ES2929570T3 - Células B para administración in vivo de agentes terapéuticos - Google Patents

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Abstract

La presente descripción se refiere a células B modificadas genéticamente, incluidas células de memoria, diferenciadas en plasmablastos o células plasmáticas útiles para la expresión in vivo a largo plazo de un transgén, como un anticuerpo específico u otra proteína terapéutica. También se describen métodos para producir las células y métodos de tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células B para administración in vivo de agentes terapéuticos
Antecedentes
Campo técnico
La presente descripción se refiere al uso de células B para la administración in vivo a largo plazo de un agente terapéutico, como un anticuerpo o proteína específica de antígeno (p. ej., una enzima).
Descripción de la técnica relacionada
Después de abandonar la médula ósea, una célula B actúa como una célula presentadora de antígenos (APC) e internaliza antígenos. El antígeno es absorbido por la célula B a través de endocitosis mediada por receptor y procesado. El antígeno se procesa en péptidos antigénicos, se carga en moléculas MHC II y se presenta en la superficie extracelular de las células B a las células auxiliares T CD4+. Estas células T se unen a la molécula MHC II/antígeno y provocan la activación de la célula B. Después de la estimulación por una célula T, la célula B activada comienza a diferenciarse en células más especializadas. Las células B del centro germinal se pueden diferenciar en células B de memoria de larga duración o células plasmáticas. Además, la estimulación inmune secundaria puede dar lugar a que las células B de memoria den lugar a células plasmáticas adicionales. La formación de células plasmáticas a partir de células B de memoria o no memoria está precedida por la formación de plasmablastos precursores que finalmente se diferencian en células plasmáticas, que producen grandes volúmenes de anticuerpos (véase, p. ej,, Trends Immunol. 2009 junio; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5: 231-242). Los plasmablastos secretan más anticuerpos que las células B, pero menos que las células plasmáticas. Se dividen rápidamente y continúan internalizando antígenos y presentando antígenos a las células T. Los plasmablastos tienen la capacidad de migrar a sitios de producción de quimioquinas (p. ej., en la médula ósea) en donde se pueden diferenciar en células plasmáticas de larga vida. En última instancia, un plasmablasto puede permanecer como plasmablasto durante varios días y luego morir o diferenciarse irrevocablemente en una célula plasmática completamente diferenciada y madura. Específicamente, los plasmablastos que se pueden alojar en tejidos que contienen nichos de supervivencia de células plasmáticas (p. ej., en la médula ósea) son capaces de desplazar las células plasmáticas residentes para convertirse en células plasmáticas de larga vida, que pueden continuar secretando altos niveles de proteínas durante años.
Los métodos actuales de terapia celular (p. ej., transferencia adoptiva de células madre) son estrategias prometedoras para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos; sin embargo, sigue existiendo en la técnica la necesidad de un tratamiento a largo plazo para muchas enfermedades y trastornos crónicos. Si bien los métodos in vitro para la diferenciación y transducción de células B de memoria se describieron en una solicitud anterior, el documento WO 2014/152832, la presente descripción proporciona composiciones de células B diferenciadas para la expresión in vivo a largo plazo de un transgén y métodos para producir las composiciones de células B y uso en aplicaciones profilácticas y terapéuticas. La presente descripción proporciona estas y otras ventajas como se describe en la descripción detallada.
Resumen de la invención
Un aspecto de la presente invención proporciona un método para producir una composición de células B modificadas que comprende (a) aislar células pan-B, células B de memoria o células B de memoria con cambio de clase a partir de una muestra, obteniendo así una población de células B aisladas, (b) cultivar la población de células B aisladas in vitro con CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 y un agente de entrecruzamiento de CD40L, obteniendo así una población expandida de células B, (c) transfectar la población de células B expandida con un transgén, y (d) diferenciar la población de células B expandida in vitro con uno o más factores activadores de células B, obteniendo así una composición de células B modificada. En una realización, la etapa de transfección comprende además enriquecer la población de células B expandidas usando un marcador seleccionable. En una realización adicional, el marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en una proteína marcadora fluorescente, un factor de resistencia a fármacos y un marcador de superficie.
En una realización, la población de células B aisladas es CD20+, CD27+ y CD138-. En una realización, la población de células B aisladas es CD20-, CD38- y CD138-. En una realización, la muestra es sangre completa o células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En una realización, la etapa de aislamiento comprende 1) deplecionar las células CD3+ y CD56+ y 2) enriquecer las células CD27+.
En otra realización, el CD40L es sCD40L-his. En una realización, uno o más factores activadores de células B de la etapa de cultivo comprenden además CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10. En una realización, las células alimentadoras están ausentes de la etapa de cultivo.
En una realización, la población de células B expandidas es migratoria, en donde las células de la población de células B expandidas migran hacia CXCL12. En una realización, al menos el 20 % de las células de la población de células B expandidas son migratorias.
En otra realización, uno o más factores activadores de células B de la etapa de diferenciación comprenden CD40L, CpG, IFN-a, IFN-5, IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15.
En una realización, la transfección comprende electroporación, lipofección, realizar cell squeezing o transducción viral. En una realización adicional, la transducción viral comprende un vector retroviral. En una realización, el vector retroviral es un vector lentiviral.
En otra realización, la transfección comprende un vector no viral. En una realización adicional, el vector no viral se selecciona del grupo que consiste en un transposón, una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción, una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada, un minicírculo, un replicón de ADN, un replicón de ARN, un cromosoma artificial, un plásmido, un plásmido mini-intrónico, un nanoplásmido, un cósmido y un bacteriófago. En una realización, el vector no viral es un transposón. En otra realización, el vector no viral es un minicírculo, un mini-plásmido intrónico o un nanoplásmido.
En una realización, el transgén codifica un anticuerpo específico de antígeno, o un fragmento de unión a antígeno de este, una proteína de fusión o una proteína terapéutica. En otra realización, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en un receptor de superficie celular, una proteína secretada, una molécula de señalización, un fragmento antigénico, una enzima, un factor de coagulación y una molécula de adhesión. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-VIH, un anticuerpo anti-ARN o un anticuerpo que se une a una proteína implicada en la regulación inmune. En una realización, las células de la composición de células B modificadas son CD20-, CD38+ y CD138+. En una realización, las células de la composición de células B modificadas son CD20-, CD38+ y CD138-.
También se describe una composición de células B modificadas producida de acuerdo con el método descrito anteriormente. En una realización, la mayoría de las células de la composición sobreviven durante 10 o más días después de la administración in vivo. En otra realización, una mayoría de las células de la composición sobreviven durante 30 o más días después de la administración in vivo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de líneas que muestra la expansión de las células B en cultivo medida por recuento celular automatizado. Las células B se expandieron usando una combinación de IL-2, IL-10, CpG y CD40L. Las células se pueden expandir aún más en cultivo si se hacen pases hasta alcanzar una densidad celular de 5 x 106 células/ml.
La figura 2 es una serie de diagramas de puntos de citometría de flujo que muestran la diferenciación de las células B en el Día 0, el Día 6 y el Día 9 de cultivo in vitro usando un sistema de cultivo de tres etapas diseñado para producir células B activadas CD20-, CD38+. CD20 se muestra en el eje y, y CD38 se muestra en el eje x.
La figura 3 es una serie de imágenes del Imaging System In Vivo® (IVIS®) que muestran la cantidad relativa y la ubicación de las células inyectadas en ratones antes de la inyección (Figura 3A) y a los 3, 11,21,41 y 81 días después de la inyección (Figuras 3B-3F, respectivamente). Los ratones de control recibieron células fijas, un grupo de ratones recibió células pan-B (CD19+) que se activaron mediante un sistema de cultivo in vitro, y el tercer grupo de ratones recibió células generadas a partir de células B de memoria que se activaron usando el sistema de cultivo in vitro en tres etapas. Las células se tiñeron con un colorante fluorescente de infrarrojo cercano, DiR, antes de la inyección, y las imágenes muestran la señal fluorescente resultante.
La Figura 4 es un gráfico de líneas que muestra el injerto y la persistencia de células B primarias humanas en ratones NSG representados en la Figura 3. Datos de ratones de control que recibieron células fijas y de ratones inyectados con plasmablastos derivados de células B de memoria y células pan-B (CD19+).
La figura 5A es un gráfico de puntos de citometría de flujo que muestra células B de memoria de control (no transducidas).
La Figura 5B es un diagrama de puntos de citometría de flujo que muestra células B de memoria transducidas con vectores lentivirales que codifican GFP.
La figura 6 es un gráfico de barras que muestra la producción de IDUA por células B evaluada mediante ensayo fluorimétrico. Los linfocitos B se modificaron para expresar IDUA de forma estable usando el sistema de transposón Bella Durmiente. Para un control negativo, las células se modificaron para expresar GFP. Los niveles de IDUA se midieron en medios de cultivo de tejidos el día 10 de cultivo usando un ensayo enzimático. Según los resultados de múltiples experimentos, se encontró que las células B modificadas de manera estable producían un promedio de 0,09 pMol de IDUA/célula/hora.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la producción de células B transducidas con VRC01 (VRC01) según lo determinado mediante un ELISA de unión de gp120. Después de 10 días en cultivo, las células B diferenciadas produjeron un promedio de 1,47 pg VRC01/célula/día. VRC01 no se detectó en las células B de control.
La Figura 8 es una serie de diagramas de puntos de citometría de flujo que muestran la transfección de células B de memoria que usa el Sistema 4D-Nucleofactor™ (Lonza). Las células de control se sometieron a electroporación con un vector de transposón vacío (Figura 8A). La Figura 8B muestra células que se sometieron a electroporación con un transposón que albergaba GFP en ausencia de transposasa, y la Figura 8C muestra células que se sometieron a electroporación con un transposón que albergaba GFP junto con la transposasa SB100x.
La Figura 9 es una serie de diagramas de puntos de citometría de flujo que muestran la diferenciación de células pan B de memoria (CD27+) en un sistema de cultivo que contiene IL-21. Se muestran las muestras de los días 0, 3, 6 y 9 de cultivo in vitro de arriba a abajo. A la izquierda de cada gráfico resultante de la expresión de CD20 (eje y) frente a CD38 (eje x) se muestra la ventana de selección de dispersión frontal y lateral para linfocitos.
La Figura 10 muestra dos diagramas de puntos de citometría de flujo para la expresión de CD20 (eje y) y CD38 (eje x) por células B de memoria con cambio de clase (panel superior) y células pan B de memoria (CD27+) (panel inferior) después de la diferenciación in vitro en un sistema de cultivo que contiene IL-21.
La Figura 11 muestra dos histogramas de citometría de flujo para la expresión de CD138 (eje x) después de la diferenciación de células B de memoria con cambio de clase (panel superior) y de células pan B de memoria (CD27+) (panel inferior) en un sistema de cultivo que contiene IL-21.
La Figura 12 es un gráfico de líneas que muestra la proliferación celular usando dos condiciones de cultivo celular. El cultivo A utiliza CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10 y el cultivo B utiliza CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21.
La Figura 13 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de IL-15 e IL-21 por separado y en combinación sobre la proliferación de células pan-B in vitro.
La figura 14 es un gráfico lineal que muestra la proliferación de células pan-B durante 10 días en cultivo con CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21.
La figura 15 es un gráfico de barras (panel superior) que muestra la migración de células B hacia un quimioatractante, CXCL12. El panel inferior es un diagrama de flujo del ensayo.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la utilización de células B de memoria, en lugar de células B vírgenes, como población celular de partida y el sistema descrito en la presente memoria para activación, diferenciación y expansión da como resultado una composición celular que demuestra una mejora de la supervivencia in vivo. Además, se descubrieron los procesos para la expansión o proliferación de células B vírgenes y de memoria in vitro en ausencia de células alimentadoras o auxiliares. Los métodos de expansión de células B descritos en la presente memoria permiten la fabricación a gran escala de composiciones de células B. Las composiciones de células B descritas en la presente memoria son útiles para la administración y la expresión in vivo de agentes terapéuticos, que incluyen, p. ej., anticuerpos específicos de antígeno y otras proteínas. En particular, las composiciones de células B descritas en la presente memoria son útiles para la administración y expresión in vivo de agentes terapéuticos. La presente descripción se refiere en general a métodos de cultivo y producción de células B in vitro en condiciones que permitan diferenciar las células B en plasmablastos y células plasmáticas antes de la administración in vivo, para provocar la producción de proteínas terapéuticas a partir de estas células, y/o para lograr un enriquecimiento y número suficiente de células que producen proteínas terapéuticas.
Como se usa en la presente memoria, las frases "supervivencia a largo plazo in vivo " y "supervivencia a largo plazo" se refieren a la supervivencia de las células de una composición de células B descrita en la presente memoria durante 10 o más días después de la administración en un sujeto. La supervivencia a largo plazo se puede medir en días, semanas o incluso años. En una realización, una mayoría de las células de una composición de células B sobreviven in vivo durante 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o más días después de la administración. En una realización, una mayoría de las células de una composición de células B sobreviven in vivo durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 o más semanas después de la administración. En otra realización, las células de una composición de células B sobreviven in vivo durante 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más años. Además, aunque las células de una composición de células B descritas en la presente memoria pueden sobrevivir in vivo durante 10 o más días, se entiende que una mayoría de las células de una composición de células B sobreviven in vivo durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más días después de la administración. Por consiguiente, se contempla que las composiciones de células B descritas en la presente memoria son útiles para métodos de tratamiento a corto plazo (p. ej., 4 días) y a largo plazo (p. ej., 30 días o más).
Aislamiento de células B
Las células B usadas en los métodos descritos en la presente memoria son células pan B aisladas, células B de memoria, plasmablastos y/o células plasmáticas. En una realización, las células B aisladas son células B de memoria. En otra realización, las células B aisladas son células B vírgenes. En una realización, las células B aisladas son células pan B. Sin embargo, un experto habitual en la técnica apreciará fácilmente que los vectores y métodos de la descripción se puedan aplicar a otros tipos de células.
Las células plasmáticas diferenciadas terminalmente no expresan marcadores comunes de células pan-B, como CD20, y expresan relativamente pocos antígenos de superficie. Algunas células plasmáticas diferenciadas terminalmente tampoco expresan CD19. Las células plasmáticas expresan CD38, CD78, CD138 y el receptor de interleuquina-6 (IL-6R) y carecen de expresión de CD45, y estos marcadores se pueden usar, p. ej., por citometría de flujo, para identificar células plasmáticas. CD27 también es un buen marcador para las células plasmáticas, ya que las células B vírgenes son CD27-, las células B de memoria son CD27+ y las células plasmáticas son CD27++. Los subconjuntos de células B de memoria también pueden expresar IgG, IgM e IgD de superficie, mientras que las células plasmáticas no expresan estos marcadores en la superficie celular. CD38 y CD138 se expresan en niveles elevados en las células plasmáticas (Véase Wikipedia, The Free Encyclopedia., "Plasma cell" Page Versión ID: 404969441; Fecha de la última revisión: 30 de diciembre de 2010 09:54 UTC, consultado el 4 de enero de 2011; Véase también: Jourdan y cols. Blood. 10 de diciembre 2009; 114 (25): 5173-81; Trends Immunol. 2009 junio; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5: 231-242; Nature Med. 2010, 16: 123-129; Neuberger, M. S.; Honjo, T.; Alt, Frederick W. (2004). Molecular biology of B cells. Amsterdam: Elsevier, págs. 189-191; Bertil Glader; Greer, John G.; John Foerster; Rodgers, George G.; Paraskevas, Frixos (2008). Wintrobe’s Clinical Hematology, 2 vol. Set. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins. pag. 347; Walport, Mark; Murphy, Kenneth; Janeway, Charles; Travers, Paul J. (2008). Janeway’s immunobiology. Nueva York: Garland Science, págs. 387-388; Rawstron AC (mayo 2006). "Immunophenotyping of plasma cells". Curr Protoc Cytom).
“Quiescente”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un estado celular en donde la célula no está proliferando activamente.
"Activado", como se usa en la presente memoria, se refiere a un estado celular en donde la célula prolifera activamente y/o produce citoquinas en respuesta a un estímulo.
Los términos "diferenciar" y "diferenciado", como se usan en la presente memoria, se refieren a cambios en el fenotipo de una célula de un tipo o estado celular a otro tipo o estado celular. Por ejemplo, se diferencia una célula B de memoria que hace la transición a una célula plasmática.
Antes de la diferenciación y la transfección, se obtiene una fuente de células B de un sujeto. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmune adaptativa (p. ej., mamíferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Las células B se pueden obtener de varias fuentes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido de un sitio de infección, tejido del bazo y tumores. En una realización preferida, la fuente de células B son las PBMCs. En ciertas realizaciones de la presente descripción, se puede usar cualquier número de líneas de células B disponibles en la técnica.
En ciertas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria, las células B se pueden obtener de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, como separación por FICOLL™ (copolímeros de sacarosa y epiclorhidrina que se pueden usar para preparar soluciones de alta densidad). En una realización preferida, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis o leucoféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, que incluyen linfocitos T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, sino de todos, los cationes divalentes. Como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica, se puede realizar una etapa de lavado mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, como mediante el uso de una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en una variedad de tampones biocompatibles, como, por ejemplo, PBS. Alternativamente, los componentes indeseables de la muestra de aféresis se pueden eliminar y las células se pueden resuspender directamente en medios de cultivo.
