CN112055717A

CN112055717A - 用在免疫细胞中表达的膜结合抗细胞因子非信号传导粘合剂中和人细胞因子

Info

Publication number: CN112055717A
Application number: CN201980022423.4A
Authority: CN
Inventors: 陈鸿基; D·坎帕纳
Original assignee: National University of Singapore
Current assignee: National University of Singapore
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: EP3774896A4; EP3774896A1; KR20200138741A; WO2019193476A1; JP7334985B2; CA3093518A1; US20210017271A1; CN112055717B; JP2021519593A; SG11202008976YA; AU2019248842A1

Abstract

描述了转基因T细胞和用于制备转基因T细胞的载体。这些载体可包括编码膜结合抗IL6(mb‑aIL6)单链可变片段(scFv)的核酸，并且这些转基因T细胞可表达mb‑aIL6。这些转基因T细胞可用于抑制IL‑6依赖性细胞的增殖，降低IL‑6浓度，或用于两者。在一个实施例中，该载体是编码该mb‑alL6和抗CD19‑41 BB‑003ζ嵌合抗原受体(CAR)的双顺反子构建体。在另一个实施例中，抗IL‑6 scFv可与41 BB和003ζ结构域连接以形成抗IL‑6 CAR。表达所述构建体的转基因T细胞可降低正在接受CAR T细胞治疗的癌症患者的细胞因子释放综合征(CRS)的风险，或用于治疗细胞因子参与发病机制的自身免疫疾病和炎性疾病。

Description

用在免疫细胞中表达的膜结合抗细胞因子非信号传导粘合剂中和人细胞因子

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月2日提交的美国临时申请号62/651,311的权益。上述申请的全部传授内容通过引用并入本文。

ASCII文本文件中的材料通过引用并入

本申请将包含在以下ASCII文本文件中的序列表通过引用并入，该序列表在此同时提交：

a)文件名称：44591149001SequenceListing.txt；2019年3月29日创建，33KB大小。

背景技术

白细胞介素-6(IL-6)是一种促炎细胞因子，其参与多种自身免疫和炎性疾病(包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、和移植物抗宿主病(GvHD))的发病机制。

IL-6也参与细胞因子释放综合征(CRS)的发展，该细胞因子释放综合征是输注用嵌合抗原受体(CAR)重定向的T细胞后最常见的副作用之一。CRS可能很严重，并且在某些情况下是致命的。IL-6对CRS的发展至关重要，并且目前使用抗IL-6受体抗体(托珠单抗)来遏制其作用。

用于降低自身免疫疾病和CRS的严重程度和发病率的方法是令人希望的。

发明内容

本文描述了核酸、载体和转基因宿主细胞，以及制备和使用这些核酸、载体和转基因宿主细胞的方法。可以将核酸掺入载体中，该载体可以用于在宿主细胞中表达核酸。可以在降低细胞因子(如IL-6)浓度的方法中将转基因宿主细胞引入(例如，输入、植入、移入、注入)宿主哺乳动物(例如人)中。可以在降低细胞因子(如IL-6)浓度的方法中在宿主哺乳动物(例如人)中表达核酸。

在一些实施例中，载体包括编码膜结合抗细胞因子单链可变片段(scFv)的核酸。膜结合抗细胞因子可包括抗细胞因子单链可变片段(抗细胞因子scFv)，以及与该抗细胞因子scFv偶联的铰链和跨膜结构域。抗细胞因子scFv可包括抗细胞因子可变轻链结构域、抗细胞因子可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域。抗细胞因子构建体可以对多种细胞因子，如IL-6(例如抗IL-6)、(TNF)-α(例如抗TNF-α)、IL-1β(例如抗IL-1β)、IL-12(例如抗IL-12)、IL-17(例如抗IL-17)、IL-18(例如抗IL-18)、IFNγ(例如抗IFNγ)等具有特异性。

在一些实施例中，核酸编码膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)。mb-aIL6可包括抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)。抗IL6 scFv可包括抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域。铰链和跨膜结构域可以与抗IL6 scFv偶联。在一些实施例中，载体的核酸可进一步编码嵌合抗原受体(CAR)，如抗CD19-41BB-CD3ζ。

本文所述的载体可用于产生转基因细胞，如转基因T细胞。特别地，转基因T细胞可用于抑制IL-6依赖性细胞的增殖，降低IL-6浓度，或用于两者。在一些实施例中，转基因T细胞可用于降低哺乳动物(例如人)，例如正在(例如针对癌症)治疗的哺乳动物的细胞因子释放综合征(CRS)的风险或严重程度。在一些实施例中，哺乳动物正在接受用嵌合抗原受体(CAR)T细胞的治疗(例如，针对癌症的治疗)。一个实例是患者正在接受用表达抗CD19 CAR的T细胞进行的针对癌症的治疗。

转基因T细胞还可以用于治疗如下哺乳动物，该哺乳动物患有细胞因子参与发病机制的疾病或障碍，如自身免疫疾病、炎性疾病、或淋巴增生性障碍。自身免疫疾病的实例包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。炎性疾病的实例包括移植物抗宿主病和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症。淋巴增生性障碍的实例是卡斯尔曼病(Castleman disease)。

附图说明

根据示例实施例的以下更具体的说明，上述内容将是清楚的，如在这些附图中展示的，其中贯穿这些不同的视图，相同的附图标记是指相同的部分。这些图不一定是按比例绘出，而是着重展示实施例。

图1A-D涉及mb-aIL6的设计和表达。图1A是mb-aIL6构建体的示意图。图1B是MSCV-mb-aIL6-IRES-GFP质粒的示意图。图1C是用仅GFP(“模拟物”)或GFP加mb-aIL6转导的Jurkat细胞的流式细胞术分析。点图示出了用生物素缀合的山羊抗人F(ab′)2抗体和链霉亲和素APC(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories))染色后的GFP荧光和mb-aIL6表达。图1D是IL-6与模拟物转导的或mb-aIL6转导的Jurkat细胞结合的流式细胞术分析。点图示出了用IL-6生物素(艾博抗公司(Abcam))和链霉亲和素APC染色后的GFP荧光和IL-6结合。大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)-生物素用作对照。

图2A-E涉及mb-aIL6构建体的功能。图2A是显示IL-6的水平的图表。将用仅GFP(“模拟物”)或GFP加mb-aIL6转导的Jurkat细胞(2x10⁶/mL)在含有1ng/mL人IL-6的组织培养基中培养2小时。培养结束时，通过ELISA测量IL-6的水平。图2B是显示IL-6中和具有细胞剂量依赖性的图。测试了不同的细胞浓度(0.25-2x10⁶/mL)，并且通过ELISA测量了培养2小时后上清液中IL-6的水平。图2C是显示IL-6中和具有时间依赖性的图。如关于图2A所述建立培养物，并且在指定的培养时间后测量上清液中IL-6的水平。将细胞孵育10、30、60和120分钟。虚线曲线表示拟合的指数衰减曲线。图2D是显示mb-aIL6 Jurkat细胞在低IL-6浓度下仍然有效的图表。如关于图2A所述建立培养物，但是组织培养基中IL-6的初始浓度范围为从0.025至0.2ng/mL且Jurkat细胞的初始浓度为0.5x10⁶/mL。图2E是显示通过允许Jurkat-mb-aIL6细胞增殖来增强IL-6中和的图。如关于图2A所述建立培养物，但是初始细胞浓度为0.2x10⁶个细胞/mL；在2-72小时后通过ELISA测量上清液中的IL-6。

图3A-B显示表达mb-aIL6的细胞消除了IL-6依赖性信号转导和细胞增殖。图3A是显示通过暴露于mb-aIL6 Jurkat细胞而防止由IL-6引发的U937细胞中Stat3磷酸化的图表。将未转导的(“WT”)或用GFP加mb-aIL6转导的Jurkat细胞(2x10⁶/mL)在含有1ng/mL人IL-6的组织培养基中培养2小时。然后在37℃下将上清液添加至U937细胞中持续15分钟。含或不含IL-6的组织培养基(“无T细胞”)用作对照。柱状图显示了在用抗磷酸化Stat3抗体(BD生物科学公司(BD Biosciences)抗Stat3 pY705)染色后，如通过流式细胞术测量的Stat3磷酸化的平均值(±SD)。***P<0.001。图3B是显示通过暴露于mb-aIL6 Jurkat细胞而抑制DS-1细胞的IL-6依赖性增殖的图。将用mCherry转导的DS-1和模拟物转导的或mb-IL6转导的Jurkat细胞与IL-6(0.5ng/mL)以1:1的比率共培养。使用IncuCyte活体成像系统(伊森公司(Essen))定量DS-1增殖；结果表示为一式三份测量值的红色校准单元(RCU)xμm²/孔的平均值(±SD)。**P<0.01针对120小时的测量值。

图4A-D显示了mb-aIL6构建体在外周血T细胞上的表达和功能。图4A是用仅GFP(“模拟物”)或GFP加mb-aIL6转导的外周血T细胞的流式细胞术分析。点图示出了用生物素缀合的山羊抗人F(ab′)2抗体和链霉亲和素APC染色后的GFP荧光和mb-aIL6表达。图4B是IL-6与模拟物转导的或mb-aIL6转导的外周血T细胞结合的流式细胞术分析。点图示出了用IL-6生物素和链霉亲和素APC染色后的GFP荧光和IL-6结合。图4C是用抗CD3 APC、抗CD56PE、抗CD4 V450和抗CD8 PerCP(BD生物科学公司)标记的、模拟物转导的或mb-aIL6转导的外周血T细胞的细胞标记谱。图4D是显示通过暴露于mb-aIL6 T淋巴细胞而抑制DS-1细胞的IL-6依赖性增殖的图。将用mCherry转导的DS-1和模拟物转导的或mb-aIL6转导的T细胞与IL-6(0.5ng/mL)以1:1的比率共培养。使用IncuCyte活体成像系统(伊森公司)定量DS-1增殖；结果表示为一式三份测量值的红色校准单元(RCU)xμm²/孔的平均值(±SD)。**P<0.01针对120小时的测量值。

