JPS6342688A

JPS6342688A - ヒトｂ細胞分化因子の遺伝子

Info

Publication number: JPS6342688A
Application number: JP61184858A
Authority: JP
Inventors: Chuzo Kishimoto; 忠三岸本; Toshio Hirano; 俊夫平野; Yutaka Matsui; 裕松井; Yoshiyuki Takahara; 義之高原
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1988-02-23
Anticipated expiration: 2012-11-12
Also published as: JP2676336B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は人について活性を有するＢ細胞分化因子（以
下ｒ　ＢＣＤＦ　Ｊと記す）ならびに同因子のポリペプ
チドに対応する遺伝子ならびにクローン化遺伝子を用い
る同ＢＣＤＦの製造法に関する。ヒトＢＣＤＦは本発明
により物質としての存在が初めて発明され、免疫不全に
よる疾患等に汎く治療薬として利用しうる有用な物質で
ある。

〔従来の技術〕

抗原刺激を受は活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の助
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。この物質の存在はＲ，Ｗ、Ｄｕｔｔｏｎら、Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｒｅｖ、　２３　６６（１９７
５）、　ハ、Ｓｃｈｉｍｐｌ　　とＥ、Ｗｅｃｋｅｒら
、ＮａｔｕｒｅＮ、　Ｂｉｏｌ、２３７．　ｌ　５　（
１９７２）　、により明らかにされた。彼らはマウスの
リンパ球混合物培養後の培養上清中または抗原やマイト
ゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培養上清が、
マウスのＴ細胞を除去されたリンパ球細胞集団やヌード
マウス由来のリンパ球のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対
する１次免疫応答を増幅させることを見出し、そのよう
な作用を有する活性本体にＴリンパ球代替因子、すなわ
ちＴＲＦという呼称を与えた。それ以来ＴＲＦは、抗原
非特異的に主要組織適合遺伝子複合体（以下、ＭＨＣと
略称する。）の一致を必要としない様式でＢ細胞に作用
し、Ｂ細胞の分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細
胞への分化を誘導する液性因子であると定義されている
。

その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す機能上
の証拠が蓄積されており、人においてもマウス同様の分
化因子の存在が示唆されている。

現在では上述のように定義されたＢ細胞を抗体産生細胞
へ分化させる因子をＢＣＤＦと総称するようになった。

このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤＦ
のイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に用
いることが出来ると共に、自己免疫疾患において散見さ
れるＢ細胞機能異常の修復にも用いうる。第２の応用は
各種疾患の治療への応用である。

例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にともなうＢ細胞抗
体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣＤＦ単独また
は他のリンホカインや免疫療法剤と共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。

さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。

Ｂ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ）　（Ｋ、　Ｙｏｓｈｉｚａ
ｋｉら、Ｊ、ｏｆ］＋ｍｍｕｎｏ１．１３０．１２４１
　　（１９８３））、その他のリンホカインを含むＴ細
胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を長期培養
できることが報告されている（　Ｂ、　５ｒｅｄｎｉら
、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。

−り汀、１５００　（１９８１）参照〉。これらの培養
正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細胞
に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることにより
生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体、
例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞な
どの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ細
胞をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞またはＥ
Ｂウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他のリ
ンホカインを組み合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。

従来ＢＣＤＦを得るには、大末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激することによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。この方法では、Ｔ細胞
を十分得ることが困難である点、マイトゲンを用いたた
め、ＢＣＤＦに有害なマイトゲンが混入し、これを除去
するのが困難である点、またＴ細胞培養にはウシ胎児血
清など血清成分を培地に添加する必要があり、これら添
加タンパク質とＢＣＤＦを十分分離することが出来ず、
ＢＣＤＦを医療に用いるには、純化ＢＣＤＦが得られぬ
ことが障害となっている点など問題が多く、工業的にＢ
ＣＤＦを産生ずることは出来なかった。また人Ｔ細胞を
大癌細胞と細胞融合して人Ｔ融合細胞を得、これにより
ＢＣＤＦを産生せしめる方法も報告されている（　０ｋ
ａｄａ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１５７．
　５８３（１９８３））。しかし、人融合細胞は継代中
、リンホカイン産生能が低下してゆくことが多く、実用
的ＢＣＤＦ産住人融合細胞は未だない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明の目的は、ヒトＢＣＤＦおよびその製遣方
法、それをコードするＤＮＡを提供することにある。ヒ
トＢＣＤＦをコードするＤＮＡはヒトＢＣＤＦを真核生
物、原核生物の細胞等により大量に生産する際に必要不
可欠で有用なものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、人Ｔ細胞白血球ウィルス（以下ｒ　ＨＴ
ＬＶ　Ｊと記す）により形質転換された人Ｔ細胞が高い
効率でＢＣＤＦを生産することをすでに見い出し、Ｂ細
胞分化因子活性が５Ｘ１０６単位／ｍＡ’以上である蛋
白標品を得た。

人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・請帯血などよりフィ
ルコールバックなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ
球を分離し、Ｎ、　Ｙａｍａｍｏｔｏ＋５ｃｉｅｎｃｅ
　２　」−Ｌ、　　７３７　　（１９８２）の方法に準
じてＨＴＬＶを用いて人Ｔ細胞を形質転換（トランスフ
オーメーション）する。たとえば下記の方法を用いるこ
とができる。ウィルス産生細胞株ＭＴ−２をＸ線照射（
１２０００〜１４０００ラド）で不活化した細胞Ｉ　Ｘ
　１０７／ｍｅと、−ト述のようにして得た人リンパ球
Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ’　／１ｍｌを２０　％　Ｆ　ＣＳ　。

１００μｇ／ｍβカナマイシン、２μｇ　／　ｗ＋　ｌ
１Ｎａ）ＩＣＯ３，２５＋Ｍ　Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ
ｅｔｈｙｌ　ｐｉｐｅｒａ−ｚｉｎｅ　−Ｎ　’　−２
−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥ
Ｓ）を含むＲＰＭ１１６４０培地を入れたプラスチック
シャーレ（ファルコン＃３００３）に接種し５％ＣＯ２
存在下３７℃で培養する。１週間に２回、半分の培地を
新鮮な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、グミテ
ィングダイリューション法により株化する。株化した細
胞の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性を
有する株を得る。