Las células B se pueden aislar de sangre periférica o leucoféresis usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, las PBMCs se pueden aislar usando FICOLL™ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y las células B CD19+ purificar por selección negativa o positiva usando cualquiera de una variedad de anticuerpos conocidos en la técnica, como el sistema complejo tetramérico Rosette (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) o la tecnología MicroBead MACS™ (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). En ciertas realizaciones, las células B de memoria se aíslan como se describe por Jourdan y cols., (Blood 10 dic. 2009; 114(25): 5173-81). Por ejemplo, después de la eliminación de las células CD2+ usando perlas magnéticas anti-CD2, las células B de memoria CD19+ CD27+ se pueden separar mediante FACS. Las células plasmáticas de médula ósea (BMPCs) se pueden purificar usando separación por microesferas magnéticas anti-CD138 u otros métodos y reactivos similares.
Hay otros kits de aislamiento comercialmente disponibles, como el kit de aislamiento de células B humanas MagCellect de R&D Systems (Minneapolis, MN). En ciertas realizaciones, se pueden preparar células B en reposo mediante sedimentación en gradientes discontinuos de Percoll, como se describe en (Defranco y cols., (1982) J. Exp. Med. 155: 1523).
En una realización, las PBMCs se obtienen a partir de una muestra de sangre usando una purificación basada en gradiente (p. ej., FICOLL™). En otra realización, las PBMCs se obtienen a partir de una recogida basada en aféresis. En una realización, las células B se aíslan de las PBMCs mediante el aislamiento de células pan B. La etapa de aislamiento puede utilizar selección positiva y/o negativa. En una realización, la selección negativa comprende la depleción de las células T usando microesferas conjugadas con anti-CD3, lo que proporciona así una fracción deplecionada de células T. En una realización adicional, las células B de memoria se aíslan a partir de las células pan B o de la fracción deplecionada de células T mediante selección positiva para CD27.
En una realización, se obtienen células B de memoria con cambio de clase. "Célula B de memoria con cambio de clase" o "célula B con cambio de clase", como se usa en la presente memoria, se refiere a una célula B que ha sufrido un cambio de clase de isotipo. En una realización, se seleccionan positivamente las células B de memoria con cambio de clase para IgG. En otra realización, las células B de memoria con cambio de clase se obtienen deplecionando las células que expresan IgD e IgM.
En una realización adicional, se usa la secuencia promotora de un gen exclusivo de las células B de memoria, como, p. ej., el gen CD27 (u otro gen específico de las células B de memoria y no expresado en las células B vírgenes) para impulsar la expresión de un marcador seleccionable como, p. ej., dihidrofolato reductasa mutada, que permite la selección positiva de las células B de memoria en presencia de metotrexato. En otra realización, se deplecionan las células T usando CD3 o mediante la adición de ciclosporina. En otra realización, las células CD138+ se aíslan de las células pan B mediante selección positiva. En otra realización más, las células CD138+ se aíslan de las PBMCs mediante selección positiva. En otra realización, las células CD38+ se aíslan de las células pan B mediante selección positiva. En otra realización más, las células CD38+ se aíslan de las PBMCs mediante selección positiva. En una realización, las células CD27+ se aíslan de las PBMCs mediante selección positiva. En otra realización, las células B de memoria y/o las células plasmáticas se expanden selectivamente a partir de PBMCs usando métodos de cultivo in vitro disponibles en la técnica.
Cultivo de células B in vitro
La presente descripción proporciona métodos para cultivar células B, como células B de memoria y/o células B vírgenes, con el fin de activar y diferenciar las células B en células plasmáticas o plasmablastos o ambas. Como reconocería el experto en la materia, las células plasmáticas se pueden identificar mediante patrones de expresión de proteínas de superficie celular usando métodos de citometría de flujo estándar. Por ejemplo, las células plasmáticas diferenciadas terminalmente expresan relativamente pocos antígenos de superficie y no expresan marcadores de células pan-B comunes, como CD20. Algunas células plasmáticas diferenciadas terminalmente tampoco expresan CD19. En cambio, las células plasmáticas se pueden identificar por la expresión de CD38, CD78, CD138 e IL-6R y la ausencia de expresión de CD45. También se puede usar CD27 para identificar células plasmáticas, ya que las células B vírgenes son CD27-, las células B de memoria son CD27+ y las células plasmáticas son CD27++. Las células plasmáticas expresan altos niveles de CD38 y CD138.
En una realización, después de ciertas etapas de los métodos de cultivo descritos en la presente memoria, las células aisladas son células B de memoria CD20-, CD38-, CD138-. En una realización, las células aisladas son células plasmáticas CD20-, CD38+, CD138+. En una realización, las células se activan y tienen un fenotipo de superficie celular de CD20-, CD38-, CD138-, CD27+. En una realización, las células aisladas son CD20-, CD38+, CD138- y CD27+.
En una realización, las células B se ponen en contacto con uno o más factores activadores de células B, p. ej., cualquiera de una variedad de citoquinas, factores de crecimiento o líneas celulares que se sabe que activan y/o diferencian las células B (véase, p. ej., Fluckiger, y cols. Blood 199892: 4509-4520; Luo, y cols., Blood 2009 113: 1422-1431). Dichos factores se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limitan a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, e IL-35, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IFN-5, quimioquinas tipo C XCL1 y XCL2, quimioquinas tipo C-C (que incluyen hasta la fecha CCL1-CCL28) y quimioquinas tipo CXC (que incluyen hasta la fecha CXCL1 -CXCL17) y miembros de la superfamilia del TNF (p. ej., TNF-a, ligando Bb 4-1, factor activador de células B (BLyS), ligando FAS, sCD40L (que incluye las versiones multiméricas de sCD40L; p. ej., CD40L recombinante soluble marcado con histidina en combinación con mAb anti-polihistidina para agrupar múltiples moléculas de sCD40L), Linfotoxina, OX40L, RANKL, TRAIL), CpG y otros agonistas de receptores de tipo toll (p. ej., CpG).
Se pueden agregar factores activadores de células B a cultivos celulares in vitro a varias concentraciones para lograr el resultado deseado (p. ej., expansión o diferenciación). En una realización, se utiliza un factor de activación de células B para expandir las células B en cultivo. En una realización, se utiliza un factor activador de células B para diferenciar las células B en cultivo. En otra realización, el factor activador de células B se utiliza tanto para expandir como para diferenciar las células B en cultivo. En una realización, se proporciona el factor de activación de células B a la misma concentración para expandir y diferenciar. En otra realización, se proporciona el factor activador de células B en una primera concentración para expandir y en una segunda concentración para diferenciar. Se contempla que un factor activador de células B puede ser 1) utilizado para expandir las células B y no para diferenciar las células B, 2) utilizado para diferenciar las células B y no para expandir las células B, o 3) utilizado para expandir y diferenciar las células B.
Por ejemplo, las células B se cultivan con uno o más factores activadores de células B seleccionados de CD40L, IL 2, IL-4 e IL-10 para la expansión de las células B. En una realización, las células B se cultivan con 0,25-5,0 pg/ml de CD40L. En una realización, la concentración de CD40L es de 0,5 pg/ml. En una realización, se usa un agente de entrecruzamiento (como un anticuerpo anti-HIS en combinación con CD40L marcado con HIS) para crear multímeros de CD40L. En una realización, las moléculas de CD40L se unen covalentemente o se mantienen unidas usando dominios de multimerización de proteínas (p. ej., la región Fc de una IgG o un dominio de cremallera de leucina). En una realización, CD40L se conjuga con perlas. En una realización, CD40L se expresa a partir de células alimentadoras. En otra realización, las células alimentadoras están ausentes. En una realización, las células B se cultivan con 1-10 ng/ml de IL-2. En una realización, la concentración de IL-2 es de 5 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 1-10 ng/ml de IL-4. En una realización, la concentración de IL-4 es de 2 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 10-100 ng/ml de IL-10. En una realización, la concentración de IL-10 es de 40 ng/ml.
En una realización, las células B se cultivan con uno o más factores activadores de células B seleccionados de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 para la expansión de las células B. En una realización, las células B se cultivan con 0,25-5,0 pg/ml de CD40L. En una realización, la concentración de CD40L es de 0,5 pg/ml. En una realización, se usa un agente de entrecruzamiento (como un anticuerpo anti-HIS en combinación con CD40L marcado con HIS) para crear multímeros de CD40L. En una realización, las moléculas de CD40L se unen covalentemente o se mantienen unidas usando dominios de multimerización de proteínas (p. ej., la región Fc de una IgG o un dominio de cremallera de leucina). En una realización, CD40L se conjuga con perlas. En una realización, CD40L se expresa a partir de células alimentadoras. En una realización, las células B se cultivan con 1-10 ng/ml de IL-2. En una realización, la concentración de IL-2 es de 5 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 1-10 ng/ml de IL-4. En una realización, la concentración de IL-4 es de 2 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 10-100 ng/ml de IL-10. En una realización, la concentración de IL-10 es de 40 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 50-150 ng/ml de IL-15. En una realización, la concentración de IL-15 es de 100 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 50-150 ng/ml de IL-21. En una realización, la concentración de IL-21 es de 100 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10. En una realización particular, las células B se cultivan con CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 para la expansión de las células B. En otra realización, las células B se cultivan con CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 y un agente de entrecruzamiento de CD40L (p. ej., un anticuerpo de entrecruzamiento de CD40L). En una realización, el CD40L es un CD40L marcado con HIS, y el anticuerpo de entrecruzamiento de CD40L es un anticuerpo anti-HIS.
En otro ejemplo, las células B se cultivan con uno o más factores activadores de células B seleccionados de CD40L, mezcla de FN-a e IFN-5, IL-2, IL-6, IL-10, IL-15, IL-21 y oligodesoxinucleótidos CpG de clase P (p-ODN) para la diferenciación de las células B. En una realización, las células B se cultivan con 25-75 ng/ml de CD40L. En una realización, la concentración de CD40L es de 50 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con una mezcla de 250-750 U/ml de IFN-a e IFN-5. En una realización, la concentración de la mezcla de IFN-a e IFN-5 es de 500 U/ml. En una realización, las células B se cultivan con 5-50 U/ml de IL-2. En una realización, la concentración de IL-2 es de 20 U/ml. En una realización, las células B se cultivan con 25-75 ng/ml de IL-6. En una realización, la concentración de IL-6 es de 50 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 10-100 ng/ml de IL-10. En una realización, la concentración de IL-10 es de 50 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 1-20 ng/ml de IL-15. En una realización, la concentración de IL-15 es de 10 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 10-100 ng/ml de IL-21. En una realización, la concentración de IL-21 es de 50 ng/ml. En una realización, las células B se cultivan con 1-50 pg/ml de p-ODN. En una realización, la concentración de p-ODN es de 10 pg/ml.
En una realización, las células B se ponen en contacto o se cultivan sobre células alimentadoras. En una realización, las células alimentadoras son una línea de células de estroma, p. ej., la línea de células de estroma murino S17 o MS5. En otra realización, las células CD19+ aisladas se cultivan con una o más citoquinas como factor de activación de células B, como IL-10 e IL-4, en presencia de fibroblastos que expresan el ligando CD40 (CD40L, CD154). En una realización, el CD40L se proporciona unido a una superficie como una placa de cultivo de tejidos o una perla. En otra realización, las células B purificadas se cultivan, en presencia o ausencia de células alimentadoras, con CD40L y una o más citoquinas o factores seleccionados de IL-10, IL-4, IL-7, p-ODN, ADN CpG, IL-2, IL-15, IL-6, IFN-a e IFN-5.
En otra realización, los factores activadores de células B se proporcionan a través de transfección en la célula B u otra célula alimentadora. En este contexto, se pueden usar uno o más factores que promuevan la diferenciación de la célula B en una célula secretora de anticuerpos y/o uno o más factores que promuevan la longevidad de la célula productora de anticuerpos. Dichos factores incluyen, por ejemplo, Blimp-1, TRF4, factores antiapoptóticos como Bcl-xl o Bcl5, o mutantes constitutivamente activos del receptor de CD40. Además, en la activación/diferenciación de las células B también se pueden usar factores que promuevan la expresión de moléculas señalizadoras corriente abajo como factores asociados al receptor de TNF (TRAFs). En este sentido, la activación celular, la supervivencia celular y las funciones antiapoptóticas de la superfamilia de receptores del TNF están mediadas principalmente por TRAF1 -6 (véase, p. ej., R.H. Arch, y cols., Genes Dev. 12 (1998), págs. 2821 -2830). Los efectores corriente abajo de la señalización de TRAF incluyen factores de transcripción en la familia NF-kB y AP-1 que pueden activar genes involucrados en varios aspectos de las funciones celulares e inmunes. Además, se ha demostrado que la activación de NF-kB y AP-1 proporciona protección celular contra la apoptosis a través de la transcripción de genes antiapoptóticos.
En otra realización, las proteínas derivadas del virus Epstein Barr (EBV) se usan para la activación y/o diferenciación de células B o para promover la longevidad de la célula productora de anticuerpos. Las proteínas derivadas del EBV incluyen, pero no se limitan a, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, EBER, miRNAs, EBV-EA, EBV-MA, EBVVCA y EBV-AN.
En ciertas realizaciones, poner en contacto las células B con factores de activación de células B usando los métodos proporcionados en la presente memoria da lugar a, entre otras cosas, a la proliferación celular (es decir, expansión), modulación del fenotipo de superficie celular IgM+ a uno consistente con una célula B madura activada, secreción de Ig y cambio de isotipo. Las células B CD19+ se pueden aislar usando kits de separación de células conocidos y comercialmente disponibles, como el sistema de separación celular MiniMACS™ (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). En determinadas realizaciones, los fibroblastos CD40L se irradian antes de su uso en los métodos descritos en la presente memoria. En una realización, las células B se cultivan en presencia de uno o más de IL-3, IL-7, ligando Flt3, trombopoyetina, SCF, IL-2, IL-10, G-CSF y CpG. En ciertas realizaciones, los métodos incluyen el cultivo de células B en presencia de uno o más de los factores antes mencionados junto con células estromales transformadas (p. ej., MS5) que proporcionan un nivel bajo de CD40L anclado y/o CD40L unido a una placa o a una perla.
En una realización, poner en contacto las células B con factores activadores de células B que usan los métodos proporcionados en la presente memoria induce a las células B a ser migratorias. Las células B migratorias pueden ser capaces, por ejemplo, de migrar a nichos de supervivencia, completar la diferenciación, recibir señales que respaldan la supervivencia a largo plazo después de la administración in vivo, y moverse a los sitios de inflamación. Por ejemplo, CXCL12 atrae plasmablastos a la médula ósea, lo cual es importante para su supervivencia a largo plazo. De manera similar, CXCL13, por ejemplo, atrae las células B hacia los sitios de inflamación. Las células B expandidas y/o activadas pueden ser migratorias. En una realización, una población de células B expandida es migratoria. En una realización, las células de la población de células B expandidas migran hacia CXCL12. En una realización, las células de la población de células B expandidas migran hacia CXCL13. En una realización, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o incluso el 100 % de las células de una población de células B (p. ej., una población expandida de células B) son migratorias. En una realización, una población de células B es migratoria cuando al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o incluso el 100 % de las células migran hacia un quimioatractante. En una realización, el quimioatractante es CXCL12. En una realización, el quimioatractante es CXCL13.
Como se discutió anteriormente, los factores activadores de células B inducen la expansión, proliferación o diferenciación de células B. Por consiguiente, las células B se ponen en contacto con uno o más factores activadores de células B enumerados anteriormente para obtener una población celular expandida. Se puede expandir una población celular antes de la transfección. Alternativa, o adicionalmente, se puede expandir una población celular después de la transfección. En una realización, expandir una población de células B comprende cultivar células con IL-2, IL-4, IL-10 y CD40L (véase, p. ej., Neron y cols. PLoS ONE, 2012 7(12):e51946). En una realización, expandir una población de células B comprende cultivar células con IL-2, IL-10, CpG y CD40L. En una realización, expandir una población de células B comprende cultivar células con IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 y CD40L. En una realización, expandir una población de células B comprende cultivar células con IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21, CD40L y un agente de entrecruzamiento de CD40L en ausencia de células auxiliares o alimentadoras.
En otra realización, la expansión de una población de células B se induce y/o mejora mediante un transgén introducido en las células B. Por ejemplo, una célula B que contiene un receptor recombinante o un receptor diseñado que induce una vía de señalización celular (p. ej., señalización corriente abajo de CD40) al unirse a su ligando (p. ej., un ligando soluble o un ligando expresado en la superficie celular). En una realización, una célula B sobreexpresa CD40 debido a la expresión de un transgén de CD40. En otra realización, una célula B expresa un receptor diseñado, que incluye, p. ej., un anticuerpo diseñado de forma recombinante. En una realización, un receptor diseñado es similar a un receptor quimérico de un antígeno (CAR) y comprende una proteína de fusión de un scFv y una porción de señalización intracelular de un receptor de célula B (p. ej., CD40).
En una realización, la expansión de una población de células B se induce y/o mejora mediante un compuesto de molécula pequeña añadido al cultivo celular. Por ejemplo, se puede usar un compuesto que se une a CD40 y lo dimeriza para desencadenar la vía de señalización de CD40.