图5A-C显示了编码mb-aIL6和抗CD19 CAR的双顺反子构建体的设计、表达和IL-6中和能力。图5A是含有两种受体(“DUAL”)的MSCV质粒的示意图。图5B是用仅GFP(“模拟物”)、GFP加抗CD19-41BB-CD3ζCAR、mb-aIL6、或两者转导的外周血T细胞的流式细胞术分析。点图示出了用生物素缀合的山羊抗人F(ab′)2抗体和链霉亲和素APC染色后的mb-aIL6表达，以及用CD19-myc随后用R-藻红蛋白(PE)缀合的抗myc(细胞信号传导技术公司(CellSignaling Technology))染色后的抗CD19 CAR表达。图5C是显示mb-aIL6 T淋巴细胞中和IL-6不受CAR共表达影响的图。将如关于图5B所述转导的T淋巴细胞在含有1ng/mL IL-6的组织培养基中培养。2小时后，通过ELISA测量上清液中的IL-6。

图6A-D显示了mb-aIL6的表达不影响抗CD19 CAR功能。图6A是显示以1:1的E:T比率在与CD19+ALL细胞系OP-1共培养6小时的T细胞中IFN-γ产生的图。在用PE缀合的抗人IFNγ抗体(BD生物科学公司)染色后，通过流式细胞术测量IFNγ的表达。符号表示用来自3个供体的T细胞获得的一式三份实验的结果。图6B是显示以1:1的E:T比率在与OP-1共培养4小时的T细胞中CD107a表达的图。在用PE缀合的抗人CD107a抗体(BD生物科学公司)染色后，通过流式细胞术测量CD107a表达。图6C是显示以1:1的E:T比率4小时后T细胞对OP-1的细胞毒性的图。图6D是两个图表，其显示以1:1的E:T比率与或不与经照射的OP-1(含120IU/mLIL-2)共培养21天的T细胞的增殖。在第0天、第7天和第14天添加经照射的OP-1细胞。符号表示一式三份测量值的平均值(±SD)。

图7A-B显示了在CRS的体外模型中表达mb-aIL6和抗CD19 CAR的T细胞的功能。图7A是两个图，其显示与含或不含THP-1细胞的mCherry转导的OP-1细胞共培养的T细胞(1:5:1T细胞:OP-1:THP-1比率)的细胞毒性。使用IncuCyte活体成像系统(伊森公司)定量OP-1细胞数量；结果表示为一式三份测量值的红色校准单元(RCU)xμm²/孔的平均值(±SD)。图7B是显示培养40小时后，通过ELISA测量的图7A所示培养物的上清液中IL-6的水平的图表。

图8A-C是其他IL-6中和受体的示意图。图8A是核酸构建体的示意图，该核酸构建体针对分泌的aIL6和表达分泌的aIL6的细胞。图8B是核酸构建体的示意图，该核酸构建体针对与41BB结构域和CD3ζ结构域连接的抗IL-6scFv，从而形成抗IL6CAR。图8C是核酸构建体的示意图，其中抗IL6 scFv被丧失信号传导能力的IL-6受体替换。

图9A-B显示了T细胞中mb-aIL6的表达在体内中和了IL-6。在第0天向NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratory)，巴尔港，缅因州)腹膜内注射1x10⁶个DS-1细胞，并且在第2天向其腹膜内注射用仅GFP(“模拟物”)或GFP加mb-aIL6转导的1x10⁷个外周血T细胞。使用Xenogen IVIS-200系统(卡尺生命科学公司(Caliper Life Sciences))测量肿瘤植入和生长。从第0天开始，每2天所有小鼠腹膜内接受1000IU人IL-6和20000IU人IL-2。图9A是小鼠的腹侧和背侧图像。图9B是显示在植入表达萤光素酶的DS-1的小鼠中发光变化的图表。每个符号对应一个生物发光测量值；线连接一只小鼠中的所有测量值。

图10A-F显示了mb-aIL6的表达不影响体内抗CD19 CAR功能。在第0天向NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，缅因州)静脉内注射0.5x10⁶个Nalm-6细胞，并且在第3天向其静脉内注射用抗CD19-41BB-CD3ζ(CAR)或CAR加mb-aIL6(CAR+mb-aIL6)转导的2x10⁷个外周血T细胞。使用Xenogen IVIS-200系统(卡尺生命科学公司)测量肿瘤植入和生长。从第0天开始，每2天所有小鼠腹膜内接受20000IU人IL-2。当信号阈值达到10¹⁰个光子/秒时，对小鼠进行安乐死。图10A是小鼠的腹侧和背侧图像。在注射工程化T细胞之前，以增强的敏感性对第3天的图像进行了处理，以显示肿瘤的存在。图10B是显示在植入表达萤光素酶的Nalm-6的小鼠中发光变化的图表。图10C是小鼠的腹侧和背侧图像。在注射工程化T细胞之前，以增强的敏感性对第3天的图像进行了处理，以显示肿瘤的存在。图10D是显示第53天的CAR T细胞计数的图表。经由颊刺获得小鼠血液，并使用流式细胞术定量CAR T细胞。图10E是示出小鼠的存活曲线的图表。通过对数秩检验计算未注射T细胞的小鼠与注射CAR-T细胞或CAR-T+mb-aIL6的小鼠的曲线(P<0.01针对任一比较)。图10F是显示在植入表达萤光素酶的Nalm-6的小鼠中发光变化的图表。每个符号对应一个生物发光测量值；线连接一只小鼠中的所有测量值。

图11A-B涉及mb-aTNFα的设计。图11A是mb-aTNFα构建体的示意图。图11B是MSCV-mb-aTNFα-IRES-GFP质粒的示意图。

具体实施方式

示例实施例的描述如下。

白细胞介素-6和细胞因子释放综合征

白细胞介素-6(IL-6)是一种促炎细胞因子，其参与多种自身免疫疾病、炎性疾病、和淋巴增生性障碍，包括移植物抗宿主病(GvHD)、类风湿性关节炎、和系统性红斑狼疮的发病机制。IL-6也参与细胞因子释放综合征(CRS)的发展，该细胞因子释放综合征是输注用嵌合抗原受体(CAR)重定向的T细胞后最常见的副作用之一。CRS可能很严重，并且在某些情况下是致命的。^7-10IL-6对CRS的发展至关重要，并且目前使用抗IL-6受体抗体(托珠单抗)来遏制其作用。^7-10

本文所述的载体可用于产生经修饰的T细胞，继而可用于治疗自身免疫疾病和CRS。本文所述的过程可用于产生可中和IL-6的转基因T细胞，从而降低CRS的风险和/或严重程度。虽然本文所述的特定实例使用IL-6作为范例，但该方法适用于中和参与自身免疫疾病和CRS的发病机制的其他细胞因子。

核酸

如本文所用，术语“核酸”是指包含多个核苷酸单体(例如，核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体)的聚合物。“核酸”包括例如DNA(例如，基因组DNA和cDNA)、RNA和DNA-RNA杂合分子。核酸分子可以是天然存在的、重组的或合成的。另外，核酸分子可以是单链的、双链的或三链的。在某些实施例中，核酸分子可以被修饰。在双链聚合物的情况下，“核酸”可以指分子的任一条链或两条链。

术语“核苷酸”和“核苷酸单体”是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，以及其非天然存在的衍生物和类似物。相应地，核苷酸可包括例如包含天然存在的碱基(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、肌苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、或脱氧胞苷)的核苷酸和包含本领域已知的经修饰的碱基的核苷酸。

如本文所用，术语“序列同一性”是指当比对序列以实现最大同一性水平时，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度，将该程度表示为百分比。对于序列比对和比较，通常将一个序列指定为参考序列，将其与测试序列进行比较。参考序列和测试序列之间的序列同一性表示为跨参考序列整个长度的位置的百分比，其中当比对参考序列和测试序列以实现最大同一性水平时，参考序列和测试序列共享相同的核苷酸或氨基酸。作为实例，当进行比对以实现最大同一性水平时，两个序列被认为具有70％序列同一性，测试序列在参考序列整个长度的70％相同位置上具有相同的核苷酸或氨基酸残基。

本领域普通技术人员可以使用适当的比对方法或算法来容易地进行用于比较的序列比对，以实现最大同一性水平。在某些情况下，比对可包括引入的空位以提供最大同一性水平。实例包括Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法，Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法研究，这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或目测检查(一般参见，Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南])。

当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于确定序列同一性百分比的常用工具是蛋白质基本局部比对搜索工具(BLASTP)，其可通过美国国立卫生研究院(UnitedStates National Institutes of Health)的国家医学图书馆(National Library ofMedicine)的美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)获得。(Altschul等人,J Mol Biol.[分子生物学杂志]215(3):403-10(1990))。

在不同实施例中，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列可具有至少例如70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。当确定与本文所述的一个或多个序列的序列同一性百分比时，本文所述的序列是参考序列。

在一些实施例中，可变轻链结构域与SEQ ID NO:4具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。在一些实施例中，可变重链结构域与SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或更高的序列同一性。

载体

术语“载体”、“载体构建体”和“表达载体”意指可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞中，从而转化宿主并促进所引入的序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体通常包含可传播药剂的DNA，通过限制酶技术将编码蛋白质的外源DNA插入其中。载体的常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含(self-contained)分子，该双链DNA可以容易地接受其他(外源)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞中。已经描述了用于在多种真核和原核宿主中复制和/或表达的大量载体，包括质粒和真菌载体。

