JP2021184771A - 免疫調節性融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

免疫調節性融合タンパク質およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】免疫調節性融合タンパク質およびその使用を提供すること。【解決手段】本開示は、細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含有する免疫調節性融合タンパク質に関し、標的の結合により、Ｔ細胞などの宿主細胞における調節性シグナルが生じ得る。本開示は、がんまたは感染症などのある特定の疾患を処置するための、そのような免疫調節性融合タンパク質を発現する免疫細胞の使用にも関する。さらに他の態様では、本開示は、腫瘍を処置するための方法であって、腫瘍を有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含み、投与される宿主細胞が、免疫抑制性の腫瘍微小環境において増殖することができるものである、方法を提供する。【選択図】なし

Description

配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４３３ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは２８６ＫＢであり、２０１６年に３月４日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
Ｔ細胞に基づく免疫療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団の中で腫瘍反応性Ｔ細胞が見いだされた時に開発され始めた（Ｃｌａｒｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２９巻：７０５頁、１９６９年）。１つの戦略は、養子Ｔ細胞移入として公知であり、一部の状況では、腫瘍反応性について予め選択した腫瘍浸潤リンパ球を単離すること、ＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体によって誘導される腫瘍反応性Ｔ細胞をクローン拡大させること、ならびに、最終的に、拡大させた細胞集団を、腫瘍を担持する患者に注入し戻すこと（化学療法およびＩＬ−２の反復投与と共に）を伴う（Ｄｕｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻：８５０頁、２００２年）。腫瘍浸潤リンパ球を用いるこの形態の養子Ｔ細胞療法は、技術的に煩わしいことがあり、また、完全寛解は黒色腫を有する患者のほんの一部にしか導かれず、他のがんではめったに有効でない（Ｂｅｓｓｅｒら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１６巻：２６４６頁、２０１０年）。
腫瘍反応性Ｔ細胞クローンの単離は、別の免疫療法的手法、つまり、腫瘍細胞上に発現する主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子として公知）によって提示される腫瘍関連ペプチドなどの所望の標的に対する特異性を付与するために、例えばベクター送達系を使用してＴ細胞に導入することができる、特定の抗原に特異的な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の生成につながる。別の手法では、一般には、例えば抗腫瘍療法の状況では腫瘍に特異的であるまたは関連する抗原に結合することができる抗原結合ドメインと、それと連結した、ＴＣＲシグナル伝達ドメインなどの一次シグナル伝達ドメインまたは一部の状況では共刺激シグナル伝達ドメインなどのエフェクタードメインを含む１つまたは複数の細胞内成分を含有する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる合成受容体を導入する。ＴＩＬの投与とは異なり、ＴＣＲまたはＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法を操作するための基本的な手順は、一般に、腫瘍標的化部分をコードする導入遺伝子を用いてヒトＴ細胞を遺伝子改変し、組換えＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて拡大させ、拡大させた組換えＴ細胞を患者に輸注し戻すことである。
組換えＴＣＲを発現するＴ細胞を使用する養子Ｔ細胞療法には、特に、ある特定のＢ細胞がんにおいて有望な臨床的有用性があることが示されている。しかし、有効なＴ細胞活性化は、多くの場合、同時の共刺激シグナルを必要とするまたはそれにより増強される（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。腫瘍微小環境では、共刺激分子は一般に下方制御される。結果として、がん抗原に特異的な組換えＴＣＲを発現するＴ細胞には、ＩＬ−２を介した外因性刺激が一般に必要である。
Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣに提示された特異的なペプチドと会合すると開始される（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年）。Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の点は免疫学的シナプス（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ）になり、これは、中心部のｃＳＭＡＣ、周辺部のｐＳＭＡＣ、および遠位のｄＳＭＡＣを含めた３つの同心性超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）で構成される（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年）。ｃＳＭＡＣ内では、共刺激受容体によりシグナル伝達分子が動員されてＴＣＲシグナルが増幅し得る。そのような共刺激受容体はＣＤ２８を含み得、一部の状況では、ＴＣＲと共にマイクロクラスターを形成して活性化の閾値を低下させる（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。Ｔ細胞によって発現される膜貫通タンパク質によるｃＳＭＡＣへの接近は、細胞外ドメインのサイズによって制限される可能性がある。例えば、ＣＤ４５は大きな外部ドメインを有し、一般には免疫学的シナプスから排除され、それにより、ＴＣＲシグナル伝達を阻害するその能力が妨げられる（ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ、４８７巻：６４〜６９頁、２０１２年）。
ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３年）１３巻：２２７〜２４２頁 Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２年）３巻：１〜１２頁 ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２年）４８７巻：６４〜６９頁
免疫療法の分野では、がんまたは感染などの様々な疾患を処置するために、宿主細胞に免疫調節性シグナルをもたらす代替組成物および方法が依然として必要とされている。本明細書で開示される実施形態は、これらの必要性に対処し、他の関連する利点をもたらすものである。
ある特定の態様では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインを含有する細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとする。
一部の実施形態では、融合タンパク質と標的の間で形成される複合体またはそのような融合タンパク質：：標的複合体の一部（一般に、そのような複合体の細胞外部分）の長さまたは空間距離は、特定の距離であるかまたは特定の距離にまたがり、例えば、一部の実施形態では、ある特定の距離未満またはおよそある特定の距離未満の距離である。一部の態様では、融合タンパク質：：標的複合体（または、一般には、その細胞外部分）の距離は、５０ｎｍ未満もしくは約５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満もしくは約４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満もしくは約３０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満もしくは約２０ｎｍ未満、または１５ｎｍに等しいかもしくはそれ未満、もしくは約１５ｎｍに等しいかもしくはそれ未満である。一部の実施形態では、当該距離は、１０ｎｍもしくは約１０ｎｍ、１１ｎｍもしくは約１１ｎｍ、１２ｎｍもしくは約１２ｎｍ、１３ｎｍもしくは約１３ｎｍ、１４ｎｍもしくは約１４ｎｍ、１５ｎｍもしくは約１５ｎｍ、１６ｎｍもしくは約１６ｎｍ、１７ｎｍもしくは約１７ｎｍ、１８ｎｍもしくは約１８ｎｍ、１９ｎｍもしくは約１９ｎｍ、または２０ｎｍもしくは約２０ｎｍ、例えば、１４ｎｍもしくは約１４ｎｍまたは１５ｎｍもしくは約１５ｎｍなどである。一部の態様では、距離は、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離である、または、ＴＣＲ−ペプチド／ＭＨＣ複合体に関しては、ＴＣＲの細胞外ドメインの膜最近位部分、例えば残基と、ＭＨＣ（例えば、ＭＨＣＩもしくはＭＨＣＩＩなどのＨＬＡ）分子の膜最近位部分、例えば残基の間の距離、または、そのような複合体の細胞外部分がまたがる距離（または、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、およびそれぞれの結合パートナーまたはそのリガンドを含有する複合体などの、シナプス内に含有されることが公知の細胞外部分がまたがる空間距離）と、同じ、ほぼ同じ、もしくは実質的に同じ距離である。一部の実施形態では、複合体の空間距離は、２つの異なる細胞の膜間の距離を指し、第１の細胞と第２の細胞は、それぞれ、それらの表面上に、細胞が互いと近傍になった場合に膜間で複合体を形成し得る結合パートナーを発現する。一部の態様では、距離は、ＴＣＲとＭＨＣ分子との同族相互作用の間で形成される複合体の細胞外部分がまたがる距離と同じ、ほぼ同じ、または実質的に同じ距離である。融合タンパク質が、普通は免疫学的シナプスに進入することまたは抗原受容体と共局在することができる分子に由来する結合ドメインを含む場合などの一部の態様では、距離は、分子（融合タンパク質に使用される結合ドメインを有する）と天然の結合パートナーとの間で形成される複合体がまたがる距離と同様であるかまたは同じである。融合タンパク質が、普通は免疫学的シナプスに進入することができないまたは普通は抗原受容体と共局在することができない分子に由来する結合ドメインを含む場合などの一部の態様では、距離は、分子（融合タンパク質に使用される結合ドメインまたはその機能的部分を有する）とその天然の結合パートナーとの間で形成される複合体がまたがる距離とは異なる、例えば、その距離よりも短いまたは実質的に短い。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞外成分内の結合ドメインは、阻害分子、例えば、免疫阻害受容体または免疫チェックポイント分子などの免疫阻害分子などの阻害シグナルを送達することができる分子の標的結合部分を含有する。一部の態様では、そのような分子は、糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーである。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーに由来するか、または、Ｂ７もしくはＢ７結合分子ではないか、または、ＣＤ２８−Ｂ７−スーパーファミリーメンバーではない（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、もしくは他のＢ７ファミリー結合分子ではない）結合ドメインを含む。例示的な糖タンパク質、チェックポイントファミリーメンバーは、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５、またはそのような分子のいずれかの結合性改変体を含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞外成分内の結合ドメインは、前述のもののいずれかの結合パートナー、またはそのような分子のいずれかの結合性改変体を含む。そのような実施形態の一部の態様では、融合タンパク質の細胞内部分は、共刺激シグナルなどの刺激シグナルをＴ細胞などのリンパ球に送達することができるシグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳの共刺激領域、または他の共刺激分子などを含む。一部の態様では、細胞外結合部分がチェックポイントまたは免疫阻害分子に由来する場合には、融合タンパク質の細胞内部分は、チェックポイントまたは免疫阻害分子などの阻害分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。一部の態様では、融合タンパク質は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインまたは一次シグナルをＴ細胞に送達することができる他のドメインなどの一次シグナル伝達ドメインを含まない。
ある特定の態様では、細胞外成分またはその結合部分は、ＣＤ２００Ｒの結合部分またはその改変体などの、ＣＤ２００に特異的に結合することができる、分子の結合ドメインまたは外部ドメインを含有する、またはこのドメインである。一部の実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ４７に特異的に結合することができる、分子または外部ドメインの結合領域、例えば、ＳＩＲＰ外部ドメインまたはそのＣＤ４７結合領域など、例えば、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはそのＣＤ４７結合領域などであるまたはそれを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、ＰＤ−Ｌ１分子またはＰＤ−Ｌ２分子またはＬＡＧ３分子に結合することができる。例示的な標的は、本発明で提供される融合タンパク質および組成物を用いて処置または改善される疾患もしくは状態に関連するもしくはそれのある特定の細胞もしくは組織、例えば、腫瘍細胞もしくは腫瘍微小環境などにおいて発現が増大するもしくは上方制御される、または、腫瘍などの患部組織に浸潤しているリンパ球などの免疫細胞上で一般に上方制御される受容体が結合する、１つもしくは複数のタンパク質であり得る。
一部の実施形態では、細胞外成分は、例えば結合ドメインが由来する分子以外の分子または結合ドメインが同一性を共有する分子以外の分子に由来する１つまたは複数の追加的な領域またはドメインをさらに含む。１つまたは複数の追加的な細胞外ドメインは、ヒンジまたはＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインなどの定常領域ドメインの全部または一部を含有し得る、免疫グロブリン分子に由来するもの、または、別の細胞表面分子、例えば共刺激受容体など、例えばＣＤ２８などに由来するものなどの、スペーサー領域を含み得る。追加的な細胞外ドメイン（複数可）は、一部の態様では、マルチマー形成ドメイン、例えば、別の分子とのホモダイマー形成またはヘテロダイマー形成、例えば２つまたはそれ超の融合タンパク質のマルチマー形成などを促進し得るダイマー形成ドメインまたは配列を含み得る。一部の実施形態では、そのようなドメインは、少なくとも膜貫通最近位システインを含むＣＤ２８分子の細胞外ドメインの一部、および一般に、そのようなシステインと膜との間の細胞外部分、またはその改変された改変体を含む。一部の態様では、そのようなドメインは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列もしくはその一部、または、それに対して少なくとも９０％、９５％、もしくは９９％同一性を有するものなどのその改変体を含む。一部の態様では、マルチマー形成を容易にするまたは促進するために、そのようなドメインを含めることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２００結合ドメイン、例えば、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分（またはその一部、例えば、その結合ドメインなど）など、例えば、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するもしくは配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるＣＤ２００Ｒの細胞外部分など、またはそのＣＤ２００結合部分もしくはその改変体もしくはその結合部分を含めた細胞外成分を含有する。そのような実施形態の一部の態様では、融合タンパク質の細胞外部分は、ＣＤ２８の細胞外領域の一部、例えば、最大でその約９〜約１２アミノ酸（例えば、９アミノ酸または１２アミノ酸）などをさらに含み、一部の態様では、ＣＤ２８細胞外領域の膜最近位システイン残基を含む。一部のそのような実施形態では、細胞外領域のＣＤ２００Ｒ部分の長さは、ＣＤ２８由来の部分における追加的な残基の数に対応して、長さが、例えば、約９〜約１２アミノ酸（例えば、９アミノ酸もしくは１２アミノ酸）、または、融合タンパク質とＣＤ２００分子の間の複合体の細胞外部分がまたがる距離が、ヒトＣＤ２００Ｒ、例えば、ＣＤ２００ＲとＣＤ２００との複合体の細胞外部分がまたがる距離；もしくは、同族ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合した、ＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ ＩまたはＭＨＣＩＩ）と同族相互作用しているＴＣＲの複合体の細胞外部分がまたがる距離；もしくは免疫学的シナプスの距離と同様、実質的に同様、もしくは同じになるのに十分な数のアミノ酸だけ、減少する。一部の態様では、融合タンパク質は、膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ２８膜貫通など、例えば、配列番号４として記載されている配列によりコードされる膜貫通ドメインもしくはその一部など、またはその改変バージョン、例えば、分子間相互作用を容易にするために追加的な荷電領域もしくは残基または親水性残基を含有するように改変された改変体などをさらに含む。一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８の共刺激ドメインなど、例えば、ライゲーションに応答して１つまたは複数のアダプター分子をＣＤ２８に動員することができるものなどをさらに含む。一部の態様では、ＣＤ２８細胞内ドメインは、配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる配列またはその部分もしくは機能的改変体を含む、またはこれらの配列またはその部分もしくは機能的改変体である。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＴＩＭ３の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＬＡＧ３の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質を対象とするが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体の長さは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとし、ここで、（ａ）細胞外成分は、ＣＤ２の細胞外部分を含み、（ｂ）疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）細胞内成分は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を対象とする。
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを対象とする。
ある特定の他の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸、またはベクターを含む宿主細胞を対象とする。
ある特定の他の態様では、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、免疫細胞活性の増大を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法が提供される。
他の態様では、本開示は、免疫応答を増強または延長する方法であって、免疫細胞活性の増強または延長を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
さらに他の態様では、本開示は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、免疫細胞活性の増大を必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
他の態様では、本開示は、免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
他の態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、がんを有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
他の態様では、本開示は、がん細胞の免疫抵抗性を阻害する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法を対象とする。
さらに他の態様では、本開示は、腫瘍を処置するための方法であって、腫瘍を有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含み、投与される宿主細胞が、免疫抑制性の腫瘍微小環境において増殖することができるものである、方法を提供する。
感染を処置する方法であって、感染を有する被験体に、治療有効量の本明細書に記載の宿主細胞を投与するステップを含む方法も本開示によって提供される。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および付属図を参照すれば明らかになろう。
図１Ａおよび１Ｂは、初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞上で高レベルで発現されるＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物を示す図である。（Ａ）例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＣＤ２００Ｒ細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜Ｖ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するためにＣＤ２８の細胞外ドメインから膜貫通近位システインの部分も組み込んでいる。任意の追加の細胞外アミノ酸（例えば１から約５０アミノ酸；本明細書で開示される例示的なマウス構築物は追加の９個の（９）アミノ酸を含有し、本明細書で開示される例示的なヒト構築物は１２個の（１２）アミノ酸を含有するなど）を検討するために、一部の構築物は細胞外または細胞内ドメインの切断された一部を有する（例えばＮ連結グリコシル化部位を保存しているＣＤ２００Ｒ）。例えば構築物ＩＶは、３アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物Ｖは、９アミノ酸短縮されたＣＤ２００Ｒの切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＣＤ２００Ｒ抗体によって検出されたＴＣＲｇａｇＴ細胞上のマウスＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物のトランスジェニック発現。対照ベクターは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含有している。 同上
図２Ａから２Ｇは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋腫瘍標的細胞に応答して増殖、蓄積およびエフェクター機能を促進し、免疫学的シナプスにおいて蓄積することを示す図である。ナイーブのＴＣＲｇａｇマウス由来脾細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８および組換えヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で刺激され、レトロウイルス上清で２日間形質導入された。細胞は、照射ＦＢＬおよび脾細胞で７日ごとに再刺激され、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）と共に３回刺激まで培養された。Ｔ細胞は、最後の刺激の５〜７日後にアッセイのために使用された。（Ａ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎによって測定されたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８およびＧＦＰ対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖。Ｔ細胞は、ＣＤ２００−ＦＢＬ（上パネル）またはＣＤ２００＋ＦＢＬ（下パネル）で３日間刺激された。（Ｂ）照射ＣＤ２００＋ＦＢＬおよび脾細胞での刺激の毎週のサイクルの間、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞との共培養での形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の優先的拡大／生存。（Ｃ）形質導入Ｔ細胞の濃縮。照射ＣＤ２００＋腫瘍細胞での反復再刺激は、空ＧＦＰ対照ベクターで形質導入された野生型Ｔ細胞と比較してＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入された細胞を濃縮した。（Ｄ）Ｔ細胞：ＦＢＬシナプスでのＣＤ２００ＲおよびＣＤ２００シグナル強度の増加。脂質ラフトは免疫学的シナプス（Ｉ）で増加している。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質は脂質ラフトと共局在していた。これは、融合タンパク質が免疫学的シナプス（ＩＩＩ、ＩＶ）内で濃縮していることを示している。（Ｅ）ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで溶解する能力の増強を示している。標的腫瘍細胞は、示したとおり蛍光色素５，６−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）のさまざまな希釈物で標識された。示したＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質または空ベクター対照で形質導入されたエフェクターＴＣＲｇａｇＴ細胞は、示したエフェクター対標的の比で、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）と非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的との１：１混合物と５時間インキュベートされた。ＦＢＬと対照腫瘍細胞の合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。（Ｆ）（Ｇ）におけるＣＦＳＥアッセイのための標的腫瘍細胞。標的腫瘍細胞は、蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）またはＣＦＳＥのさまざまな希釈物で標識された。ＥＬ４細胞（ＣＴＶ＋）、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）および非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的の１：１：１混合物が生成された。（Ｇ）ＣＦＳＥ細胞毒性アッセイ。ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８受容体またはＧＦＰ対照ベクターで形質導入された。エフェクターＴＣＲｇａｇＴ細胞は、示したエフェクター対標的の比で、ＣＤ２００−ＦＢＬまたはＣＤ２００＋ＦＢＬと非特異的ＥＬ４対照標的との１：１混合物と４時間インキュベートされた。ＦＢＬと対照腫瘍細胞との合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図３Ａから３Ｄは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍チャレンジに応答して優先的に蓄積し、Ｃｙｔｏｘａｎ処置、ＦＢＬ保有マウスへの注射後にエフェクター表現型と一致する表面タンパク質を発現することを示す図である。形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、実施例２に記載のとおり生成された。（Ａ）実験の模式図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ（Ｔｈｙ１．１ホモ接合）およびｅＧＦＰ対照（Ｔｈｙ１．１ヘテロ接合）ＴＣＲｇａｇＴ細胞をＣｙｔｏｘａｎ処置ＦＢＬ保有Ｂ６マウスに細胞４×１０６個／マウスで同時注射した。ＩＬ−２は、２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。Ｔ細胞移入８日後にマウスは、安楽死され、脾臓および鼠径部リンパ節は回収された。（Ｂ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＦＢＬに応答して脾臓に蓄積する（ＬＮ＝リンパ節；Ｓｐｌ＝脾臓）。（Ｃ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するように形質導入されたＴ細胞、空ベクターで形質導入されたＴ細胞および内因性Ｔ細胞について移入３日後での表面タンパク質の比較。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＴＣＲｇａｇＴ細胞は対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して低減したＣＤ６２Ｌを発現していた。これは、エフェクターＴ細胞表現型を示唆している。（Ｄ）ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞を発現するように形質導入された細胞、空ベクターで形質導入されたＴ細胞および内因性Ｔ細胞について移入１５日後での表面タンパク質の比較。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＴＣＲｇａｇＴ細胞は対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較して同様のレベルの細胞表面タンパク質を発現している。 同上 同上 同上
図４Ａから４Ｄは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞での養子免疫療法が播種性白血病（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を根絶させることができることを示す図である。（Ａ）実験の模式図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはｅＧＦＰ ＴＣＲｇａｇＴ細胞がＣｙ処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。ＩＬ−２は、示したとおりマウスのコホートに２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。（Ｂ）フローサイトメトリーによって決定されたＩＬ−２を注射した日のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ形質導入Ｔ細胞および形質導入されていないＴ細胞における細胞表面タンパク質の発現の代表例。（Ｃ）ＩＬ−２注射存在下で処置したマウスの生存。（Ｄ）ＩＬ−２注射非存在下で処置したマウスの生存。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＴＣＲｇａｇＴ細胞の移入は、ＩＬ−２注射非存在下での生存を有意に改善した（ｐ＜０．０５、ログランクマンテル・コックス検定）。 同上 同上 同上
図５Ａから５Ｃは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現しているＴ細胞が検出可能な自己免疫性肝臓損傷を誘導せず、正常組織に浸潤しないことを示す図である。（Ａ）実験の模式図。Ｃｙｔｏｘａｎ処置Ａｌｂ／Ｇａｇマウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびｅＧＦＰ ＴＣＲｇａｇＴ細胞がＣｙｔｏｘａｎ処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。ＩＬ−２は、示したとおりマウスのコホートに２日ごとに投与された（２×１０４Ｕ／用量）。移行の３および７日後に肝臓損傷は、肝臓酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルの定量によって評価された。（Ｂ）Ｔ細胞を受けていない、ＧＦＰを発現している対照Ｔ細胞またはＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現しているＴ細胞を受けたマウスについて移入３および７日後に測定されたＡＳＴおよびＡＬＴレベルは、処置によって変化しなかった。（Ｃ）正常組織のＴ細胞浸潤の評価。肝臓組織においてＴ細胞の限定的な存在がＴ細胞マーカーＣＤ３（左パネル）に特異的な抗体を使用して観察され、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＴＣＲｇａｇまたは対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞（右パネル）のレシピエント間で有意な差異はなかった。 同上 同上
