KR20200138741A - 면역 세포에서 발현되는 막-결합 항-사이토카인 비-신호전달 결합제를 이용한 인간 사이토카인의 중화 - Google Patents

면역 세포에서 발현되는 막-결합 항-사이토카인 비-신호전달 결합제를 이용한 인간 사이토카인의 중화 Download PDF

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홍 지 아드리안 탄
다리오 캄파나
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내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

형질전환 T 세포 및 형질전환 T 세포를 제조하기 위한 벡터가 개시되어 있다. 벡터는 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있고, 형질전환 T 세포는 mb-aIL6을 발현할 수 있다. 형질전환 T 세포는 IL-6 의존성 세포의 증식을 억제하고 IL-6 농도를 감소시키는데 유용하거나 이들 둘 모두에 유용하다. 하나의 실시형태에서, 벡터는 mb-aIL6 및 항-CD19-41BB-CD3ζ 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 이시스트론성 구조체이다. 다른 실시형태에서, 항-IL-6 scFv는 41BB 및 CD3ζ 도메인에 연결되어 항-IL-6 CAR을 형성할 수 있다. 상기 구조체를 발현하는 형질전환 T 세포는 CAR T 세포로 치료되는 암 환자에서의 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 위험성 또는 사이토카인이 병인과 관련이 있는 자가면역 질병 및 염증성 질병 치료의 위험성을 감소시킬 수 있다.

Description

면역 세포에서 발현되는 막-결합 항-사이토카인 비-신호전달 결합제를 이용한 인간 사이토카인의 중화
관련 출원
본 출원은 2018년 4월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/651,311호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 교시 전체는 본원에서 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 내의 재료에 대한 참고를 통한 포함
본 출원에는 이와 함께 제출된 하기 ASCII 텍스트 파일에 포함되어 있는 서열 목록이 참고로 포함된다:
a) 파일명: 2019년 3월 29일자로 33 KB의 크기로 생성된 44591149001SequenceListing.txt.
인터류킨-6(IL-6)은 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 및 이식편대숙주 질병(GvHD)을 비롯한 다발성 자가면역 및 염증성 질병의 병인(pathogenesis)과 관련이 있는 전염증성 사이토카인이다.
또한 IL-6은 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 리디렉팅(redirecting)되는 T 세포의 가장 흔한 주입 부작용들 중 하나인 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 발달과 관련이 있다. CRS는 심각할 수 있으며, 일부 경우에 치명적일 수 있다. IL-6은 CRS의 발달에 핵심이며, 항-IL-6 수용체 항체(토실리주맙(tocilizumab))는 현재 이의 효과를 억제하기 위해 사용된다.
자가면역 질병 및 CRS의 중증도 및 발생률을 감소시키기 위한 방법이 바람직하다.
본원에는 핵산, 벡터, 및 형질전환 숙주 세포 및 이들을 제조 및 이용하는 방법이 개시되어 있다. 핵산은 숙주 세포에서 핵산을 발현하기 위해 사용될 수 있는 벡터 내로 혼입될 수 있다. 형질전환 숙주 세포는 IL-6과 같은 사이토카인의 농도를 감소시키는 방법에서 숙주 포유동물(예를 들어, 인간)에 도입(예를 들어, 주입, 임플란팅(implanting), 이식, 주사)될 수 있다. 핵산은 IL-6과 같은 사이토카인의 농도를 감소시키는 방법에서 숙주 포유동물(예를 들어, 인간)에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 막-결합 항-사이토카인 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함한다. 막-결합 항-사이토카인은 항-사이토카인 단일쇄 가변 절편(항-사이토카인 scFv) 및 항-사이토카인 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 항-사이토카인 scFv는 항-사이토카인 가변 경쇄 도메인, 항-사이토카인 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함할 수 있다. 항-사이토카인 구조체는 IL-6(예를 들어, 항-IL-6), (TNF)-α(예를 들어, 항-TNF-α), IL-1β(예를 들어, 항-IL-1β), IL-12(예를 들어, 항-IL-12), IL-17(예를 들어, 항-IL-17), IL-18(예를 들어, 항-IL-18), IFNγ(예를 들어, 항-IFNγ) 등과 같은 매우 다양한 사이토카인에 대해 특이적일 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산은 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화한다. mb-aIL6은 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv)을 포함할 수 있다. 항-IL6 scFv는 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함할 수 있다. 힌지 및 막관통 도메인은 항-IL6 scFv에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터의 핵산은 항-CD19-41BB-CD3ζ와 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 암호화할 수 있다.
본원에 기술되어 있는 벡터는 형질전환 T 세포와 같은 형질전환 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 형질전환 T 세포는 IL-6 의존성 세포의 증식을 억제하거나, IL-6 농도를 감소시키기 위해 사용될 수 있거나, 이들 둘 모두에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질전환 T 세포는 (예를 들어, 암에 대해) 치료되는 포유동물과 같은 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 위험도 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 이용하여 치료(예를 들어, 암에 대해 치료) 중이다. 일례로, 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포를 이용하여 암에 대해 치료 중인 환자가 있다.
또한, 형질전환 T 세포는 사이토카인이 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 림프구 증식성 질환과 같은 병인과 관련이 있는 질병 또는 질환을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역 질병의 예로는 류머티스성 관절염 및 전신 홍반성 루푸스를 들 수 있다. 염증성 질병의 예로는 이식편대숙주 질병 및 혈구 포식성 림프조직구 증식증(hemophagocytic lymphohistiocytosis)을 들 수 있다. 림프구 증식성 질환의 일례는 캐슬맨(Castleman) 질병이다.
상기는, 상이한 도면 전반에서 동일한 도면 부호는 동일한 부품을 지칭하는 첨부된 도면에 나타나 있는 바와 같이, 예시적인 실시형태에 대한 보다 구체적인 하기 설명으로부터 자명하게 될 것이다. 도면은 반드시 비율이 맞게 나타낸 것은 아니지만, 대신에 설명되는 실시형태를 강조하고 있다.
도 1a 내지 도 1d는 mb-aIL6의 설계 및 발현에 관한 것이다. 도 1a는 mb-aIL6 구조체의 도식이다. 도 1b는 MSCV-mb-aIL6-IRES-GFP 플라스미드의 도식이다. 도 1c는 GFP 단독("모의(mock)") 또는 GFP 및 mb-aIL6과 함께 형질 도입된 저캇 세포(Jurkat cell)의 유세포 분석이다. 점 도표에는 비오틴-접합된 염소 항-인간 F(ab')2 항체 및 스트렙타비딘-APC(잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories))으로 염색한 이후의 GFP 형광 및 mb-aIL6 발현이 나타나 있다. 도 1d는 모의- 또는 mb-aIL6-형질 도입된 저캇 세포에 대한 IL-6 결합의 유세포 분석이다. 점 도표에는 IL-6 비오틴(압캠(Abcam)) 및 스트렙타비딘-APC로 염색한 이후의 GFP 형광 및 IL-6 결합이 나타나 있다. 대두-트립신 억제제(STI)-비오틴은 대조군으로서 사용되었다.
도 2a 내지 도 2e는 mb-aIL6 구조체의 기능성에 관한 것이다. 도 2a는 IL-6의 수준을 보여주는 차트이다. GFP 단독("모의") 또는 GFP 및 mb-aIL6과 함께 형질 도입된 저캇 세포(2 x 106개/㎖)를 1 ng/㎖의 인간 IL-6을 함유하는 조직 배양 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 배양이 끝날 무렵에 ELISA에 의해 IL-6의 수준을 측정하였다. 도 2b는 IL-6 중화가 세포 투여량 의존적임을 보여주는 그래프이다. 상이한 세포 농도를 시험하고(0.25 내지 2 x 106개/㎖), 2시간의 배양 이후에 ELISA에 의해 상층액 중의 IL-6의 수준을 측정하였다. 도 2c는 IL-6 중화가 시간 의존적임을 보여주는 그래프이다. 도 2a에 대해 기술되어 있는 바와 같이 배양액을 준비하고, 표시된 배양 시간 이후에 상층액 중의 IL-6의 수준을 측정하였다. 세포를 10분, 30분, 60분 및 120분 동안 배양하였다. 파선 곡선은 맞춤형 지수 감소 곡선을 나타낸다. 도 2d는 mb-aIL6 저캇 세포가 낮은 IL-6 농도에서 여전히 효과적임을 보여주는 차트이다. 도 2a에 대해 기술되어 있는 바와 같이 배양액을 준비하지만, 조직 배양 배지 중의 IL-6의 초기 농도는 0.025 ng/㎖ 내지 0.2 ng/㎖ 범위이고, 저캇 세포는 0.5 x 106개/㎖이었다. 도 2e는 저캇-mb-aIL6 세포의 증식을 허용함으로써 IL-6 중화가 증대된다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 2a에 대해 기술되어 있는 바와 같이 배양액을 준비하지만, 초기 세포 농도는 0.2 x 106개의 세포/㎖이며; 2시간 내지 72시간 이후에 ELISA에 의해 상층액 중의 IL-6을 측정하였다.
도 3a 및 도 3b는 mb-aIL6을 발현하는 세포가 IL-6 의존성 신호 형질 도입 및 세포 증식을 제거한다는 것을 보여준다. 도 3a는 IL-6에 의해 촉발되는 U937 세포 내에서의 Stat3 인산화가 mb-aIL6 저캇 세포에 대한 노출에 의해 방지된다는 것을 보여주는 차트이다. 형질 도입되지 않거나("WT") GFP 및 mb-aIL6과 함께 형질 도입된 저캇 세포(2 x 106개/㎖)를 1 ng/㎖의 인간 IL-6을 함유하는 조직 배양 배지에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 상층액을 37℃에서 15분 동안 U937 세포에 첨가하였다. IL-6가 존재하거나 존재하지 않는 조직 배양 배지("T 세포 부재")를 대조군으로서 사용하였다. 바(bar)는 항-PhosphoStat3 항체(BD 바이오사이언스(BD Biosciences) 항-Stat3 pY705)를 이용한 염색 이후에 유세포 분석법으로 측정할 때 Stat3 인산화의 평균(± SD)을 나타낸다. *** P < 0.001. 도 3b는 DS-1 세포의 IL-6 의존성 증식이 mb-aIL6 저캇 세포에 대한 노출에 의해 억제된다는 것을 보여주는 그래프이다. mCherry로 형질 도입된 DS-1 및 모의-형질 도입 또는 mb-IL6-형질 도입된 저캇 세포를 IL-6(0.5 ng/㎖)과 함께 1:1 비율로 동시 배양하였다. 인큐사이트 라이브 이미지화 시스템(IncuCyte Live Imaging System; 에센(Essen))을 이용하여 DS-1 증식을 정량화하고; 결과는 3회 측정치에 대해 적색 보정 단위(RCU) x μm2/웰의 평균(± SD)으로서 나타나 있다. ** 120시간에서의 측정치에 대한 P < 0.01.
도 4a 내지 도 4d는 말초 혈액 T 세포 상에서의 mb-aIL6 구조체의 발현 및 기능성을 보여준다. 도 4a는 GFP 단독("모의") 또는 GFP 및 mb-aIL6과 함께 형질 도입된 말초 혈액 T 세포의 유세포 분석이다. 점 도표에는 비오틴-접합된 염소 항-인간 F(ab')2 항체 및 스트렙타비딘-APC로 염색한 이후의 GFP 형광 및 mb-aIL6 발현이 나타나 있다. 도 4b는 모의- 또는 mb-aIL6-형질 도입된 말초 혈액 T 세포에 대한 IL-6 결합의 유세포 분석이다. 점 도표에는 IL-6 비오틴 및 스트렙타비딘-APC로 염색한 이후의 GFP 형광 및 IL-6 결합이 나타나 있다. 도 4c는 항-CD3 APC, 항-CD56 PE, 항-CD4 V450 및 항-CD8 PerCP(BD 바이오사이언스)로 표시된, 모의- 또는 mb-aIL6-형질 도입된 말초 혈액 T 세포의 세포 마커 프로파일이다. 도 4d는 DS-1 세포의 IL-6 의존성 증식이 mb-aIL6 T 림프구에 대한 노출에 의해 억제된다는 것을 보여주는 그래프이다. mCherry로 형질 도입된 DS-1 및 모의-형질 도입 또는 mb-IL6-형질 도입된 T 세포를 IL-6(0.5 ng/㎖)과 함께 1:1 비율로 동시 배양하였다. 인큐사이트 라이브 이미지화 시스템(에센)을 이용하여 DS-1 증식을 정량화하고; 결과는 3회 측정치에 대해 적색 보정 단위(RCU) x μm2/웰의 평균(± SD)으로서 나타나 있다. ** 120시간에서의 측정치에 대한 P < 0.01.
