CN110846344A

CN110846344A - 一种表达il-6r阻断抗体的靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及制备方法、应用

Info

Publication number: CN110846344A
Application number: CN201911124922.2A
Authority: CN
Inventors: 谭毅; 张慧慧; 陈倩; 韩镇
Original assignee: Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Qilu Cell Therapy Engineering Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2020-02-28

Abstract

本发明属于基因工程和细胞生物学领域，涉及一种表达IL‑6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用。具体地，构建靶向CD19的嵌合抗原受体和IL‑6R阻断剂托珠单抗的双表达载体。通过慢病毒介导的方式将靶向CD19的嵌合抗原受体和IL‑6R阻断剂托珠单抗的双表达载体转导至T细胞。本发明提供的pHR‑antiCD19CAR‑Tocilizumab‑T细胞在不影响其表型，杀伤，细胞因子释放等方面的特性的情况下，通过基因工程技术使细胞自分泌IL‑6R阻断剂托珠单抗），控制CRS副作用的产生，增加安全性。

Description

一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及制备方法、应用

技术领域

本发明属于基因工程和细胞生物学技术领域，具体涉及一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）及制备方法、应用。

背景技术

1989年，嵌合抗原受体改造T细胞（CAR-T）这一概念被首次提出，目的是建立肿瘤特异性识别能力的过继细胞疗法。第一代CAR的设计是简单的用特异性单克隆抗体来源的scFv（single-chain antibody variable region fragment）段替换TCR （T cellreceptor）的胞外区部分，保留了跨膜结构和胞内传递信号的CD3ζ区域，有的研究组胞内信号传递部分也会采用FcR。但第一代CAR的临床试验结果却非常令人失望，效果最好的一次临床试验也仅仅有2/11个病人有长期的缓解。随着对免疫学认识的不断深入，人们发现CD3ζ信号虽然能够诱导T细胞的活化和短暂增殖，但之后会诱导T细胞的无能（anergy）。1998年，有两个实验室报道了CD28信号结构域可以为CD3ζ信号提供辅助的共刺激功能。因此，第二代CAR的设计在第一代的基础上引入了共刺激分子的部分，如CD28或CD137（4-1BB）的胞内信号结构域。而第三代CAR则是加入了2个共刺激分子的功能信号结构域，包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40(15-18)。现在在临床上进行实验的主要是第二代CAR的设计。

CAR-T的疗效已经被业内所公认，2017年8月30日，美国FDA批准了首个CAR-T药物——Kymriah（tisagenlecleucel），用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病。这是首个获批的免疫细胞药物。一个多月后的10月18日，FDA批准Kite制药Yescarta (axicabtagene ciloleucel，KTE-C10)，用于治疗对其他疗法无响应或者接受过至少2种治疗方案后复发的特定类型成人大B细胞淋巴瘤患者,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。Yescarta是FDA批准的第2款CAR-T疗法。

与CD-19-CAR-T疗法的有效性共存的是它的副作用和细胞毒性。由于设计时选取CD19为靶点，输入的T细胞会将体内本身存在的正常B细胞与肿瘤细胞一起杀掉，并且在肿瘤消失后，只要CAR-T细胞依然存在，机体内都不会有正常B细胞存活，病人需要间隔一定时间注射免疫球蛋白以维持基本的体液免疫。另一方面，在CAR-T细胞输入初期，由于T细胞的大量扩增以及T细胞杀伤肿瘤过程中会分泌大量细胞因子，病人会出现细胞因子释放综合症（Cytokine Release Syndrome，CRS），具体表现为发热、低血压、缺氧以及血清中某些细胞因子水平显着升高，这些因子包括干扰素-γ(IFN-γ)，分形趋化因子(Fracktalkine)，粒-巨噬细胞生长因子(GM-CSF)，白细胞介素-5 (IL-5)，白细胞介素-6 (IL-6)，人FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)和白细胞介素-10 (IL-10)。2016年7月初，Juno Therapeutics 发布了报道在该公司进行的临床试验JCAR015中，先后有四位病人在接受CAR-T细胞治疗后发生死亡，FDA随即停止了JCAR015的临床试验，Juno随后解释是因为使用化疗药物氟达拉滨导致神经毒素，但也有很多人猜测是由于输入的T细胞所产生的强烈细胞因子风暴（CRS）导致病人死亡。诺华（Novartis）公司的靶向CD-19的产品CLT019虽然能够让80%的患者病情得到缓解，但同时也会导致近一半的患者出现细胞激素释放症（CRS）。出现CRS的患者体内，T细胞会释放过多的炎症因子，导致过激的炎症反应和发烧，严重的话会危及生命。同样的，KitePharma公司用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的产品KTE-C19，会导致1/3的患者出现神经系统副作用、1/5的患者出现CRS，还有两名患者在测试中死亡。

