivier等，2002；Reid等，2003；Shang等，2000)，在没有E2刺激时ERα以较低但可检测到的水平占据pS2和组织蛋白酶D的ERE(图3E)。为了确定MUC1占据ERE是否依赖于ERα，将MUC1阴性并表达较低水平ERα的人MDA-MB-231乳腺癌细胞稳定转染以表达空载体或MUC1。MDA-MB-231/MUC1转染子以与ZR-75-1细胞中相当的水平表达MUC1。也瞬时转染MDA-MB-231/载体和MDA-MB-231/MUC1细胞以表达ERα。值得注意地是，与MCF-7细胞比较，MUC1对pS2和组织蛋白酶D的ERE的占据在MDA-MB-231/MUC1细胞中显著减少。而且，MUC1对pS2和组织蛋白酶D的ERE的占据通过ERα转染显著增加。这些发现表明：i)MUC1是ERα转录复合物的成分，ii)E2刺激与雌激素-效应启动子上ERα和MUC1两者的占据增加相关，以及iii)MUC1占据ERE依赖于ERα。

实施例5：MUC1共激活ERα-介导的转录

为了评估MUC1对ERα功能的影响，用表达MUC1siRNA的逆转录病毒稳定感染MCF-7细胞。对两种独立分离的克隆的免疫印迹分析证明，与表达对照siRNA(CsiRNA)的细胞比较，在MCF-7/MUC1siRNA-A和MCF-7/MUC1siRNA-B细胞中分别部分(～80-90％)和完全下调了MUC1。对MCF-7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA-A细胞实施的ChIP测定显示，ERα对pS2启动子的占据通过降低MUC1表达而减少。正如期望的，E2刺激与ERα对pS2启动子的占据增加相关，但是，该响应在MCF-7/MUC1siRNA细胞中受到削弱。在分析组织蛋白酶D启动子时观察到类似的MUC1效应。为了评估MUC1对ERα-介导的转录的影响，将MCF-7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA-A细胞用ERE-tk-Luc报告基因转染并随后用E2刺激。在没有E2刺激时，MUC1表达与激活ERE启动子的相关即使有也没多少。比较而言，ERE-tk-Luc的MUC1-依赖性激活在用E2刺激该细胞时增强了～5倍。在MCF-7细胞用不同量的ERα载体转染时，观察到ERα-介导的转录的MUC1-依赖性刺激进一步增强。为了确定MUC1是否在ZR-75-1细胞中显示出类似的作用，我们使用ZR-75-1/载体和ZR-75-1/MUC1siRNA细胞(Ren等，2004)。在缺少和存在E2刺激这两种情形中，在ZR-75-1细胞中降低MUC1表达都减少了ERα对pS2启动子的占据。在分析组织蛋白D ERE时获得类似的结果。在ZR-75-1细胞中降低MUC1也降低了E2-介导的ERE-tk-Luc报告基因的激活。这些发现表明MUC1增加ERα对雌激素效应启动子的占据，并共激活了ERα-介导的转录。

实施例6：MUC1稳定ERα

MUC1的下调削弱了ERα对ERE的占据这一发现促使我们去了解MUC1是否影响ERα表达。因而，比较了MCF-7、MCF-7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA细胞中的ERα水平。结果证明降低MUC1与ERα表达减少相关联(图5A，左侧)。在表达MUC1siRNA的ZR-75-1细胞中观察到类似的ERα水平减少(图5A，右侧)。RT-PCR分析证明ERαmRNA水平在存在和缺少MUC1时是相似的(数据未显示)，表明MUC1通过翻译后机制调节ERα。在这一点上，ERα蛋白质的稳定性通过泛素化和蛋白酶体降解控制(Lonard等，2000；Nawaz等，1999；Reid等，2003)。因此，评估了MCF-7和ZR-75-1细胞响应蛋白酶体抑制剂MG132时的ERα水平。蛋白酶体的抑制与ERα表达增加相关，并且该效应在沉默了MUC1的细胞中更显著(图5B)。用抗-泛素(Ub)对抗-ERα沉淀物进行免疫印迹分析进一步显示，MCF-7细胞中MUC1的下调与ERα的泛素化增强相关联(图5C，左侧)。在ZR-75-1细胞中获得了类似的结果(图5C，右侧)。为了进一步评估MUC1对ERα稳定性的影响，将细胞用[³⁵S]-甲硫氨酸脉冲处理并在追踪阶段于不同的时间间隔免疫沉淀ERα。通过用放射自显影法分析ERα显示，在MCF-7细胞(图5D)和ZR-75-1细胞(补充的图S4A)中，ERα的半衰期在不存在MUC1时都减小。雌激素拮抗剂ICI182,780(ICI)靶向ERα至蛋白酶体(Dauvois等，1992；Reid等，2003)。与MUC1在稳定ERα中的作用一致，ICI-诱导的ERα下调在存在MUC1时受到削弱(补充的图S4B)。这些发现表明MUC1通过阻断ERα的泛素化和蛋白酶体降解来稳定ERα。