术语“表达(express和expression)”意指允许或使基因或DNA序列中的信息得以表现，例如通过活化与相应基因或DNA序列的转录和翻译有关的细胞功能来产生蛋白质。DNA序列在细胞中表达或由细胞表达以形成“表达产物”如蛋白质。表达产物本身，例如所得蛋白质，也可以说成是由细胞“表达”的。例如，当多核苷酸或多肽在外源或天然启动子的控制下在外源宿主细胞中表达或产生时，或者在外源启动子的控制下在天然宿主细胞中表达或产生时，该多核苷酸或多肽重组表达。

基因递送载体通常包括与启动子可操作地连接的转基因(例如，编码酶的核酸)和在引入载体的宿主细胞中表达该转基因所需的其他核酸元件。用于基因表达的合适的启动子和递送构建体是本领域已知的。重组质粒还可以包含可诱导的或可调节的启动子，用于在细胞中表达酶。

多种基因递送媒介物是本领域已知的，并且包括病毒和非病毒(例如裸DNA、质粒)载体两者。适用于基因递送的病毒载体是本领域技术人员已知的。此类病毒载体包括例如源自疱疹病毒的载体、杆状病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、和鼠干细胞病毒(MSCV)。病毒载体可以是复制的或非复制的。可以使用本文披露或引用的方法或者相关领域技术人员已知的其他方法将此类载体引入许多适当的宿主细胞中。

用于基因递送的非病毒载体包括裸DNA、质粒、转座子和mRNA等等。非限制性实例包括pKK质粒(克泰科公司(Clonetech))、pUC质粒、pET质粒(Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州)、pRSET或pREP质粒(英杰公司(Invitrogen)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、pMAL质粒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州)。可以使用本文披露或引用的方法或者相关领域技术人员已知的其他方法将此类载体引入许多适当的宿主细胞中。

在某些实施例中，载体包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，载体包括选择标记，如氨苄青霉素抗性基因(Amp)。在一些实施例中，核酸编码荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施例中，核酸适合于亚克隆到EcoRI和XhoI之间的pMSCV-IRES-GFP中。在一些实施例中，载体含有用于插入所需基因的多克隆位点(MCS)。

尽管遗传密码是简并的，因为大多数氨基酸由多个密码子(称为“同义”或“同义的”密码子)表示，但是在本领域中应理解，特定生物体的密码子使用是非随机的，并且偏向于特定的密码子三联体。相应地，在一些实施例中，载体包括已经针对在特定类型的宿主细胞中表达而优化(例如，通过密码子优化)的核苷酸序列。密码子优化是指如下过程，在该过程中，对编码目的蛋白的多核苷酸进行修饰，以用编码相同的一个或多个氨基酸但在表达核酸的宿主细胞中更普遍使用/识别的密码子替换该多核苷酸中的特定密码子。在一些方面，本文所述的多核苷酸经密码子优化以在T细胞中表达。

膜结合抗细胞因子构建体

可以如本文所述产生膜结合抗细胞因子构建体，其实例是图1A的mb-aIL6构建体。抗细胞因子构建体可以对多种细胞因子，例如IL-6、(TNF)-α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-18、IFNγ等具有特异性。

图1A示出了特定的构建体，其是与铰链和跨膜结构域偶联的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)。抗IL6 scFv包括抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域。可变轻链结构域和可变重链结构域的相对位置可以颠倒，但它们均在跨膜结构域的N’末端，在图1A中示为CD8α铰链和跨膜结构域。构建体还可以包括N-末端信号肽(图1A中未显示)，如CD8α信号肽。图1B是MSCV mb-aIL6-IRES-GFP质粒的示意图。

多种接头结构域是合适的。在一些实施例中，接头结构域可以是(G4S)_x，其中x是从1至100的整数。在一些实施例中，接头结构域可以是(G4S)₃。在其他实施例中，接头结构域可以是一个或多个甘氨酸残基。在其他实施例中，接头结构域可以是(EAAAK)₃。

多种铰链和跨膜结构域是合适的。在一些实施例中，铰链结构域可以是CD8α铰链结构域。在一些实施例中，跨膜结构域可以是CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，铰链和跨膜结构域可以是CD8α铰链和跨膜结构域。在一些实施例中，铰链可以是多个甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，跨膜结构域可以是来自CD4、CD8β、CD16、CD28、CD32、CD34、CD64、CD137、FcεRIγ、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、VEGFR2、FAS、或FGFR2B的跨膜结构域。

虽然图1A的实施例是抗IL6构建体，但是可以采用类似方法来产生用于其他细胞因子(如肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-18、IFNγ等)的构建体，和/或阻断其受体。例如，基于图1A中的示意图，抗IL6 scFv部分可以被特异性结合至不同细胞因子(如(TNF)-α(图11)、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-18、或IFNγ)的不同scFv替换。本文的全部传授内容同样适用于表达中和细胞因子的膜结合蛋白的构建体。

多种中和受体可以在相同的细胞上或在不同的细胞亚群中表达，以发挥全面且持久的抗炎作用。

转基因宿主细胞的制备方法

本文描述了制备转基因宿主细胞(如转基因T细胞)的方法。转基因宿主细胞可以例如通过将本文所述的载体实施例中的一种或多种引入宿主细胞中来制备。

在一个实施例中，该方法包括将载体引入宿主细胞中，该载体包括编码膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)的核酸。在一些实施例中，载体的核酸可进一步编码嵌合抗原受体(CAR)，如抗CD19-41BB-CD3ζ。在一些实施例中，核酸(如双顺反子载体)表达mb-aIL6和CAR。在一些实施例中，两种单独的载体可以用于产生表达mb-aIL6和CAR的转基因细胞，如转基因T细胞。

在一些实施例中，一种或多种核酸被整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，可以使用本领域已知的多种合适方法中的任一种(包括例如同源重组、基于CRISPR的系统(例如CRISPR/Cas9；CRISPR/Cpf1)、和TALEN系统)将待整合到宿主基因组中的核酸引入宿主细胞中。

值和范围

除非另作说明或另外从上下文和本领域的普通技术人员所理解的明显可见，在不同实施例中表示为范围的值可以采取所陈述的范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另作清楚规定。关于数值的“约”通常是指落入±8％的值，在一些实施例中±6％，在一些实施例中±4％，在一些实施例中±2％，在一些实施例中±1％，在一些实施例中±0.5％的值的范围，除非另作说明或另外从上下文明显可见。

实例实施例：载体

一个实施例是包括编码膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)的核酸的载体。mb-aIL6 scFv包括a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；和b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，抗IL-6可变轻链结构域和抗IL-6可变重链结构域中的一个或多个是人抗IL6可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施例中，可变轻链结构域与SEQID NO:4具有至少90％序列同一性。在一些实施例中，可变重链结构域与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性。

在一些实施例中，接头结构域是(G4S)_x，其中x是从1至100的整数。在一些实施例中，接头结构域是(G4S)₃。在一些实施例中，接头结构域是一个或多个甘氨酸残基。在一些实施例中，接头结构域是(EAAAK)₃。

在一些实施例中，铰链和跨膜结构域是CD8α铰链和跨膜结构域。在一些实施例中，铰链包含多个甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，跨膜结构域是来自CD4、CD8β、CD16、CD28、CD32、CD34、CD64、CD137、FcεRIγ、OX40、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、VEGFR2、FAS、或FGFR2B的跨膜结构域。

在一些实施例中，核酸进一步编码嵌合抗原受体(CAR)，如抗CD19-41BB-CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，mb-aIL6通过P2A序列与抗CD19-41BB-CD3ζ偶联。

实例实施例：载体

另一个实施例是包括编码抗IL6(aIL6)单链可变片段(scFv)的核酸的载体。该aIL6 scFv包括：a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)。

实例实施例：载体

另一个实施例是包括编码抗IL6嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体。该抗IL6CAR包括：a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的第一接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；b)在该抗IL6scFv的N-末端的第二接头结构域；c)在该第二接头结构域的N-末端的铰链和跨膜结构域；和d)在该铰链和跨膜结构域的N-末端的细胞内信号传导结构域。

在一些实施例中，细胞内信号传导结构域是41BB结构域。

在一些实施例中，载体还包括在该细胞内信号传导结构域的N-末端的共刺激结构域。在一些实施例中，共刺激结构域是CD3ζ结构域。

实例实施例：载体

另一个实施例是包括编码膜结合IL-6受体的核酸的载体。该膜结合IL-6受体包括：a)细胞外结构域；b)在该细胞外结构域的N-末端的接头结构域；c)IL-6受体α结构域；和d)跨膜结构域。

在一些实施例中，细胞外结构域是gp130细胞外结构域。

在一些实施例中，跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。

实例实施例：哺乳动物T细胞

另一个实施例是依据本文所述的任何实施例，包括编码膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)的转基因的哺乳动物T细胞。

在一些实施例中，该mb-aIL6 scFv可包括：a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；和b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一些实施例中，哺乳动物T细胞是人外周血T淋巴细胞。

实例实施例：抑制哺乳动物中IL-6依赖性细胞的增殖的方法

另一个实施例是抑制哺乳动物中IL-6依赖性细胞的增殖的方法。该方法包括：在T细胞中表达膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)。该mb-aIL6 scFv可以依据本文所述的任何实施例。

在一些实施例中，该mb-aIL6 scFv包括：a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；和b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，该哺乳动物是人。

实例实施例：降低哺乳动物中IL-6浓度的方法

另一个实施例是降低哺乳动物中IL-6浓度的方法。该方法包括：在T细胞中表达膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)，并使该T细胞与含有IL-6的液体接触。该mb-aIL6 scFv可以依据本文所述的任何实施例。

在一些实施例中，该mb-aIL6包括：a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；和b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，该哺乳动物是人。