この方法により株化した細胞としてたとえばＶＴ−１と
標識された人Ｔ細胞株を用いることができる。ＶＴ−１
を増殖させるための特別な条件はなく、一般に用いられ
ている培養条件を適宜採用して行なえばよい。また、Ｂ
ＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよいが、好まし
くはタンパク質を含まない培地を用いて行なうべきであ
る。

ＶＴ〜１の細胞数を増やすのに最適な培地として、例え
ば１〜３０％、好ましくは２０％のＦＣ３を添加した培
地を用いる。ＢＣＤＦ産生のための最適な培地としては
、Ｆｅ２を添加しない上述の培地でよい。Ｆｅ２を添加
しない完全合成培地中で４８時間培養後もＶＴ−１の生
存率は７０％以上が保持されている。

Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦｅ
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（Ｔ。

Ｔｅｒａｎｉｓｈｉ　　ら、Ｊ、　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏ
ｌ、　１２８．　１０９３（１９８２）、　　八、　　
Ｍｕｒａｇｕｃｈｉら、Ｊ、　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ。

↓文フー、４１２　　（１９８１）参照）。これに対し
てＶＴ−１を使用してＢＣＤＦを生産する場合、培地に
Ｆｅ２のような血清、血液中のタンパク質成分、その他
タンパク質成分を加える必要がなく、また通常用いられ
ているＴ細胞またはＢ細胞に対するマイトゲンも加える
必要がないことは特筆に値する。そのため高価なＦｅ２
を用いないで安価にＢＣＤＦを生産することが出来るば
かりでなく、人体に有害な異種タンパク質やマイトゲン
を含まない安全なりＣＤＦを容易に得ることが出来る。

ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくは　ＶＴ−
１培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１
０％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に保持すべきであ
る。また、理想的には培地のｐＨは約７．０〜７．４と
僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。ＶＴ−
１は平底ミクロプレートなど種々のタイプの培養器に１
００μ！単位などの種々の容量で接種される。フアシヨ
ン・ラブウェア・ディヴイジョン、ヘクトン・ディソキ
ンソン・エンド・コーポレーション（ＦａｌｃｏｎＬａ
ｂｗａｒｅ、Ｄｉｖ、　Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）から市販されているフラスコＮ
ａ３０１３マたは３０２４のような組織培養フラスコも
使用できる。別法として上記フアシヨン・ラブウェアか
ら市販されているボトルｍ３０２７のような回転びんち
培養容器として使用できる。

ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地１ｍＡあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５Ｘ１０５細胞、好ましくは２ＸＩＯ５細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｍｎ当り５×１０５細胞から２Ｘ１０６細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地ｌｌ１１７！当りｌＸｌ０’〜５Ｘ１０５細胞に
まで細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにし
て目的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた
後、細胞を遠心分離等で分離する。細胞をタンパク質を
含まぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に
接種する。この時の細胞の当初密度は培地ｌｌ１１１あ
たり約ｌＸｌ０’細胞ないしｌＸｌＯ７細胞であること
が好ましく、理想的には培地１ｍρあたりｌＸｌ０６細
胞である。

Ｖ１’−１を培養することによって生産されるＢＣＤＦ
量は経時的に変化する。例えば１ｍｌ当り１×１０６初
発細胞密度てＶＴ−１をＲＰ旧１６４０培地（１ｍ６当
りペニシリンｌＯＯ単位、ストレプトマイシン１００μ
ｇ１ケンタマイシン１０μｇおよびＮａＨＣＯ，、１６
ｍ　Ｍを含む）で培養すると、ＲＣ叶活性は４８時間後
にピークレベルに達する。

さらに、次の２４時間に存在するＢＣＤＦ活性は僅かに
減少する。このようにＲＰ旧１６４ｏ培地中のＶＴ−Ｉ
　Ｔ：ＢｃＤＦを生産する至適培養時間は約２４〜７８
時間である。

ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清から濃
縮して精製できる。

次にＢＣＤＦＣＤ側定法であるが以下のような方法があ
る。

人ＢＣＤＦに反応してＩｇＭを産生する人Ｂ細胞株ＣＬ
　４　　（Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

８２７）　５４９０．　１９８５）を用イテＢｃＤＦ活
性を測定する。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６×１０
３個のＣｌ３を２００．ｃｌ！の１０％ＦＣ３を含むＲ
ＰＭ１１６４０培地（ＩＩＩＩｌ当りペニシリンｌｏｏ
単位、ストレプトマイシン１００μｇ１ゲンタマイシン
１０１１ｇおよびＮａＨＣＯ３１６ｍ　Ｍを含む）に入
れる。

この混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、５％
　ＣＯ７存在下、３７℃で培養し、培養上清の１ｇＭ量
を酵素免疫測定法により、測定する。この条件において
最大の１ｇＭ生産量（最高のＣｌ３の反応）の５０％を
示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍβとした。

また人ＢＣＤＦに反応してＩｇＭを産生する人Ｂ細胞株
ＣＬ　４　　（０，５ＡＩＫＩ　　ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ　　１３　。

３１　　（１９８３））を用いたリバースＰＦＣ法でも
ＢＣＤＦ活性を測定しうる。ＢＣＤＦ活性を測定する検
液とＩ　Ｘ　１０’個（７）Ｃｌ３を２００μｆｆ（７
）１０％ＦＣ３を含むＲＰ旧１６４ｏ培地（添加物は前
記と同じ）に入れる。この混合物を９６穴マイクロプレ
ート中で３日間、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する
。培養細胞・補体・抗ヒトＩｇＭ抗体プロティンＡ結合
緬羊保存血をＩＩＡＮＫＳ液に溶解したアガロースに混
合して、シャーレ上に拡げ固め、３７℃。