도 5a 내지 도 5c는 mb-aIL6 및 항-CD19 CAR을 암호화하는 이시스트론성 구조체(bicistronic construct)의 설계, 발현, 및 IL-6 중화 능력을 보여준다. 도 5a는 2개의 수용체("DUAL") 모두를 함유하는 MSCV 플라스미드의 도식이다. 도 5b는 GFP 단독(모의), GFP 및 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR인 mb-aIL6 함께 또는 이들 둘 모두로 형질 도입된 말초 혈액 T 세포의 유세포 분석이다. 점 도표에는 비오틴-접합된 염소 항-인간 F(ab')2 항체 및 스트렙타비딘-APC로 염색한 이후의 mb-aIL6 발현 및 CD19-myc로 염색한 후 R-피코에리트린(R-phycoerythrin; PE)-접합된 항-myc(셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology))로 염색한 이후의 항-CD19 CAR 발현을 보여준다. 도 5c는 mb-aIL6 T 림프구에 의한 IL-6의 중화가 CAR 동시 발현에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 5b에 대해 기술되어 있는 바와 같이 형질 도입된 T 림프구를 1 ng/㎖의 IL-6을 함유하는 조직 배양 배지에서 배양하였다. 2시간 후, ELISA에 의해 상층액에서 IL-6을 측정하였다.
도 6a 내지 도 6d는 mb-aIL6의 발현이 항-CD19 CAR 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 도 6a는 1:1의 E:T 비율로 6시간 동안 CD19+ ALL 세포주 OP-1과 함께 동시 배양된 T 세포에서의 IFN-γ 생성을 보여주는 도표이다. IFNγ의 발현은 PE-접합된 항-인간 IFNγ 항체(BD 바이오사이언스)에 의한 염색 이후에 유세포 분석법으로 측정하였다. 기호는 3명의 기증자에서 유래한 T 세포를 이용하여 수득된 3회의 실험 결과를 나타낸다. 도 6b는 1:1의 E:T 비율로 4시간 동안 OP-1과 함께 동시 배양된 T 세포에서의 CD107a 발현을 보여주는 도표이다. CD107a 발현은 PE-접합된 항-인간 CD107a 항체(BD 바이오사이언스)에 의한 염색 이후에 유세포 분석법으로 측정하였다. 도 6c는 1:1의 E:T 비율로 4시간 이후에 OP-1에 대한 T 세포의 세포 독성을 보여주는 도표이다. 도 6d는 조사된 OP-1의 존재 또는 부재 시에 120 IU/㎖의 IL-2와 함께 1:1의 E:T 비율로 21일 동안 동시 배양된 T 세포의 증식을 보여주는 2개의 차트이다. 조사된 OP-1 세포는 0일째 날, 7일째 날 및 14일째 날에 첨가하였다. 기호는 3회 측정치의 평균(± SD)을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 CRS의 시험관 내 모델에서 mb-aIL6 및 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포의 기능을 보여준다. 도 7a는 THP-1 세포의 존재 또는 부재 하에 mCherry-형질 도입된 OP-1 세포와 동시 배양된 T 세포(1:5:1의 T 세포:OP-1:THP-1 비율)의 세포 독성을 보여주는 2개의 그래프이다. 인큐사이트 라이브 이미지화 시스템(에센)을 이용하여 OP-1 세포 수치를 정량화하고; 결과는 3회 측정치에 대해 적색 보정 단위(RCU) x μm2/웰의 평균(± SD)으로서 나타나 있다. 도 7b는 40시간의 배양 이후 도 7a에 나타나 있는, ELISA에 의해 측정된 배양액의 상층액 중의 IL-6의 수준을 보여주는 차트이다.
도 8a 내지 도 8c는 기타 IL-6 중화 수용체의 개략도이다. 도 8a는 분비된 aIL6을 위한 핵산 구조체 및 분비된 aIL6을 발현하는 세포의 개략도이다. 도 8b는 41BB 도메인 및 CD3ζ 도메인에 연결되어 항-IL6 CAR을 형성하는 항-IL-6 scFv를 위한 핵산 구조체의 개략도이다. 도 8c는 항-IL6 scFv가 신호전달 능력이 없는 IL-6 수용체로 교체되어 있는 핵산 구조체의 개략도이다.
도 9a 및 도 9b는 T 세포 내에서의 mb-aIL6의 발현에 의해 IL-6이 생체 내에서 중화된다는 것을 보여준다. NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull) 마우스(매인주 바하버(Bar Harbor) 소재의 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory))에는 0일째 날에 1 x 106개의 DS-1 세포를, 그리고 2일째 날에 GFP 단독(모의) 또는 GFP 및 mb-aIL6과 함께 형질 도입된 1 x 107개의 말초 혈액 T 세포를 복강 내 주사하였다. 제노젠(Xenogen) IVIS-200 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시스(Caliper Life Sciences))을 이용하여 종양 이식 및 성장을 측정하였다. 모든 마우스는 0일째 날로부터 시작하여 2일마다 1,000 IU의 인간 IL-6 및 20,000 IU의 인간 IL-2를 복강 내 투여 받았다. 도 9a는 마우스의 복부 및 배부 이미지이다. 도 9b는 루시페라아제를 발현하는 DS-1으로 이식된 마우스에서 발광 변화를 보여주는 차트이다. 각각의 기호는 1회의 생체 발광 측정치에 상응하고; 라인은 1마리의 마우스에서의 모든 측정치를 연결한 것이다.
도 10a 내지 도 10f는 mb-aIL6의 발현이 생체 내에서 항-CD19 CAR 기능에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull) 마우스(매인주 바하버 소재의 잭슨 래버러토리)에는 0일째 날에 0.5 x 106개의 Nalm-6 세포를, 그리고 3일째 날에 항-CD19-41BB-CD3ζ(CAR) 또는 CAR 및 mb-aIL6(CAR+mb-aIL6)과 함께 형질 도입된 2 x 107개의 말초 혈액 T 세포를 정맥 내 주사하였다. 제노젠 IVIS-200 시스템(캘리퍼 라이프 사이언시스)을 이용하여 종양 이식 및 성장을 측정하였다. 모든 마우스는 0일째 날로부터 시작하여 2일마다 20,000 IU의 인간 IL-2를 복강 내 투여 받았다. 신호 임계치가 1010개의 광자/초에 도달했을 때 마우스를 안락사 시켰다. 도 10a는 마우스의 복부 및 배부 이미지이다. 조작된 T 세포의 주사 이전에 종양의 존재를 나타내기 위해 3일째 날의 이미지를 향상된 민감도로 가공 처리하였다. 도 10b는 루시페라아제를 발현하는 Nalm-6로 이식된 마우스에서의 발광 변화를 보여주는 차트이다. 도 10c는 마우스의 복부 및 배부 이미지이다. 조작된 T 세포의 주사 이전에 종양의 존재를 나타내기 위해 3일째 날의 이미지를 향상된 민감도로 가공 처리하였다. 도 10d는 53일째 날에 CAR T 세포수를 보여주는 차트이다. 마우스에서 유래한 혈액은 볼 찌르기(cheek prick)를 통해 수득하고, 유세포 분석법을 이용하여 CAR T 세포를 정량화하였다. 도 10e는 마우스의 생존 곡선을 보여주는 차트이다. 어떠한 T 세포도 주사되지 않는 마우스 대 CAR-T 세포 또는 CAR-T + mb-aIL6로 주사된 마우스에 대한 곡선을 로그 순위 검정에 의해 계산하였다(양쪽 비교에 있어서 P < 0.01). 도 10f는 루시페라아제를 발현하는 Nalm-6으로 이식된 마우스에서의 발광 변화를 보여주는 차트이다. 각각의 기호는 1회의 생체 발광 측정치에 상응하고; 라인은 1마리의 마우스에서의 모든 측정치를 연결한 것이다.
도 11a 및 도 11b는 mb-aTNFα의 설계에 관한 것이다. 도 11a는 mb-aTNFα 구조체의 도식이다. 도 11b는 MSCV-mb-aTNFα-IRES-GFP 플라스미드의 도식이다.
예시적인 실시형태에 대한 설명은 다음과 같다.
인터류킨-6 및 사이토카인 방출 증후군
인터류킨-6(IL-6)은 이식편대숙주 질병(GvHD), 류머티스성 관절염, 및 전신 홍반성 루푸스를 비롯한 다발성 자가면역 질병, 염증성 질병 및 림프구 증식성 질환의 병인과 관련이 있는 전염증성 사이토카인이다. 또한, IL-6은 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 리디렉팅되는 T 세포의 가장 흔한 주입 부작용들 중 하나인 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 발달과 관련이 있다. CRS는 심각할 수 있으며, 일부 경우에 치명적일 수 있다.7~10 IL-6은 CRS의 발달에 핵심이며, 항-IL-6 수용체 항체(토실리주맙)는 현재 이의 효과를 억제하기 위해 사용된다.7~10
본원에 기술되어 있는 벡터는 변형된 T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 이어서 자가면역 질병 및 CRS의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 과정은 IL-6을 중화시켜 CRS의 위험도 및/또는 중증도를 감소시킬 수 있는 형질전환 T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술되어 있는 특정 실시예에서 IL-6이 활용례로서 사용될지라도 상기 접근법은 자가면역 질병 및 CRS의 병인과 관련이 있는 기타 사이토카인의 중화에 적용 가능하다.
핵산
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"이란 용어는 다수의 뉴클레오티드 단량체(예를 들어, 리보뉴클레오티드 단량체 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체)를 포함하는 중합체를 지칭한다. "핵산"은, 예를 들어 DNA(예를 들어, 게놈 DNA 및 cDNA), RNA 및 DNA-RNA 하이브리드 분자를 포함한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생하거나, 재조합 또는 합성될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 변형될 수 있다. 이중 가닥 중합체의 경우, "핵산"은 상기 분자의 가닥 중 하나 또는 둘 모두를 지칭할 수 있다.
"뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 단량체"란 용어는 자연적으로 발생하는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체뿐만 아니라 이의 비자연적으로 발생하는 유도체 및 유사체를 지칭한다. 따라서, 뉴클레오티드는, 예를 들어 자연적으로 발생하는 염기(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 이노신, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 또는 데옥시시티딘)를 포함하는 뉴클레오티드 및 당해 기술분야에 알려져 있는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일성"이란 용어는 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열이 최대 동일성 수준(비율(%)로 표시됨)을 구현하기 위해 정렬되는 경우에 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 정도를 지칭한다. 서열의 정렬 및 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열을 참조 서열로서 지정하고, 시험 서열을 이와 비교한다. 참조 서열과 시험 서열 사이의 서열 동일성은 최대 동일성 수준을 구현하기 위해 참조 서열 및 시험 서열을 정렬할 때 참조 서열 및 시험 서열이 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 공유하는 경우에 참조 서열의 전체 길이를 가로지르는 위치의 비율(%)로서 나타낸다. 일례로서, 2개의 서열은 최대 동일성 수준을 구현하기 위해 정렬할 때 시험 서열이 참조 서열의 전체 길이에 대해 70%의 동일한 위치에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 경우에 70%의 서열 동일성을 갖는 것으로 고려된다.
최대 동일성 수준을 구현하기 위해 비교용 서열의 정렬은 적절한 정렬 방법 또는 알고리즘을 이용하여 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 일부 경우, 정렬은 최대 동일성 수준을 제공하기 위해 도입된 간극을 포함할 수 있다. 예로는 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482(1981)]의 국부 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 검색법(search for similarity method), 이들 알고리즘(위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재의 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행(computerized implementation) 및 육안 검사(일반적으로 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology] 참조)를 들 수 있다.
서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 후속적인 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘에 의해, 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열 대비 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 비율(%)을 계산한다. 서열 동일성 비율(%)을 측정하기 위해 흔히 사용되는 기구는 미국 국립보건원의 국립의학 도서관(National Library of Medicine) 내 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 이용 가능한 단백질의 기본 국부 정렬 검색 도구(BLASTP)이다(문헌[Altschul et al., J Mol Biol. 215(3): 403~10 (1990)]).