在一些实施例中，该方法进一步包括培养该T细胞以产生表达该mb-aIL6的新T细胞。

在一些实施例中，该方法进一步包括降低细胞因子释放综合征(CRS)的风险，并且其中该哺乳动物的T细胞表达嵌合抗原受体。

在一些实施例中，嵌合抗原受体是抗CD19-41BB-CD3ζCAR。

在一些实施例中，嵌合抗原受体包括抗CD22结构域、抗CD20结构域、抗CD123结构域、B细胞成熟抗原(BCMA)结构域、抗间皮素结构域、抗CD7结构域、抗CD2结构域、抗CD5结构域、抗CD3结构域、抗Lewis Y结构域、抗EpCam结构域、抗Her2结构域、或抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)。

在一些实施例中，CAR还包括4-1BB结构域、CD3ζ结构域、CD28结构域、可诱导的T细胞共刺激因子(ICOS)结构域、DNAX活化蛋白10(DAP10)结构域、或DNAX活化蛋白12(DAP12)结构域。

在一些实施例中，该哺乳动物患有自身免疫疾病，并且降低该哺乳动物中的IL-6浓度可治疗该自身免疫疾病。

在一些实施例中，该哺乳动物患有类风湿性关节炎，并且降低IL-6浓度可治疗类风湿性关节炎。

在一些实施例中，该哺乳动物患有系统性红斑狼疮，并且降低IL-6浓度可治疗系统性狼疮。

在一些实施例中，该哺乳动物患有炎性疾病，并且降低该哺乳动物中的IL-6浓度可治疗该炎性疾病。

在一些实施例中，该哺乳动物患有移植物抗宿主病，并且降低IL-6浓度可治疗移植物抗宿主病。

在一些实施例中，该哺乳动物患有淋巴增生性障碍，并且降低IL-6浓度可治疗该淋巴增生性障碍。

在一些实施例中，该哺乳动物患有卡斯尔曼病，并且降低IL-6浓度可治疗卡斯尔曼病。

实例实施例：载体

在另一个实施例中，载体包括编码膜结合抗细胞因子单链可变片段(scFv)的核酸。该膜结合抗细胞因子scFv可以依据本文所述的任何实施例。

在一些实施例中，该膜结合抗细胞因子包括：a)含有抗细胞因子可变轻链结构域、抗细胞因子可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗细胞因子单链可变片段(抗细胞因子scFv)；和b)与该抗细胞因子scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，抗细胞因子是抗(TNF)-α、抗IL-1β、抗IL-12、抗IL-17、抗IL-18、或抗IFNγ。

范例

材料与方法

细胞

人细胞系Nalm-6(B细胞急性成淋巴细胞白血病，ALL)、Jurkat(T细胞ALL)、THP-1和U937(急性单核细胞白血病)、DS-1(B细胞淋巴瘤)和HEK293T(胚肾成纤维细胞)购自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。B-ALL细胞系OP-1是在我们的实验室中开发的。¹¹将Nalm-6、OP-1、THP-1、U937和Jurkat细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)(海克隆GE医疗公司(HyClone GE Healthcare)，洛根，犹他州)和1％青霉素/链霉亲和素(P/S)(PAN-Biotech公司，艾登巴赫，德国)的RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中。将DS-1细胞维持在补充有10％FBS、1％P/S和1ng/mL白细胞介素-6(IL-6)的RPMI-1640(赛默飞世尔科技公司)中。将HEK-293T维持在补充有10％FBS和1％P/S的DMEM(海克隆实验室公司(HyClone Laboratories))中。

将DS-1和Nalm-6用含有萤火虫萤光素酶基因的鼠干细胞病毒(MSCV)-内部核糖体进入位点(IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)逆转录病毒载体(获得自田纳西州孟菲斯圣裘德研究医院的载体开发和生产共享资源(St.Jude Children's Research Hospital VectorDevelopment and Production Shared Resource))转导，并使用MoFlo细胞分选仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，布雷亚市，加利福尼亚州)对其进行选择用于GFP表达。将DS-1和OP-1用含有mCherry的MSCV-IRES-GFP逆转录病毒载体转导，并使用MoFlo细胞分选仪对其进行选择用于mCherry表达。

为了诱导THP-1的分化，将2x10⁶个THP-1细胞在补充有10％FBS、1％P/S和20ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)的10mL RPMI-1640中培养72小时。随后使用1％EDTA(默克公司(Merck)，肯纳尔沃斯堡，新泽西州)收获分化的THP-1细胞。

从由国立大学医院献血中心(National University Hospital Blood DonationCentre)提供的血小板捐献物的废弃匿名副产物中通过密度梯度分离出外周血单核细胞。将单核细胞与Dynabeads人T活化因子CD3/CD28(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))在补充有10％FBS、1％P/S和120IU/ml白细胞介素-2(IL-2)(诺华公司(Novartis)，巴塞尔，瑞士)的RPMI-1640中培养3天。在第4天，去除抗CD3/CD28珠，并用新鲜的抗CD3/CD28珠再刺激细胞。随后将扩增的T细胞在补充有10％FBS、1％P/S和120IU/ml IL-2的RPMI-1640中培养。

质粒和逆转录病毒转导

mb-aIL6中抗IL6 scFv的重链和轻链结构域源自人抗IL6单克隆抗体AME-19a的公开序列，并与15个氨基酸[(G4S)₃]接头连接以形成单链可变片段(scFv)；该构建体由金斯瑞公司(GenScript)(南京，中国)合成。scFv与CD8α铰链和跨膜结构域(“mb-aIL6”)连接。抗CD19-41BB-CD3ζ构建体先前是在我们的实验室中开发的。¹²先前报道了用于连接mb-aIL6和抗CD19-41BB-CD3ζ的P2A序列。¹³将所有构建体亚克隆到EcoRI和XhoI之间的pMSCV-IRES-GFP中。

如前所述进行逆转录病毒上清液的制备和转导。¹⁴简而言之，将T细胞与逆转录病毒上清液在RetroNectin(宝生物公司(Takara)，大津，日本)的存在下于37℃孵育。此后每12小时用新鲜收获的上清液替换逆转录病毒上清液，持续接下来的三天。随后收获转导的T细胞，并将其在补充有10％FBS、1％P/S和200IU/mL IL-2的RPMI-1640中培养。

转导的细胞的表面染色

通过流式细胞术检测mb-aIL6和抗CD19-41BB-CD3ζ的表面表达。对于mb-aIL6，使用生物素缀合的山羊抗人F(ab)’2(杰克森免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，西格罗夫，宾夕法尼亚州)，随后用别藻蓝蛋白(APC)缀合的链霉亲和素(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)进行二级染色。细胞也用缀合至生物素(艾博抗公司，剑桥，英国)，随后是链霉亲和素APC的人IL-6标记；缀合至生物素的大豆胰蛋白酶抑制剂(来自R&D公司，明尼阿波里斯市，明尼苏达州)用作阴性对照。CD19-myc是由我们实验室生产的一种可溶性融合蛋白，其含有与myc-标签连接的人CD19的细胞外结构域，用于特异性检测抗CD19-41BB-CD3ζ。将T细胞与CD19-myc孵育30分钟，随后与R-藻红蛋白(PE)缀合的抗myc(细胞信号传导技术公司，丹弗斯，马萨诸塞州)孵育。对于细胞免疫表型，将T细胞用抗CD3 APC、抗CD56 PE、抗CD4 V450和抗CD8 PerCP(BD生物科学公司)标记。使用Accuri C6或Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析细胞染色。

IL-6耗竭测定

为了测量IL-6耗竭，将2x10⁶个T细胞在含有1ng IL-6的1mL RPMI-1640中培养2小时。在另一个实验中，将0.5-2x10⁶个T细胞在含有10IU IL-6的1mL RPMI-1640中培养2小时。在又另一个实验中，将2x10⁶个T细胞在含有1ng IL-6的1mL RPMI-1640中培养20分钟至2小时的不同时间间隔。在进一步的实验中，将0.5x10⁶个细胞在含有25-200pg/mL重组人IL-6的1mL RPMI中于37℃培养2小时。在另一个进一步的实验中，将0.2x10⁶个T细胞在含有1ng IL-6的1mL RPMI-1640中培养2-72小时。培养结束时，收获上清液，将其用0.22μm过滤器过滤，并以1:10稀释。使用人IL-6Platinum ELISA试剂盒(赛默飞世尔公司)通过ELISA测量IL-6的水平。使用来自计算得出的标准曲线的插值确定每个样品中IL-6的浓度。

对于Stat3磷酸化测量，将2x10⁶个细胞接种到含有10IU IL-6的1mL RPMI-1640中持续2小时。收获上清液，并将其与0.2x10⁶个U937细胞在37℃下孵育15分钟。添加裂解固定缓冲液(Lysefix buffer)(BD生物科学公司)，并将样品在37℃下进一步保持10分钟。然后洗涤细胞，并将其置于Perm III缓冲液中在冰上持续30分钟。三次洗涤之后，添加PE缀合的抗Stat3(pY705)抗体(BD生物科学公司)。1小时后，洗涤细胞并将其通过流式细胞术分析。

为了确定mb-aIL6耗竭IL-6对IL-6依赖性细胞系DS-1的生长的影响，将1.5x10⁴个T细胞与用mCherry转导的DS-1细胞(以1:1的比率)在补充有10％FBS、1％P/S和0.5ng/mlIL-6的RPMI-1640中孵育。对于扩增的T细胞，添加120IU/ml IL-2。在实验开始之前，DS-1细胞已经饥饿72小时。在培养期间每2天添加IL-2和IL-6。使用IncuCyte活细胞分析系统(伊森生物科学公司(Essen Biosciences)，安阿伯市，密歇根州)每4小时捕获每个孔的4x图像。使用荧光测量细胞计数，并将总红色物体累积强度(total red object integratedintensity)用作孔中DS-1mCherry的量的量度。在其他实验中，以1:5:1的比率对T细胞、OP-1和分化的THP-1进行相似的培养。在测定开始前1小时接种分化的THP-1。如上使用IncuCyte系统捕获每个孔的4x图像。40小时后，收获来自每个孔的上清液，将其以1:5稀释，并如上所述通过ELISA测量IL-6。