Se puede usar cualquiera de una variedad de medios de cultivo en los presentes métodos, como sabrá el experto en la técnica (véase, p. ej., Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 por John Wiley & Sons, Inc.). En una realización, los medios para usar en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, medio Dulbecco modificado Iscove (con o sin suero bovino fetal u otro suero apropiado). Los medios ilustrativos también incluyen, pero no se limitan a, iMd M, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20. En realizaciones adicionales, el medio puede comprender un tensioactivo, un anticuerpo, un plasmanato o un agente reductor (p. ej., N-acetilcisteína, 2-mercaptoetanol), uno o más antibióticos y/o aditivos como insulina, transferrina, selenito de sodio y ciclosporina. En algunas realizaciones, también se pueden usar IL-6, CD40L soluble y un amplificador del entrecruzamiento
Las células B se cultivan en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes para lograr la diferenciación y la activación deseadas. En determinadas realizaciones, las células B se cultivan en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes tales que se diferencian y/o activan el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, el 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o incluso el 100 % de las células B según se desee. En una realización, las células B se activan y se diferencian en una población mixta de plasmablastos y células plasmáticas. Como reconocería el experto en la técnica, los plasmablastos y las células plasmáticas se pueden identificar mediante patrones de expresión de proteínas de superficie celular usando métodos de citometría de flujo estándar como se describe en otra parte de la presente memoria, como la expresión de uno o más de CD38, CD78, IL-6R, CD27alto, y CD138 y/o ausencia o reducción de la expresión de uno o más de CD19, CD20 y CD45. Como entenderá el experto en la técnica, las células B de memoria son generalmente CD20+ CD19+ CD27+ CD38- mientras que los plasmablastos tempranos son CD20- CD19+ CD27++ CD38++. En una realización, las células cultivadas que usan los métodos descritos en la presente memoria son CD20-, CD38+, CD138-. En otra realización, las células tienen un fenotipo de CD20-, CD38+, CD138+. En determinadas realizaciones, las células se cultivan durante 1-7 días. En realizaciones adicionales, las células se cultivan durante 7, 14, 21 días o más. Por lo tanto, las células se pueden cultivar en condiciones apropiadas durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o más días. Las células se vuelven a sembrar y se pueden añadir o cambiar medios y suplementos según sea necesario usando las técnicas conocidas en la técnica.
En determinadas realizaciones, las células B se cultivan en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes de manera que al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las células se diferencian y activan para producir Ig y/o para expresar el transgén.
La inducción de la activación de las células B se puede medir mediante técnicas como incorporación de 3H-uridina en el ARN (a medida que las células B se diferencian, aumenta la síntesis de ARN), o por incorporación de 3H-timidina, que mide la síntesis de ADN asociada con la proliferación celular. En una realización, se puede añadir interleuquina-4 (IL-4) al medio de cultivo a una concentración adecuada (p. ej., aproximadamente 10 ng/ml) para potenciar la proliferación de células B.
Alternativamente, la activación de las células B se mide en función de la secreción de inmunoglobulina. Por ejemplo, se añade CD40L a las células B en reposo junto con IL-4 (p. ej., 10 ng/ml) e IL-5 (p. ej., 5 ng/ml) u otras citoquinas que activan las células B. La citometría de flujo también se puede usar para medir los marcadores de superficie celular típicos de las células B activadas. Véase, p. ej., Civin Cl, Loken MR, Int'l J. Cell Cloning 987; 5: 1-16; Loken, MR, y cols., Flow Cytometry Characterization of Erythroid, Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow, en Flow Cytometry in Hematology, Laerum OD, Bjerksnes R. eds., Academic Press, Nueva York 1992; págs.
31 -42; y LeBein TW y cols., Leukemia 1990; 4: 354-358.
Después del cultivo durante un período de tiempo apropiado, como de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más días, generalmente alrededor de 3 días, se puede añadir un volumen adicional de medio de cultivo. Se puede recoger el sobrenadante de cultivos individuales en varios momentos durante el cultivo y cuantificarse en IgM e IgG1 como se describe en Noelle y cols., (1991) J. Immunol. 146: 1118-1124. En una realización, el cultivo se recoge y se mide para determinar la expresión del transgén de interés usando citometría de flujo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ELISPOT u otro ensayo conocido en la técnica.
En otra realización, se usa ELISA para medir la producción de isotipos de anticuerpos, p. ej., IgM o un producto del transgén de interés. En determinadas realizaciones, las determinaciones de IgG se realizan usando anticuerpos comercialmente disponibles, como anti-IgG humana de cabra, como anticuerpo de captura seguido de la detección usando cualquiera de una variedad de reactivos de detección apropiados, como anti-Ig de cabra biotinilado, fosfatasa alcalina con estreptavidina y sustrato.
En determinadas realizaciones, las células B se cultivan en condiciones y durante períodos de tiempo suficientes de modo que el número de células sea de 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000 veces o más que el número de células B al comienzo del cultivo. En una realización, el número de células es de 10 a 1.000 veces más, incluidos los números enteros consecutivos, que el número de células B al comienzo del cultivo. Por ejemplo, una población de células B expandida es al menos 10 veces mayor que la población de células B aisladas inicial. En otra realización, la población de células B expandida es al menos 100 veces mayor que la población de células B aisladas inicial. En una realización, la población de células B expandida es al menos 500 veces mayor que la población de células B aisladas inicial.
Transfección de células B
Las células de las composiciones de células B descritas en la presente memoria se transfectan con un transgén. La transfección de células B se lleva a cabo usando cualquiera de una variedad de métodos disponibles en la técnica para introducir ADN o ARN en una célula B. Las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por presión o "cell squeezing" (p. ej., sistema de microfluidos CellSqueeze, SQZ Biotechnologies), transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, p. ej., vaccinia. Véase, p. ej., Graham y cols., 1973, Virology 52: 456; Sambrook y cols., 2001, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis y cols., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu y cols., 1981, Gene 13: 197; los documentos US 5.124.259; US 5.297.983; US 5.283.185; US 5.661.018; US 6.878.548; US 7.799.555; US 8.551.780; y US 8.633.029. Un ejemplo de una técnica de electroporación comercialmente disponible adecuada para las células B es la tecnología de transfección Nucleofector™.
La transfección puede tener lugar antes o durante el cultivo in vitro de las células B aisladas en presencia de uno o más factores activadores y/o diferenciadores descritos anteriormente. Por ejemplo, las células se transfectan los días 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 del cultivo in vitro. En una realización, las células se transfectan el día 1, 2 o 3 del cultivo in vitro. En una realización particular, las células se transfectan el día 2. Por ejemplo, las células se someten a electroporación el día 2 del cultivo in vitro para la administración de, p. ej., un plásmido, un transposón, un minicírculo o un ARN autorreplicante. En otra realización, las células se transfectan el día 4, 5, 6 o 7 del cultivo in vitro. En una realización particular, las células se transfectan el día 6 del cultivo in vitro. En otra realización, las células se transfectan el día 5 del cultivo in vitro.
En una realización, las células se transfectan antes de la activación. En otra realización, las células se transfectan durante la activación. En una realización, las células se transfectan después de la activación. En una realización, las células se transfectan antes de la diferenciación. En otra realización, las células se transfectan durante la diferenciación. En una realización, las células se transfectan después de la diferenciación.
En una realización, se usa un vector no viral para administrar ADN o ARN a células pan B, células B de memoria y/o células plasmáticas. Los ejemplos de vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, transposones (p. ej., el sistema de transposón Bella Durmiente), nucleasas con dedos de zinc (ZFNs), nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALENs), repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPRs), minicírculos, replicones de ADN, replicones de ARN, cromosomas artificiales (p. ej., cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de mamíferos y cromosomas artificiales de levadura), plásmidos, miniplásmidos intrónicos, nanoplásmidos, cósmidos y bacteriófagos. En una realización, el vector no viral es un vector episomal persistente.
En una realización, un método para transfectar una célula B comprende electroporar la célula B antes de ponerla en contacto con un vector. En una realización, las células se someten a electroporación los días 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del cultivo in vitro. En una realización, las células se someten a electroporación el día 2 del cultivo in vitro para la distribución de un plásmido. En una realización, las células se transfectan usando un transposón en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del cultivo in vitro. En otra realización, las células se transfectan usando un minicírculo en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del cultivo in vitro. En una realización, la electroporación de un transposón Bella Durmiente tiene lugar el día 2 del cultivo in vitro.
En una realización, las células B se ponen en contacto con un vector que comprende un ácido nucleico de interés unido operativamente a un promotor, en condiciones suficientes para transfectar al menos una parte de las células B. En una realización, las células B se ponen en contacto con un vector que comprende un ácido nucleico de interés unido operativamente a un promotor, en condiciones suficientes para transfectar al menos el 5 % de las células B. En una realización adicional, las células B se ponen en contacto con un vector en condiciones suficientes para transfectar al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso el 100% de las células B. En una realización particular, las células B, cultivadas in vitro como se describe en la presente memoria, se transfectan, en cuyo caso las células B cultivadas se ponen en contacto con un vector como se describe en la presente memoria en condiciones suficientes para transfectar al menos el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de la B células.
Ciertas realizaciones emplean vectores virales para transducir células B de memoria y/o células plasmáticas. Los ejemplos de vectores virales incluyen, sin limitación, vectores basados en adenovirus, vectores basados en virus adenoasociados (AAV), vectores retrovirales, vectores retrovirales-adenovirales y vectores derivados de virus del herpes simple (HSV), que incluyen los vectores amplicón, HSV defectuoso en la replicación y HSV atenuado (véase, p. ej., Krisky, Gene Ther. 5: 1517-30, 1998; Pfeifer, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2: 177-211, 2001).
En una realización, las células se transducen con un vector viral (p. ej., un vector lentiviral) el día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 del cultivo in vitro. En una realización particular, las células se transducen con un vector viral el día 5 del cultivo in vitro. En una realización, el vector viral es un lentivirus. En una realización, las células se transducen con un lentivirus seudotipado del virus del sarampión el día 1 del cultivo in vitro.
En una realización, las células B se transducen con vectores retrovirales usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica (véase, p. ej., Science 12 abril 1996272: 263-267; Blood 2007, 99: 2342- 2350; Blood 2009, 113: 1422-1431; Blood 8 octubre 2009; 114(15): 3173-80; Blood. 2003; 101(6): 2167-2174; Current Protocols in Molecular Biology o Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (2009)). Se puede encontrar una descripción adicional de la transducción viral de las células B en los documentos WO 2011/085247 y WO 2014/152832.
Por ejemplo, se pueden aislar PBMCs, linfocitos B o T a partir de donantes y otras células cancerosas de células B, como B-CLL, y cultivarse en medio IMDM o RPMI 1640 (GibcoBRL Invitrogen, Auckland, Nueva Zelanda) u otro medio adecuado como se describe en la presente memoria, ya sea sin suero o suplementado con suero (p. ej., FCS al 5-10 %, suero AB humano y sustitutos de suero) y penicilina/estreptomicina y/u otros suplementos adecuados como transferrina y/o insulina. En una realización, las células se siembran a 1 x 105 células en placas de 48 pocillos y se añade vector concentrado a varias dosis que el experto en la técnica puede optimizar de forma rutinaria usando metodologías de rutina. En una realización, las células B se transfieren a una monocapa de células MS5 en RPMI suplementado con suero AB al 10 %, FCS al 5 %, 50 ng/ml de rhSCF, 10 ng/ml de rhlL-15 y 5 ng/ml de rhlL-2 y el medio se cambia periódicamente según sea necesario. Como reconocerá el experto en la técnica, se pueden usar otros medios y complementos adecuados según se desee.
Ciertas realizaciones se relacionan con el uso de vectores retrovirales o vectores derivados de retrovirus. Los "retrovirus" son virus de ARN envueltos que son capaces de infectar células animales y que utilizan la enzima transcriptasa inversa en las primeras etapas de la infección para generar una copia de ADN a partir de su genoma de ARN, que luego se integra típicamente en el genoma del huésped. Ejemplos de vectores retrovirales, vectores derivados del virus de la leucemia Moloney murina (MLV), vectores retrovirales basados en un virus de células madre murinas, que proporciona una expresión estable a largo plazo en células diana como células precursoras hematopoyéticas y su progenie diferenciada (véase, p. e j, Hawley y cols., PNAS USA 93: 10297-10302, 1996; Keller y cols., Blood 92: 877-887, 1998), vectores híbridos (véase, p. ej., Choi, y cols., Stem Cells 19: 236-246, 2001), y vectores derivados de retrovirus complejos, como vectores lentivirales.
En una realización, las células B se ponen en contacto con un vector retroviral que comprende un ácido nucleico de interés unido operativamente a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos una parte de las células B. En una realización, las células B se ponen en contacto con un vector retroviral que comprende un ácido nucleico de interés unido operativamente a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos el 2 % de las células B. En una realización adicional, las células B se ponen en contacto con un vector en condiciones suficientes para transducir al menos el 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de las células B en reposo. En una realización particular, las células B diferenciadas y activadas, cultivadas in vitro como se describe en la presente memoria, se transducen, en cuyo caso las células B diferenciadas/activadas cultivadas se ponen en contacto con un vector como se describe en la presente memoria en condiciones suficientes para transducir al menos el 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 15%, 20 %, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de las células B diferenciadas y activadas.
En ciertas realizaciones, antes de la transducción, las células se estimulan previamente con Staphylococcus Aureus Cowan (SAC; Calbiochem, San Diego, CA) y/o IL-2 en concentraciones apropiadas conocidas por los expertos y optimizadas de forma rutinaria. Se pueden usar otros factores activadores de células B (p. ej., PMA), como los conoce el experto en la técnica y se describen en la presente memoria.
Como se indicó anteriormente, ciertas realizaciones emplean vectores lentivirales. El término ''lentivirus'' se refiere a un género de retrovirus complejos que son capaces de infectar tanto células en división como células que no se dividen. Los ejemplos de lentivirus incluyen el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana; incluido el VIH tipo 1 y el VIH tipo 2), visna-maedi, el virus de la artritis-encefalitis caprina, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), el virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), y el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV). Los vectores lentivirales se pueden derivar de cualquiera o más de estos lentivirus (véase, p. ej., Evans y cols., Hum Gene Ther. 10: 1479-1489, 1999; Case y cols., PNAS USA 96: 2988-2993, 1999; Uchida y cols., PNAS USA 95:1 1939-1 1944, 1998; Miyoshi y cols., Science 283: 682-686, 1999; Sutton y cols., J Virol 72: 5781-5788, 1998; y Frecha y cols., Blood. 112: 4843-52, 2008).
Se ha documentado que las células T y B en reposo pueden ser transducidas por un LV recubierto con VSVG que contiene la mayoría de las proteínas accesorias del VIH (vif, vpr, vpu y nef) (véase, p. ej., Frecha y cols., 2010 Mol. Therapy 18: 1748). En ciertas realizaciones, el vector retroviral comprende ciertas secuencias mínimas de un genoma de lentivirus, como el genoma de VIH o el genoma de SIV. El genoma de un lentivirus generalmente se organiza en una región de repetición terminal larga (LTR) 5 ', el gen gag, el gen pol, el gen env, los genes accesorios (p. ej., nef, vif, vpr, vpu, tat, rev) y una región LTR 3'. El LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R (repetición) y U5. La región U3 contiene los elementos amplificadores y promotores, la región U5 contiene las señales de poliadenilación y la región R separa las regiones U3 y U5. Las secuencias transcritas de la región R aparecen en los extremos 5' y 3' del ARN viral (véase, p. ej., "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70: 1617-1639, 1989; Fields y cols., Fundamental Virology Raven Press., 1990; Miyoshi y cols., J Virol. 72: 8150-7,1998; y la Patente de EE.UU. N°. 6.013.516). Los vectores lentivirales pueden comprender cualquiera o más de estos elementos del genoma lentiviral, para regular la actividad del vector según se desee, o pueden contener supresiones, inserciones, sustituciones o mutaciones en uno o más de estos elementos, como para reducir los efectos patológicos de la replicación lentiviral, o limitar el vector lentiviral a una sola ronda de infección.
Normalmente, un vector retroviral mínimo comprende ciertas secuencias 5'LTR y 3'LTR, uno o más genes de interés (para expresarse en la célula diana), uno o más promotores y una secuencia que actúa en cis para empaquetar el ARN. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras, como se describe en la presente memoria y se conoce en la técnica. El vector viral normalmente se clona en un plásmido que se puede transfectar en una línea celular de empaquetamiento, como una célula eucariota (p. ej., 293-HEK), y también comprende normalmente secuencias útiles para la replicación del plásmido en bacterias.
En ciertas realizaciones, el vector viral comprende secuencias de los LTRs 5' y/o 3' de un retrovirus como un lentivirus. Las secuencias LTR pueden ser secuencias LTR a partir de cualquier lentivirus de cualquier especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias LTR de VIH, SIV, FIV o BIV. Preferiblemente, las secuencias LTR son secuencias LTR de VIH.
En ciertas realizaciones, el vector viral comprende las secuencias R y U5 a partir de la LTR 5' de un lentivirus y una LTR 3' inactivada o "autoinactivante" de un lentivirus. Una "LTR 3' autoinactivante" es una repetición terminal larga (LTR) 3' que contiene una mutación, sustitución o supresión que evita que las secuencias LTR impulsen la expresión de un gen corriente abajo. Una copia de la región U3 del LTR 3' actúa como molde para la generación de ambos LTR en el provirus integrado. Por tanto, cuando la LTR 3' con una supresión o mutación inactivante se integra como la LTR 5' del provirus, no es posible la transcripción a partir de la LTR 5'. Esto elimina la competición entre el amplificador/promotor viral y cualquier amplificador/promotor interno. Los LTR 3' autoinactivantes se describen, por ejemplo, en Zufferey y cols., J Virol. 72: 9873-9880, 1998; Miyoshi y cols., J Virol. 72: 8150-8157, 1998; y Iwakuma y cols., Wro/ogy 261: 120-132, 1999. Los LTR 3' autoinactivantes se pueden generar mediante cualquier método conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, el elemento U3 del LTR 3’ contiene una supresión de su secuencia amplificadora, preferiblemente la TATA box, y sitios Spl y/o NF-kappa B. Como resultado de la LTR 3' autoinactivante, el provirus que se integra en el genoma de la célula huésped comprenderá una LTR 5' inactivada.