５％ＣＯ２存在下−晩培養した後の溶血斑数をもってＢ
ＣＤＦの作用にて人１ｇＭ産生細胞に分化した細胞数を
測定する。

ヒト　ＢＣＤＦをコードする遺伝子を同定・採取するた
めには、前述のＢＣＤＦＣＤ型適条件で培養されたＶＴ
−１細胞よりＲＮＡを抽出、採取し、ｃＤＮＡライブラ
リーを作成し、同ライブラリーよりＢＣＤＦをコードす
るｃＤＮ＾をクローニングする。このために本発明者ら
は実施例に示すようにＶＴ−１細胞の産生するヒトＢＣ
ＤＦを完全に精製し、そのＮ末のアミノ酸部分配列およ
び同ＢＣＤＦをリシルエンドペプチダーゼを作用させて
限定分解し、得られるフラグメントペプチドのアミノ酸
配列を決定し、各々のペプチドに対応するオリゴヌクレ
オチドを合成し、本合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いて上述のｃＤＮＡライブラリーより複数の合成プロ
ーブと相補的にハイブリダイズするクローンを採取する
ことによりＢＣＤＦ　ｃＤＮ＾を同定した。ここで得ら
れたｃＤＮＡの塩基配列を常法により決定し、ＢＣＤＦ
をコードする遺伝子の本体を物質的に確定し、本遺伝子
配列よりヒト　ＢＣＤＦが１８４個のアミノ酸より構成
されるポリペプチドであることを見出した。と同時にこ
こに得られたｃＤＮＡを真核生物の細胞で発現すべく発
現ヘクターに連結したのちに、同細胞に遺伝子導入し、
本細胞の培養により、上清にＢＣＤＦを生産させ、精製
操作により純化ヒトＢＣＤＦを同定・採取し、ＢＣＤＦ
の遺伝子構造に対応するりコンビナンドヒトＢＣＤＦを
製造し、かつ本ＢＣＤＦがＶＴ−１細胞や他のヒト細胞
より得られるヒトＢＣＤＦと同じ理化学的、生物学的性
状を有することを明らかにした。このことより同定され
た遺伝子が確かにヒトＢＣＤＦ蛋白をコードするもので
あることが最終的に立証された。

一方ヒトＢＣＤＦは原核生物においても製造できる。

すなわちヒトＢＣＩ）Ｆをコートする遺伝子を発現可能
なようにヘクターＤＮＡに導入して得られた組み換え体
ＤＮＡを原核生物宿主に導入し、得られた形質転換微生
物を培養すればよい。

ＢＣＤＦをコードする遺伝子はアミノ酸配列（Ｉ）。

（ＩＩ）もしくはその部分構造に対応する塩基配列を少
くも有するものである。組み換え体ＤＮＡが導入される
原核生物宿主細胞はエソシェリヒア・コリ、バチルス・
ズブチリス、その他の微生物があり、現在の遺伝子工学
的生産の分野において当該業者の容易になしうるところ
のものである。

形質転換された微生物（原核生物）を培養する培地およ
び培養方法は通常の培地、方法でよい。

形質転換された微生物細胞中にヒｌ−ＢＣＤＦが蓄積さ
れている場合には、ＢＣＤＦは、当該分野の業者の容易
になしうる方法で回収、精製する。簡単に記すと以下の
通りである。培養後、遠心で菌体を集め、リゾチームを
含む溶液や他のｄｅｔｅｒｇｅｎｔを含む液に細胞を懸
濁し、反応後、凍結・融解を繰り返し、細胞抽出液を採
取し、以下前述の精製法及び／又は抗ＢＣＤＦ抗体固定
化カラムを用いるアフィニーｌティクロマトグラフィーで簡便に精製する。

実施例１２β容プラスチツクローラー培養器（フアシヨン＃３０
２７）　　（以下ローラーと称する）中のＩＩ！の２０
％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン
、５Ｘ１０−５Ｍ　　２ＭＥ、１００単位／ｍｅペニシ
リン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２０μｇ
／ｍｌゲンタマイシン及び１６ｍＭＮａＨＣＯ３を含有
）に、２ＸＩＯ５／ｍ＃細胞数になるようＶＴ−１を接
種し、ローラーを８　ｒｐｍで回転させつつ３日間、３
７℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を
集めＲＰ旧１６４０培地で２回細胞を洗った後、細胞を
２１容ローラー中１４のＲＰ旧１６４０培地にｌＸｌ０
６／ｍＡ！細胞淵度になるよう懸濁した。ローラーを８
　ｒｐｍで回転させつつ２日間、３７℃で培養する。培
養後培養物を遠心分離して、培養上清を得た。

上述のようにＶＴ−１を培養して得たＢＣＤＦを含む培
養上清より、ＢＣＤＦを以下の方法で精製した。

無細胞−ト清１０ｆｆを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１
０、アミコン・コーポレーション、マサチューセ・７ツ
、ＵＳＡ）を装着した限外濾過装置（アミコン大量処理
用セル２０００型、アミコン・コーポレーション、マサ
チューセソツ、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより４　ｋ
ｇ／ｃｌｌＩの圧力をかけ濾過した。

濾過膜上部に残った１００ｍＡのｔＲ縮液をさらに限外
濾過膜（アミコンＹＭ−１０）を装着した限外濾過装置
（アミコン、スタンダードセル５２型）を用い、窒素ガ
スにより４　ｋｇ　／　ｃｄの圧力をかけて濾過した。

濾過膜上部に残った５　ｍｌの濃縮液を採取した。

上述の濃縮した上清をＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、　Ｓｗｅｄｅｎｓ　２．６　
Ｘ　９０　ａｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラムは
あらかじめＰＢＳ　（ホスフェート・バンファードセイ
ライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフェート
・バッファー、ｐＨ７，０）で平衡化した。濃縮上清を
ＰＢＳで溶出し、溶出液を５　ｍｌずつ分取し、分取液
のＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を有する両分
は分子量３．５±０．５Ｘ１０’ダルトンに相当するフ
ラクションに含まれていることがわかった。ゲル濾過カ
ラムは以下に示すファルマシア・ファインケミカルス（
スウェーデン）社製の分子量マーカーで検定した。即ち
、ブルーデキストラン２０００　２×１０６、フェリチ
ン４．５Ｘ１０５、アルドラーゼ１．５８Ｘ１０’、オ
ブアルブミン４．５ＸＩＱ’、キモトリプシノーゲン２
．５Ｘ１０’及びチトクロームＣ１，１７ｘｌＯ’。ま
た、ＢＣ［ｌＦを含むフラクションを集め、限外濾過膜
（アミコンＹＭ−１０）を装置した限外濾過装置を用い
て２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６，３）に置
換した。

ＡｃＡ−３４カラムクロマトグラフイーで分画されたＢ
ＣＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝
液（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｐカラム（フ
ァルマシア・ファインケミカルス、スウェーデン）に通
した。このカラムを２５ｍＭピペラジン＝塩酸緩衝液で
洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０ｍｆｆの１
／１０希釈ポリハソファ−７４（ファルマシア・ファイ
ンケミカルス、スウェーデン）で溶出した。カラム操作
はファースト・プロティン・リキッド・クロマトグラフ
ィー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファインケミカルス、
スウェーデン）を用い、流速は毎分０．５ｍ＋εで行な
った。溶出液を１　ｍｌずつ分取し、ＢＣＤＦ活性とｐ
Ｈを測定した。ＢＣＩ）Ｆ活性はｐ）１４．９〜５．１
の位置に溶出された。