다양한 실시형태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열은, 예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 본원에 기술되어 있는 하나 이상의 서열에 대한 서열 동일성 비율(%)이 확인되는 경우, 본원에 기술되어 있는 서열은 참조 서열이다.
일부 실시형태에서, 가변 경쇄 도메인은 서열 번호 4에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
벡터
"벡터", "벡터 구조체" 및 "발현 벡터"란 용어는 숙주를 형질 전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 조장하기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입될 수 있는 비히클을 의미한다. 벡터는 전형적으로 단백질을 암호화하는 외래 DNA가 제한 효소 기술에 의해 삽입되는 전달체(transmissible agent)의 DNA를 포함한다. 흔한 유형의 벡터는 "플라스미드"로서, 추가적인 (외래) DNA를 용이하게 받아들일 수 있고 적당한 숙주 세포 내로 용이하게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 독립된 분자이다. 플라스미드 및 진균 벡터를 비롯한 다수의 벡터는 다양한 진핵생물 및 원핵생물 숙주에서의 복제 및/또는 발현용으로 기술되어 있다.
"발현하는" 및 "발현"란 용어는 유전자 또는 DNA 서열 내의 정보가 자명하게 되도록 허용 또는 야기하는 것을 의미하며, 예를 들어 상응하는 유전자 또는 DNA 서열의 전사 및 번역과 관련이 있는 세포 기능을 활성화함으로써 단백질을 생성하는 것을 의미한다. DNA 서열은 세포 내에서 또는 세포에 의해 발현되어 단백질과 같은 "발현 산물"을 형성한다. 또한, 발현 산물 그 자체, 예를 들어 얻어진 단백질은 세포에 의해 "발현"되는 것으로 여겨질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어 외래 또는 천연 프로모터의 제어 하에 외래 숙주 세포에서 발현 또는 생성되거나, 외래 프로모터의 제어 하에 천연 숙주 세포에 발현 또는 생성되는 경우에 재조합에 의해 발현된다.
유전자 전달 벡터는 일반적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식 유전자(예를 들어, 효소를 암호화하는 핵산), 및 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에서 이식 유전자의 발현을 위해 요구되는 기타 핵산 요소를 포함한다. 유전자 발현 및 전달 구조체용으로 적당한 프로모터가 당해 기술분야에 알려져 있다. 또한, 재조합 플라스미드는 세포에서의 효소의 발현을 위한 유도성 또는 조절 가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
다양한 유전자 전달 비히클이 당해 기술분야에 알려져 있으며, 바이러스 및 비-바이러스 (예를 들어, 노출 DNA(naked DNA), 플라스미드) 벡터 둘 모두를 포함한다. 유전자 전달에 적합한 바이러스 벡터는 당업자에게 알려져 있다. 이 같은 바이러스 벡터로는, 예를 들어 헤르페스 바이러스, 배큘로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터(AAV) 및 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV)에서 유래하는 벡터를 들 수 있다. 바이러스 벡터는 복재성 또는 비복재성일 수 있다. 이 같은 벡터는 본원에 개시되거나 인용된 방법 또는 그 외의 관련 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 방법을 이용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
그 중에서도, 유전자 전달용 비-바이러스 벡터로는 노출 DNA, 플라스미드, 트랜스포손(transposon) 및 mRNA을 들 수 있다. 비제한적인 예로는 pKK 플라스미드(클론테크(Clonetech)), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(위스콘신주 매디슨 소재의 노바젠 인코포레이티드(Novagen, Inc.)), pRSET 또는 pREP 플라스미드(캘리포니주 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen)), pMAL 플라스미드(매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 들 수 있다. 이 같은 벡터는 본원에 개시되거나 인용된 방법 또는 그 외의 관련 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 방법을 이용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 암피실린 내성 유전자(Amp)와 같은 선택 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 EcoRI과 XhoI 사이의 pMSCV-IRES-GFP 내로의 서브클로닝에 적합하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 목적하는 유전자의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(MCS)를 함유한다.
대부분의 아미노산이 다중 코돈("동의어(synonym)" 또는 "동의" 코돈으로 지칭됨)으로 표시된다는 점에서 유전자 코드가 축퇴성일지라도 특정 유기체에 의한 코돈 사용은 무작위가 아니며, 특정 코돈 트리플렛(codon triplet)에 편향적인 것으로 당해 기술분야에서 이해된다. 따라서, 일부 실시형태에서 벡터는 (예를 들어, 코돈 최적화를 통한) 특정 유형의 숙주 세포의 발현에 최적화되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 코돈 최적화는, 동일한 아미노산(들)을 암호화하지만 핵산이 발현되고 있는 숙주 세포에서 보다 흔하게 사용/인식되는 코돈을 갖는 이러한 폴리뉴클레오티드 내의 특정 코돈을 치환하도록 관심 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 변형하는 과정을 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 기술되어 있는 폴리뉴클레오티드는 T 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
막-결합 항-사이토카인 구조체
막-결합 항-사이토카인 구조체(이의 예는 도 1a의 mb-aIL6 구조체임)는 본원에 기술되어 있는 바와 같이 생성될 수 있다. 항-사이토카인 구조체는 IL-6, (TNF)-α, IL-1β, IL-12, IL-17, IL-18, IFNγ 등과 같은 매우 다양한 사이토카인에 특이적일 수 있다.
도 1a는 힌지 및 막관통 도메인에 결합되어 있는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv)인 특정 구조체를 보여준다. 항-IL6 scFv는 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함한다. 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인의 상대적인 위치는 바뀌어 있을 수 있지만, 이들은 모두 도 1a에서 CD8α 힌지 및 막관통 도메인으로서 나타나 있는 막관통 도메인에 대해 N' 말단에 있다. 또한, 구조체는 CD8α 신호 펩티드와 같이 N-말단 신호 펩티드(도 1a에 미도시)를 포함할 수 있다. 도 1b는 MSCV mb-aIL6-IRES-GFP 플라스미드에 대한 도식이다.
다양한 링커 도메인이 적합하다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 (G4S)x(여기서, x는 1 내지 100의 정수임)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 (G4S)3일 수 있다. 기타 실시형태에서, 링커 도메인은 하나 이상의 글리신 잔기일 수 있다. 기타 실시형태에서, 링커 도메인은 (EAAAK)3일 수 있다.
다양한 힌지 및 막관통 도메인이 적합하다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 및 막관통 도메인은 CD8α 힌지 및 막관통 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지는 복수의 글리신 및 세린 잔기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD4, CD8β, CD16, CD28, CD32, CD34, CD64, CD137, FcεRIγ, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B에서 유래한 막관통 도메인일 수 있다.
도 1a의 실시형태가 항-IL6 구조체일지라도, 종양 괴사 인자(TNF)-α, IL-1β, IL-12, IL-17, IL-18, IFNγ 등과 같은 기타 사이토카인에 대한 구조체를 생성하고/하거나 이들의 수용체를 차단하기 위해 유사한 접근법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 도 1a의 도식에 기초하여, 항-IL6 scFv 부분은 (TNF)-α(도 11), IL-1β, IL-12, IL-17, IL-18 또는 IFNγ와 같은 상이한 사이토카인에 특이적으로 결합하는 상이한 scFv로 교체될 수 있다. 본원의 교시 모두는 사이토카인을 중화시키는 막-결합 단백질의 발현을 위해 구조체에 동일하게 적용 가능하다.
다수의 중화 수용체는 포괄적이고 오래 지속되는 항염증 효과를 발휘하도록 동일한 세포 상에서 발현되거나 상이한 세포 하위세트에서 발현될 수 있다.
형질전환 숙주 세포를 제조하는 방법
본원에는 형질전환 T 세포와 같은 형질전환 숙주 세포를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 형질전환 숙주 세포는, 예를 들어 본원에 기술되어 있는 벡터 실시형태들 중 하나 이상을 숙주 세포에 도입함으로써 만들 수 있다.
하나의 실시형태에서, 방법은 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터의 핵산은 항-CD19-41BB-CD3ζ와 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이시스트론성 벡터와 같은 핵산에 의해 mb-aIL6 및 CAR이 발현된다. 일부 실시형태에서, mb-aIL6 및 CAR를 발현하는 형질전환 T 세포와 같은 형질전환 세포를 생성하기 위해 2개의 별도의 벡터가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산들 중 하나 이상은 숙주 세포의 게놈 내에 통합되어 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 게놈에 통합될 핵산은, 예를 들어 상동성 재조합, CRISPR 기반 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cpf1) 및 TALEN 시스템을 비롯한, 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 다양하고 적당한 방법을 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다.
값 및 범위
달리 표시하지 않거나 문맥 및 당업자의 이해로부터 달리 자명하지 않은 한, 범위로 표시된 값은 문맥 상 달리 명백히 언급하지 않는 한 다양한 실시형태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 상정할 수 있다. 수치 값과 관련하여 "약"은, 달리 언급하지 않거나 달리 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 일반적으로 상기 값의 ±8%, 일부 실시형태에서 ±6%, 일부 실시형태에서 ±4%, 일부 실시형태에서 ±2%, 일부 실시형태에서 ±1%, 일부 실시형태에서 ±0.5% 이내에 있는 값의 범위를 지칭한다.
예시적인 실시형태: 벡터
실시형태는 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. mb-aIL6 scFv는 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및 b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-IL-6 가변 경쇄 도메인 및 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 중 하나 이상은 인간 항-IL6 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인이다. 일부 실시형태에서, 가변 경쇄 도메인은 서열 번호 4에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 가변 중쇄 도메인은 서열 번호 8에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 링커 도메인은 (G4S)x(여기서, x는 1 내지 100의 정수임)이다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 (G4S)3이다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 하나 이상의 글리신 잔기이다. 일부 실시형태에서, 링커 도메인은 (EAAAK)3이다.
일부 실시형태에서, 힌지 및 막관통 도메인은 CD8α 힌지 및 막관통 도메인이다. 일부 실시형태에서, 힌지는 복수의 글리신 및 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD4, CD8β, CD16, CD28, CD32, CD34, CD64, CD137, FcεRIγ, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B에서 유래한 막관통 도메인이다.
일부 실시형태에서, 핵산은 항-CD19-41BB-CD3ζ 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 암호화한다. 일부 실시형태에서, mb-aIL6은 P2A 서열에 의해 항-CD19-41BB-CD3ζ에 결합된다.
예시적인 실시형태: 벡터
다른 실시형태는 항-IL6(aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. aIL6 scFv는 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv)을 포함한다.
예시적인 실시형태: 벡터
다른 실시형태는 항-IL6 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 항-IL6 CAR은 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 제1 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); b) 항-IL6 scFv에 대해 N-말단에 있는 제2 링커 도메인; c) 제2 링커 도메인에 대해 N-말단에 있는 힌지 및 막관통 도메인; 및 d) 힌지 및 막관통 도메인에 대해 N-말단에 있는 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 내 신호전달 도메인은 41BB 도메인이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 세포 내 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 있는 공동 자극 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 공동 자극 도메인은 CD3ζ 도메인이다.
예시적인 실시형태: 벡터
다른 실시형태는 막-결합 IL-6 수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터이다. 막-결합 IL-6 수용체는 a) 세포 외 도메인; b) 세포 외 도메인에 대해 N-말단에 있는 링커 도메인; c) IL-6 수용체 α 도메인; 및 d) 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 외 도메인은 gp130 세포 외 도메인이다.
일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인이다.
예시적인 실시형태: 포유동물 T 세포
다른 실시형태는 본원에 기술되어 있는 임의의 실시형태에 따라 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 이식 유전자를 포함하는 포유동물 T 세포이다.
일부 실시형태에서, mb-aIL6 scFv는 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및 b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 T 세포는 인간 말초 혈액 T 림프구이다.
예시적인 실시형태: 포유동물에서 IL-6 의존성 세포의 증식을 억제하는 방법
다른 실시형태는 포유동물에서 IL-6 의존성 세포의 증식을 억제하는 방법이다. 방법은 T 세포에서 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 발현시키는 단계를 포함한다. mb-aIL6 scFv는 본원에 기술되어 있는 임의의 실시형태에 따를 수 있다.