Los vectores proporcionados en la presente memoria normalmente comprenden un gen que codifica una proteína (u otra molécula, como ARNsi) que se expresa de forma deseable en una o más células diana. En un vector viral, el gen de interés se localiza preferiblemente entre las secuencias LTR 5' y LTR 3'. Además, el gen de interés está preferiblemente en una relación funcional con otros elementos genéticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción como promotores y/o amplificadores, para regular la expresión del gen de interés de una manera particular una vez que el gen se incorpora a la célula diana. En ciertas realizaciones, las secuencias reguladoras transcripcionales útiles son aquellas que están altamente reguladas con respecto a la actividad, tanto temporal como espacialmente.
En determinadas realizaciones, se pueden incorporar uno o más genes adicionales como medida de seguridad, principalmente para permitir la eliminación selectiva de células diana transfectadas dentro de una población heterogénea, como dentro de un paciente humano. En una realización ejemplar, el gen seleccionado es un gen de timidina quinasa (TK), cuya expresión hace que una célula diana sea susceptible a la acción del fármaco ganciclovir. En una realización adicional, el gen suicida es un gen suicida de caspasa 9 activado por un fármaco dimerizante (véase, p. ej., Tey y cols., Biology of Blood and Marrow Transplantation 13: 913-924, 2007).
En ciertas realizaciones, se puede colocar un gen que codifica una proteína marcadora antes o después del gen primario en un vector viral o no viral para permitir la identificación y/o selección de células que expresan la proteína deseada. Ciertas realizaciones incorporan una proteína marcadora fluorescente, como la proteína fluorescente verde (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP), junto con el gen primario de interés. Si se incluyen uno o más genes reporteros adicionales, también se pueden incluir secuencias IRES o elementos 2A, que separan el gen primario de interés de un gen reportero y/o cualquier otro gen de interés.
Ciertas realizaciones pueden emplear genes que codifican uno o más marcadores seleccionables. Los ejemplos incluyen marcadores seleccionables que son eficaces en una célula eucariota o una célula procariota, como un gen de resistencia a un fármaco que codifica un factor necesario para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selección ejemplares codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, p. ej., G418, higromicina B, puromicina, zeocina, ouabaína, blasticidina, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas del complemento, o la aportación puede estar presente en un plásmido separado e introducido mediante co-transfección con el vector viral. En una realización, el gen codifica una dihidrofolato reductasa mutante (DHFR) que confiere resistencia al metotrexato. Ciertas otras realizaciones pueden emplear genes que codifican uno o más receptores de superficie celular que se pueden usar para marcar y detectar o purificar células transfectadas (p. ej., receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) u otros receptores útiles como sistemas de marcadores de transducción. Véase p. ej., Lauer y cols., Cancer Gene Ther. 2000 marzo; 7(3): 430-7.
Ciertos vectores virales como vectores retrovirales emplean uno o más promotores heterólogos, amplificadores o ambos. En ciertas realizaciones, la secuencia U3 de un LTR 5' retroviral o lentiviral se puede reemplazar con una secuencia promotora o amplificadora en la construcción viral. Ciertas realizaciones emplean un promotor/amplificador "interno" que está ubicado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3' del vector viral, y está unido operativamente al gen de interés.
Una "relación funcional" y "ligado operativamente" significan, sin limitación, que el gen está en la ubicación y orientación correctas con respecto al promotor y/o amplificador, de modo que la expresión del gen se verá afectada cuando el promotor y/o el amplificador se ponen en contacto con las moléculas reguladoras apropiadas. Se puede usar cualquier combinación de amplificador/promotor que regule (p. ej., aumente, disminuya) la expresión del genoma del ARN viral en la línea celular de empaquetamiento, que regule la expresión del gen de interés seleccionado en una célula diana infectada, o ambas.
Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que se produzca la unión a la polimerasa y la transcripción. Los promotores son secuencias no traducidas que se ubican corriente arriba (5') del codón de inicio de un gen de interés seleccionado (típicamente dentro de aproximadamente 100 a 1.000 pb) y controlan la transcripción y la traducción de la secuencia polinucleotídica codificadora a la que están unidos operativamente. Los promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Los promotores inducibles inician mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, como un cambio de temperatura. Los promotores pueden ser unidireccionales o bidireccionales. Los promotores bidireccionales se pueden usar para co-expresar dos genes, p. ej., un gen de interés y un marcador de selección. Alternativamente, se puede utilizar una configuración de promotor bidireccional que comprende dos promotores, cada uno de los cuales controla la expresión de un gen diferente, en orientación opuesta en el mismo vector.
Se conocen en la técnica una variedad de promotores, así como métodos para unir operativamente el promotor a la secuencia codificadora del polinucleótido. Se pueden usar tanto las secuencias del promotor nativo como muchos promotores heterólogos para dirigir la expresión del gen de interés seleccionado. Ciertas realizaciones emplean promotores heterólogos, porque generalmente permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína deseada en comparación con el promotor nativo.
Ciertas realizaciones pueden emplear promotores virales heterólogos. Los ejemplos de tales promotores incluyen aquellos obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus, el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus simio 40 (SV40). Ciertas realizaciones pueden emplear un promotor de mamífero heterólogo, como el promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque térmico o un promotor que está asociado con la secuencia nativa del gen de interés. Normalmente, el promotor es compatible con la célula diana, como un linfocito B activado, una célula B plasmática, una célula B de memoria u otra célula diana de linfocitos.
Ciertas realizaciones pueden emplear uno o más de los promotores de ARN polimerasa II y III. Se puede encontrar una selección adecuada de promotores de ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule y White. Nucleic Acids Research., vol. 28, págs. 1283-1298, 2000. Los promotores de ARN polimerasa II y III también incluyen cualquier fragmento de ADN sintético o diseñado que pueda dirigir a la ARN polimerasa II o III, respectivamente, para transcribir sus secuencias de ARN codificadoras corriente abajo. Además, el promotor o promotores de ARN polimerasa II o III (Pol II o III) usados como parte del vector viral pueden ser inducibles. Se puede usar cualquier promotor Pol II o III inducible adecuado con los métodos descritos en la presente memoria. Los ejemplos de promotores Pol II o III incluyen los promotores sensibles a tetraciclina proporcionados en Ohkawa y Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, págs. 577-585, 2000; y Meissner y cols., Nucleic Acids Research, vol. 29, págs. 1672-1682, 2001.
Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que se pueden usar incluyen el promotor de ubiquitina, el promotor de CMV (véase, p. ej., Karasuyama y cols., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), la p-actina (véase, p. ej., Gunning y cols., PNAS USA 84: 4831 -4835, 1987), el promotor del factor de elongación-1 alfa (EF-1 alfa), el promotor CAG y el promotor pgk (véase, p. ej., Adra y cols., Gene 60: 65-74, 1987); Singer-Sam y cols., Gene 32: 409-417, 1984; y Dobson y cols., Nucleic Acids Res. 10: 2635-2637, 1982). Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido incluyen el promotor Ick (véase, p. ej., Garvin y cols., Mol. Cell Biol. 8: 3058-3064, 1988; y Takadera y cols., Mol. Cell Biol. 9: 2173-2180, 1989), el promotor de miogenina (Yee y cols., Genes and Development 7: 1277-1289. 1993), y el promotor thyl (véase, p. ej., Gundersen y cols., Gene 113: 207-214, 1992).
Ejemplos adicionales de promotores incluyen el promotor de la ubiquitina-C, el promotor de la cadena pesada g humana o el promotor de la cadena pesada de Ig (p. ej., MH) y el promotor de la cadena ligera k humana o el promotor de la cadena ligera de Ig (p. ej., EEK), que son funcionales en linfocitos B. El promotor MH contiene el promotor de cadena pesada g humana precedido por el amplificador iEg flanqueado por regiones de asociación a matriz, y el promotor EEK contiene el promotor de cadena ligera k precedido por un amplificador intrónico (iEk), una región asociada a matriz y un amplificador 3' (3Ek) (véase, p. ej., Luo y cols., Blood 113: 1422-1431,2009, y la publicación de solicitud de Patente de EE.UU. N°. 2010/0203630). Por consiguiente, ciertas realizaciones pueden emplear uno o más de estos elementos promotores o amplificadores.
En una realización, un promotor dirige la expresión de un marcador seleccionable y un segundo promotor dirige la expresión del gen de interés. Por ejemplo, en una realización, el promotor EF-1 alfa impulsa la producción de un marcador de selección (p. ej., DHFR) y un promotor CAG en miniatura (véase, p. ej., Fan y cols., Human Gene Therapy 10: 2273-2285, 1999) impulsa la expresión del gen de interés (p. ej., IDUA).
Como se indicó anteriormente, ciertas realizaciones emplean elementos amplificadores, como un amplificador interno, para aumentar la expresión del gen de interés. Los amplificadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente aproximadamente de 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Las secuencias amplificadoras se pueden derivar de genes de mamíferos (p. ej., globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, insulina), como el amplificador isg, el amplificador intrónico isk y el amplificador 3' sk. También se incluyen amplificadores de un virus eucariótico, que incluyen el amplificador SV40 en el lado del origen de replicación tardío (pb 100-270), el amplificador del promotor temprano de citomegalovirus, el amplificador de polioma en el lado del origen de replicación tardío y amplificadores de adenovirus. Los amplificadores se pueden cortar y empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia polinucleotídica específica del antígeno, pero se ubican preferiblemente en un sitio 5' del promotor. Los expertos en la técnica seleccionarán el amplificador apropiado en función del patrón de expresión deseado.
En ciertas realizaciones, los promotores se seleccionan para permitir la expresión inducible del gen. Se conocen en la técnica varios sistemas para la expresión inducible, que incluyen el sistema de respuesta a tetraciclina y el sistema operador-represor lac. También se contempla que se puede usar una combinación de promotores para obtener la expresión deseada del gen de interés. El experto en la materia podrá seleccionar un promotor en función del patrón de expresión deseado del gen en el organismo y/o la célula diana de interés.
Ciertos vectores virales contienen secuencias de empaquetamiento que actúan en cis para promover la incorporación del ARN viral genómico en la partícula viral. Los ejemplos incluyen secuencias psi. Dichas secuencias que actúan en cis son conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, los vectores virales descritos en la presente memoria pueden expresar dos o más genes, lo que se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un promotor interno que esté unido operativamente a cada gen separado más allá del primer gen, mediante la incorporación de un elemento que facilite la expresión conjunta como un elemento de secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) (documento de Pat. de EE.UU. N°. 4.937.190) o un elemento 2A, o ambos. Simplemente a modo de ilustración, los elementos IRES o 2A se pueden usar cuando un solo vector comprende secuencias que codifican cada cadena de una molécula de inmunoglobulina con una especificidad deseada. Por ejemplo, la primera región codificadora (que codifica la cadena pesada o ligera) se puede ubicar inmediatamente corriente abajo del promotor, y la segunda región codificadora (que codifica la otra cadena) se puede ubicar corriente abajo de la primera región codificadora, con un elemento IRES o 2A ubicado entre la primera y la segunda región codificadora, preferiblemente inmediatamente antes de la segunda región codificadora. En otras realizaciones, se usa un elemento IRES o 2A para expresar conjuntamente un gen no relacionado, como un gen reportero, un marcador seleccionable, o un gen que aumenta la función inmune. Los ejemplos de secuencias IRES que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, los elementos IRES del virus de la encefalomielitis (EMCV), el virus de la fiebre aftosa (FMDV), el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV), el rinovirus humano (HRV), el virus coxsackie (CSV), poliovirus (POLIO), virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis C (HCV) y pestivirus (p. ej., virus del cólera porcino (HOCV) y virus de la diarrea viral bovina (BVDV)) (véase, p. ej., Le y cols., Virus Genes 12: 135-147, 1996; y Le y cols., Nuc. Acids Res. 25: 362-369, 1997). Un ejemplo de un elemento 2A incluye la secuencia F2A del virus de la fiebre aftosa.
En ciertas realizaciones, los vectores proporcionados en la presente memoria también contienen elementos genéticos adicionales para lograr un resultado deseado. Por ejemplo, ciertos vectores virales pueden incluir una señal que facilite la entrada nuclear del genoma viral en la célula diana, como una señal de “colgajo” de VIH-1. Como ejemplo adicional, ciertos vectores virales pueden incluir elementos que facilitan la caracterización del sitio de integración del provirus en la célula diana, como una secuencia supresora ámbar de ARNt. Ciertos vectores virales pueden contener uno o más elementos genéticos diseñados para mejorar la expresión del gen de interés. Por ejemplo, se puede colocar un elemento sensible al virus de la hepatitis de la marmota (WRE) en el constructo (véase, p. ej., Zufferey y cols., J. Virol.
74: 3668-3681, 1999; y Deglon y cols., Hum. Gene Ther. 11: 179-190, 2000). Como otro ejemplo, también se puede incluir en el constructo un aislante de p-globina de pollo. Se ha demostrado que este elemento reduce la posibilidad de silenciar el ADN integrado en la célula diana debido a los efectos de metilación y heterocromatización. Además, el aislante puede proteger el amplificador interno, el promotor y el gen exógeno de los efectos posicionales positivos o negativos del ADN circundante en el sitio de integración en el cromosoma. Ciertas realizaciones emplean cada uno de estos elementos genéticos. En otra realización, los vectores virales proporcionados en la presente memoria también pueden contener un elemento de apertura de cromatina ubicuo (UCOE) para aumentar la expresión (véase p. ej., Zhang F, y cols., Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy 2010 Sep;18(9): 1640-9).
En ciertas realizaciones, los vectores virales (p. ej., retroviral, lentiviral) proporcionados en la presente memoria están "pseudotipados" con una o más glicoproteínas virales seleccionadas o proteínas de la cubierta, principalmente para dirigirse a tipos de células seleccionados. La pseudotipificación se refiere generalmente a la incorporación de una o más glicoproteínas virales heterólogas en la superficie celular de la partícula de virus, lo que a menudo permite que la partícula de virus infecte una célula seleccionada que difiere de sus células diana habituales. Un elemento "heterólogo" deriva de un virus distinto del virus del que se deriva el ARN genómico del vector viral. Normalmente, se han alterado genéticamente las regiones que codifican glicoproteínas del vector viral, como mediante supresión para evitar la expresión de su propia glicoproteína. Simplemente a modo de ilustración, normalmente se eliminan las glicoproteínas gp41 y/o gp120 de la cubierta de un vector lentiviral derivado del VIH antes de la pseudotipificación con una glicoproteína viral heteróloga.
En ciertas realizaciones, el vector viral se pseudotipifica con una glicoproteína viral heteróloga que se dirige a los linfocitos B. En ciertas realizaciones, la glicoproteína viral permite la infección selectiva o la transducción de linfocitos B en reposo o quiescentes. En ciertas realizaciones, la glicoproteína viral permite la infección selectiva de células plasmáticas de linfocitos B, plasmablastos y células B activadas. En ciertas realizaciones, la glicoproteína viral permite la infección o la transducción de linfocitos B quiescentes, plasmablastos, células plasmáticas y células B activadas. En ciertas realizaciones, la glicoproteína viral permite la infección de células de leucemia linfocítica crónica de células B. En una realización, el vector viral se pseudotipifica con VSV-G. En otra realización, la glicoproteína viral heteróloga se deriva de la glicoproteína del virus del sarampión, como el virus del sarampión de Edmonton. Ciertas realizaciones pseudo-tipifican las glicoproteínas de hemaglutinina (H) del virus del sarampión, proteína de fusión (F) o ambas (véase, p. ej., Frecha y cols., Blood. 112: 4843-52, 2008; y Frecha y cols., Blood. 114: 3173-80, 2009). En una realización, el vector viral se pseudotipifica con el virus de la leucemia del simio gibón (GALV). En realizaciones adicionales, el vector viral comprende un dominio insertado de unión al anticuerpo, como una o más regiones variables (p. ej., regiones variables de cadena pesada y ligera) que sirve para dirigir el vector a un tipo de célula particular.
La generación de vectores virales se puede lograr usando cualquier técnica de ingeniería genética adecuada conocida en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, las técnicas estándar de digestión con endonucleasas de restricción, ligadura, transformación, purificación de plásmidos, amplificación por PCR y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describe en Sambrook y cols. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin y cols. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) y "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).
Se puede usar cualquier variedad de métodos conocidos en la técnica para producir partículas retrovirales adecuadas cuyo genoma comprenda una copia de ARN del vector viral. Como un método, el vector viral se puede introducir en una línea celular de empaquetamiento que empaqueta el ARN genómico viral basado en el vector viral en partículas virales con una especificidad de célula diana deseada. La línea celular de empaquetamiento generalmente proporciona en trans las proteínas virales que se requieren para empaquetar el ARN genómico viral en partículas virales e infectar la célula diana, que incluye las proteínas estructurales gag, las proteínas enzimáticas pol y las glicoproteínas de la envuelta.
En ciertas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento expresa de manera estable ciertas proteínas virales necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol) (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N°. 6.218.181). En ciertas realizaciones, la línea celular de empaquetamiento se transfecta transitoriamente con plásmidos que codifican algunas de las proteínas virales necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol, glicoproteína), que incluyen las secuencias de glicoproteína del virus del sarampión descritas en la presente memoria. En una realización ejemplar, la línea celular de empaquetamiento expresa de manera estable las secuencias gag y pol, y después la línea celular se transfecta con un plásmido que codifica el vector viral y un plásmido que codifica la glicoproteína. Después de la introducción de los plásmidos deseados, las partículas virales se recogen y procesan como corresponde, como por ultracentrifugación, para lograr un stock concentrado de partículas virales. Ejemplos de líneas celulares de empaquetamiento incluyen las líneas celulares 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430).