図６Ａから６Ｄは、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインがｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積およびエフェクター機能を促進し、ＣＤ２００＋腫瘍標的細胞に応答して形質導入Ｔ細胞の腫瘍保有レシピエントの生存を促進することを示す図である。（Ａ）ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８（「Ｖ」）、−４−１ＢＢ（「ＶＩ」）および−ＣＤ２８−４−１ＢＢ（「ＶＩＩ」）構築物の模式図。（Ｂ）照射ＣＤ２００＋ＦＢＬおよび脾細胞での毎週の刺激後の、形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較した形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の拡大。ＣＤ２００Ｒ−４−１ＢＢおよびＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢもｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進する。（Ｃ）標準的ＣＦＳＥベース細胞毒性アッセイを使用して、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照と比較してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞を溶解する能力の増強を示した。ＦＢＬと対照腫瘍細胞の合計でのＦＢＬの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。溶解百分率は、Ｔ細胞とインキュベートされたＦＢＬのパーセントをＴ細胞を含まずにインキュベートされたＦＢＬのパーセントで割ることによって決定された。（Ｄ）ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ−形質導入Ｔ細胞も対照と比較して生存を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞４×１０６個を注射された。５日後、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたはｅＧＦＰ ＴＣＲｇａｇＴ細胞はＣｙｔｏｘａｎ処置ＦＢＬ保有マウスにｉ．ｐ．で細胞１０５個／マウスで注射された。 同上 同上 同上
図７Ａから７Ｄは、ＷＴ１特異的ＴＣＲおよびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８融合タンパク質を発現するように形質導入されたヒト初代Ｔ細胞が、ＣＤ２００を発現する標的細胞の増殖の増強およびＣＤ２００を発現する腫瘍細胞に応答したサイトカイン産生の増加を示すことを示す図である。（Ａ）ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ、Ｃ４およびＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の発現。（Ｂ）Ｔ２およびＫ５６２細胞におけるＣＤ２００の発現。Ｔ２細胞は、低レベルの内因性ＣＤ２００発現を示す。（Ｃ）ＣＦＳＥによって示されるＴ細胞の増殖。抗原に応答して増殖する細胞は、ＣＦＳＥ蛍光強度の低減を示す。Ｃ４およびＩＦＰの両方で形質導入されたＴ細胞は、Ｃ４のみで形質導入されたＴ細胞と比較して低レベルのＣＤ２００を発現する標的細胞の増殖の増強を示す。（Ｄ）フローサイトメトリーによって測定されたＣＤ２００ｄｉｍ腫瘍細胞への曝露に応答したサイトカイン産生。ＴＣＲ Ｃ４のみで形質導入された対照Ｔ細胞と比較して、Ｃ４およびＩＦＰ ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の両方で形質導入されたＴ細胞はサイトカイン産生の増加を示す。 同上 同上 同上
図８Ａから８Ｅは、ＳＩＲＰα細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含有する融合タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積および増殖を促進することを示す図である。（Ａ）例示的なＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＳＩＲＰα細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＳＩＲＰα−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜ＶＩ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するためにＣＤ２８の細胞外ドメインから膜貫通近位システインの部分も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、一部の構築物は、細胞外または細胞内ドメインの切断された一部（例えば、Ｎ連結グリコシル化部位を保存しているＳＩＲＰα部位）を有する。構築物ＩＶは、Ｎ連結グリコシル化部位を保存するように６アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物Ｖは、９アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物ＶＩは、２３アミノ酸短縮されているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）形質導入されていないＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較した、照射ＳＩＲＰα＋ＦＢＬおよび脾細胞での毎週の刺激後の形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞の拡大。ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物は、ＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓが蓄積の増強を示して形質導入Ｔ細胞の蓄積をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進する。（Ｃ）ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）希釈増殖アッセイにおけるＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物で形質導入されたＴ細胞の増殖。Ｔ細胞−腫瘍細胞距離を維持するように操作されたＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物を発現しているＴ細胞は、形質導入されていないＴ細胞と比較して増殖の増強を示した。（Ｄ）ＣＤ４７＋腫瘍細胞は、ＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８またはＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ構築物を発現するように形質導入されたＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞との共培養後に殺滅された。対照的に腫瘍細胞は、空ベクターまたその細胞内ドメインを欠如している切断型ＳＩＲＰαを受けたＴ細胞と培養された場合は根絶されなかった。（Ｅ）ＣＤ４７＋腫瘍細胞の殺滅を定量するために使用されるＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイの結果。ＣＤ４７＋ＦＢＬ腫瘍細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入された。赤シグナルの喪失は腫瘍細胞の殺滅を示している。腫瘍細胞の殺滅は、エフェクター：標的比１０：１、２：１および０．４：１で検査された。検査した最も低いエフェクター対標的比においてさえ、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４７＋腫瘍細胞を殺滅した。 同上 同上 同上 同上 同上
図９Ａおよび９Ｂは、ＰＤ−１細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏでサイトカイン産生を促進することを示す図である。（Ａ）例示的なＰＤ−１−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＰＤ−１細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＰＤ−１ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＰＤ−１の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＰＤ１−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ〜ＶＩＩ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶ〜ＶＩＩはＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＩＶは、９アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物Ｖは、１２アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＶＩは、１５アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物ＶＩＩは、２１アミノ酸短縮されているＰＤ−１の切断された一部を有する。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「Ｖ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）ＰＤ１−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、内因的にＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現するＦＢＬ細胞でＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下での５時間の刺激に応答してサイトカイン産生の増加を示した。刺激されたＴ細胞は、フローサイトメトリーによってエフェクターサイトカイン、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの細胞内発現について評価された。 同上
図１０は、ＴＣＲ Ｃ４およびＰＤ−１ ＩＦＰの共発現を示す図である（ＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。Ｃ４およびＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入されたＴ細胞は、両方のタンパク質の高い形質導入効率および発現を示した。
図１１Ａから１１Ｃは、Ｆａｓ細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質が、照射ＦＢＬ細胞での刺激の際にｉｎ ｖｉｔｒｏで蓄積することを示す図である。（Ａ）例示的なＦａｓ−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、Ｆａｓ細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（Ｆａｓｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、Ｆａｓの細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（Ｆａｓ−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＦａｓの切断された一部を有し、Ｆａｓ細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）Ｆａｓ構築物で形質導入されたＴＣＲｇａｇＴ細胞の照射ＦＢＬ細胞での複数回刺激での蓄積。すべての構築物が対照Ｔ細胞と比較してＴ細胞の蓄積を促進した。（Ｃ）Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複数回の刺激においてＴ細胞の生存および拡大を促進したが、全長（ＦＬ）Ｆａｓはしなかった。 同上 同上
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＬＡＧ３細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質の構造および発現を示す図である。（Ａ）例示的なＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＬＡＧ３細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＬＡＧ３ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＬＡＧ３−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＬＡＧ３の切断された一部を有し、ＬＡＧ３細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＬＡＧ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって決定されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞によるＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物の発現。ＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物（ＬＡＧ３ｔｍ−ＣＤ２８；ＬＡＧ３−ＣＤ２８ｔｍ；ＬＡＧ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ；ＬＡＧ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を発現するように形質導入されたＴ細胞は、空ベクターを受けた対照Ｔ細胞とは対照的に構築物の発現を示した。 同上
図１３Ａおよび１３Ｂは、ＴＩＭ３細胞外成分およびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質の構造および発現を示す図である。（Ａ）例示的なＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物の模式図。構築物「Ｉ」は、ＴＩＭ３細胞外（「ＥＣ」）および膜貫通（「ＴＭ」）ドメインならびにＣＤ２８細胞内（「ＩＣ」）シグナル伝達ドメインを含有している（ＴＩＭ３ｔｍ−ＣＤ２８）。構築物「ＩＩ」は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインならびにＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含有している（ＴＩＭ３−ＣＤ２８ｔｍ）。構築物「ＩＩＩ」および「ＩＶ」は、マルチマー形成を促進し、ＣＤ２８シグナル伝達を増強するために膜貫通近位システインに近接するＣＤ２８の細胞外ドメインの一部も組み込んでいる。追加の細胞外アミノ酸（例えばマウス構築物についての追加の９個の（９）アミノ酸、またはヒト構築物についての１２個の（１２）アミノ酸）を検討するために、構築物ＩＶはＴＩＭ３の切断された一部を有し、ＴＩＭ３細胞外ドメインは９アミノ酸短縮されている。構築物「Ｉ」、「ＩＩ」および「ＩＶ」は、細胞間（例えば、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間）の短い空間距離を維持しており、ｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在でき、強い共刺激シグナルを送達することができる。（Ｂ）抗ＴＩＭ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって決定されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞によるＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物の発現。ＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物（ＴＩＭ３ｔｍ−ＣＤ２８；ＴＩＭ３−ＣＤ２８ｔｍ；ＴＩＭ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ；ＴＩＭ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を発現するように形質導入されたＴ細胞は、典型的に、空ベクターを受けた対照Ｔ細胞とは対照的に構築物の発現を示した。 同上
本開示は、免疫細胞などの宿主細胞におけるシグナル伝達を調節する融合タンパク質を提供する。例えば、本開示の融合タンパク質は、ヒトＴ細胞において活性化または共刺激シグナルをもたらすことができ、Ｔ細胞は、任意選択で、好ましい抗原特異的ＴＣＲを有するように操作することができる。これらの免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）は、遍在的に発現される標的または一般に非正常細胞（例えば、がん細胞）において上方制御または過剰発現される標的と相互作用することができる。そのようなＩＦＰは、細胞外結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを有する。操作されたＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）および活性化シグナルを生成する本開示の融合タンパク質を用いてＴ細胞に形質導入することにより、Ｔ細胞のある特定の実施形態は、例えば腫瘍細胞との相互作用の際に外因性共刺激がもはや必要なくなる可能性がある。
ある特定の態様では、本開示は、被験体における疾患（例えば、がん、感染症）の処置を含めた様々な治療への適用のための、ＩＦＰを含む宿主細胞（例えば、例えばＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞）、ＩＦＰをコードするベクター、およびＩＦＰを含むＴ細胞を活性化する方法を提供する。
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を示すことは、それを理解するのに有用であり得る。付加的な定義は、本開示を通して説明する。
本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数および、適切な場合、その分数（整数の十分の一および百分の一など）の値を含むと理解すべきである。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さなどの、任意の物理的特徴に関連して本明細書で列挙する任意の数の範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に示さない限り、表示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「１つまたは複数」の列挙された構成要素を意味することが理解されるものとする。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方またはその任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、「包含する」、「有する」および「含む」という用語は、同義で使用され、それらの用語およびその変形形態は、非限定的と解釈するものとする。
「から本質的になる」という用語は、指定された材料もしくはステップに、または特許請求の範囲に記載されている発明の基本的特性に実質的に影響を及ぼさない材料もしくはステップに特許請求の範囲を限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域、またはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）もしくはタンパク質（１つまたは複数のドメイン、領域、またはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、もしくはモジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、一緒に、ドメイン、領域、もしくはモジュールまたはタンパク質の長さの多くて２０％（例えば、多くて１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、活性を４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％以下など、５０％超低下させない）伸長、欠失、変異またはそれらの任意の組合せ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端またはドメイン間におけるアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
本明細書で使用される場合、「異種性」または「非内因性」または「外因性」は、宿主細胞もしくは被験体にとって天然ではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、もしくは活性を指す、または、宿主もしくは宿主細胞にとって天然であり、構造、活性もしくはその両方が、天然の分子と変異した分子の間で異なるように変更されたもしくは変異した、任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、もしくは活性である。ある特定の実施形態では、異種、非内因性または外因性の分子（例えば、受容体、リガンド）は、宿主細胞または被験体に対して内因性ではなくてよいが、その代わりに、そのような分子をコードする核酸が、宿主細胞に、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔などによって付加されていてよく、ここで、付加された核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよく、染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製性ベクターとして）存在していてもよい。「相同」または「ホモログ」という用語は、宿主細胞、種、または株において見いだされるまたはそれに由来する分子または活性を指す。例えば、分子をコードする異種または外因性の分子または遺伝子は、それぞれ天然の宿主または宿主細胞分子または当該分子をコードする遺伝子と相同であり得るが、構造、配列、発現レベルまたはこれらの組合せが変更されていてよい。非内因性分子は、同じ種、異なる種、またはこれらの組合せに由来するものであり得る。
本明細書で使用される場合、「内因性」または「天然」という用語は、宿主または宿主細胞に通常存在し、操作された変更を有さない遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。
「結合ドメイン」（「結合領域」または「結合部分」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＳＭＡ、ＷＴ−１、サイクリン−Ａ１）と特異的かつ非共有結合により会合する、１つに合わさる、または組み合わさる能力を保有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの分子を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または他の標的またはその結合タンパク質の、任意の天然に存在する、合成、半合成または組換えにより生成した結合パートナーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または機能的結合ドメインまたはその抗原結合断片などの抗原結合ドメインである。例示的な結合ドメインは、生体分子に結合する特定の能力について選択された、受容体外部ドメイン（例えば、ＣＤ２００Ｒ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、Ｆａｓのもの）またはその結合部分、リガンド（例えば、ＩＬ３５、ケモカインなどのサイトカイン）またはその結合部分、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）またはその結合部分、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原結合領域、または合成ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、「特異的に結合する」は、１０５Ｍ−１に等しいもしくはより大きい親和性もしくはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合ドメイン、もしくはその融合タンパク質が会合することもしくは１つに合わさること、または試料中の任意の他の分子もしくは成分と有意に会合することも１つに合わさることもなしに、そのような標的分子に結合することを指す。結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）または「低親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、最大で１０７Ｍ−１まで、最大で１０６Ｍ−１まで、最大で１０５Ｍ−１までのＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、「増強された親和性」を有し得、これは、標的抗原に対して野生型（または親）結合ドメインよりも強力な結合を有する、選択または操作された結合ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）が野生型結合ドメインよりも高いことに起因し得る、または標的抗原に対するＫｄ（解離定数）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る、または標的抗原に対する解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析などの、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためならびに結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための様々なアッセイが公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、５１巻：６６０頁、１９４９年；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物も参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単鎖で少なくとも２つの別個のドメインを有し、それらのドメインが天然ではタンパク質において一緒には見いだされない、ポリペプチドを指す。融合タンパク質をコードする核酸分子は、ＰＣＲ、組換え操作などを使用して構築することができる、または、そのような融合タンパク質は、タンパク質合成の方法を使用して作製することができる。融合タンパク質は、タグまたは生物活性分子などの他の成分（例えば、共有結合した）をさらに含有し得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）により発現または産生される融合タンパク質は細胞表面に位置し、そこで、融合タンパク質は細胞膜につなぎ止められ、融合タンパク質の一部（例えば、結合ドメインを含有する）が細胞外に位置し、融合タンパク質の一部（例えば、シグナル伝達ドメインを含有する）が細胞内に位置する。
「疎水性成分」は、本明細書で使用される場合、細胞膜において熱力学的に安定な三次元構造を有する任意のアミノ酸配列を意味し、一般に、約１５アミノ酸から約３０アミノ酸までの長さにわたる。疎水性成分の構造は、アルファヘリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータへリックス、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、疎水性成分は、細胞膜に挿入またはまたがり得る膜貫通タンパク質の部分である、公知の膜貫通タンパク質由来の「膜貫通ドメイン」で構成される。さらなる実施形態では、疎水性成分または膜貫通ドメインは、融合タンパク質の細胞外部分と細胞内部分との間に位置し、それらを連結することができる。さらに、疎水性成分は、分子間相互作用を容易にするために、荷電した領域または親水性残基を含有するように改変することができる。
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、適切なシグナルを受け取った際に細胞における共刺激、陽性、または活性化生物学的応答または生理応答などの応答を直接または間接的に促進することができる、本開示の融合タンパク質において使用されるものなどの分子の細胞内部分である。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、結合によりシグナルを受け取る、またはそれ自体が標的分子に直接結合して細胞内の他の成分にシグナルを伝達することができる、タンパク質またはタンパク質複合体の一部である。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、キナーゼドメイン、共刺激ドメインなどの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインまたはモチーフを含有する場合、細胞応答を直接促進し得る。他の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進し、それが今度は細胞応答を直接促進する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはそれらの任意の組合せに由来し得る。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ζを含まない。
「マルチマー形成ドメイン」は、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド分子または領域と、直接または間接的に、優先的に相互作用または会合するポリペプチド分子または領域を指し、マルチマー形成ドメインの相互作用は、マルチマー形成（すなわち、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモマルチマー、ヘテロマルチマーなどであり得るダイマー、トリマー、テトラマー、またはより高次のマルチマーの形成）に実質的に寄与するまたはそれを効率的に促進する。例えば、マルチマー形成は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合または架橋）、イオン結合、金属結合、静電相互作用、塩橋、双極子−双極子力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、またはそれらの任意の組合せを含めた１つまたは複数の型の分子力に起因し得る。マルチマーは、適切な条件下（例えば、生理的条件、組換えもしくは操作されたタンパク質の発現、精製、もしくは保管に適した水溶液中、または非変性もしくは非還元電気泳動の条件下）で安定である。例示的なマルチマー形成ドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合、ジンクフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、へリックス−ターン−へリックス、へリックス−ループ−へリックスなどを含み得る。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、得られるポリペプチド構造が標的分子に対する特異的結合親和性を維持するまたはシグナル伝達活性（例えば、エフェクタードメイン活性）を維持するまたはその両方であるように２つの単鎖融合タンパク質の相互作用または１つもしくは複数の結合ドメインの位置付けを容易にするスペーサー機能をもたらす「リンカー」を含有し得る。例示的なリンカーは、１〜約１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復を含み、式中、ｘおよびｙは、独立に、１〜５の整数である。
「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」は、結合ドメインと隣接する疎水性成分との間または疎水性成分の一方の末端もしくは両方の末端上などの、融合タンパク質の２つの隣接するモチーフ、領域またはドメインの間の１つまたは複数（例えば、約２〜２０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築デザインに起因し得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用に起因するアミノ酸残基）。ある特定の実施形態では、接合部アミノ酸は、１〜約１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復を有し、式中、ｘおよびｙが、独立に１〜５の整数であるものなどのリンカーを形成する。