일부 실시형태에서, mb-aIL6 scFv는 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및 b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
예시적인 실시형태: 포유동물에서 IL-6 농도를 감소시키는 방법
다른 실시형태는 포유동물에서 IL-6 농도를 감소시키는 방법이다. 방법은 T 세포에서 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 발현시키는 단계 및 T 세포를 IL-6을 함유하는 유체와 접촉시키는 단계를 포함한다. mb-aIL6 scFv는 본원에 기술되어 있는 임의의 실시형태에 따를 수 있다.
일부 실시형태에서, mb-aIL6은 a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및 b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다.
일부 실시형태에서, 방법은 T 세포를 배양하여 mb-aIL6을 발현하는 새로운 T 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 위험도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 이때 포유동물의 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현한다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR이다.
일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 항-CD22 도메인, 항-CD20 도메인, 항-CD123 도메인, B 세포 성숙 항원(BCMA) 도메인, 항-메소텔린 도메인, 항-CD7 도메인, 항-CD2 도메인, 항-CD5 도메인, 항-CD3 도메인, 항-루이스 Y 도메인, 항-EpCam 도메인, 항-Her2 도메인 또는 항-전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 41BB 도메인, CD3ζ 도메인, CD28 도메인, 유도성 T 세포 공동 자극인자(ICOS) 도메인, DNAX-활성화 단백질 10(DAP10) 도메인 또는 DNAX-활성화 단백질 12(DAP12) 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 자가면역 질병을 앓고 있으며, 포유동물에서의 IL-6 농도의 감소에 의해 자가면역 질병이 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 류머티스성 관절염을 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 류머티스성 관절염이 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 전신 홍반성 루푸스를 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 전신성 루푸스가 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 염증성 질병을 앓고 있으며, 포유동물에서의 IL-6 농도의 감소에 의해 염증성 질병이 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 이식편대숙주 질병을 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 이식편대숙주 질병이 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 림프구 증식성 질환을 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 림프구 증식성 질환이 치료된다.
일부 실시형태에서, 포유동물은 캐슬맨 질병을 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 캐슬맨 질병이 치료된다.
예시적인 실시형태: 벡터
다른 실시형태에서, 벡터는 막-결합 항-사이토카인 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함한다. 막-결합 항-사이토카인 scFv는 본원에 기술되어 있는 임의의 실시형태에 따를 수 있다.
일부 실시형태에서, 막-결합 항-사이토카인은 a) 항-사이토카인 가변 경쇄 도메인, 항-사이토카인 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인과 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-사이토카인 단일쇄 가변 절편(항-사이토카인 scFv); 및 b) 항-사이토카인 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-사이토카인은 항-(TNF)-α, 항-IL-1β, 항-IL-12, 항-IL-17, 항-IL-18 또는 항-IFNγ이다.
예시
재료 및 방법
세포
인간 세포주인 Nalm-6(B 세포 급성 림프모구성 백혈병; ALL), 저캇(T 세포 ALL), THP-1 및 U937(급성 단핵구성 백혈병), DS-1(B 세포 림프종) 및 HEK293T(배아 신장 섬유아세포)를 미국 유전자은행(American Type Culture Collection; 버지니아주 머내서스 소재)으로부터 구입하였다. B-ALL 세포주 OP-1을 본 발명자의 실험실에서 개발하였다.11 Nalm-6, OP-1, THP-1, U937 및 저캇 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)(유타주 로건 소재의 하이클론 GE 헬스케어(HyClone GE Healthcare)) 및 1% 페니실린/스트렙타비딘(P/S)(독일 아이덴바흐 소재의 팬-아이로테크(PAN-Biotech))이 보충된 RPMI-1640(매사추세츠주 월섬 소재의 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))에서 유지하였다. DS-1 세포를 10% FBS, 1% P/S 및 1 ng/㎖의 인터류킨-6(IL-6)(써모피셔 사이언티픽)이 보충된 RPMI-1640에서 유지하였다. HEK-293T를 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 DMEM (하이클론 래버러토리즈(HyClone Laboratories))에서 유지하였다.
반딧불이 루시페라아제 유전자를 함유하고 GFP 발현으로 인해 MoFlo 세포 분별장치(캘리포니아주 브레아 소재의 벡크만 쿨터(Beckman Coulter))를 이용하여 선택되는 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV)-내부 리보솜 진입 부위(IRES)-녹색 형광 단백질(GFP) 레트로바이러스 벡터(테네시주 멤피스 소재의 성 쥬드 소아 연구 병원(St Jude Children's Research Hospital)의 벡터 개발 및 생산 공용 자원(Vector Development and Production Shared Resource)으로부터 수득됨)로 DS-1 및 Nalm-6을 형질 도입하였다. mCherry를 함유하고 mCherry 발현으로 인해 MoFlo 세포 분별장치를 이용하여 선택되는 MSCV-IRES-GFP 레트로바이러스 벡터로 DS-1 및 OP-1을 형질 도입하였다.
THP-1의 분화를 유도하기 위해, 2 x 106개의 THP-1 세포를 10% FBS, 1% P/S, 및 20 ng/㎖의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)가 보충된 10 ㎖의 RPMI-1640에서 72시간 동안 배양하였다. 이어, 분화된 THP-1 세포를 1% EDTA(뉴저지주 케닐워스 소재의 머크(Merck))를 이용하여 수확하였다.
말초 혈액 단핵 세포를 국립대 병원 헌혈 센터(National University Hospital Blood Donation Centre)가 제공하는 폐기된 익명의 혈소판 기증 부산물로부터 밀도 구배에 의해 단리하였다. 단핵 세포를 10% FBS, 1% P/S 및 120 IU/㎖의 인터류킨-2(IL-2)(스위스 바젤 소재의 노바르티스(Novartis))가 보충된 RPMI-1640에서 3일 동안 다이나비즈(Dynabeads) 인간 T-활성화제 CD3/CD28(써모피셔)과 함께 배양하였다. 4일째 날, 항-CD3/CD28 비드를 제거하고, 새로운 항-CD3/CD28 비드로 세포를 다시 자극하였다. 이어서, 확장된 T 세포를 10% FBS, 1% P/S 및 120 IU/㎖의 IL-2가 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다.
플라스미드 및 레트로바이러스 형질 도입
mb-aIL6 내의 항-IL6 scFv의 중쇄 및 경쇄 도메인은 인간 항-IL6 단클론성 항체 AME-19a의 공개된 서열에서 유래하였으며, 15개의 아미노산으로 이루어진 [(G4S)3] 링커와 연결하여 단일쇄 가변 절편(scFv)을 형성하고; 구조체는 진스크립트(Genscript; 중국 난징 소재)에 의해 합성되었다. scFv를 CD8α 힌지 및 막관통 도메인("mb-aIL6")에 연결하였다. 항-CD19-41BB-CD3ζ 구조체는 본 발명자의 연구실에서 이전에 개발되었다.12 mb-aIL6과 항-CD19-41BB-CD3ζ를 연결하기 위해 사용되는 P2A 서열은 이전에 보고되어 있었다.13 모든 구조체를 EcoRI과 XhoI 사이의 pMSCV-IRES-GFP 내에 서브클로닝하였다.
레트로바이러스 상층액의 제조 및 형질 도입은 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다.14 간단하게는, T 세포를 레트로넥틴(RetroNectin; 일본 구사쓰 소재의 타카라(Takara))의 존재 하에 37℃에서 레트로바이러스 상층액과 함께 배양하였다. 레트로바이러스 상층액을 그 후 3일 동안 12시간 마다 새로 수확한 상층액으로 교체하였다. 이어서, 형질 도입된 T 세포를 수확하고, 10% FBS, 1% P/S 및 200 IU/㎖의 IL-2가 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다.
형질 도입된 세포의 표면 염색
유세포 분석법에 의해 mb-aIL6 및 항-CD19-41BB-CD3ζ의 표면 발현을 검출하였다. mb-aIL6에 대해 비오틴-접합된 염소 항-인간 F(ab)'2(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치)를 사용한 후, 알로피코시아닌(APC)-접합된 스트렙타비딘(캘리포니아주 산호세 소재의 BD 바이오사이언스)으로 2차 염색하였다. 또한, 세포를 비오틴에 접합된 인간 IL-6(영국 케임브리지 소재의 압캠)으로 표지한 후, 스트렙타비딘-APC로 표지하였으며; 비오틴에 접합된 대두-트립신 억제제(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D)는 음성 대조군으로 사용하였다. 항-CD19-41BB-CD3ζ를 특이적으로 검출하기 위해 myc-tag에 연결된 인간 CD19의 세포 외 도메인을 함유하는, 본 발명자의 실험실에서 생산된 가용성 융합 단백질인 CD19-myc를 사용하였다. T 세포를 CD19-myc와 함께 30분 동안 배양한 후, R-피코에리트린(PE)-접합된 항-myc(매사추세츠주 댄버스 소재의 셀 시그날링 테크놀로지)와 함께 배양하였다. 세포 면역 표현형 검사(cell immunophenotyping)를 위해, T 세포를 항-CD3 APC, 항-CD56 PE, 항-CD4 V450 및 항-CD8 PerCP(BD 바이오사이언스)로 표지하였다. 어큐리(Accuri) C6 또는 포테사(Fortessa) 유동 분석기(BD 바이오사이언스)를 이용하여 세포 염색을 분석하였다.
IL-6 감소 검정
IL-6 감소를 측정하기 위해, 2 x 106개의 T 세포를 1 ng의 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI-1640에서 2시간 동안 배양하였다. 다른 실험에서, 0.5 내지 2 x 106개의 T 세포를 10 IU의 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI-1640에서 2시간 동안 배양하였다. 또 다른 실험에서, 2 x 106개의 T 세포를 1 ng의 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI-1640에서에서 20분 내지 2시간의 상이한 시간 간격 동안 배양하였다. 추가의 실험에서, 0.5 x 106개의 세포를 25 pg/㎖ 내지 200 pg/㎖의 재조합 인간 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다른 추가의 실험에서, 0.2 x 106개의 T 세포를 1 ng의 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI-1640에서 2시간 내지 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝날 무렵에, 상층액을 수확하고, 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과하고, 1:10로 희석하였다. 인간 IL-6 Platinum ELISA 키트(써모피셔)를 이용하여 ELISA에 의해 IL-6의 수준을 측정하였다. 계산된 표준 곡선으로부터의 내삽(Interpolation)은 각각의 샘플 내의 IL-6의 농도를 측정하기 위해 사용되었다.
Stat3 인산화 측정을 위해, 2 x 106개의 세포를 10 IU의 IL-6을 함유하는 1 ㎖의 RPMI-1640에서 2시간 동안 분주하였다. 상층액을 수확하고, 37℃에서 15분 동안 0.2 x 106개의 U937 세포와 함께 배양하였다. 라이스픽스(Lysefix) 완충액(BD 바이오사이언스)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 10분 동안 추가로 방치하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 얼음 상의 Perm III 완충액에 30분 동안 놓아두었다. 3회의 세척 이후, PE-접합된 항-Stat3(pY705) 항체(BD 바이오사이언스)를 첨가하였다. 1시간 후, 세포를 세척하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다.
mb-aIL6에 의한 IL-6 감소가 IL-6 의존성 세포주 DS-1의 성장에 미치는 효과를 측정하기 위해, 1.5 x 104개의 T 세포를 10% FBS, 1% P/S 및 0.5 ng/㎖의 IL-6이 보충된 RPMI-1640에서 mCherry로 형질 도입된 DS-1 세포와 함께 1:1의 비율로 배양하였다. 확장된 T 세포에 대해, 120 IU/㎖의 IL-2를 첨가하였다. 실험을 개시하기 전에 DS-1 세포를 72시간 동안 굶겼다. 배양하는 동안에 2일 마다 IL-2 및 IL-6을 첨가하였다. 인큐사이트 라이브 세포 분석 시스템(미시간주 앤아버 (Ann Arbor) 소재의 에센 바이오사이언스)을 이용하여 각각의 웰의 4x 이미지를 4시간 마다 캡처하였다. 형광을 이용하여 세포수를 측정하고, 적색 객체의 총 적분 세기는 웰 내의 DS-1 mCherry의 양에 대한 척도로서 사용되었다. 기타 실험에서, T 세포, OP-1 및 분화된 THP-1을 1:5:1의 비율로 이용하여 유사한 배양을 수행하였다. 분화된 THP-1을 검정을 시작하기 1시간 전에 분주하였다. 인큐사이트 시스템을 이용하여 상기와 같이 각각의 웰의 4x 이미지를 캡처하였다. 40시간 후, 각각의 웰로부터의 상층액을 수확하고, 1:5로 희석하였으며, 상술한 바와 같이 ELISA에 의해 IL-6을 측정하였다.