Ｍｏｎｏ　Ｐカラムより得たＢＣＩ）Ｆ活性画分を０．
１％ＴＦＡ　（１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラム５ｙｎｃｈｒｏｐａ
ｋ　ＲＰ−Ｐ　　（ＣＩｓ）（２５０ｘ　４．１１１１
％　５ｙｎｃｈｒｏｓ＋）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにかけ、溶出液０．１％　ＴＦＡ中のアセトニ
トリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させＢＣＤ
Ｆを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で？容出さ
れる。０．０．２８０のピークは他のＯ，Ｄ、Ｚ８゜の
ピークとは完全に分離しており、このピークに対応して
ＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍結乾燥して
ＢＣＤＦ標品を得た。

この標品を還元条件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％ゲル）電気泳動を行なった。

分子量２１０００に相当するゲル区分を切り出し、工ソ
ペンドルフチューブ中０．０５％ＳＤＳ、１０ｍＭＮＩ
ＩＪＣＯｓで３７℃、−晩、振盪し抽出した。

この溶出液を再び直接逆相クロマトグラフ用カラム５ｙ
ｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰ−Ｐ　　（ＣＩｓ）（２５０Ｘ
　４．１ｆｉ、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）を用いた）ＩＰＬＣ
にかけ、溶出後０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度
を０から６０％まで直線的に増加させてＢＣＤＦを溶出
した。

アセトニトリル５０〜５５％で溶出される０、Ｄ、ｚｓ
ｏのピークは他のＯ，Ｄ、ｚｓ。ピークとは完全に分離
しており、このピークに対応してＢＣＤＦ活性が検出さ
れた。このピークを凍結乾燥して精製ＢＣＤＦを得た。

ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために前述のよ
うにして得られた６μｇの精製ＢＣＤＦをプロティン・
シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
　Ｃｏ、。

Ｃａ１ｆ、Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ）に導入した。アミノ
酸配列の決定方法はＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　
１９３．２６５〜２７５（１９５１）に記載されている
方法により行なった。

Ｎ末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。

Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　
ＧｌｕＡｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｌａｌａ実施例２実施例１に記した方法により調製した精製ＢＣＤＦ標品
２０１１ｇを５　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、ｐＨ
９，５のパンファーに溶解し、リシルエンドペプチデー
ス（Ｌｙｓｙｌ　Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（和光
）（Ｌｙｓｙｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔ−ｉｄａｓｅ：　　
ＢＣＤＦ標品＝１　：　２００、モル比）を加え、３７
℃、６時間反応させ、ＢＣＤＦをフラグメント化した。

反応液を逆相クロマトグラフィー用カラムｐ　Ｂｏｎｄ
ｏ　Ｐａｃｋ　（０，２１Ｘ　３０　ｃｍ）を用いた　
ＨＰＬＣにかけ、溶出液、０．０６％ＴＦＡ中のアセト
ニトリル濃度を０から６０％まで直線的に増加させてフ
ラグメントを分離溶出した。この結果）ＩＰＬＣの溶出
ピーク１〜９を得た。各ピーク部分の溶出液を凍結乾燥
し、プロティン・シークエンサー　　（Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏ、、　Ｃａ１ｆ、　Ｍｏｄ
ｅｌ　４７０４）に導入した。アミノ酸配列の決定は、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋↓、２６５〜２７５（１
１５１）に記載されている方法により行なった。

アミノ酸配列を確認出来たフラグメントとアミノ酸配列
を記す。

フラグメント３Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕフラ
グメント８Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−へＩａ−Ｇｌｎ−へｓｎ−Ｇｌｎ
−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｙ−Ｍｅｔフラグメント２Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−χ
−Ｙ−Ｌｙｓフラグメント６八５ｐ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｘ尚、Ｘ及
びＹは同定できなかったアミノ酸フラグメント２，６は
実施例１のＮ末端配列と一致した。

実施例３実施例１および２で得たＢＣＤＦのアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを、下記のように合成した。

オリゴヌクレオチドの合成はアプライドバイオシステム
社製ＤＮＡシンセザイザー・モデル３８０Ａを用い、シ
リカゲルを固相担体とし、亜リン酸トリエステル法を用
いてヌクレオチド結合反応を行った。常法により保護基
を除去した後、ｃ１８逆相カラム）ＩＰＬＣにてアセト
ニトリルグラジェントを用いて、目的のオリゴヌクレオ
チドを精製した。

フラグメント３Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕプロ
ーブ魚＾Ａ八へＧ八へへＧＣＣ−ＣＴＣ−ＧＣＧ−Ｇ＾　　　
　　　・・・　　　３−６（各６４ｉ？！！りの混合物
）フラグメント８Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｙ−Ｍｅｔプローブ陽ＧＣ八−ＣＡＡ−ＡＡＴ−Ｃへへ−ＴＧＧ−ＴＴ　　　
　　　　・・・　　　８−１ＧＧＣＧ　　　ＣＧＣＴ−ＣＡＭ−へへＴ−ＣＡ＾−ＴＧＧ−ＴＴ　　　
　　　　・・・　　　８−２ＣＧＣＧ　　　Ｃ（各３２通りの混合物）Ｎ末端アミノ酸配列ＣＧＧＣＧＡ＾−ＧＡＴ−ＴＣＴ−Ａへ＾−ＧＡＴ−ＧＴ　　　
　　　　・・・　　　Ｎ−２ＣＣＧＣＡＡＡ−ＧＡＴ−ＧＴ＾−ＧＣＡ−ＣＣ八−ＣＣ・・・
　　　Ｎ−４ＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧ（各６４通りの混合物）実施例４（イ）　　２Ｒ容プラスチツクローラー培養器（ファル
コン＃３０２７）　　（以下ローラーと称する）中の１
２の２０％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグ
ルタミン、５Ｘ１０−’Ｍ　　２ＭＢ、１００単位／ｌ
ｌｌ１ペニシリン、１００μｇ７ｍｌストレプトマイシ
ン、２（ｌｔ１ｇ／ｍＩｔゲンタマイシン、１６ｍＭＮ
ａＨＣＯｓを含有）に２Ｘ１０’／ａｎ細胞数にＶＴ−
１を接種し、８ｒｐ１１１で回転させつつ３日間、３７
℃で培養した。培養後、培養物を遠心分離して細胞を集
めＰＢＳで２回細胞を洗った後細胞（１，８Ｘ１０９細
胞）をＰＢＳ溶？＆１３００　　ｍＡに懸濁し、細胞を
遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤で
あるＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ
　ｃｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ）を含んだＲ３Ｂ溶液（１
０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩ（Ｊ！、　ｐＨ７，５，１０ｍＭ
　ＮａＣ１’、　　１．５ｍＭＭｇ（Ｊ！　ｇ）　８０
０　ｍｌに懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％に
なるように加えた後ゆるやかに攪拌後、３０００　ｒｐ
ｍで５分遠心して核を含む細胞ｄｅｂｒｉｓを除去し、
その上清液にＳＤＳ　（最終濃度０．５％）とＥＤＴＡ
　（最終濃度５ｍＭ）を加えた後、直ちにフェノールを
等量刑え、細胞質ＲＮＡを抽出した。