Gen de interés
Como se usa en la presente memoria, "gen de interés" o "gen" o "ácido nucleico de interés" se refiere a un transgén que se va a expresar en la célula diana transfectada. Si bien se puede usar el término "gen", esto no implica que se trate de un gen que se encuentra en el ADN genómico, y se usa indistintamente con el término "ácido nucleico". Generalmente, el ácido nucleico de interés proporciona un ácido nucleico adecuado para codificar la proteína de interés y puede comprender ADNc o ADN y puede incluir o no intrones, pero generalmente no incluye intrones. Como se indicó en otra parte, el ácido nucleico de interés está unido operativamente a las secuencias de control de la expresión para expresar eficazmente la proteína de interés en la célula diana. En ciertas realizaciones, los vectores descritos en la presente memoria pueden comprender uno o más genes de interés y pueden incluir 2, 3, 4 o 5 o más genes de interés, como por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina que se pueden organizar usando un promotor interno como se describe en la presente memoria.
La mención "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en la presente memoria, designa ARNm, ARN, ARNc, ADNc o ADN. El término normalmente se refiere a la forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN y ARN. El ácido nucleico o gen de interés puede ser cualquier ácido nucleico que codifique una proteína de interés.
Una proteína de interés para su uso como se describe en la presente memoria comprende cualquier proteína que proporcione una actividad deseada. En este sentido, una proteína de interés incluye, pero no se limita a, un anticuerpo o fragmento de este de unión a antígeno, un receptor de superficie celular, una proteína secretada como una citoquina (linfoquinas, interleuquinas, interferones o quimioquinas), otras moléculas secretadas de señalización como TGF-beta y factor de crecimiento de fibroblastos, un fragmento antigénico de una proteína, una molécula pequeña codificada por ADN (véase, p. ej., Nature Chemical Biology 5, 647-654 (2009), una enzima, un factor de coagulación y una molécula de adhesión. En una realización, el ácido nucleico codifica un anticuerpo o un fragmento de este de unión a antígeno. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. En una realización, el ácido nucleico codifica la proteína de interés como una proteína de fusión que comprende un enlazador escindible. Por ejemplo, la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo pueden expresarse con un péptido enlazador autoescindible, p. ej., F2A.
En una realización, el anticuerpo codificado por el ácido nucleico comprende al menos el dominio de unión al antígeno del anticuerpo neutralizante del VIH, b12 (véase, p. ej., J Virol 2003, 77: 5863-5876; J Virol. 1994 agosto; 68(8): 4821-8; Proc Natl Acad Sci U S A. 1992, 89: 9339-9343; se proporcionan ejemplos de secuencias en los números de acceso de GenBank para la cadena ligera b12 (AAB26306.1 GI 299737) y la cadena pesada (AAB26315.1 GI 299746). En una realización adicional, el anticuerpo codificado por el ácido nucleico de interés comprende Fuzeon™ (T-20/enfuvirtida/pentafusida/DP-178). DP-178 es una secuencia de aminoácidos de gp41 en el VIH e interfiere con la capacidad del VIH para fusionarse con su célula diana. Fuzeon se puede producir sintéticamente usando métodos conocidos por los expertos (véase p. ej., 2001 J. Virol. 75: 3038-3042; cabe señalar que es muy poco probable que los métodos descritos en este documento den como resultado la secreción de una dosis terapéutica del péptido DP-178).
En una realización particular, el ácido nucleico de interés codifica una proteína inmunológicamente activa. En determinadas realizaciones, un ácido nucleico de interés codifica una proteína o un fragmento biológicamente activo de esta (p. ej., un fragmento antigénico), que induce una reacción inmune similar a la de una vacuna a través de la presentación de la proteína en la superficie de una célula B, una célula T u otra célula inmune. En ciertas realizaciones, la proteína de interés influye en la regulación de las células B, por ejemplo, pero no se limita a promover la división celular, promover la diferenciación en diferentes linajes B, inactivar o matar células, o regula la producción o actividad de otros elementos de ADN introducidos. Las interleuquinas son conocidas por los expertos y hasta la fecha incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL -23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, forma secretada de la subunidad p28 de IL27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL- 33, IL-34 e IL-35. Los interferones incluyen IFN-y, IFN-a, IFN-p e IFN-o. Las quimioquinas contempladas para su uso en la presente memoria incluyen las quimioquinas de tipo C, XCL1 y XCL2, las quimioquinas de tipo C-C (que hasta la fecha incluyen CCL1 - CCL28) y las quimioquinas de tipo CXC (que hasta la fecha incluyen CXCL1 -CXCL17). También se contemplan como un gen de interés los miembros de la superfamilia del TNF (p. ej., TNF-a, ligando Bb 4-1, factor activador de células B, ligando FAS, linfotoxina, OX40L RAn Kl y TRAIL).
En ciertas realizaciones, la proteína de interés induce tolerancia inmunológica. En este sentido, la proteína de interés puede comprender una proteína de fusión IgG-antígeno (véase, p. ej., Cellular Immunology 235(1), 2005, 12-20). En determinadas realizaciones, la expresión de una proteína de interés puede ir acompañada de la estimulación de las células con factores como TGF-p, IL-10 y LPS. En ciertas realizaciones, factores tales como IL-10 o factores de transcripción que inducen tolerancia se expresan con las células B cultivadas.
En otra realización, el(los) gen(es) de interés codifica(n) uno o más factores que promueven la diferenciación de la célula B en una célula secretora de anticuerpos y/o uno o más factores que promueven la longevidad de la célula productora de anticuerpos. Dichos factores incluyen, por ejemplo, Blimp-1, Xbp1, IRF4, Zbtb20, TRF4, factores antiapoptóticos como Bcl-xl, Bcl-2, Mcl-1 o Bcl5, mutantes constitutivamente activos del receptor CD40. Otros genes de interés codifican factores que promueven la expresión de moléculas de señalización corriente abajo, como los factores asociados al receptor de TNF (TRAFs). En este sentido, la activación celular, la supervivencia celular y las funciones antiapoptóticas de la superfamilia de receptores TNF están mediadas principalmente por TRAF 1-6 (véase p. ej., RH. Arch y cols., Genes Dev. 12 (1998), págs. 2821-2830). Los efectores corriente abajo de la señalización de TRAF incluyen factores de transcripción en la familia NF-KB y AP-1 que pueden activar genes implicados en varios aspectos de las funciones celulares e inmunes. Además, se ha demostrado que la activación de NF-Kp y AP-1 proporciona protección celular contra la apoptosis a través de la transcripción de genes antiapoptóticos. En una realización adicional, el factor codificado, como IL-10, IL-35, TGF-beta o una proteína de fusión Fc, está asociado con la inducción de tolerancia inmune.
En una realización adicional, el(los) ácido(s) nucleico(s) de interés codifica(n) una o más proteínas derivadas del virus de Epstein Barr (EBV). Las proteínas derivadas de EBv incluyen, pero no se limitan a, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, Eb ER, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA y EBV-AN. En una realización particular, el ácido nucleico de interés codifica un anticuerpo o un fragmento de este que se une al antígeno. En este sentido, el anticuerpo puede ser un anticuerpo natural o un anticuerpo modificado mediante ingeniería recombinante personalizada. Se contemplan específicamente las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo o una porción de este para ser codificadas por los vectores descritos en la presente memoria.
En una realización, un anticuerpo o fragmento de este de acuerdo con la presente descripción tiene una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-VIH, como el anticuerpo anti-VIH m36 (véase, p. ej., Proc Natl Acad Sci U S A.
2008 Nov 4; 105(44): 17121-6), o una molécula de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-VIH, como m36. En particular, se contemplan específicamente proteínas de fusión que comprenden m36, o derivados de esta, como m36L2CD4Fc (véase, p. ej., Antiviral Research volumen 88, número 1, octubre 2010, páginas 107-115). En una realización, el anticuerpo anti-VIH es el anticuerpo monoclonal ampliamente neutralizante VRC01 (véase, p. ej, Wu y cols., Science, 2010, 329 (5993): 856861 y Li y cols., J Virol, 2011,85(17): 8954-8967).
En una realización adicional, el anticuerpo codificado por el transgén de la descripción se une a un autoantígeno. En ciertas realizaciones, el autoantígeno en este aspecto está asociado con el desarrollo de esclerosis múltiple o diabetes tipo 1, que incluyen, pero no se limitan a, MBP, alfaB-cristalina, S100beta, proteína proteolipídica (PLP), HSP105, isoforma epitelial del antígeno 1 (BPAG1-e) del penfigoide ampolloso (BP), lípidos y glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG)-alfa e isoformas de MOG-beta o cualquiera de una variedad de autoantígenos de células de los islotes (p. ej., sialoglucolípido, glutamato descarboxilasa, insulina, receptor de insulina, 38 kD, albúmina de suero bovino, transportador de glucosa, hsp 65, carboxipeptidasa H, 52 kD, ICA 12/ICA512, 150 kD y RIN polar). Se conocen en la técnica los anticuerpos contra estos autoantígenos y se pueden secuenciar y producir de forma recombinante usando técnicas de rutina (véase, p. ej., J. Clin. Invest. 107(5): 555-564 (2001)).
En una realización adicional, el anticuerpo se une a un antígeno asociado a cáncer. Los antígenos asociados con cáncer pueden derivar de una variedad de proteínas tumorales. Las proteínas tumorales ilustrativas útiles en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, una o más de p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, - 4, -5, -6, -7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1 R, Gp100, PSA, Ps M, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her2/neu (p. ej., el anticuerpo puede derivar del mAb específico de Her2, Herceptin (R)), hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, p-catenina/m, Caspasa-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miosina/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARa y t El/AML1. Estas y otras proteínas tumorales son conocidas por el experto en la materia.
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de interés codifica un péptido u otro dominio de unión con un atributo funcional particular, como, pero no se limita a, actividad inhibidora, capacidad para inducir la muerte celular en células cancerosas o capacidad para retardar o inhibir la proliferación celular cancerígena. En este sentido, en una realización, un péptido o dominio de unión codificado por el ácido nucleico de interés puede unirse a cualquiera de las proteínas objetivo descritas en la presente memoria, como un antígeno asociado a cáncer como se describe anteriormente, c D4, gp120 de VIH u otra proteína viral, ICAM-3, DC-SIGN (véase, p. e j, Patente de EE.UU. 7.301.010). En ciertas realizaciones, los péptidos pueden derivar de bacterias patógenas y no patógenas y plantas verdes. Los péptidos ilustrativos se describen en las patentes de EE.UU. 7084105, 7301010, 7338766, 7381701, 7491394, 7511117, 7556810. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica azurina-p28 (NSC745104), un inhibidor peptídico de la ubiquitinación de p53 (véase, p. ej., Cancer Chemother Pharmacol 2010, DOI 10.1007/S00280-010-1518-3; Patente de EE.UU. 7.084.105). En una realización adicional, el ácido nucleico de interés codifica un factor conocido como grelina, que induce el apetito y se puede usar para tratar pacientes con cáncer (véase, p. ej., Obes. Facts. 2010 3: 285-92; FASEB J. 18(3): 439-56). En otra realización, el ácido nucleico de interés codifica un péptido de unión que se une e inhibe la angiopoyetina 1 y 2 (véase, p. ej., AMG386, un fragmento Fc de un anticuerpo (pepticuerpo) usado para tratar el cáncer; en ciertas realizaciones, los antígenos tumorales se pueden identificar directamente a partir de un individuo con cáncer. En este sentido, se pueden llevar a cabo cribados que usan una variedad de tecnologías conocidas. Por ejemplo, en una realización, se toma una biopsia de tumor de un paciente, se aísla el ARN de las células tumorales y se analiza usando un chip genético (por ejemplo, de Affymetrix, Santa Clara, CA) y se identifica un antígeno tumoral. Una vez que se identifica el antígeno tumoral diana, se puede clonar, expresar y purificar usando técnicas conocidas en la técnica.
En una realización particular, el ácido nucleico de interés codifica una enzima. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica una enzima para tratar un trastorno de almacenamiento lisosomal. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica la iduronidasa (IDUA) para el tratamiento o la prevención de la mucopolisacaridosis tipo I (MPS I). En una realización, el ácido nucleico de interés codifica idursulfasa para el tratamiento o la prevención de la mucopolisacaridosis tipo II (MPS II). En una realización, el ácido nucleico de interés codifica galsulfasa para el tratamiento o prevención de la mucopolisacaridosis tipo VI (MPS VI). En una realización, el ácido nucleico de interés codifica elosulfasa alfa para el tratamiento o la prevención de la mucopolisacaridosis tipo IVA (MPS IVA). En una realización, el ácido nucleico de interés codifica agalsidasa beta para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Fabry. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica agalsidasa beta para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Fabry. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica alfa-1-antitripsina para el tratamiento o prevención de la deficiencia de alfa-1 -antitripsina. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica alfa-N-acetilglucosaminidasa para el tratamiento o prevención de la mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB). En otra realización, el ácido nucleico de interés codifica el factor VII para el tratamiento o prevención de la hemofilia. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) útil para el tratamiento o la prevención de, p. ej., la deficiencia de LCAT y la aterosclerosis. En otra realización, el ácido nucleico de interés codifica la apolipoproteína A-1 Milano (ApoA-1 Milano) para el tratamiento o la prevención de enfermedades y trastornos cardiovasculares, como, p. ej., aterosclerosis. En una realización, el ácido nucleico de interés codifica la lipoproteína lipasa (LPL) para el tratamiento o la prevención de la deficiencia de LPL. En otra realización, el ácido nucleico de interés codifica un anticuerpo ampliamente neutralizante (bNAb), o una proteína de fusión de este, que une y neutraliza múltiples cepas de VIH-1 (p. ej., b12). En otra realización más, el ácido nucleico de interés codifica la fenilalanina hidroxilasa para el tratamiento o la prevención de la fenilcetonuria (PKU).
Un "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales; primatizado (p. ej., humanizado); murino; ratón-humano; ratón-primate; y quimérico; y puede ser una molécula intacta, un fragmento de esta (como fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2), o multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos; y puede darse en la naturaleza o ser producido, p. ej., mediante inmunización, síntesis o ingeniería genética; un "fragmento de anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a fragmentos, derivados de o relacionados con un anticuerpo, que se unen al antígeno y que en algunas realizaciones se pueden derivatizar para exhibir características estructurales que facilitan la eliminación y la absorción, p. ej., mediante la incorporación residuos de galactosa. Esto incluye, p. ej., F(ab), F(ab)'2, scFv, región variable de la cadena ligera (VL), región variable de la cadena pesada (VH) y combinaciones de estas. Las fuentes incluyen secuencias de genes de anticuerpos de varias especies (que se pueden dar formato de anticuerpos, sFvs, scFvs o Fabs, como en una biblioteca de fagos), incluidos humanos, camélidos (a partir de camellos, dromedarios o llamas); Hamers-Casterman y cols. (1993) Nature, 363: 446 y Nguyen y cols. (1998) J. Mol. Biol., 275: 413), tiburón (Roux y cols. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 11804), pez (Nguyen y cols. (2002) Immunogenetics, 54: 39), roedores, aves, ovinos, secuencias que codifican bibliotecas de péptidos aleatorias o secuencias que codifican una diversidad diseñada de aminoácidos en regiones bucle de estructuras alternativas que no son anticuerpos, como dominios de fibrinógeno (véase, p. ej., Weisel y cols. (1985) Science 230: 1388), dominios de Kunitz (véase, p. ej., Patente de EE.UU. N°. 6.423.498), dominios de lipocalina (véase, p. ej., documento WO 2006/095164), dominios tipo V (véase, p. ej., Publicación de Solicitud de Patente de EE.u U. N°.
2007/0065431), dominios de lectina tipo C (Zelensky y Gredy (2005) FEBS J. 272: 6179), mAb<2> o Fcab(TM) (véase, p. ej., Publicación de Solicitud de Patente PCT N°s. WO 2007/098934; WO 2006/072620), o similares.
Los términos entendidos por los especialistas en la técnica referentes a la tecnología de anticuerpos reciben cada uno el significado adquirido en la técnica, a menos que se definan expresamente en la presente memoria. Por ejemplo, los términos "VL" y "VH" se refieren a la región de unión variable derivada de una cadena ligera y pesada de anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variable están formadas por subregiones discretas bien definidas conocidas como "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR) y "regiones marco" (FR). Los términos "CL" y "CH" se refieren a una "región constante de inmunoglobulina", es decir, una región constante derivada de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo, respectivamente, entendiéndose que la última región se divide en los dominios de región constante Cm, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) del que se deriva la región. La región Fc (la región "fragmentable cristalizable") constituye una parte de los dominios de la región constante que contiene dominios responsables de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores Fc, mayor vida media in vivo en relación con un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteína A y quizás incluso transferencia placentaria (véase Capón y cols. (1989) Nature, 337: 525). Además, un polipéptido que contiene una región Fc permite la dimerización o multimerización del polipéptido.
La estructura de dominio de las inmunoglobulinas es susceptible de diseño, ya que los dominios de unión a antígeno y los dominios que confieren funciones efectoras se pueden intercambiar entre clases y subclases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos (p. ej., supresiones, inserciones, sustituciones) pueden alterar los procesos postraduccionales de la inmunoglobulina, como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación y/o fucosilación. Se conocen en la técnica métodos para mejorar la ADCC a través de la glicosilación y se contemplan para su uso en la presente memoria. Por ejemplo, las enzimas que mejoran la glicosilación pueden expresarse junto con el anticuerpo. En una realización, MGAT3 se sobreexpresa en células que producen el anticuerpo para mejorar la glicosilación del anticuerpo y su función ADCC. En una realización, la inhibición de Fut8 a través de, p. ej., siRNA, mejora la glicosilación del anticuerpo y la ADCC.