인터페론-γ(IFNγ) 생산, CD107a 발현, 세포 독성 및 증식 검정
IFNγ 생산을 시험하기 위해, 1 x 105개의 T 세포를 OP-1 세포와 함께 1:1의 비율로 배양하였다. 1시간 후, 골지플러그(GolgiPlug; BD 바이오사이언스)를 세포에 첨가하였으며, 이때 세포를 5시간 더 배양하였다. 본 발명자의 실험실에서 개발된 투과 시약인 8E에 의한 세포막 투과 이후, 세포를 PE-접합된 항-인간 IFNγ 항체(BD 바이오사이언스)로 표지하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다.
세포 독성 과립의 세포외 배출(exocytosis)을 측정하기 위해, 상술한 바와 같이 세포를 배양하였다. 배양 초기에, PE-접합된 항-인간 CD107a 항체(BD 바이오사이언스)를 첨가하였다. 1시간 후, 골지스톱(GolgiStop; BD 바이오사이언스)을 첨가하고, 유세포 분석법에 의한 분석 이전에 3시간 더 배양을 계속하였다.
세포 독성을 시험하기 위해, OP-1 세포를 칼세인-AM 레드(calcein-AM Red; 캘리포니아주 칼즈배드 (Carlsbad) 소재의 인비트로젠)로 표지하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 도말하였다. T 세포(1 x 105개)를 1:1의 E:T 비율로 첨가하고, 4시간 동안 동시 배양하였다. 생존 가능한 표적 세포(칼세인-AM 양성)를 앞서 기술되어 있는 바와 같이 유세포 분석법에 의해 계수하였다.14
세포 증식을 측정하기 위해, 1 x 105개의 T 세포를 10% FBS, 1% P/S 및 120 IU/㎖의 IL-2가 보충된 RPMI-1640에서 조사된 OP-1과 함께 1:1의 E:T 비율로 동시 배양하였다. 각각의 웰에 IL-2을 2일 마다 첨가하였다. 7일, 14일 및 21일째 날에, T 세포를 유세포 분석법에 의해 계수하였다. 1:1의 E:T 비율을 재구성하기 위해 세포를 계수한 후 새로운 조사된 OP-1 세포를 첨가하였다.
이종 이식 실험
루시페라아제를 발현하는 DS-1 세포를 NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOD/scid IL2RGnull) 마우스(잭슨 래버러토리)에서 복강 내(i.p.; 1 x 106개 세포/마우스) 주사하였다. DS-1 접종 2일 후, GFP 단독으로 형질 도입된 1 x 107개의 T 세포, MSCV-mb-aIL6로 형질 도입된 1 x 107개의 T 세포, 또는 T 세포 대신에 10% FBS를 갖는 RPMI 1640을 마우스에 복강 내 주사하였다. 모든 마우스는 2일 마다 20,000 IU의 IL-2 및 1,000 IU의 IL-6을 복강 내 투여 받았다. 수성 d-루시페린 칼륨염(매사추세츠주 월썸 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 복강 내(마우스 당 2 ㎎) 주사한 후에 제노젠 IVIS-200 시스템(매사추세츠주 월썸 소재의 캘리퍼 라이프 사이언시스)을 이용하여 매주 2회 종양 하중(tumor load)을 측정하였다. 리빙 이미지(Living Image) 3.0 소프트웨어를 이용하여 발광을 측정하였다.
루시페라아제를 발현하는 Nalm-6 세포를 NOD/scid IL2RGnull 마우스에서 정맥 내(i.v.; 도 10a 및 도 10b의 경우 0.5 x 106개의 세포/마우스, 및 도 10c 내지 도 10f의 경우 1 x 106개의 세포/마우스) 주사하였다. 3일 후, 마우스는 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR로 형질 도입된 2 x 107개의 T 세포, CAR 및 mb-aIL6("DUAL")을 함유하는 구조체로 형질 도입된 2 x 107개의 T 세포, 또는 T 세포 대신에 10% FBS를 갖는 RPMI 1640을 정맥 내 주사를 맞았다. 모든 마우스는 2일 마다 20,000 IU의 IL-2를 복강 내 투여 받았다. 수성 d-루시페린 칼륨염(매사추세츠주 월썸 소재의 퍼킨 엘머)을 복강 내(마우스 당 2 ㎎) 주사한 후에 제노젠 IVIS-200 시스템(매사추세츠주 월썸 소재의 캘리퍼 라이프 사이언시스)을 이용하여 매주 2회 종양 하중을 측정하였다. 리빙 이미지 3.0 소프트웨어를 이용하여 발광을 분석하였다.
결과
mb-aIL6의 설계, 발현 및 특이성
막-결합 항-IL6 구조체를 생성하기 위해, 인간 항-IL-6 항체 AME-19a의 가변 경쇄 및 중쇄의 서열로부터 단일쇄 가변 절편(scFv)을 합성하고, CD8α의 힌지 및 막관통 도메인에 연결하였다(도 1a). 구조체를 IRES 및 GFP를 함유하는 MSCV 레트로바이러스 벡터 내에 배치시켰다(도 1b). 저캇 T 세포를 형질 도입하기 위해 이러한 레트로바이러스 벡터를 이용하였다. MSCV-mb-aIL6로 형질 도입된 세포에서 GFP 발현이 높았다: 세포의 98%가 GFP 양성이었다. 형질 도입된 저캇 세포의 표면 상의 mb-aIL6을 검출하기 위해, 세포를 비오틴-접합된 염소 항-인간 F(ab)' 항체로 표지한 후, 스트렙타비딘-APC로 표지하였다. 도 1c에 나타나 있는 바와 같이, 본질적으로 모든 GFP 발현 저캇 세포에서 mb-aIL6이 검출되는 반면, GFP 단독("모의")만을 함유하는 벡터로 형질 도입된 세포는 mb-aIL6 음성이었다.
세포 표면 상에서 발현되는 mb-aIL6이 인간 IL-6과 결합할 수 있는지를 결정하기 위해, 형질 도입된 저캇 세포를 10분 동안 비오틴-접합된 인간 IL-6에 노출시킨 후; 세포를 스트렙타비딘-APC로 표지하였다. 도 1d에 나타나 있는 바와 같이, mb-aIL6-저캇 세포는 GFP 수준 및 이로 인한 수용체 발현 수준에 비례하는 수준으로 IL-6과 결합하고, 즉 세포의 99%가 IL-6과 결합하는 반면, 비오티닐화 대조군 단백질(대두-트립신 억제제)로 표지된 세포는 여전히 염색되지 않았다.
mb-aIL6 세포를 이용한 IL-6의 중화
IL-6에 대한 mb-aIL6의 결합은 저캇 세포를 재조합 인간 IL-6(1 ng/㎖)을 함유하는 배지에서 2시간 동안 배양하는 실험에서 확인되었으며; 배양 이후에 회수된 잔류 IL-6을 ELISA에 의해 상층액에서 측정하였다. 2시간의 배양 후, mb-aIL6 저캇 세포에서 유래한 상층액 중의 IL-6의 농도는 0.163 ng/㎖로서, 모의-형질 도입된 저캇 세포의 상층액에서의 0.941 ng/㎖와는 대조가 된다(도 2a).
IL-6을 중화시키기 위해 필요한 mb-aIL6 저캇 세포 수치를 측정하기 위해, 0.25 x 106개의 세포/㎖에서 2 x 106개의 세포/㎖까지 증가하는 농도의 세포를 사용하였다. 상층액으로부터 IL-6의 제거는 세포 투여량 의존적이었다(도 2b). 병행 실험에서, mb-aIL6 세포에 의한 IL-6 제거 동력학을 측정하였다. 도 2c에 나타나 있는 바와 같이, IL-6 중화는 시간 의존적이며, 30분 이후에 거의 90%가 중화되었으며, 120분 이후에는 검출되지 않았다. 특히, 곡선은 일차 지수 감소 곡선(R2 = 0.9957)의 것에 적합하며, 이는 IL-6의 반감기가 7.443분이고 K가 0.09313임을 나타낸다.
mb-aIL6을 발현하는 저캇 세포가 또한 낮은 농도의 IL-6을 중화시킬 수 있는 지를 시험하기 위해, 농도가 0.025 ng/㎖ 내지 0.2 ng/㎖ 범위인 IL-6을 이용하여 IL-6 감소 검정을 준비하였다. 도 2d에 나타나 있는 바와 같이, mb-aIL6을 발현하는 저캇 세포도 또한 대부분의 IL-6을 중화시킬 수 있었다. 이전 실험과 일치하게도, 모의-형질 도입된 세포와 비교할 때 mb-aIL6을 발현하는 저캇 세포에 의해 다양한 농도에 걸쳐 IL-6 수준의 감소는 3.8배 내지 5.4배이었다.
본 발명자들은 세포 증식이 지속적인 세포 배양 시에 계속해서 IL-6을 중화시킬 수 있는 새로운 mb-aIL6 세포를 생성할 수 있다는 것을 가정하였다. 이러한 개념을 시험하기 위해, 본 발명자들은 2시간 이내에 IL-6을 중화시키고 72시간 동안 배양을 계속하기에는 불충분한 이전에 결정된 배양 조건을 이용하였다(도 2b). 24시간에 대부분의 IL-6은 상층액으로부터 제거되었다(도 2e).
mb-aIL6 T 세포를 이용한 IL-6 중화에 대한 기능적 결과
U937은 IL-6에 의해 자극될 수 있는 단핵구 세포주이다.15,16 IL-6 수용체에 대한 결합 시에 IL-6은 Stat3 인산화를 촉발한다.17 mb-aIL6- 또는 모의-형질 도입된 저캇 세포에 대한 2시간 동안의 노출 이후에 U937에서 Stat3 인산화를 촉발하는 IL-6 함유 상층액의 능력을 시험하였다. 1 ng/㎖의 IL-6을 함유하는 상층액에 대한 15분간의 노출 후, Stat3 인산화가 용이하게 검출되었다(P < 0.001; n = 3; 도 3a). IL-6 상층액이 모의-형질 도입된 저캇 세포(P = 유의하지 않음)를 이용한 배양액으로부터 수집되는 경우에 유사한 수준의 인산화가 관찰되었다. 이에 반해, 배양액에 mb-aIL6 저캇 세포가 함유되어 있는 경우, Stat3 인산화 수준은 모의-형질 도입된 저캇 세포의 IL-6 또는 IL-6 함유 상층액에 노출된 U937 세포(양쪽 비교에 있어서 P < 0.001)에서 측정된 것보다 훨씬 낮았으며, 자극되지 않은 세포(P = 유의하지 않음)의 것과 유사하였다.
DS-1은 증식에 IL-6이 요구되는 B-림프종 세포주이다.18 본 발명자들은 mb-aIL6을 발현하는 저캇 세포를 이용한 공동 배양이 DS-1 확장에 영향을 미칠 수 있는 지를 결정하였다. 이를 위해, 5일에 걸친 mCherry-형질 도입된 DS-1 세포에 대한 순차적인 라이브 세포 이미지화 기록이 이용되었다. 도 3b에 나타나 있는 바와 같이, IL-6 함유 배지에서 배양된 DS-1은 모의-형질 도입된 저캇의 존재 하에 빠르게 확장되는 반면, mb-aIL6-형질 도입된 저캇 세포가 배양액에 존재하는 경우에 확장이 현저하게 감소하였다. 이들 조건 하에, DS-1 성장률은 모의- 또는 mb-aIL6-형질 도입된 저캇 세포의 존재 여부와는 무관하게 IL-6이 결핍된 배양액에서 관찰된 것과 유사하였다. 종합하면, 이들 결과에 따르면 mb-aIL6을 발현하는 세포의 IL-6의 효과를 중화시키는 능력이 확인되었다.