干扰素-γ(IFNγ)的产生、CD107a表达、细胞毒性和增殖测定

为了测试IFNγ的产生，将1x10⁵个T细胞与OP-1细胞以1:1的比率培养。1小时后，将GolgiPlug(BD生物科学公司)添加至细胞中，再培养5小时。用我们实验室开发的透化试剂8E透化细胞膜之后，将细胞用PE缀合的抗人IFNγ抗体(BD生物科学公司)标记，并通过流式细胞术分析。

为了测量细胞毒性颗粒的胞吐作用，如上所述培养细胞。在培养开始时，添加PE缀合的抗人CD107a抗体(BD生物科学公司)。1小时后，添加GolgiStop(BD生物科学公司)，并且继续培养3小时，然后通过流式细胞术进行分析。

为了测试细胞毒性，将OP-1细胞用钙黄绿素-AM红(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)标记并铺板到96孔圆底板中。以1:1的E:T比率添加T细胞(1x10⁵)，并且共培养4小时。如前所述，通过流式细胞术对活靶细胞(钙黄绿素-AM阳性)进行计数。¹⁴

为了测量细胞增殖，将1x10⁵个T细胞与经照射的OP-1以1:1的E:T比率在补充有10％FBS、1％P/S和120IU/ml IL-2的RPMI-1640中共培养。每2天向每个孔中添加IL-2。在第7、14和21天，通过流式细胞术对T细胞进行计数。细胞计数后，添加新鲜照射的OP-1细胞，以重构1:1的E:T比率。

异种移植实验

在NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(杰克逊实验室)中腹膜内注射(i.p.；1x10⁶个细胞/小鼠)表达萤光素酶的DS-1细胞。接种DS-1后两天，小鼠接受ip注射用仅GFP转导的1x10⁷个T细胞、用MSCV-mb-aIL6转导的1x10⁷个T细胞、或含10％FBS的RPMI 1640(代替T细胞)。所有小鼠每2天i.p接受20000IU IL-2和1000IU IL-6。在i.p.注射d-萤光素钾盐水溶液(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)(2mg/小鼠)后，使用Xenogen IVIS-200系统(卡尺生命科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)每周两次测定肿瘤负荷。用活体成像3.0软件(Living Image 3.0software)测量发光。

在NOD/scid IL2RGnull小鼠中静脉内注射表达萤光素酶的Nalm-6细胞(i.v.；图10A-B为0.5x10⁶个细胞/小鼠，图10C-F为1x10⁶个细胞/小鼠)。三天后，小鼠接受i.v.注射用抗CD19-41BB-CD3ζCAR转导的2x10⁷个T细胞、用含有CAR和mb-aIL6(“DUAL”)的构建体转导的2x10⁷个T细胞、或含10％FBS的RPMI 1640(代替T细胞)。所有小鼠每2天腹膜内接受20000IU IL-2。在i.p.注射d-萤光素钾盐水溶液(珀金埃尔默公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)(2mg/小鼠)后，使用Xenogen IVIS-200系统(卡尺生命科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)每周两次测定肿瘤负荷。用活体成像3.0软件分析发光。

结果

mb-aIL6的设计、表达和特异性

为了产生膜结合抗IL6构建体，从人抗IL-6抗体AME-19a的可变轻链和重链的序列合成单链可变片段(scFv)，并将其与CD8α铰链和跨膜结构域连接(图1A)。将构建体置于含有IRES和GFP的MSCV逆转录病毒载体中(图1B)。此逆转录病毒载体用于转导Jurkat T细胞。在用MSCV-mb-aIL6转导的细胞中GFP表达较高：98％的细胞均为GFP阳性。为了检测转导的Jurkat细胞表面上的mb-aIL6，将细胞用生物素缀合的山羊抗人F(ab)’抗体，随后用链霉亲和素APC标记。如图1C中所示，基本上在所有表达GFP的Jurkat细胞中均检测到mb-aIL6，而用含有仅GFP(“模拟物”)的载体转导的细胞均为mb-aIL6阴性。

为了确定在细胞表面上表达的mb-aIL6是否能结合人IL-6，将转导的Jurkat细胞暴露于生物素缀合的人IL-6持续10分钟；然后将细胞用链霉亲和素APC标记。如图1D中所示，mb-aIL6-Jurkat细胞以与GFP水平成比例的水平结合IL-6，并因此受体表达：99％的细胞结合IL-6，而用生物素化对照蛋白(大豆胰蛋白酶抑制剂)标记的细胞仍未染色。

用mb-aIL6细胞中和IL-6

mb-aIL6与IL-6的结合通过以下实验得到证实：在这些实验中，将Jurkat细胞在含有重组人IL-6(1ng/mL)的培养基中培养2小时；通过ELISA测量上清液中培养后回收的残余IL-6。培养2小时后，来自mb-aIL6 Jurkat细胞的上清液中IL-6的浓度为0.163ng/mL，相比于模拟物转导的Jurkat细胞的上清液中IL-6的浓度为0.941ng/mL(图2A)。

为了确定中和IL-6所需的mb-aIL6 Jurkat细胞的数量，使用从0.25x10⁶个细胞/mL至2x10⁶个细胞/mL的细胞的增加浓度。从上清液中去除IL-6具有细胞剂量依赖性(图2B)。在平行实验中，测量了由mb-aIL6细胞去除IL-6的动力学。如图2C中所示，IL-6中和具有时间依赖性，其中30分钟后近90％被中和，且120分钟后变得不可检测。值得注意的是，该曲线与一阶指数衰减曲线(R²＝0.9957)拟合，表明IL-6的半衰期为7.443分钟且K为0.09313。

为了测试表达mb-aIL6的Jurkat细胞是否也可以中和低浓度的IL-6，使用浓度范围为0.025至0.2ng/mL的IL-6建立了IL-6耗竭测定。如图2D中所示，表达mb-aIL6的Jurkat细胞也可以中和大多数IL-6。与先前实验一致，与模拟物转导的细胞相比，表达mb-aIL6的Jurkat细胞在各种浓度下的IL-6水平降低了3.8-5.4倍。

我们推测细胞增殖将产生新的mb-aIL6细胞，这些细胞将在延长的细胞培养中继续中和IL-6。为了测试该概念，我们使用了先前确定的培养条件(图2B)(这些条件不足以在2小时内中和IL-6)，并继续培养72小时。在24小时时，已经从上清液中去除了大部分IL-6(图2E)。

用mb-aIL6 T细胞中和IL-6的功能后果

U937是可以被IL-6刺激的单核细胞系。^15,16与IL-6受体结合后，IL-6引发Stat3磷酸化。¹⁷在暴露于mb-aIL6转导的或模拟物转导的Jurkat细胞2小时后，测试了含IL-6的上清液在U937中引发Stat3磷酸化的能力。在暴露于含有1ng/mL IL-6的上清液15分钟后，很容易检测到Stat3磷酸化(P<0.001；n＝3；图3A)。如果已从含模拟物转导的Jurkat细胞的培养物中收集到IL-6上清液，则观察到相似的磷酸化水平(P＝不显著)。相比之下，当培养物含有mb-aIL6 Jurkat细胞时，Stat3磷酸化水平明显低于U937细胞中测量的Stat3磷酸化水平，这些U937细胞暴露于IL-6或含IL-6的模拟物转导的Jurkat细胞的上清液(P<0.001针对任一比较)，并且与未刺激细胞的Stat3磷酸化水平相似(P＝不显著)。

DS-1是一种B淋巴瘤细胞系，其增殖需要IL-6。¹⁸我们确定了与表达mb-aIL6的Jurkat细胞共培养是否影响DS-1扩增。为此目的，使用经5天mCherry转导的DS-1细胞的连续活细胞成像记录。如图3B中所示，在模拟物转导的Jurkat存在下，在含有IL-6的培养基中培养的DS-1迅速扩增，而如果培养物中存在mb-aIL6转导的Jurkat细胞，则扩增明显减少。在这些条件下，无论是否存在模拟物转导的或mb-aIL6转导的Jurkat细胞，DS-1的生长速率都与缺乏IL-6的培养物中所观察到的相似。总之，这些结果证实了表达mb-aIL6的细胞中和IL-6的作用的能力。

mb-aIL6在人外周血T淋巴细胞中的表达

在下一组实验中，确定了mb-aIL-6是否可以在外周血T淋巴细胞的表面上表达。为此目的，将外周血单核细胞用抗CD3/CD28珠刺激，然后用MSCV-mb-aIL6逆转录病毒载体转导。用含有仅GFP(“模拟物”)的载体转导的细胞用作对照。如图4A和4B中所示，mb-aIL6在转导的GFP+T淋巴细胞的表面上高表达，并有效结合IL-6。表达mb-IL6的T细胞的免疫表型与模拟物转导的T细胞的免疫表型仍保持基本上相同(图4C)。

测试了表达mb-IL6的T细胞是否可以抑制IL-6依赖性细胞系DS-1的生长。图4D显示了DS-1的生长被明显抑制，表明在T淋巴细胞中表达的mb-aIL6可以中和IL-6以及表达该受体的Jurkat细胞。