本明細書で使用される場合、「免疫系細胞」は、２つの主要な系統である骨髄系前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球などの骨髄系細胞を生じる）およびリンパ系前駆細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を生じる）を生じる、骨髄における造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。例示的な免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞を含む。マクロファージおよび樹状細胞は、ペプチドと複合体を形成したＡＰＣの表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面上のＴＣＲと相互作用する時にＴ細胞を活性化し得る特殊化した細胞である、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ぶことができる。
「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現の増大、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の低下）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原経験済みおよび長寿命）およびエフェクター細胞（抗原経験済み、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現の増大、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の低下）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ４５ＲＡの発現の低下、ならびにＣＤ１２７の発現の増大）のサブセットにさらに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現の低下を有し、グランザイムおよびパーフォリンについて陽性である抗原経験済みＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。他の例示的なＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）調節Ｔ細胞およびＴｒｅｇ１７細胞などの調節Ｔ細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、およびＱａ−１制限Ｔ細胞を含む。
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と会合すると、一般に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見いだされる分子を指す。大多数のＴ細胞では、ＴＣＲは、高度に可変性のα鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド連結ヘテロダイマーを有する。Ｔ細胞の小さなサブセットでは、ＴＣＲは、可変性のγ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）ヘテロダイマーで構成される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｎ末端免疫グロブリン可変ドメイン１つ、免疫グロブリン定常ドメイン１つ、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質尾部を有する（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４：３３頁、１９９７年を参照されたい）。本開示において使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、または他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。ＴＣＲは、細胞に結合した形態（すなわち、膜貫通領域もしくはドメインを有する）または可溶性形態であり得る。
「主要組織適合性遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、互換的に使用され、ヒト対応物のヒト白血球抗原（ＨＬＡ分子）も指し、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指すと理解される。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜を貫通するα鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合により会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、どちらも膜を貫通する２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成される。各鎖は２つのドメインを有する。ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ分子は、細胞質ゾルにおいて生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド：ＭＨＣ（または、ヒトではペプチド：ＨＬＡ）複合体がＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子は、小胞系において生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。
「核酸分子」またはポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、または、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス鎖）であり得る。コード分子は、当技術分野で公知のコード配列と同一のコード配列を有し得る、または、遺伝暗号の重複性もしくは縮重の結果として、異なるコード配列を有し得る、または、スプライシングにより、同じポリペプチドをコードし得る。
本開示の核酸分子またはポリヌクレオチドの改変体も意図されている。改変体ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の定義済みの配列のポリヌクレオチドのうちの１つと少なくとも９０％、好ましくは９５％、９９％、もしくは９９．９％同一である、または、定義済みの配列のそれらのポリヌクレオチドのうちの１つと、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃、もしくは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、約４２℃のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ポリヌクレオチド改変体は、本明細書に記載の機能性を有する結合ドメインまたはその融合タンパク質をコードする能力を保持する。
「ストリンジェント」という用語は、当技術分野においてストリンジェントであると一般に理解されている条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主に温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についてのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃または０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、約４２℃である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年を参照されたい）。
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）を使用することもできるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する例では、追加的な例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドに対して）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドに対して）の洗浄を含む。
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージであり得る。「発現ベクター」は、適切な環境に存在すると、ベクターに担持されている１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである。
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスである。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。例示的なガンマレトロウイルスは、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスを含む。
「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：１型ＨＩＶ、および２型ＨＩＶを含む）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。
「同一の」または「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれ超のポリペプチドまたは核酸分子の配列に関しては、配列比較アルゴリズムなどの当技術分野で公知の方法を使用して、手動のアラインメントにより、または目視検査により測定して、比較ウインドウまたは指定の領域にわたって最大の対応について比較し、アラインメントした場合に、同じであるか、または指定された領域にわたって、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性）２つまたはそれ超の配列または部分配列を意味する。例えば、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するための適切な好ましいアルゴリズムは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３頁に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。
「処置する」または「処置」または「改善する」は、被験体（例えば、ヒト、または、霊長類、ウマ、イヌ、マウスもしくはラットなどの非ヒト哺乳動物）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般に、本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞、および任意選択でアジュバントまたは補助的療法を含む適切な用量または処置レジメンを、治療的または予防的利益を引き出すために十分な量で投与する。治療的または予防的／防止的利益は、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の軽減または緩和；症状の出現の減少；生活の質の改善；より長い無病状態；疾患の程度の低下、疾患状態の安定化；疾患の進行の遅延；寛解；生存；生存の持続；またはそれらの任意の組合せを含む。
融合タンパク質または本開示の融合タンパク質（例えば、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８、ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ、ＳＩＲＰα−４１ＢＢ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４１ＢＢ、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢまたは他のそのような融合タンパク質）を発現する細胞の「治療有効量」または「有効量」は、処置される疾患または状態に関しては、処置される疾患の１つまたは複数の症状の改善を統計的に有意にもたらすために（例えば、感染の減少、腫瘍サイズの縮小、がんの成長の阻害など）十分な融合タンパク質の量または細胞の数を指す。
免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）
ある特定の態様では、本開示は、細胞外成分、疎水性成分、および細胞内成分を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、細胞外成分は、標的に特異的に結合するものなどの結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、普通は、例えば、その天然の状態では、免疫阻害受容体もしくはチェックポイント分子などのその結合パートナーもしくはリガンドもしくは受容体に結合すると負もしくは阻害シグナルを送達することができる分子に由来するか、または、標的は、阻害性受容体もしくはリガンドもしくはチェックポイント分子もしくは他の阻害性リガンドである。一部の実施形態では、細胞内成分は、一般に共刺激または正のシグナルを例えば免疫細胞に送達することができる、分子の共刺激シグナル伝達ドメインまたはシグナル伝達領域などのシグナル伝達ドメインを含む。したがって、一部の態様では、融合タンパク質は、天然の状況では阻害シグナルをもたらす結合事象に応答して、正または共刺激シグナルを送達することができる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、特定の距離が達成されるようなものである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体（例えば、融合タンパク質と標的の間で特異的な結合により形成される複合体の細胞外部分で構成されるものなど）は、特定の長さのものである、または、最大で免疫学的シナプスにおける膜間の距離、もしくは、例えばＴＣＲによる特異的な認識後のＴＣＲとＭＨＣ分子との間の同族複合体の細胞外部分がまたがる距離、もしくは天然分子との天然の結合パートナーとの間で形成される複合体の細胞外部分がまたがる距離などの、特定の距離にまたがる。一部の実施形態では、距離または長さは、Ｔ細胞などの免疫細胞において発現した際、または免疫学的シナプスに進入した際に、融合タンパク質と抗原受容体または他のシグナル伝達分子の共局在を促進するために十分なものである。
背景として、免疫学的シナプスは、様々な細胞間、例えば免疫細胞間で形成され得る、細胞間の界面である（Ｒｏｓｓｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：１〜１２頁、２０１２年；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２１巻：８２０頁、２０１３年）。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触するＴ細胞の場合では、免疫学的シナプスは、ＴＣＲ（Ｔ細胞の表面上に見いだされる）とＨＬＡペプチド（非ヒトについてはＭＨＣ−ペプチド）複合体（例えばＡＰＣの表面上に見いだされる；ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面上に見いだされ得、一方、ＨＬＡクラスＩＩは、全ての細胞型において条件的に発現し得るが、通常ＡＰＣ上に見いだされる）との結合によって形成され得る。さらに、免疫学的シナプスは、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に組織化し得、それが、リンパ球活性化に影響を及ぼし、リンパ球への抗原−ＨＬＡ（または抗原−ＭＨＣ）複合体提示を導き、細胞間のサイトカインまたは溶解性顆粒分泌を導く可能性がある。ＳＭＡＣは、同心円に配置された３つの構造：多数のＴＣＲならびに共刺激および阻害分子を含有する中心領域（ｃＳＭＡＣ）、ＬＦＡ−１およびタリンがクラスター化している周辺領域（ｐＳＭＡＣ）、およびＣＤ４３およびＣＤ４５分子に富む遠位領域（ｄＳＭＡＣ）で構成され得る。ある特定の実施形態では、免疫学的シナプスは、約１０ｎｍから約１５ｎｍまでにまたがる。例えば、ＴＣＲ：：ＨＬＡペプチド相互作用または融合タンパク質−標的相互作用などの、免疫学的シナプス内で見出されるタンパク質相互作用は、一般に、膜間の約１４ｎｍにまたがる。ある特定の実施形態では、免疫学的シナプスにおけるＳＭＡＣの幅は、１５ｎｍを超えない。
一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外スパンは、免疫学的シナプスの特定の区画に局在し得るようなものである。免疫学的シナプスの様々な区画に局在すると考えられる一部の複合体は、それらの細胞外スパンの長さに関してよく特徴付けられている。例えば、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体は、およそ１０〜１５ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられ、より多くのインテグリンに基づく複合体は、およそ４０ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられる（Ａｌａｋｏｓｋｅｌａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、１００巻：２８６５頁、２０１１年）。追加的な例示的な複合体は、ＣＤ２−ＣＤ４８複合体を含み、これは、およそ１２．８ｎｍの細胞外スパンを有すると考えられる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８３巻：３４４１４頁、２００８年）。さらに、ｃＳＭＡＣに局在すると考えられる例示的なリガンド結合分子は、ＴＣＲおよびＭＨＣ複合体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、およびそのリガンドを含み（Ｄｕｓｔｉｎら、ＣＳＨ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２巻：ａ００２３１１頁、２０１０年）、したがって、それらの天然のリガンドと複合体を形成するこれらの分子は、ｃＳＭＡＣに局在するのに適したサイズのものであることが意図されている。
一部の態様では、特定の構築物または融合タンパク質の細胞外部分などの操作されたその細胞外部分、または前述のもののいずれかと、例えばその結合パートナーとの複合体の長さもしくは距離またはおよその長さもしくは距離は、公知の方法によって決定またはモデリングすることができる。一部の例示的なモデルでは、タンパク質の三次構造、結合ドメイン、および他の特性は、インプットアミノ酸配列または核酸配列を使用して概算することができる。タンパク質の三次構造を使用して、タンパク質またはその複合体の細胞外部分のおよその長さを決定するために有用な、細胞外部分のサイズ、柔軟性、および他の特性を概算することができる。一般に、タンパク質の細胞外部分の長さをモデリングまたは概算するための方法は公知である。例えば、ｍｏｌｂｉｏｌ−ｔｏｏｌ．ｃａおよびＳｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌは、タンパク質の構造を予測するために有用な多数のツールを含有する（Ｓｃｈｗｅｄｅ， Ｔ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２１巻：１５３１頁、２０１３年も参照されたい）。
ある特定の実施形態では、標的と複合体を形成する、会合するまたは相互作用する本開示の融合タンパク質は、免疫学的シナプス中に存在することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分は、免疫学的シナプスにまたがる。他の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体は、ｃＳＭＡＣなどの超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に局在する。さらなる実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分は、ＴＣＲ：：ＨＬＡ−ペプチド相互作用の細胞外部分によって定義される免疫学的シナプスにまたがる。さらに別の実施形態では、融合タンパク質：：標的複合体の細胞外部分の長さは、約１２ｎｍ〜約１５ｎｍ、または約１４ｎｍである。
免疫学的シナプスにおいて相互作用する細胞の細胞膜間の距離は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、距離は、サブ回折解像度方法（ｓｕｂｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）または電子顕微鏡によって測定することができる（ＪａｍｅｓおよびＶａｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ、４８７巻：６４〜６９頁、２０１２年）。
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から４０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から３０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から２０ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、細胞膜から１５ｎｍ未満伸長した細胞外部分を含む。
一部の実施形態では、提供される融合タンパク質は、細胞膜間の距離と比較して、シナプスへの進入もしくは抗原受容体との共局在を可能にするまたは天然のタンパク質に存在する距離もしくは長さを模倣する細胞外の長さもしくは空間距離を有するという利点を提供する。融合タンパク質の細胞外部分が、結合ドメインを得たものとは異なる分子に由来する追加的な分子由来のドメイン（複数可）を含む一部の実施形態では、結合ドメインを含有する細胞外成分の長さは、そのような同様の長さまたは距離をもたらすように、天然分子の細胞外領域と比較して、減少、例えば、切断される。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞表面受容体の細胞外ドメインおよび第２のドメイン（例えば、リンカーまたは第２の細胞表面受容体の細胞外ドメイン）を含む細胞外成分を含む。一部のそのような実施形態では、標的分子と複合体を形成した場合に免疫学的シナプス中に存在することまたは免疫学的シナプスにまたがることができる細胞外成分を維持するために、細胞外成分の１つまたは複数のドメインを切断することができる。
一部の疾患（例えば、がん）では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって生じるＴ細胞応答の大きさおよび質は、共刺激シグナルと阻害シグナルとの間の不均衡に起因して調節不全である（例えば、低下する）可能性があり、その結果、免疫抵抗性が生じる可能性がある。本開示のある特定の融合タンパク質の１つの利点は、第１のシグナルを質的に異なる第２のシグナルに転換することができることである。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、負または阻害シグナルを正または共刺激シグナルに有効に転換することができ、それにより、がんなどの疾患に関連する免疫抵抗性を軽減するまたは最小限にするようなものである。例えば、一部の実施形態では、天然の結合パートナーが結合した場合には阻害または負のシグナルの送達をもたらす標的に、本発明で提供される融合タンパク質が結合すると、その代わりに、正、例えば共刺激シグナルを、それを発現する細胞、例えばＴ細胞などに送達することができる。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、負のシグナルに関連する細胞外成分および正のシグナルに関連する細胞内成分を含む。Ｔ細胞の表面上に見いだされる例示的な受容体、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４またはＣＤ１５２）は、ＡＰＣ上に見いだされるそのリガンドであるＣＤ８０またはＣＤ８６のうちの１つが結合すると、阻害シグナルを受け取り得る。ＣＴＬＡ４は、初期Ｔ細胞活性化の大きさを、Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ２８を打ち消すことによって調節する（Ｒｕｄｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、２２９巻：１２頁、２００９年を参照されたい）。Ｔ細胞の表面上に見いだされる別の例示的な受容体、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）は、ＡＰＣ上に見いだされるそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）またはＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ７３）のうちの１つが結合すると、阻害シグナルを受け取り得る。ＰＤ−１は、炎症中の末梢組織におけるＴ細胞の活性を制限し、自己免疫を最小限にする（Ｋｅｉｒら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６巻：６７７頁、２００８年を参照されたい）。負のシグナルに関連する細胞外成分（例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）および正のシグナルに関連する細胞内成分（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７）を含む本開示の代表的な融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４ ＣＤ２８融合タンパク質、ＣＴＬＡ４ ＣＤ１３７融合タンパク質、ＣＴＬＡ４ ＣＤ２８−ＣＤ１３７融合タンパク質、ＰＤ１−ＣＤ２８融合タンパク質、ＰＤ１−ＣＤ１３７融合タンパク質、またはＰＤ１−ＣＤ２８−ＣＤ１３７融合タンパク質を含む。
本開示の融合タンパク質は、免疫細胞から受け取る阻害シグナルを遮断するまたはその数を減少させることができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、阻害シグナルを正のシグナルに転換し、それにより、免疫細胞から受け取る阻害シグナルの総数を減少させる、または普通は負または阻害シグナルであるものを正のシグナルに転換する。他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、野生型受容体のシグナル伝達を遮断する。例えば、ドミナントネガティブ融合タンパク質が本開示の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、野生型受容体に結合し、野生型受容体とオリゴマーを形成することにより、野生型受容体のシグナル伝達を遮断する。
本開示のある特定の融合タンパク質のさらに別の利点は、１つ超のそのような融合タンパク質を細胞によって発現させ、それにより、多数の刺激シグナルをもたらすことができることである。多数の共刺激ドメインを有する組換えＴＣＲにより適切な共刺激シグナル伝達が起きない場合があることが観察されている。多数の免疫調節性融合タンパク質、特に免疫学的シナプス中に存在することができる免疫調節性融合タンパク質の同時発現により、Ｔ細胞がアネルギーを回避し、増殖するために必要な共刺激シグナル伝達がもたらされ得る。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＣＲもしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他の抗原受容体に対してトランスに作動する。一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、免疫学的シナプスの外部で作動する。
さらに別の態様では、本開示の融合タンパク質により、選別を必要とせずに、融合タンパク質に結合するリガンドを発現する腫瘍細胞を用いて再刺激することにより、形質導入されたＴ細胞を濃縮することが可能になる。
例示的な一実施形態では、（ａ）ＣＤ２００Ｒの細胞外部分、（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、細胞外部分は、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分をさらに含む。さらなる実施形態では、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２３１アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
別の例示的な実施形態では、本開示は、（ａ）ＳＩＲＰαの細胞外部分、（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、および（ｃ）ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分をさらに含む。さらなる実施形態では、ＳＩＲＰαの細胞外部分は、ＳＩＲＰαのＮ末端から少なくとも約３６１アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
ここで本開示の融合タンパク質の構成部分をさらに詳細に記載する。
細胞外成分
本明細書に記載の通り、本開示の融合タンパク質は、一般に、標的に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含む。融合タンパク質結合ドメインの標的への結合により、例えば、融合タンパク質が発現する細胞において、（１）標的と、別の分子との相互作用が遮断される（例えば、受容体−リガンド相互作用が遮断または干渉される）、（２）標的のある特定の機能（例えば、阻害性シグナルトランスダクション）が干渉される、低下するまたは排除される、（３）標的が結合した際に通常は誘導されないある特定の生物学的経路が誘導される（例えば、阻害または負のシグナルが刺激または正のシグナルに転換される）、またはそれらの任意の組合せをもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、細胞外部分を含み、細胞外部分は、負のシグナルに関連するタンパク質の細胞外部分を含む。
例示的な本開示の結合ドメインは、細胞表面受容体の外部ドメイン、またはその結合部分、細胞表面リガンドの外部ドメイン、サイトカイン（例えば、ＩＬ３５）、ケモカイン、抗体に基づく結合ドメイン、ＴＣＲに基づく結合ドメイン、従来のものではない結合ドメイン、またはそれらの任意の組合せであり得る。例えば、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５の外部ドメインを含む結合ドメインが本開示の範囲内に入る。本明細書で使用される場合、細胞表面受容体またはリガンドに由来する「外部ドメイン」は、完全な細胞外ドメインまたはその機能的（結合）断片を含む。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、標的に対するアビディティが野生型または参照タンパク質と比較して高い、変異した細胞外ドメインまたはその機能的（結合）断片を含む。ある特定の実施形態では、外部ドメインは、可変様ドメインまたは可変様ドメインのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインまたはそのＣＤ２００結合部分などのＣＤ２００結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。背景として、ＣＤ２００Ｒは、免疫グロブリンスーパーファミリーの１型膜タンパク質であるＣＤ２００に結合する受容体である（Ｔｏｎｋｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１巻：５６６〜５６８頁、２００７年）。ＣＤ２００は、白血病、多発性骨髄腫、および様々な固形腫瘍（例えば、黒色腫、乳房、および扁平上皮細胞癌）を含めた様々な悪性疾患において上方制御されることが報告されている。実際、高レベルのＣＤ２００発現は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予後不良に関連付けられており、また、ＣＤ２００Ｒシグナル伝達にはＴ細胞に対する阻害効果があることが示されている（Ｃｏｌｅｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２６巻：２１４８〜２１５１頁、２０１２年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインは、ＣＤ２００Ｒタンパク質の全長細胞外部分、ＣＤ２００Ｒタンパク質の全長成熟細胞外部分、ＣＤ２００Ｒタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＣＤ２００Ｒの膜貫通ドメインの一部と共になったＣＤ２００Ｒタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