通常来说，采用大剂量类固醇激素，如强的松，可以迅速逆转CRS的临床症状。但是，类固醇药物会显著抑制CAR-T细胞在体内的增殖，使得患者有较高的复发率，影响CAR-T治疗的疗效。临床研究已经发现，白介素6在其中占据了相当重要的地位，仅用白细胞介素-6受体(IL-6R)的阻断性单克隆抗体药物(Tocilizumab)一种药物，就能非常有效的控制细胞因子风暴的强度。已有临床试验证明，阻断IL-6受体后能迅速解决CRS带来的毒副作用并且对CAR-T细胞体内增殖没有影响。目前FDA已正式批准Tocilizumab用于治疗CAR-T疗法中可能会出现的CRS风险。但是Tocilizumab价格昂贵，对患者来说是不小的经济负担，而且药物的给药时机需要监控。因此，研发一种能够自主分泌这一抗体的CAR-T细胞成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T），本发明成功将IL-6R阻断抗体和CD19CAR共表达。本发明人发现，共表达了IL-6R阻断抗体的CD19CAR-T细胞，能够自分泌IL-6R阻断抗体，在细胞因子风暴发生的时候，能够阻断IL-6和IL-6R的结合，提高CAR-T治疗中的安全性。

本发明还提供了一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法

本发明还提供了一种表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种慢病毒表达载体，包含有编码嵌合抗原受体的基因和IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），所述编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

本发明提供的慢病毒表达载体的结构为pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab，其表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步的，所述IL-6R阻断剂，托珠单抗，依次包含KOZAK、信号肽、轻链可变区、铰链区、重链可变区、IgG1-Fc。

根据本发明任一项所述的IL-6R阻断抗体，托珠单抗（Tocilizumab），其中，优选的，所述KOZAK的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述铰链区的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述IgG1-Fc的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供了一种含有上述慢病毒表达载体的试剂盒，包括权利要求1或2所述的慢病毒表达载体。

上述慢病毒表达试剂盒，其重组慢病毒的制备方法，包括如下步骤：

将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 过滤头过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。

本发明还提供了一种上述慢病毒表达载体制备表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）将CD8穿膜信号肽、anti-CD19 Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 ZetaTCR激活区、IRES、Tocilizumab依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab质粒；

（2）将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基（DMEM+10% FBS）培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液；

（3）取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液进行密度梯度离心来分离单个核细胞，将单个核细胞重悬至CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中，同时添加CD3单抗和CD28单抗来激活T淋巴细胞，37℃ 5%CO2培养48小时；

（4）取2×10⁶的细胞，按照MOI=5加入浓缩的重组慢病毒的溶液，同时加入IL-2和polybrene，混匀，37℃ 5%CO2培养6-8小时，300g 5min离心换液为新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基；每2-3天加入新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基，维持细胞密度在1×10⁶/mL，扩增10-12天，得表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞-pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T。

进一步的，步骤（3）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基还含有5%的ICS。

进一步的，步骤（4）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中还含有200IU/ml IL-2。

本发明还提供了一种上述慢病毒表达载体在制备预防、治疗或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

上述恶性肿瘤选自B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤。

本发明的一个方面涉及一种嵌合抗原受体，依次包含信号肽、单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区，其中，单链抗体包括轻链可变区(VL)、重链可变区(VH) 以及连接它们的铰链区。其序列见本发明人专利CN 107365798 A。

本发明的另一方面涉及一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体其特征在于如下的(1) 至(2) 项中的任意一项或者多项：

（1）慢病毒载体同时表达嵌合抗原受体和托珠单抗（Tocilizumab）

（2）所述慢病毒表达载体的结构为pHR-antiCD19CAR- Tocilizumab。其中IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

（3）所述pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明分泌这一抗体。细胞因子风暴是级联放大的，最初的细胞因子激活了其他种类的免疫细胞，进而诱导更多的炎症因子的释放。由于其分泌量与CAR-T细胞的增殖呈正相关，早期T细胞尚未增殖，细胞因子风暴尚未发生，此时分泌抗体的量也低。中期T细胞大量活化增殖，相应的阻断性抗体的量也会增加，这样一来可以较好地控制阻断的时机和强度。

本发明的另一方面涉及一种细胞，其同时表达本发明中任一项所述的IL-6 shRNA和嵌合抗原受体；或者含有本发明的慢病毒表达载体；优选地，所述细胞为T 细胞。

本发明的另一方面涉及本发明中任一项所述的嵌合抗原受体在制备转基因修饰免疫细胞中的用途，优选地，所述免疫细胞选自来源于人的T淋巴细胞。

本发明中一些常用的术语说明如下；

术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体) 锚定在免疫细胞( 如T 细胞) 上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

术语“单链抗体”(single-chain antibody variable region fragment,scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区) 氨基酸序列和重链可变区(V H区) 氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