인간 말초 혈액 T-림프구에서의 mb-aIL6의 발현
다음 세트의 실험에서, 말초 혈액 T 림프구의 표면 상에서 mb-aIL-6이 발현될 수 있는지의 여부를 측정하였다. 이를 위해, 항-CD3/CD28 비드를 이용하여 말초 혈액 단핵 세포를 자극한 후, MSCV-mb-aIL6 레트로바이러스 벡터로 형질 도입하였다. GFP 단독("모의")만을 함유하는 벡터로 형질 도입된 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타나 있는 바와 같이, mb-aIL6은 형질 도입된 GFP+ T 림프구의 표면 상에서 고도로 발현되었으며, IL-6과 효과적으로 결합하였다. mb-IL6을 발현하는 T 세포의 면역 표현형은 모의-형질 도입된 T 세포의 것과 본질적으로 동일한 채로 남아 있었다(도 4c).
mb-IL6을 발현하는 T 세포가 IL-6 의존성 세포주 DS-1의 성장을 억제할 수 있는 지의 여부를 시험하였다. 도 4d는 DS-1 성장이 현저하게 억제되었다는 것을 보여주며, 이는 T 림프구에서 발현된 mb-aIL6이 IL-6뿐만 아니라 상기 수용체를 발현하는 저캇 세포를 중화시킬 수 있다는 것을 보여준다.
막-결합 항-IL-6 및 항-CD19-41BB-CD3z CAR은 T 림프구에서 동시 발현될 수 있다.
CAR T 세포가 CAR 이외에도 mb-aIL6을 발현하기 위한 것인 경우, 이는 미세 환경에서 활성화된 T 림프구 및 대식세포에 의해 분비되는 IL-6을 중화시킴으로써 CRS의 발생을 예방할 수 있다.
이러한 개념을 시험하기 위한 첫 번째 단계로서, mb-aIL6 및 CAR이 효과적으로 동시에 발현될 수 있는 지의 여부를 측정하였다. 이를 위해, mb-aIL6 및 항-CD19-41BB-CD3ζ CAR을 암호화하는 유전자를 함유하는 이시스트론성 MSCV 벡터(도 5a)를 개발하였다.12 항-CD19 CAR을 특이적으로 검출하기 위해, 인간 CD19 분자의 세포 외 도메인을 myc 태그에 연결하고, 세포를 항-myc 항체로 염색하였다. 도 5b는 mb-aIL6 및 항-CD19 CAR 둘 모두가 말초 혈액 T 세포에서 높은 수준으로 발현될 수 있다는 것을 보여준다. 단독으로 발현되는 mb-aIL6과 같이, CAR과 함께 발현된 mb-aIL6은 IL-6을 효과적으로 중화시켰다(도 5c).
mb-aIL6의 발현은 CAR T 세포 기능에 영향을 미치지 않는다.
mb-aIL6의 발현 및 IL-6 중화가 CAR에 의해 활성화된 T 세포 기능에 영향을 미칠 수 있는 지의 여부를 측정하였다. mb-aIL6 또는 항-CD19 CAR 중 하나를 발현하는 3명의 기증자에서 유래한 T 림프구 및 수용체 둘 모두를 발현하는 T 세포를 이용하여, CD19+ 표적 세포 OP-1과의 공동 배양 이후의 IFNγ의 생산을 시험하였다. mb-aIL6이 발현되는 지의 여부와는 무관하게 CAR을 발현하는 세포에서의 IFNγ의 생산이 높은 반면, mb-aIL6 단독만을 발현하는 T 세포는 모의-형질 도입된 세포의 것과 유사한 수준의 IFNγ를 분비하였다(도 6a).
항-CD107a 항체를 이용한 염색에 의해 입증된 바와 같이, CD19+ 표적 세포의 존재 하에, CAR을 발현하는 세포는 세포 독성 과립을 방출하였다. mb-aIL6의 발현과는 무관하게 CD107a+ 세포의 비율(%)은 유사한 반면, mb-aIL6 단독만을 발현하는 세포는 CD107a 음성으로 남아 있었다(도 6b). 이러한 결과에 따르면, CAR에 의해 유도되는 CD19+ 표적에 대한 세포 독성 비율(%)은 mb-aIL6의 존재에 의해 변하지 않은 채로 남아 있었다(도 6c).
2세대 및 그 이후 세대의 CAR의 중요한 기능 특성은 동시 자극을 제공하고 장기간의 T 세포 증식을 유지하는 능력이다.19 도 6d에 나타나 있는 바와 같이, 항-CD19 CAR-T 세포는 CD19+ 표적 세포의 존재 하에 4주 동안 증식하였으며, 증식 속도는 mb-aIL6의 존재 및 부재 하의 세포에서 유사하였다. 이에 반해, mb-aIL6만으로 형질 도입된 세포 및 모의-형질 도입된 세포는 확장하지 않았으며, 확장은 CAR의 발현과는 무관하게 표적 세포의 부재 하에 발생하지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 mb-aIL6의 발현이 IFNγ의 CAR 유도 T 세포 분비, 특정 세포 독성 또는 세포 증식에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
mb-aIL6 및 CAR을 발현하는 T 세포는 IL-6을 중화시키면서 표적 세포를 살해할 수 있다.
CAR 활성화에 의해 촉발된 CRS 동안에, 대식세포에 의해 분비되는 IL-6은 이의 중증도에 기여한다.7~10
CAR-T 세포와 대식세포 사이의 상호작용을 모방하기 위해, CAR-T 세포를 TNF-α 및 IFNγ의 존재 하에 IL-6을 분비하는 단핵구 세포주 THP-1과 함께 동시 배양하고;20 활성화 시에 T 림프구에 의해 후자의 사이토카인이 IL-6과 함께 분비된다.9,21 따라서, mb-aIL6 및/또는 항-CD19 CAR로 형질 도입된 T 림프구, THP-1 및 CD19+ 백혈병 세포 OP-1을 40시간 동안 동시 배양하였다(도 7a). 상층액에서의 OP-1 세포의 살해 및 IL-6의 수준을 모니터링하였다. 도 7b에 나타나 있는 바와 같이, CAR T 세포는 mb-aIL6의 발현 또는 THP-1의 존재와는 무관하게 OP-1을 효과적으로 살해한다. 놀랍게도, IL-6의 수준은 CAR-T 및 THP-1 세포 둘 모두를 함유하는 배양액에서 상당히 상승하였지만, 이들은 CAR-T 세포가 mb-aIL6을 또한 발현하는 경우에 본질적으로 검출 불가능하였다.
이종 이식 실험
T 림프구를 발현하는 mb-aIL6의 생체 내에서 IL-6을 중화시키는 능력을 측정하기 위해, 루시페라아제가 표지된 DS-1 세포로 이식된 NOD/scid IL2RGnull 마우스를 이용한 실험을 수행하였다. 라이브 이미지화에 의해 종양 성장을 측정하고, GFP 단독으로 형질 도입된 T 세포를 투여 받은 마우스와 mb-aIL6으로 형질 도입된 T 세포를 투여 받은 마우스를 비교하였다. mb-aIL6로 형질 도입된 T 세포를 투여 받은 3마리의 마우스 중 2마리에서, 종양 부하량(tumor burden)의 감소가 있는 반면, 모의-형질 도입된 T 세포를 투여 받은 마우스에서의 종양 부하량은 안정적이거나 증가하였다(도 9a 및 도 9b).
mb-aIL6의 발현이 항-CD19 CAR T 세포의 항종양 능력에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 루시페라아제로 표지된 Nalm-6 세포로 이식된 NOD/scid IL2RGnull 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다. 라이브 이미지화에 의해 종양 성장을 측정하고, CAR 단독으로 형질 도입된 T 세포를 투여 받은 마우스와 CAR 및 mb-aIL6을 함유하는 이시스트론성 구조체로 형질 도입된 T 세포를 투여 받은 마우스를 비교하였다. CAR T 세포는 mb-aIL6이 발현되는 지의 여부와는 무관하게 항-백혈병 활성을 나타냈다(도 10a 내지 도 10f). 종합하면, 이들 결과는 mb-aIL6이 생체 내에서 IL-6을 중화시킬 수 있고, CAR 기능에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다.
토의
본 연구 결과에 따르면 T 림프구에 의해 전달되는 mb-aIL6이 IL-6의 강력한 중화제인 것으로 나타난다. 중요하게도, mb-aIL6은 CAR 효능에 영향을 미치지 않으면서 CAR과 함께 T 림프구 상에서 발현될 수 있다. 이를 위해, mb-aIL6을 발현하는 CAR-T 세포는 이들의 항종양 잠재성을 유지하면서 중증 CRS를 촉발하는 보다 낮은 위험도를 가질 것이다.
이제, 본 발명자들은 mb-aIL6과 기능적으로 관련이 있지만 독특한 특징을 갖는 기타 수용체를 설계하였다(도 8a 내지 도 8c). 도 8a는 형질 도입된 세포에 의해 지속적으로 분비될 수 있고 염증성 미세 환경의 영역에 보다 효과적으로 확산될 수 있는 mb-aIL6(sec-aIL6)의 CD8α 막관통 도메인이 없는 가용성 형태의 수용체를 위한 핵산 구조체의 개략도이다. 도 8b는 mb-aIL6이 전형적으로 CAR(aIL6-CAR) 내에 혼입되어 있는 자극 도메인 및 공동 자극 도메인에 연결되어 있는 핵산 구조체의 개략도이다. 이 같은 수용체를 갖고 있는 세포는 aIL6-CAR의 결찰(ligation) 시에 증식하여 IL-6의 중화를 증대시킬 것이다. 도 8c는 scFv 항-IL6이 신호전달 능력이 없는 IL-6 수용체에 의해 교체되어 있는 핵산 구조체의 개략도이다. 이는 IL-6 수용체 α에 융합되어 있는 gp130의 세포 외 도메인 및 CD8α의 힌지 및 막관통 도메인에 의해 구성된다. 이러한 포맷의 잠재적인 이점은, 이것이 scFv 함유 수용체에 대해 면역원성이 보다 낮을 수 있다는 것이다.
본 연구가 IL-6을 대상으로 하고 있을지라도, 종양 괴사 인자(TNF)-α(도 11a 및 도 11b), IL-1β, IL-12, IL-17, IL-18, IFNγ 등과 같은 기타 전염증성 사이토카인을 중화시키고/시키거나 이들의 수용체를 차단하기 위해 유사한 접근법이 적용될 수 있다. 예를 들어, 도 11a의 도식에 기초하여, 항-IL6 scFv 일부는 (TNF)-α(도 11), IL-1β, IL-12, IL-17, IL-18 또는 IFNγ와 같은 상이한 사이토카인에 특이적으로 결합하는 상이한 scFv로 교체될 수 있다. 다수의 중화 수용체는 포괄적이고 오래 지속되는 항염증 효과를 발휘하도록 동일한 세포 상에서 발현되거나 상이한 세포 하위세트에서 발현될 수 있다.