实施例7：MUC1刺激转录共激活因子在雌激素-效应启动子上的占据并削弱TAM的作用。

为了确定ERα的MUC1-依赖性稳定是否影响了转录共激活因子的募集，我们探究了MUC1是否与p160家族成员SRC-1和GRIP-1一同占据ERE。在实施于MCF-7细胞上的Re-ChIP测定中，释放抗-MUC1免疫沉淀物并用抗-SRC-1再次沉淀证实了，SRC-1存在于pS2和组织蛋白酶D启动子两者上的MUC1复合物中。当在来自ZR-75-1细胞的可溶性染色质上实施Re-ChIP测定时获得了类似的结果(补充的图S5A)同样，在这两种细胞中，MUC1和SRC-1的启动子复合物受E2刺激增加。Re-ChIP测定的结果进一步显示MUC1与pS2和组织蛋白酶D启动子上的GRIP1结合(补充的图S5B)。为了进一步评估MUC1对共激活因子占据E2-效应启动子的影响，对MCF-7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA-A细胞实施了ChIP测定。在没有和存在E2刺激这两种情形中，SRC-1对pS2和组织蛋白酶D启动子的占据在MUC1-阳性细胞中更加明显(图6A)。关于GRIP1占据获得了类似的结果(图6A)。此外，TAM在实质上对MUC1表达下调的MCF-7细胞中减少SRC1/GRIP1占据pS2和组织蛋白酶D启动子来说更有效(图6A)。因此，我们探求MUC1是否削弱了TAM对ERα-介导的转录的影响。与MCF-7/MUC1siRNA细胞中的相比，在MCF-7/CsiRNA细胞中TAM对E2-诱导的转录的下调受到削弱(图6B)。在ZR-75-1细胞中，TAM-诱导的SRC-1/GRIP1对pS2和组织蛋白酶D启动子占据的减少同样受MUC1表达而削弱(图6C)。此外，与ZR-75-1/MUC1siRNA细胞中的相比，在ZR-75-1/载体细胞中TAM对E2-诱导的转录的下调受到削弱(图6D)。与这些结果一致，在MCF-7和ZR-75-1这两种细胞中，E2对pS2和组织蛋白酶D表达的刺激通过MUC1的下调而削弱(图6E)。这些结果表明MUC1加强了对E2的响应并对抗TAM对雌激素-效应启动子的抑制作用。

实施例8：MUC1削弱抗-雌激素-诱导的存活率降低

为了确定MUC1是否与TAM抗性相关联，我们将MCF-7细胞暴露于浓度渐增的TAM下12个月。在3-6个月内几乎没有观察到MUC1的变化；然而，在9和12个月的TAM暴露时检测到MUC1表达显著增强(图7A)。与MUC1在稳定ERα中的作用一致，MUC1水平增加与ERα上调相关(图7A)。分析pS2和组织蛋白酶D启动子的ERE进一步显示，TAM抗性与MUC1和ERα两者的占据增加都相关(图7B)。为了直接评估MUC1是否影响乳腺癌细胞对TAM-诱导的死亡的敏感性，将MCF7/CsiRNA和MCF-7/MUC1siRNA-A细胞暴露于TAM并通过集落形成监测存活率。TAM减少了MCF-7/MUC1siRNA细胞的存活率高于60％(图7C)。比较而言，在缺少或存在E2时TAM-处理的MCF-7/CsiRNA细胞的存活率显著更高(图7C)。在MCF-7细胞暴露于ICI时，降低MUC1表达也降低了存活率(图7C)。用ZR-75-1/载体和ZR-75-1/MUC1siRNA细胞获得的类似结果(图7D)为MUC1参与保护MCF-7和ZR-75-1乳腺癌细胞对抗抗-雌激素-诱导的存活率降低提供了进一步支持。

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根据本公开内容，可以产生和执行所有在此公开和要求的组合物和方法而不需要过多的实验。虽然本发明的组合物和方法是根据优选的实施方案来描述，本领域的那些技术人员将理解可以对所述的组合物和方法进行改变，以及在在此描述的方法的步骤或步骤的顺序中进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别是，应该理解在化学和生理学两者上都相关的某些试剂可以替代在此描述的试剂，而将获得相同或类似的结果。对本领域技术人员明显的所有类似的取代和修饰被认为是在如附带的权利要求书定义的本发明的范围内。

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序列表

<110>KUFE，DONALD W.