La estructura y la función de las inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow y cols., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). En el libro de texto Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, NY, 1999) se puede encontrar una introducción extensa, así como información detallada sobre todos los aspectos de la tecnología de anticuerpos recombinantes. Se puede encontrar una colección completa de protocolos detallados de laboratorio de ingeniería de anticuerpos en R. Kontermann y S. Dubel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/Nueva York, 2000). Otros protocolos relacionados también están disponibles en Current Protocols in Immunology (agosto de 2009), publicado por John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA. Los métodos para la producción de enzimas y la ingeniería de proteínas (p. ej., IDUA) también se conocen en la técnica y se contemplan para su uso en la presente memoria.
Por lo tanto, esta descripción proporciona polinucleótidos (polinucleótidos aislados o purificados o puros) que codifican las proteínas de interés de esta descripción para modificar genéticamente las células B, los vectores (que incluyen los vectores de clonación y los vectores de expresión) que comprenden dichos polinucleótidos y las células (p. ej., células huésped) transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector de acuerdo con esta descripción. En ciertas realizaciones, se contempla un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica una proteína de interés de esta descripción. También se contemplan en la presente memoria casetes de expresión que codifican proteínas de interés.
La presente descripción también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido de esta descripción y, en particular, a constructos de expresión recombinantes. En una realización, esta descripción contempla un vector que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de esta descripción, junto con otras secuencias de polinucleótidos que producen o facilitan la transcripción, traducción y procesamiento de dichas secuencias codificantes de proteínas. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes procarióticos y eucarióticos se describen, por ejemplo, en Sambrook y cols, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Los vectores de clonación/expresión ejemplares incluyen vectores de clonación, vectores lanzadera y constructos de expresión, que se pueden basar en plásmidos, fagémidos, fásmidos, cósmidos, virus, cromosomas artificiales o cualquier vehículo de ácido nucleico conocido en la técnica adecuado para amplificación, transferencia y/o expresión de un polinucleótido contenido en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, a menos que se describa lo contrario con respecto a los vectores virales, "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores ejemplares incluyen plásmidos, minicírculos, transposones, cromosomas artificiales de levadura, ARNs autorreplicantes y genomas virales. Ciertos vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped, mientras que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula huésped y, por tanto, replicarse con el genoma huésped. Además, ciertos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"), que contienen secuencias de ácido nucleico que están unidas operativamente a una secuencia de control de expresión y, por lo tanto, son capaces de dirigir la expresión de esas secuencias. En ciertas realizaciones, los constructos de expresión se derivan de vectores plasmídicos. Los constructos ilustrativos incluyen el vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican un gen de resistencia a ampicilina, una señal de poliadenilación y un sitio promotor de T7; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), que tienen un promotor CHEF1; y pD18 (Lonza), que tiene un promotor de CMV. Se conocen bien otros vectores de expresión de mamíferos adecuados (véase, p. ej., Ausubel y cols., 1995; Sambrook y cols., supra; véase también, p. ej., catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ). Se pueden preparar constructos útiles que incluyan una secuencia codificadora de dihidrofolato reductasa (DHFR) bajo un control regulatorio adecuado, para promover niveles de producción mejorados de las proteínas de fusión, cuyos niveles son resultado de la amplificación génica tras la aplicación de un agente de selección apropiado (p. ej., metotrexato).
Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo, como se describió anteriormente. Un vector unido operativamente con un polinucleótido de acuerdo con esta descripción produce un constructo de clonación o expresión. Los constructos ejemplares de clonación/expresión contienen al menos un elemento de control de la expresión, p. ej., un promotor, unido operativamente a un polinucleótido de esta descripción. También se contemplan en los vectores y constructos de clonación/expresión elementos de control de expresión adicionales, como amplificadores, sitios de unión específicos de factores, terminadores y sitios de unión a ribosomas de acuerdo con esta descripción. La secuencia estructural heteróloga del polinucleótido de acuerdo con esta descripción se ensambla en la fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la traducción. Así, por ejemplo, los ácidos nucleicos codificantes que se proporcionan en la presente memoria se pueden incluir en cualquiera de una variedad de constructos de vectores de expresión (p. ej., minicírculos) como un constructo de expresión recombinante para expresar dicha proteína en una célula huésped.
La(s) secuencia(s) de ADN apropiada(s) se puede(n) insertar en un vector, por ejemplo, mediante una variedad de procedimientos. En general, una secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de escisión de endonucleasas de restricción apropiados mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se contemplan técnicas estándar para clonación, aislamiento de ADN, amplificación y purificación, para reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y diversas técnicas de separación. Se describen varias técnicas estándar, por ejemplo, en Ausubel y cols. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook y cols. (Molecular Cloning, Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis y cols. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (DNA Cloning Vol. I y II, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985); Hames y Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1985); y en otros lugares.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se une operativamente a al menos una secuencia de control de expresión apropiada (p. ej., un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de ARNm. Los ejemplos representativos de tales secuencias de control de la expresión incluyen promotores de células eucariotas o sus virus, como se describió anteriormente. Las regiones promotoras se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa), vectores de kanamicina u otros vectores con marcadores seleccionables. Los promotores eucarióticos incluyen CMV temprano inmediato, HSV timidina quinasa, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados se encuentra dentro del nivel de los expertos en la técnica, y se describe en la presente memoria la preparación de ciertos constructos de expresión recombinantes particularmente preferidos que comprenden al menos un promotor o un promotor regulado unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína o un polipéptido de acuerdo con esta descripción.
También se contemplan variantes de los polinucleótidos de esta descripción. Los polinucleótidos variantes son al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,9 % idénticos a uno de los polinucleótidos de secuencia definida como se describe en la presente memoria, o que hibrida con uno de esos polinucleótidos de secuencia definida en condiciones de hibridación estrictas de cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a aproximadamente 42°C. Las variantes de polinucleótido conservan la capacidad de codificar un dominio de unión o una proteína de fusión de estas que tiene la funcionalidad descrita en la presente memoria.
El término "astringente" se usa para referirse a condiciones que comúnmente se entienden en la técnica como estrictas. La astringencia de la hibridación está determinada principalmente por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes como la formamida. Ejemplos de condiciones astringentes para la hibridación y el lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a aproximadamente 42 °C (véase Sambrook y cols, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). También se pueden usar condiciones más astringentes (como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta u otro agente desnaturalizante); sin embargo, se verá afectada la tasa de hibridación. En los casos en los que se trata de la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones de hibridación astringentes ejemplares adicionales incluyen lavado en SSC 6x, pirofosfato de sodio al 0,05 % a 37 °C (para oligonucleótidos de 14 bases), 48 °C (para oligonucleótidos de 17 bases), 55 °C (para oligonucleótidos de 20 bases) y 60°C (para oligonucleótidos de 23 bases).
Un aspecto adicional de esta descripción proporciona una célula huésped transformada o transfectada con cualquiera de los polinucleótidos o vectores/constructos de expresión de esta descripción, o que los contiene de otro modo. Los polinucleótidos o constructos de clonación/expresión de esta descripción se introducen en células adecuadas usando cualquier método conocido en la técnica, que incluyen transformación, transfección y transducción. Las células huésped incluyen las células de un sujeto que se somete a terapia celular ex vivo que incluye, por ejemplo, terapia génica ex vivo. Las células huésped eucarióticas contempladas como un aspecto de esta descripción cuando contienen un polinucleótido, vector o proteína de acuerdo con esta descripción incluyen, además de las propias células de un sujeto (p. ej., las propias células de un paciente humano), células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) (que incluyen células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glicosilación de las moléculas de unión multivalente expresadas, véase la publicación de la solicitud de Patente de EE.UU. N°.2003/01 15614), células COS (como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células HEK293, células HepG2, células N, células 3T3, células Spodoptera frugiperda (p. ej., células Sf9), células de Saccharomyces cerevisiae y cualquier otra célula eucariota conocida en la técnica que sea útil para expresar, y opcionalmente aislar, una proteína o un péptido de acuerdo con esta descripción. También se contemplan células procarióticas, que incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, un estreptomiceto, o cualquier célula procariótica conocida en la técnica que sea adecuada para expresar, y opcionalmente aislar, una proteína o péptido de acuerdo con esta descripción. En el aislamiento de proteínas o péptidos de células procarióticas, en particular, se contempla que se pueden usar técnicas conocidas en la técnica para extraer proteínas de cuerpos de inclusión. La selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente memoria. Se contemplan células huésped que glicosilan las proteínas de fusión de esta descripción.
El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") se refiere a una célula que contiene un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no sólo a la célula objeto particular sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero está incluida aún dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente memoria. Las células huésped recombinantes se pueden cultivar en un medio de nutrientes convencional modificado según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar genes particulares. Las condiciones de cultivo para células huésped particulares seleccionadas para la expresión, como temperatura, pH y similares, serán fácilmente evidentes para el experto en la materia. También se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritos por Gluzman (1981) Cell 23: 175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado y, opcionalmente, un amplificador, y también cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación transcripcionales y secuencias no transcritas flanqueantes en 5', por ejemplo, como se describe en la presente memoria con respecto a la preparación de constructos de expresión de proteína de unión multivalente. Se pueden usar las secuencias de ADN derivadas del corte y empalme de SV40 y los sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. La introducción del constructo en la célula huésped se puede efectuar mediante una variedad de métodos con los que los expertos en la técnica estarán familiarizados, que incluyen la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano o la electroporación (Davis y cols. (1986) Basic Methods in Molecular Biology).
Células y composiciones
En una realización, las composiciones de células B descritas en la presente memoria utilizan células B de memoria al comienzo del cultivo in vitro y demuestran mayor supervivencia in vivo en comparación con las células B vírgenes que se someten al mismo tratamiento. En otra realización, las composiciones de células B descritas en la presente memoria utilizan células B vírgenes al comienzo del cultivo in vitro. En una realización, las composiciones de células B descritas en la presente memoria utilizan células pan B al comienzo del cultivo in vitro. En una realización, la población de células de partida comprende células B vírgenes y células B de memoria.
En una realización, las composiciones celulares descritas en la presente memoria comprenden células B que se han activado/diferenciado in vitro y transfectado para expresar una proteína de interés como se describe en la presente memoria. En una realización, las composiciones comprenden células B que se han diferenciado en células B plasmáticas, se han transfectado y expresan una o más proteínas de interés. Las poblaciones de células diana, como las poblaciones de células B transfectadas y activadas de la presente descripción se pueden administrar solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes como citoquinas o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones celulares de la presente descripción pueden comprender una población de células B diferenciadas y activadas que ha sido transfectada y expresa una proteína de interés como se describe en la presente memoria, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato, solución de Lactato de Ringer y similares; carbohidratos como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes como EDTA o glutation; adyuvantes (p. ej., hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente descripción se formulan preferiblemente para administración intravenosa o subcutánea.
En una realización, se evalúa la pureza de una composición celular antes de la administración. En otra realización, se prueba la robustez de la producción del agente terapéutico en una composición celular. En una realización, se prueba la esterilidad de una composición celular. En otra realización, se analiza una composición celular para confirmar que coincide con el sujeto receptor.
En una realización, una composición de células se almacena y/o transporta a 4°C. En otra realización, una composición de células se congela para su almacenamiento y/o envío. Una composición celular se puede congelar a, p. ej., -20°C o -80°C. En una realización, una etapa de congelación de una composición celular comprende nitrógeno líquido. En una realización, una composición de células se congela usando un congelador de velocidad controlada. Por consiguiente, los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir además una etapa de descongelación.
Métodos de uso
Debido a la mayor supervivencia in vivo demostrada por las composiciones celulares a partir de poblaciones de células B de memoria, las composiciones celulares descritas en la presente memoria son particularmente adecuadas para la administración a largo plazo in vivo de un agente terapéutico. Sin embargo, las composiciones de células B de poblaciones de células pan B o vírgenes iniciales también son útiles para la administración in vivo de un agente terapéutico. En realizaciones particulares, las composiciones celulares se usan en métodos para tratar y/o prevenir enfermedades y trastornos crónicos.
Las composiciones celulares descritas en la presente memoria se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad o trastorno a tratar o prevenir. La cantidad y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar las dosis apropiadas mediante ensayos clínicos.
Cuando se indica "una cantidad eficaz", "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", se puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente descripción que se administrará por un médico que tenga en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). Las composiciones de células B también se pueden administrar múltiples veces en una dosis apropiada. Las células se pueden administrar usando técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, p. ej., Rosenberg y cols., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente particular mediante el seguimiento del paciente en busca de signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia. El tratamiento también se puede ajustar después de medir los niveles de un agente terapéutico (p. ej., un gen o proteína de interés) en una muestra biológica (p. ej., fluido corporal o muestra de tejido) y también se puede usar para evaluar la eficacia del tratamiento, y el tratamiento se puede ajustar en consecuencia para aumentar o disminuir. Generalmente, en estudios de inmunoterapia adoptiva relacionados, las células T específicas de antígeno se administran aproximadamente de 2x109 a 2x1011 células al paciente. (Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N°. 5.057.423). En algunos aspectos de la presente descripción, se pueden administrar números más bajos de las células B transfectadas de la presente descripción, en el intervalo de 106/kilogramo (106­ 1011 por paciente). En ciertas realizaciones, las células B se administran a 1x104, 5x104, 1x105, 5x105, 1x106, 5x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, o 1x1012 células al sujeto. Las composiciones de células B se pueden administrar múltiples veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser autólogas o heterólogas para el paciente que se somete a la terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenos (p. ej., PHA) o linfoquinas, citoquinas y/o quimioquinas (p. ej., GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1a, etc.) como se describe en la presente memoria para mejorar la inducción de una respuesta inmune y el injerto de las células B infundidas.
La administración de las composiciones en cuestión se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente, que incluyen por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en la presente memoria se pueden administrar a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraganglionar, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células B de la presente descripción se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra realización, las composiciones de células B como se describen en la presente memoria se administran preferiblemente por inyección i.v. Las composiciones de células B se pueden inyectar directamente en un tumor, ganglio linfático, médula ósea o sitio de infección.
En otra realización más, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba (véase Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald y cols., 1980; Surgery 88: 507; Saudek y cols., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, 1974, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York; Ranger y Peppas, 1983; J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véase también Levy y cols., 1985, Science 228: 190; Durante y cols., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard y cols., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada en la proximidad de la diana terapéutica, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p.ej., Medical Applications of Controlled Release, 1984, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., vol. 2, págs. 115-138).
Las composiciones de células B de la presente descripción también se pueden administrar usando cualquier número de matrices. Las matrices se han utilizado durante varios años en el contexto de la ingeniería de tejidos (véase, p.ej., Principles of Tissue Engineering (Lanza, Langer y Chick (eds.)), 1997. La presente descripción utiliza tales matrices dentro del contexto novedoso de actuar como un órgano linfoide artificial para apoyar y mantener las células B. Por consiguiente, la presente descripción puede utilizar aquellas composiciones y formulaciones de matriz que han demostrado utilidad en la ingeniería de tejidos. Por consiguiente, es virtualmente ilimitado el tipo de matriz que se puede usar en las composiciones, dispositivos y métodos de la descripción y puede incluir matrices tanto biológicas como sintéticas. En un ejemplo particular, se utilizan las composiciones y dispositivos expuestos por las Patentes de EE.UU. N°s: 5.980.889; 5.913.998; 5.902.745; 5.843.069; 5.787.900; o 5.626.561. Las matrices comprenden características comúnmente asociadas con ser biocompatibles cuando se administran a un huésped mamífero. Las matrices se pueden formar a partir de materiales naturales y/o sintéticos. Las matrices pueden ser no biodegradables en los casos en que sea deseable dejar estructuras permanentes o estructuras extraíbles en el cuerpo de un animal, como un implante; o biodegradables. Las matrices pueden adoptar la forma de esponjas, implantes, tubos, almohadillas de Telfa, fibras, fibras huecas, componentes liofilizados, geles, polvos, composiciones porosas o nanopartículas. Además, las matrices se pueden diseñar para permitir la liberación sostenida de células sembradas o citoquinas producidas u otro agente activo. En ciertas realizaciones, la matriz de la presente descripción es flexible y elástica, y se puede describir como una estructura semisólida que es permeable a sustancias como sales inorgánicas, fluidos acuosos y agentes gaseosos disueltos, incluido el oxígeno.
En la presente memoria se usa una matriz como ejemplo de una sustancia biocompatible. Sin embargo, la descripción actual no se limita a las matrices y, por lo tanto, siempre que aparezca el término matriz o matrices, estos términos deben leerse para incluir dispositivos y otras sustancias que permitan la retención celular o el traspaso celular, sean biocompatibles y sean capaces de permitir el traspaso de macromoléculas, ya sea directamente a través de la sustancia, de modo que la sustancia misma sea una membrana semipermeable, o se use junto con una sustancia semipermeable particular.