さらなる実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ外部ドメインは、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２００アミノ酸を含む。一部の他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされる。さらに他の実施形態では、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも１８０アミノ酸、１９０アミノ酸、２００アミノ酸、２１０アミノ酸、２２０アミノ酸、２３０アミノ酸、２３１アミノ酸、２３４アミノ酸、または２４３アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号８に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００Ｒ外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２００Ｒ断片は、ヒトＣＤ２００Ｒである。さらなる実施形態では、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２００Ｒ外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００Ｒは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２００Ｒ外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２００Ｒ断片は、ヒトＣＤ２００Ｒである。さらなる実施形態では、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２００Ｒ外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはその結合部分などのＣＤ４７結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。背景として、ＣＤ４７は、食作用からの細胞の保護において役割を果たす、広範に発現する膜貫通タンパク質である（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍら、ＰＮＡＳ、１０９巻：６６６２〜６６６７頁、２０１２年）。ＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合することにより、ＳＩＲＰαシグナル伝達が開始され、それによりマクロファージによる食作用が阻害される。したがって、ＳＩＲＰαの下方制御により、マクロファージによる食作用が増大する。ＳＩＲＰαは、ＡＭＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肺、膀胱、および他の固形腫瘍を含めた多数のヒト腫瘍型において発現する。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、ＳＩＲＰαタンパク質の全長細胞外部分、ＳＩＲＰαタンパク質の全長成熟細胞外部分、ＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＳＩＲＰαの膜貫通ドメインの一部と共になったＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
さらなる実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインまたはその結合部分は、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、ＳＩＲＰαのＮ末端から少なくとも３００アミノ酸、３１０アミノ酸、３２０アミノ酸、３３０アミノ酸、３４０アミノ酸、３５０アミノ酸、３６０アミノ酸、３６１アミノ酸、３７０アミノ酸、３７３アミノ酸、またはそれ超を含む。一部の他の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号２１に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰα外部ドメイン、または任意のそのＳＩＲＰα断片は、ヒトＳＩＲＰαである。さらなる実施形態では、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＳＩＲＰα外部ドメインが提供される。
さらなる実施形態では、ＳＩＲＰα外部ドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰα外部ドメイン、または任意のそのＳＩＲＰα断片は、ヒトＳＩＲＰαである。さらなる実施形態では、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＳＩＲＰα外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはその両方に結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ−１外部ドメインまたはそのリガンド結合部分を含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、ＰＤ−１タンパク質の全長細胞外部分、ＰＤ−１タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＰＤ−１タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＰＤ−１の膜貫通ドメインの一部と共になったＰＤ−１タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、ＰＤ−１のＮ末端から少なくとも８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１３０アミノ酸、１３２アミノ酸、１３５アミノ酸、１３７アミノ酸、１４０アミノ酸、１４９アミノ酸、１５０アミノ酸、１５５アミノ酸、１５８アミノ酸、１６０アミノ酸、または１７０アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９１、９３または９５に記載の核酸分子によりコードされる。さらなる実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号６０に記載のＰＤ−１からの少なくとも約９０アミノ酸〜少なくとも約１３０アミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９０に記載のＰＤ−１外部ドメインのＮ末端から１７０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１は、配列番号８９に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＰＤ−１、ＰＤ−１外部ドメイン、または任意のそのＰＤ−１断片は、ヒトＰＤ−１である。さらなる実施形態では、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。さらなる実施形態では、配列番号９０に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。さらに別の実施形態では、配列番号８９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１結合ドメインが提供される。
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１外部ドメインは、配列番号９２、９４または９６に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、配列番号９２、９４、または９６に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＰＤ−１外部ドメインが提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＰＤ−１、ＰＤ−１外部ドメイン、または任意のそのＰＤ−１断片は、ヒトＰＤ−１である。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ２外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、配列番号６１に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、ＣＤ２タンパク質の全長細胞外部分、ＣＤ２タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＣＤ２タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはＣＤ２の膜貫通ドメインの一部と共になったＣＤ２タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２、ＣＤ２外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２断片は、ヒトＣＤ２である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１７６７．３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。さらなる実施形態では、配列番号６１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ２外部ドメインは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＣＤ２外部ドメインが提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＣＤ２、ＣＤ２外部ドメイン、または任意のそのＣＤ２断片は、ヒトＣＤ２である。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＦａｓＬに結合する結合ドメインを含む細胞外成分を含有する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。Ｆａｓは、腫瘍関連脈管構造において発現し、細胞死を誘導することによってＣＤ８細胞浸潤を妨げる。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、Ｆａｓタンパク質の全長細胞外部分、Ｆａｓタンパク質の全長成熟細胞外部分、Ｆａｓタンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＦａｓの膜貫通ドメインの一部と共になったＦａｓタンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされる。さらに他の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、ＦａｓのＮ末端から少なくとも１５０アミノ酸、１６０アミノ酸、１６１アミノ酸、１６６アミノ酸、１７０アミノ酸、または１７３アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、Ｆａｓは、配列番号７３に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓは、配列番号７５に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＦａｓ、Ｆａｓ外部ドメイン、または任意のそのＦａｓ断片は、ヒトＦａｓである。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４３．４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。さらに別の実施形態では、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７４に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の他の実施形態では、Ｆａｓ外部ドメインは、配列番号７６に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＦａｓ、Ｆａｓ外部ドメイン、または任意のそのＦａｓ断片は、ヒトＦａｓである。さらなる実施形態では、配列番号７２に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＦａｓ外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３タンパク質の全長細胞外部分、ＬＡＧ３タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＬＡＧ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＬＡＧ３の膜貫通ドメインの一部と共になったＬＡＧ３の細胞外部分タンパク質の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。例えば、一部の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３のＮ末端から約４２０アミノ酸、４１６アミノ酸、４１５アミノ酸、４１３アミノ酸、または４１０アミノ酸を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２２８６．５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
さらなる実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１５３に記載の核酸分子によってコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＬＡＧ３外部ドメインは、ＬＡＧ３のＮ末端から少なくとも４３０アミノ酸、４３５アミノ酸、４３８アミノ酸、４４０アミノ酸、４４５アミノ酸、または４５０アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１６１に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、配列番号１５３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＡＧ３は、配列番号１６２に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＬＡＧ３、ＬＡＧ３外部ドメイン、または任意のそのＬＡＧ３断片は、ヒトＬＡＧ３である。さらなる実施形態では、配列番号１５４に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＬＡＧ３外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＴＩＭ３外部ドメインを含む細胞外成分を含有する。ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３外部ドメインは、ＴＩＭ３タンパク質の全長細胞外部分、ＴＩＭ３タンパク質の全長成熟細胞外部分、ＴＩＭ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、およびＴＩＭ３の膜貫通ドメインの一部と共になったＴＩＭ３タンパク質の細胞外部分の結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２７８２．４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
さらなる実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１６７に記載の核酸分子によりコードされる。ある特定の他の実施形態では、ＴＩＭ３外部ドメインは、ＴＩＭ３のＮ末端から少なくとも１８０アミノ酸、１８５アミノ酸、１９０アミノ酸、１９５アミノ酸、または２００アミノ酸を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１７７に記載の核酸分子によりコードされる。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、配列番号１６７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
一部の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１６８に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＩＭ３は、配列番号１７８に記載のアミノ酸配列を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の融合タンパク質に使用されるＴＩＭ３、ＴＩＭ３外部ドメイン、または任意のそのＴＩＭ３断片は、ヒトＴＩＭ３である。さらなる実施形態では、配列番号１６８に記載のアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも１００％同一である配列を有するＴＩＭ３外部ドメインが提供される。
結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する任意のペプチドであり得る。結合ドメインの供給源は、ヒト、齧歯類、トリ、またはヒツジを含めた様々な種に由来する抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖに基づくグラバボディー（ｇｒａｂａｂｏｄｙ）、または可溶性ＶＨドメインまたはドメイン抗体の形態であり得る）を含む。追加的な結合ドメインの供給源は、ラクダ科の動物（ラクダ、ヒトコブラクダ、もしくはラマに由来する；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４１４巻：５２１頁、１９９７年；Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８４巻：３２７３頁、２００９年；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６頁、１９９３年およびＮｇｕｙｅｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７５巻：４１３頁、１９９８年）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁、１９９８年）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．、５４巻：３９頁、２００２年）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５巻：２０４０頁、２００８年およびＡｌｄｅｒら Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：３１９頁、２００８年）などの他の種に由来する抗体の可変領域を含む。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成し得る、すなわち、これらの機能的抗体は、重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６４巻：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、１２巻：５８０頁、２００６年；およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８３巻：３６３９頁、２００８年）。
本開示の従来のものではない結合ドメインの代替供給源は、ランダムなペプチドライブラリーをコードする配列、または、ｓｃＴＣＲ（例えば、Ｌａｋｅら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１巻：７４５頁、１９９９年；Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０６巻：５１頁、２００５年；米国特許第８，３６１，７９４号を参照されたい）、フィブリノーゲンドメイン（例えば、Ｗｅｉｓｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１３８８頁、１９８５年を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、米国特許第６，４２３，４９８号を参照されたい）、デザインされたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｂｉｎｚら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４８９頁、２００３年およびＢｉｎｚら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：５７５頁、２００４年）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）またはモノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ））（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３２６巻：１４７５頁、２００３年；Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌｅｃ．、１８巻：４３５頁、２００５年およびＨａｃｋｅｌら（２００８年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１２３８〜１２５２頁）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａら（１９９５年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２巻：６４０４〜６４０８頁；Ｍａｒｔｉｎら（２００２年）、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１巻：７１頁、２００２年およびＨｕａｎｇら（２００５年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１３巻：７５５頁、２００５年）、テトラトリコペプチド（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）リピートドメイン（Ｍａｉｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１１巻：４９７頁、２００３年およびＣｏｒｔａｊａｒｅｎａら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３巻：１６１頁、２００８年）、ロイシンリッチリピートドメイン（Ｓｔｕｍｐｐら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３２巻：４７１頁、２００３年）、リポカリンドメイン（例えば、ＷＯ２００６／０９５１６４、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６巻：１８９８頁、１９９９年およびＳｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６巻：８１９８頁、２００９年を参照されたい）、Ｖ様ドメイン（例えば、米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号を参照されたい）、Ｃ型レクチンドメイン（ＺｅｌｅｎｓｋｙおよびＧｒｅａｄｙ、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７２巻：６１７９頁、２００５年；Ｂｅａｖｉｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９巻：７５３頁、１９９２年およびＳａｔｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００巻：７７７９頁、２００３年）、ｍＡｂ２またはＦｃａｂ（商標）（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００７／０９８９３４号；同第ＷＯ２００６／０７２６２０号を参照されたい）、アルマジロリピートタンパク質（例えば、Ｍａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、２１巻：１０１５頁、２０１２年；ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２００９／０４０３３８号を参照されたい）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３７２巻：１７２頁、２００７年）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ノッチン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（Ｗｅｉｄｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｐｒｏｔｅｏ．、１０巻：１５５頁、２０１３年）などの代替的な非抗体足場のループ領域内の操作された多様なアミノ酸をコードする配列を含む（Ｎｏｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻：６０１頁、１９９５年；Ｎｏｒｄら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻：７７２頁、１９９７年；Ｎｏｒｄら、Ｅｕｒｏ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６８巻：４２６９頁、２００１年；Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：１２５７頁、２００５年；ＢｏｅｒｓｍａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２２巻：８４９頁、２０１１年）。
一部の実施形態では、結合ドメインは、Ｖα／βおよびＣα／β鎖（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）を含むまたは目的の標的（例えば、ペプチド−ＭＨＣ複合体またはペプチド−ＨＬＡ複合体）に特異的なＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ対を含む単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）である。
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＴＣＲ Ｖα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβのアミノ酸配列を有する分子の外部ドメインと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一の配列を含む、またはこの配列であり、各ＣＤＲは、目的の標的に特異的に結合するＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体からゼロの変化または最大で１つ、２つ、または３つの変化を含む。
ある特定の実施形態では、本開示の結合ドメインＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域は、公知のＴＣＲ（例えば、高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβに由来するものまたはそれに基づくものであり得、公知のＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα、またはＣβと比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の挿入、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の欠失、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組合せを含有する。挿入、欠失または置換は、各ＣＤＲがゼロの変化または最大で１つ、２つ、または３つの変化を含み、また、改変されたＶα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域を含有する結合ドメインがなおその標的に野生型と同様の親和性で特異的に結合するのであれば、アミノ末端またはカルボキシ末端またはこれらの領域の両末端を含めた、Ｖα領域、Ｖβ領域、Ｃα領域、またはＣβ領域内のどこにあってもよい。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して、約１０μＭから約５００μＭまでにわたる親和性を有する。さらなる実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に対して、約１０ｎＭから約２００ｐＭまでにわたる高親和性を有する。
ある特定の態様では、本開示による融合タンパク質は、標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分（例えば、リガンドまたは受容体）を有し、細胞外成分は、任意選択で、マルチマー形成ドメイン、リンカー、接合部アミノ酸、またはそれらの任意の組合せなどの、１つまたは複数の他の機能的な小成分またはドメインを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質は、結合ドメインに加えてまたは結合ドメインが由来する分子に由来する部分に加えて、スペーサーまたはマルチマー形成ドメインなどの追加的な細胞外領域をさらに含む。例えば、一部の態様では、マルチマー形成ドメインは、融合タンパク質の細胞外成分に含有されるまたはその一部である。例えば、マルチマー形成ドメインは、細胞外成分を変化させること（例えば、変異させること）によって作製することができる、またはマルチマー形成ドメインは、細胞外成分に１〜約５０アミノ酸残基を付加することによって作製することができる。マルチマー形成ドメインは、細胞外成分の結合ドメインと本開示の融合タンパク質の疎水性成分との間に位置し得る。ある特定の実施形態では、細胞表面上に発現した融合タンパク質は、細胞外成分内にマルチマー形成ドメインを含み、細胞膜に近位であり、疎水性成分から１〜５０アミノ酸の範囲内にある。例えば、融合タンパク質マルチマー形成ドメインは、融合タンパク質疎水性成分から３０アミノ酸、２５アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、１アミノ酸または０アミノ酸以内に位置する１つまたは複数のシステイン残基を含み得、１つの融合タンパク質からのそのような１つまたは複数のシステイン残基は、１つまたは複数の他の融合タンパク質と１つまたは複数のジスルフィド架橋を形成し得る。一部の実施形態では、追加的な細胞外部分は、融合タンパク質の膜貫通または刺激領域が由来するものと同じ分子に由来する。
さらなる実施形態では、２つまたはそれ超の融合タンパク質のマルチマー形成ドメイン間の相互作用は、融合タンパク質モノマーと比較して、シグナルトランスダクション（例えば、免疫細胞刺激または活性化）に実質的に寄与するまたはそれを効率的に促進する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質のマルチマー形成は、融合タンパク質モノマーと比較して、宿主細胞におけるシグナルトランスダクションを統計的に有意に促進する。さらなる実施形態では、宿主細胞におけるシグナルトランスダクションを促進または増強する融合タンパク質のマルチマー形成は、ジスルフィド架橋を介したものである。
例示的なマルチマーは、「ダイマー」であり、これは、互いと会合した２つの融合タンパク質などの２つの分子を含有する生物学的実体を指す。そのようなダイマーは、２つの会合した融合タンパク質が実質的に同様または同一のアミノ酸配列を有する場合には、「ホモダイマー」とみなされる。同様に、３つの実質的にまたは完全に同一の融合タンパク質のマルチマー形成は、「ホモトリマー」と呼ばれる。一部の実施形態では、マルチマー形成ドメインは、少なくとも１つのシステイン残基を含み、第１の融合タンパク質に由来するマルチマー形成ドメインのシステイン残基は、第２の融合タンパク質に由来するマルチマー形成ドメインのシステイン残基とジスルフィド架橋を形成し得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質ダイマーはジスルフィド架橋を介して形成される。他の実施形態では、融合タンパク質トリマーは、２つまたはそれ超のジスルフィド架橋を介して形成される。あるいは、ダイマー、ホモダイマー、トリマーまたはホモトリマーは、ジンクフィンガーモチーフまたはロイシンジッパーモチーフを介してマルチマー形成し得る。さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、複数のマルチマー形成ドメインを含み、これは、細胞外、細胞内またはその両方に位置し得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、疎水性成分から伸長した細胞外部分を含む。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、膜貫通ドメインに隣接する約５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、または最大で約２５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、膜貫通ドメインに隣接する９アミノ酸または１２アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８の細胞外部分は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む。さらに別の例示的な実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分（例えば、１〜５０アミノ酸にわたる）を含む。ある特定の実施形態では、マルチマー形成ドメインおよび疎水性成分は、異なるタンパク質に由来する。例えば、融合タンパク質の細胞外成分内に含有されるマルチマー形成ドメインは、ＣＤ１３７膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、または、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７の細胞外部分を含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、マルチマー形成ドメインは、グリコシル化部位をさらに含み得る。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、細胞外成分とマルチマー形成ドメインを連結する、または細胞外成分と疎水性成分を連結する、または疎水性成分と細胞内成分を連結するリンカーまたは接合部アミノ酸を含有し得る。一部の実施形態では、リンカーはＧｌｙｘＳｅｒｙであり、式中、ｘおよびｙは、独立に、１〜５の整数である。