术语“Linker”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

术语“CD19”是指人白细胞分化抗原19，它在NCBI GeneBank 的ID 号为930，有2个异构体(cDNA 序列/ 蛋白序列)，分别为NM_001178098.1/NP_001171569.1，NM_001770.5/NP_001761.3。当提及CD19 的氨基酸序列时，其包括，CD19 蛋白的全长或者具有CD19 功能的CD19 的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD19的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异( 包括但不限于置换，缺失和/ 或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD19 的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。

术语“IRES”是指内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site），一种富含二级结构的RNA序列，这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译。在IRES前面的蛋白翻译后,核糖体不脱离mRNA,可与IRES结合,使翻译继续进行,因此一条mRNA可翻译两种蛋白。

术语“托珠单抗（Tocilizumab）”是一种重组人源化抗人白介素6（IL-6）受体单克隆抗体，由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞通过DNA重组技术制得。

本发明的有益效果是：

（1）与现有的antiCD19CAR-T细胞相比，本发明引入了IL-6R阻断剂托珠单抗，在表达CAR 的同时，共表达IL-6R阻断剂。共表达了IL-6R阻断抗体的CD19CAR-T细胞，能够自分泌IL-6R阻断抗体，从而降低CRS的影响，提高CAR-T治疗的安全性。

（2）与现有的antiCD19CAR-T细胞相比，pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab细胞在自分泌IL-6R阻断抗体，控制CRS副作用的产生，增加其安全性的同时，不影响其表型，杀伤，细胞因子释放等方面的特性。

附图说明

图1：CD19 CAR和Tocilizumab双表达载体结构图。

图2：pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab转染效率流式图。

图3：pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞阳性率流式检测图

图4：pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞表型流式图

图5：pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞统计图。

图6：ELISA法检测pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞细胞因子及托珠单抗释放量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件( 例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。

实施例1：CD19 CAR和Tocilizumab双表达载体的构建

如图1所示，将CD8穿膜信号肽、anti-CD19 Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3Zeta TCR激活区、IRES、Tocilizumab依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab质粒。

antiCD19CAR-Tocilizumab的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，antiCD19CAR-Tocilizumab的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体1ug转染到293FT 细胞中， 24h 后收集293FT细胞5×105，每个样品加FITC-LabeledHumanCD19（20-291）Protein 10ul，4度避光孵育1h，洗涤3遍，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab质粒的转染效率如图2所示。

实施例2：慢病毒的包装及浓缩

将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。

慢病毒浓缩根据Lenti-XTM Concentrator （takara，cat:631231）说明书进行。

实施例3：CD19 CAR和Tocilizumab双表达载体的T细胞的制备

取50mL新鲜血液，通过淋巴细胞分离液（天津灏洋）进行密度梯度离心来分离单个核细胞。将单个核细胞重悬至CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（GIBCO,货号A3021002）中，该培养基需添加5%ICS (GIBCO,A2596101)。同时添加CD3单抗和CD28单抗来激活T淋巴细胞，37℃ 5%CO2培养48小时。

取2×106的细胞，按照MOI=5加入实施例2中浓缩的慢病毒，同时加入IL-2和polybrene，混匀，37℃ 5%CO2培养6-8小时，300g 5min离心换液为新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（含IL-2）。

每2-3天加入新鲜CTS^TM AIM V^TM SFM培养基（含IL-2），维持细胞密度在1×106/mL左右，扩增10-12天。

取病毒感染后培养48h之后的T细胞5×105，每个样品加FITC-Labeled HumanCD19（20-291）Protein 10ul，4度避光孵育1h，洗涤3遍，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。结果如图3所示，病毒感染后培养48h后的细胞中pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞的比例为54.0%，和pHR-antiCD19CAR-T 48.3%的感染效率无显著差异。将该实施例中制备的T细胞命名为pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T，作为以后实施例中所用到的细胞。

取病毒感染后培养48h之后的T细胞5×105，分别用CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA的抗体室温避光染色15min，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测（Millipore guavaeasyCyte HT）。结果如图4所示，病毒感染后培养48h后的细胞中CD3+的细胞的比例为96.1%，CD3+的细胞中CD4、CD8的细胞比例分别为53.4%、59.8%，CCR7-CD45RA-的记忆性T细胞的比例为88.8%，和pHR-antiCD19CAR-T无显著差异。

实施例4：pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞对肿瘤细胞株的体外杀伤试验

K562-CD19细胞株的构建见本发明人专利CN 107365798 A。将K562细胞及构建好的K562-CD19细胞按1:1接种于96孔板中，按E:T=1:1、3:1分别接种培养9天的pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T、antiCD19CAR-T细胞和T细胞。37℃ 5%CO2培养24小时，取每孔细胞的上清，冻到-80度冰箱备用。剩下的每孔细胞加入PE anti-human CD19（Biolegend）和FITC anti-human CD3（Biolegend），室温避光孵育15min，离心，沉淀用200μL PBS重悬后上机检测（Millipore guava easyCyte HT）。结果如图5所示，pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞对K562-CD19细胞有特异性杀伤，效靶比为1:1、3:1时特异性杀伤效率均值分别为36.5%和81.5%，杀伤率随效靶比的增加而升高。统计学分析显示，pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞和T细胞组之间的特异性杀伤效率有显著差异，而pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T和antiCD19CAR-T细胞组之间的特异性杀伤效率无显著差异。