En ciertas realizaciones de la presente descripción, se administran células B transfectadas y activadas que usan los métodos descritos en la presente memoria, u otros métodos conocidos en la técnica, a un paciente junto con (p. ej. antes, simultáneamente o después) de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento con agentes como agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, bisulfina, bortezomib, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la calcineurina fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506), el proteosoma (bortezomib) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu y cols., Cell 66: 807-815, 1991; Henderson y cols., Immun. 73: 316-321, 1991; Bierer y cols., Curr. Opinión Immun. 5: 763-773, 1993; Isoniemi (supra)). En una realización adicional, las composiciones celulares de la presente descripción se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultáneamente o después) de un trasplante de médula ósea, terapia de ablación de células T usando agentes de quimioterapia como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En una realización, las composiciones celulares de la presente descripción se administran después de una terapia de eliminación de células B, como agentes que reaccionan con CD20, p. ej. Rituxan®. En una realización, las composiciones celulares de la presente descripción se administran después de la terapia de eliminación de células B usando un agente como bortezomib. Por ejemplo, en una realización, los sujetos se pueden someter a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente descripción. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
La dosis de los tratamientos anteriores a administrar a un paciente variará con la naturaleza precisa de la afección que se está tratando y del receptor del tratamiento. La escala de las dosis para la administración humana se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica.
Se pueden usar las composiciones de células B transfectadas de la descripción, particularmente las células B transfectadas para expresar un anticuerpo particular de interés, en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades infecciosas, cánceres, enfermedades degenerativas y trastornos inmunológicos.
Se pueden usar las composiciones que comprenden las células B transfectadas como se describe en la presente memoria en el tratamiento de cualquiera de una variedad de enfermedades infecciosas causadas por organismos infecciosos, como virus, bacterias, parásitos y hongos. Los organismos infecciosos pueden comprender virus, (p. ej., virus de ARN, virus de ADN, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B y C, virus del herpes simple (VHS), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus del papiloma humano (VPH)), parásitos (p. ej., protozoos y metazoos patógenos como especies de Plasmodio, especies de Leishmania, especies de esquistosoma, especies de tripanosoma), bacterias (p. ej., Micobacteria, en particular, M. tuberculosis, Salmonella, Estreptococo, E. coli, Estafilococo), hongos (p. ej., especies de Cándida, especies de Aspergillus), Pneumocystis carinii y priones (priones conocidos que infectan a los animales y causan la tembladera, una enfermedad transmisible, degenerativa del sistema nervioso de ovejas y cabras, así como la encefalopatía espongiforme bovina (BSE), o "enfermedad de las vacas locas", y la encefalopatía espongiforme felina de los gatos. Cuatro enfermedades priónicas que afectan a los humanos son (1) kuru, (2) enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) e (4) insomnio familiar fatal (FFI)). Como se usa en la presente memoria, "prión" incluye todas las formas de priones que causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquier animal usado, y en particular en humanos y animales de granja domesticados. Las enfermedades infecciosas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, toxoplasmosis, histoplasmosis, CMV, EBV, coccidiomicosis, tuberculosis, VIH y similares.
En ciertas realizaciones, también se pueden usar las composiciones de células B transfectadas como se describe en la presente memoria para la prevención o el tratamiento de una variedad de cánceres. A este respecto, en ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden células B transfectadas son útiles para prevenir o tratar melanoma, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, leucemia, plasmocitoma, sarcoma, glioma, timoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, cáncer de útero, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, cáncer gástrico, cáncer de esófago, mieloma múltiple, hepatoma, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC) y leucemia linfocítica crónica (LLC) u otros tipos de cáncer.
En una realización, las células B transfectadas también se pueden usar en el tratamiento de trastornos inmunológicos como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), agammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, otras inmunodeficiencias, inmunosupresión y enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
En una realización, las células B transfectadas como se describe en la presente memoria también se pueden usar en el tratamiento de enfermedades autoinmunes como, pero no se limitan a, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes dependiente de insulina, enfermedad de Addison, enfermedad celíaca, síndrome de fatiga crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, síndrome de Sjogren, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, diabetes insulino-dependiente (tipo 1), miastenia gravis, endometriosis, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome mielodisplásico, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica autoinmune, síndrome de Evan, síndrome del inhibidor del factor VIII, vasculitis sistémica, dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumática. Por tanto, en una realización, los métodos de la presente memoria incluyen métodos para tratar una enfermedad que comprende administrar a un sujeto o paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones que comprenden las células B transfectadas como se describe en la presente memoria, tratando así la enfermedad.
En una realización, las células B transfectadas como se describe en la presente memoria también se pueden usar en el tratamiento de enfermedades y trastornos por deficiencia de enzimas como, pero no se limitan a, MPS I, MPS II, MPS III, MP IV, MPS V, MPS VI, MPS VII, trastornos de almacenamiento lisosomal, enfermedad de Nieman-pick (tipos A, B y C), enfermedad de Guacher (tipos I, II y III), enfermedad de Tay-Sachs y trastorno de Pompe.
Ejemplos
Ejemplo 1
Supervivencia in vivo de células B activadas y diferenciadas in vitro
Con el fin de determinar si el fenotipo de una población de células B antes de la activación y la diferenciación in vitro afectan a la cantidad de tiempo que las células B sobreviven in vivo, se usó un modelo de ratón para comparar la supervivencia in vivo de dos poblaciones de células B humanas activadas in vitro.
Aislamiento de células B
La primera población de células B comprendía células pan-B CD19+, y la segunda población de células B comprendía células B de memoria. Se usaron células pan-B fijas como control negativo. Se aislaron PBMCs de muestras de sangre completa humana usando la separación por gradiente de FICOLL. Las células pan-B se aislaron de las PBMC mediante selección negativa usando un kit de aislamiento de células pan-B de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Brevemente, la suspensión de células se centrifugó a 300 g durante 10 minutos después del recuento. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron las células a 108 células/400 pl de tampón frío para una concentración total de 4,5 x 108 células/1,8 ml. A continuación, se añadieron a las células 450 pl del cóctel de anticuerpos biotinilados de células B y se incubaron durante 40 minutos a 4°C. Se añadieron 1,25 ml de tampón frío y 900 pl de Anti-Biotin MicroBeads y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron añadiendo 10 ml de tampón y centrifugando a 300 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aspiró por completo y las células se resuspendieron en 4,5 ml de tampón frío. Usando separación magnética, se deplecionaron las células no B aplicando la suspensión celular a una Columna MACS® en un Separador magnético MACS. Después de dos lavados de la columna, el efluente contenía la fracción de células B (células pan-B CD19+).
El aislamiento de células B de memoria utilizó una etapa adicional de selección positiva para CD27 con un kit de aislamiento de células B de memoria de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). La fracción de células B obtenida anteriormente se centrifugó a 300 g durante 10 minutos y el sobrenadante se aspiró por completo. Las células se resuspendieron en 450 pl de tampón y se añadieron 450 pl de CD27 MicroBeads y se incubaron durante 15 minutos a 4°C. Las células se lavaron añadiendo 20 ml de tampón y centrifugando a 300 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aspiró por completo y las células se resuspendieron en 225 ml de tampón frío. Usando separación magnética, las células B de memoria CD27+ se retuvieron aplicando la suspensión celular a una Columna MACS® en un Separador magnético MACS. Después de tres lavados de la columna, se retiró la columna del campo magnético y se eliminaron las células marcadas de la columna usando 2,5 ml de tampón y empujando un émbolo en la columna para obtener la fracción de células B de memoria (células B CD27+).
Alternativamente, las células B de memoria se aislaron mediante depleción de células CD3+ y CD56+, seguido de una selección positiva para las células CD27+ como se describió anteriormente.
Cultivo in vitro
Tanto la población de células pan-B como la población de células B de memoria se cultivaron in vitro antes de la administración a ratones. Las células pan-B CD19+ se diferenciaron usando un sistema de cultivo de 3 etapas. Los medios de cultivo base comprendían medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), suero bovino fetal (FBS) al 10% y 50 pg/ml de transferrina. Durante la primera etapa del sistema de cultivo, las células se expusieron durante 5 días a 10 pg/ml de CpG, 50 ng/ml de IL-10 y 10 ng/ml de IL-15. Para la siguiente etapa, se reemplazó el medio y las células se cultivaron en medios que contenían 20 U/ml de IL-2, 50 ng/ml de IL-10, 10 ng/ml de IL-15, 50 ng/ml de IL-6 y 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD40L. Después de 3 días de cultivo en el medio de la etapa 2, se reemplazó el medio y las células se cultivaron durante 3 días adicionales para inducir la diferenciación en plasmablastos y células plasmáticas. Específicamente, los medios de la etapa 3 contenían 10 ng/ml de IL-15, 50 ng/ml de IL-6, 500 U/ml de IFN-alfa, 20 ng/ml de HFG y 100 pg/ml de ácido hialurónico.
Después de la selección positiva de células CD27+, las células B de memoria se cultivaron en IMDM con FBS al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, transferrina e insulina. También se añadieron al medio de cultivo CD40L marcado con histidina(His) y mAb anti-poli-his. Alternativamente, se podría utilizar un CD40L multimérico o un CD40L expresado en células auxiliares. Las citoquinas añadidas al medio de cultivo el día 0 fueron IL-2, IL-10 e IL-15. También se añadieron al medio de cultivo oligodesoxinucleótidos CpG de clase P (P-ODNs). En la Figura 1 se muestra un ejemplo de expansión de células B cultivadas con IL-2, IL-10, IL-15 y CpG. En el día 3 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron con medio base (IMDM no suplementado), se centrifugaron y se resuspendieron en IMDM suplementado con IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15. En el día 6 de cultivo in vitro, las células se recogieron, lavaron, centrifugaron y resuspendieron en IMDM suplementado con IFN-aA/D, IL-6 e IL-10. En el día 9 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron dos veces y se resuspendieron en solución tampón de tinción de citometría de flujo o en medio de congelación para su almacenamiento. Las células que se iban a congelar para el almacenamiento se colocaron a -80 °C durante toda la noche antes de transferirlas a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
El fenotipo de las células cultivadas in vitro se verificó mediante citometría de flujo. En la Figura 2 se muestran datos representativos de los fenotipos CD20 y CD38 de células B cultivadas in vitro que usan condiciones para promover la diferenciación de las células B. Ambas poblaciones de células B, células pan-B y células B de memoria, demostraron una cinética de fenotipo similar. Como se muestra en la Figura 2, el fenotipo de la mayoría de las células en el Día 0 es CD20+, CD38-. Después de 7 días en cultivo para promover la diferenciación de células B, las células son en su mayoría CD20-, CD38+.
Supervivencia en ratones in vivo
Después del cultivo in vitro, las células B congeladas se descongelaron y se tiñeron con el colorante fluorescente infrarrojo cercano DiOC18(7) (DiR). Para examinar la supervivencia in vivo de las células B cultivadas in vitro, se utilizaron ratones NOD scid gamma (NSG) (The Jackson Laboratory) para que las células B humanas no fueran matadas y eliminadas por el sistema inmune del huésped. Además, las quimioquinas y los receptores homing humanos y de ratón relevantes, que incluyen CXCR4 y CXCL12/SDF-1, tienen reactividad cruzada, por lo que las células humanas pueden migrar en el ratón. T res grupos de cuatro ratones NSG recibieron 5 x 106 células B mediante inyección iv. Un grupo de 4 ratones NSG recibió células pan-B, otro grupo de 4 ratones NSG recibió células B de memoria y el grupo de control de 4 ratones NSG recibió células B CD19+ fijas. Las células pan-B y las células B de memoria se centrifugaron y se resuspendieron en PBS para inyección. Las células de control se colocaron en paraformaldehído al 3% en PBS durante 15 minutos, se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en PBS para inyección.
Los ratones fueron examinados durante el transcurso del estudio usando IVIS®. Se tomaron imágenes de un ratón de cada grupo de tratamiento en cada punto de tiempo de acuerdo con el programa de imágenes en la Tabla 1 a continuación, y el patrón se repitió a lo largo del estudio. Se tomaron imágenes de los ratones 2 días antes de la inyección para establecer un nivel de referencia de fluorescencia. Luego se midió la señal IVIS® cada 8 horas durante los primeros 10 días, y luego cada 5 días hasta que se perdió la señal o finalizó el estudio. Originalmente, se esperaba que el estudio finalizara el día 45 después de la inyección; sin embargo, persistía un gran número de células en el día 41 (Figuras 3 y 4). Se sacrificaron dos ratones de cada grupo el día 45, como se planeó originalmente, y se siguieron tomando imágenes de los ratones restantes (dos de cada grupo) cada 5 días hasta el día 100. Como se puede ver en la Figura 3, la población de células B de memoria aún estaba ampliamente presente en los ratones el día 81, mientras que la población de células pan-B era similar a la muestra de control.
Tabla 1. Cronograma de imágenes
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Estos resultados demuestran que las condiciones de cultivo de células B de memoria indujeron la proliferación celular y la transición fenotípica y dieron como resultado una mejora de la supervivencia in vivo. En particular, es importante destacar que, si bien el modelo de ratón NSG proporciona señales de migración relevantes para las células, las señales de supervivencia (p. ej., el factor activador de células B (BAFF) y la IL-6) no tienen reactividad cruzada, por lo que las células B no sobreviven tanto tiempo como lo harían en un ser humano.
Por consiguiente, los presentes métodos se pueden usar para producir células B para la administración a largo plazo de un agente terapéutico, como un anticuerpo específico u otra proteína terapéutica. Ningún método descrito en la técnica ha diferenciado las células B de memoria transducidas en plasmablastos y células plasmáticas in vitro antes de la administración in vivo para el suministro a largo plazo de un agente terapéutico.
Ejemplo 2
Transducción de células B activadas y diferenciadas in vitro
Para optimizar las condiciones de cultivo y demostrar que in vitro se pueden transducir células B de memoria cultivadas, se utilizaron vectores lentivirales pseudotipados VSV-G para introducir un gen de interés en las células B.
Las células B de memoria se aislaron como se describe en el ejemplo anterior. Después de la selección positiva de células CD27+, las células B de memoria se cultivaron en IMDM con FBS al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, transferrina e insulina. También se añadieron al medio de cultivo CD40L marcado con His y mAb anti-poli-his. Las citoquinas añadidas al medio de cultivo el día 0 fueron IL-2, IL-10 e IL-15. También se añadieron al medio de cultivo oligodesoxinucleótidos CpG de clase P (P-ODNs). En el día 3 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron con medio base (IMDM no suplementado), se centrifugaron y se resuspendieron en IMDM suplementado con IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15. En el día 5 de cultivo in vitro, las células se recogieron, lavaron, centrifugaron y resuspendieron en IMDM suplementado con sulfato de protamina para la transducción viral con lentivirus. Se añadió el lentivirus que albergaba GFP a las células a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 y se incubó durante la noche. En el día 6 de cultivo in vitro, las células se recogieron, lavaron, centrifugaron y resuspendieron en IMDM suplementado con IFN-aA/D, IL-6 e IL-10. En el día 9 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron dos veces y se resuspendieron en solución tampón de tinción de citometría de flujo o en medio de congelación para su almacenamiento. Las células que se iban a congelar para el almacenamiento se colocaron a -80 °C durante toda la noche antes de transferirlas a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
Como se muestra en la Figura 5, se usó citometría de flujo para observar la presencia de GFP (eje x). La dispersión frontal se muestra en el eje y. También se generaron células B que expresan IDUA (Figura 6) y VRC01 (Figura 7) usando el sistema de cultivo celular descrito anteriormente para la transducción con lentivirus GFP. Se detectó proteína recombinante en los medios de cultivo celular de las células B transducidas.
Se generaron células B diferenciadas que secretan una proteína terapéutica, por primera vez, mediante el uso de los métodos descritos en la presente memoria para la transducción de células B de memoria seguido de cultivo in vitro.
Ejemplo 3
Transfección de células B activadas y diferenciadas in vitro
Con el fin de optimizar las condiciones de cultivo y demostrar que las células B de memoria cultivadas in vitro se pueden transfectar mediante electroporación, se utilizaron vectores de transposones para introducir un gen de interés en las células B.
Las células B de memoria se aislaron a partir de PBMCs como se describe en los ejemplos anteriores. Las células se sometieron a electroporación el día 2 del cultivo in vitro usando el Sistema 4D-Nucleofactor™ (Lonza). Las células B de memoria se cultivaron en IMDM con FBS al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, transferrina e insulina. También se añadieron al medio de cultivo CD40L marcado con His y mAb anti-poli-his. Las citoquinas añadidas al medio de cultivo el día 0 fueron IL-2, IL-10 e IL-15. También se añadieron al medio de cultivo oligodesoxinucleótidos CpG de clase P (P-ODNs). Como se mencionó, las células B se sometieron a electroporación el día 2. Además, la estimulación de las células B con IL-2, IL-4, IL-10 y CD40L favorece una electroporación eficaz los 2 días siguientes a la estimulación. En el día 3 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron con medio base (IMDM no suplementado), se centrifugaron y se resuspendieron en IMDM suplementado con IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15. En el día 6 de cultivo in vitro, las células se recogieron, lavaron, centrifugaron y resuspendieron en IMDM suplementado con IFN-a A/D, IL-6 e IL-10. En el día 9 de cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron dos veces y se resuspendieron en solución tampón de tinción de citometría de flujo o en medio de congelación para su almacenamiento. Las células se sometieron a electroporación con un vector de transposón vacío (control, Figura 8A), un transposón que albergaba GFP en ausencia de transposasa (Figura 8B) y un transposón que albergaba GFP junto con la transposasa SB100x (Figura 8C).
Se generaron células B diferenciadas que secretan una proteína terapéutica, por lo tanto, mediante el uso de los métodos descritos en la presente memoria para la transfección de células B de memoria seguido de cultivo in vitro.