合計３回フェノール抽出を繰り返してから、２容エタノ
ールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め、１０　
ｍ　Ｍ　ＴｒｉｓｌｌＣ１、ｐｕ　７．５で溶解した。

このようにしてＶＴ−１細胞から得られたＲＮＡ量は３
０■であった。

次にこのＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ（
ｄ　Ｔ）−セルロース（Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋
１ｃａｌｓ。

Ｔｙｐｅ　７　）を用い、カラムクロマトグラフィーを
行なった。吸着は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１、ｐＨ
７，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　
０．５％ＳＤＳ溶液にＲＮＡを溶解して行ない、緩衝液
（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、　ｐＨ７，５，０，５
Ｍ　ＮａＣｌ！、　　１　ｍＭＥＤＴ＾）で洗浄後、溶
出は水と１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ７，５
）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。こ
の結果溶出されたｍＲＮＡ量は５７６μｇであった。

（Ｅｌ）　　（Ａ）で調製したｍＲＮＡ　５μｇを用い
て二重鎖ｃＤＮＡを作製した。ＧｔｌＢＬＥＲ，ＵとＨ
ＯＦＦＭ八Ｎ　＋へＢ　＋　Ｊ　、　＋　（Ｇ　ｅ　ｎ
　ｅ翻、　２６３．１９８３）の方法に従い、ｃＤＮＡ
合成キット（アマジャム）を用いアマジャムのプロトコ
ールによって二重鎖ｃＤＮＡを作製した。すなわち、ｍ
ＲＮＡより逆転写酵素によりジングルストランドｃＤＮ
へを合成し、ｍＲＮＡとｃＤＮＡのハイブリッドを基質
として、大腸菌リボヌクレアーゼＨを利用してＲＮ　Ａ
　ＩＮにニックとギャプを形成した。さらに大腸菌ＤＮ
ＡポリメラーゼＩによって、ニックトランスレーション
タイプの反応によりｍＲＮＡをＤＮＡに置き換え二重鎖
ＤＮＡを作製した。この３′末端にある小さなオーバー
ハングをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて除去し、二重
鎖ｃＤＮ＾を作製した。最終的に得た二重鎖ｃＤＮ＾は
１．０８μｇであった。

（ハ）得られた二本鎖ｃＤＮ４１．０８μｇを蔗糖密度
勾配遠心法（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆｉ　、　　
１　ｍＭ　ＥＴ）ＴＡ。

ｐＨ１７，５を含む溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、
４０．００Ｏｒｐｍ　、　　４℃下で１３時間）により
分画し、その１部をアガロースゲル電気泳動法によるオ
ートラジオダラムにより解析し、二本鎖ｃＤＮＡのサイ
ズが５００ｂｐ以上の両分を集めてエタノール沈澱法で
回収した。回収した二本鎖ｃＤＮＡは約０．６μｇであ
った。

（ニ）０．１Ｍカコジル酸カリウム（トリスＢａ５ｅで
ｐＨを７．２にしたもの）１０ｍＭ　　ＤＴＴ、２ｍＭ
ＣｏＣＲ２，０，５ｍ　Ｍ　３２Ｐ−ｄＣＴＰ　　（比
活性ＩＸＩＯ６ｃｐｍ／ｎ　ｍｏｌｅ）　＋　　０．６
　＃　ｇ二本鎖ｃＤＮＡおよび５０単位のデオキシヌク
レオチジルターミナルトランスフエラーゼ（ＢＲＬ）を
混合し、２４℃、２０分間インキユヘートした後、フェ
ノール処理を行い、セファデックスＧ−５０カラムを通
してｃＤＮＡ画分を集め、エタノール沈澱物として０．
２４μｇのｄＣ−テイルしたｃＤＮＡを得た。このｃＤ
Ｎ＾は約１３個のｄＣＭＰ残基が３′両末端に付加され
ていた。

（＊）一方、第１図に示したようにサル細胞（ＣＯ３細
胞）でのｃＤＮＡ発現ベクターｐＱをｐＣＥＩＬ−２（
Ｎａｔｕｒｅ　、　３０２　、３０５　、　（１９８３
））から構築した。ｐＱはｃＤＮ＾を両向きのＳＶ４０
初期プロモーターにはさみごみができ、ｃＤＮＡがどち
らの方向に挿入されてもＣＯＳ細胞中でｃＤＮＡにコー
ドされるペプチド蛋白を発現させることができる。また
、Ｅ、　ｃｏｌｉ中でも複製可能で、テトラサイクリン
耐性として選択することができる。

このｐＱをＰｓｔ　Ｉで切断し、先程のｄｓ−ｃＤＮＡ
の３′端の両端にｄＣｔａｉｌをつけたのと全く同じよ
うにｄＧ　ｔａｉｌを１３個前後付与した。

次にこのｄＧ−ｔａｉｌｅｄ　ｐ　Ｑ　１００　ｎｇと
ｄＣ−ｔａｉｌｅｄｄｓ−ｃＤＮＡ　　２　０ｎｇを　
５　０ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ２　、　　ｐＨ７
，５゜０、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ　、　　１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡの溶液に混合し、まず６５℃で２分間、ついで４５
℃で６０分間、３７℃で６０分間、そして室温で６０分
間インキユヘートシた。そしてこのアニーリングしたＤ
ＮＡをコンピテントなＥ、　ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０６１
に導入した。次にＭＣ１０６１のコンピテント細胞の作
り方、導入法を以下に示す。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を１００ｍｆｆの！培地
（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｍｇ
ＳＯ４・７ＨｚＯ，ｐＨ７，６）に接種し、培養液の吸
光度が５５０ｎｍで０．３〜０．５付近になるまで３７
℃で振盪培養した。培養終了後、培養液を５分間、０℃
に保持し、菌体を遠心分離により集め、Ｔｆｂｌ（３０
ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ　ＲｂＣ４’、　　１０
ｍＭ　ＣａＣｆｆ２　、　５０ｍＭ　Ｍｎ（１！、　、
　　１５％グリセリン。