实施例5：ELISA法检测pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞细胞因子及托珠单抗释放量。

取实施例4中E:T=3:1体外杀伤试验所留上清液，分别为T细胞组、antiCD19CAR-T细胞组、pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞组和肿瘤细胞的阴性对照组的上清液，按Human IL-2 ELISA MAX™ Deluxe（Biolegend，431804）、Human IFN-gama ELISA MAX™Deluxe（Biolegend，430104）、Human IL-6 ELISA MAX™ Deluxe（Biolegend，430504）试剂盒说明书操作，检测IFN-gama、IL-6和IL-2的释放。

取T细胞组、antiCD19CAR-T细胞组、pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞组和肿瘤细胞的阴性对照组的培养7天的上清液，按照Tocilizumab ELISA (mAb-based) （TaniMedikal IG-AB108）试剂盒说明书操作，检测Tocilizumab的释放。

结果如图6所示，pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞培养上清中能释放772pg/ml的Tocilizumab，和antiCD19CAR-T细胞培养上清有显著差异。而和antiCD19CAR-T细胞相比pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab-T细胞的IFN-gama、 IL-6的释放量无明显差异。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。但显而易见的是可由本领域技术人员设计本发明的其他实施方式和变形，而不脱离本发明的真实精神和范围。权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

<110>山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司

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<212>DNA

<213> Artificial Sequence

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<223>

<400>1

GCCGCCATGG GTGTACTGCT CACACAGAGG ACGCTGCTCA GTCTGGTCCT CGCCCTCCTG 60

TTCCCAAGCA TGGCCAGCGA CATCCAGATG ACCCAGAGCC CAAGCAGCCT GAGCGCCAGC 120

GTGGGTGACA GAGTGACCAT CACCTGTAGA GCCAGCCAGG ACATCAGCAG TTACCTGAAT 180

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG AAAGGCTCCA AAGCTGCTGA TCTACTACAC CTCCAGACTG 240

CACTCTGGTG TGCCAAGCAG ATTCAGCGGT AGCGGTAGCG GTACCGACTT CACCTTCACC 300

ATCAGCAGCC TCCAGCCAGA GGACATCGCT ACCTACTACT GCCAACAGGG TAACACGCTT 360

CCATACACGT TCGGCCAAGG GACCAAGGTG GAAATCAAAG GTGGCGGTGG CTCGGGCGGT 420

GGTGGGTCGG GTGGCGGCGG ATCTCAGGTC CAACTGCAGG AGAGCGGTCC AGGTCTTGTG 480

AGACCTAGCC AGACCCTGAG CCTGACCTGC ACCGTGTCTG GCTACTCAAT TACCAGCGAT 540

CATGCCTGGA GCTGGGTTCG CCAGCCACCT GGACGAGGTC TTGAGTGGAT TGGATACATT 600

AGTTATAGTG GAATCACAAC CTATAATCCA TCTCTCAAAT CCAGAGTGAC AATGCTGAGA 660

GACACCAGCA AGAACCAGTT CAGCCTGAGA CTCAGCAGCG TGACAGCCGC CGACACCGCG 720

GTTTATTATT GTGCAAGATC CCTAGCTCGG ACTACGGCTA TGGACTACTG GGGTCAAGGC 780

AGCCTCGTCA CAGTCTCCTC AGAGCCCAAG AGCTGCGACA AGACCCACAC CTGTCCCCCT 840

TGTCCTGCCC CTGAACTGCT GGCCGGACCC GACGTGTTCC TGTTCCCCCC AAAGCCCAAG 900

GACACCCTGA TGATCTCCCG GACCCCCGAA GTGACCTGCG TGGTGGTGGA TGTGTCCCAC 960

GAGGACCCTG AAGTGAAGTT CAATTGGTAC GTGGACGGCG TGGAAGTGCA CAACGCCAAG 1020

ACCAAGCCCA GAGAGGAACA GTACAACAGC ACCTACCGGG TGGTGTCCGT GCTGACAGTG 1080

CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAAGAG TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAGGCCCTG 1140