膜结合抗IL-6和抗CD19-41BB-CD3z CAR可以在T淋巴细胞中共表达

如果CAR T细胞除CAR外还表达mb-aIL6，则可通过中和由微环境中的活化T淋巴细胞和巨噬细胞分泌的IL-6来防止CRS的发生。

作为测试该概念的第一步，确定了mb-aIL6和CAR是否可以被同时有效表达。为此，开发了含有编码mb-aIL6和抗CD19-41BB-CD3ζCAR的基因的双顺反子MSCV载体(图5A)。¹²为了特异性检测抗CD19 CAR，将人CD19分子的细胞外结构域与myc标签连接，并用抗myc抗体对细胞进行染色。图5B显示了mb-aIL6和抗CD19CAR两者均可以在外周血T细胞中以高水平表达。与单独表达的mb-aIL6一样，与CAR结合表达的mb-aIL6有效中和IL-6(图5C)。

mb-aIL6的表达不影响CAR T细胞功能

确定了mb-aIL6的表达和IL-6中和是否将影响由CAR活化的T细胞功能。使用来自表达mb-aIL6或抗CD19 CAR的3个供体的T淋巴细胞和表达两种受体的T细胞，测试了与CD19+靶细胞OP-1共培养后IFNγ的产生。无论是否表达mb-aIL6，表达CAR的细胞中IFNγ的产生都很高，而仅表达mb-aIL6的T细胞分泌的IFNγ水平与模拟物转导的细胞的IFNγ水平相似(图6A)。

在CD19+靶细胞的存在下，表达CAR的细胞释放细胞毒性颗粒，如通过用抗CD107a抗体进行染色所证明的。无论mb-aIL6表达如何，CD107a+细胞的百分比均相似，而仅表达mb-aIL6的细胞仍保持CD107a阴性(图6B)。与此结果一致，由于mb-aIL6的存在，针对由CAR驱动的CD19+靶标的细胞毒性百分比仍保持不变(图6C)。

第二代和后代CAR的重要功能特性是提供共刺激并维持延长的T细胞增殖的能力。¹⁹如图6D中所示，在CD19+靶细胞的存在下，抗CD19 CAR-T细胞增殖持续4周，并且在含和不含mb-aIL6的细胞中的增殖速率是相似的。相比之下，用仅mb-aIL6转导的细胞和模拟物转导的细胞均不会扩增，并且在不存在靶细胞的情况下，无论CAR表达如何，都不会发生扩增。综上，这些结果表明，mb-aIL6的表达不会影响CAR驱动的T细胞分泌IFNγ、特异性细胞毒性或细胞增殖。

表达mb-aIL6和CAR的T细胞可杀死靶细胞，同时中和IL-6

在由CAR活化引发的CRS期间，由巨噬细胞分泌的IL-6加剧其严重程度。^7-10

为了模拟CAR-T细胞与巨噬细胞之间的相互作用，将CAR-T细胞与单核细胞细胞系THP-1(其在TNF-α和IFNγ的存在下分泌IL-6)共培养；²⁰后者的细胞因子与IL-6一起在活化后由T淋巴细胞分泌。^9,21因此，将用mb-aIL6和/或抗CD19 CAR转导的T淋巴细胞、THP-1和CD19+白血病细胞OP-1共培养40小时(图7A)。监测OP-1细胞的杀伤和上清液中IL-6的水平。如图7B中所示，无论mb-aIL6表达如何或THP-1是否存在，CAR T细胞都能有效杀死OP-1。值得注意的是，在含有CAR-T和THP-1细胞两者的培养物中，IL-6的水平明显升高，但如果CAR-T细胞也表达mb-aIL6，则基本上检测不到这些水平。

异种移植实验

为了确定表达mb-aIL6的T淋巴细胞在体内中和IL-6的能力，用植入萤光素酶标记的DS-1细胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠进行实验。通过活体成像测量肿瘤生长，并比较接受用仅GFP转导的T细胞的小鼠和接受用mb-aIL6转导的T细胞的小鼠。在接受mb-aIL6转导的T细胞的三只小鼠的两只中，肿瘤负担降低，而在接受模拟物转导的T细胞的小鼠中，肿瘤负担仍保持稳定或增加(图9A-B)。

测试了mb-aIL6的表达是否影响抗CD19 CAR T细胞的抗肿瘤能力。用植入萤光素酶标记的Nalm-6细胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠进行实验。通过活体成像测量肿瘤生长，并比较接受用仅CAR转导的T细胞的小鼠和接受用含有CAR和mb-aIL6的双顺反子构建体转导的T细胞的小鼠。无论是否表达mb-aIL6，CAR T细胞都具有抗白血病活性(图10A-F)。综上，这些结果表明，mb-aIL6可以在体内中和IL-6，并且不会显著影响CAR功能。

讨论

此项研究的结果表明，由T淋巴细胞携带的mb-aIL6是IL-6的强大中和剂。重要的是，mb-aIL6可以与CAR结合在T淋巴细胞上表达，而不会影响CAR效能。为此，表达mb-aIL6的CAR-T细胞应具有较低的引发严重CRS的风险，同时保留其抗肿瘤潜力。

我们现在已经设计了与mb-aIL6在功能上相关但具有独特特征的其他受体(图8A-C)。图8A是核酸构建体的示意图，该核酸构建体针对缺少mb-aIL6的CD8α跨膜结构域的受体的可溶形式(sec-aIL6)，该核酸构建体将由转导的细胞连续分泌，并可能更有效地扩散到炎性微环境区域。图8B是核酸构建体的示意图，其中mb-aIL6与通常掺入CAR(aIL6-CAR)的刺激结构域和共刺激结构域连接。带有这种受体的细胞在连接aIL6-CAR后应增殖，从而放大了IL-6中和。图8C是核酸构建体的示意图，其中scFv抗IL6被丧失信号传导能力的IL-6受体替换。这由与IL-6受体α融合的gp130的细胞外结构域和CD8α的铰链加跨膜结构域构成。这种形式的潜在优势是其免疫原性可能低于含scFv的受体。

虽然此项研究侧重于IL-6，但可以采用类似的方法来中和其他促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α(图11A-B)、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-18、IFNγ等，和/或阻断其受体。例如，基于图11A中的示意图，抗IL6 scFv部分可以被特异性结合至不同细胞因子(如(TNF)-α(图11)、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-18、或IFNγ)的不同scFv替换。多种中和受体可以在相同的细胞上或在不同的细胞亚群中表达，以发挥全面且持久的抗炎作用。

序列

mb-aIL6序列

CD8α信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

CD8α信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MALPVTALLLPLALLLHAARP

抗IL6的可变轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：

抗IL-6的可变轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

GSG接头核苷酸序列(SEQ ID NO:5)：

GGCGGCGGCGGCTCTGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGATCC

GSG接头氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：GGGGSGGGGSGGGGS

抗IL-6的可变重链核苷酸序列(SEQ ID NO:7)：

抗IL-6的可变重链氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：

CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:9)：

CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：

sec-aIL6

sec-aIL6核苷酸序列(SEQ ID NO:11)：

sec-aIL6氨基酸序列(SEQ ID NO:12)：

aIL6BBz序列

CD8α信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO:13)：

CD8α信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:14)：MALPVTALLLPLALLLHAARP

aIL6 scFv核苷酸序列(SEQ ID NO:15)：

aIL6 scFv氨基酸序列(SEQ ID NO:16)：

CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:17)：

CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:18)：

41BB结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:19)：

41BB结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:20)：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

CD3ζ结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:21)：

CD3ζ结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:22)：

mb-gp130-IL6R序列

gp130结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:23)：

gp130结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:24)：

GSG接头核苷酸序列(SEQ ID NO:25)：

GGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGCGGCGGCTCT

GSG接头氨基酸序列(SEQ ID NO:26)：GGGGSGGGGSGGGGS

IL-6R结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:27)：

IL-6R结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:28)：

CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:29)：

CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:30)：

mb-aTNFα序列

CD8α信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO:31)：

CD8α信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:32)：

MALPVTALLLPLALLLHAARP

抗TNFα的可变轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:33)：

抗TNFα的可变轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:34)：

GSG接头核苷酸序列(SEQ ID NO:35)：

GGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCAGC

GSG接头氨基酸序列(SEQ ID NO:36)：GGGGSGGGGSGGGGS

抗TNFα的可变重链核苷酸序列(SEQ ID NO:37)：

抗TNFα的可变重链氨基酸序列(SEQ ID NO:38)：

CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列(SEQ ID NO:39)：

CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:40)：

参考文献

1.Tanaka T,Kishimoto T.The biology and medical implications ofinterleukin-6.Cancer Immunol Res.2014；2(4):288-294.

2.Hunter CA,Jones SA.IL-6as a keystone cytokine in health anddisease.Nat Immunol.2015；16(5):448-457.

3.McInnes IB,Schett G.Pathogenetic insights from the treatment ofrheumatoid arthritis.Lancet.2017；389(10086):2328-2337.

4.Chen X,Das R,Komorowski R,et al.Blockade of interleukin-6signalingaugments regulatory T-cell reconstitution and attenuates the severity ofgraft-versus-host disease.Blood.2009；114(4):891-900.

5.Tawara I,Koyama M,Liu C,et al.Interleukin-6modulates graft-versus-host responses after experimental allogeneic bone marrow transplantation.ClinCancer Res.2011；17(1):77-88.

6.Roddy JV,Haverkos BM,McBride A,et al.Tocilizumab for steroidrefractory acute graft-versus-host disease.Leuk Lymphoma.2016；57(1):81-85.

7.Lee DW,Gardner R,Porter DL,et al.Current concepts in the diagnosisand management of cytokine release syndrome.Blood.2014；124(2):188-195.

8.Davila ML,Riviere I,Wang X,et al.Efficacy and Toxicity Managementof19-28z CAR T Cell Therapy in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia.Sci TranslMed.2014；6(224):224ra225.

9.Maude SL,Barrett D,Teachey DT,Grupp SA.Managing cytokine releasesyndrome associated with novel T cell-engaging therapies.Cancer J.2014；20(2):119-122.