本開示の融合タンパク質に含有される結合ドメインが特異的に結合する標的分子は、目的の細胞（「標的細胞」）上にまたはそれに付随して見いだされ得る。例示的な標的細胞は、免疫細胞、がん細胞、自己免疫疾患もしくは障害もしくは炎症性疾患もしくは障害に関連する細胞、および感染性生物体もしくは細胞（例えば、細菌、ウイルス、ウイルスに感染した細胞）、またはＭＨＣまたはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と複合体を形成した抗原を提示する任意の細胞を含む。哺乳動物寄生生物などの感染性生物体の細胞も標的細胞として意図されている。一部の実施形態では、標的は、免疫抑制リガンドである。一部の実施形態では、標的は、ＣＤ４７、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）、ＣＤ２００、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、またはＧＡＬ９から選択される。
細胞内成分
本開示の融合タンパク質に含有される細胞内成分は、機能的シグナルを細胞に伝達することができる活性化ドメインまたは共刺激ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを有する。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞応答を直接促進する１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進する。細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つまたはそれ超の受容体シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン、またはこれらの組合せを含み得る。様々なシグナル伝達分子（例えば、シグナルトランスダクション受容体）のいずれかに由来する活性化ドメイン、共刺激ドメイン、またはその両方を含む任意の細胞内成分を本開示の融合タンパク質に使用することができる。
本明細書で使用される場合、細胞表面受容体またはリガンドに由来する「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、完全な細胞内ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインを含む部分、またはその機能的（シグナル伝達）断片を含む。ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型または参照細胞内シグナル伝達ドメインと比較してシグナル伝達活性が増大した、変異した細胞内ドメインまたはその機能的（シグナル伝達）断片を含む。
「共刺激分子」は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞にシグナルを伝達してＴ細胞活性化を正に調節することができる受容体または細胞表面分子を指す（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。背景として、Ｔ細胞活性化および増殖には、Ｔ細胞抗原特異的受容体（ＴＣＲ）と共刺激シグナルの会合、最も典型的にはＣＤ２８とＣＤ８０およびＣＤ８６の結合を通じて媒介される２つのシグナルが必要である（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１５３１頁、１９９０年）。
本開示の融合タンパク質に有用な細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはそれらの任意の組合せに由来するものであり得る。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的断片は、一次シグナルを含まない。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含まない。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８を含む。ＣＤ２８シグナル伝達は、ＴＣＲを介して刺激されるＴ細胞の増殖を促進する（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２８は、膜貫通ドメインの近位にあるシステイン残基の結果としてジスルフィド連結ホモダイマーを形成する（Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４４巻：１２５〜１２９頁、２００６年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８タンパク質の全長細胞内部分、ＣＤ２８タンパク質の全長成熟細胞内部分、ＣＤ２８タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、およびＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその断片と共になったＣＤ２８タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。ＣＤ１３７は共刺激分子であり、ＣＤ１３７とそのリガンド（４−１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌ）の結合はＴ細胞活性化および増殖に関連する（Ｃｈｅｕｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１巻：２１５〜２２６頁、２００４年）。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７タンパク質の全長細胞内部分、ＣＤ１３７タンパク質の全長成熟細胞内部分、ＣＤ１３７タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、およびＣＤ１３７の膜貫通ドメインまたはその断片と共になったＣＤ１３７タンパク質の細胞内部分のシグナル伝達断片、またはそれらの任意の組合せを含む。
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメインを含む、または、１つまたは複数の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激因子、またはそれらの任意の組合せである。
一部の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００に特異的に結合するＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含む細胞外成分、ＣＤ２８の細胞内部分を含む細胞内成分、および細胞外成分と細胞内成分とを連結する疎水性成分を有する融合タンパク質を提供するが、ただし、融合タンパク質：：標的複合体は、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるものとする。
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質の細胞内成分は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）またはその両方を含む。例えば、一部の実施形態では、細胞内成分は、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、細胞内成分は、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞内成分は、２つの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）を含む。一部の実施形態では、細胞内成分は、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号１３に記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
疎水性成分
本開示の単鎖融合タンパク質に含有される疎水性部分により、本開示の融合タンパク質と細胞膜の会合が可能になり、その結果、融合タンパク質の一部が細胞外に位置し、一部が細胞内に位置する（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）。疎水性成分は、一般に、細胞膜リン脂質二重層内に配置される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の接合部アミノ酸が間に位置し、疎水性部分と細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。
ある特定の実施形態では、疎水性ドメインは、内在性膜タンパク質（例えば、受容体、表面抗原分類（ＣＤ）分子、酵素、輸送体、細胞接着分子など）に由来するものなどの膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、疎水性ドメインは、内在性膜タンパク質において見いだされるまたはそれに由来する膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、１つまたは複数のアミノ酸の付加、除去、または分子間相互作用を容易にする荷電または親水性残基などの少なくとも１つの異なるアミノ酸での置き換え、またはそれらの任意の組合せによって改変されている。したがって、「疎水性ドメイン」という用語は、疎水性を低下させ得る改変を有する膜貫通ドメインを含む。
一部の実施形態では、疎水性成分は、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＰＡ５、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）に由来する膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメインである。ある特定の他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＳＩＲＰα膜貫通ドメインである。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号６３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＣＤ２膜貫通ドメインである。さらに別の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＦａｓ膜貫通ドメインである。さらに別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＴＩＭ３膜貫通ドメインである。さらに別の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１６９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＴＩＭ３膜貫通ドメインである。さらに別の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＡＧ３膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号１５５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するＬＡＧ３膜貫通ドメインである。
核酸および宿主細胞
ある特定の態様では、本開示は、免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）であり得る本明細書に記載の融合タンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、目的の宿主細胞（例えば、造血前駆細胞、Ｔ細胞）への導入のために、適切なベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクター）に挿入することができる。
本明細書で使用される場合、「組換え」または「非天然」という用語は、少なくとも１つの遺伝学的変更を含む、または外因性核酸分子の導入により改変された生物体、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指し、そのような変更または改変は、遺伝子工学により導入される。遺伝学的変更は、例えば、タンパク質、融合タンパク質または酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊を含む。追加的な改変は、例えば、改変により遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域を含む。ある特定の実施形態では、被験体から得たＴ細胞などの細胞を、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を導入し、それによって細胞が融合タンパク質を発現することにより、非天然または組換え細胞（例えば、非天然または組換えＴ細胞）に転換することができる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、特定の型のＴ細胞などの細胞における発現を増強するまたは最大にするために、コドン最適化することができる（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９巻：１３５〜１４５頁、２００６年）。
例示的な一実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８）をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＣＤ２００Ｒ外部ドメインを含み、疎水性成分がＣＤ２００Ｒの膜貫通ドメインを含み、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、配列番号１に記載の核酸分子が提供される。
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ）をコードする核酸分子であって、疎水性成分がＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、本開示は、配列番号６に記載の核酸分子を提供する。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＣＤ２００Ｒの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＣＤ２００Ｒ細胞外ドメインは、９アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号７）または１２アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０）であり得る。
例示的な一実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃまたはｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、核酸分子は、配列番号１２または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を有する。
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ｔｍ ｉｃ ４１ＢＢｉｃまたはｈｕＣＤ２００Ｒ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ｔｍ ｉｃ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。一実施形態では、例えば、本開示の核酸は、配列番号９または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を有する。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１６に記載の核酸分子（ｈｕＳＩＲＰαｔｍ−ＣＤ２８）または配列番号１９に記載の核酸分子（ｈｕＳＩＲＰα−ＣＤ２８ｔｍ）を含む。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＳＩＲＰαの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＳＩＲＰα細胞外ドメインは、１２アミノ酸短縮されたものであり得る（例えば、ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号２０）。
例示的な一実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓｔｍ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。例えば、一実施形態では、本開示の核酸は、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列を有する。
別の例示的な実施形態では、本開示は、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８−４−１ＢＢ構築物（ｈｕＳＩＲＰα−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ｔｍ ｉｃ−４１ＢＢｉｃ）をコードする核酸分子であって、細胞内成分がＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子を提供する。一実施形態では、例えば、本開示の核酸は、配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を有する。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＰＤ−１−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号９７に記載の核酸分子（ｈｕＰＤ１−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＰＤ−１−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＰＤ−１の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、ＰＤ−１細胞外ドメインは、１２アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号９９）、１５アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０１）、または２１アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１０３）であり得る。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＣＤ２−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号６９に記載の核酸分子（ｈｕＣＤ２−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
他の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号８３に記載の核酸分子（ｈｕＦａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。
他の例示的な実施形態では、本開示は、Ｆａｓ−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子であって、細胞外成分がＦａｓの切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含む、核酸分子を提供する。例えば、Ｆａｓ細胞外ドメインは、７アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＦａｓ−７ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号８５）または１２アミノ酸短縮されたもの（例えば、ｈｕＦａｓ−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号８７）であり得る。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１７３に記載の核酸分子（ｈｕＴＩＭ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。細胞外成分がＴＩＭ３の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含むＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質も本開示の範囲内に含まれる。例えば、ＴＩＭ３細胞外ドメインは、１２アミノ酸短縮されたものであり得る（例えば、ｈｕＴＩＭ３−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１７５）。
他の例示的な実施形態では、本開示は、ＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物をコードする核酸分子を提供する。例えば、本開示は、配列番号１６３に記載の核酸分子（ｈｕＬＡＧ３−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。細胞外成分がＬＡＧ３の切断された細胞外ドメインおよびＣＤ２８の細胞外部分を含むＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質も本開示の範囲内に含まれる。例えば、ＬＡＧ３細胞外ドメインは、１２アミノ酸短縮されたものであり得る（例えば、ｈｕＬＡＧ３−１２ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、配列番号１５９）。
コアウイルスをコードするベクターは、本明細書では、「ウイルスベクター」と呼ばれる。ヒト遺伝子療法への適用のために同定されたものを含め、本開示の組成物と共に使用するのに適した多数の入手可能なウイルスベクターが存在する（ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．、２巻：１７７頁、２００１年を参照されたい）。適切なウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスに基づくベクター、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターなどを含み、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターを含む。ＨＩＶ−１由来ベクターはこのカテゴリーに属する。他の例は、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ−ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターを含む。キメラ抗原受容体導入遺伝子を含有するウイルス粒子を用いて哺乳動物宿主細胞に形質導入するための、レトロウイルスウイルスベクターおよびレンチウイルスウイルスベクターならびにパッケージング細胞の使用方法は当技術分野で公知であり、以前に、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、６巻：３２７９３０頁、２０１１年；Ｚｈａｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：４４１５頁、２００５年；Ｅｎｇｅｌｓら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１４巻：１１５５頁、２００３年；Ｆｒｅｃｈａら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、１８巻：１７４８頁、２０１０年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５０６巻：９７頁、２００９年に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系はまた、市販もされている。
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、融合タンパク質をコードする非内因性核酸配列または標的に特異的な融合タンパク質をコードする非内因性核酸配列を導入する。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、形質導入についてのマーカーをコードする核酸配列も含み得る。ウイルスベクター用の形質導入マーカーは当技術分野で公知であり、薬物耐性を付与することができる選択マーカー、または、フローサイトメトリーなどの方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは細胞表面タンパク質などの検出可能なマーカーを含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む形質導入についての遺伝子マーカー、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、または切断されたヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ；Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：１２５５頁、２０１１年を参照されたい）をさらに含む。ウイルスベクターゲノムが、別々の転写物として宿主細胞において発現される複数の核酸配列を含む場合、ウイルスベクターは、２つ（またはそれ超）の転写物の間に、バイシストロン性または多シストロン性の発現を可能にする追加的な配列も含み得る。ウイルスベクターに使用するそのような配列の例は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む。
例えばアデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含めた、ＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶを含めた、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクターを含めた他のベクターも、ポリヌクレオチド送達のために使用することができる（Ｋｒｉｓｋｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５巻：１５１７頁、１９９８年）。
遺伝子療法への使用のために最近開発された他のベクターも本開示の組成物および方法と共に使用することができる。そのようなベクターは、バキュロウイルスおよびα−ウイルスに由来するもの（Ｊｏｌｌｙ， Ｄ Ｊ．、１９９９年、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．、２０９〜４０頁、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ｔ．編、Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ）、またはプラスミドベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙまたは他のトランスポゾンベクターなど）を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターは、形質導入についての遺伝子マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｈｕＥＧＦＲｔ）をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、１つ超の融合タンパク質をコードし得る。例えば、ベクターは、２つの異なる融合タンパク質（例えば、ＰＤ−１外部ドメインを含む第１の融合タンパク質およびＴＩＭ３外部ドメインを含む第２の融合タンパク質）をコードし得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、抗原特異的ＴＣＲをさらに含み得る。一部の実施形態では、抗原特異的ＴＣＲは外因性である。一部の実施形態では、抗原特異的ＴＣＲは、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ制限抗原に特異的である。一部の実施形態では、抗原は、がん特異的抗原である。がん特異的抗原がＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む実施形態も本開示の範囲内に入る。さらに他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８であり得るリガンドをさらにコードする。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするベクターは、内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする。一部の特定の実施形態では、内因性受容体は、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）またはＣＤ２である。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を細胞表面上に発現することができる宿主細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を細胞表面上に発現することができる宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物に由来する初代細胞または細胞株を含めたＴ細胞である。Ｔ細胞は、哺乳動物から得る場合、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織または体液を含めた多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、濃縮または精製することができる。Ｔ細胞株は当技術分野で周知であり、その一部は、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１巻：２３０頁、２０００年に記載されている。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ α鎖およびβ鎖の内因性発現を欠くＴ細胞を使用する。そのようなＴ細胞は、ＴＣＲ α鎖およびβ鎖の内因性発現を天然に欠くものであってもよく、発現が遮断されるように改変されたもの（例えば、ＴＣＲ α鎖およびβ鎖を発現しないトランスジェニックマウス由来のＴ細胞もしくはＴＣＲ α鎖およびβ鎖の発現が阻害されるように操作された細胞）またはＴＣＲ α鎖、ＴＣＲ β鎖、または両方の遺伝子がノックアウトされるように改変されたものであってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞を、特定の抗原に特異的なＴＣＲを発現するように操作することができる。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルまたはエフェクターメモリーＴ細胞、γδ Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞などの機能的Ｔ細胞である。さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組合せに導入する。さらに別の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ４＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組合せに導入する。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。さらに他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。上述の実施形態のいずれかにおいて、Ｔ細胞は、操作された抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、外因性共刺激分子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸分子をさらに含有する。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主細胞は、機能的なナチュラルキラー細胞である。