<120>Muc1-依赖性的抗-雌激素抗性的调节

<130>GENU：002WO

<140>PCT/US2006/020383

<141>2006-05-26

<150>60/685,052

<151>2005-05-26

<160>12

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1344

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

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<210>2

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<212>PRT

<213>智人

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Cys Tyr Glu Val Gly Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys

210 215 220

Gly Tyr Arg Leu Val Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu Gln Leu His

225 230 235 240

Cys Ala Gly Lys Ala Lys Arg Ser Gly Gly His Ala Pro Arg Val Arg

245 250 255

Glu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Ser Pro Glu Gln Leu Val Leu Thr Leu

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Pro Pro His Val Leu Ile Ser Arg Pro Ser Ala Pro

275 280 285

Phe Thr Glu Ala Ser Met Met Met Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asp Lys

290 295 300

Glu Leu Val His Met Ile Ser Trp Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val

305 310 315 320

Glu Leu Ser Leu Phe Asp Gln Val Arg Leu Leu Glu Ser Cys Trp Met

325 330 335

Glu Val Leu Met Met Gly Leu Met Trp Arg Ser Ile Asp His Pro Gly

340 345 350

Lys Leu Ile Phe Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Arg Asp Glu Gly Lys

355 360 365

Cys Val Glu Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Thr

370 375 380

Ser Arg Phe Arg Glu Leu Lys Leu Gln His Lys Glu Tyr Leu Cys Val

385 390 395 400

Lys Ala Met Ile Leu Leu Asn Ser Ser Met Tyr Pro Leu Val Thr Ala

405 410 415

Thr Gln Asp Ala Asp Ser Ser Arg Lys Leu Ala His Leu Leu Asn Ala

420 425 430

Val Thr Asp Ala Leu Val Trp Val Ile Ala Lys Ser Gly Ile Ser Ser

435 440 445

Gln Gln Gln Ser Met Arg Leu Ala Asn Leu Leu Met Leu Leu Ser His

450 455 460

Val Arg His Ala Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Leu Asn Met Lys

465 470 475 480

Cys Lys Asn Val Val Pro Val Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asn

485 490 495

Ala His Val Leu Arg Gly Cys Lys Ser Ser Ile Thr Gly Ser Glu Cys

500 505 510

Ser Pro Ala Glu Asp Ser Lys Ser Lys Glu Gly Ser Gln Asn Pro Gln

515 520 525

Ser Gln

530

<210>11

<211>110

<212>PRT

<213>智人

<400>11

Ser Lys Arg Asp Ala His Phe Cys Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser

1 5 10 15

Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Arg Glu Gly Cys Lys Ala Phe

20 25 30

Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Cys Pro Ala Thr Asn

35 40 45

Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg

50 55 60

Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg

65 70 75 80

Glu Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Val Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu

85 90 95

Gln Leu His Cys Ala Gly Lys Ala Lys Arg Ser Gly Gly His

100 105 110

<210>12

<211>17

<212>PRT

<213>智人

<400>12

Ile Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Cys Arg Glu Thr Phe Leu Lys

1 5 10 15

Trp

Claims

1.一种就调节MUC1胞质结构域多肽与雌激素受体结合的效力来筛选化合物的方法，该方法包括：

提供能结合ER DNA结合结构域的含有SEQ ID NO 7或其片段的第一种多肽；

提供能结合MUC1 CD的含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或其片段的第二种多肽；

提供候选化合物；

定量所述第一种多肽和所述第二种多肽之间的结合；并且

将所述第一种多肽和所述第二种多肽之间的结合的所述定量结果与合适的对照比较。

2.权利要求1的方法，其中所述的第二种多肽含有SEQ ID NO：9或其片段，其中所述片段能结合至MUC1 CD。

3.权利要求1的方法，其中所述的第二种多肽含有SEQ ID NO：11或其片段，其中所述片段能结合至MUC1 CD。

4.权利要求1的方法，其中通过连接至固定相而将所述的第一种多肽固定化。

5.权利要求1的方法，其中通过连接至固定相而将所述的第二种多肽固定化。

6.权利要求1的方法，其中所述的第一种多肽进一步含有荧光标记、放射标记或发色团。

7.权利要求1的方法，其中所述的第二种多肽进一步含有荧光标记、放射标记或发色团。

8.权利要求1的方法，其中所述的第一种多肽是融合蛋白。

9.权利要求1的方法，其中所述的第二种多肽是融合蛋白。

10.权利要求1的方法，该方法进一步包括提供足以增加所述第一种多肽和所述第二种多肽的结合的量的17β-雌二醇。

11.一种筛选特异性结合MUC1胞质结构域多肽的化合物的方法，所述多肽含有能结合雌激素受体DNA结合结构域的SEQ ID NO 7或其片段，所述方法包括：a)在合适的条件下将所述多肽与至少一种试验化合物混合，和b)检测该试验化合物与该多肽的结合，从而鉴定特异性结合所述多肽的化合物。

12.一种用于筛选有效预防或抑制抗雌激素抗性的化合物的方法，该方法包括鉴定减少MCU1胞质结构域与雌激素受体结合的化合物。