Ejemplo 4
Supervivencia de células modificadas in vivo en un modelo de ratón humanizado
Con el fin de determinar si las células B de memoria modificadas descritas en el Ejemplo 1 sobreviven más tiempo en un modelo de ratón más humanizado, se pueden usar ratones humanizados CD34+ (The Jackson Laboratory). Para generar los ratones humanizados CD34+, se injertan ratones NSG con células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ del mismo donante que las células B.
Las poblaciones de control, células pan-B y células B de memoria se preparan como se describe en el Ejemplo 1. Tres grupos (control, células pan-B y células B de memoria) de cuatro ratones humanizados CD34+ reciben 5 x 106 células B teñidas mediante inyección iv. Los ratones se examinan durante el transcurso del estudio usando IVIS® como se describió anteriormente. Se toman imágenes de un ratón de cada grupo cada 8 horas durante los primeros 10 días y luego cada 5 días hasta el final del estudio.
Ejemplo 5
Expansión y diferenciación mejorada de células B de memoria in vitro
Con el fin de determinar si las células B de memoria con cambio de clase tienen mayor potencial proliferativo que las células pan B de memoria (CD27+), se obtuvo una población de células B de memoria con cambio de clase antes de la expansión y diferenciación celular. Además, se probaron las condiciones de cultivo destinadas a facilitar una mayor expansión de las células de memoria.
El aislamiento de células pan B de memoria (CD27+) o células B de memoria con cambio de clase se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Después de la purificación de las poblaciones de células de memoria, las células se cultivaron en IMDM con FBS al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, transferrina e insulina. Con el fin de facilitar la expansión, las células se combinaron con 0,5 ug/ml de CD40L marcado con his y mAb anti-poli-his. También se añadieron al medio de cultivo IL-2 (5 ng/ml), IL-4 (2 ng/ml), (40 ng/ml) IL-10. Las células se suplementaron con medio nuevo cada 3-4 días según fuera necesario. Dependiendo de la tasa de proliferación celular, las células se expanden durante 6 a 14 días. A continuación, las células se transfieren a condiciones para inducir la diferenciación.
Específicamente, después se cambiaron los medios celulares para incluir CD40L marcado con His y mAb anti-poli-his, las citoquinas IL-2, IL-10 e IL-15 y los oligodesoxinucleótidos CpG de clase P (P-ODNs). Después de 3-4 días de cultivo en esta formulación de medios, las células se recogieron, se lavaron con medio base (IMDM no suplementado), se centrifugaron y se resuspendieron en IMDM suplementado con IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15. Después de 3 días de cultivo en esta formulación de medios, las células se recogieron, lavaron, centrifugaron y resuspendieron en IMDM suplementado con IFN-aA/D, IL-6 e IL-10. En el día 9 o 10 del cultivo in vitro, las células se recogieron, se lavaron dos veces y se resuspendieron en solución tampón de tinción de citometría de flujo o en medio de congelación para su almacenamiento. Las células que se iban a congelar para el almacenamiento se colocaron a -80 °C durante toda la noche antes de transferirlas a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
Como se demuestra, la inclusión de condiciones para apoyar la proliferación antes de las condiciones que inducen la diferenciación aumentó el rendimiento final de células diferenciadas.
Ejemplo 6
Medios alternativos para diferenciar las células B de memoria después de la expansión
Como un método alternativo para diferenciar las células, se probó un sistema de cultivo que utilizaba IL-21. Las condiciones de cultivo fueron similares a las descritas por Coco y cols., (J Immunology 189: 5773-5785, 2012). Específicamente, las células B de memoria se cultivaron a 2,5 x 105/ml con IL-2 (20 U/ml), IL-21 (50 ng/ml), F(ab')2 IgM e anti-IgG humana de cabra (10 gg/ml) en presencia del ligando de CD40 durante 3 días. A continuación, las células se volvieron a sembrar a los 105/ml en medios suplementados con IL-2 (20 U/ml), IL-21 (50 ng/ml), suplemento de crecimiento de hibridomas HybridoMax (11 gl/ml), mezcla de lípidos 1, solución de aminoácidos químicamente definidos y MEM (1X concentración final) durante 3 días más. Las células se volvieron a sembrar a 2,5 x 105/ml en medios suplementados con IL-6 (10 ng/ml), IL-21 (50 ng/ml), IFN-a (100 U/ml), suplemento de crecimiento de hibridomas HybridoMax (11 pl/ml), mezcla de lípidos 1 y solución de aminoácidos químicamente definida y MEM.
La diferenciación de las células se controló mediante citometría de flujo observando la expresión de CD20 y CD38 en el transcurso de 10 días (Figura 9). Usando el sistema de cultivo con IL-21, la diferenciación de las células B de memoria con cambio de clase y las células pan B de memoria (CD27+) dio como resultado una expresión similar de CD20 y CD38 en la población final, como se muestra en la Figura 10. Además, la expresión de CD138 fue similar al comenzar con células B de memoria con cambio de clase y células pan B de memoria (Figura 11).
Ejemplo 7
Expansión de las células B de memoria in vitro
Con el fin de optimizar las condiciones de cultivo para la expansión de las células de memoria, se compararon las condiciones de cultivo descritas anteriormente en el Ejemplo 5 que utilizan una combinación de CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10 con las condiciones de cultivo que también incluían IL-15 y IL-21.
Las células pan B de memoria (CD27+) se aislaron como se describió anteriormente. Después de la purificación de las células de memoria, las células se cultivaron en IMDM con FBS al 10 %, solución de penicilina-estreptomicina al 1 %, transferrina e insulina. Para la expansión, las células se cultivaron con una combinación de 0,5 pg/ml de CD40L marcado con His y mAb anti-poli-his, 5 ng/ml de IL-2, 2 ng/ml de IL-4 y 40 ng/ml de IL-10 (Cultivo A) o una combinación de 0,5 pg/ml de CD40L marcado con His y mAb anti-poli-his, 5 ng/ml de IL-2, 2 ng/ml de IL-4, 40 ng/ml de IL-10, 100 ng/ml de IL-15 y 100 ng/ml de IL-21 (Cultivo B). Las células se suplementaron con medio nuevo cada 3-4 días según fuera necesario. Se realizaron recuentos de células los días 0, 4, 7, 12, 14, 18, 21 y 25 con el fin de determinar el cambio en el número de células. Como se representa en la Figura 12 y se demuestra a continuación en la Tabla 2, la adición de IL-15 e IL-21 al cultivo celular aumentó en gran medida la tasa de proliferación de las células de memoria.
Tabla 2. Cambio en el número de células B de memoria
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Ejemplo 8
Expansión de células PAN B in vitro
Con el fin de examinar los efectos de IL-15 e IL-21 en la expansión de las células pan B in vitro se probaron condiciones de cultivo que incluían IL-15 e IL-21 solas y en combinación.
Las células B se aislaron a partir de PBMC y se crecieron en medios que contenían CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-15 y/o IL-21. Por consiguiente, se cultivó una población de células B con CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-15; otra población se cultivó con CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-21; y una tercera población se cultivó con CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21. Se tomaron recuentos de células usando un contador de células automatizado. Como se muestra en la Figura 13, la adición tanto de IL-15 como de IL-21 en combinación mejoró significativamente la proliferación de las células B. Por el contrario, la adición de sólo IL-15 redujo la proliferación, mientras que la adición de IL-21 dio lugar a un modesto aumento de la proliferación.
A continuación, se examinó el potencial de expansión de las células pan B cultivadas durante un período de tiempo de 10 días con una combinación de IL-15 e IL-21. Las células B se cultivaron en presencia de CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 en placas de cultivo celular de 24 pocillos. Los medios se cambiaron diariamente. Los datos que se muestran en la Figura 14 demuestran la capacidad del cóctel de citoquinas descrito en la presente memoria para promover la proliferación de alto nivel de las células B a una densidad celular baja y en ausencia de células alimentadoras.
Ejemplo 9
Migración de células PAN B expandidas in vitro
Se realizó otro experimento con el fin de estudiar la capacidad migratoria de las células B expandidas. El ensayo se realizó usando recipientes de cultivo de dos cámaras, en los que las cámaras están conectadas (p. ej., una placa T ranswell®). Las células B se sembraron en una cámara y la otra cámara se cargó con 100 ng/ml de CXCL12, que es un quimioatractante que atrae las células B hacia la médula ósea. Después de permitir que las células B migraran durante 3 horas, se recogieron las células B del segundo pocillo y se contaron. Se usó un control negativo en el que no se añadió CXCL12 a la segunda cámara. Para una comparación, también se usaron células B recién purificadas/sin cultivar. El grupo de prueba eran células B que se expusieron al sistema de cultivo descrito en el Ejemplo 8 durante 6 días. En promedio, el 51,2 % de las células B cultivadas migraron hacia la cámara CXCL12. Los datos que se muestran en la Figura 15 demuestran que la exposición al sistema de cultivo que comprende CD40L, un agente de entrecruzamiento de CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 e IL-21 mejoró en gran medida la capacidad migratoria de las células B. Este hallazgo demuestra que una población inicial de células pan B es migratoria siguiendo el sistema de cultivo in vitro descrito en la presente memoria, de modo que las células B son capaces de migrar a nichos de supervivencia, completar la diferenciación y recibir señales que respalden la supervivencia a largo plazo después de la administración in vivo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para producir una composición de células B modificadas que comprende:
(a) aislar células pan-B, células B de memoria o células B de memoria con cambio de clase a partir de una muestra, obteniendo así una población de células B aisladas,
(b) cultivar la población de células B aisladas in vitro con CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 y un agente de entrecruzamiento de CD40L, obteniendo así una población de células B expandida,
(c) transfectar la población de células B expandida con un transgén, y
(d) diferenciar la población de células B expandida in vitro con uno o más factores activadores de células B, obteniendo así una composición de células B modificada.
2. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la etapa de transfección comprende además enriquecer la población de células B expandidas usando un marcador seleccionable,
en donde el marcador seleccionable se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en una proteína marcadora fluorescente, un factor de resistencia a fármacos y un marcador de superficie.
3. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la población de células B aisladas es CD20+, CD27+ y CD138-.
4. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la población de células B aisladas es CD20+ e IgG+, o en donde la población de células B aisladas es CD20-, CD38- y CD138-.
5. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la muestra es sangre completa o células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), o
en donde la etapa de aislamiento comprende 1) depleción de células CD3+ y CD56+ y 2) enriquecimiento de células CD27+.
6. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde el CD40L es preferiblemente sCD40L-His, o
en donde uno o más factores activadores de células B de la etapa de cultivo comprenden CD40L, IL-2, IL-4 e IL-10.
7. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde las células alimentadoras están ausentes de la etapa de cultivo.
8. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la población de células B expandidas es migratoria, en donde las células de la población de células B expandidas migran preferiblemente hacia CXCL12, o
en donde preferiblemente al menos el 20% de las células de la población de células B expandidas son migratorias.
9. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde uno o más factores activadores de células B de la etapa de diferenciación comprenden CD40L, CpG, IFN-a, IFN-5, IL-2, IL-6, IL-10 e IL-15.
10. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la transfección comprende electroporación, lipofección, cell squeezing o transducción viral,
en donde la transducción viral comprende preferiblemente un vector retroviral,
en donde el vector retroviral es preferiblemente un vector lentiviral.
11. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde la transfección comprende un vector no viral,
en donde el vector no viral se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un transposón, una nucleasa con dedos de zinc, una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción, una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada, un minicírculo, un replicón de ADN, un replicón de ARN, un cromosoma artificial, un plásmido, un mini-plásmido intrónico, un nanoplásmido, un cósmido y un bacteriófago,
en donde el vector no viral preferiblemente es un transposón, o
en donde el vector no viral es preferiblemente un minicírculo, un miniplásmido intrónico o un nanoplásmido.
12. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde el transgén codifica un anticuerpo específico de antígeno, o un fragmento de este que se une al antígeno, una proteína de fusión o una proteína terapéutica,
en donde la proteína terapéutica se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un receptor de superficie celular, una proteína secretada, una molécula de señalización, un fragmento antigénico, una enzima, un factor de coagulación y una molécula de adhesión, o
en donde el anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo anti-VIH, un anticuerpo anti-ARN o un anticuerpo que se une a una proteína implicada en la regulación inmune.
13. El método in vitro de la reivindicación 1, en donde las células de la composición de células B modificadas son CD20-, CD38+ y CD138+, o
en donde las células de la composición de células B modificadas son CD20-, CD38+ y CD138-.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2971039T (pt) 2013-03-14 2020-05-06 Immusoft Corp Métodos para diferenciação e transdução in vitro de células b de memória com vetores virais pseudotipados vsv-g
EP4335918A3 (en) * 2015-04-03 2024-04-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
JP2019526270A (ja) * 2016-09-12 2019-09-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ゲノム編集初代ｂ細胞ならびに作製方法および使用方法
WO2018102612A1 (en) * 2016-12-02 2018-06-07 Juno Therapeutics, Inc. Engineered b cells and related compositions and methods
KR20190111063A (ko) * 2017-01-26 2019-10-01 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 B-세포 조작
US20220193129A1 (en) * 2017-04-27 2022-06-23 Immusoft Corporation B cells for in vivo delivery of therapeutic agents and dosages thereof
GB201707238D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Univ Oxford Innovation Ltd Composition
EP3765601A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Immusoft Corporation B cells genetically engineered to secrete follistatin and methods of using the same to treat follistatin-related diseases, conditions, disorders and to enhance muscle growth and strength
US11913023B2 (en) 2020-03-31 2024-02-27 Walking Fish Therapeutics, Inc. Modified B cells and methods of use thereof
JP2023539382A (ja) * 2020-09-02 2023-09-13 ウォーキング フィッシュ セラピューティクス，インコーポレイテッド 改変ｂ細胞及びそれらの使用方法
JP2023548118A (ja) * 2020-10-30 2023-11-15 イミュソフト コーポレーション 治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、遺伝子改変Ｂ細胞を投与する方法
WO2024040201A1 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Celdara Medical Llc Improved method and system for cell therapy

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
JPH0276820A (ja) * 1988-06-15 1990-03-16 Ajinomoto Co Inc 骨髄移植療法支持剤
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
US5057423A (en) 1987-12-18 1991-10-15 University Of Pittsburgh Method for the preparation of pure LAK-active lymphocytes
US5124259A (en) 1989-08-23 1992-06-23 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Method for electroporation
US5297983A (en) 1991-07-15 1994-03-29 Albert Handtmann Maschinenfabrik Gmbh & Co., Kg Process and device for separating and placing a gut caterpillar on a filling tube
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
WO1995004521A1 (en) 1993-08-10 1995-02-16 W.L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulating device
ATE277081T1 (de) 1994-01-11 2004-10-15 Dyax Corp Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
DE69630266T2 (de) 1995-06-07 2004-09-09 W.L. Gore & Associates, Inc., Newark Implantierbare aufnahmevorrichtung für ein therapeutisches gerät
US5626561A (en) 1995-06-07 1997-05-06 Gore Hybrid Technologies, Inc. Implantable containment apparatus for a therapeutical device and method for loading and reloading the device therein
WO1997010807A1 (en) 1995-09-22 1997-03-27 Gore Hybrid Technologies, Inc. Improved cell encapsulation device
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US6218181B1 (en) 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7381701B2 (en) 2001-02-15 2008-06-03 The Borad Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions and methods for treating conditions related to ephrin signaling with cupredoxins
US7338766B2 (en) 2001-02-15 2008-03-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions and methods for treating malaria with cupredoxin and cytochrome
EP1411963A4 (en) 2001-02-15 2005-01-19 Univ Illinois CYTOTOXIC FACTORS FOR MODULATING CELL DEATH
US7301010B2 (en) 2001-02-15 2007-11-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions and methods for treating HIV infection with cupredoxin and cytochrome c
US7556810B2 (en) 2005-07-19 2009-07-07 The Board Of Trustees Of The University Of Ilinois Compositions and methods to control angiogenesis with cupredoxins
US7491394B2 (en) 2001-02-15 2009-02-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Cytotoxic factors for modulating cell death
EP1369108A4 (en) 2001-02-19 2007-06-20 Pola Chem Ind Inc COMPOSITION FOR USE IN ELECTROPORATION
PT1772465E (pt) 2005-01-05 2009-05-21 F Star Biotech Forsch & Entw Domínios de imunoglobulina sintética com propriedades de ligação construídos em regiões da molécula diferentes das regiões determinantes de complementaridade
GB0504767D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Ares Trading Sa Lipocalin protein
JP5396083B2 (ja) * 2005-11-17 2014-01-22 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 血小板凝集アッセイ
CA2633157C (en) * 2005-12-09 2018-10-09 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells
US7799555B2 (en) 2006-02-10 2010-09-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Apparatus for high-throughput electroporation
EP1829895A1 (en) 2006-03-03 2007-09-05 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies
US8551780B2 (en) 2008-02-01 2013-10-08 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Electroporation buffer composition and method of use
US8133727B2 (en) 2008-11-21 2012-03-13 California Institute Of Technology In vitro human B lymphopoiesis culture system
CA2786664C (en) 2010-01-08 2020-03-10 Immusoft Corporation Vectors and methods for transducing b cells
US8633029B2 (en) 2010-03-15 2014-01-21 Yamaguchi University Agent for improving gene transfer efficiency to mammalian cells
CA2806858C (en) * 2010-08-04 2021-06-15 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming immortalized b cells
AU2012354057B2 (en) * 2011-12-14 2017-08-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Human monocyte sub-population for treatment of central nervous system injury
PT2971039T (pt) 2013-03-14 2020-05-06 Immusoft Corp Métodos para diferenciação e transdução in vitro de células b de memória com vetores virais pseudotipados vsv-g

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