本開示の融合タンパク質を発現するＴ細胞の増殖を促進する１つまたは複数の増殖因子サイトカインを、Ｔ細胞を拡大させるために使用する培養物に添加することができる。サイトカインは、ヒトまたは非ヒトであり得る。Ｔ細胞増殖を促進するために使用することができる例示的な増殖因子サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ１５などを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ制限抗原に特異的な抗原特異的高親和性ＴＣＲも発現するＣＤ４＋Ｔ細胞である（Ｓｏｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、６２巻：３５９〜３６９頁、２０１３年を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、がん抗原に特異的な組換えＴＣＲも発現する。一部の実施形態では、がん抗原は、ＷＴ１である。「ＷＴ１」は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフを含有し、Ｎ末端にプロリン／グルタミンリッチＤＮＡ結合ドメインを含有する転写因子であるウィルムス腫瘍１を指す。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の正常な発達において重要な役割を有し、ウィルムス腫瘍の患者の小さなサブセットにおいて変異している。ＷＴ１の高発現は、乳がん、卵巣がん、急性白血病、血管の新生物、黒色腫、結腸がん、肺がん、甲状腺がん、骨および軟部組織肉腫、ならびに食道がんを含めた様々ながんにおいて観察されている。ＷＴ１について選択的スプライシングが認められている。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、メソテリンに特異的な組換えＴＣＲも発現する。「メソテリン」（ＭＳＬＮ）は、２つの生成物、巨核球増強因子およびメソテリンに切断される前駆タンパク質をコードする遺伝子を指す。巨核球増強因子は、骨髄巨核球におけるコロニー形成を刺激することができるサイトカインとして機能する。メソテリンは、細胞接着タンパク質として機能し得るグリコシルホスファチジルイノシトール係留細胞表面タンパク質である。このタンパク質は、上皮中皮腫、卵巣がんにおいて、および特定の扁平上皮細胞癌において過剰発現する。選択的スプライシングにより、多数の転写物改変体が生じる。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、サイクリン−Ａ１に特異的な組換えＴＣＲも発現する。
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主Ｔ細胞は、ＣＡＲも発現する。
さらに他の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８であり得るリガンドをさらに含む。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらに発現する。一部の特定の実施形態では、内因性受容体は、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、またはＣＤ２である。
一部の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する宿主細胞は、１つ超の融合タンパク質を発現し得る。例えば、宿主細胞は、２つの異なる融合タンパク質（例えば、ＰＤ−１外部ドメインを含む第１の融合タンパク質およびＴＩＭ３外部ドメインを含む第２の融合タンパク質）を発現し得る。
使用
本開示に記載の融合タンパク質を発現する細胞を用いて処置することができる疾患は、がん、感染症（ウイルス感染、細菌感染、原生動物感染）、免疫疾患（例えば、自己免疫性）、または老化関連疾患（例えば、老化）を含む。養子免疫および遺伝子療法は、様々な型のがん（Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻：１２６頁、２００６年；Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０巻：１２４０頁、２００９年；Ｊｕｎｅ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻：１４６６頁、２００７年）および感染症（Ｋｉｔｃｈｅｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、４巻：３８２０８頁、２００９年；Ｒｏｓｓｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５巻：１４４４頁、２００７年；Ｚｈａｎｇら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．、６巻：ｅ１００１０１８頁、２０１０年；Ｌｕｏら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、８９巻：９０３頁、２０１１年）に対して有望な処置である。
固形腫瘍または白血病を含む、様々ながんは、本明細書で開示する組成物および方法に感受性（ａｍｅｎａｂｌｅ）である。処置することができる例示的な種類のがんは、乳房、前立腺および結腸の腺癌；肺のすべての型の気管支原性癌；骨髄性白血病；黒色腫；肝がん；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアス、管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、エンバク細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞および移行細胞）を含む。処置することができるさらなる種類のがんは、組織球性障害；悪性組織球症；白血病；ホジキン病；免疫増殖性小細胞（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ）：非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；栄養膜腫瘍を含む。
さらに、以下の種類のがんも処置に感受性であると考えられる：腺腫；胆管腫；コレステリン腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺がん；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝がん；汗腺腫；膵島細胞腫瘍；ライジッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫（ｌｅｉｍｙｏｍａ）；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫（ｍｙｏｍｍａ）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節神経腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫。処置することができる種類のがんは、被角血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌腫；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）；および子宮頸部異形成をも含む。
融合タンパク質Ｔ細胞療法に感受性である例示的なさまざまな過剰増殖性障害は、Ｂ細胞リンパ腫（様々な種類のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫など）、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞芽球化反応など）ならびに骨髄腫（多発性骨髄腫など）を含む、Ｂ細胞がんである。さらなるＢ細胞がんは、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦郭（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性の可能性のあるＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症および移植後リンパ増殖性障害を含む。
炎症性疾患および自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シドナム舞踏病、サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス病を含めた肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎（過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）／過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｇｉｉｔｉｓ）、ＡＮＣＡおよびリウマチ性血管炎を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器傷害症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、実質臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多発性内分泌腺症、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含めた精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（または多腺性内分泌疾患症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病およびシーハン症候群を含めた自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、寒冷グロブリン血症、肝炎に関連する寒冷グロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群および閉塞性血栓性血管炎を含む。
特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質を用いて被験体を処置する方法は、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、および慢性骨髄球性白血病を含む。
感染症は、感染因子に関連するものを含み、また、様々な細菌（例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア、および寄生生物（原生生物の任意の公知の寄生生物のメンバーを含む）のいずれかを含む。感染性ウイルスは、例えば、アデノウイルス、ブニヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）などの真核生物ウイルスを含む。ある特定の実施形態では、その抗原がプロセシングされ、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ分子に提示される細胞質ゾル病原体による感染を、本開示の融合タンパク質を用いて処置する。
本開示の融合タンパク質は、細胞に結合した形態で被験体に投与することができる（例えば、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）または他のＴ細胞系統の細胞）の遺伝子療法）。特定の実施形態では、被験体に投与される融合タンパク質を発現するＴ細胞系統の細胞は、同系細胞、同種異系細胞、または自己細胞である。
本開示の融合タンパク質を含む医薬組成物は、医療分野の当業者によって決定される処置（または防止）すべき疾患または状態に適切な方法で投与することができる。組成物の適切な用量、好適な投与の期間および頻度は、患者の状態、サイズ、疾患の種類および重症度、有効成分の特定の形態、ならびに投与方法のような因子により決定される。本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、本開示は、免疫細胞の活性を増大させる、免疫応答を増強または延長する、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する、免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する、がんまたは腫瘍を処置する、がん細胞の免疫抵抗性を阻害する、または感染を処置する方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する有効量の宿主細胞を投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態では、上述の方法のいずれかにおいて使用するための宿主細胞は、操作された抗原特異的ＴＣＲ、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＡＲ、共刺激分子、またはそれらの任意の組合せをさらに発現する。特定の実施形態では、本明細書で開示される融合タンパク質と組換え抗原特異的ＴＣＲを同時発現させることを含む、白血病を処置する方法が提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩ ＨＬＡ応答を誘導または増強する方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の融合タンパク質を発現する有効量のＣＤ４＋Ｔ細胞を投与することを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩ ＨＬＡ応答を誘導または増強において使用するための宿主細胞は、操作された抗原特異的ＴＣＲ、操作された抗原特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＡＲ、共刺激分子、またはそれらの任意の組合せをさらに発現する。
上述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、外因性ＩＬ−２の投与の非存在下で有効である。
さらに他の実施形態では、上述の方法のいずれかの被験体を、化学療法などの補助的療法を用いてさらに処置する。例示的な化学療法剤は、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフロルニチン；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＴＭ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン、カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
一部の実施形態では、補助的療法は、ワクチン、免疫抑制シグナルの阻害剤、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞傷害性薬剤、化学療法薬、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、免疫抑制シグナルの阻害剤は、抗体またはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、抗体またはｓｉＲＮＡは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＣＤ２４４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、またはそれらの任意の組合せに対して特異的である。
（実施例１）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質構築
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、図１Ａの模式図を使用して例示される。例示的な融合タンパク質は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインまたはその一部からなる免疫調節性融合タンパク質（ＩＦＰ）を含む（図１Ａ、構築物Ｉ〜Ｖ）。疎水性成分は、ＣＤ２００Ｒ（図１Ａ、構築物Ｉ）もしくはＣＤ２８（図１Ａ、構築物ＩＩ〜Ｖ）のいずれかの膜貫通ドメインまたはその部分からなってよい。一部の例示的なＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質では疎水性成分は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は、ＣＤ２８の細胞外部分、詳細には疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば図１Ａ構築物ＩＩＩ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ；および構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメインのすべてまたは部分を含んでよい。一部の実施形態では細胞外成分は、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む（図１Ａ、構築物Ｉ〜ＩＩＩ）。他の例では細胞外成分は、ＣＤ２００ＲのＮ末端からの最初の２３５アミノ酸（Ｎ連結グリコシル化部位を保存している）（例えば図１Ａ、構築物ＩＶ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）または最初の２２９アミノ酸（例えば図１Ａ、構築物Ｖ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）を含む。融合タンパク質構築物を調整することによって操作できる細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内のＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。追加的にＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、ＣＤ２００Ｒのその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする例示的な核酸分子は、次のエレメントを含む（５’から３’）：細胞外成分（ＣＤ２００Ｒ）−マルチマー形成ドメイン（ＣＤ２８システイン）−疎水性成分（ＣＤ２８膜貫通）−細胞内成分（ＣＤ２８細胞内）。一部の実施形態では、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号４７〜５１または１、６、７、１０、１２、１４または１５のいずれか１つとして記載する核酸分子を含む。
構築物をコードする核酸は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注したまたはＰＣＲによって所内で生成し、次いでｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に指向的にＴＯＰＯクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターｐＭＰ７１−ａｔｔＲに移入した。ある特定の実施形態では本開示のＩＦＰをコードする核酸分子は、ｐＭＰ７１−ａｔｔＲレトロウイルスベクターへのクローニングの前にコドン最適化した。
（実施例２）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物のトランスジェニック発現
マウスＣ５７ＢＬ／６ Ｆｒｉｅｎｄウイルス誘発赤白血病（ＦＢＬ）およびＴＣＲｇａｇトランスジェニックマウスに基づく播種性白血病についての前臨床マウスモデルを、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８キメラ受容体がＴ細胞機能を改善できるかどうかを決定するために使用した。
ＴＣＲトランスジェニックマウスをｇａｇエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を産生するために生成した（ＴＣＲｇａｇ）。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＴＣＲｇａｇトランスジェニックマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＦｒｉｅｎｄウイルスｇａｇエピトープに特異的なＴＣＲ導入遺伝子を発現する（Ｏｅｈｌｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６巻：２８６３〜２８７０頁、２００１年）。実施されたすべての動物研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＃２０１３−０１）で承認された。マウスＢ６ Ｆｒｉｅｎｄウイルス誘発赤白血病（ＦＢＬ）は、ｇａｇエピトープ（ペプチドＣＣＬＣＬＴＶＦＬ）をコードするＦ−ＭｕＬＶを発現する。
マウス遺伝子に基づくＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８キメラ構築物をｐＭＰ７１レトロウイルスベクターに挿入し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で刺激した初代マウス脾細胞を形質導入するために使用した。構築物は、実施例１に記載のとおり設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに発注したまたはＰＣＲによって所内で生成した。次いで構築物をｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に指向的にＴＯＰＯクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターｐＭＰ７１−ａｔｔＲに移入した。レトロウイルスパッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｍｏｒｉｔａら、２０００年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：１０６３〜１０６６頁、２０００年；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）をｅｆｆｅｃｔｅｎｅ形質導入試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してレトロウイルスベクターで形質導入した。ウイルス上清を２および３日目に回収し、次いでＴＣＲｇａｇＴ細胞を形質導入するために使用した。
トランスフェクションの１日前に、ＴＣＲｇａｇＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８および１００Ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ−２で刺激した。ＴＣＲｇａｇＴ細胞の形質導入を９０分間、１０００ｇでのスピンフェクション（ｓｐｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）によってＩＬ−２およびポリブレンの存在下で１２ウエルプレートで実施した。ＦＢＬ細胞を、Ｔ細胞形質導入と同様にポリブレンスピンフェクションでＣＤ２００で形質導入し、次に均一な集団を生成するために選別した。
形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ２００Ｒ抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターを対照として使用した。形質導入効率は４〜３６％の範囲であり、形質導入細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は構築物間で同様であった。
（実施例３）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物は、形質導入Ｔ細胞の増殖、蓄積およびエフェクター機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進する
実施例１および２に記載のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物をＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖、蓄積およびエフェクター機能を促進するそれらの能力について評価した。
エフェクター細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大
ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで以前記載の通り生成した（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）。照射抗原提示脾細胞（５×１０６個）、照射ＦＢＬ（３×１０６個）およびＴＣＲｇａｇｔｇ細胞（１０６個）をＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）と共に培養培地（非必須アミノ酸、２μＭグルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳおよび５０μＭ ２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐａｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を補充したＩＭＤＭ）１０ｍＬ中で培養した。Ｔ細胞を毎週再刺激し、最後の刺激の５〜７日後にフローサイトメトリーによって評価した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞増殖アッセイ
ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２に記載のとおり形質導入した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖を評価するために、ＴＣＲｇａｇＴ細胞を製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で染色した。ＣＴＶ−標識Ｔｇ Ｔ細胞（１０５個）およびＧＦＰ対照Ｔ細胞をＣＤ２００−ＦＢＬまたはＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞の数を用量調整（ｔｉｔｒａｔｅ）して刺激した。３日後、ＴＣＲｇａｇＴ細胞のＣＴＶ希釈物をフローサイトメトリーによって評価した。
ＣＤ２００−ＦＢＬ細胞（上）またはＣＤ２００＋ＦＢＬ（下）の数を用量調整した刺激後のＴＣＲｇａｇＴ細胞の数を示すフローサイトメトリー結果は図２Ａに示されている。検査した５個のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物の内４個は、ＧＦＰ対照形質導入Ｔ細胞（赤線）と比較して、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（青線）に応答してＴＣＲｇａｇＴ細胞の増殖を劇的に改善した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞蓄積アッセイ
増殖の増強も形質導入細胞の蓄積の増加をもたらすかどうかを決定するために、照射ＣＤ２００＋ＦＢＬでの複数サイクルの刺激による総ＴＣＲｇａｇ集団における形質導入細胞の割合を測定した。
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＣＤ２００Ｒ−３ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを含むいくつかの構築物は、形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進した（図２Ｂ）。これらの構築物の内、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓは複数回の刺激で形質導入Ｔ細胞における最も高い増加を示し、３回の刺激で３倍を超える拡大を生じる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞濃縮アッセイ
形質導入したおよび形質導入していないＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団を、再刺激が形質導入ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＩＦＰ＋Ｔ細胞の集団を濃縮するかどうかを決定するためにＣＤ２００＋またはＣＤ２００−照射ＦＢＬ細胞で再刺激した。照射ＣＤ２００＋腫瘍細胞での反復刺激は、野生型Ｔ細胞と比較してＩＦＰで形質導入した細胞を濃縮し、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＩＲＰに対するリガンドを発現している標的の認識が応答を増強することを実証している（図２Ｃ）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ共局在アッセイ
Ｔ細胞活性化の際に免疫学的シナプス（ＩＳ）においてＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＩＦＰが同族リガンドと共局在するかどうかを決定するために形質導入Ｔ細胞を顕微鏡によって画像化した。シナプスで濃縮される細胞膜内の脂質を染色するためにＣＴｘＢを使用した（図２Ｄ、パネルＩ）。ＦＢＬ細胞によって発現されるＣＤ２００（図２Ｄ、パネルＩＩ）またはＴ細胞によって発現されるＣＤ２００Ｒ（図２Ｄ、パネルＩＩＩ）を標的化する標識抗体をＩＳとの関連する分子の位置を視覚化するために使用した。ＣＤ２００リガンドおよびＣＤ２００ＲはＩＳ内に共局在し（図２Ｄ、パネルＩＶ）、構築物が免疫学的シナプスによって受け入れられるように適切なサイズにされていることを実証している。
ＣＦＳＥに基づく細胞毒性アッセイ
ＣＤ２８シグナル伝達の増加もエフェクター機能を促進する（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８融合タンパク質形質導入Ｔ細胞を標的腫瘍細胞の殺滅の増加について検査した。ＦＢＬおよび対照ＥＬ４腫瘍を１０分間、室温で２．５μＭ（ＣＦＳＥｈｉ）または０．２５μＭ（ＣＦＳＥｌｏ）ＣＦＳＥと共にＰＢＳ中でそれぞれインキュベートした。過剰の色素は腫瘍細胞を血清含有培地中で洗浄することによって除去した。ＥＬ４とＦＢＬ腫瘍細胞との１：１混合物を用量調整した数のＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８またはＧＦＰベクターで形質導入したＴＣＲｇａｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大エフェクターＴ細胞と共に４時間、９６ウエル丸底プレート、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。特異的ＦＢＬ溶解をウエルに残存している総ＣＦＳＥ陽性細胞（ＦＢＬ＋ＥＬ４）の％ＣＦＳＥｈｉ（ＦＢＬ）についてのフローサイトメトリー解析によって決定した。
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物で形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、空ベクターで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞と比較してＦＢＬ腫瘍をｉｎ ｖｉｔｒｏで溶解する能力の増強を示した（図２Ｅ、２Ｇ）。標的腫瘍細胞をＥＬ４細胞（ＣＴＶ＋）、ＣＤ２００＋ＦＢＬ（ＣＦＳＥｈｉ）および非特異的ＥＬ４（ＣＦＳＥｌｏ）対照標的の１：１：１混合物を生成するために、さまざまな希釈の蛍光色素ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）またはＣＦＳＥで標識した（図２Ｆ）。追加的に対照ＧＦＰ形質導入ＴＣＲｇａｇＴ細胞はＣＤ２００−ＦＢＬおよびＣＤ２００＋ＦＢＬを等効率で溶解した（図２Ｇ）。対照的にＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較してＣＤ２００＋ＦＢＬ細胞の殺滅の増加を示し、検査した最低のＥ：Ｔ比において４０％を超えるＣＤ２００＋ＦＢＬを溶解した（図２Ｇ）。
まとめるとこれらのデータは、ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物が腫瘍細胞刺激に応答して形質導入Ｔ細胞の蓄積および溶解活性を増加させるように機能することを示している。
（実施例４）
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴ細胞は、ＦＢＬの認識に応答してｉｎ ｖｉｖｏで増強した蓄積を示す
Ｂ６マウスに以前記載（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）のとおり生ＦＢＬ白血病４×１０６個を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＦＢＬを５日間播種した後、マウスはエフェクターＴ細胞の移入の少なくとも６時間前に１８０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（Ｃｙ、「Ｃｙｔｏｘａｎ」）をｉ．ｐ．で受けた。生存研究について、刺激１〜３回をｉｎ ｖｉｔｒｏで先に受けたＴＣＲｇａｇＴ細胞１０５個を腫瘍保有マウスに移入した。短期間増殖および蓄積を評価するために、融合タンパク質を形質導入した、およびＧＦＰ対照を形質導入したＴ細胞各２×１０６個を腫瘍保有マウスに同時注射し、マウスは解析のために８日後に安楽死させた。マウスは、腫瘍負荷について定期的にモニターし、２４〜４８時間以内の死亡が予測される腫瘍進行のエビデンスが生じた場合は安楽死させた。
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ融合タンパク質形質導入Ｔ細胞がＦＢＬの認識に応答してｉｎ ｖｉｖｏでさらに大きな増殖および蓄積を示すかどうかを評価するために、融合タンパク質形質導入細胞と対照細胞との混合集団を腫瘍保有マウスに移入し、ｅｘ ｖｉｖｏ解析による細胞の比を移入８日後に比較した（図３Ａ）。導入遺伝子マーカーの使用により、注射した比と比較して脾臓およびリンパ節の両方において対照細胞の１．２〜１．４倍を超える比で形質導入Ｔ細胞が検出された（図３Ｂ）。形質導入ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ発現の低減を腫瘍保有マウスへの移入３日後に示した。これは、エフェクターＴ細胞表現型を示唆している（図３Ｃ）。１５日目までに形質導入および対照Ｔ細胞は、疲弊マーカーの欠如を含む同様の表現型を示した（図３Ｄ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの知見と同様にＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓを発現するＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍刺激に応答して増加した蓄積を示した。さらにそれらは、腫瘍保有マウスへの移入後少なくとも３日間についてエフェクターＴ細胞表現型と一致するタンパク質発現パターンを示した。