ｐＨ５，８）の４０！＋ｌＩ！に懸濁し、０℃に５分間
静置した。

再び菌体を遠心分離により集め、ＴｆｂＩＩ（１０ｍＭ
　ＭＯＰＳ　ｏｒ　ＰＩＰＥＳ、　　７５ｍＭ　ＣａＣ
ｆｆ２．１０ｍＭ　ＲｂＣｊ！。

１０％グリセリン、ｐｌ＋６．５＞の４０ｍｆｆに懸濁
し、０℃で１５分間静置した。この懸濁液を分注して一
７０℃に保存した。

次にこのように調製したコンピテント細胞の１００μｌ
を１５分間、０℃に保持し、この中に先程ｄＧ−ｔａｉ
ｌｅｄ　ｐＱ　ｖｅｃｔｏｒとｄＣ−ｔａｉｌｅｄ　ｃ
ＤＮＡとを７　ニー　ルＬ　ｆ、−標品ｉ　０＋ｒｆ及
び５０ｍＭ　ＭｇＣ１２゜１０ｄ　ＣａＣｌ１ｚの溶液
９０μβとを混合し、０℃で２０分間静置する。ついで
３７℃で６０秒間熱処理後、１〜２分間、０℃に保持し
、これに！培地ｌｌｌ７！を加え、３７℃で６０分間振
とう培養した。この培養液を１５μｇ７ｍｌのテトラサ
イクリンと２５μｇ／１ＩＩｎのストレプトマイシンを
含むし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０
．５％ＮａＣＡ’　）の寒天プレートに塗抹し、３７℃
で一晩インキユベートするとコロニーが出現した。

（へ）得られた形質転換株約１５０，０００クローンに
対し、プローブ８−１．および８−２を用いてＧｒｕｎ
ｓｔｅｉｎ、ＭらＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｇｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　６８　。

３７９　（１９７９）の方法でコロニーハイブリダイゼ
ーションを行ったところ、８−１とハイブリダイズする
株が１０クローン認められた。さらにこれらの１０クロ
ーンに対してプローブ３−１〜３−６を用いて、同様の
方法でコロニーハイブリダイゼーションを行ったところ
プローブ３−２とハイブリダイズする株１クローンを得
た。本クローンが保持するプラスミドＤＮＡを粗抽出精
製し、制限酵素Ｐｓｔｌで切断後、ｃＤＮＡインサート
をアガロース電気泳動にてｐＱベクターと分離した。

プローブ８−１プローブ３−２．プローブＮ−２または
プローブＮ−５を用いてサザンハイブリダイゼーション
分析を行ったところいずれのプローブともハイブリダイ
ズした。その他のプローブとはハイブリダイズしなかっ
た。

このプラスミ）”ＤＮＡをｐＢＳＦ２−３８と名づけた
。すなわち本ｐＢＳＦ２−３８のもつｃＤＮＡインサー
トはＢＣＤＦ活性をもつ蛋白の明らかにされた部分アミ
ノ酸配列に相当する遺伝子配列を有することが明らかで
あり、本ｃＤＮＡはＢＣＤＦ遺伝子であると同定した。

実施例５（イ）　ｐＢＳＦ２−３８　　プラスミドＤＮＡを大量
調製するために本ｐＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０
６１を２０μｇ／ｍβのテトラサイリンと２５μｇ／ｍ
Ａのスプレブトマイシンを含む！培地１００ｍＪに接種
し、３７℃で５〜７時間振盪培養した。次に最終濃度１
７０μｇ／ｍ１２となるようにクロラムフェニコールを
含む新たな！培地１００ＩＩＩｅを加え、さらに−晩振
盪培養した。

このようにして増幅されたプラスミドＤＮＡを以下のよ
うに精製した。

培養液を遠心分離により菌体のみ集め、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−）ＩＣｌ　、　ｐＨ７，５の５１１１ｊ２に懸濁し
一８０℃に凍結後、融解して次にリゾチーム（最終濃度
、２■／ＩＩ＋りを加えて０℃で１０分間静置し、さら
にＥＤＴＡ　（最終濃度０．１Ｍ）を加え、０℃で１０
分間静置する。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終
濃度０．１％）を加えて０℃で６０分間静置する。つい
で３０．００Ｏｒｐｍ　、３０分間遠心分離し、ソ０）
上清液を等量の水飽和フェノールで処理する。その水層
をさらに等量のクロロホルムで処理し、その水層を抽出
し、これに最終濃度２０μｇ／ＩＩＩＩ！となるように
ＲＮａｓｅを加え、３７℃で６０分間インキヱへ−トし
た。

その後０．２容の５ＭＮａ（ｌと１／３容のポリエチレ
ングリコールを加え、０℃に６０分間静置後、１０．０
０Ｏｒｐｍ　２０分間、遠心分離によりＤＮＡ沈殿を回
収する。

次にこの沈殿を３．８ｍｎの水に溶解し、４ｇのＣｓＣ
１を加えて溶解後、１０ｍｇ／ｍｆｆのＥ　ｔＢｒの２
００、ｕ／を加えて４０．００Ｏｒｐｍ　、１６時間、
２０℃で超遠心分画を行う。

遠心終了後、ｐｌａｓｍｉｄ　Ｄ　Ｎ　Ａ画分を抽出し
、水飽和ｎ−ブタノールの１〜２容で４回抽出操作を行
ってＥｔＢｒを除く。その後＋１２０中で透析を行って
ＣｓＣｅを除去後、３Ｍ酢酸ソーダｐｏｓ、６のｌ／１
０容を加え、さらに２容の冷エタノールを加えて、−２
０℃で一晩静置する。このエタノール沈殿を遠心分離で
集めて８０％エタノール水溶液で洗浄後、よく乾燥し、
この沈殿物を１０　ｍＭ　ＴｒｉｓｌｌＣ１、ｐｔ１７
．５の５０μｌに溶解しザル細胞トランスフェクション
だめのサンプルとした。