서열
mb-aIL6 서열
CD8α 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1):
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCC
CD8α 신호 펩티드 아미노산 서열(서열 번호 2):
MALPVTALLLPLALLLHAARP
항-IL6의 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 3):
GAAATCGTCCTGACCCAGTCCCCTGCCACACTGTCCCTGTCTCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCTATCAGCGTGTCCTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTACGACATGTCTAACCTGGCAAGCGGCATCCCCGCACGCTTCTCTGGAAGCGGATCCGGCACAGACTTTACACTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCATGCAGTGGTCCGGCTATCCATACACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
항-IL-6의 가변 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 4):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQWSGYPYTFGGGTKVEIK
GSG 링커 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5):
GGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCC
GSG 링커 아미노산 서열(서열 번호 6):
GGGGSGGGGSGGGGS
항-IL-6의 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 7):
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCTCCATTCGCCATGAGCTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAAGATCTCCCCTGGCGGCTCTTGGACATACTATTCCGACACAGTGACCGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGACAGCTGTGGGGCTACTATGCCCTGGATATCTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGC
항-IL-6의 가변 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 8):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 9):
AAGCCTACCACAACCCCAGCACCCAGGCCCCCTACACCTGCACCAACCATCGCCAGCCAGCCACTGTCCCTGAGGCCCGAGGCATGCAGGCCTGCAGCAGGAGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCACCCCTGGCTGGAACCTGCGGAGTCCTGCTGCTGTCACTGGTCATTACCCTGTATTGC
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 아미노산 서열(서열 번호 10):
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
sec-aIL6
sec-aIL6 뉴클레오티드 서열(서열 번호 11):
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCCGAAATCGTCCTGACCCAGTCCCCTGCCACACTGTCCCTGTCTCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCTATCAGCGTGTCCTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTACGACATGTCTAACCTGGCAAGCGGCATCCCCGCACGCTTCTCTGGAAGCGGATCCGGCACAGACTTTACACTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCATGCAGTGGTCCGGCTATCCATACACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCTCCATTCGCCATGAGCTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAAGATCTCCCCTGGCGGCTCTTGGACATACTATTCCGACACAGTGACCGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGACAGCTGTGGGGCTACTATGCCCTGGATATCTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGC
sec-aIL6 아미노산 서열(서열 번호 12):
MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQWSGYPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
aIL6BBz 서열
CD8α 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열(서열 번호 13):
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCC
CD8α 신호 펩티드 아미노산 서열(서열 번호 14):
MALPVTALLLPLALLLHAARP
aIL6 scFv 뉴클레오티드 서열(서열 번호 15):
GAAATCGTCCTGACCCAGTCCCCTGCCACACTGTCCCTGTCTCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCTCCGCCTCTATCAGCGTGTCCTACATGTATTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTACGACATGTCTAACCTGGCAAGCGGCATCCCCGCACGCTTCTCTGGAAGCGGATCCGGCACAGACTTTACACTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCATGCAGTGGTCCGGCTATCCATACACATTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGCGGCTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTTCTCCATTCGCCATGAGCTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCAAGATCTCCCCTGGCGGCTCTTGGACATACTATTCCGACACAGTGACCGGCCGGTTTACCATCTCCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCAGACAGCTGTGGGGCTACTATGCCCTGGATATCTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGC
aIL6 scFv 아미노산 서열(서열 번호 16):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASISVSYMYWYQQKPGQAPRLLIYDMSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCMQWSGYPYTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPFAMSWVRQAPGKGLEWVAKISPGGSWTYYSDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLWGYYALDIWGQGTTVTVSS
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 17):
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 아미노산 서열(서열 번호 18):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
41BB 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 19):
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
41BB 도메인 아미노산 서열(서열 번호 20):
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD3ζ 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 21):
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD3ζ 도메인 아미노산 서열(서열 번호 22):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
mb-gp130-IL6R 서열
gp130 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 23):
ATGCTGACACTGCAGACATGGCTGGTCCAGGCACTGTTTATCTTTCTGACAACCGAGTCCACAGGCGAACTGCTGGATCCTTGCGGGTACATCTCTCCAGAGAGCCCCGTGGTGCAGCTGCACTCCAACTTCACCGCCGTGTGCGTGCTGAAGGAGAAGTGTATGGACTACTTTCACGTGAACGCCAATTATATCGTGTGGAAGACAAACCACTTCACCATCCCTAAGGAGCAGTACACAATCATCAATAGAACCGCCAGCTCCGTGACCTTCACCGATATCGCCAGCCTGAACATCCAGCTGACATGCAATATCCTGACCTTCGGCCAGCTGGAGCAGAACGTGTATGGCATCACCATCATCTCCGGCCTGCCCCCTGAGAAGCCAAAGAACCTGTCTTGCATCGTGAATGAGGGCAAGAAGATGAGGTGTGAGTGGGACCGGGGCAGAGAGACACACCTGGAGACAAATTTCACCCTGAAGTCCGAGTGGGCCACCCACAAGTTTGCCGACTGCAAGGCCAAGAGGGATACACCCACCAGCTGTACAGTGGATTACTCCACCGTGTATTTTGTGAACATCGAAGTGTGGGTGGAGGCCGAGAATGCCCTGGGCAAGGTGACCAGCGACCACATCAACTTCGATCCCGTGTACAAGGTGAAGCCTAACCCACCCCACAATCTGTCTGTGATCAATAGCGAGGAGCTGTCTAGCATCCTGAAGCTGACATGGACCAACCCCTCCATCAAGTCTGTGATCATCCTGAAGTACAATATCCAGTATAGAACAAAGGACGCCAGCACCTGGTCCCAGATCCCTCCAGAGGATACAGCCTCCACCAGGTCCTCTTTTACAGTGCAGGACCTGAAGCCTTTCACCGAGTACGTGTTCCGGATCCGGTGTATGAAGGAGGACGGCAAGGGCTACTGGTCTGATTGGAGCGAGGAGGCCTCCGGCATCACCTATGAGGACAGGCCA
gp130 도메인 아미노산 서열(서열 번호 24):
MLTLQTWLVQALFIFLTTESTGELLDPCGYISPESPVVQLHSNFTAVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIASLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDRGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRP
GSG 링커 뉴클레오티드 서열(서열 번호 25):
GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCT
GSG 링커 아미노산 서열(서열 번호 26):
GGGGSGGGGSGGGGS
IL-6R 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 27):
GTGGATGTGCCCCCTGAGGAGCCCCAGCTGTCTTGCTTCAGGAAGTCCCCTCTGTCTAACGTGGTGTGCGAGTGGGGACCTCGCAGCACCCCATCCCTGACCACAAAGGCCGTGCTGCTGGTGCGGAAGTTCCAGAATAGCCCTGCCGAGGACTTTCAGGAGCCATGCCAGTACTCTCAGGAGAGCCAGAAGTTCAGCTGTCAGCTGGCAGTGCCAGAGGGCGATAGCTCCTTTTATATCGTGTCCATGTGCGTGGCCTCTAGCGTGGGCTCCAAGTTCTCTAAGACACAGACCTTTCAGGGCTGTGGCATCCTGCAGCCTGACCCACCCGCCAACATCACAGTGACCGCCGTGGCCCGGAATCCAAGATGGCTGTCTGTGACATGGCAGGATCCCCACAGCTGGAACTCCTCTTTCTACCGGCTGAGATTTGAGCTGAGGTATCGCGCCGAGCGGAGCAAGACCTTTACCACATGGATGGTGAAGGACCTGCAGCACCACTGCGTGATCCACGATGCATGGAGCGGCCTGAGGCACGTGGTGCAGCTGAGAGCACAGGAGGAGTTCGGACAGGGAGAGTGGAGCGAGTGGTCCCCAGAGGCAATGGGAACACCATGGACCGAGAGCCGCTCCCCTCCAGCAGAGAATGAGGTGAGCACACCA
IL-6R 도메인 아미노산 서열(서열 번호 28):
VDVPPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTP
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 29):
AAGCCAACCACAACCCCTGCACCACGGCCCCCTACACCAGCACCTACCATCGCATCCCAGCCACTGTCTCTGAGGCCTGAGGCATGCAGGCCAGCAGCAGGAGGAGCAGTGCACACCCGGGGCCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCCCCACTGGCTGGCACTTGCGGGGTCCTGCTGCTGTCCCTGGTCATCACTCTGTATTGC
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 아미노산 서열(서열 번호 30):
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
mb-aTNFα 서열
CD8α 신호 펩티드 뉴클레오티드 서열(서열 번호 31):
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCC
CD8α 신호 펩티드 아미노산 서열(서열 번호 32):
MALPVTALLLPLALLLHAARP
항-TNFα의 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 33):
GAAATCGTCCTGACCCAGTCCCCCGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCCAGTCTGTGAGCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCAAGGCTGCTGATCTACGACGCATCCAACAGGGCAACAGGCATCCCCGCACGCTTCAGCGGATCCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTTACACTGACCATCTCTAGCCTGGAGCCTGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCGCAGCAATTGGCCCCCTTTCACATTTGGCCCAGGCACCAAGGTGGATATCAAG
항-TNFα의 가변 경쇄 아미노산 서열(서열 번호 34):
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK
GSG 링커 뉴클레오티드 서열(서열 번호 35):
GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGC
GSG 링커 아미노산 서열(서열 번호 36):
GGGGSGGGGSGGGGS
항-TNFα의 가변 중쇄 뉴클레오티드 서열(서열 번호 37):
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCAGGCAGGTCCCTGAGGCTGTCTTGTGCAGCAAGCGGCTTCATCTTTTCCTCTTACGCAATGCACTGGGTGCGGCAGGCACCTGGAAACGGCCTGGAGTGGGTGGCCTTCATGTCCTACGACGGCTCTAATAAGAAGTATGCCGATTCCGTGAAGGGCCGGTTTACAATCAGCAGAGACAACTCCAAGAATACCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGTGCCCGGGATAGAGGAATCGCAGCAGGAGGAAATTACTATTACTATGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGAGCTCC
항-TNFα의 가변 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 38):
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 뉴클레오티드 서열(서열 번호 39):
AAGCCTACCACAACCCCTGCACCACGGCCACCAACACCAGCACCTACCATCGCCTCTCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCAGAGGCATGCAGGCCAGCAGCAGGAGGAGCAGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGGACTTGCGGGGTGCTGCTGCTGTCACTGGTCATCACACTGTATTGTTGA
CD8α 힌지 및 막관통 도메인 아미노산 서열(서열 번호 40):
KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
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참고를 통한 포함: 등가물
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시는 그 전체가 참고로 포함된다.
예시적인 실시형태가 구체적으로 나타나 있고 기술되어 있을지라도, 첨부된 특허청구범위에 의해 포함되는 실시형태의 범주에서 벗어나지 않는 한 형태 및 세부사항에서의 다양한 변경이 그 내부에서 이루어질 수 있다는 것을 당업자라면 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore Tan, Hong Ji Adrian Campana, Dario <120> Neutralization of Human Cytokines with Membrane-Bound Anti-Cytokine Non-Signaling Binders Expressed in Immune Cells <130> 4459.1149-001 <150> 62/651,311 <151> 2018-04-02 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aIL6 CD8alpha signal peptide nucleotide sequence <400> 1 atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60 ccc 63 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aIL6 CD8alpha signal peptide amino acid sequence <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 318 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aIL6 Variable light chain nucleotide sequence of anti-IL6 <400> 3 gaaatcgtcc tgacccagtc ccctgccaca ctgtccctgt ctccaggaga gagggccacc 60 ctgagctgct ccgcctctat cagcgtgtcc tacatgtatt ggtaccagca gaagccagga 120 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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 213 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aIL6 CD8alpha hinge and transmembrane domain nucleotide sequence <400> 9 aagcctacca caaccccagc acccaggccc cctacacctg caccaaccat cgccagccag 60 ccactgtccc tgaggcccga ggcatgcagg cctgcagcag gaggcgccgt gcacacccgc 120 ggcctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcacccc tggctggaac ctgcggagtc 180 ctgctgctgt cactggtcat taccctgtat tgc 213 <210> 10 <211> 71 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aIL6 CD8alpha hinge and transmembrane domain amino acid sequence <400> 10 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 35 40 45 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 50 55 60 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 65 70 <210> 11 <211> 783 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> sec-aIL6 nucleotide sequence <400> 11 atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60 cccgaaatcg tcctgaccca gtcccctgcc acactgtccc tgtctccagg agagagggcc 120 accctgagct gctccgcctc tatcagcgtg tcctacatgt attggtacca gcagaagcca 180 ggacaggcac ctaggctgct gatctacgac atgtctaacc tggcaagcgg catccccgca 240 cgcttctctg gaagcggatc cggcacagac tttacactga ccatcagctc cctggagcct 300 gaggatttcg ccgtgtacta ttgcatgcag tggtccggct atccatacac atttggcggc 360 ggcaccaagg tggagatcaa gggcggcggc ggctctggag gaggaggaag cggaggagga 420 ggatccgagg tgcagctggt ggagagcggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggctccctg 480 cggctgtctt gtgccgccag cggcttcacc ttttctccat tcgccatgag ctgggtgaga 540 caggcaccag gcaagggcct ggagtgggtg gccaagatct cccctggcgg ctcttggaca 600 tactattccg acacagtgac cggccggttt accatctcca gagataacgc caagaacagc 660 ctgtatctgc agatgaatag cctgcgggcc gaggacacag ccgtgtacta ttgtgccaga 720 cagctgtggg gctactatgc cctggatatc tggggccagg gcaccacagt gaccgtgtct 780 agc 783 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> sec-aIL6 amino acid sequence <400> 12 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile 35 40 45 Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser 100 105 110 Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met 165 170 175 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys 180 185 190 Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly 195 200 205 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 210 215 220 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 225 230 235 240 Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser 260 <210> 13 <211> 63 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD8alpha signal peptide nucleotide sequence <400> 13 atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60 ccc 63 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD8alpha signal peptide amino acid sequence <400> 14 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 15 <211> 720 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz aIL6 scFv nucleotide sequence <400> 15 gaaatcgtcc tgacccagtc ccctgccaca ctgtccctgt ctccaggaga gagggccacc 60 ctgagctgct ccgcctctat cagcgtgtcc tacatgtatt ggtaccagca gaagccagga 120 caggcaccta ggctgctgat ctacgacatg tctaacctgg caagcggcat ccccgcacgc 180 ttctctggaa gcggatccgg cacagacttt acactgacca tcagctccct ggagcctgag 240 gatttcgccg tgtactattg catgcagtgg tccggctatc catacacatt tggcggcggc 300 accaaggtgg agatcaaggg cggcggcggc tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 360 tccgaggtgc agctggtgga