CCTCTGCCCG AGGAAAAGAC CATCAGCAAG GCCAAGGGCC AGCCCAGGGA ACCCCAGGTG 1200

TACACACTGC CCCCCAGCAG AGATGAGCTG ACCAAGAACC AGGTGTCCCT GACCTGTCTC 1260

GTGAAGGGCT TTTACCCCTC CGATATCGCC GTGGAATGGG AGAGCAACGG CCAGCCCGAG 1320

AACAACTACA AGACCACCCC CCCTGTGCTG GACTCCGACG GCTCATTCTT CCTGTACTCC 1380

AAGCTGACCG TGGACAAGAG CAGATGGCAG CAGGGCAACG TGTTCAGCTG CTCCGTGATG 1440

CACGAGGCCC TGCACAACCA CTACACCCAG AAGTCCCTGA GCCTGAGCCC AGGCAAATGA 1500

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<213> Artificial Sequence

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GCCGCC

<210>3

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<212>DNA

<213> Artificial Sequence

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<223>

<400>3

ATGGGTGTAC TGCTCACACA GAGGACGCTG CTCAGTCTGG TCCTCGCCCT CCTGTTCCCA 60

AGCATGGCCA GC 72

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<212>DNA

<213> Artificial Sequence

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<223>

<400>4

GACATCCAGA TGACCCAGAG CCCAAGCAGC CTGAGCGCCA GCGTGGGTGA CAGAGTGACC 60

ATCACCTGTA GAGCCAGCCA GGACATCAGC AGTTACCTGA ATTGGTACCA GCAGAAGCCA 120

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<212>DNA

<213> Artificial Sequence

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GGTGGCGGTG GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG GATCT 45

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CAGGTCCAAC TGCAGGAGAG CGGTCCAGGT CTTGTGAGAC CTAGCCAGAC CCTGAGCCTG 60

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AATCCATCTC TCAAATCCAG AGTGACAATG CTGAGAGACA CCAGCAAGAA CCAGTTCAGC 240