10.Park JH,Geyer MB,Brentjens RJ.CD19-targeted CAR T-celltherapeutics for hematologic malignancies:interpreting clinical outcomes todate.Blood.2016；127(26):3312-3320.

11.Manabe A,Coustan-Smith E,Kumagai M,et al.Interleukin-4 inducesprogrammed cell death(apoptosis)in cases of high-risk acute lymphoblasticleukemia.Blood.1994；83(7):1731-1737.

12.Imai C,Mihara K,Andreansky M,Nicholson IC,Pui CH,CampanaD.Chimeric receptors with 4-1BB signaling capacity provoke potentcytotoxicity against acute lymphoblastic leukemia.Leukemia.2004；18:676-684.

13.Szymczak-Workman AL,Vignali KM,Vignali DA.Design and constructionof 2A peptide-linked multicistronic vectors.Cold Spring Harb Protoc.2012；2012(2):199-204.

14.Kudo K,Imai C,Lorenzini P,et al.T lymphocytes expressing a CD16signaling receptor exert antibody-dependent cancer cell killing.CancerRes.2014；74(1):93-103.

15.Taga T,Kawanishi Y,Hardy RR,Hirano T,Kishimoto T.Receptors for Bcell stimulatory factor 2.Quantitation,specificity,distribution,andregulation of their expression.J Exp Med.1987；166(4):967-981.

16.Onozaki K,Akiyama Y,Okano A,et al.Synergistic regulatory effectsof interleukin 6 and interleukin 1 on the growth and differentiation of humanand mouse myeloid leukemic cell lines.Cancer Res.1989；49(13):3602-3607.

17.Zhong Z,Wen Z,Darnell JE,Jr.Stat3:a STAT family member activatedby tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor andinterleukin-6.Science.1994；264(5155):95-98.

18.Bock GH,Long CA,Riley ML,et al.Characterization of a new IL-6-dependent human B-lymphoma cell line in long term culture.Cytokine.1993；5(5):480-489.

19.Campana D,Schwarz H,Imai C.4-1BB chimeric antigen receptors.CancerJ.2014；20(2):134-140.

20.Sanceau J,Wijdenes J,Revel M,Wietzerbin J.IL-6 and IL-6 receptormodulation by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in human monocyticcell line(THP-1).Priming effect of IFN-gamma.J Immunol.1991；147(8):2630-2637.

21.Slifka MK,Whitton JL.Activated and memory CD8+T cells can bedistinguished by their cytokine profiles and phenotypic markers.JImmunol.2000；164(1):208-216.

通过引用并入；等效形式

所有专利、公开的申请以及本文引用的参考文献的传授内容都通过引用以其全文并入。

虽然已经具体显示和描述了示例实施例，但是本领域技术人员将理解，可在不脱离由所附权利要求涵盖的实施例的范围的情况下在其中做出在形式和细节方面的各种改变。

序列表

<110> 新加坡国立大学（National University of Singapore）

Tan, Hong Ji Adrian

Campana, Dario

<120> 用在免疫细胞中表达的膜结合抗细胞因子非信号传导粘合剂中和人细胞因子

<130> 4459.1149-001

<141> 2020-09-25

<150> 62/651,311

<151> 2018-04-02

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 CD8α信号肽核苷酸序列

<400> 1

atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60

ccc 63

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 CD8α信号肽氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 3

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL6的mb-aIL6可变轻链核苷酸序列

<400> 3

gaaatcgtcc tgacccagtc ccctgccaca ctgtccctgt ctccaggaga gagggccacc 60

ctgagctgct ccgcctctat cagcgtgtcc tacatgtatt ggtaccagca gaagccagga 120

caggcaccta ggctgctgat ctacgacatg tctaacctgg caagcggcat ccccgcacgc 180

ttctctggaa gcggatccgg cacagacttt acactgacca tcagctccct ggagcctgag 240

gatttcgccg tgtactattg catgcagtgg tccggctatc catacacatt tggcggcggc 300

accaaggtgg agatcaag 318

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-6的mb-aIL6可变轻链氨基酸序列

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 GSG接头核苷酸序列

<400> 5

ggcggcggcg gctctggagg aggaggaagc ggaggaggag gatcc 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 GSG接头氨基酸序列

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-6的mb-aIL6可变重链核苷酸序列

<400> 7

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcggctg 60

tcttgtgccg ccagcggctt caccttttct ccattcgcca tgagctgggt gagacaggca 120

ccaggcaagg gcctggagtg ggtggccaag atctcccctg gcggctcttg gacatactat 180

tccgacacag tgaccggccg gtttaccatc tccagagata acgccaagaa cagcctgtat 240

ctgcagatga atagcctgcg ggccgaggac acagccgtgt actattgtgc cagacagctg 300

tggggctact atgccctgga tatctggggc cagggcacca cagtgaccgt gtctagc 357

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗IL-6的mb-aIL6可变重链氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列

<400> 9

aagcctacca caaccccagc acccaggccc cctacacctg caccaaccat cgccagccag 60

ccactgtccc tgaggcccga ggcatgcagg cctgcagcag gaggcgccgt gcacacccgc 120

ggcctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcacccc tggctggaac ctgcggagtc 180

ctgctgctgt cactggtcat taccctgtat tgc 213

<210> 10

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aIL6 CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列

<400> 10

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

50 55 60

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

65 70

<210> 11

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sec-aIL6核苷酸序列

<400> 11

atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60

cccgaaatcg tcctgaccca gtcccctgcc acactgtccc tgtctccagg agagagggcc 120

accctgagct gctccgcctc tatcagcgtg tcctacatgt attggtacca gcagaagcca 180

ggacaggcac ctaggctgct gatctacgac atgtctaacc tggcaagcgg catccccgca 240

cgcttctctg gaagcggatc cggcacagac tttacactga ccatcagctc cctggagcct 300

gaggatttcg ccgtgtacta ttgcatgcag tggtccggct atccatacac atttggcggc 360

ggcaccaagg tggagatcaa gggcggcggc ggctctggag gaggaggaag cggaggagga 420

ggatccgagg tgcagctggt ggagagcggc ggcggcctgg tgcagcccgg cggctccctg 480

cggctgtctt gtgccgccag cggcttcacc ttttctccat tcgccatgag ctgggtgaga 540

caggcaccag gcaagggcct ggagtgggtg gccaagatct cccctggcgg ctcttggaca 600

tactattccg acacagtgac cggccggttt accatctcca gagataacgc caagaacagc 660

ctgtatctgc agatgaatag cctgcgggcc gaggacacag ccgtgtacta ttgtgccaga 720

cagctgtggg gctactatgc cctggatatc tggggccagg gcaccacagt gaccgtgtct 780

agc 783

<210> 12

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> sec-aIL6氨基酸序列

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

20 25 30

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile

35 40 45

Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser

100 105 110

Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

130 135 140

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met

165 170 175

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys

180 185 190

Ile Ser Pro Gly Gly Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly

195 200 205

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

210 215 220

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

225 230 235 240

Gln Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser

260

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD8α信号肽核苷酸序列

<400> 13

atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca tgctgctaga 60

ccc 63

<210> 14

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD8α信号肽氨基酸序列

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 15

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz aIL6 scFv核苷酸序列

<400> 15

gaaatcgtcc tgacccagtc ccctgccaca ctgtccctgt ctccaggaga gagggccacc 60

ctgagctgct ccgcctctat cagcgtgtcc tacatgtatt ggtaccagca gaagccagga 120

caggcaccta ggctgctgat ctacgacatg tctaacctgg caagcggcat ccccgcacgc 180

ttctctggaa gcggatccgg cacagacttt acactgacca tcagctccct ggagcctgag 240

gatttcgccg tgtactattg catgcagtgg tccggctatc catacacatt tggcggcggc 300

accaaggtgg agatcaaggg cggcggcggc tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 360

tccgaggtgc agctggtgga gagcggcggc ggcctggtgc agcccggcgg ctccctgcgg 420

ctgtcttgtg ccgccagcgg cttcaccttt tctccattcg ccatgagctg ggtgagacag 480

gcaccaggca agggcctgga gtgggtggcc aagatctccc ctggcggctc ttggacatac 540

tattccgaca cagtgaccgg ccggtttacc atctccagag ataacgccaa gaacagcctg 600

tatctgcaga tgaatagcct gcgggccgag gacacagccg tgtactattg tgccagacag 660

ctgtggggct actatgccct ggatatctgg ggccagggca ccacagtgac cgtgtctagc 720

<210> 16

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz aIL6 scFv氨基酸序列

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ile Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Phe Ala Met Ser Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Lys Ile Ser Pro Gly Gly