（実施例５）
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８＋Ｔ細胞での養子免疫療法は、播種性白血病の治療においてさらに大きな活性を示す
ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８で形質導入したＴ細胞での養子免疫療法は、播種性白血病の前臨床マウスモデルにおける治療活性の増加を媒介した。
マウスにＣＤ２００＋ＦＢＬ白血病の致死用量を注射し、５日後、Ｃｙ処置マウスのコホートはＴ細胞１０５個での追加的治療を受けた（図４Ａ）。ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物によって媒介される有効性へのＣＤ２８システイン結合の寄与を図１Ａに示すＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＧＦＰ対照構築物で形質導入したＴ細胞を比較することによって評価した。ＩＬ−２をＴ細胞の活性を促進するためにマウスのコホートに１０日間、追加的治療試薬として投与した（Ｓｔｒｏｍｎｅｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２０巻：３７２２〜３４頁、２０１０年）。注射前にＴ細胞をフローサイトメトリーによって種々の表面タンパク質について評価した。形質導入および対照ＴＣＲｇａｇＴ細胞は、同様の表現型を示した。これは、形質導入が注射前の細胞の表現型を変化させなかったことを示している（図４Ｂ）。
ＩＬ−２注射を受けたマウスの小コホートにおいてＴ細胞は生存を改善したが、異なる群のＴ細胞を受けたマウスの生存において有意な差異は検出できなかった（図４Ｃ）。しかしＩＬ−２注射を受けなかったマウスのコホートでは、免疫学的シナプス内に適合するように適切なサイズにしたＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物で形質導入したＴ細胞を受けたマウスの生存に顕著な改善があった（図４Ｄ）。Ｔ細胞を受けなかった、ＧＦＰ対照ベクターで形質導入したＴ細胞または最も大きな外部ドメイン（ＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８Ｃｙｓ ＩＦＰ）で形質導入したＴ細胞を受けたマウスの大部分は、３０日を超えて生存しなかった（図４Ｃおよび４Ｄ、それぞれ黒実線、破線およびオレンジ線）。対照的にＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８ｔｍ＋Ｔ細胞を受けたマウスの７１％およびＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞を受けたマウスの８３％は治療後１００日間より長く生存した（図４Ｃおよび４Ｄ、それぞれ緑および赤線）。これらのデータは、免疫学的シナプスにおける膜間の距離と同様の距離にまたがるＣＤ２００Ｒ−ＣＤ２８構築物でのＴ細胞の形質導入が、外因性ＩＬ−２の注射へのＴ細胞免疫療法の依存を克服する十分な共刺激を提供することを示唆している。さらに、外因性ＩＬ−２の注射を受けなかったマウスにおいて検査したＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物とＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ構築物との間では増殖および蓄積において差異があったが、両方のＩＦＰとも、他の進行性白血病からの臨床転帰を有意に改善するようにＴ細胞免疫療法を有効に増強した。
（実施例６）
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋Ｔ細胞は、内因性組織に自己反応性を生じず、ｉｎ ｖｉｖｏで正常組織の浸潤を示さない
ＴＣＲｇａｇＴ細胞の形質導入が内因性組織との自己反応性を生じるように活性化の閾値を十分に低下させるかどうかを決定するために、自己免疫性毒性をアルブミンプロモーターの調節下で肝細胞において自己抗原としてＦＢＬ ｇａｇ腫瘍Ａｇを発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて評価した（図５Ａ）。ＴＣＲｇａｇエフェクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、１０６個を播種性白血病を有するＣｙｔｏｘａｎ処置Ａｌｂ：Ｇａｇマウスに移入した。移入３および７日後に肝臓損傷を肝臓酵素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルを定量によって評価した。マウスにおける対照またはＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋ＴＣＲｇａｇ細胞での養子療法は、移入３または７日後にＡＳＴまたはＡＬＴの血清レベルに影響を与えなかった。これは、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓが検出可能な自己免疫性肝臓損傷をＡｌｂ：Ｇａｇマウスにおいて誘導しないことを示している（図５Ｂ）。
ＩＦＰで形質導入したＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して正常組織の浸潤の増加を示さない。マウスを移入７日後に安楽死させ、肝臓切片をＴ細胞浸潤を定量するためにＴ細胞マーカーＣＤ３に対する抗体で染色した。肝臓組織におけるＴ細胞の限定的な存在が観察され、ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ＋または対照ＴＣＲｇａｇのレシピエント間で有意な差異はなかった。これは、ＩＦＰ発現の結果としてリンパ球細胞浸潤が増加しなかったことを示している（図５Ｃ）。
（実施例７）
４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進する
共刺激受容体４−１ＢＢは活性化Ｔ細胞で上方制御され、Ｔ細胞生存およびサイトカイン産生を促進する（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３巻：２２７〜２４２頁、２０１３年）。ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを有するまたは有さない４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞増殖および蓄積の増加を誘導できるかどうかを評価するために、４−１ＢＢ（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−４−１ＢＢ）を使用してまたは４−１ＢＢをＣＤ２８（ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ）と組み合わせて、実施例２に記載の方法を使用してＩＦＰを生成した（図６Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した。
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、４−１ＢＢ構築物で形質導入したＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複数ラウンドの刺激で蓄積した（図６Ｂ）。これらのデータは、４−１ＢＢ ＩＦＰもＴ細胞の増殖および生存を促進することを示している。
ＣＤ２００Ｒ−４−１ＢＢで形質導入したＴＣＲｇａｇＴ細胞は、実施例３に記載のＣＦＳＥベース細胞毒性アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＢＬ腫瘍を溶解する能力の増強を示した（図６Ｃ）。ＣＤ２００Ｒ−４１ＢＢ−形質導入Ｔ細胞も生存を促進する（図６Ｄ）。
（実施例８）
ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８の共発現は、ＷＴ１特異的ＴＣＲ初代Ｔ細胞において機能を増強する
ヒトＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物（配列番号１）をＩＦＰ発現がヒト初代Ｔ細胞のＴ細胞機能を増強するかどうかを決定するために生成した。構築物を、Ｐ２Ａエレメントを有する遺伝子を連結することによってＨＬＡ−Ａ２制限ＷＴ１１２６特異的ＴＣＲ「Ｃ４」のベータおよびアルファ鎖と組み合わせた（図７Ａ）。第２のＰ２Ａ配列との遺伝子組換えを妨げるために第１のＰ２Ａ配列をコドン最適化した。レンチウイルスを生成するために、２９３Ｔ／１７細胞（細胞３×１０６個／プレート）をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｐＲＲＬＳＩＮならびにパッケージングベクターｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２−ＧおよびｐＲＳＶ−ＲＥＶ中のヒト構築物で形質導入した。培養培地をトランスフェクション後１日目に交換し、ウイルス含有上清を２および３日目に回収し、将来の使用のためにアリコートを凍結した。
内因性ＴＣＲを欠如しているジャーカットヒトＴ細胞亜系統（ｓｕｂｌｉｎｅ）をＩＦＰおよびＴＣＲの発現を検査するために使用した。これらのジャーカットＴ細胞を２ｍｌのレトロウイルス上清、１０００ｇ、９０分間、３２℃での細胞２×１０６個のスピンフェクションによって形質導入した。ジャーカットヒトＴ細胞株の３種の遺伝子構築物での形質導入は、ＩＦＰの高発現およびＴＣＲのみで形質導入したＴ細胞と同様のＭＦＩでＴＣＲの発現を生じた（図７Ａ）。
初代ヒトＴ細胞を形質導入するために、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡ−Ａ２＋ドナーから回収した。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓを使用して精製し、ヒトＴ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２で刺激した。刺激４時間後にＴ細胞をジャーカットＴ細胞について上に記載したのと同様に形質導入した。Ｔ細胞は以前記載（Ｈｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１０巻：４０〜５２頁、２００６年）のとおり急速拡大プロトコール（ＲＥＰ）で１０〜１４日ごとに再刺激した。
ヒト細胞株Ｔ２をＡＰＣとして使用した。これはＴＡＰが欠損しており、そのため内因性ペプチドを提示できないが、低レベルＭＨＣＩ発現により、外因性に負荷されたペプチドの提示は可能だからである。Ｔ２細胞によるＣＤ２００の発現をフローサイトメトリーによって評価した（図７Ｂ）。Ｔ２細胞は、低レベルの内因性ＣＤ２００発現を示した（図７Ｂ）。
形質導入Ｔ細胞をＷＴ１１２６−パルス化Ｔ２細胞で刺激した。標的細胞での低レベルのＣＤ２００発現にもかかわらず、ＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞は、Ｃ４ ＴＣＲのみで形質導入したＴ細胞と比較して、増殖の増強を示した（図７Ｃ）。加えて、刺激されたＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８−形質導入Ｔ細胞（すなわち、ＩＦＰ＋Ｔ細胞）は、ＣＤ２００ｄｉｍ腫瘍細胞に曝露した場合に対照Ｔ細胞と比較して増加したレベルのＩＦＮγおよびＩＬ−２を産生した（図７Ｄ）。
全体としてこれらの結果は、ヒトＣＤ２００Ｒｔｍ−ＣＤ２８構築物ならびにＷＴ１１２６特異的ＴＣＲのベータおよびアルファ鎖を発現するように形質導入した初代Ｔ細胞が、ＴＣＲ構築物のみで形質導入したＴ細胞と比較して増殖の増強およびサイトカイン産生の増加を示したことを示している。
（実施例９）
ＳＩＲＰα−ＣＤ２８融合タンパク質構築物は形質導入Ｔ細胞の蓄積をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図８Ａ）。疎水性成分は、ＳＩＲＰαもしくはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＳＩＲＰα−ＣＤ２８融合タンパク質では疎水性成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には疎水性成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよい。一部の実施形態では細胞外成分は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン全体を含む。他の例では細胞外成分は、ＳＩＲＰαのＮ末端からの最初の３６７アミノ酸（例えばＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）、最初の３６４アミノ酸（例えばＳＩＲＰα−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）または最初の３５０（ＳＩＲＰα−２３ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）アミノ酸を含む。細胞外成分のサイズは、免疫学的シナプスに侵入しｃＳＭＡＣ内でＴＣＲと共局在して強い共刺激シグナルを送達する融合タンパク質の能力に影響を与える場合がある。一部の例では細胞外成分は、細胞外成分のサイズを変更できる切断型ＳＩＲＰαを含む。例えば融合タンパク質の細胞外ドメインの追加的細胞外アミノ酸（例えば追加的９または１２アミノ酸）を検討するために、ＳＩＲＰα−６ａａｓ−ＣＤ２８は天然Ｎ連結グリコシル化部位を保存しているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。別の例ではＳＩＲＰα−２３ａａｓ−ＣＤ２８は、ＳＩＲＰα細胞外ドメインのステム領域全体を欠如しているＳＩＲＰαの切断された一部を有する。追加的にＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物は、ＳＩＲＰαのその標的への結合によって開始されるシグナルをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
実施例２に記載の方法を使用して、ＳＩＲＰα細胞外成分を使用するＩＦＰを生成した（図８Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した。ＦＢＬ細胞をＣＤ４７またはｍＣｈｅｒｒｙでポリブレンスピンフェクションを用いて、Ｔ細胞形質導入と同様に形質導入し、次に均一な集団を生成するために選別した。
ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、ＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複数ラウンドの刺激で蓄積した（図８Ｂ）。これらのデータは、ＳＩＲＰα−ＣＤ２８ ＩＦＰもＴ細胞の増殖および生存を促進することを示唆している。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖を評価するために、ＣＴＶ希釈増殖アッセイを実施例２に記載のとおり実施した。ＣＤ２００Ｒ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで観察されたとおり、Ｔ細胞−腫瘍細胞シナプス距離を維持するように操作されたＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して増殖の増強を示した（図８Ｃ）。加えて、ＣＤ４７＋腫瘍細胞はＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞との共培養の３日後に効率的に殺滅されたが、対照Ｔ細胞または細胞内シグナル伝達ドメインを欠如しているＳＩＲＰα構築物で形質導入したＴ細胞ではされなかった（図８Ｄ）。ＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞の溶解能力をさらに評価するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイをＣＤ４７＋ＦＢＬの殺滅を定量するために使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４７＋ＦＢＬ合計１０５個を２４ウエルプレートでＳＩＲＰα−ＣＤ２８構築物で形質導入したヒトＴ細胞を用量調整して共培養した。プレートを細胞培養インキュベーター内でＩｎｃｕＣｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）において７０時間インキュベートした。赤色シグナルの消失によって決定される腫瘍細胞の殺滅をモニターするために画像を１時間ごとに保存した。検査した最も低いエフェクター対標的比においてさえＳＩＲＰα−ＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４７＋腫瘍細胞を殺滅した（０．４：１、図８Ｅ）。
（実施例１０）
ＰＤ−１−ＣＤ２８融合タンパク質構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を促進する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図９Ａ）。膜貫通成分は、ＰＤ−１もしくはＣＤ２８のいずれかの膜貫通ドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＰＤ１−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分は鎖間ダイマー形成を促進するためにＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えば、ＰＤ１−ＣＤ２８Ｃｙｓ、ＰＤ１−９ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＰＤ１−２１ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＰＤ−１の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、リガンド結合した受容体の免疫学的シナプスへの接近を促進するために細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えばマウス構築物において−９ａａ、ヒト構築物において−１２ａａまたは−１５ａａ；ＰＤ−１のステム領域を欠如している、−２１ａａ）。追加的にＰＤ１−ＣＤ２８構築物は、ＰＤ１のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
ＰＤ−１細胞外成分を含むＩＦＰは、実施例２に記載の方法を使用して生成した（図９Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した。
マウスＰＤ１−ＣＤ２８ ＩＦＰを構築物Ｉ〜ＩＶおよびＶＩＩ（図９Ａ）を使用して生成した。ＰＤ１−ＣＤ２８＋Ｔ細胞を内因的にＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現するＦＢＬ細胞でＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（産生されたサイトカインを保持するため）の存在下で再刺激した。５時間後、細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットで処置し、エフェクターサイトカイン、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを細胞内で染色した。５個のＰＤ１−ＣＤ２８構築物のそれぞれでの形質導入は、対照Ｔ細胞と比較して細胞内サイトカインの産生を増強した（図９Ｂ）。
ヒトＰＤ１−ＣＤ２８ ＩＦＰを構築物Ｉ〜ＩＩＩおよびＶ〜ＶＩＩを使用して生成した（図９Ａ）。ＰＤ１−ＣＤ２８ ＩＦＰおよびＣ４ ＴＣＲを含有するベクターを上に記載のとおり生成した。ジャーカットＴ細胞を上に記載のとおり形質導入した。ＴＣＲおよびＰＤ１−１２ａａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓまたはＰＤ１−１５ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓで形質導入したＴ細胞は、両方のタンパク質の高い形質導入効率および発現を示した（図１０）。
（実施例１１）
Ｆａｓ−ＣＤ２８融合タンパク質構築物はｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入Ｔ細胞における蓄積を促進し機能を増強する
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、Ｆａｓの細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１１Ａ）。膜貫通成分は、ＦａｓもしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＦａｓ−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＦａｓ−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＦａｓ−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、Ｆａｓの細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、受容体−リガンド相互作用の際に細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（−９ａａ）。追加的にＦａｓ−ＣＤ２８構築物は、Ｆａｓのその標的への結合によって開始されるシグナルをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
Ｆａｓ細胞外成分を含むＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１１Ａ）。ＴＣＲｇａｇＴ細胞を実施例２のとおり形質導入し、ＴＣＲｇａｇエフェクター細胞を実施例３のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した。
Ｆａｓ−ＣＤ２８ ＩＦＰの発現が形質導入細胞の蓄積の増加を生じるかどうかを決定するために、総ＴＣＲｇａｇ集団における混合集団からの形質導入細胞の割合を実施例３に記載のとおり照射ＦＢＬでの複数サイクルの刺激にわたって測定した。すべての構築物は、対照Ｔ細胞と比較して形質導入Ｔ細胞の蓄積を促進した（図１１Ｂ）。付加的にＦａｓ−ＣＤ２８構築物の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複数回の刺激でＴ細胞の生存および拡大を促進したが、全長（ＦＬ）Ｆａｓはしなかった（図１１Ｃ）。
（実施例１２）
ＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質構築物
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１２Ａ）。膜貫通成分は、ＬＡＧ３もしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＬＡＧ３−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＬＡＧ３−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＬＡＧ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＬＡＧ３の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、受容体−リガンド相互作用の際に細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えば−９ａａ）。追加的にＬＡＧ３−ＣＤ２８構築物は、ＬＡＧ３のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正の（例えば共刺激）シグナルに転換する能力を有する。
ＬＡＧ３細胞外成分を使用するＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１２Ａ）。Ｔ細胞を記載のとおりＬＡＧ３−ｅＧＦＰ構築物で形質導入した。形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＬＡＧ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１２Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみをコードするベクターを対照として使用した。すべての構築物はＬＡＧ３の発現を示した（図１２Ｂ）。
（実施例１３）
ＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質構築物
本明細書に記載の例示的な融合タンパク質は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインまたはその一部およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインからなるＩＦＰも含む（図１３Ａ）。膜貫通成分は、ＴＩＭ３もしくはＣＤ２８のいずれかのドメインまたはその一部からなってよい。一部の例示的なＴＩＭ３−ＣＤ２８融合タンパク質では膜貫通成分はＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、細胞外成分はＣＤ２８の細胞外部分、具体的には膜貫通成分に隣接する細胞外システイン残基をさらに含む（例えばＴＩＭ３−ＣＤ２８ＣｙｓおよびＴＩＭ３−９ａａｓ−ＣＤ２８Ｃｙｓ）。細胞外成分は、ＴＩＭ３の細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでよく、細胞間の短い空間距離を維持するために短縮されてよい（例えば−９ａａ）。追加的にＴＩＭ３−ＣＤ２８構築物は、ＴＩＭ３のその標的への結合由来の典型的には阻害シグナルであるものをＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインによって生成される正のシグナルに転換する能力を有する。
ＴＩＭ３細胞外成分を使用する新規ＩＦＰを実施例２に記載の方法を使用して生成した（図１３Ａ）。Ｔ細胞を記載のとおりＧＦＰ−ＴＩＭ３構築物で形質導入した。形質導入の５日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＴＩＭ３抗体染色およびフローサイトメトリーによって構築物発現について解析した（図１３Ｂ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみをコードするベクターを対照として使用した。大部分の構築物はＴＩＭ３の同様の発現を示した（図１３Ｂ）。
本発明の具体的な実施形態は例示され、記載される一方で、上に記載の種々の実施形態をさらなる実施形態を提供するために組み合わせることができ、種々の変更を本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができることは容易に理解される。
米国仮特許出願第６２／１２８，９７９号を含むがそれに限定されない、本明細書で言及され、または出願データシートに示された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要である場合、実施形態の態様を修正することができる。
上記の詳細な説明に照らして実施形態についてこれらおよび他の変更を行うことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではないが、すべての可能な実施形態、加えてそのような特許請求の範囲により権利が与えられる同等物のすべての範囲を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示に限定されない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質と前記標的の特異的な結合によって形成される複合体（融合タンパク質：：標的複合体）の細胞外部分が、（ｉ）最大でおよそ免疫学的シナプスの２つの細胞膜間の距離、（ｉｉ）最大で、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と前記ＴＣＲが特異的に結合したＭＨＣ−ペプチド複合体との間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ、（ｉｉｉ）最大で、結合ドメインを含む天然分子とその同族結合パートナーとの間の複合体の細胞外部分がまたがる距離とほぼ同じであるかまたは実質的に同じ；（ｉｉｉ）約４０ｎｍ未満もしくは最大で約４０ｎｍ、約２５ｎｍ未満もしくは最大で約２５ｎｍ、約２０ｎｍ未満もしくは最大で約２０ｎｍ、約１５ｎｍ未満もしくは最大で約１５ｎｍ、または約１４ｎｍ未満もしくは最大で約１４ｎｍ；または（ｉｖ）それらの任意の組合せのサイズである、またはその距離にまたがる、融合タンパク質。
（項目２）
前記融合タンパク質：：標的複合体が、超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）に局在する、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記融合タンパク質：：標的複合体が、中心領域超分子活性化クラスター（ｃＳＭＡＣ）に局在する、項目１または２に記載の融合タンパク質。
（項目４）
前記ＳＭＡＣが、抗原：：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体と会合したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の幅を有する、項目２または３に記載の融合タンパク質。
（項目５）
前記細胞外成分が負のシグナルに関連し、前記細胞内成分が正のシグナルに関連する、項目１から４までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目６）
（ａ）標的に特異的に結合する結合ドメインで構成される細胞外成分、（ｂ）細胞内シグナル伝達ドメインで構成される細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分とを連結する疎水性成分を含む融合タンパク質であって、
前記結合ドメインが、阻害分子結合ドメインであるかまたは阻害分子結合ドメインに対して少なくとも９５％同一性を有し、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインであるかまたは共刺激分子もしくは刺激分子結合ドメインに対して少なくとも９５％同一性を含み、
前記阻害分子が、Ｂ７−ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーではないか、ＣＴＬＡ４ではないか、ＰＤ１ではないか、Ｂ７に結合しないか、糖タンパク質であるか、またはそれらの任意の組合せである、
融合タンパク質。
（項目７）
抗原に特異的なＴＣＲまたはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞において前記融合タンパク質を発現させることにより、前記Ｔ細胞と実質的に同じであるが前記融合タンパク質を含有しない細胞と比較して、前記抗原との結合に応答して、かつ／もしくは被験体への投与後に、前記Ｔ細胞による、生存、拡大、細胞傷害性、サイトカイン分泌、および／もしくは多数回の刺激への応答の少なくとも約１．５倍、２倍、または３倍の増大をもたらし、かつ／または、前記細胞が投与される被験体の生存時間、無病生存期間、もしくは１つもしくは複数の疾患症状の改善の少なくとも約１．５倍、２倍、もしくは３倍の増大をもたらす、項目１から６までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目８）
前記融合タンパク質が、Ｔ細胞において発現させると、前記Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲまたはＣＡＲと共局在することができる、項目１から７までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目９）
前記結合ドメインおよび／または前記阻害分子が、ＣＤ２００またはＣＤ４７に特異的に結合する、項目６から８までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１０）
前記結合ドメインが、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＴＩＭ３、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５に由来するものであり、かつ／または、前記阻害分子が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＴＩＭ３、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５である、項目６から９までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１１）
前記阻害分子が、ＣＤ２００Ｒである、またはそれを含む、項目６から９までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１２）
前記阻害分子が、ＳＩＲＰαである、またはそれを含む、項目６から９までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１３）
前記結合ドメインが、抗体結合断片、受容体外部ドメイン、サイトカイン、またはリガンドである、項目１から１２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１４）