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<213> Artificial Sequence

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<400>7

GAGCCCAAGA GCTGCGACAA GACCCACACC TGTCCCCCTT GTCCTGCCCC TGAACTGCTG 60

GCCGGACCCG ACGTGTTCCT GTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ACACCCTGAT GATCTCCCGG 120

ACCCCCGAAG TGACCTGCGT GGTGGTGGAT GTGTCCCACG AGGACCCTGA AGTGAAGTTC 180

AATTGGTACG TGGACGGCGT GGAAGTGCAC AACGCCAAGA CCAAGCCCAG AGAGGAACAG 240

TACAACAGCA CCTACCGGGT GGTGTCCGTG CTGACAGTGC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC 300

GGCAAAGAGT ACAAGTGCAA GGTGTCCAAC AAGGCCCTGC CTCTGCCCGA GGAAAAGACC 360

ATCAGCAAGG CCAAGGGCCA GCCCAGGGAA CCCCAGGTGT ACACACTGCC CCCCAGCAGA 420

GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTGTCCCTG ACCTGTCTCG TGAAGGGCTT TTACCCCTCC 480

GATATCGCCG TGGAATGGGA GAGCAACGGC CAGCCCGAGA ACAACTACAA GACCACCCCC 540

CCTGTGCTGG ACTCCGACGG CTCATTCTTC CTGTACTCCA AGCTGACCGT GGACAAGAGC 600

AGATGGCAGC AGGGCAACGT GTTCAGCTGC TCCGTGATGC ACGAGGCCCT GCACAACCAC 660

TACACCCAGA AGTCCCTGAG CCTGAGCCCA GGCAAA 696

<210>8

<211>585

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

<400>8

GCCCCTCTCC CTCCCCCCCC CCTAACGTTA CTGGCCGAAG CCGCTTGGAA TAAGGCCGGT 60

GTGCGTTTGT CTATATGTTA TTTTCCACCA TATTGCCGTC TTTTGGCAAT GTGAGGGCCC 120

GGAAACCTGG CCCTGTCTTC TTGACGAGCA TTCCTAGGGG TCTTTCCCCT CTCGCCAAAG 180

GAATGCAAGG TCTGTTGAAT GTCGTGAAGG AAGCAGTTCC TCTGGAAGCT TCTTGAAGAC 240

AAACAACGTC TGTAGCGACC CTTTGCAGGC AGCGGAACCC CCCACCTGGC GACAGGTGCC 300

TCTGCGGCCA AAAGCCACGT GTATAAGATA CACCTGCAAA GGCGGCACAA CCCCAGTGCC 360

ACGTTGTGAG TTGGATAGTT GTGGAAAGAG TCAAATGGCT CTCCTCAAGC GTATTCAACA 420

AGGGGCTGAA GGATGCCCAG AAGGTACCCC ATTGTATGGG ATCTGATCTG GGGCCTCGGT 480

GCACATGCTT TACATGTGTT TAGTCGAGGT TAAAAAAACG TCTAGGCCCC CCGAACCACG 540

GGGACGTGGT TTTCCTTTGA AAAACACGAT GATAATATGG CCACA 585

<210>9

<211>3593

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

<400>9

ATGGCCTTAC CAGTGACCGC CTTGCTCCTG CCGCTGGCCT TGCTGCTCCA CGCCGCCAGG 60

CCGGAGCAGA AGCTGATCAG CGAGGAGGAC CTGGACATCC AGATGACACA GACTACATCC 120

TCCCTGTCTG CCTCTCTGGG AGACAGAGTC ACCATCAGTT GCAGGGCAAG TCAGGACATT 180

AGTAAATATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA CCAGATGGAA CTGTTAAACT CCTGATCTAC 240

CATACATCAA GATTACACTC AGGAGTCCCA TCAAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGAACA 300

GATTATTCTC TCACCATTAG CAACCTGGAG CAAGAAGATA TTGCCACTTA CTTTTGCCAA 360

CAGGGTAATA CGCTTCCGTA CACGTTCGGA GGGGGGACCA AGCTGGAGAT CACAGGTGGC 420

GGTGGCTCGG GCGGTGGTGG GTCGGGTGGC GGCGGATCTG AGGTGAAACT GCAGGAGTCA 480

GGACCTGGCC TGGTGGCGCC CTCACAGAGC CTGTCCGTCA CATGCACTGT CTCAGGGGTC 540

TCATTACCCG ACTATGGTGT AAGCTGGATT CGCCAGCCTC CACGAAAGGG TCTGGAGTGG 600

CTGGGAGTAA TATGGGGTAG TGAAACCACA TACTATAATT CAGCTCTCAA ATCCAGACTG 660

ACCATCATCA AGGACAACTC CAAGAGCCAA GTTTTCTTAA AAATGAACAG TCTGCAAACT 720

GATGACACAG CCATTTACTA CTGTGCCAAA CATTATTACT ACGGTGGTAG CTATGCTATG 780

GACTACTGGG GCCAAGGAAC CTCAGTCACC GTCTCCTCAA CCACGACGCC AGCGCCGCGA 840

CCACCAACAC CGGCGCCCAC CATCGCGTCG CAGCCCCTGT CCCTGCGCCC AGAGGCGTGC 900

CGGCCAGCGG CGGGGGGCGC AGTGCACACG AGGGGGCTGG ACTTCGCCTG TGATATCTAC 960

ATCTGGGCGC CCTTGGCCGG GACTTGTGGG GTCCTTCTCC TGTCACTGGT TATCACCCTT 1020

TACTGCTCCC TAAAACGGGG CAGAAAGAAA CTCCTGTATA TATTCAAACA ACCATTTATG 1080

AGACCAGTAC AAACTACTCA AGAGGAAGAT GGCTGTAGCT GCCGATTTCC AGAAGAAGAA 1140

GAAGGAGGAT GTGAACTGAG AGTGAAGTTC AGCAGGAGCG CAGACGCCCC CGCGTACAAG 1200

CAGGGCCAGA ACCAGCTCTA TAACGAGCTC AATCTAGGAC GAAGAGAGGA GTACGATGTT 1260

TTGGACAAGA GACGTGGCCG GGACCCTGAG ATGGGGGGAA AGCCGAGAAG GAAGAACCCT 1320

CAGGAAGGCC TGTACAATGA ACTGCAGAAA GATAAGATGG CGGAGGCCTA CAGTGAGATT 1380

GGGATGAAAG GCGAGCGCCG GAGGGGCAAG GGGCACGATG GCCTTTACCA GGGTCTCAGT 1440

ACAGCCACCA AGGACACCTA CGACGCCCTT CACATGCAGG CCCTGCCCCC TCGCGGCTAA 1500

GCGGCCGCGC CCCTCTCCCT CCCCCCCCCC TAACGTTACT GGCCGAAGCC GCTTGGAATA 1560

AGGCCGGTGT GCGTTTGTCT ATATGTTATT TTCCACCATA TTGCCGTCTT TTGGCAATGT 1620

GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT GACGAGCATT CCTAGGGGTC TTTCCCCTCT 1680