（ロ）　　サルＣＯ３−７細胞へのプラスミドの感染法
ＣＯＳ〜７細胞をｌＸＩＯ３７ｍ１ｌになる様に１０％
牛脂児血清含有ＲＰＭＩに懸濁し、この３　ｍｌ。

分を５ｃｍシャーレにて５％炭炭酸ガスインキュベータ
ー内子７で一夜培養した。培養上清を除去し、新しい１
０％牛脂児血清含有ＲＰＭ１３　ｍ　ｌを加え、３７℃
、５％炭酸ガスインキュベーター内で２時間培養した。

培養後、上滑を除去し、ＴＢＳ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩｔ　、　ｐＨ７，５，１３０＋Ｍ　ＮａＣ１！、
５ｍＭＫＣｎ、０．６ｄ　ＮａＪＰＯ＋）　２．５　ｍ
ｌｌにて１回洗浄した。

プラスミド混合物（ＴＢＳ　（＋）（ＴＢＳに０、７　
ｄ　ＣａＣｌｚ　、０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ１ｚを加えた
もの）１．０ｍｆ、プラスミドＤＮＡ２ｔｒｇおよび１
０■／ｌ１ｌｌ　ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ　５０μｌ
を加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で４
時間インキュヘート、上清を除去後、ＴＢＳ２．５ｓ＋
Ｉｌで洗浄除去し、１５０μｎクロロキン含有１０％牛
脂児血清含有ＲＰＭＩ２．５　ｍｌを加えた。３７℃、
５％炭酸ガスインキュベーター内で５時間インキュヘー
ト後上清を除去し、ＴＢＳ２．５ＩＩＩＩｌで２回洗浄
した。

１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　３　ｖｎ　１を加え、
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で一夜培養し
た。

上清を除去後向ＲＰＭＩ３ｍβを加え、３７℃５％炭酸
ガスインキュベーター内で２日培養した。そしてこの培
養上清を遠沈後その上清をＢＧ叶活性測定用サンプルと
した。

ミドＤＮＡを導入したＣＯ３は対照に比べ明らかなりＣ
ＤＦ活性を示した。

このように真核生物細胞ＣＯＳ〜７で生産されたりコン
ビナントヒト　ＢＣＤＦは培養液を抗ＢＧ叶抗体固定化
カラムを通し、次いで前出の逆相肝ＬＣ（ジンクロンＣ
ｌ８）を用いて精製された。本ＢＣＤＦはｃＤＮＡ構造
にＮ−グリコシレージョン位置のあることより糖鎖を含
有するものであり、その理化学的性質は実施例１の方法
にてＶＴ−１培養上清により精製された純化ＢＣＤＦの
それに一致した。すなわち分子量：３，５±ｏ、５ｘｔ
ｏ’ダルトン（ゲル濾過法）２．２±０．２Ｘ１０’ダ
ルトン（ＳＯ３−ボリアクリルアミド電気泳動法）等電点：ｐＨ４，９〜５．１であった。

実施例６実施例５（イ）により調製したｐＢＳＦ２−３８より制
限酵素ＢａｍＨＩで切り出したＢＣＤＦ　ｃＤＮＡ　１
ｎｓｅｒｔをプローブとしてＢＣＤＦ　＋ｗＲＮＡサイ
ズ、分子種、ＢＣＤＦｍＲＮＡ産生株の評価を行なった
。用いたｍＲＮＡは本ＢＣＤＦを産生ずるＶＴ−１細胞
をはじめとして他にＢＣＤＦを産生ずると考えられるＣ
　Ｅ　Ｓ　Ｓ　、　ＲＰＭＩ　１７８８とＢＣＤＦ活性
の認められないＣＬ　−４、Ｊｕｒｋａｔ、　ＣＥＭ細
胞から実施例４の（イ）と同じ方法で調製したものであ
る。

各々ｍＲＮ＾１０μｇ／３．６ｕ＃、５ｘＭＯＰＳ緩衝
液（０，１Ｍ　ＭＯＰＳ　　（ｐＨ７，０）　７５ｍＭ
　Ｎａ０Ａｃ、５ＩＩＩＭＥＤＴＡ　）　６．０μ！、
ホルムアルデヒド５．４μ！およびホルムアミド１５．
０μβを６０℃１５分間インキユヘートし、これに色素
液（０，０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５
％キシレンシアツール含有８０％グリセロール液）３μ
ｌを加えたものを調整サンプルとした。本サンプルを１
×ＭＯＰＳ緩衝液、１．８％ホルムアルデヒド含有ｔ、
６％アガロースゲルにて電気泳動し、その後、常法によ
りニトロセルロースフィルターにブロッティングした。

そして本フィルターを８０℃３時間へ−りした。この様
に調製したフィルターを０．１％ＳＤＳ含有３ＸＳＳＣ
に浸漬後、１×デンハルト溶液、５０％ホルムアミド、
５ＸＳＳＣ１２５０μｇ／ｍβニシンＤＮＡ含有５０ｍ
Ｍナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）にて４２℃で
一夜プレハイブリダイズした。そして、１×デンハルト
溶液、５０％ホルムアミド、５　ｘＳＳＣ，２５０８ｇ
　／ｍｌｌニシンＤＮＡ含有５０ｎ＋Ｍナトリウムリン
酸緩衝液（ｐＨ６，５）中にて３２ｐラヘル化、Ｂ５Ｆ
２−３９のＢａｍ１ｌｌ　ｃＤＮＡインサートをプロー
ブとして４２℃−夜ハイブリダイズした。

ハイブリダイズしたフィルターを室温で０．２％ＳＤＳ
含有２ＸＳＳＣにて５分間４回、５０℃で０．２％ＳＤ
Ｓ含有０．　Ｉ　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃにて３０分間２回洗浄
し、風乾後、オートラジオグラムを作成した。

その結果、Ｖ　Ｔ　−１、、ＣＥＳＳ　（ＢＣＤＦ産生
株）、ＲＰ旧１７８８由来のＩＩＩＲＮ八にはｐＢＳＦ
２−３８のｃＤＮＡプローブはハイブリダイズした。Ｂ
ＣＤＦを産生じないと思われるＣ　Ｌ　−４、Ｊｕｒｋ
ａｔ、　ＣＥＭおよびＢＣＤＦ非産生ＣＥＳＳ由来のｍ
ＲＮＡにはハイブリダイズしなかった。