gagcggcggc ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgcgg 420 ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttt tctccattcg ccatgagctg ggtgagacag 480 gcaccaggca agggcctgga gtgggtggcc aagatctccc ctggcggctc ttggacatac 540 tattccgaca cagtgaccgg ccggtttacc atctccagag ataacgccaa gaacagcctg 600 tatctgcaga tgaatagcct gcgggccgag gacacagccg tgtactattg tgccagacag 660 ctgtggggct actatgccct ggatatctgg ggccagggca ccacagtgac cgtgtctagc 720 <210> 16 <211> 240 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz aIL6 scFv amino acid sequence <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly 165 170 175 Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser 180 185 190 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 195 200 205 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr 210 215 220 Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 <210> 17 <211> 207 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD8alpha hinge and transmembrane domain nucleotide sequence <400> 17 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180 ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207 <210> 18 <211> 69 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD8alpha hinge and transmembrane domain amino acid sequence <400> 18 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 19 <211> 126 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz 41BB domain nucleotide sequence <400> 19 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 20 <211> 42 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz 41BB domain amino acid sequence <400> 20 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 21 <211> 336 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD3zeta domain nucleotide sequence <400> 21 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> aIL6BBz CD3zeta domain amino acid sequence <400> 22 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 23 <211> 978 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R gp130 domain nucleotide sequence <400> 23 atgctgacac tgcagacatg gctggtccag gcactgttta tctttctgac aaccgagtcc 60 acaggcgaac tgctggatcc ttgcgggtac atctctccag agagccccgt ggtgcagctg 120 cactccaact tcaccgccgt gtgcgtgctg aaggagaagt gtatggacta ctttcacgtg 180 aacgccaatt atatcgtgtg gaagacaaac cacttcacca tccctaagga gcagtacaca 240 atcatcaata gaaccgccag ctccgtgacc ttcaccgata tcgccagcct gaacatccag 300 ctgacatgca atatcctgac cttcggccag ctggagcaga acgtgtatgg catcaccatc 360 atctccggcc tgccccctga gaagccaaag aacctgtctt gcatcgtgaa tgagggcaag 420 aagatgaggt gtgagtggga ccggggcaga gagacacacc tggagacaaa tttcaccctg 480 aagtccgagt gggccaccca caagtttgcc gactgcaagg ccaagaggga tacacccacc 540 agctgtacag tggattactc caccgtgtat tttgtgaaca tcgaagtgtg ggtggaggcc 600 gagaatgccc tgggcaaggt gaccagcgac cacatcaact tcgatcccgt gtacaaggtg 660 aagcctaacc caccccacaa tctgtctgtg atcaatagcg aggagctgtc tagcatcctg 720 aagctgacat ggaccaaccc ctccatcaag tctgtgatca tcctgaagta caatatccag 780 tatagaacaa aggacgccag cacctggtcc cagatccctc cagaggatac agcctccacc 840 aggtcctctt ttacagtgca ggacctgaag cctttcaccg agtacgtgtt ccggatccgg 900 tgtatgaagg aggacggcaa gggctactgg tctgattgga gcgaggaggc ctccggcatc 960 acctatgagg acaggcca 978 <210> 24 <211> 326 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R gp130 domain amino acid sequence <400> 24 Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu 1 5 10 15 Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser 20 25 30 Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys 35 40 45 Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr 50 55 60 Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr 65 70 75 80 Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser 85 90 95 Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu 100 105 110 Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys 115 120 125 Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys 130 135 140 Glu Trp Asp Arg Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu 145 150 155 160 Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg 165 170 175 Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val 180 185 190 Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr 195 200 205 Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro 210 215 220 Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu 225 230 235 240 Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys 245 250 255 Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile 260 265 270 Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp 275 280 285 Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu 290 295 300 Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile 305 310 315 320 Thr Tyr Glu Asp Arg Pro 325 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R GSG linker nucleotide sequence <400> 25 ggaggaggag gaagcggagg aggaggctcc ggcggcggcg gctct 45 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R GSG linker amino acid sequence <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 663 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R IL-6R domain nucleotide sequence <400> 27 gtggatgtgc cccctgagga gccccagctg tcttgcttca ggaagtcccc tctgtctaac 60 gtggtgtgcg agtggggacc tcgcagcacc ccatccctga ccacaaaggc cgtgctgctg 120 gtgcggaagt tccagaatag ccctgccgag gactttcagg agccatgcca gtactctcag 180 gagagccaga agttcagctg tcagctggca gtgccagagg gcgatagctc cttttatatc 240 gtgtccatgt gcgtggcctc tagcgtgggc tccaagttct ctaagacaca gacctttcag 300 ggctgtggca tcctgcagcc tgacccaccc gccaacatca cagtgaccgc cgtggcccgg 360 aatccaagat ggctgtctgt gacatggcag gatccccaca gctggaactc ctctttctac 420 cggctgagat ttgagctgag gtatcgcgcc gagcggagca agacctttac cacatggatg 480 gtgaaggacc tgcagcacca ctgcgtgatc cacgatgcat ggagcggcct gaggcacgtg 540 gtgcagctga gagcacagga ggagttcgga cagggagagt ggagcgagtg gtccccagag 600 gcaatgggaa caccatggac cgagagccgc tcccctccag cagagaatga ggtgagcaca 660 cca 663 <210> 28 <211> 221 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R IL-6R domain amino acid sequence <400> 28 Val Asp Val Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser 1 5 10 15 Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser 20 25 30 Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro 35 40 45 Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys 50 55 60 Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile 65 70 75 80 Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr 85 90 95 Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn 100 105 110 Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr 115 120 125 Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe 130 135 140 Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met 145 150 155 160 Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly 165 170 175 Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly 180 185 190 Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu 195 200 205 Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro 210 215 220 <210> 29 <211> 213 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R CD8alpha hinge and transmembrane domain nucleotide sequence <400> 29 aagccaacca caacccctgc accacggccc cctacaccag cacctaccat cgcatcccag 60 ccactgtctc tgaggcctga ggcatgcagg ccagcagcag gaggagcagt gcacacccgg 120 ggcctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggccccac tggctggcac ttgcggggtc 180 ctgctgctgt ccctggtcat cactctgtat tgc 213 <210> 30 <211> 71 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-gp130-IL6R CD8alpha hinge and transmembrane domain amino acid sequence <400> 30 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 35 40 45 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 50 55 60 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 65 70 <210> 31 <211> 63 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha CD8alpha signal peptide nucleotide sequence <400> 31 atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60 ccc 63 <210> 32 <211> 21 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha CD8alpha signal peptide amino acid sequence <400> 32 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 33 <211> 330 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha Variable light chain nucleotide sequence of anti TNFalpha <400> 33 gaaatcgtcc tgacccagtc ccccgccaca ctgtctctga gcccaggaga gagggccacc 60 ctgagctgca gagcctccca gtctgtgagc tcctacctgg cctggtatca gcagaagcca 120 ggacaggcac caaggctgct gatctacgac gcatccaaca gggcaacagg catccccgca 180 cgcttcagcg gatccggatc tggcagcggc accgacttta cactgaccat ctctagcctg 240 gagcctgagg atttcgccgt gtactattgc cagcagcgca gcaattggcc ccctttcaca 300 tttggcccag gcaccaaggt ggatatcaag 330 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha variable light chain amino acid sequence of anti TNFalpha <400> 34 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 85 90 95 Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha GSG linker nucleotide sequence <400> 35 ggaggaggag gatccggagg aggaggatct ggcggcggcg gcagc 45 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha GSG linker amino acid sequence <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 37 <211> 378 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha Variable heavy chain nucleotide sequence of anti TNFalpha <400> 37 caggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc gtggtgcagc caggcaggtc cctgaggctg 60 tcttgtgcag caagcggctt catcttttcc tcttacgcaa tgcactgggt gcggcaggca 120 cctggaaacg gcctggagtg ggtggccttc atgtcctacg acggctctaa taagaagtat 180 gccgattccg tgaagggccg gtttacaatc agcagagaca actccaagaa taccctgtat 240 ctgcagatga actctctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgtgc ccgggataga 300 ggaatcgcag caggaggaaa ttactattac tatggcatgg acgtgtgggg ccagggcacc 360 acagtgaccg tgagctcc 378 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha Variable heavy chain amino acid sequence of anti TNFalpha <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 39 <211> 216 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha CD8alpha hinge and transmembrane domain nucleotide sequence <400> 39 aagcctacca caacccctgc accacggcca ccaacaccag cacctaccat cgcctctcag 60 cctctgagcc tgaggccaga ggcatgcagg ccagcagcag gaggagcagt gcacaccaga 120 ggcctggact ttgcctgtga tatctacatc tgggcccctc tggctgggac ttgcggggtg 180 ctgctgctgt cactggtcat cacactgtat tgttga 216 <210> 40 <211> 71 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mb-aTNFalpha CD8alpha hinge and transmembrane domain amino acid sequence <400> 40 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 35 40 45 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 50 55 60 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 65 70

Claims (20)

  1. 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로서,
    상기 mb-aIL6 scFv는,
    a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인과 상기 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및
    b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함하는 것인, 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-IL-6 가변 경쇄 도메인 및 상기 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 중 하나 이상은 인간 항-IL6 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인인 것인 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 가변 경쇄 도메인은 서열 번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 가변 중쇄 도메인은 서열 번호 8과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 도메인은 (G4S)x(여기서, x는 1 내지 100의 정수임)인 것인 벡터.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 도메인은 (G4S)3인 것인 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 및 막관통 도메인은 CD8α 힌지 및 막관통 도메인인 것인 벡터.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 암호화하는 것인 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 항-CD19-41BB-CD3ζ 키메라 항원 수용체(CAR)인 것인 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 mb-aIL6은 P2A 서열에 의해 상기 항-CD19-41BB-CD3ζ에 결합되는 것인 벡터.
  11. 항-IL6 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로서,
    상기 항-IL6 CAR은,
    a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인과 상기 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 제1 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv);
    b) 상기 항-IL6 scFv에 대해 N-말단에 있는 제2 링커 도메인;
    c) 상기 제2 링커 도메인에 대해 N-말단에 있는 힌지 및 막관통 도메인; 및
    d) 상기 힌지 및 막관통 도메인에 대해 N-말단에 있는 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 것인, 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 41BB 도메인인 것인 벡터.
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 있는 공동 자극 도메인을 추가로 포함하는 것인 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공동 자극 도메인은 CD3ζ 도메인인 것인 벡터.
  15. 포유동물에서 IL-6 농도를 감소시키는 방법으로서,
    T 세포에서 막-결합 항-IL6(mb-aIL6) 단일쇄 가변 절편(scFv)을 발현시키는 단계; 및
    상기 T 세포를 IL-6을 함유하는 유체와 접촉시키는 단계를 포함하며,
    이때 상기 mb-aIL6은,
    a) 항-IL-6 가변 경쇄 도메인, 항-IL-6 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인과 상기 가변 중쇄 도메인을 연결시키는 링커 도메인을 포함하는 항-IL6 단일쇄 가변 절편(항-IL6 scFv); 및
    b) 항-IL6 scFv에 결합되어 있는 힌지 및 막관통 도메인을 포함하는 것인, 포유동물에서 IL-6 농도를 감소시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 mb-aIL6을 발현하는 새로운 T 세포를 생성하기 위해 상기 T 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 위험성을 감소시키는 단계를 추가로 포함하며, 이때 상기 포유동물의 T 세포는 키메라 항원 수용체를 발현하는 것인 방법.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 포유동물은 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 림프구 증식성 질환을 앓고 있으며, 상기 포유동물에서의 IL-6 농도의 감소에 의해 상기 자가면역 질병, 상기 염증성 질병 또는 상기 림프구 증식성 질환이 각각 치료되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 포유동물은 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 이식편대숙주 질병 또는 캐슬맨(Castleman) 질병을 앓고 있으며, IL-6 농도의 감소에 의해 류머티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 이식편대숙주 질병 또는 캐슬맨 질병이 각각 치료되는 것인 방법.
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