前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ａ２ａＲ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、またはＬＰＡ５の細胞外部分を含む、項目１から１３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１５）
前記細胞外成分が、追加的な細胞外部分をさらに含み、前記追加的な細胞外部分が、任意選択で、前記結合ドメインの供給源分子とは別個の分子の細胞外部分に由来するもしくはそれと同一性を共有する、または前記結合ドメインを含有しない、項目１から１４までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目１６）
前記細胞外成分が、前記疎水性成分に由来する細胞外部分をさらに含む、または前記疎水性成分もしくはその一部を含有する、項目１から１５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインおよび／またはスペーサーを含む、項目１５または１６に記載の融合タンパク質。
（項目１８）
前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含む、または、前記結合ドメインが、ＣＤ２００ＲのＣＤ２００結合部分もしくはその結合性改変体を含む、項目１から１７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１９）
前記細胞外成分が、ＳＩＲＰαの細胞外部分を含む、または、前記結合ドメインが、ＳＩＲＰαのＣＤ４７結合部分もしくはその結合性改変体を含む、項目１から１７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２０）
前記細胞外成分または前記追加的な細胞外部分が、マルチマー形成ドメインを含む、項目１から１９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
前記マルチマー形成ドメインがシステイン残基を含む、項目２０に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
前記マルチマー形成ドメインが、前記疎水性成分から約２〜約１５アミノ酸内にシステイン残基を含有するように改変された細胞外成分を含む、項目２０に記載の融合タンパク質。
（項目２３）
前記疎水性成分が、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭ、ＬＰＡ５、またはＺａｐ７０の膜貫通ドメインを含む、項目１から２２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２４）
前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、項目１から２３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２５）
前記疎水性成分が、４−１ＢＢの膜貫通ドメインを含む、項目１から２３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２６）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１から２５までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目２７）
前記共刺激分子が、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、またはＩＣＯＳを含む、項目２６に記載の融合タンパク質。
（項目２８）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２の細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、項目１から２７までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目２９）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）の共刺激ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、項目１から２８までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３０）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）またはＣＤ２８の共刺激ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、項目１から２９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３１）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８の共刺激ドメインを含む、項目１から３０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３２）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の共刺激ドメインを含む、項目１から３１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３３）
前記標的が、免疫抑制リガンドである、項目１から３２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３４）
前記標的が、ＣＤ４７、ＣＤ５８、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）、ＣＤ２００、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＧＡＬ９から選択される、項目１から３２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目３５）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８または４１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１から３４までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目３６）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３７）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２００アミノ酸を含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３８）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２２５アミノ酸〜少なくとも約２３５アミノ酸を含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目３９）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２３４アミノ酸を含む、項目３５に記載の融合タンパク質。
（項目４０）
前記ＣＤ２００ＲがヒトＣＤ２００Ｒである、項目３５から３９までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目４１）
前記細胞内成分が、第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目３５から４０までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目４２）
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目４１に記載の融合タンパク質。
（項目４３）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目３５から４２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目４４）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目４３に記載の融合タンパク質。
（項目４５）
細胞内シグナル伝達成分がＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有せず、かつ／または、Ｔ細胞に一次シグナルを送達することができるシグナル伝達ドメインを含有せず、かつ／または、天然にＴ細胞に一次シグナルを送達することができる分子に由来するシグナル伝達ドメインを含有しない、項目１から４４までのいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目４６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４８）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目４９）
前記細胞外成分が、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインをさらに含む、項目４１に記載の融合タンパク質。
（項目５０）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５１）
前記細胞外成分が、配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列をさらに含む、項目５０に記載の融合タンパク質。
（項目５２）
前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項目５１に記載の融合タンパク質。
（項目５３）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目５４）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む、項目５３に記載の融合タンパク質。
（項目５５）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２００アミノ酸を含む、項目５３に記載の融合タンパク質。
（項目５６）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも約２２５アミノ酸〜少なくとも約２３５アミノ酸を含む、項目５３に記載の融合タンパク質。
（項目５７）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目５３から５６までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目５８）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目５７に記載の融合タンパク質。
（項目５９）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６０）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン全体を含む、項目５９に記載の融合タンパク質。
（項目６１）
前記ＣＤ２００Ｒの細胞外部分が、ＣＤ２００ＲのＮ末端から少なくとも２３０アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目５９に記載の融合タンパク質。
（項目６２）
前記細胞外成分が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）膜貫通ドメインから伸長したＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分を含む、項目５９から６１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目６３）
前記ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞外部分が、システイン残基を含む、項目６２に記載の融合タンパク質。
（項目６４）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６５）
前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項目６４に記載の融合タンパク質。
（項目６６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６７）
（ａ）前記細胞外成分が、ＳＩＲＰαの細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目６８）
前記ＳＩＲＰαの細胞外部分が、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン全体を含む、項目６７に記載の融合タンパク質。
（項目６９）
前記ＳＩＲＰαの細胞外部分が、ＳＩＲＰαのＮ末端から少なくとも３６１アミノ酸を含む、項目６７に記載の融合タンパク質。
（項目７０）
前記細胞内成分が、第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目６７から６９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７１）
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目７０に記載の融合タンパク質。
（項目７２）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目６７から７１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目７３）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目７２に記載の融合タンパク質。
（項目７４）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号１８に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７５）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号１７に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号２１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号１３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目７８）
前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列をさらに含む、項目７０に記載の融合タンパク質。
（項目７９）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８０）
前記ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分が、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外ドメイン全体を含む、項目７９に記載の融合タンパク質。
（項目８１）
前記ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分が、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）のＮ末端から少なくとも１００アミノ酸である、細胞外ドメインの一部を含む、項目７９に記載の融合タンパク質。
（項目８２）
前記ＣＤ２７９（ＰＤ−１）の細胞外部分が、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）のＮ末端から少なくとも１４９アミノ酸である、細胞外ドメインの一部を含む、項目７９に記載の融合タンパク質。
（項目８３）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目７９から８２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目８４）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目８３に記載の融合タンパク質。
（項目８５）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号８９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号９１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号９５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８８）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目８９）
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外ドメイン全体を含む、項目８８に記載の融合タンパク質。
（項目９０）
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）のＮ末端から少なくとも１７５アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目８８に記載の融合タンパク質。
（項目９１）
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）のＮ末端から少なくとも１７３アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目８８に記載の融合タンパク質。
（項目９２）
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）のＮ末端から少なくとも１６６アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目８８に記載の融合タンパク質。
（項目９３）
前記ＣＤ９５（Ｆａｓ）の細胞外部分が、ＣＤ９５（Ｆａｓ）のＮ末端から少なくとも１６１アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目８８に記載の融合タンパク質。
（項目９４）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目８８から９３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目９５）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目９４に記載の融合タンパク質。
（項目９６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７３に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９８）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目９９）
（ａ）前記細胞外成分が、ＣＤ２の細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１００）
前記ＣＤ２の細胞外部分が、ＣＤ２の細胞外ドメイン全体を含む、項目９９に記載の融合タンパク質。
（項目１０１）
前記ＣＤ２の細胞外部分が、ＣＤ２のＮ末端から少なくとも１７５アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目９９に記載の融合タンパク質。
（項目１０２）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目９９から１０１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１０３）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目１０２に記載の融合タンパク質。
（項目１０４）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号６１に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号９に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号５に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１０５）
（ａ）前記細胞外成分が、ＴＩＭ３の細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１０６）
前記ＴＩＭ３の細胞外部分が、ＴＩＭ３の細胞外ドメイン全体を含む、項目１０５に記載の融合タンパク質。
（項目１０７）
前記ＴＩＭ３の細胞外部分が、ＴＩＭ３のＮ末端から少なくとも１８０アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目１０５に記載の融合タンパク質。
（項目１０８）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＣＤ２８の細胞外部分を含む、項目１０５から１０７までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１０９）
前記ＣＤ２８の細胞外部分がシステイン残基を含む、項目１０８に記載の融合タンパク質。
（項目１１０）
（ａ）前記細胞外成分が、ＬＡＧ３の細胞外部分を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み、（ｃ）前記細胞内成分が、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１１１）
前記ＬＡＧ３の細胞外部分が、ＬＡＧ３の細胞外ドメイン全体を含む、項目１１０に記載の融合タンパク質。
（項目１１２）
前記ＬＡＧ３の細胞外部分が、ＬＡＧ３のＮ末端から少なくとも４１０アミノ酸である、細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む、項目１１０に記載の融合タンパク質。
（項目１１３）
前記細胞外成分が、ＣＤ２８膜貫通ドメインから伸長したＬＡＧ３の細胞外部分を含む、項目１１０から１１２までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
（項目１１４）
前記ＣＤ２８の細胞外部分が、システイン残基を含む、項目１１３に記載の融合タンパク質。
（項目１１５）
前記細胞外成分が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１１６）
前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有する第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、項目１１５に記載の融合タンパク質。
（項目１１７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１１８）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１１９）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２０）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２１）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する結合ドメインおよび配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２２）
前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列をさらに含む、項目１２１に記載の融合タンパク質。
（項目１２３）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号９０に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２４）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号９２に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２５）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号９６に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２６）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７２に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２７）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７４に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２８）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号７６に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１２９）
（ａ）前記細胞外成分が、配列番号６２に記載のアミノ酸配列および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有するマルチマー形成ドメインを含み、（ｂ）前記疎水性成分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含み、（ｃ）前記細胞内成分が、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の融合タンパク質。
（項目１３０）
項目１から１２９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
（項目１３１）
項目１３０に記載の核酸分子を含むベクター。
（項目１３２）
ウイルスベクターである、項目１３１に記載のベクター。
（項目１３３）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、項目１３２に記載のベクター。
（項目１３４）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、項目１３３に記載のベクター。
（項目１３５）
抗原特異的ＴＣＲをさらにコードする、項目１３１から１３４までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目１３６）
前記ＴＣＲが、宿主細胞に対して外因性である、項目１３５に記載のベクター。
（項目１３７）
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、項目１３５または１３６に記載のベクター。
（項目１３８）
前記抗原が、がん特異的抗原である、項目１３５から１３７までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目１３９）
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、項目１３８に記載のベクター。
（項目１４０）
リガンドをさらにコードする、項目１３１から１３９までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目１４１）
前記リガンドが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８である、項目１４０に記載のベクター。
（項目１４２）
内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする、項目１３１から１４１までのいずれか一項に記載のベクター。
（項目１４３）
前記内因性受容体が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、もしくはＣＤ２を含む、または、ＴＣＲもしくはその一部である、項目１４２に記載のベクター。
（項目１４４）
項目１から１２９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む宿主細胞。
（項目１４５）
項目１から１２９までのいずれか一項に記載の少なくとも２つの異なる融合タンパク質を含む宿主細胞。
（項目１４６）
項目７９に記載の融合タンパク質；および
項目１０５に記載の融合タンパク質
を含む、項目１４５に記載の宿主細胞。
（項目１４７）
項目１３０に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
（項目１４８）
項目１３１から１４３までのいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１４９）
免疫系細胞である、項目１４４から１４８までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５０）
前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、項目１４９に記載の宿主細胞。
（項目１５１）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、項目１５０に記載の宿主細胞。
（項目１５２）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、項目１５０に記載の宿主細胞。
（項目１５３）
任意選択で抗原特異的ＴＣＲである抗原受容体をさらに含む、項目１４４から１５２までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５４）
前記抗原特異的ＴＣＲが、前記細胞または前記宿主に対して外因性である、項目１５３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５５）
前記ＴＣＲが、抗原：：ＨＬＡ複合体に高親和性で結合する、項目１５３または１５４に記載の宿主細胞。
（項目１５６）
前記高親和性結合のＫａが、１０７Ｍ−１に等しいかまたはそれよりも大きい、項目１５５に記載の宿主細胞。
（項目１５７）
前記ＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ制限抗原に特異的である、項目１５３から１５６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５８）
前記抗原が、がん特異的抗原である、項目１５３から１５６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１５９）
前記がん特異的抗原が、ＷＴ−１、メソテリン、またはサイクリン−Ａ１を含む、項目１５８に記載の宿主細胞。
（項目１６０）
前記抗原が、ウイルス抗原である、項目１５３から１５６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１６１）
前記抗原受容体が、キメラ抗原受容体である、項目１５３に記載の宿主細胞。
（項目１６２）
前記キメラ抗原受容体が、細胞外抗原結合ドメイン、およびＴ細胞に一次シグナルを送達することができる細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに任意選択で共刺激ドメインを含む、項目１６１に記載の宿主細胞。
（項目１６３）
リガンドをさらにコードする、項目１４４から１６２までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１６４）
前記リガンドが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＤ５８である、項目１６３に記載の宿主細胞。
（項目１６５）
内因性受容体の発現を低下させるためのｓｉＲＮＡをさらにコードする、項目１４４から１６４までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
（項目１６６）
前記内因性受容体が、ＣＤ２００Ｒ、ＳＩＲＰα、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）またはＣＤ２を含む、項目１６５に記載の宿主細胞。
（項目１６７）
被験体において疾患を処置する方法であって、項目１から１２９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１６８）
被験体において疾患を処置する方法であって、項目１３１から１４３までのいずれか一項に記載のベクターを前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１６９）
被験体において疾患を処置する方法であって、項目１４４から１６６までのいずれか一項に記載の宿主細胞を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１７０）
前記疾患が、ウイルス感染、細菌感染、がん、および自己免疫疾患からなる群より選択される、項目１６７から１６９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
前記被験体が、ヒトである、項目１６７から１７０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７２）
がんの処置において使用するための、項目１から１２９までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
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