165 170 175

Ser Trp Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Trp Gly Tyr

210 215 220

Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

<210> 17

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列

<400> 17

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207

<210> 18

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列

<400> 18

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 19

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz 41BB结构域核苷酸序列

<400> 19

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 20

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz 41BB结构域氨基酸序列

<400> 20

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 21

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD3ζ结构域核苷酸序列

<400> 21

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aIL6BBz CD3ζ结构域氨基酸序列

<400> 22

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 23

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R gp130结构域核苷酸序列

<400> 23

atgctgacac tgcagacatg gctggtccag gcactgttta tctttctgac aaccgagtcc 60

acaggcgaac tgctggatcc ttgcgggtac atctctccag agagccccgt ggtgcagctg 120

cactccaact tcaccgccgt gtgcgtgctg aaggagaagt gtatggacta ctttcacgtg 180

aacgccaatt atatcgtgtg gaagacaaac cacttcacca tccctaagga gcagtacaca 240

atcatcaata gaaccgccag ctccgtgacc ttcaccgata tcgccagcct gaacatccag 300

ctgacatgca atatcctgac cttcggccag ctggagcaga acgtgtatgg catcaccatc 360

atctccggcc tgccccctga gaagccaaag aacctgtctt gcatcgtgaa tgagggcaag 420

aagatgaggt gtgagtggga ccggggcaga gagacacacc tggagacaaa tttcaccctg 480

aagtccgagt gggccaccca caagtttgcc gactgcaagg ccaagaggga tacacccacc 540

agctgtacag tggattactc caccgtgtat tttgtgaaca tcgaagtgtg ggtggaggcc 600

gagaatgccc tgggcaaggt gaccagcgac cacatcaact tcgatcccgt gtacaaggtg 660

aagcctaacc caccccacaa tctgtctgtg atcaatagcg aggagctgtc tagcatcctg 720

aagctgacat ggaccaaccc ctccatcaag tctgtgatca tcctgaagta caatatccag 780

tatagaacaa aggacgccag cacctggtcc cagatccctc cagaggatac agcctccacc 840

aggtcctctt ttacagtgca ggacctgaag cctttcaccg agtacgtgtt ccggatccgg 900

tgtatgaagg aggacggcaa gggctactgg tctgattgga gcgaggaggc ctccggcatc 960

acctatgagg acaggcca 978

<210> 24

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R gp130结构域氨基酸序列

<400> 24

Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Leu Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu

1 5 10 15

Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser

20 25 30

Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys

35 40 45

Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr

50 55 60

Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr

65 70 75 80

Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser

85 90 95

Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu

100 105 110

Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys

115 120 125

Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys

130 135 140

Glu Trp Asp Arg Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu

145 150 155 160

Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg

165 170 175

Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val

180 185 190

Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr

195 200 205

Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro

210 215 220

Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu

225 230 235 240

Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys

245 250 255

Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile

260 265 270

Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp

275 280 285

Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu

290 295 300

Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile

305 310 315 320

Thr Tyr Glu Asp Arg Pro

325

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R GSG接头核苷酸序列

<400> 25

ggaggaggag gaagcggagg aggaggctcc ggcggcggcg gctct 45

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R GSG接头氨基酸序列

<400> 26

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 27

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R IL-6R结构域核苷酸序列

<400> 27

gtggatgtgc cccctgagga gccccagctg tcttgcttca ggaagtcccc tctgtctaac 60

gtggtgtgcg agtggggacc tcgcagcacc ccatccctga ccacaaaggc cgtgctgctg 120

gtgcggaagt tccagaatag ccctgccgag gactttcagg agccatgcca gtactctcag 180

gagagccaga agttcagctg tcagctggca gtgccagagg gcgatagctc cttttatatc 240

gtgtccatgt gcgtggcctc tagcgtgggc tccaagttct ctaagacaca gacctttcag 300

ggctgtggca tcctgcagcc tgacccaccc gccaacatca cagtgaccgc cgtggcccgg 360

aatccaagat ggctgtctgt gacatggcag gatccccaca gctggaactc ctctttctac 420

cggctgagat ttgagctgag gtatcgcgcc gagcggagca agacctttac cacatggatg 480

gtgaaggacc tgcagcacca ctgcgtgatc cacgatgcat ggagcggcct gaggcacgtg 540

gtgcagctga gagcacagga ggagttcgga cagggagagt ggagcgagtg gtccccagag 600

gcaatgggaa caccatggac cgagagccgc tcccctccag cagagaatga ggtgagcaca 660

cca 663

<210> 28

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R IL-6R结构域氨基酸序列

<400> 28

Val Asp Val Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser

1 5 10 15

Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser

20 25 30

Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro

35 40 45

Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys

50 55 60

Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile

65 70 75 80

Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr

85 90 95

Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn

100 105 110

Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr

115 120 125

Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe

130 135 140

Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met

145 150 155 160

Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly

165 170 175

Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly

180 185 190

Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu

195 200 205

Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro

210 215 220

<210> 29

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列

<400> 29

aagccaacca caacccctgc accacggccc cctacaccag cacctaccat cgcatcccag 60

ccactgtctc tgaggcctga ggcatgcagg ccagcagcag gaggagcagt gcacacccgg 120

ggcctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggccccac tggctggcac ttgcggggtc 180

ctgctgctgt ccctggtcat cactctgtat tgc 213

<210> 30

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-gp130-IL6R CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列

<400> 30

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

50 55 60

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

65 70

<210> 31

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα CD8α信号肽核苷酸序列

<400> 31

atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60

ccc 63

<210> 32

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα CD8α信号肽氨基酸序列

<400> 32

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 33

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFα的mb-aTNFα可变轻链核苷酸序列

<400> 33

gaaatcgtcc tgacccagtc ccccgccaca ctgtctctga gcccaggaga gagggccacc 60

ctgagctgca gagcctccca gtctgtgagc tcctacctgg cctggtatca gcagaagcca 120

ggacaggcac caaggctgct gatctacgac gcatccaaca gggcaacagg catccccgca 180

cgcttcagcg gatccggatc tggcagcggc accgacttta cactgaccat ctctagcctg 240

gagcctgagg atttcgccgt gtactattgc cagcagcgca gcaattggcc ccctttcaca 300

tttggcccag gcaccaaggt ggatatcaag 330

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFα的mb-aTNFα可变轻链氨基酸序列

<400> 34

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp

85 90 95

Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα GSG接头核苷酸序列

<400> 35

ggaggaggag gatccggagg aggaggatct ggcggcggcg gcagc 45

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα GSG接头氨基酸序列

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFα的mb-aTNFα可变重链核苷酸序列

<400> 37

caggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc gtggtgcagc caggcaggtc cctgaggctg 60

tcttgtgcag caagcggctt catcttttcc tcttacgcaa tgcactgggt gcggcaggca 120

cctggaaacg gcctggagtg ggtggccttc atgtcctacg acggctctaa taagaagtat 180

gccgattccg tgaagggccg gtttacaatc agcagagaca actccaagaa taccctgtat 240

ctgcagatga actctctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgtgc ccgggataga 300

ggaatcgcag caggaggaaa ttactattac tatggcatgg acgtgtgggg ccagggcacc 360

acagtgaccg tgagctcc 378

<210> 38

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TNFα的mb-aTNFα可变重链氨基酸序列

<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 39

<211> 216

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα CD8α铰链和跨膜结构域核苷酸序列

<400> 39

aagcctacca caacccctgc accacggcca ccaacaccag cacctaccat cgcctctcag 60

cctctgagcc tgaggccaga ggcatgcagg ccagcagcag gaggagcagt gcacaccaga 120

ggcctggact ttgcctgtga tatctacatc tgggcccctc tggctgggac ttgcggggtg 180

ctgctgctgt cactggtcat cacactgtat tgttga 216

<210> 40

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mb-aTNFα CD8α铰链和跨膜结构域氨基酸序列

<400> 40

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

50 55 60

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

65 70

Claims

1.一种载体，其包含编码膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)的核酸，该mb-aIL6 scFv包含：

a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6 scFv)；和

b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

2.如权利要求1所述的载体，其中该抗IL-6可变轻链结构域和该抗IL-6可变重链结构域中的一个或多个是人抗IL6可变轻链结构域和可变重链结构域。

3.如权利要求2所述的载体，其中该可变轻链结构域与SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性。

4.如权利要求2所述的载体，其中该可变重链结构域与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同一性。

5.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中该接头结构域是(G4S)_x，其中x是从1至100的整数。

6.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中该接头结构域是(G4S)₃。

7.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中该铰链和跨膜结构域是CD8α铰链和跨膜结构域。

8.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中该核酸进一步编码嵌合抗原受体(CAR)。

9.如权利要求8中任一项所述的载体，其中该嵌合抗原受体是抗CD19-41BB-CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)。

10.如权利要求9中任一项所述的载体，其中该mb-aIL6通过P2A序列与该抗CD19-41BB-CD3ζ偶联。

11.一种载体，其包含编码抗IL6嵌合抗原受体(CAR)的核酸，该抗IL6 CAR包含：

a)含有抗IL-6可变轻链结构域、抗IL-6可变重链结构域、以及连接该可变轻链结构域和该可变重链结构域的第一接头结构域的抗IL6单链可变片段(抗IL6scFv)；

b)在该抗IL6 scFv的N-末端的第二接头结构域；

c)在该第二接头结构域的N-末端的铰链和跨膜结构域；和

d)在该铰链和跨膜结构域的N-末端的细胞内信号传导结构域。

12.如权利要求11所述的载体，其中该细胞内信号传导结构域是41BB结构域。

13.如权利要求11所述的载体，其进一步包含在该细胞内信号传导结构域的N-末端的共刺激结构域。

14.如权利要求13所述的载体，其中该共刺激结构域是CD3ζ结构域。

15.一种降低哺乳动物中IL-6浓度的方法，该方法包括：在T细胞中表达膜结合抗IL6(mb-aIL6)单链可变片段(scFv)，并使该T细胞与含有IL-6的液体接触，其中该mb-aIL6包含：

b)与该抗IL6 scFv偶联的铰链和跨膜结构域。

16.如权利要求15所述的方法，其中该哺乳动物是人。

17.如权利要求15或16所述的方法，其进一步包括培养该T细胞以产生表达该mb-aIL6的新T细胞。

18.如权利要求15或16所述的方法，其进一步包括降低细胞因子释放综合征(CRS)的风险，并且其中该哺乳动物的T细胞表达嵌合抗原受体。

19.如权利要求15或16所述的方法，其中该哺乳动物患有自身免疫疾病、炎性疾病、或淋巴增生性障碍，并且其中降低该哺乳动物中的IL-6浓度分别治疗该自身免疫疾病、该炎性疾病、或该淋巴增生性障碍。

20.如权利要求19所述的方法，其中该哺乳动物患有类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、或卡斯尔曼病，并且其中降低IL-6浓度分别治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、或卡斯尔曼病。