またｐＢＳＦ２−３８のｃＤＮＡプローブとハイブリダ
イズす実施例７ｐＢＳＦ２−３８を保持するＭＣ１０６１より実施例５
の（イ）に記した通りプラスミドＤＮＡを得、制限酵素
ＢａｍＨＩで切り出すことによりＢＣＤＦ　ｃＤＮ＾を
調製した。そして制限酵素地図と塩基配列を決定した。

塩基配列はＭａｘａ＋ｌ１−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（
Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ。

脳、　４９９　（’８０）　）およびＭ１３ファージ（
Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、１９．２
６９（’８２））を使ったジデオキシヌクレオチド鎖集
結法（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
７４．５４６３（’７７）の方法により決定した。決定
された塩基配列および制限酵素地図を第５図に示す。

ごこに決定されたヒトＢＣＤＦ塩基配列は実施例１゜２
で開示されたアミノ酸部分配列構造を全て正確に含む。

【図面の簡単な説明】

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトＢ細胞分化因子（以下ＢＣＤＦと称する）活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
（２）遺伝子が、制限エンドヌクレアーゼにより切断さ
れる箇所がコード配列の５′−末端からＭｖａ I 、Ａ
ｌｕ I 、Ｓａｕ３Ａ I 、Ｐｓｔ I の順序で配列され
ている部分を有する特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（３）遺伝子が、制限エンドヌクレアーゼにより切断さ
れる箇所がコード配列の５′−末端からＭｖａ I 、Ｍ
ｖａ I 、Ａｌｕ I 、Ｓａｕ３Ａ I 、Ｐｓｔ I 、Ｘｂ
ａ I 、Ａｌｕ I 、Ｐｓｔ I 、Ｐｓｔ I 、Ａｌｕ I
の順序で配列されている部分を有する特許請求の範囲第
１項記載の遺伝子
（４）遺伝子が下記の塩基配列（ａ）を有するものであ
る特許請求の範囲第１項記載の遺伝子（ａ）【遺伝子配列があります】
（５）遺伝子が、前項記載の配列（ａ）における１〜３
番目のＡＴＧ配列からはじまり、該ＡＴＧ配列から少く
も６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列までの配列スペース
を有するものである特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（６）遺伝子が、（４）項記載の配列（ａ）における８
５〜８７番目のＣＣＡ配列からはじまり、該ＣＣＡ配列
から少くも６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列までの配列
スペースを有するものである特許請求の範囲第１項記載
の遺伝子
（７）遺伝子が、（４）項記載の塩基配列（ａ）におけ
る８５〜８７番目のＣＣＡ配列からはじまるものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（８）遺伝子が、（４）項記載の塩基配列（ａ）におけ
る６３４〜６３６番目のＡＴＧ配列で終わるものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
（９）遺伝子が、下記のアミノ酸配列（ I ）に対応す
る塩基配列を有するものである特許請求の範囲第１項記
載の遺伝子アミノ酸配列（ I ）：【遺伝子配列があります】
（１０）遺伝子が下記のアミノ酸配列（II）に対応する
塩基配列を有するものである特許請求の範囲第１項記載
の遺伝子アミノ酸配列（II）：【遺伝子配列があります】
（１１）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
ドした遺伝子および真核生物の細胞中で複製可能なベク
ターＤＮＡよりなることを特徴とする組み換えＤＮＡ体
（１２）遺伝子が第４項記載の塩基配列（ａ）を有する
ものである特許請求の範囲第１１項記載の組み換えＤＮ
Ａ体
（１３）遺伝子が第５項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１４）遺伝子が第６項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１５）遺伝子が第７項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１６）遺伝子が第８項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１７）遺伝子が第９項記載のものである特許請求の範
囲第１１項記載の組み換えＤＮＡ体
（１８）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第１１項記載の組み換え体
（１９）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子および真核生物の細胞中で複製可能なベク
ターＤＮＡよりなることを特徴とする組み換えＤＮＡ体
により形質転換された真核生物細胞
（２０）遺伝子が第４項記載の塩基配列（ａ）を有する
ものである特許請求の範囲第１９項記載の真核生物細胞
（２１）遺伝子が第５項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２２）遺伝子が第６項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２３）遺伝子が第７項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２４）遺伝子が第８項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２５）遺伝子が第９項記載のものである特許請求の範
囲第１９項記載の真核生物細胞
（２６）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第１９項記載の細胞
（２７）特許請求の範囲第１９項記載の真核生物細胞を
培地中にて培養し、生産されたヒトＢＣＤＦを採取する
ことを特徴とするヒトＢＣＤＦの製造法
（２８）真核生物がサッカロミセス属に属するものであ
る特許請求の範囲第２７項記載の方法
（２９）真核生物の細胞が大型Ｔ抗原を構成的に発現す
るＳＶ−４０で形質転換されたサル細胞である特許請求
の範囲第２７項記載の方法
（３０）ヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
（３１）Ｃ−末端がメチオニンである特許請求の範囲第
３０項記載のポリペプチド
（３２）Ｎ−末端がプロリンである特許請求の範囲第３
０項記載のポリペプチド
（３３）Ｎ−末端がプロリンであり、Ｃ−末端がメチオ
ニンである特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（３４）Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ
Ｌｕの配列を内部に有する特許請求の範囲第３０項記載
のポリペプチド
（３５）Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎの配列を内部に有す
る特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（３６）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏの配
列を内部に有する特許請求の範囲第３０項記載のポリペ
プチド
（３７）特許請求の範囲第３４〜３６項記載のアミノ酸
部分配列もしくはＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕのアミノ酸部分配列を少なくとも２個以上
内部に有する特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチ
ド
（３８）アミノ酸配列（II）で示される特許請求の範囲
第３０項記載のポリペプチド
（３９）アミノ酸配列（II）に示す構造で１個もしくは
複数アミノ酸を他のアミノ酸におき換えた構造を有する
特許請求の範囲第３０項記載のポリペプチド
（４０）アミノ酸配列（II）に示す配列のうち、Ｎ−末
端部もしくはＣ−末端部より１個もしくは複数個のアミ
ノ酸が欠損し、かつ連続している複数のアミノ酸よりな
るヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド
（４１）真核生物の細胞で生産される糖鎖を有する糖蛋
白質でポリペプチド部分が特許請求の範囲第３１〜３７
項の範囲に入るヒトＢＣＤＦ活性を有するポリペプチド