CGCCAAAGGA ATGCAAGGTC TGTTGAATGT CGTGAAGGAA GCAGTTCCTC TGGAAGCTTC 1740

TTGAAGACAA ACAACGTCTG TAGCGACCCT TTGCAGGCAG CGGAACCCCC CACCTGGCGA 1800

CAGGTGCCTC TGCGGCCAAA AGCCACGTGT ATAAGATACA CCTGCAAAGG CGGCACAACC 1860

CCAGTGCCAC GTTGTGAGTT GGATAGTTGT GGAAAGAGTC AAATGGCTCT CCTCAAGCGT 1920

ATTCAACAAG GGGCTGAAGG ATGCCCAGAA GGTACCCCAT TGTATGGGAT CTGATCTGGG 1980

GCCTCGGTGC ACATGCTTTA CATGTGTTTA GTCGAGGTTA AAAAAACGTC TAGGCCCCCC 2040

GAACCACGGG GACGTGGTTT TCCTTTGAAA AACACGATGA TAATATGGCC ACAGCCGCCA 2100

TGGGTGTACT GCTCACACAG AGGACGCTGC TCAGTCTGGT CCTCGCCCTC CTGTTCCCAA 2160

GCATGGCCAG CGACATCCAG ATGACCCAGA GCCCAAGCAG CCTGAGCGCC AGCGTGGGTG 2220

ACAGAGTGAC CATCACCTGT AGAGCCAGCC AGGACATCAG CAGTTACCTG AATTGGTACC 2280

AGCAGAAGCC AGGAAAGGCT CCAAAGCTGC TGATCTACTA CACCTCCAGA CTGCACTCTG 2340

GTGTGCCAAG CAGATTCAGC GGTAGCGGTA GCGGTACCGA CTTCACCTTC ACCATCAGCA 2400

GCCTCCAGCC AGAGGACATC GCTACCTACT ACTGCCAACA GGGTAACACG CTTCCATACA 2460

CGTTCGGCCA AGGGACCAAG GTGGAAATCA AAGGTGGCGG TGGCTCGGGC GGTGGTGGGT 2520

CGGGTGGCGG CGGATCTCAG GTCCAACTGC AGGAGAGCGG TCCAGGTCTT GTGAGACCTA 2580

GCCAGACCCT GAGCCTGACC TGCACCGTGT CTGGCTACTC AATTACCAGC GATCATGCCT 2640

GGAGCTGGGT TCGCCAGCCA CCTGGACGAG GTCTTGAGTG GATTGGATAC ATTAGTTATA 2700

GTGGAATCAC AACCTATAAT CCATCTCTCA AATCCAGAGT GACAATGCTG AGAGACACCA 2760

GCAAGAACCA GTTCAGCCTG AGACTCAGCA GCGTGACAGC CGCCGACACC GCGGTTTATT 2820

ATTGTGCAAG ATCCCTAGCT CGGACTACGG CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGCAGCCTCG 2880

TCACAGTCTC CTCAGAGCCC AAGAGCTGCG ACAAGACCCA CACCTGTCCC CCTTGTCCTG 2940

CCCCTGAACT GCTGGCCGGA CCCGACGTGT TCCTGTTCCC CCCAAAGCCC AAGGACACCC 3000

TGATGATCTC CCGGACCCCC GAAGTGACCT GCGTGGTGGT GGATGTGTCC CACGAGGACC 3060

CTGAAGTGAA GTTCAATTGG TACGTGGACG GCGTGGAAGT GCACAACGCC AAGACCAAGC 3120

CCAGAGAGGA ACAGTACAAC AGCACCTACC GGGTGGTGTC CGTGCTGACA GTGCTGCACC 3180

AGGACTGGCT GAACGGCAAA GAGTACAAGT GCAAGGTGTC CAACAAGGCC CTGCCTCTGC 3240

CCGAGGAAAA GACCATCAGC AAGGCCAAGG GCCAGCCCAG GGAACCCCAG GTGTACACAC 3300

TGCCCCCCAG CAGAGATGAG CTGACCAAGA ACCAGGTGTC CCTGACCTGT CTCGTGAAGG 3360

GCTTTTACCC CTCCGATATC GCCGTGGAAT GGGAGAGCAA CGGCCAGCCC GAGAACAACT 3420

ACAAGACCAC CCCCCCTGTG CTGGACTCCG ACGGCTCATT CTTCCTGTAC TCCAAGCTGA 3480

CCGTGGACAA GAGCAGATGG CAGCAGGGCA ACGTGTTCAG CTGCTCCGTG ATGCACGAGG 3540

CCCTGCACAA CCACTACACC CAGAAGTCCC TGAGCCTGAG CCCAGGCAAA TGA 3593

<210>10

<211>998

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

<400>10

MALPVTALLL PLALLLHAAR PEQKLISEED LDIQMTQTTS SLSASLGDRV TISCRASQDI 60

SKYLNWYQQK PDGTVKLLIY HTSRLHSGVP SRFSGSGSGT DYSLTISNLE QEDIATYFCQ 120

QGNTLPYTFG GGTKLEITGG GGSGGGGSGG GGSEVKLQES GPGLVAPSQS LSVTCTVSGV 180

SLPDYGVSWI RQPPRKGLEW LGVIWGSETT YYNSALKSRL TIIKDNSKSQ VFLKMNSLQT 240

DDTAIYYCAK HYYYGGSYAM DYWGQGTSVT VSSTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC 300

RPAAGGAVHT RGLDFACDIY IWAPLAGTCG VLLLSLVITL YCSLKRGRKK LLYIFKQPFM 360

RPVQTTQEED GCSCRFPEEE EGGCELRVKF SRSADAPAYK QGQNQLYNEL NLGRREEYDV 420

LDKRRGRDPE MGGKPRRKNP QEGLYNELQK DKMAEAYSEI GMKGERRRGK GHDGLYQGLS 480

TATKDTYDAL HMQALPPRGA AMGVLLTQRT LLSLVLALLF PSMASDIQMT QSPSSLSASV 540

GDRVTITCRA SQDISSYLNW YQQKPGKAPK LLIYYTSRLH SGVPSRFSGS GSGTDFTFTI 600

SSLQPEDIAT YYCQQGNTLP YTFGQGTKVE IKGGGGSGGG GSGGGGSQVQ LQESGPGLVR 660

PSQTLSLTCT VSGYSITSDH AWSWVRQPPG RGLEWIGYIS YSGITTYNPS LKSRVTMLRD 720

TSKNQFSLRL SSVTAADTAV YYCARSLART TAMDYWGQGS LVTVSSEPKS CDKTHTCPPC 780

PAPELLAGPD VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT 840

KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP LPEEKTISKA KGQPREPQVY 900

TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK 960

LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 998

<210> 11

<211> 1197

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223>

<400> 11

ATGGGCGTGC AGGTGGAAAC AATCAGCCCT GGCGACGGCA GGACATTCCC CAAGAGGGGC 60

CAGACCTGTG TGGTGCACTA TACCGGCATG CTGGAGGACG GCAAGAAGGT GGACAGCAGC 120

AGGGACAGGA ACAAGCCCTT CAAGTTCATG CTGGGCAAAC AGGAAGTCAT CAGAGGCTGG 180

GAGGAAGGCG TCGCCCAGAT GAGCGTGGGC CAGAGAGCCA AGCTGACAAT CAGCCCCGAT 240

TACGCCTACG GCGCCACAGG CCATCCTGGC ATCATTCCCC CCCACGCCAC CCTGGTGTTC 300

GATGTGGAGC TGCTGAAGCT GGAGTCCGGA GGCGGTTCTG GAGGCTTTGG CGATGTGGGC 360

GCCCTGGAGT CCCTCAGAGG AAACGCTGAC CTGGCCTACA TCCTGAGCAT GGAGCCCTGC 420

GGCCACTGCC TGATCATCAA CAACGTGAAC TTCTGCAGGG AGTCCGGCCT GAGGACCAGA 480

ACAGGCTCCA ACATCGACTG CGAAAAGCTG AGGAGGAGGT TCTCCTCCCT GCACTTTATG 540

GTGGAGGTGA AGGGCGATCT GACCGCCAAG AAGATGGTGC TCGCCCTGCT CGAACTGGCC 600

AGACAGGACC ACGGCGCCCT GGACTGTTGC GTGGTCGTGA TCCTGAGCCA CGGCTGTCAG 660

GCTTCCCACC TGCAGTTCCC TGGCGCCGTG TACGGCACCG ACGGATGTCC TGTGAGCGTG 720

GAGAAGATCG TGAATATCTT CAACGGCACC TCCTGTCCCA GCCTGGGCGG AAAGCCTAAG 780

CTGTTCTTCA TCCAGGCCTG CGGAGGCGAG CAGAAGGACC ACGGCTTTGA GGTGGCTTCC 840

ACCTCCCCCG AAGACGAGTC CCCCGGAAGC AACCCCGAAC CTGACGCCAC CCCCTTCCAG 900

GAGGGACTGA GGACATTCGA CCAGCTGGCC GCCATTAGCT CCCTGCCCAC ACCTTCCGAC 960

ATCTTCGTGA GCTACAGCAC CTTTCCCGGA TTCGTGAGCT GGAGAGACCC CAAGTCCGGA 1020

AGCTGGTACG TGGAGACCCT GGACGACATC TTTGAGCAGT GGGCCCATAG CGAGGACCTG 1080

CAGAGCCTGC TGCTGAGAGT GGCCAACGCC GTCAGCGTGA AGGGCATCTA CAAGCAGATG 1140

CCTGGCTGCT TCAACTTCCT GAGGAAGAAG CTCTTCTTCA AGACCAGCGC CAGCAGA 1197

Claims

1.一种慢病毒表达载体，其特征在于：包含有编码嵌合抗原受体的基因和IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），所述编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述IL-6R阻断剂托珠单抗（Tocilizumab），其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于：所述慢病毒表达载体的结构为pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab，其表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1或2所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述种IL-6R阻断剂，托珠单抗，依次包含KOZAK、信号肽、轻链可变区、铰链区、重链可变区、IgG1-Fc。

4.一种含有如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体的试剂盒，包括权利要求1或2所述的慢病毒表达载体。

5. 一种利用如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体制备表达IL-6R阻断抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将CD8穿膜信号肽、anti-CD19 Scfv、CD8跨膜区、4-1BB共刺激信号区和CD3 Zeta TCR激活区、IRES、Tocilizumab依序克隆到慢病毒骨架质粒pHR中，得到pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab质粒；

（2）将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体pHR-antiCD19CAR-Tocilizumab、pCMV载体和pMD.2G载体混合后转染到293FT 细胞中，转染后6h ～ 8h 更换为完全培养基培养，48h 后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm 滤器过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基还含有5%的ICS。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述CTS^TM AIM V^TM SFM培养基中还含有200IU/ml IL-2。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的慢病毒表达载体在制备预防、治疗或辅助治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤选自B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤。