DESCRIPCION

Vectores y procedimientos para la transduccion de linfocitos B 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Campo de la invencion

[0001] La presente descripcion se refiere a la modification genetica de linfocitos B, una poblacion de celulas

10 normalmente muy resistentes a la transduccion, y a la diferenciacion o activation de los mismos para expresar una protelna de interes tal como un anticuerpo especlfico.

Descripcion de la tecnica relacionada

15 [0002] Despues de salir de la medula osea, el linfocito B actua como una celula presentadora de antlgeno

(APC) e internaliza antlgenos. El antlgeno es recogido por el linfocito B a traves de la endocitosis mediada por receptor y es procesado. El antlgeno es procesado en peptidos antigenicos, cargado en moleculas MHC II y presentado en la superficie extracelular de linfocitos B a linfocitos T cooperadores CD4+. Estos linfocitos T se unen a la molecula MHC II/antlgeno y producen la activacion del linfocito B. Tras la estimulacion por un linfocito T, el linfocito 20 B activado empieza a diferenciarse en celulas mas especializadas. Los linfocitos B del centro germinal se pueden diferenciar en linfocitos B de memoria o celulas plasmaticas. La mayorla de estos linfocitos B se convertiran en plasmablastos, y finalmente en celulas plasmaticas, y empiezan a producir grandes volumenes de anticuerpos (vease, p. ej., Trends Immunol. 2009 June; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5:231-242).

25 [0003] La celula sangulnea mas inmadura que se considera una celula plasmatica en lugar de un linfocito B

es el plasmablasto. Los plasmablastos segregan mas anticuerpos que los linfocitos B, pero menos que las celulas plasmaticas. Se dividen rapidamente y todavla son capaces de internalizar antlgenos y presentarlos a los linfocitos T. Una celula puede permanecer en este estado durante varios dlas, y despues bien morir o diferenciarse irrevocablemente en una celula plasmatica completamente diferenciada madura.

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[0004] Las celulas plasmaticas definitivamente diferenciadas expresan relativamente pocos antlgenos de superficie, y no expresan marcadores celulares pan-B comunes, tales como CD19 y CD20. En cambio, las celulas plasmaticas son identificadas por citometrla de flujo por su expresion adicional de CD38, CD78, el receptor de interleuquina 6 y la falta de expresion de CD45. En seres humanos, CD27 es un buen marcador para celulas

35 plasmaticas, los linfocitos B indiferenciados son CD27-, los linfocitos B de memoria son CD27+ y las celulas plasmaticas son CD27++. CD38 y CD138 son expresados con niveles altos (Vease Wikipedia, The Free Encyclopedia., "Plasma cell" Page Version ID: 404969441; Fecha de la ultima revision: 30 de diciembre de 2010 09:54 UTC, recuperado el 4 de enero, 2011; Vease tambien: Trends Immunol. 2009 June; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5:231-242; Nature Med. 2010, 16:123-129; Neuberger, M. S.; Honjo, T.; Alt, Frederick W. (2004). 40 Molecular biology of B cells. Amsterdam: Elsevier. pp. 189-191; Bertil Glader; Greer, John G.; John Foerster; Rodgers, George G.; Paraskevas, Frixos (2008). Wintrobe's Clinical Hematology, 2-Vol. Set. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins. pp. 347; Walport, Mark; Murphy, Kenneth; Janeway, Charles; Travers, Paul J. (2008). Janeway's immunobiology. New York: Garland Science. pp. 387-388; Rawstron AC (May 2006). "Immunophenotyping of plasma cells". Curr Protoc Cytom).

45

[0005] Los retrovirus pseudotipo convencionales han demostrado insuficiente infectividad de diferentes tejidos y celulas. Por ejemplo, una variedad de citoblastos que incluyen citoblastos hematopoyeticos y linfocitos B y T en reposo, pueden ser celulas diana importantes en la terapia genica o similar (Y. Hanazono, Molecular Medicine, Vol. 36, No. 7, 1999), pero la mayorla de estos tipos de celulas se encuentran en un estado de no division (Abkowitz,

50 J. L. et al., Nat Med, 2 (2), 190-7, 1996). En general, es diflcil introducir genes usando el vector retrovlrico que presenta infectividad baja contra dichas celulas que no se dividen.

[0006] Frecha y col., recientemente mostraron que los linfocitos T y B en reposo se pueden transducir eficazmente con vectores retrovlricos pseudotipados con virus del sarampion, glucoprotelnas, H y F, en sus

55 superficies (Blood 2009 Oct 8; 1 14(15):3173-80; Blood 2008 1 12:4843-4852). En particular, estos vectores retrovlricos usaban el virus del sarampion de Edmonston. Esta tecnica para modificar celulas que no se dividen es de particular importancia para la terapia genica e inmunoterapia. Sin embargo, la capacidad para diferenciar y activar linfocitos B in vitro es una etapa importante en la preparation de linfocitos B modificados para infusion en sujetos. Los linfocitos B activados y que se dividen tampoco se modifican geneticamente de forma facil, por lo tanto, este

procedimiento se puede usar para transducir todos los tipos de linfocitos B. La presente descripcion proporciona vectores y procedimientos para modificar y diferenciar/activar linfocitos B, de modo que se puedan usar eficazmente en aplicaciones profilacticas y terapeuticas.

5 [0007] Funke y col., (2008) describieron la entrada en celulas diana de vectores lentivlricos (Molecular

Therapy 16(8) 1427-1436) y Funke y col., (2009) describieron el pseudotipado lentivfrico con glucoprotelnas del sarampion naturales para mejorar el tltulo y selectividad (Gene Therapy 16(5) 700-5).

[0008] La presente descripcion proporciona estas y otras ventajas como se describen en la descripcion 10 detallada.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCION

[0009] La invencion proporciona un procedimiento para expresar un acido nucleico de interes en una celula 15 plasmatica como se define en las reivindicaciones.

[0010] Tambien se describe en el presente documento un procedimiento para expresar un acido nucleico de interes en un linfocito B, que comprende, transducir un linfocito B en reposo con un vector retrovlrico pseudotipado con glucoprotelnas del virus del sarampion H y F, en el que dicho vector retrovlrico comprende el acido nucleico de

20 interes unido operativamente a un promotor; y poner en contacto los linfocitos B en reposo transducidos con una composition que comprende CD40L en combination con un factor de activation de linfocitos B que comprende uno o mas de los factores seleccionados del grupo que consiste en IL- 2, IL-7, IL-10 y CpG; en condiciones suficientes para diferenciar los linfocitos B transducidos en una celula plasmatica, de modo que los linfocitos B transducidos diferenciados expresen el acido nucleico de interes. En una realization del procedimiento, el vector retrovlrico es un 25 vector lentivlrico. En otra realizacion del procedimiento, el acido nucleico de interes comprende un acido nucleico que codifica al menos una region VL y VH de inmunoglobulina. En una realizacion adicional del procedimiento, el acido nucleico de interes codifica una protelna de anticuerpo, o fragmento de union al antlgeno de la misma, una protelna de fusion o una molecula pequena codificada por ADN. En otra realizacion adicional mas, el anticuerpo es un anticuerpo dirigido contra el VIH, un anticuerpo dirigido contra el ARN o un anticuerpo que se une a una protelna 30 implicada en la regulation inmunitaria. En otra realizacion, se proporciona CD40L en una celula o una llnea celular o se puede unir a una placa de cultivo tisular o una perla. En algunas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento, el promotor es un promotor especlfico de linfocitos B y en particular es un promotor de EEK.

[0011] Otro aspecto proporciona un procedimiento para expresar un acido nucleico de interes en un linfocito 35 B, que comprende transducir un linfocito B en reposo con un vector retrovlrico pseudotipado con glucoprotelnas del

virus del sarampion, H y F, en el que dicho vector retrovlrico comprende el acido nucleico de interes operativamente unido a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos 20% de los linfocitos B en reposo; y poner en contacto los linfocitos B en reposo transducidos con una composicion que comprende CD40L en combinacion con un factor de activacion de linfocitos B que comprende uno o mas de los factores seleccionados del grupo que 40 consiste en IL- 2, IL-7, IL-10 y CpG; en condiciones suficientes para diferenciar los linfocitos B transducidos en una celula plasmatica, de modo que al menos 20% de los linfocitos B transducidos expresen el acido nucleico de interes.

[0012] En una realizacion de los procedimientos descritos en el presente documento, los linfocitos B en reposo se alslan de la sangre. En una realizacion adicional de los procedimientos descritos en el presente

45 documento, las celulas plasmaticas se pueden caracterizar por la expresion en la superficie celular de uno o mas marcadores seleccionados del grupo que consiste en CD38, CD78, receptor de interleuquina 6, CD27alto y CD138.

[0013] Un aspecto adicional de la descripcion proporciona un procedimiento para la transduction y promotion de la activacion de linfocitos B en reposo que comprende, poner en contacto los linfocitos B en reposo con un vector

50 retrovlrico pseudotipado con glucoprotelnas del virus del sarampion, H y F, en el que dicho vector retrovlrico comprende el acido nucleico de interes operativamente unido a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos 20% de los linfocitos B en reposo; y poner en contacto los linfocitos B transducidos con una composicion que comprende CD40L en combinacion con un factor de activacion de linfocitos B tal como uno o mas de los factores seleccionados del grupo que consiste en IL-2, IL-10, Staphylococcus aureus Cowan I (SAC), PMA y 55 CpG; en condiciones suficientes para activar los linfocitos B transducidos de modo que al menos 20% de los linfocitos B transducidos expresan el acido nucleico de interes. En una realizacion, el vector retrovlrico es un vector lentivlrico. En una realizacion adicional, el acido nucleico de interes comprende un acido nucleico que codifica al menos una region Vl y Vh de inmunoglobulina. En realizaciones adicionales, el acido nucleico de interes comprende un acido nucleico que codifica el interferon p. En relation con esto, en otras realizaciones, el acido nucleico de

interes puede codificar cualquiera de una variedad de citoquinas tales como, pero no limitadas a IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34 e IL-35, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IFN-w, quimioquinas tipo C XCL1 y XCL2, quimioquinas tipo C-C (que incluyen hasta la fecha CCL1-CCL28) y quimioquinas 5 tipo CXC (que incluyen hasta la fecha CXCL1-CXCL17), y miembros de la superfamilia del TNF (p.ej., TNF-a, ligando 4-1BB, factor de activacion de linfocitos B (BLyS), ligando FAS, linfotoxina, OX40L RANKL y tRaiL). En otra realizacion, el acido nucleico de interes codifica una protelna de anticuerpo, un fragmento de union al antlgeno de la misma. En otra realizacion mas, el CD40L se proporciona en una celula o una llnea celular o se puede unir a una placa de cultivo tisular o una perla. En una realizacion particular, el promotor es un promotor especlfico de linfocitos 10 B. En algunas realizaciones, el linfocito B es activado y se diferencia en una celula plasmatica que expresa la protelna de interes.

[0014] Estos y otros aspectos de la invencion seran evidentes tras referencia a la siguiente descripcion detallada y dibujos adjuntos.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0015] La figura 1 es una grafica de barras que muestra la produccion de anticuerpo b12 en linfocitos B diferenciados transducidos.

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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

[0016] La presente descripcion se refiere en general a modificar geneticamente linfocitos B para expresar un gen de interes, y cultivar los linfocitos B modificados de modo que se diferencien y activarlos para que expresen la

25 protelna codificada por el gen de interes. Despues, estos linfocitos B modificados activados se administran a un sujeto.

[0017] La composicion y procedimientos descritos en el presente documento proporcionan sorprendentemente la capacidad de transducir linfocitos B derivados, por ejemplo, de una simple extraction de

30 sangre, con un acido nucleico de interes y cultivar los linfocitos B modificados de modo que se desarrollen en celulas plasmaticas (linfocitos B activados) que segregan cantidades abundantes de la protelna codificada por el acido nucleico de interes. Una ventaja particular de este sistema es que solo requiere aproximadamente 10 dlas para producir una protelna de interes, a diferencia de sistemas conocidos en la tecnica que pueden tardar tanto como 10 semanas. Por lo tanto, la presente descripcion proporciona procedimientos que requieren menos tiempo de cultivo, 35 proporcionando ventajas comerciales y de seguridad comparado con los procedimientos previos.

Procedimientos de cultivo y transduction de linfocitos B

[0018] El ejemplo prototlpico de celulas para usar con los procedimientos de transduccion de la descripcion 40 son los linfocitos B.

[0019] En algunas realizaciones, los linfocitos B que se van a usar en los procedimientos de esta descripcion pueden ser linfocitos B en reposo, linfocitos B cebados o activados, celulas de mieloma, linfocitos B de leucemia linfocltica, o linfocitos B de linfoma. Sin embargo, un experto en la tecnica apreciara facilmente que los vectores y

45 procedimientos de la descripcion se pueden aplicar a otros tipos de celulas. A modo de ejemplo, los tipos de celulas que se pueden modificar y activar incluyen cualquier celula que tlpicamente no se divide o quiescente tal como neuroblastos, citoblastos hematopoyeticos y celulas progenitoras hematopoyeticas (celulas CD34+), citoblastos mesenquimales, celulas progenitoras mesenquimales, citoblastos y celulas progenitoras neurales y hepaticas, celulas dendrlticas, linfocitos T (linfocitos T CD8+ o CD4+), otras poblaciones de leucocitos, citoblastos pluripotentes, 50 citoblastos multipotentes, etc. Por consiguiente, algunas realizaciones de la presente descripcion proporcionan poblaciones de celulas que resultan de esta metodologla. En algunas realizaciones, los procedimientos y vectores descritos en el presente documento se pueden usar para transducir cualquier otro tipo de celula deseado, tales como hepatocitos, celulas epiteliales, osteoblastos, miocitos, fibroblastos, adipocitos, etc.

55 [0020] “Quiescente”, como se usa en el presente documento, se refiere a un estado de la celula en el que la

celula no esta proliferando activamente.

[0021] Antes de la transduccion y diferenciacion, se obtiene una fuente de linfocitos B de un sujeto. El termino

“sujeto” se pretende que incluya organismos vivos en los que se puede producir una respuesta inmunitaria

adaptativa (p. ej., mamlferos). Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgenicas de los mismos. Los linfocitos B se pueden obtener de una serie de fuentes, que incluyen celulas mononucleares de sangre periferica, medula osea, tejido de ganglios linfaticos, sangre de cordon, tejido de un sitio de infeccion, tejido de bazo y tumores. En algunas realizaciones de la presente descripcion, se puede usar 5 cualquier numero de llneas de linfocitos B disponibles en la tecnica. En algunas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento, los linfocitos B se pueden obtener de una unidad de sangre recogida de un sujeto usando cualquiera de una serie de tecnicas conocidas por el experto en la materia, tales como separation con FICOLLTM (copollmeros de sacarosa y epiclorhidrina que se pueden usar para preparar soluciones de alta densidad). En una realization preferida, las celulas de la sangre que circula de un individuo se obtienen por aferesis o 10 leucaferesis. El producto de la aferesis tlpicamente contiene linfocitos, que incluyen linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros leucocitos nucleados, eritrocitos y plaquetas. En una realizacion, las celulas recogidas por aferesis se pueden lavar para separar la fraccion de plasma y poner las celulas en un tampon o medio adecuado para las posteriores etapas de procesamiento. En una realizacion de los procedimientos descritos en el presente documento, las celulas se lavan con solution salina tamponada con fosfato (PBS). En una realizacion 15 alternativa, la solucion de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, sino todos, los cationes divalentes. Como apreciaran facilmente los expertos en la tecnica, se puede llevar a cabo una etapa de lavado por procedimientos conocidos en la tecnica, tales como usando una centrlfuga de “flujo continuo” (por ejemplo, el procesador celular Cobre 2991) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues de lavado, las celulas se pueden volver a suspender en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, 20 PBS. Alternativamente, los componentes no deseables de la muestra de aferesis se pueden separar y directamente volver a suspender las celulas en medio de cultivo.

[0022] Los linfocitos B se pueden aislar de sangre periferica o leucaferesis usando tecnicas conocidas en la

materia. Por ejemplo, las PBMC se pueden aislar usando FICOLL™ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y purificar los 25 linfocitos B CD19+ por selection negativa o positiva usando cualquiera de una variedad de anticuerpos conocidos en la tecnica, tales como el sistema de complejo tetramerico Rosette (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Estan disponibles en el comercio otros kits de aislamiento, tales como R&D Systems' MagCellect Human B Cell Isolation Kit (Minneapolis, MN).

30 [0023] En algunas realizaciones, los linfocitos B en reposo se pueden preparar por sedimentation en

gradientes Percoll discontinuos, como se describe en (Defranco et al., (1982) J. Exp. Med. 155:1523). En resumen, las celulas aisladas de la interfase de Percoll al 70-75% (densidad de 1,087-1,097) tlpicamente son >95% mlg+, tienen un grado bajo, uniforme de dispersion de la luz hacia delante y no responden a la Con A.

35 [0024] Los linfocitos B, u otras celulas de interes, se pueden transducir con vectores retrovlricos descritos en

el presente documento usando cualquiera de una variedad de tecnicas conocidas en la materia (vease, p. ej., Science 12 April 1996 272: 263-267; Blood 2007, 99:2342-2350; Blood 2009, 113:1422-1431; Blood 2009 Oct 8;114(15):3173-80; Blood. 2003;101 (6):2167-2174; Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009)). Por ejemplo, las PBMC, linfocitos B o T de donantes y 40 otros linfocitos B de celulas de cancer tales como B-CLL se pueden aislar y cultivar en RPMI 1640 (GibcoBRL Invitrogen, Auckland, Nueva Zelanda) u otro medio adecuado, sea exento de suero o complementado con FCS al 10% y penicilina/estreptomicina y/u otros complementos adecuados. En algunas realizaciones, las celulas se siembran con 1 E5 celulas en placas de 48 pocillos y se anade vector concentrado en diferentes dosis que puede optimizar de forma rutinaria el experto usando metodologlas rutinarias. En algunas realizaciones, los linfocitos B se 45 pueden transferir a monocapa celular MS5 en RPMI complementado con suero AB al 10%, FCS al 5%, rhSCF 50 ng/ml, rhlL-15 10 ng/ml y rhIL-2 5 ng/ml, y renovar el medio periodicamente segun sea necesario. Como reconocera el experto en la materia, se pueden usar otros medios y complementos adecuados segun convenga.

[0025] En una realizacion, los linfocitos B se ponen en contacto con un vector retrovlrico como se describe en

50 el presente documento, que comprende un acido nucleico de interes operativamente unido a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos una parte de los linfocitos B. En una realizacion, los linfocitos B se ponen en contacto con un vector retrovlrico, como se describe en el presente documento, que comprende un acido nucleico de interes operativamente unido a un promotor, en condiciones suficientes para transducir al menos 20% de los linfocitos B en reposo. En una realizacion adicional, los linfocitos B se ponen en contacto con un vector como se 55 describe en el presente documento, en condiciones suficientes para transducir al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de los linfocitos B en reposo. Cuando se transducen linfocitos B activados, los linfocitos B activados se ponen en contacto con un vector como se describe en el presente documento, en condiciones suficientes para transducir al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100% de los

linfocitos B activados.

[0026] En algunas realizaciones, las celulas son activadas en el momento de la transduccion. En relacion con

esto, las celulas se pueden estimular previamente con Staphylococcus Aureus Cowan (SAC; Calbiochem, San 5 Diego, CA); IL-2 para linfocitos B o con anticuerpos anti-hCD3/anti-hCD28/IL-2 para linfocitos T, en concentraciones adecuadas conocidas para el experto en la materia y optimizadas de forma rutinaria. Se pueden usar otros factores de activacion de linfocitos B (p. ej., PMA), como conoce el experto en la materia y se describe en el presente documento.

10 [0027] La presente descripcion proporciona procedimientos de cultivo de linfocitos B transducidos para as!

promover la diferenciacion y activacion de modo que los linfocitos B produzcan activamente la protelna codificada transgenica. En relacion con esto, los linfocitos B se activan y se diferencian en celulas plasmaticas. Como reconocerla un experto en la materia, las celulas plasmaticas se pueden identificar por patrones de expresion de protelnas de superficie celular usando procedimientos de citometrla de flujo estandar. Por ejemplo, las celulas 15 plasmaticas diferenciadas definitivamente expresan relativamente pocos antlgenos de superficie, y no expresan marcadores celulares pan-B comunes, tales como CD19 y CD20. En su lugar, las celulas plasmaticas son identificadas por citometrla de flujo por su expresion adicional de CD38, CD78, el receptor de interleuquina 6 y la falta de expresion de CD45. En seres humanos, CD27 es un buen marcador para las celulas plasmaticas, los linfocitos B indiferenciados sonCD27-, los linfocitos B de memoria son CD27+ y las celulas plasmaticas son CD27++. 20 CD38 y CD138 son expresados con niveles altos.

[0028] En algunas realizaciones, puede ser conveniente diferenciar y activar linfocitos B antes de la transduccion. Por consiguiente, cualquiera de dichos procedimientos esta contemplado en el presente documento para usar con celulas no transducidas.

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[0029] En una realization, los linfocitos B se pueden poner en contacto con un factor de activacion de linfocitos B, p. ej., cualquiera de una variedad de citoquinas, factores de crecimiento o llneas celulares que se sabe que activan y/o diferencian linfocitos B (vease, p. ej., Fluckiger, et al. Blood 1998 92: 4509-4520; Luo, et al., Blood 2009 113: 1422-1431). Dichos factores se pueden seleccionar del grupo que consiste en, pero no se limita a, IL-1,

30 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, e IL-35, IFN-y, IFN-a, IFN-p, IFN- w, quimioquinas de tipo C XCL1 y XCL2, quimioquinas de tipo C-C (que incluyen hasta la fecha CCL1-CCL28) y quimioquinas de tipo CXC (que incluyen hasta la fecha CXCL1-CXCL17), y miembros de la superfamilia del TNF (p. ej., TNF-a, ligando 4-1BB, factor de activacion de linfocitos B (BLyS), ligando FAS, linfotoxina, OX40L RANKL y 35 TRAIL). En particular, los linfocitos B transducidos (o linfocitos B antes de la transduccion) se pueden poner en contacto o cultivar en celulas nutrientes. En algunas realizaciones, las celulas nutrientes son una llnea de celulas estromales, p. ej., las llneas de celulas estromales murinas S17 o MS5. En una realizacion adicional, se pueden cultivar celulas CD19+ purificadas en presencia de fibroblastos que expresan el ligando CD40 en presencia de factores de activacion de linfocitos B citoquinas tales como IL-10 y IL-4. El CD40L tambien se puede proporcionar 40 unido a una superficie tal como una placa de cultivo tisular o una perla. En otra realizacion, las celulas CD19+ purificadas se pueden cultivar en presencia de celulas nutrientes que expresan CD40L en presencia de una o mas citoquinas o factores seleccionados de IL-10, IL-4, IL-7, CpG DNA, IL-2, iL-15, IL6 e IFN-a.

[0030] En otra realizacion, los factores de activacion de linfocitos B se pueden proporcionar por transfection 45 en el linfocito B u otra celula nutriente. En este contexto, se pueden usar uno o mas factores que promueven la

diferenciacion del linfocito B en una celula que segrega anticuerpos y/o uno mas factores que promueven la longevidad de la celula que produce anticuerpos. Dichos factores incluyen, por ejemplo, Blimp-1, TRF4, factores antiapoptoticos tales como Bcl-xl o Bcl5, mutantes del receptor de CD40 constitutivamente activos. Tambien se pueden usar factores adicionales que promueven la expresion de moleculas de serialization en la direction 3' tales 50 como factores asociados con el receptor de TNF (TRAF) en la activacion/diferenciacion de los linfocitos B. En relacion con esto, la activacion de celulas, supervivencia celular y funciones antiapoptoticas de la superfamilia de receptores de TNF, son mediadas principalmente por TRAF1-6 (vease, p. ej., R.H. Arch, et al., Genes Dev. 12 (1998), pp. 2821-2830). Los efectores en la direccion 3' de la senalizacion de TRAF incluyen factores de transcription en la familia de NF-kB y AP-1 que pueden poner en marcha genes implicados en diferentes aspectos 55 de las funciones celular e inmunitaria. Ademas, se ha mostrado que la activacion de NF-kB y AP-1 proporciona protection a las celulas frente a la apoptosis a traves de la transcripcion de genes antiapoptoticos.

[0031] En una realizacion adicional, pueden ser utiles protelnas derivadas del virus de Epstein Barr (EBV) para la activacion/diferenciacion de linfocitos B o para promover la longevidad de la celula que produce anticuerpos.

Las protelnas derivadas del EBV incluyen, pero no se limitan a, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, EBER, miARN, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA y EBV-AN.

[0032] El contacto de los linfocitos B con factores de activacion de linfocitos B usando los procedimientos 5 proporcionados en el presente documento, conduce a, entre otras cosas, la proliferacion celular, modulacion del

fenotipo de superficie celular IgM+ a uno concordante con un linfocito B maduro activado, secrecion de Ig y cambio de isotipo. Los linfocitos B CD19+ se pueden aislar usando kits de separacion de celulas conocidos y disponibles en el comercio, tales como el sistema de separacion de celulas MiniMacs (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). En algunas realizaciones, los fibroblastos CD40L son irradiados antes de usar en los procedimientos 10 descritos en el presente documento.

[0033] En una realizacion adicional, las celulas progenitoras o linfocitos B se pueden cultivar en presencia de uno o mas de IL-3, IL-7, ligando Flt3, trombopoyetina, SCF, IL-2, IL-10, G-CSF y CpG. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen cultivar los linfocitos B o progenitores en presencia de uno o mas de los factores

15 mencionados antes junto con celulas estromales transformadas (p. ej., MS5) proporcionando un nivel bajo de CD40L anclado o CD40L unido a una placa o una perla.

[0034] Se puede usar cualquiera de una variedad de medios de cultivo en los presentes procedimientos, como sabra el experto en la materia (vease, p. ej., Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 de John Wiley &

20 Sons, Inc.). En una realizacion, los medios para usar en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a medio Dulbecco modificado por Iscove (con o sin suero bovino fetal u otro suero adecuado). Los medios ilustrativos tambien incluyen, pero no se limitan a, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, y X-Vivo 20. En realizaciones adicionales, el medio puede comprender un tensioactivo, un anticuerpo, Plasmanate o un agente de reduccion (p. ej. N-acetil-cistelna, 2-mercaptoetanol), o uno o mas 25 antibioticos. En algunas realizaciones, se puede usar tambien IL6, CD40L soluble y un potenciador de la reticulacion.

[0035] Los linfocitos B o celulas progenitoras se pueden cultivar en condiciones y durante periodos de tiempo suficientes para lograr la diferenciacion y activacion deseados. En algunas realizaciones, los linfocitos B o celulas progenitoras se cultivan en condiciones y durante periodos de tiempo suficientes de modo que 10%, 15%, 20%,

30 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o incluso 100% de los linfocitos B se diferencian y/o activan como se desea. En una realizacion, los linfocitos B se activan y se diferencian en celulas plasmaticas. Como reconocera el experto en la materia, las celulas plasmaticas se pueden identificar por patrones de expresion de protelnas de superficie celular usando procedimientos estandar de citometrla de flujo, como se describe en otra parte en el presente documento, tal como por la expresion de CD38, CD78, el receptor de 35 interleuquina 6, CD27alto, CD138, y la falta de expresion de marcadores celulares pan-B comunes, tales como CD19 y CD20 y la falta de expresion de CD45.

[0036] En algunas realizaciones, las celulas se cultivan durante 1-7 dlas. En realizaciones adicionales, las celulas se cultivan 7, 14, 21 dlas o mas. Por lo tanto, las celulas se pueden cultivar en condiciones adecuadas

40 durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o mas dlas. Las celulas se vuelven a poner en placa, se pueden anadir o cambiar medio y complementos segun sea necesario, usando tecnicas conocidos en la materia.

[0037] En algunas realizaciones, los linfocitos B transducidos o celulas progenitoras se pueden cultivar en 45 condiciones y durante periodos de tiempo suficientes de modo que al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%,

40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las celulas se diferencian y activan para producir Ig y/o para expresar el transgen de interes.

[0038] La induction de activacion de linfocitos B se puede medir por tecnicas tales como incorporation de 3H- 50 uridina en ARN (cuando se diferencian los linfocitos B, aumenta la slntesis de ARN), o por incorporacion de 3H-

timidina, que mide la slntesis de ADN asociada con la proliferacion celular. Para la medicion optima de la proliferacion de linfocitos B, se puede anadir interleuquina 4 (IL-4) al medio de cultivo en una concentration adecuada, tal como aproximadamente 10 ng/ml.

55 [0039] Alternativamente, la activacion de linfocitos B se puede medir como funcion de la secrecion de

inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede anadir CD40L a los linfocitos B en reposo junto con IL-4 (p. ej., 10 ng/ml) e IL-5 (p. ej., 5 ng/ml) u otras citoquinas adecuadas para la activacion de linfocitos B. Tambien se puede usar la citometrla de flujo para medir marcadores de superficie celular tlpicos de linfocitos B activados. Vease, p. ej., Civin Cl, Loken MR, Int'l J. Cell Cloning 1987; 5:1-16; Loken, MR, et al., “Flow Cytometry Characterization of Erythroid,

Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow”, en Flow Cytometry in Hematology, Laerum OD, Bjerksnes R. eds., Academic Press, New York 1992; pp. 31-42; y LeBein TW, et al., Leukemia 1990; 4:354-358.

[0040] Despues de cultivar durante un periodo de tiempo adecuado, tal como de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o mas 5 dlas, en general aproximadamente 3 dlas, se puede anadir un volumen adicional de medio de cultivo. Se puede

recoger el llquido sobrenadante de cultivos individuales en diferentes tiempos durante el cultivo y cuantificar la IgM e IGi como describen Noelle et a., (1991) J. Immunol. 146:1118-1124. En realizaciones adicionales, los cultivos se pueden recoger y medir la expresion del transgen de interes usando citometrla de flujo, ELISA, ELISPOT u otro ensayo conocido en la tecnica.

10

[0041] En realizaciones adicionales, se puede usar el enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA) para medir la IgM u otra produccion de isotipo de anticuerpo o para la produccion del transgen de interes. En algunas realizaciones, las determinaciones de IgG se pueden hacer usando anticuerpos disponibles en el comercio tales como anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana, como anticuerpo de captura, seguido de detection usando

15 cualquiera de una variedad de reactivos de deteccion adecuados tales como anticuerpo de cabra dirigido contra Ig humana biotinilado, estreptavidina, fosfatasa alcalina y sustrato.

Vectores viricos

20 [0042] Algunas realizaciones usan vectores viricos para transducir celulas plasmaticas tales como linfocitos B

con los sistemas de expresion descritos en el presente documento. Los ejemplos de vectores viricos incluyen, sin limitation, vectores basados en adenovirus, vectores basados en virus adenoasociados (AAV), vectores retrovlricos, vectores retrovlricos-adenovlricos, y vectores derivados del virus herpes simple (HSV), incluyendo vectores amplicones, HSV de replication defectuosa y HSV atenuado (vease, p. ej., Krisky, Gene Ther. 5: 1517-30, 1998; 25 Pfeifer, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211,2001).

[0043] Algunas realizaciones, se refieren al uso de vectores retrovlricos, o vectores derivados de retrovirus. Los “retrovirus” son virus de ARN con envuelta que son capaces de infectar celulas animales, y que usan la enzima transcriptasa inversa en las etapas tempranas de infection para generar una copia de ADN a partir de su genoma de

30 ARN, que despues tlpicamente es integrado en el genoma del hospedante. Los ejemplos de vectores retrovlricos son vectores derivados del virus de la leucemia murina Moloney (MLV), vectores retrovlricos basados en un virus de citoblastos murinos, que proporciona expresion estable a largo plazo en celulas diana tales como celulas precursoras hematopoyeticas y su progenie diferenciada (vease, p. ej., Hawley et al., PNAS USA 93:10297-10302, 1996; Keller et al., Blood 92:877-887, 1998), vectores hlbridos (vease, p. ej., Choi, et al., Stem Cells 19:236-246, 35 2001), y vectores derivados de retrovirus complejos, tales como vectores lentivfricos.

[0044] Como se ha indicado antes, algunas realizaciones usan vectores lentivlricos. El termino “lentivirus” se refiere a un genero de retrovirus complejos que son capaces de infectar tanto celulas que se dividen como que no se dividen. Los ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de inmunodeficiencia humana; que incluye VIH de tipo 1 y VIH

40 de tipo 2), visna-maedi, el virus de la artritis-encefalitis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia felina (FIV), virus de inmunodeficiencia bovina (BIV), y virus de inmunodeficiencia simia (SIV). Los vectores lentivlricos se pueden obtener de uno cualquiera o mas de estos lentivirus (vease, p. ej., Evans et al., Hum Gene Ther. 10:1479-1489, 1999; Case et al., PNAS USA 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., PNAS USA 95:1193911944, 1998; Miyoshi et al., Science 283:682-686, 1999; Sutton et al., J Virol 72:5781-5788, 1998; y Frecha et al., 45 Blood. 112:4843-52, 2008).

[0045] Se ha publicado que los linfocitos T y B en reposo se pueden transducir mediante un LV recubierto de VSVG que lleva la mayorla de las protelnas accesorias del VIH (vif, vpr, vpu y nef) (vease, p. ej., Frecha et al., 2010 Mol. Therapy 18:1748). Sin embargo, la inclusion de dichas protelnas genera problemas de seguridad. Una ventaja

50 de los vectores descritos en el presente documento es que no son necesarias protelnas accesorias. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el vector retrovlrico comprende determinadas secuencias mlnimas de un genoma de lentivirus, tal como el genoma del VIH o el genoma del SIV. El genoma de un lentivirus tlpicamente esta organizado en una region de repeticiones terminales largas 5' (LTR), el gen gag, el gen pol, el gen env, los genes accesorios (p. ej., nef, vif, vpr, vpu, tat, rev) y una region LTR 3'. La LTR vlrica se divide en tres regiones denominadas U3, R 55 (repetition) y U5. La region U3 contiene elementos potenciadores y promotores, la region U5 contiene las senales de poliadenilacion, y la region R separa las regiones U3 y U5. Las secuencias transcritas de la region R aparecen en los extremos tanto 5' como 3' del ARN vlrico (vease, p. ej., "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70:1617-1639, 1989; Fields et al., Fundamental Virology Raven Press., 1990; Miyoshi et al., J Virol. 72:8150-7,1998; y patente de EE.UU. n° 6.013.516). Los

vectores lentivfricos pueden comprender uno cualquiera o mas de estos elementos del genoma lentivfrico, para regular la actividad del vector segun se desee, o pueden contener eliminaciones, inserciones, sustituciones o mutaciones, en uno o mas de estos elementos, de modo que se reduzcan los efectos patologicos de la replication lentivlrica, o se limite el vector lentivlrico a una sola ronda de infection.

5

[0046] Tlpicamente, un vector retrovlrico mlnimo comprende algunas secuencias LTR 5' y LTR 3', uno o mas genes de interes (que se van a expresar en la celula diana), uno o mas promotores, y una secuencia que actua en cis para el empaquetamiento del ARN. Se pueden incluir otras secuencias reguladoras, como se describe en el presente documento y se conocen en la materia. El vector vlrico tlpicamente se clona en un plasmido que se puede

10 transfectar en una llnea celular de empaquetamiento, tal como una celula eucariota (p. ej., 293-HEK), y tlpicamente tambien comprende secuencias utiles para la replicacion del plasmido en bacterias.

[0047] En algunas realizaciones, el vector vlrico comprende secuencias de las LTR 5' y/o 3' de un retrovirus tal como un lentivirus. Las secuencias de LTR pueden ser secuencias de LTR de cualquier lentivirus de cualquier

15 especie. Por ejemplo, pueden ser secuencias de LTR de VIH, SIV, FIV o BIV. Preferiblemente, las secuencias de LTR son secuencias de LTR del VIH.

[0048] En algunas realizaciones, el vector vlrico comprende las secuencias R y U5 de la LTR 5' de un lentivirus y una LTR 3' inactivada o “autoinactivante” de un lentivirus. Una “LTR 3' autoinactivante” es una repetition

20 terminal larga (LTR) 3' que contiene una mutation, sustitucion o elimination que previene que las secuencias LTR dirijan la expresion de un gen en la direction 3'. Una copia de la region U3 de la LTR 3' actua como un molde para la generation de ambas LTR en el provirus integrado. Por lo tanto, cuando la LTR 3' con una eliminacion o mutacion inactivante se integra como la LTR 5' del provirus, no es posible la transcription a partir de la LTR 5'. Esto elimina la competition entre el potenciador/promotor vlrico y cualquier potenciador/promotor interno. Las LTR 3' 25 autoinactivantes se describen, por ejemplo, en Zufferey et al., J Virol. 72:9873-9880, 1998; Miyoshi et al., J Virol. 72:8150-8157, 1998; y Iwakuma et al., Virology 261:120-132, 1999.

[0049] Las LTR 3' autoinactivantes se pueden generar por cualquier procedimiento conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, el elemento U3 de las LTR 3' contiene una eliminacion de su secuencia potenciadora,

30 preferiblemente la caja TATA, sitios SpI y/o NF-kappa B. Como resultado de las LTR 3' autoinactivantes, el provirus que se integra en el genoma de la celula hospedante comprendera una LTR 5' inactivada.

[0050] Los vectores vlricos proporcionados en el presente documento, comprenden tlpicamente un gen que codifica una protelna (u otra molecula, tal como ARNip) que es expresada convenientemente en una o mas celulas

35 diana. Preferiblemente, el gen de interes esta situado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3'. Ademas, el gen de interes preferiblemente esta en una relation funcional con otros elementos geneticos, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripcion tales como promotores y/o potenciadores, para regular la expresion del gen de interes de una forma particular una vez que el gen se incorpora en la celula diana. En algunas realizaciones, las secuencias reguladoras de la transcripcion utiles son aquellas altamente reguladas con respecto a la actividad, tanto 40 temporal como espacialmente.

[0051] En algunas realizaciones, se pueden incorporar uno o mas genes adicionales como una medida de seguridad, principalmente para permitir la muerte selectiva de celulas diana infectadas dentro de una poblacion heterogenea, tal como dentro de un paciente humano. En una realization de ejemplo, el gen seleccionado es un gen

45 de timidina quinasa (TK), cuya expresion hace a la celula diana susceptible a la action del farmaco ganciclovir. En una realizacion adicional, el gen suicida es un gen suicida de caspasa 9.

[0052] En algunas realizaciones, se puede poner un gen que codifica una protelna marcadora antes o despues del gen principal para la identification de celulas que expresan la protelna deseada. Algunas realizaciones

50 incorporan una protelna marcadora fluorescente, tal como la protelna verde fluorescente (GFP) o la protelna roja fluorescente (RFP), junto con el gen principal de interes. Si se incluyen uno o mas genes indicadores adicionales, tambien se pueden incluir secuencias IREs o elementos 2A, separando el gen principal de interes de un gen indicador y/o cualquier otro gen de interes.

55 [0053] Algunas realizaciones pueden usar genes que codifican uno o mas marcadores estables. Los

ejemplos incluyen marcadores seleccionables que son eficaces en una celula eucariota o una celula procariota, tal como un gen para una resistencia a farmaco que codifica un factor necesario para la supervivencia o crecimiento de las celulas hospedantes transformadas en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selection de ejemplo codifican protelnas que confieren resistencia a antibioticos y otras toxinas, p. ej., G418, higromicina B, puromicina,

zeocina, ouabaina, blasticidina, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotroficas del complemento, o puede haber suministro presente en un plasmido separado e introducirlo por cotransfeccion con el vector vlrico.

5 [0054] Algunos vectores vlricos tales como los vectores retrovlricos usan uno o mas promotores heterologos,

potenciadores o ambos. En algunas realizaciones, la secuencia U3 de una LTR 5' retrovlrica o lentivlrica se puede sustituir por un promotor o potenciador en la construccion vlrica. Algunas realizaciones usan un promotor/potenciador “interno” que esta situado entre las secuencias LTR 5' y LTR 3' del vector vlrico, y esta operativamente unido al gen de interes. Una “relacion funcional” y “operativamente unido” significa, sin limitacion, 10 que el gen esta en la posicion y orientacion correctas con respecto al promotor y/o potenciador, de modo que se afectara la expresion del gen cuando el promotor y/o potenciador se pongan en contacto con las moleculas reguladoras adecuadas. Se puede usar cualquier combinacion de potenciador/promotor que regule (p. ej., aumente, disminuya) la expresion del genoma de ARN vlrico en la llnea celular de empaquetamiento, regule la expresion del gen seleccionado de interes en una celula diana infectada, o ambos.

15

[0055] Un promotor es un elemento de control de la expresion formado por una secuencia de ADN que permite la union de la ARN polimerasa y que tenga lugar la transcripcion. Los promotores son secuencias no traducidas que estan situadas en la direction 5' del codon de inicio de un gen seleccionado de interes (tlpicamente en aproximadamente de 100 a 1000 pb) y controlan la transcripcion y traduction de la secuencia de polinucleotido

20 codificante a la que estan operativamente unidos. Los promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles mayores de transcripcion del ADN bajo su control en respuesta a algun cambio en condiciones de cultivo, tales como un cambio en la temperatura.

[0056] Se conocen una variedad de promotores en la tecnica, as! como procedimientos para unir 25 operativamente el promotor a la secuencia codificante de polinucleotido. Se pueden usar tanto secuencias

promotoras naturales como muchos promotores heterologos para dirigir la expresion del gen seleccionado de interes. Algunas realizaciones usan promotores heterologos, porque en general permiten una mayor transcripcion y mayores rendimientos de la protelna deseada comparado con el promotor natural.

30 [0057] Algunas realizaciones pueden usar promotores vlricos heterologos. Los ejemplos de dichos

promotores incluyen los obtenidos de genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40). Algunas realizaciones pueden usar promotor de mamlfero heterologo, tal como promotor de la actina, un promotor de inmunoglobulina, un promotor de choque termico o un promotor que esta asociado con la 35 secuencia natural del gen de interes. Tlpicamente, el promotor es compatible con la celula diana, tal como un linfocito B quiescente, un linfocito B activado, un linfocito B plasmatico, un linfocito B de memoria u otra celula diana linfocltica.

[0058] Algunas realizaciones pueden usar uno o mas promotores de la ARN polimerasa I y III. Se puede

40 encontrar una selection adecuada de promotores de la ARN polimerasa III, por ejemplo, en Paule and White. Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298, 2000, que se incorpora por referencia en su totalidad. Los promotores de la ARN polimerasa II y III tambien incluyen cualquier fragmento de ADN sintetico o geneticamente manipulado que puede dirigir la ARN polimerasa II o III, respectivamente, para transcribir sus secuencias codificantes de ARN en la direccion 3'. Ademas, el promotor o promotores de la ARN polimerasa II o III (Pol II o III) 45 usados como parte del vector vlrico pueden ser inducibles. Se puede usar cualquier promotor de Pol II o III inducible adecuado con los procedimientos descritos en el presente documento. Los ejemplos de promotores de Pol II o III incluyen los promotores sensibles a tetraciclina proporcionados en Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585, 2000; y Meissner et al., Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682, 2001.

50 [0059] Los ejemplos no limitantes de promotores constitutivos que se pueden usar incluyen el promotor de la

ubiquitina, el promotor del CMV (vease, p. ej., Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169:13, 1989), de la p-actina (vease, p. ej., Gunning et al., PNAS USA 84:4831-4835, 1987), y el promotor de pgk (vease, p. ej., Adra et al., Gene 60:6574, 1987); Singer-Sam et al., Gene 32:409-417, 1984; y Dobson et al., Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 1982).

55 [0060] Los ejemplos no limitantes de promotores especlficos de tejido incluyen el promotor lck (vease, p. ej.,

Garvin et al., Mol. Cell Biol. 8:3058-3064, 1988; y Takadera et al., Mol. Cell Biol. 9:2173-2180, 1989), el promotor de miogenina (Yee et al., Genes and Development 7:1277-1289. 1993), y el thy1 (vease, p. ej., Gundersen et al., Gene 113:207-214, 1992).

[0061] Los ejemplos adicionales de promotores incluyen el promotor de la ubiquitina C, el promotor de la

cadena pesada p humana o el promotor de la cadena pesada de Ig (p. ej., MH-b12), y el promotor de la cadena ligera k o el promotor de la cadena ligera de Ig (p. ej., EEK-b12) que son funcionales en linfocitos B. El promotor MH- b12 contiene el promotor de la cadena pesada p humana precedido por el potenciador iEp, flanqueado por regiones 5 de asociacion de matriz, y el promotor EEK-b12 contiene el promotor de la cadena ligera k precedido de un potenciador intronico (iEK), una region asociada a la matriz, y un potenciador 3' (3'Ek) (vease, p. ej., Luo et al., Blood. 113:1422-1431, 2009, y solicitud de patente de EE.UU. publicada 20100203630). Por consiguiente, algunas realizaciones pueden usar uno o mas de estos elementos promotores o potenciadores.

10 [0062] Como se ha indicado antes, algunas realizaciones pueden usar elementos potenciadores, tales como

un potenciador interno para aumentar la expresion del gen de interes. Los potenciadores son elementos de ADN que actuan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actuan en un promotor para aumentar su transcription. Algunas secuencias de potenciadores pueden derivar de genes de mamlfero (p. ej., globina, elastasa, albumina, a-fetoprotelna, insulina), tal como el potenciador iEp, el potenciador intronico iEK y el 15 potenciador 3' Ek. Tambien estan incluidos potenciadores de un virus eucariota, que incluye el potenciador de SV40 en el lado tardlo del origen de replication (pb 100-270), el promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardlo del origen de replicacion y potenciadores adenovlricos. Los potenciadores se pueden empalmar en el vector en la position 5' o 3' a la secuencia de polinucleotido especlfica del antlgeno, pero preferiblemente se situan en un sitio 5' desde el promotor. Los expertos en la materia seleccionaran el potenciador 20 adecuado basandose en el patron de expresion deseado.

[0063] En algunas realizaciones, los promotores se pueden seleccionar para permitir la expresion inducible del gen. Se conocen en la tecnica una serie de sistemas para le expresion inducible, que incluyen el sistema sensible a la tetraciclina y el sistema operador-represor lac. Tambien esta contemplado que se puede usar una

25 combination de promotores para obtener la expresion deseada del gen de interes. El experto en la materia podra seleccionar un promotor basandose en el patron de expresion deseado del gen en el organismo y/o celula diana de interes.

[0064] Algunos vectores vlricos contienen secuencias de empaquetamiento que actuan en cis para promover 30 la incorporation del ARN vlrico genomico en la partlcula vlrica. Los ejemplos incluyen secuencias psi. Dichas

secuencias que actuan en cis son conocidas en la materia.

[0065] En algunas realizaciones, los vectores vlricos descritos en el presente documento pueden expresar dos o mas genes, lo cual se puede llevar a cabo, por ejemplo, incorporando un promotor interno que esta

35 operativamente unido a cada gen separado mas alla del primer gen, incorporando un elemento que facilita la co- expresion tal como una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES) (Patente de EE.uU. n° 4.397.190, incorporada por referencia) o un elemento 2A, o ambos.

[0066] Simplemente a modo de ilustracion, los elementos IRES o 2A se pueden usar cuando un solo vector 40 comprende secuencias que codifican cada cadena de una molecula de inmunoglobulina con una especificidad

deseada. Por ejemplo, la primera region codificante (que codifica bien la cadena pesada o la ligera) puede estar ubicada inmediatamente en la direction 3' desde el promotor, y la segunda region codificante (que codifica la otra cadena) puede ser ubicada en la direccion 3' desde la primera region codificante, con un elemento IRES o 2A ubicado entre la primera y la segunda region codificantes, preferiblemente precediendo inmediatamente a la 45 segunda region codificante. En otra realizacion, un elemento IRES o 2A se usa para coexpresar un gen no relacionado, tal como un gen indicador, un marcador seleccionable o un gen que potencia la funcion inmunitaria.

[0067] Los ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar incluyen, sin limitation, los elementos IRES del virus de la encefalomielitis (EMVC), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la encefalomielitis murina de

50 Theiler (TMEV), rinovirus humano (HRV), virus de Coxsackie (CSV), poliovirus (POLIO), virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis C (HCV), y Pestivirus (p. ej., virus del colera porcino (HOCV) y virus de la diarrea vlrica bovina (BVDV)) (vease, p. ej., Le et al., Virus Genes 12:135-147, 1996; y Le et al., Nuc. Acids Res. 25:362-369, 1997).

55 [0068] Un ejemplo de un elemento 2A incluye la secuencia F2A del virus de la fiebre aftosa.

[0069] En algunas realizaciones, los vectores vlricos proporcionados en el presente documento pueden

contener tambien elementos geneticos adicionales para lograr un resultado deseado. Por ejemplo, algunos vectores vlricos pueden incluir una senal que facilita la entrada nuclear del genoma vlrico en la celula diana, tal como una

senal flap de VIH-1. Como ejemplo adicional, algunos vectores vlricos pueden incluir elementos que facilitan la caracterizacion del sitio de integracion del provirus en la celula diana, tal como una secuencia supresora de ARNt ambar. Algunos vectores vlricos pueden contener uno o mas elementos geneticos disenados para potenciar la expresion del gen de interes. Por ejemplo, se puede poner el elemento sensible al virus de la hepatitis de la marmota 5 (WRE) en la construccion (vease, p. ej., Zufferey et al., J. Virol. 74:3668-3681, 1999; y Deglon et al., Hum. Gene Ther. 11:179-190, 2000).

[0070] Como otro ejemplo, tambien se puede incluir un aislante de globina p de pollo en la construccion vlrica. Se ha mostrado que este elemento reduce la posibilidad de silenciar el provirus integrado en la celula diana

10 debido a la metilacion y efectos de heterocromatinizacion. Ademas, el aislante puede proteger el potenciador interno, promotor y gen exogeno de efectos de posicion positivos o negativos del ADN que rodea en el sitio de integracion en el cromosoma. Algunas realizaciones usan todos dichos elementos geneticos.

[0071] En algunas realizaciones, los vectores vlricos (p. ej., retrovlricos, lentivlricos) proporcionados en el 15 presente documento son “pseudotipados” con una o mas glucoprotelnas vlricas seleccionadas o protelnas de

envuelta, principalmente para dirigirse a tipos de celulas seleccionados. El pseudotipado se refiere en general, a la incorporacion de una o mas glucoprotelnas vlricas heterologas en la partlcula vlrica en la superficie celular, a menudo permitiendo que la partlcula vlrica infecte una celula seleccionada que difiere de sus celulas diana normales. Un elemento “heterologo” deriva de un virus distinto del virus del cual deriva el genoma de ARN del vector 20 vlrico. Tlpicamente, las regiones que codifican glucoprotelnas del vector vlrico se han alterado geneticamente, tal como por elimination para prevenir la expresion de su propia glucoprotelna. Simplemente a modo de ilustracion, las glucoprotelnas de la envuelta gp41 y/o gp120 de un vector lentivfrico derivado de VIH, tlpicamente se eliminan antes del pseudotipado con una glucoprotelna vlrica heterologa.

25 [0072] En algunas realizaciones, el vector vlrico es pseudotipado con una glucoprotelna vlrica heterologa que

dirige a celulas plasmaticas tales como linfocitos B. En algunas realizaciones, la glucoprotelna vlrica permite la infection o transduction selectiva de linfocitos B en reposo o quiescentes. En algunas realizaciones, la glucoprotelna vlrica permite la infeccion selectiva de linfocitos B activados. En algunas realizaciones, la glucoprotelna vlrica permite la infeccion o transduccion tanto de linfocitos B quiescentes como de linfocitos B activados. En algunas 30 realizaciones, la glucoprotelna vlrica permite la infeccion de celulas de leucemia linfocltica cronica de linfocitos B. En algunas realizaciones, la glucoprotelna vlrica heterologa se obtiene de la glucoprotelna del virus del sarampion, tal como el virus del sarampion de Edmonton. En algunas realizaciones se realiza el pseudotipado de las glucoprotelnas del virus del sarampion hemaglutinina (H) y protelna de fusion (F), o ambos (vease, p. ej, Frecha et al., Blood. 112:4843-52, 2008; y Frecha et al., Blood. 114:3173-80, 2009).

35

[0073] En realizaciones adicionales, el vector vlrico comprende un dominio de union a anticuerpo insertado,

tal como una o mas regiones variables (p. ej., regiones variables de la cadena pesada y ligera) que sirven para dirigir el vector a un tipo de celula particular.

40 [0074] La generation de vectores vlricos se puede llevar a cabo usando cualquier tecnica de ingenierla

genetica adecuada conocida en la materia, que incluye, sin limitation, las tecnicas estandar de digestion con endonucleasas de restriction, ligado, transformation, purification de plasmido, amplification por PCR, secuenciacion de ADN, por ejemplo, como describen Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin y col. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) y 45 "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).

[0075] Se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica para producir

partlculas retrovlricas adecuadas cuyo genoma comprende una copia de ARN del vector vlrico. Como un procedimiento, el vector vlrico se puede introducir en una llnea celular de empaquetamiento que empaqueta el ARN 50 genomico vlrico basado en el vector vlrico en partlculas vlricas con una especificidad de celula diana deseada. La llnea celular de empaquetamiento tlpicamente proporciona las protelnas vlricas en trans que son necesarias para el empaquetamiento del ARN genomico vlrico en partlculas vlricas e infectar la celula diana, que incluye las protelnas gag estructurales, las protelnas pol enzimaticas, y las glucoprotelnas de la envuelta.

55 [0076] En algunas realizaciones, la llnea celular de empaquetamiento puede expresar establemente algunas

protelnas vlricas necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol) (vease, p. ej., patente de EE.UU. n° 6.218.181). En algunas realizaciones, la llnea celular de empaquetamiento se puede transfectar transitoriamente con plasmidos que codifican algunas de las protelnas vlricas necesarias o deseadas (p. ej., gag, pol, glucoprotelna), que incluyen las secuencias de glucoprotelnas del virus del sarampion descritas en el presente documento, En una realization de

ejemplo, la ilnea celular de empaquetamiento expresa establemente las secuencias de gag y pol, y la llnea celular despues se transfecta con un plasmido que codifica el vector vlrico y un plasmido que codifica la glucoprotelna. Despues de la introduccion de los plasmidos deseados, las partlculas vlricas se recogen y procesan en consecuencia, tal como por ultracentrifugacion para lograr una solucion madre concentrada de partlculas vlricas. Las 5 llneas celulares de empaquetamiento incluyen las llneas celulares 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430).

Gen/acido nucleico de interes

10 [0077] Como se usa en el presente documento “gen de interes” o “gen” o “acido nucleico de interes” se

refiere a un acido nucleico de interes que codifica una protelna de interes que va a ser expresada en la celula transducida diana. Aunque se puede usar el termino “gen” este no implica que sea un gen como se encuentra en el ADN genomico y se usa de forma intercambiable con el termino “acido nucleico”. En general, el acido nucleico de interes proporciona acido nucleico adecuado para codificar la protelna de interes y puede comprender ADNc o ADN 15 y puede incluir o no intrones, pero en general no incluye intrones. Como se indica en otra parte, el acido nucleico de interes esta operativamente unido a secuencias de control de la expresion para expresar eficazmente la protelna de interes en la celula diana. En algunas realizaciones, los vectores descritos en el presente documento pueden comprender dos o mas genes de interes, y pueden incluir 2, 3 o 4 genes de interes, tales como, por ejemplo, las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina que pueden estar organizados usando un promotor interno como 20 se describe en el presente documento.

[0078] La cita de “polinucleotido” o “acido nucleico” como se usa en el presente documento indica ARNm, ARN, ARNc, ADNc o ADN. El termino tlpicamente se refiere a la forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases de longitud, sea ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido.

25 El termino incluye formas mono y bicatenarias de ADN y ARN.

[0079] El acido nucleico o gen de interes puede se cualquier acido nucleico que codifique una protelna de interes. Una protelna de interes para usar como se describe en el presente documento comprende cualquier protelna que proporcione la actividad deseada. En relacion con esto, una protelna de interes incluye, pero no se

30 limita a un anticuerpo o fragmento de union al antlgeno del mismo, un receptor de superficie celular, una protelna secretada tal como una citoquina (linfoquinas, interleuquinas, interferones o quimioquinas), una molecula pequena codificada por ADN (vease, p. ej., Nature Chemical Biology 5, 647 - 654 (2009)), o una molecula de adhesion.

[0080] En una realizacion, el acido nucleico codifica un anticuerpo o fragmento de union al antlgeno del 35 mismo. Los fragmentos de union al antlgeno de ejemplo incluyen dominios de anticuerpos, sFv, scFv, Fab, Fab',

F(ab')2, Fv). En una realizacion, el anticuerpo codificado por el acido nucleico comprende al menos el dominio de union al antlgeno del anticuerpo neutralizante del VIH, b12 (vease, p. ej., J Virol 2003, 77:5863-5876; J Virol. 1994 Aug; 68(8):4821-8; Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89:9339-9343; se proporcionan secuencias de ejemplo con los numeros de acceso en GenBank para la cadena ligera b12 (AAB26306.1 Gl 299737) y la cadena pesada 40 (AAB26315.1 Gl 299746)). En una realizacion adicional, el anticuerpo codificado por el acido nucleico de interes comprende Fuzeon™ (T-20 / enfuvirtida / pentafusida / DP-178). DP-178 es una secuencia de aminoacidos de gp14 del VIH e interfiere con la capacidad del VIH para fusionarse con su celula diana. Fuzeon se puede producir sinteticamente usando procedimientos conocidos para el experto en la materia (vease, p. ej., 2001 J. Virol. 75:30383042; debe indicarse que es muy improbable que los procedimientos descritos en este artlculo produzcan la 45 secrecion de una dosis terapeutica del peptido DP-178).

[0081] En una realizacion particular, el acido nucleico de interes codifica una protelna inmunologicamente activa. En algunas realizaciones, un acido nucleico de interes codifica una protelna, o un fragmento biologicamente activo de la misma, que induce una reaccion inmunitaria similar a vacuna por la presentacion de la protelna en la

50 superficie del linfocito B, linfocito T u otra celula inmunitaria. En algunas realizaciones, la protelna de interes influye en la regulation de los linfocitos B, por ejemplo, pero no limitado a, promueve la division celular, promueve la diferenciacion en linajes B diferentes, inactiva o mata celulas, o regula la production o actividad de otros elementos de ADN introducidos. El experto en la tecnica conoce las interleuquinas y hasta la fecha incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, 55 IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, secretado de la subunidad p28 de IL27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, e IL- 35. Los interferones incluyen IFN-y, IFN-a, IFN-p e IFN-w. Las quimioquinas contempladas para usar en el presente documento incluyen quimioquinas de tipo C XCL1 y XCL2, quimioquinas de tipo C-C (que hasta la fecha incluyen CCL1-CCL28) y quimioquinas de tipo CXC (que hasta la fecha incluyen CXCL1-CXCL17). Tambien estan contemplados como gen de interes, miembros de la superfamilia del TNF (p. ej., TNF-a, ligando 4-1BB, factor de

activacion de linfocitos B, ligando FAS, linfotoxina, OX40L RANKL, y TRAIL).

[0082] En algunas realizaciones, la proteina de interes induce tolerancia inmunologica. En relacion con esto, la proieina de interes puede comprender una proteina de fusion de IgG-antigeno (vease, p. ej., Cellular Immunology

5 235(1), 2005, 12-20).

[0083] En una realization adicional, el o los genes de interes codifican uno o mas factores que promueven la diferenciacion del linfocito B en una celula que segrega anticuerpo y/o uno o mas factores que promueven la longevidad de la celula que produce anticuerpos. Dichos factores incluyen, por ejemplo, Blimp-1, TRF4, factores

10 antiapoptoticos como Bcl-xl o Bcl5, mutantes del receptor CD40 constitutivamente activos. Genes adicionales de interes codifican factores que promueven la expresion de moleculas de serialization en la direction 3' tales como factores asociados con el receptor de TNF (TRAF). En relacion con esto, la activacion de celulas, supervivencia celular y funciones antiapoptoticas de la superfamilia de receptores de TNF, son mediadas principalmente por TRAF1-6 (vease, p. ej., R.H. Arch, et al., Genes Dev. 12 (1998), pp. 2821-2830). Los efectores en la direccion 3' de 15 la senalizacion de TRAF incluyen factores de transcription en la familia de NF-kB y AP-1 que a su vez pueden poner en marcha genes implicados en diferentes aspectos de las funciones celular e inmunitaria. Ademas, se ha mostrado que la activacion de NF-kB y AP-1 proporciona protection a las celulas frente a la apoptosis a traves de la transcripcion de genes antiapoptoticos.

20 [0084] En una realizacion adicional, el o los acidos nucleicos de interes codifican una o mas de proteinas

derivadas del virus de Epstein Barr (EBV). Las proteinas derivadas de EBV incluyen, pero no se limitan a, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, EBER, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA y EBV-AN.

[0085] En una realizacion particular, el acido nucleico de interes codifica un anticuerpo o un fragmento de

25 union al antigeno del mismo. En relacion con esto, el anticuerpo puede ser un anticuerpo natural o un anticuerpo modificado por ingenieria genetica recombinante adaptado. Esta especificamente contemplado que proteinas de fusion que comprenden un anticuerpo o parte del mismo estan codificadas por los vectores descritos en el presente documento.

30 [0086] En una realizacion, un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la presente description tiene

una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo dirigido contra el VIH, tal como el anticuerpo dirigido contra el VIH m36 (vease, p. ej., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Nov 4;105(44):17121-6), o una molecula de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo dirigido contra el VIH, tal como m36. En particular, estan especificamente 35 contempladas proteinas de fusion que comprenden m36 o derivados del mismo, tales como m36L2CD4Fc (vease, p. ej., Antiviral Research volume 88, Issue 1, October 2010, Pages 107-115).

[0087] En una realizacion adicional, el anticuerpo codificado por el transgen de la descripcion, se une a un autoantigeno. En algunas realizaciones, el autoantigeno en relacion con esto, esta asociado con el desarrollo de la

40 esclerosis multiple o diabetes de tipo 1, incluyendo, pero no limitado a MBP, alfaB-cristalina, S100beta, proteina proteolipidica (PLP), HSP105, isoforma epitelial del antigeno 1 del penfigo ampolloso (BP) (BPAG1-e), Kpidos, y glucoproteina mielinica de oligodendrocitos isoformas (MOG)-alfa y MOG-beta o cualquiera de una variedad de autoantigenos de celulas de los islotes (p. ej., sialoglucolipido, glutamato descarboxilasa, insulina, receptor de insulina, 38 kD, albumina de suero bovino, transportador de glucosa, hsp 65, carboxipeptidasa H, 52 kD, ICA 45 12/ICA512, 150 kD, y RIN polar). Los anticuerpos contra estos autoantigenos son conocidos en la tecnica y se pueden secuenciar y hacer de forma recombinante usando tecnicas rutinarias (vease, p. ej., J. Clin. Invest. 107(5): 555-564 (2001)).

[0088] En una realizacion adicional, el anticuerpo se une a un antigeno asociado con cancer. Los antigenos 50 asociados con cancer pueden derivar de una variedad de proteinas tumorales. Las proteinas tumorales ilustrativas

utiles en la presente descripcion incluyen, pero no se limitan a una cualquiera o mas de p53, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, - 7B, NA88-A, NY-ESO-1, MART-1, MC1 R, Gp100, PSA, PSM, Tirosinasa, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, Her2/neu (p. ej., el anticuerpo puede derivar del mAb especifico para Her2, Herceptin®), hTERT, hTRT, iCE, 55 MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, WT1, AFP, p-catenina/m, Caspasa-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART-2, TRP- 2/INT2, 707-AP, Anexina II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RARa, y TEL/AML1. Estas y otras proteinas tumorales son conocidas para el experto en la materia.

[0089] En realizaciones adicionales, el acido nucleico de interes codifica un peptido u otro dominio de union con un atributo funcional particular, tal como, pero no limitado a una actividad inhibidora, capacidad para inducir la muerte celular en celulas de cancer o capacidad para ralentizar o inhibir la proliferation de celulas de cancer. En relation con esto, en una realization, un peptido o dominio de union codificado por el acido nucleico de interes se

5 puede unir a cualquiera de las protelnas diana descritas en el presente documento, tal como un antlgeno asociado con cancer como se ha descrito antes, CD4, HIV gp120 u otras protelnas vlricas, ICAM-3, DC-SIGN (vease, p. ej., patente de EE.UU. 7.301.010). En algunas realizaciones, los peptidos pueden derivar de bacterias patogenas y no patogenas y plantas verdes. Se describen peptidos ilustrativos en las patentes de EE.UU. 7084105, 7301010, 7338766, 7381701, 7491394, 7511117, 7556810. En una realizacion, el acido nucleico de interes codifica azurina- 10 p28 (NSC745104) un inhibidor peptldico de la ubiquitinacion de p53 (vease, p. ej., Cancer Chemother Pharmacol 2010, DOI 10.1007/s00280-010-1518-3; patente de EE.UU. 7.084.105). En una realizacion adicional, el acido nucleico de interes codifica un factor conocido como grelina, que induce apetito y se puede usar para tratar a pacientes con cancer (vease, p. ej., Obes Facts. 2010 3:285-92; FASEB J. 18 (3): 439-56). En otra realizacion, el acido nucleico de interes codifica un peptido de union que se une a, e inhibe la angiopoyetina 1 y 2 (vease, p. ej., 15 AMG386, un fragmento Fc de un anticuerpo (pepticuerpo) usado para tratar el cancer.

[0090] En algunas realizaciones, los antlgenos tumorales se pueden identificar directamente de un individuo con cancer. En relacion con esto, se pueden llevar a cabo cribados usando una variedad de tecnologlas conocidas. Por ejemplo, en una realizacion, se toma una biopsia de tumor de un paciente, se alsla el ARN de las celulas

20 tumorales y se criba usando un chip de gen (por ejemplo, de Affymetrix, Santa Clara, CA) y se identifica un antlgeno tumoral. Una vez se ha identificado el antlgeno tumoral diana, entonces se puede clonar, expresar y purificar usando tecnicas conocidas en la materia.

[0091] Un “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, incluye tanto anticuerpo policlonales como 25 monoclonales; primatizado (p. ej., humanizado); murino; raton-humano; raton-primate; y quimerico; y puede ser una

molecula intacta, un fragmento de la misma (tal como fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2), o multlmeros, o agregados de moleculas intactas y/o fragmentos; y pueden encontrarse en la naturaleza o ser producidos, p. ej., por inmunizacion, slntesis o ingenierla genetica; un “fragmento de anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a fragmentos, derivados de o relacionados con un anticuerpo, que se une al antlgeno y que en algunas 30 realizaciones se puede derivatizar para presentar caracterlsticas estructurales que facilitan la elimination y absorcion, p. ej., por incorporation de restos de galactosa. Esto incluye, p. ej., F(ab), F(ab)'2, scFv, region variable de la cadena ligera (Vl), region variable de la cadena pesada (Vh), y combinaciones de los mismos.

[0092] Las fuentes incluyen secuencias de genes de anticuerpos de diferentes especies (que se pueden 35 formar como anticuerpos, sFvs, scFvs o Fabs, tal como en una biblioteca de fagos), que incluyen humana, camelida

(de camellos, dromedarios o Ilamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413), tiburon (Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804), pez (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39), roedor, aviar, ovino, secuencias que codifican bibliotecas o secuencias de peptidos aleatorias que codifican una diversidad modificada geneticamente de aminoacidos en regiones bucle de regiones 40 armazon de no anticuerpos alternativos, tales como dominios de fibrinogeno (vease, p. ej., Weisel et al. (1985) Science 230:1388), dominios Kunitz (vease, p. ej., patente de EE.UU. N° 6.423.498), dominios de lipocalina (vease, p. ej., el documento WO 2006/095164), dominios de tipo V (vease, p. ej., publication de solicitud de patente de EE.UU. N° 2007/0065431), dominios de lectina de tipo C (Zelensky and Gready (2005) FEBS J. 272:6179), mAb2 o Fcab™ (vease, p. ej., publicacion de solicitud de patente PCT N° WO 2007/098934; WO 2006/072620), o similares. 45

[0093] Los terminos entendidos por los expertos en la materia como relacionados con la tecnologla de anticuerpos tienen el significado que toman en la materia, salvo que se defina expresamente en el presente documento. Por ejemplo, los terminos “Vl” y “Vh” se refieren a la region variable de union derivada de una cadena ligera y pesada de anticuerpo, respectivamente. Las regiones variables de union estan formadas de subregiones

50 discretas, bien definidas, conocidas como “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR) y “regiones armazon” (FR). Los terminos “Cl” y “Ch” se refieren a una “region constante de inmunoglobulina”, es decir una region constante derivada de una cadena ligera o pesada de anticuerpo, respectivamente, entendiendose que esta ultima region se puede dividir ademas en los dominios de region constante Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4, dependiendo del isotipo de anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) del cual se ha obtenido la region. Una parte de los dominios de la region 55 constante componen la region Fc (la region de “fragmento cristalizable”) que contiene dominios responsables de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tales como la ADCC (citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), y fijacion del complemento, union a receptores de Fc, mayor semivida in vivo con respecto a un polipeptido que carece de una region Fc, union a protelna A, y quizas incluso transferencia placentaria (vease, Capon et al. (1989) Nature, 337:525). Ademas, un polipeptido que contiene

una region Fc permite la dimerizacion o multimerizacion del polipeptido.

[0094] La estructura de dominios de inmunoglobulinas es susceptible de modificacion genetica, en cuanto que los dominios de union al antlgeno y los dominios que confieren funciones efectoras se pueden intercambiar

5 entre clases y subclases de inmunoglobulina. La estructura y funcion de la inmunoglobulina se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988). Se puede encontrar una extensa introduccion, as! como informacion detallada sobre todos los aspectos de la tecnologla de anticuerpos recombinante en el libro de texto Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, NY, 1999). Se puede encontrar una completa coleccion de protocolos de laboratorio de modificacion genetica 10 de anticuerpos detallados en R. Kontermann and S. Dubel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000). Se encuentran mas protocolos relacionados disponibles en Current Protocols in Immunology (Agosto 2009) publicado por John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA.

[0095] Por lo tanto, esta description proporciona polinucleotidos (polinucleotidos aislados o purificados o 15 puros) que codifican las protelnas de interes de esta descripcion para modificar geneticamente linfocitos B, vectores

(que incluyen vectores de donation y vectores de expresion) que comprenden dichos polinucleotidos y celulas (p. ej., celulas hospedantes) transformadas o transfectadas con un polinucleotido o vector de acuerdo con esta descripcion.

20 [0096] En algunas realizaciones, esta contemplado un polinucleotido (ADN o ARN) que codifica una protelna

de interes de esta descripcion. Tambien estan contemplados en el presente documento casetes de expresion que codifican protelnas de interes.

[0097] La presente descripcion tambien se refiere a vectores que incluyen un polinucleotido de esta

25 descripcion y, en particular, a construcciones de expresion recombinantes. En una realizacion, esta descripcion contempla un vector que comprende un polinucleotido que codifica una protelna de esta descripcion, junto con otras secuencias de polinucleotido que producen o facilitan la transcripcion, traduccion y procesamiento de dichas secuencias que codifican protelnas.

30 [0098] Se describen vectores de clonacion y expresion adecuados para usar con hospedantes procariotas y

eucariotas, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Los vectores de clonacion/expresion de ejemplo incluyen vectores de clonacion, vectores lanzadera y vectores de expresion, que se pueden basar en plasmidos, fagemidos, fasmidos, cosmidos, virus, cromosomas artificiales o cualquier acido nucleico vehlculo conocido en la materia adecuado para la amplification, 35 transferencia y/o expresion de un polinucleotido contenido en el mismo.

[0099] Como se usa en el presente documento, salvo que se describa otra cosa en relation con los vectores vlricos, “vector” significa una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Los vectores de ejemplo incluyen plasmidos, cromosomas artificiales de levaduras, y genomas vlricos. Algunos

40 vectores se pueden replicar de forma autonoma en una celula hospedante, mientras que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una celula hospedante y de esta forma son replicados con el genoma hospedante. Ademas, algunos vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresion recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresion”) que contienen secuencias de acido nucleico que estan operativamente unidos a una secuencia de control de la expresion y, por lo tanto, son capaces de dirigir la expresion de esas secuencias.

45

[0100] En algunas realizaciones, las construcciones de expresion derivan de vectores plasmldicos. Las construcciones ilustrativas incluyen vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA), que tiene secuencias de acidos nucleicos que codifican un gen de resistencia a la ampicilina, una senal de poliadenilacion y un sitio de promotor T7; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologics, Inc.), que tienen un promotor de CHEF1; y pD18 (Lonza),

50 que tiene un promotor de CMV. Otros vectores de expresion de mamlfero adecuados son bien conocidos (vease, p. ej., Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., vease antes; veanse tambien, p. ej., catalogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ). Se pueden preparar construcciones utiles que incluyen una secuencia que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) bajo control regulador adecuado, para promover niveles de production potenciados de protelnas de fusion, cuyos niveles resultan de la amplificacion de genes despues de la 55 aplicacion de un agente de selection adecuado (p. ej. metotrexato).

[0101] En general, los vectores de expresion recombinantes incluiran orlgenes de replication y marcadores seleccionables que permiten la transformation de la celula hospedante, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcription de una secuencia estructural en la direction 3', como se ha descrito antes. Un

vector unido operativamente con un polinucleotido de acuerdo con esta descripcion, da una construccion de clonacion o expresion. Las construcciones de clonacion/expresion de ejemplo contienen al menos un elemento de control de la expresion, p. ej., un promotor, operativamente unido a un polinucleotido de esta descripcion. Estan contemplados elementos de control de la expresion adicionales, tales como potenciadores, sitios de union 5 especlficos de factor, terminadores y sitios de union al ribosoma, en los vectores y construcciones de clonacion/expresion de acuerdo con esta descripcion. La secuencia estructural heterologa del polinucleotido de acuerdo con esta descripcion se ensambla en la fase adecuada con secuencias de inicio y termination de la traduction. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden incluir acidos nucleicos codificantes proporcionados en el presente documento, en una cualquiera de una variedad de construcciones de vectores de expresion como una construccion 10 de expresion recombinante para expresar dicha protelna en una celula hospedante.

[0102] La o las secuencias de ADN adecuadas se pueden insertar en un vector, por ejemplo, por una variedad de procedimientos. En general, se inserta una secuencia de ADN en un sitio o sitios de escision de endonucleasa de restriction adecuado, por procedimientos conocidos en la tecnica. Estan contempladas las

15 tecnicas estandar para la clonacion, aislamiento de ADN, amplification y purification, para reacciones enzimaticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restriccion y similares, y diferentes tecnicas de separation. Se describe una serie de tecnicas estandar, por ejemplo, en Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al. (Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al. (Molecular 20 Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames and Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK, 1985); y en otros sitios.

[0103] La secuencia de ADN en el vector de expresion esta operativamente unida a al menos una secuencia 25 de control de la expresion adecuada (p. ej., un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la slntesis

de mARN. Los ejemplos representativos de dichas secuencias de control de la expresion incluyen promotores de celulas eucariotas o sus virus, como se ha descrito antes. Las regiones de promotores se pueden seleccionar de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Los promotores de eucariotas incluyen el temprano inmediato de CMV, timidina quinasa de HSV, 30 temprano y tardlo de SV40, LTR de retrovirus, y metalotionelna-I de raton. La selection del vector y promotor adecuados se basara en el nivel de experiencia del experto, y se describe en el presente documento la preparacion de algunas construcciones de expresion recombinantes particularmente preferidas que comprenden al menos un promotor o promotor regulado operativamente unido a un acido nucleico que codifica una protelna o polipeptido de acuerdo con esta descripcion.

35

[0104] Las variantes de los polinucleotidos de esta descripcion tambien estan contempladas. Los polinucleotidos variantes son al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, y preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 99,9% identicos a uno de los polinucleotidos de secuencia definida descritos en el presente documento, o que hibridan con uno o mas de esos polinucleotidos de secuencia definida en condiciones de hibridacion restrictiva

40 de cloruro sodico 0,015 M, citrato sodico 0,0015 M a aproximadamente 65-68°C, o cloruro sodico 0,015 M, citrato sodico 0,0015 M y formamida al 50% a aproximadamente 42°C. Las variantes de polinucleotidos retienen la capacidad de codificar un dominio de union o protelna de fusion del mismo que tiene la funcionalidad descrita en el presente documento.

45 [0105] El termino “restrictivo” se usa para referirse a condiciones que se entienden habitualmente en la

tecnica como restrictivas. La restriccion de la hibridacion esta determinada principalmente por la temperatura, fuerza ionica y la concentration de los agentes desnaturalizantes tales como formamida. Los ejemplos de condiciones restrictivas para la hibridacion y lavado son cloruro sodico 0,015 M, citrato sodico 0,0015 M a aproximadamente 65- 68°C o cloruro sodico 0,015 M, citrato sodico 0,0015 M y formamida al 50% a aproximadamente 42°C (vease, 50 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

[0106] Tambien se pueden usar condiciones mas restrictivas (tales como temperatura mayor, fuerza ionica

menor, mas formamida, u otro agente desnaturalizante); sin embargo, se afectara a la velocidad de hibridacion. En 55 casos en donde este implicada la hibridacion de desoxioligonucleotidos, las condiciones de hibridacion restrictivas de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6x SSC, pirofosfato sodico al 0,05% a 37°C (para oligonucleotidos de 14 bases), 48°C (para oligonucleotidos de 17 bases), 55°C (para oligonucleotidos de 20 bases), y 60°C (para oligonucleotidos de 23 bases).

[0107] Un aspecto adicional de esta descripcion proporciona una celula hospedante transformada con, o que contiene de otra forma, cualquiera de los polinucleotidos o vectores/construcciones de expresion de esta descripcion. Los polinucleotidos o construcciones de clonacion/expresion de esta descripcion se introducen en celulas adecuadas usando cualquier procedimiento conocido en la tecnica, que incluyen transformacion, transfeccion

5 y transduccion. Las celulas hospedantes incluyen las celulas de un sujeto sometido a terapia celular ex vivo, que incluye, por ejemplo, terapia genica ex vivo. Las celulas hospedante eucariotas contempladas como un aspecto de esta descripcion cuando alojan un polinucleotido, vector o protelna de acuerdo con esta descripcion incluyen, ademas de las propias celulas de un sujeto (p. ej., las propias celulas de un paciente humano), celulas VERO, celulas HeLa, llneas de celulas de ovario de hamster chino (CHO) (incluyendo celulas CHO modificadas capaces de 10 modificar el patron de glucosilacion de moleculas de union multivalente expresadas, vease la publication de solicitud de patente de EE.UU. N° 2003/0115614), celulas COS (tales como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, celulas HEK293, celulas HepG2, celulas N, celulas 3T3, celulas de Spodoptera frugiperda (p. ej., celulas Sf9), celulas de Saccharomyces cerevisiae, y cualquier otra celula eucariota conocida en la materia que es util para expresar, y opcionalmente aislar, una protelna o peptido de acuerdo con esta descripcion. Tambien estan 15 contempladas celulas procariotas, que incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, un estreptomiceto o cualquier celula procariota conocida en la materia que es adecuada para expresar, y opcionalmente aislar, una protelna o peptido de acuerdo con esta descripcion. En el aislamiento de la protelna o peptido de celulas procariotas, en particular, esta contemplado que se pueden usar tecnicas conocidas en la materia para la extraction de protelnas de cuerpos de inclusion. La selection de un hospedante adecuado esta al alcance de los expertos en la 20 materia a partir de las ensenanzas del presente documento. Estan contempladas celulas hospedantes que glucosilan protelnas de fusion de esta descripcion.

[0108] La expresion “celula hospedante recombinante” (o simplemente “celula hospedante”) se refiere a una celula que contiene un vector de expresion recombinante. Debe entenderse que dichas expresiones se pretende que

25 se refieran no solo a la celula del sujeto particular sino tambien a la progenie de dicha celula. Debido a que se pueden producir algunas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutation o influencias medioambientales, de hecho, dicha progenie puede no ser identica a la celula original, pero todavla estan incluidas dentro del alcance de la expresion “celula hospedante” usada en el presente documento.

30 [0109] Las celulas hospedantes recombinantes se pueden cultivar en un medio nutriente convencional

modificado segun sea adecuado para la activation de promotores, seleccion de transformantes o amplification de genes particulares. Las condiciones de cultivo para celulas hospedantes particulares seleccionadas para la expresion, tales como temperatura, pH y similares, seran facilmente evidentes para el experto en la materia. Tambien se pueden usar diferentes sistemas de cultivo de celulas de mamlfero para expresar la protelna 35 recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresion de mamlfero incluyen llneas COS-7 de fibroblastos de rinon de mono, descritos por Gluzman (1981) Cell 23:175, y otras llneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las llneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresion de mamlfero comprenderan un origen de replication, un promotor adecuado y opcionalmente, un potenciador, y tambien cualesquiera sitios de union al ribosoma necesarios, sitios de poliadenilacion, sitios de empalme de donador y 40 aceptor, secuencias de termination transcripcional, y secuencias no transcritas flanqueadoras 5', por ejemplo como se describe en el presente documento, en relation con la preparation de construcciones de expresion de protelnas de union multivalentes. Se pueden usar secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y sitios de poliadenilacion, para proporcionar elementos geneticos no transcritos requeridos. La introduction de la construction en la celula hospedante se puede realizar por una variedad de procedimientos con los que estaran familiarizados los 45 expertos en la materia, que incluyen la transfeccion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, o electroporation (Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology).

Composiciones y procedimientos de uso

50 [0110] En una realization, las composiciones celulares de la presente descripcion comprenden una poblacion

de linfocitos B transducidos y activados/diferenciados, que expresan una protelna de interes descrita en el presente documento. En una realizacion, las composiciones comprenden linfocitos B transducidos que se han diferenciado en linfocitos B plasmaticos y expresan una o mas protelnas de interes. Las poblaciones de celulas diana, tales como las poblaciones de linfocitos B transducidos y activados de la presente descripcion se pueden administrar solos, o como 55 una composition farmaceutica en combination con diluyentes y/o con otros componentes tales como citoquinas o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones celulares de la presente descripcion pueden comprender una poblacion de linfocitos B transducidos y activados/diferenciados, que expresan una protelna de interes como se describe en el presente documento, en combinacion con uno o mas vehlculos, diluyentes o excipientes farmaceutica o fisiologicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones tales como solution salina

tamponada neutra, solucion salina tamponada con fosfato, y similares; hidratos de carbono tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; polipeptidos o aminoacidos tales como glicina; antioxidantes; agentes de quelacion, tales como EDTA o glutation; adyuvantes (p. ej., hidroxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente descripcion se formulan preferiblemente para la administration intravenosa.

5

[0111] Las composiciones celulares de la presente descripcion se pueden administrar de una forma adecuada para la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administracion estaran determinadas por factores tales como el estado del paciente, y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque se pueden determinar dosis adecuadas mediante ensayos cllnicos

10

[0112] Cuando se indica “una cantidad eficaz”, “una cantidad eficaz antitumoral”, “una cantidad eficaz que inhibe el tumor” o “una cantidad terapeutica”, la cantidad precisa de las composiciones de la presente descripcion que se administra la puede determinar un medico considerando las diferencias individuales en edad, peso, tamano tumoral, extension de infection o metastasis, y estado del paciente (sujeto). En general se puede establecer que una

15 composition celular que comprende los linfocitos B descritos en el presente documento se puede administrar con una dosis de 104 a 1o7 celulas/kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 celulas/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de estos intervalos. Las composiciones de linfocitos B se pueden administrar tambien multiples veces con estas dosis. Las celulas se pueden administrar usando tecnicas de infusion que son normalmente conocidas en inmunoterapia (vease, p. ej., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 20 1988). La dosis optima y la posologla del tratamiento para un paciente particular lo puede determinar facilmente un experto en medicina, mediante el seguimiento de los signos de enfermedad del paciente y ajustando el tratamiento en consecuencia.

[0113] Tlpicamente, en estudios de inmunoterapia adoptiva, se administran los linfocitos T especlficos de 25 antlgeno de 2 X 109 a 2 X 1011 celulas al paciente (Vease, p. ej., patente de EE.UU. N° 5.057.423). En algunos

aspectos de la presente descripcion, se pueden administrar cantidades inferiores de linfocitos B transducidos de la presente descripcion, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). En algunas realizaciones, los linfocitos B se administran en una cantidad de 1 X105, 1 X106, 1X107, 1X108, 2X108, 2X109, 1X1010, 2X1010, 1X1011, 5X1011, o 1 X 1012 linfocitos B. Las composiciones de linfocitos B se pueden administrar multiples veces con dosis dentro de 30 estos intervalos. Las celulas pueden ser autologas o heterologas para el paciente sometido a tratamiento. Si se desea, el tratamiento tambien puede incluir la administracion de mitogenos (p. ej., PHA) o linfoquinas, citoquinas y/o quimioquinas (p. ej., GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1a, etc.) como se describe en el presente documento para potenciar la induction de una respuesta inmunitaria.

35 [0114] La administracion de las composiciones presentes, se puede llevar a cabo en cualquier forma

conveniente, que incluye por inhalation de aerosol, inyeccion, ingestion, transfusion, implante o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente por via subcutanea, intradermica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyeccion intravenosa (i.v.) o via intraperitoneal. En una realization, las composiciones de linfocitos B de la presente descripcion se administran a un 40 paciente por inyeccion intradermica o subcutanea. En otra realizacion, las composiciones de linfocitos B descritas en el presente documento se administran preferiblemente por inyeccion i.v. Las composiciones de linfocitos B se pueden inyectar directamente en un tumor, nodulo linfatico o sitio de infeccion.

[0115] En otra realizacion mas, la composicion farmaceutica se puede suministrar en un sistema de liberation 45 controlada. En una realizacion, se puede usar una bomba (vease, Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton

1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980; Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realizacion, se pueden usar materiales polimericos (vease, Medical Applications of Controlled Release, 1974, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York; Ranger and Peppas, 1983; J. Macromol. 50 Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; vease tambien Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra realizacion mas, se puede colocar un sistema de liberacion controlada cerca de la diana terapeutica, requiriendo as! solo una fraction de la dosis sistemica (vease, p. ej., Medical Applications of Controlled Release, 1984, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., vol. 2, pp. 115-138).

55

[0116] Las composiciones de linfocitos B de la presente descripcion tambien se pueden administrar usando una serie de matrices. Las matrices se han usado durante unos anos dentro del contexto de la ingenierla tisular (vease, p. ej., Principles of Tissue Engineering (Lanza, Langer, and Chick (eds.)), 1997). La presente descripcion usa dichas matrices dentro del nuevo contexto de actuation como un organo linfoide artificial para soportar y mantener

los linfocitos B. Por consiguiente, la presente descripcion puede usar esas composiciones y formulaciones de matrices que han demostrado utilidad en la ingenieria tisular. Por consiguiente, el tipo de matriz que se puede usar en las composiciones, dispositivos y procedimientos de la descripcion practicamente no tiene limites y puede incluir tanto matrices biologicas como sinteticas. En un ejemplo particular, se usan las composiciones y dispositivos 5 expuestos en las patentes de EE.UU. N°: 5.980.889; 5.913.998; 5.902.745; 5.843.069; 5.787.900; o 5.626.561. Las matrices comprenden caracteristicas habitualmente asociadas con ser biocompatible cuando se administran a un hospedante mamifero. Las matrices se pueden formar tanto de materiales naturales como sinteticos. Las matrices pueden ser no biodegradables en casos donde es conveniente dejar estructuras permanentes o estructuras retirables en el cuerpo de un animal, tal como un implante; o biodegradables. Las matrices pueden tener forma de 10 esponjas, implantes, tubos, almohadillas Telfa, fibras, fibras huecas, componentes liofilizados, geles, polvos, composiciones porosas, o nanoparticulas. Ademas, las matrices se pueden disenar para permitir la liberation sostenida de celulas sembradas o citoquinas producidas u otro agente activo. En algunas realizaciones, la matriz de la presente descripcion es flexible y elastica, y se puede describir como una estructura semisolida que es permeable a sustancias tales como sales inorganicas, fluidos acuosos y agentes gaseosos disueltos, incluyendo oxigeno.

15

[0117] En el presente documento se usa una matriz como un ejemplo de una sustancia biocompatible. Sin embargo, la presente descripcion no esta limitada a matrices, y por lo tanto, donde sea que aparezcan los terminos matriz o matrices, debe entenderse que estos terminos incluyen dispositivos y otras sustancias que permiten la retention celular o recorrido celular, son biocompatibles, y son capaces de permitir el recorrido de macromoleculas

20 directamente a traves de la sustancia de modo que la propia sustancia es una membrana semipermeable, o usadas junto con una sustancia semipermeable particular.

[0118] En algunas realizaciones de la presente descripcion, los linfocitos B transducidos y activados usando los procedimientos descritos en el presente documento, u otros procedimientos conocidos en la tecnica, se

25 administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultaneamente o despues) cualquier numero de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan al tratamiento con agentes tales como agentes antiviricos, quimioterapia, radiation, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, y FK506, anticuerpos y otros agentes inmunoablativos tales como cAmPATH, anticuerpos dirigidos contra CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, acido micofenolico, esteroides, 30 FR901228, citoquinas, y radiacion. Estos farmacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la serialization inducida por factores de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi (vease antes)). En una realization adicional, las composiciones celulares de la presente descripcion se administran a un paciente junto con (p. ej., antes, simultaneamente o 35 despues) trasplante de medula osea, terapia ablativa de linfocitos T usando bien agentes quimioterapeuticos tales como fludarabina, terapia con radiacion de haces externos (XRT), ciclofosfamida, o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En una realizacion, las composiciones celulares de la presente descripcion se administran despues de terapia ablativa de linfocitos B, tal como agentes que reaccionan con CD20, p. ej. Rituxan®. Por ejemplo, en una realizacion, los sujetos se pueden someter a tratamiento estandar con una dosis alta de quimioterapia seguida de 40 trasplante de citoblastos de sangre periferica. En algunas realizaciones, despues de trasplante los sujetos reciben una infusion de celulas inmunitarias expandidas de la presente descripcion. En una realizacion adicional, las celulas expandidas se administran antes o despues de cirugia.

[0119] La dosis de los tratamientos anteriores que se va a administrar a un paciente variara con la naturaleza 45 precisa de la afeccion que se va a tratar y el receptor del tratamiento. Se puede llevar a cabo el ajuste de la dosis

para la administration humana de acuerdo con las practicas aceptadas en la tecnica.

[0120] Las composiciones de linfocitos B transducidos de la descripcion, en particular linfocitos B

transducidos para expresar un anticuerpo particular de interes, se pueden usar en el tratamiento o prevention de

50 diferentes enfermedades infecciosas, canceres, enfermedades degenerativas y trastornos inmunologicos.

[0121] Las composiciones que comprenden los linfocitos B transducidos como se describen en el presente documento, se pueden usar en el tratamiento de cualquiera de una variedad de enfermedades infecciosas causadas por organismos infecciosos, tales como virus, bacterias, parasitos y hongos. Los organismos infecciosos pueden

55 comprender virus (p. ej., virus de ARN, virus de ADN, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B y C, virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV) virus de Epstein-Barr (EBV), papilomavirus humano (HPV)), parasitos (p. ej., protozoos y metazoos patogenos tales como especies de Plasmodia, especies de Leishmania, especies de Schistosoma, especies de Trypanosoma), bacterias (p. ej., Mycobacteria, en particular, M. tuberculosis, Salmonella, Streptococci, E. coli, Staphylococci), hongos (p. ej., especies de Candida, especies de

Aspergillus), Pneumocystis carinii, y priones (los priones conocidos infectan animales para producir encefaiopatla espongiforme ovina, una enfermedad degenerativa, transmisible del sistema nervioso de ovejas y cabras, as! como la encefalopatla espongiforme bovina (BSE) o “enfermedad de las vacas locas”, y encefalopatla espongiforme felina de gatos. Cuatro enfermedades de priones que se sabe que afectan a los seres humanos son (1) kuru, (2) 5 enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), y (4) insomnio familiar letal (FFI)). Como se usa en el presente documento “prion” incluye todas las formas de priones que producen todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquier animal usado, y en particular seres humanos y animales de granja domesticados. Las enfermedades infecciosas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a toxoplasmosis, histoplasmosis, CMV, EBV, coccidiomicosis, tuberculosis, VIH, y similares.

10

[0122] En algunas realizaciones, las composiciones de linfocitos B transducidos como se describen en el presente documento tambien se pueden usar para la prevencion o tratamiento de una variedad de canceres. En relacion con esto, en algunas realizaciones, las composiciones que comprenden linfocitos B transducidos son utiles para prevenir o tratar el mieloma, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, leucemia, plasmocitoma, sarcoma,

15 glioma, timoma, cancer de mama, cancer de prostata, cancer colorrectal, cancer de rinon, carcinoma de celulas renales, cancer de utero, cancer de pancreas, cancer de esofago, cancer de cerebro, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de cuello uterino, cancer testicular, cancer gastrico, cancer de esofago, mieloma multiple, hepatoma, leucemia linfoblastica aguda (LLA), leucemia mielogena aguda (LMA), leucemia mielogena cronica (LMC) y leucemia linfocltica cronica (LLC), u otros canceres.

20

[0123] En una realizacion, los linfocitos B transducidos se pueden usar tambien en el tratamiento de enfermedades inmunologicas tales como el slndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), agammaglobulinemia, hipogammaglobulinema, otras inmunodeficiencias, inmunosupresion y enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave.

25

[0124] En una realizacion, los linfocitos B transducidos como se describen en el presente documento se pueden usar tambien en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como, pero no limitadas a artritis reumatoide, esclerosis multiple, diabetes insulinodependiente, enfermedad de Addison, enfermedad cellaca, slndrome de fatiga cronica, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia,

30 lupus eritematoso sistemico, psoriasis, slndrome de Sjogren, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, diabetes insulinodependiente (tipo 1), miastenia gravis, endometriosis, esclerodermia, anemia perniciosa, slndrome de Goodpasture, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplasica, hemoglobinuria nocturna paroxlstica, slndrome mielodisplasico, purpura trombocitopenica idiopatica, anemia hemolltica autoinmune, slndrome de Evan, slndrome del inhibidor del factor VIII, vasculitis sistemica, 35 dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumatica.

[0125] Por lo tanto, en una realizacion, los procedimientos del presente documento incluyen procedimientos para tratar una enfermedad que comprende administrar a un sujeto o paciente que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de las composiciones que comprenden linfocitos B transducidos como se describe en el

40 presente documento, tratando as! la enfermedad.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

45

TRANSDUCCION Y CULTIVO DE LINFOCITOS B DERIVADOS DE PBMC PARA PRODUCIR PROTEINA DE INTERES

[0126] En este ejemplo, linfocitos B derivados de PBMC se transdujeron y cultivaron hasta producir con exito 50 el anticuerpo neutralizante del VIH, b12, o GFP.

Procedimientos:

[0127] PBMC humanas se descongelaron en medio RPMI y se contaron usando un hemocitometro. Se

55 recogieron linfocitos B de un total de 1,23 x 107 PBMC usando el kit de purificacion de linfocitos B con seleccion negativa de linfocitos B Easy-Sep de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Despues de purificacion, las celulas se contaron, y se anadieron 3,5 x 105 linfocitos B a dos pocillos en una placa de 24 pocillos, conteniendo cada pocillo 1,25 ml de medio. El medio consistla en: RPMI, IL-2 (10 ng/ml), IL-10 (100 ng/ml), CpG (2 micromolar), y con o sin PHA (4 microgramos/ml).

[0128] Ademas, 4x104 celulas estromales MS5 adherentes de raton que previamente se hablan transducido establemente con el ligando CD40 (celulas bajas en MS40) y seleccionado las celulas que expresaban niveles bajos del ligando, se anadieron a cada uno de los pocillos y se dejo que se adhirieran a la placa de cultivo durante 24

5 horas antes de anadir los linfocitos B (en presencia de las citoquinas y RPMI).

[0129] Los linfocitos B se expusieron a estas condiciones durante 3 dlas.

[0130] Despues de 3 dlas de cultivo, las celulas se separaron y se anadieron 1,6 microgramos de polibreno a 10 cada uno de los cultivos de 1,25 ml que contenlan los linfocitos B y se incubaron durante 3 horas, y se anadieron

vectores lentivlricos pseudotipados con virus de sarampion de Edmonston, que codificaban bien el anticuerpo neutralizante del VIH b12 o la GFP (ambos bajo el control del promotor EEK; vease Blood, 12 February 2009, Vol. 113, No. 7, pp. 1422-1431 y solicitud de patente de EE.UU. publicada 20100203630) a los linfocitos B con una MDI de 30. En total, tanto para las condiciones con PHA como sin, se transdujeron un total de 2 pocillos de linfocitos B 15 con b12 y 1 pocillo con GFP.

[0131] Cada pocillo contenla el medio mas citoquinas, celulas bajas en MS40 y 2,67 x 104 linfocitos B. Se anadieron citoquinas de nueva aportacion cada 3 dlas y se hizo el seguimiento de las celulas usando microscopla de fluorescencia para ver la presencia de celulas positivas para GFP. 18 dlas despues de transduccion, se separaron

20 500 microlitros de medio de cultivo de las muestras de b12 y GFP y se ensayo la presencia de b12 usando un dispositivo (Luminex Corporation, Austin, TX) usando la union a GP140 para medir la presencia de b12 y b12 purificado, para generar una curva patron para la cuantificacion. Los resultados del dispositivo Luminex apoyaban que el PHA no tenia impacto significativo en la production de b12, pero se incluia en el protocolo para la precision y los procedimientos de recuento.

25

Resultados:

[0132] Los resultados indicaban que las celulas transducidas producian como media 1,05 ng/ml de anticuerpo b12 (vease la figura 1). Ademas, la microscopia de fluorescencia mostro que los linfocitos B transducidos con gFp

30 se modificaron para brillar verdes. Es importante indicar que el promotor usado para dirigir la expresion de GFP y b12 solo es activo en linfocitos B diferenciados. Por lo tanto, las celulas solo fluorescen despues de convertirse en celulas plasmaticas. Por lo tanto, este experimento mostro tanto que los virus modificaban la celula correctamente y que el sistema de cultivo era capaz de diferenciar el linfocito B quiescente modificado en una celula plasmatica.

35 [0133] Todos los intervalos numericos usados en el presente documento incluyen explicitamente todos los

valores enteros dentro del intervalo y esta contemplada la selection de valores numericos especificos dentro del intervalo dependiendo del uso particular. Ademas, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitation.