FI106844B - Menetelmä Moraxella catarrhalisin antigeeneihin liittyvien koostumusten ja vasta-aineiden valmistamiseksi sekä DNA-segmentti, yhdistelmävektori ja yhdistelmäisäntäsolu - Google Patents

Description

106844

Menetelmiä Moraxella catarrhalisin antigeeneihin liittyvien koostumusten ja vasta-aineiden valmistamiseksi sekä DNA-segmentti, yhdistelmävektori ja yhdistelmäisäntäsolu 5 Keksinnön tausta

Keksinnön ala

Keksintö liittyy yleisesti Moraxella catarrhalik-sen moniin erilaisiin ulkomembraaniproteiineihin (OMP:t). Tietyissä nimenomaisissa kohteissaan tämä keksintö koskee 10 menetelmää antigeenien valmistamiseksi, jotka antigeenit ovat SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla määritettyjen moolimassojensa perusteella ovat tunnistettavissa 30 kD:n ja 80 kD:n suuruisiksi antigeeneiksi sekä menetelmää kolmannen antigeenin valmistamiseksi, jota antigeeniä ni-15 mitetään "suurimoolimassaiseksi proteiiniantigeeniksi" eli "HMWP-antigeeniksi, jonka moolimassa on alueella 200 - 700 kD. Tarkemmin tämä keksintö koskee menetelmää antigeeni-koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka sisältää Moraxella 20 catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-0MP:n kanssa im-munologisesti ristireagoivan epitoopin.

Tämä keksintö koskee muissa kohteissaan näitä antigeenejä koodaavia yhdistelmä-DNA-klooneja, näistä antigeeneistä peräisin olevia antigeenifragmentteja, niitä vastaa-25 via molekyylejä sekä näiden molekyylityyppien kanssa reagoivia vasta-aineita. Tämä keksintö koskee myös DNA-segmenttiä, yhdistelmävektoria, yhdistelmäisäntäsolua sekä menetelmää vasta-aineen valmistamiseksi. Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmiä Moraxella catarrhalis -antigee-30 nien ja -vasta-aineiden havaitsemiseksi.

Tekniikan taso .. · ·

Moraxella catarrhaliksen (joka on aiemmin tunnettu nimityksillä Branhamella catarrhalis tai Neisseria catarrhalis) arveltiin aikaisemmin olevan ylempien hengitysteiden 35 vaaraton saprofyytti. Viimeksi kuluneen vuosikymmenen aikana on kuitenkin tultu siihen johtopäätökseen, että tämä or- 2 106844 ganismi on ihmisen merkittävä patogeeni. Itse asiassa tämän gramnegatiivisen diplokokin on viimeaikaisissa tutkimuksissa osoitettu pitävästi olevan useiden infektioiden aiheuttaja ihmisellä [Murphy, (1989)]. Moraxella catarrhalis on 5 esimerkiksi tärkein välikorvantulehduksen, äkillisen poskiontelotulehduksen sekä alempien hengitysteiden yleisinfektioiden aiheuttaja [näitä kysymyksiä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Murphy, et ai., (1989)]. Tutkimukset ovat selvästi osoittaneet, että Moraxella catarrhalis 10 -infektioista johtuvien välikorvantulehdusten sekä poskiontelotulehdusten ilmaantuvuus on lisääntymässä ja että tämä organismi on nykyisin kolmanneksi yleisin taudinaiheuttaja-organismi. Välikorvantulehdus on julkaistuissa raporteissa itse asiassa katsottu yleisimmäksi vauvaikäisille ja lap-15 sille suunnattujen terveydenhoitotoimenpiteiden kohteena olevaksi taudiksi [Consensus, (1989)].

"Consensus"-raportissa, johon edellä viitattiin, tultiin siihen johtopäätökseen, että välikorvantulehduksen ehkäiseminen on terveydenhuollon tärkeä päämäärä, koska 20 tautia esiintyy sekä vauvaikäisillä että lapsilla sekä kaikkiin ikäryhmiin kuuluvissa tietyissä populaatioissa. Välikorvantulehduksesta johtuvien taloudellisten kokonaisrasitusten on itse asiassa arvioitu olevan vuosittain ainakin 2,5 miljardia, eli noin 3 % terveydenhuollon budjetis-25 ta. Rokotteiden katsottiin useista syistä olevan halutuin ratkaisuvaihtoehto tämän taudin ehkäisemiseksi. Mikäli esimerkiksi rokotteilla voitaisiin vähentää välikorvantulehduksen ilmaantuvuutta 30 prosentilla, niin arvioidut vuosittaiset säästöt terveydenhuollossa olisivat tällä tulok-30 sella ainakin 400 miljoonaa dollaria. Vaikkakin rokotteiden » · kehittämisessä kahdelle näistä kolmesta välikorvantulehduksen yleisestä patogeenistä, jotka ovat Streptococcus pneumoniae ja Haemophilus influenzae, on tapahtunut jonkin verran edistystä, ei mikään viittaa samanlaiseen edistymiseen 35 Moraxella catarrhaliksen ollessa kyseessä. Tämä on erityisen huolestuttavaa huomioiden sen, että noin 17 - 20 % kai- 3 106844 kista välikorvantulehdusinfektioista johtuu nykyisin Mora-xella catarrhaliksesta [Murphy, (1989)].

Aiemmin on tehty yrityksiä sellaisten Moraxella ca-tarrhaliksen antigeenien tunnistamiseksi ja luonnehtimisek-5 si, jotka voisivat toimia infektiota vastaan muodostuneen ihmisen immuunivasteen potentiaalisina merkittävinä kohteina [Murphy, (1989); Goldblatt, et ai., (1990); Murphy, et ai., (1990)]. Yleisesti ottaen Moraxella catarrhaliksen pinta koostuu ulkomembraaniproteiineista (OMP:t), lipo-10 oligosakkaridista (LOS) ja fimbrioista. Kuten Murphy korostaakin, vaikuttaa Moraxella catarrhalis olevan jonkin verran muista gramnegatiivisista bakteereista poikkeava siinä mielessä, että yritykset tämän organismin ulkomembraanin eristämiseksi solujen vaipan detergenttifraktioinnilla ovat 15 osoittautuneet yleensä johtavan epätyydyttäviin lopputuloksiin siinä mielessä, että suoritetuilla toimenpiteillä ei ole saatu yhtäpitäviä tuloksia. Preparaattien oli havaittu lisäksi olevan kontaminoituneita sytoplasmamembraaneilla, mikä viittaa siihen, että Moraxella catarrhaliksen solun 20 vaipan ominaisuudet ovat epätavalliset.

Tällä alalla työskentelevät tutkijat ovat kuitenkin osoittaneet, että Moraxella catarrhaliksella on 7 tai 8 tärkeintä OMP-molekyylityyppiä, ja että nämä ovat melko yhdenmukaisia bakteerikannasta toiseen tutkittujen kantojen 25 suuresta vaihtelevuudesta huolimatta. Esimerkiksi Campagna-ri, et ai., ovat merkinneet OMP-molekyylejä kirjaimilla A -H, jotka alkavat moolimassaltaan 98 kD:n suuruisesta vyöhykkeestä (OMP-A) ja jatkuvat noin 21 kD:n moolimassaiseen vyöhykkeeseen (OMP-A). [Campagnari, et ai., (1987)].

30 Moraxella catarrhaliksen LOS:ää on myös ehdotettu ϊ mahdolliseksi rokotteiden kehityskohteeksi. LOS on eristet ty Moraxella catarrhalis -kannoista ja se on tutkittu SDS-PAGE:lla ja hopeavärjäyksellä [Murphy, (1989)]. Raportin mukaan yhtä kantaa lukuunottamatta kaikki kannat tuottivat 35 samanlaiset tulokset LOS-värjäyksessä. Vaikuttaa siis siltä, että Moraxella catarrhaliksen LOS on säilynyt antigee- 4 106844 neiltään hyvin suuressa määrin muuttumattomana, minkä perusteella tulisi mahdolliseksi käyttää LOS-molekyylin osaa rokotteen komponenttina.

Lopuksi on mainittava, että fimbrioita on ehdotettu 5 mahdollisiksi ehdokkaiksi rokotteisiin. Fimbrioilla on ilmeisesti osuutta joidenkin bakteerien kiinnittymisessä ja kolonisaatiossa limakalvojen onteloihin. Tällä alalla työskentelevät tutkijat ovat esittäneet sen väittämän, että mikäli fimbrioissa ilmentyy antigeeneinä muuttumattomina säi-10 lyviä epitooppeja, niin on mahdollista, että näitä epitoop-peja vastaan suunnatut vasta-aineet voisivat olla terapeuttisesti käyttökelpoisia tai että tällaiset epitoopit voisivat toimia rokotteen komponentteina.

Vaikkakin Moraxella catarrhalis -solun useiden eri-15 laisten osakomponenttien on ehdotettu olevan kohteita, joista rokotteiksi kelpaavia ehdokkaita voitaisiin ryhtyä etsimään, ei valitettavasti ole vielä tunnistettu yhtään tällaista ehdokasta. Minkään antigeenisen epitoopin tai antigeenisten epitooppien ei ole varmuudella osoitettu saavan 20 aikaan suojaavien vasta-aineiden muodostumista. On siten ilmeistä, että nykyisin on tarvetta ottaa selvää siitä, mitkä Moraxella catarrhaliksen komponenteista voisivat mahdollisesti toimia esimerkiksi sekä passiivisten että aktiivisten immunoterapeuttisten reagenssien, kuten rokotteiden, . 25 valmistukseen soveltuvina käyttökelpoisina antigeeneinä, mikäli näitä on lainkaan. Mikäli tällainen antigeeni tai tällaiset antigeenit saadaan tunnistettua, on lisäksi tarpeellista tuoda käyttöön menetelmiä ja koostumuksia, joilla näitä rokotteita on mahdollista valmistaa sellaisia määriä, 30 että niiden laajamittainen käyttö hoito-ohjelmissa on mah-,.· dollista.

Keksinnön yhteenveto

Edellä olevan esityksen mukaisesti tämä keksintö koskee yleisessä ja kaikenkattavassa mielessä sairauden 35 diagnoosissa mahdollisesti käytettävien Moraxella catarrhaliksen antigeenityyppien tunnistamista ja näiden valmistus- 5 106844 ta tunnistamisen jälkeen. Keksinnössä on yksityiskohtaisesti kyse siitä, että se koskee sen tekijöiden yllättävää havaintoa, että tietyt nimenomaiset Moraxella catarrhaliksen OMP-antigeenit, joihin kuuluvat 30 kD:n, 80 kD:n ja HMWP-5 OMP-antigeenit, ovat erityisen käyttökelpoisia rokotteen kehittämisessä. Tämän johdosta tämän keksinnön tekijät ehdottavat, että näitä antigeenejä olisi mahdollista käyttää komponenttina rokotetta valmistettaessa tai että niitä olisi mahdollista käyttää vastaavan tai samanarvoisen antigee-10 nin valmistamiseksi niiden jaksoa analysoimalla.

On korostettava sitä, että tässä keksinnössä arvellaan näiden OMP-antigeenien joukosta juuri 30 kD- ja HMWP-tyyppien osoittautuvan käyttökelpoisimmiksi siinä mielessä, että suoritetuissa tutkimuksissa on osoitettu näitä kahta 15 OMP-tyyppiä vastaan suunnattujen vasta-aineiden kykenevän reagoimaan laaja-alaisesti Moraxella catarrhaliksen alalajien ja isolaatioiden kanssa. 80 kD -tyyppiä vastaan suunnattujen vasta-aineiden ei kuitenkaan ole tähän mennessä osoitettu reagoivan kaikkien alalajien kanssa, eikä tämä 20 tyyppi siten saata olla yleisesti reagoiva. Tämän keksinnön erityisen edulliset sovellutusmuodot koskevat siten 30 kD:n ja HMWP-OMP-antigeenien valmistusta, näitä antigeenejä ja niitä muistuttavia molekyylityyppejä koodaavia DNA-fragmentteja sekä näitä antigeenityyppejä tunnistavien vasta- . 25 aineiden ja muiden vastaavien molekyylien valmistusta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle antigeenikoostu-muksen valmistamiseksi, joka käsittää puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka sisältää M. catarrhaliksen 30 kD.-n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n kanssa immunologisesti ris-30 tireagoivan epitoopin, on tunnusomaista, että se käsittää * .· vaiheet, joissa: a) valikoidaan solut, jotka kykenevät ilmentämään sellaisen epitoopin sisältävää proteiini- tai peptidianti-geeniä, joka ristireagoi immunologisesti M. catarrhaliksen 35 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n kanssa; „ 106844 6 b) viljellään soluja antigeenin ilmentymisen mahdollistavissa olosuhteissa; c) kootaan antigeeni talteen koostumuksen valmistamiseksi .

5 Keksinnön mukaiselle DNA-segmentille on tunnus omaista se, että se koodaa proteiini-tai peptidiantigee-niä, johon sisältyy Moraxella catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n kanssa immunologisesti ristireagoiva epitooppi. Keksinnön mukaiselle yhdistelmävektorille on 10 tunnusomaista se, että siihen sisältyy patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-segmentti ja keksinnön mukaiselle isän-täsolulle on tunnusomaista se, että se käsittää käsittää patenttivaatimuksen 15 mukaisen DNA-segmentin. Lisäksi keksinnön mukaiselle menetelmälle vasta-aineen valmistamisek-15 si on tunnusomaista se, että vasta-aine valmistetaan käyttäen immunogeeninä patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä antigeeniä .

Tietyissä sovellutusmuodoissa tämä keksintö siis koskee menetelmää antigeenikoostumuksen valmistamiseksi, 20 joka valmistettava antigeeni käsittää sellaisen epitoopin sisältävän puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, joka ristireagoi immunologisesti yhden tai useamman edellä olevan M. catarrhaliksen OMP-antigeenin kanssa. Vaikka puhdistettu proteiini- tai peptidiantigeeni käsittää tavaili-• 25 sesti pelkän alkuperäisen OMP:n, niin tästä patenttiseli- tyksestä saadaan käyttöön menetelmiä, joita voidaan käyttää näiden OMP-antigeenien varianttien, alkuperäiseen antigeeniin liittyviä antigeenisiä epitooppeja sisältävien peptidien sekä niiden kaikkien antigeeneinä toimintakykyisten 30 vastineiden valmistamiseen. Koska tässä keksinnössä on ku-vattu useita erilaisia OMP-antigeenejä koodaavia DNA-segmenttejä, voidaan antigeenit lisäksi yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltamalla saada käyttöön olennaisesti sellaisessa muodossa, ettei niissä esiinny muista M. catarrhalik-35 sen antigeeneistä peräisin olevia antigeenisiä epitooppeja. Tämä tarkoittaa sitä, että antigeeni voidaan valmistaa il- « 7 106844 mentämällä yhdistelmä-DNA:ta käyttäen muuta isäntäsolua kuin M. catarrhalista tai tämän sukulaislajia, minkä avulla antigeeni saadaan käyttöön olennaisesti antigeenisestä puhtaassa muodossa muihin M. catarrhaliksen antigeeneihin näh-5 den. Näissä preparaateissa ei tämän johdosta olisi esimerkiksi LOS- tai fimbria-antigeenejä.

Tässä keksinnössä kuvattuja DNA-segmenttejä voidaan vielä muissa sovellutusmuodoissa sekvensoida tavanomaista DNA:n sekvensointitekniikkaa käyttäen ja tästä DNA-sekvens-10 sistä voidaan määrittää valittua OMP-proteiinia vastaava aminohappojakso riippumatta siitä, onko kyseessä 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP-molekyylityyppi. Kun tämä informaatio on saatu käyttöön, on sopivien antigeeniepitooppien tunnistaminen melko mutkatonta käyttämällä apuna esimerkiksi alan 15 ammattikokemuksen perusteella käyttöön saatavia tietokoneohjelmistoja tällaisten epitooppien ennustamiseksi. Näiden "epitooppisten ydinjaksojen" aminohappojakso voidaan sitten liittää vaivatta lyhyehköihin peptideihin joko peptidisyn-teesin avulla tai yhdistelmä- DNA-tekniikalla.

20 Edullisten peptidien pituus on tavallisesti 15 - 50 aminohapon suuruusluokkaa ja niiden pituus on edullisesti noin 15-30 aminohappoa. Tässä keksinnössä tehtävän ehdotuksen mukaisesti on valitun OMP:n epitooppeja sisältävistä lyhyehköistä antigeenisistä peptideistä hyötyä tie-. V. 25 tyissä olosuhteissa, esimerkiksi rokotteiden valmistuksessa tai immunologisissa havaitsemismäärityksissä. Esimerkkeihin näistä hyödyllisistä piirteistä kuuluu se, että niiden avulla kyetään välttämään kontaminaatio- ja puhtausasteon-gelmia, joita esiintyy usein yhdistelmä-DNA-tekniikalla 30 tuottamalla valmistettujen proteiinien yhteydessä, koska « tämänpituiset peptidit ovat valmistettavissa vaikeuksitta synteettisesti peptidisynteesilaitteilla.

Muissa sovellutusmuodoissa tämä keksintö koskee menetelmiä sellaisten koostumusten valmistamiseksi, joihin 35 sisältyy puhdistettuja proteiini- tai peptidiantigeenejä, joihin kuuluu 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP-molekyylityyp- « 3 106844 pien kanssa immunologisesti ristireagoivia epitooppeja. Näihin menetelmiin kuuluvan yleisen käytännön mukaisesti valitaan ensin käyttöön solut, jotka kykenevät ilmentämään tällaista proteiini- tai peptidiantigeeniä, viljellään näi-5 tä soluja antigeenin ilmentymisen mahdollistavissa olosuhteissa ja otetaan antigeeni talteen sellaisen koostumuksen valmistamiseksi, johon tätä antigeeniä käytetään. Haluttaessa valmistaa varsinainen OMP-antigeeni on haluttua valmistaa ensimmäisenä vaiheena M. catarrhalis -soluviljelmä. 10 Tässä tapauksessa antigeeni saadaan ilmentymisensä jälkeen käyttöön solun ulkomembraanifraktiosta. Antigeeni valmistetaan sitten valmistamalla ensin membraanifraktio, jonka jälkeen suoritetaan antigeenin solubilisointi ja sen uutto valmistetuista membraaneista käyttäen ionittuvaa tai ionit-15 tumatonta detergenttiä. Antigeeni voidaan puhdistaa pidemmälle useilla erilaisilla menetelmillä, joihin kuuluvat fraktiointi pylväässä, isoelektrinen fokusointi ja muut näitä muistuttavat menetelmät tai jopa immunoadsorptio OMP:tä vastaan suunnattuja vasta-aineita käyttäen.

20 Tässä esitetyn patenttiselityksen valossa voidaan halutun antigeenin valmistamiseksi valita luonnollisesti käytettäväksi edellä kuvattuja sovellutusmuotoja edullisempia sovellutusmuotoja, joihin kuuluu antigeeniä koodaavan DNA-segmentin ilmentäminen yhdistelmäisäntäsolussa. Edulli-·. 25 siä yhdistelmäisäntäsoluja kuvattujen antigeenien ilmentä miseksi ovat tyypillisesti bakteeri-isäntäsolut siinä mielessä, että antigeeni on bakteerin antigeeni. Edullisiin bakteeri-isäntäsoluihin kuuluvat E. coli, H. influenzae, Salmonella-lajit, Mycobacterium-lajit tai jopa Bacillus 30 subtilis -solut. Haluttaessa voidaan haluttua antigeeniä tai haluttuja antigeenejä luonnollisesti myös ilmentää eu-karyoottisoluissa.

Kuten edellä mainittiin, tämä keksintö koskee tietyissä sovellutusmuodoissaan haluttua proteiini- tai pepti-35 diantigeenia koodaavia DNA-segmenttejä. Tässä keksinnössä on kuvattu menetelmiä, joilla tällaisia segmenttejä saadaan , · 106844 9 käyttöön puhtaina niiden luonnolliseen esiintymisympäris-töön verrattuna. Näillä DNA-segmenteillä on useita etuja ja käyttömuotoja. Kokonaista OMP-geeniä koodaavat segmentit voidaan esimerkiksi viedä yhdistelmäisäntäsoluihin ja näitä 5 voidaan käyttää koko proteiiniantigeenin ilmentämiseen. Vaihtoehtoisesti voidaan yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltamalla valitun OMP-geenin pienempiä osia tai johdannaisia käyttää sellaisten lyhyehköjen peptidijaksojen valmistamiseen, joihin kuitenkin vielä sisältyy haluttuja antigeenie-10 pitooppeja. Lisäksi tämän keksinnön mukaisia DNA-jaksoja voidaan kohdemutageneesimenetelmillä muokata uuteen muotoon koodaavan jakson muuttamiseksi, esimerkiksi epitooppien ydinjaksojen antigeenisyyttä parantavien muutosten tekemiseksi ja sitä kautta antigeenisiltä ominaisuuksiltaan vas-15 taavien toimintakykyisten peptidien aikaansaamiseksi. Haluttaessa voidaan myös luonnollisesti valmistaa fuusiopep-tidejä esimerkiksi sijoitettaessa samassa ilmentämisyksi-kössä antigeeniä koodaavia alueita jonkin toisen halutun antigeenin tai sellaisten proteiinien tai peptidien yhtey-20 teen, jotka sisältävät haluttuja toimintoja, kuten immunologisiin havaitsemistarkoituksiin tulevia toimintoja (esimerkiksi entsyymileimaa koodaavat alueet).

Käytetyn isäntäjärjestelmän mukaan voidaan tiettyjä nimenomaisia etuja saada silloin, kun tämän keksinnön mu-25 kaiset DNA-segmentit on liitetty asianomaisiin vektorijaksoihin, jotka voivat esimerkiksi parantaa isäntäsolujen transfektiotehokkuutta. Bakteeri-isäntäsoluja käytettäessä on ehdotettu voitavan käyttää käytännöllisesti katsoen mitä tahansa tällä alalla tunnettua vektoria, joka soveltuu va-30 litulle isäntäsolulle. E. colin ollessa kyseessä voidaan siten saada tiettyjä etuja käyttämällä plasmidivektoreita, kuten pBR322:ta, tai bakteriofageja, kuten λGEM-ll:tä. Muita erityisiä esimerkkejä on kuvattu tuonnempana.

Sellaisia yhdistelmäkloonipankkeja valmistettaessa, 35 joista valikoidaan asiaankuuluvalla tavalla transfektoitu-neita soluja, on asianlaita tavallisesti niin, että välit- • * 10 106844 tuja OMP-geenijaksoja voidaan ilmentää näissä isäntäsoluis-sa käyttämättä vektoreita, joilla on näille itselleen ominaisia promoottorijaksoja. Tämä johtuu siitä, että klooni-pankin valmistamiseen käytettyihin M. catarrhaliksen geno-5 min DNA-fragmentteihin sisältyy useisiin erilaisiin koodaa-viin jaksoihin liittyviä endogeenisia promoottoreja. Tämän keksinnön tekijät kuitenkin ehdottavat, että viime kädessä voi olla haluttua muokata tässä kuvattua antigeeniä koodaa-vien fragmenttien promoottorialue uudelleen heterologisen 10 promoottorin liittämiseksi. Tämä voi mahdollistaa OMP-antigeenin yli-ilmentymisen verrattuna sen luonnolliseen ilmentymiseen M. catarrhalis -soluissa.

Tämän keksinnön mukaisilla nukleiinihapposegmen-teillä katsotaan olevan useita muita käyttömuotoja kuin ne, 15 jotka liittyvät antigeenisten peptidien tai proteiinien ilmentämiseen. Esimerkiksi nukleiinihapposegmenttejä, joiden pituus on ainakin noin 14 nukleotidia ja joihin sisältyy OMP-geenijakson alueita, voidaan käyttää selektiivisinä hy-bridisaatiokoettimina valikoiduissa näytteissä olevien M. 20 catarrhaliksen jaksojen havaitsemiseksi tai esimerkiksi kloonipankkien seulomiseen sellaisten kloonien tunnistamiseksi, jotka käsittävät vastaavia tai näitä muistuttavia jaksoja. Lyhyitä segmenttejä voidaan lisäksi käyttää nukle-iinihappoalukkeina, kuten PCR-menetelmän yhteydessä käytet-25 tävinä alukkeina, missä tahansa lukuisista sovellutuksista, joihin kuuluvat esimerkiksi kloonaus- ja muokkaustoimenpi-teet tai PCR:ään perustuvat havaitsemismenetelmät.

Tämä keksintö koskee vielä muissa sovellutusmuo-doissaan sellaisten vasta-aineiden valmistusta, jotka kyke-30 nevät muodostamaan immunologisia komplekseja OMP-antigeenin '*· epitooppien kanssa. Tiettyjä nimenomaisia menetelmiä tässä kuvattujen vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu tuonnempana. Tässä keksinnössä esitetään kuitenkin käytettäväksi yleensä mitä tahansa tällä alalla tunnettua vasta-35 aineiden valmistusmenetelmää, joka voi perustua joko mo-noklonaaliseen tekniikkaan tai polyklonaaliseen tekniik- 106844 11 kaan. Tässä kuvattujen OMP-antigeenien epitooppeja voidaan käyttää rokotekoostumusten valmistamisessa. Edellä esitetyn perusteella tämä keksintö kohdistuu sekä menetelmään tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen antigeenin sisältävien 5 rokotekoostumusten valmistamiseksi että menetelmään tällaista antigeeniä vastaan suunnattujen vasta-aineiden valmistamiseksi, joiden yhteydessä käytetään farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta, laimenninta tai adjuvanttia.

Tässä kuvataan vielä immunologisia havaitsemismene-10 telmiä. Tässä keksinnössä ehdotetaan, että sen mukaisesti valmistettuja antigeenejä voitaisin käyttää näiden antigeenien kanssa reagoivien vasta-aineiden havaitsemiseksi tai vaihtoehtoisesti sitä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita voitaisiin käyttää antigeenien ha-15 vaitsemiseen. Näihin menetelmiin kuuluvat tavallisesti vaiheet, joissa hankitaan ensin käyttöön näyte, jonka epäillään sisältävän tällaista vasta-ainetta tai antigeeniä, minkä j älkeen näyte saatetaan kosketukseen tämän keksinnön mukaisesti valmistetun vasta-aineen tai antigeenin kanssa 20 kulloinkin kyseessä olevan tapauksen mukaisesti olosuhteissa, joissa vasta-aineen on mahdollista muodostaa immuno-kompleksi havaittavana olevan vasta-aineen tai antigeenin kanssa, ja havaitaan antigeenin esiintyminen näytteessä im-munokompleksin muodostumisesta tehtävän havainnon avulla.

25 Immunokompleksin muodostumista koskevien havainto jen teko on yleensä melko hyvin tunnettua tällä alalla ja tähän tarkoitukseen on käytössä useita erilaisia mahdollisia ratkaisutapoja. Tässä keksinnössä ajatellaan esimerkiksi käytettäväksi ELISA-, RIA-, immunoblotti- ja täpläblot-30 timenetelmiä ja epäsuoria immunofluoresenssimenetelmiä ja muita näitä vastaavia menetelmiä. Immunokompleksin muodostuminen havaitaan tavallisesti käyttämällä leimaa, kuten radioaktiivista leimaa tai entsyymileimaa (kuten alkalista fosfataasia, piparjuuriperoksidaasia tai muuta vastaavaa 35 leimaa). Muita etuja voidaan luonnollisesti saada käyttämällä sekundääristä sitoutuvaa ligandia, kuten toista vas- • 12 106844 ta-ainetta tai biotiinista ja avidiinista muodostuvaa li-gandia sitovaa järjestelmää, tällä alalla tunnetulla tavalla .

Tässä keksinnössä ehdotetaan diagnostisiin tarkoi-5 tuksiin käytettäväksi käytännöllisesti katsoen mitä tahansa mahdollista näytettä, jonka epäillään sisältävän havaittavana olevaa antigeeniä tai vasta-ainetta. Esimerkkeihin näistä näytteistä kuuluvat kliiniset potilasnäytteet, kuten veri- tai seeruminäytteet, vanutikulla korvasta otetut 10 näytteet, sylkinäytteet tai välikorvaneste, tai voidaan ehkä käyttää jopa virtsanäytteitä. Lisäksi näitä sovellutus-muotoja ajatellaan voitavan soveltaa ei-kliinisiin näytteisiin, kuten antigeeni- tai vasta-ainenäytteiden titraukseen tai hybridoomien selektioon ja muihin näitä muistuttaviin 15 sovellutuksiin.

Piirrosten pääpiirteittäinen kuvaus

Kuvio l: M. catarrhaliksen proteiinien Western- blottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty 80 kD:n OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 10F3-vasta-ainetta. Kana-20 va A on Rainbow-proteiinimoolimassamarkkeri (14,3 -200 kD:n suuruiset moolimassat, Amersham); kanava B on negatiivinen kontrolli, joka käsittää 4Bl/pBR322/RRl:n koko-solulysaatin (4B1 on M. catarrhaliksen geeni, joka koodaa tutkittavista proteiineista täysin poikkeavaa monoklonaali-25 sen 4B1-vasta-aineen tunnistamaa proteiinia),- kanavat C ja D ovat 10F3/pBR322/RRl:n kokosolulysaatteja; ja kanava E on nollakoekontrolli.

Kuvio 2: pMEH120:n alustava restriktiokartta, joka käsittää Mab 10F3:n kanssa reagoivaa 80 kD -antigeeniä koo-30 daavan segmentin.

Kuvio 3: MEH200-faagin alustava restriktiokartta, joka käsittää Mab 17C7:n kanssa reagoivaa HMWP-antigeenia koodaavan segmentin.

Kuvio 4: M. catarrhaliksen proteiinien Western- 35 blottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty 30 kD:n OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 8B6-vasta-ainetta. Kanava • 13 106844 A on Rainbow-proteiinimooliraassamarkkeri (14,3 - 200 kD:n suuruiset moolimassat, Amersham); kanava B on edeltä käsin värjätty pienimoolimassainen SDS-PAGE-standardi (16 - 110 kD:n suuruiset moolimassat, Bio-Rad); kanava C sisältää 5 30 kD:n OMP:tä ilmentävän yhdistelmä-E. colin (LE392/8B6) faagilysaatista peräisin olevia proteiineja; kanava D on nollakoekontrolli; kanava E on negatiivinen kontrolli (HMWP-OMP:tä ilmentävästä yhdistelmä-E. colista, LE392/17C7:stä, peräisin oleva faagilysaatti); ja kanava F 10 on positiivinen kontrolli (M. catarrhalis 035E:n ulkomem-braanivesikkeleitä).

Kuvio 5: M. catarrhaliksen proteiinien Western- blottausanalyysi, jossa koettimena oli käytetty HMWP-OMP:n tunnistavaa monoklonaalista 17C7-vasta-ainetta. Kanava A on 15 Rainbow-proteiinimoolimassamarkkeri (14,3 - 200 kD:n suu ruiset moolimassat, Amersham); kanava B on edeltäkäsin värjätty pienimoolimassainen SDS-PAGE-standardi (16 - 110 kD:n suuruiset moolimassat, Bio-Rad); kanavat C, D ja E sisältävät HMWP-OMP:tä ilmentävän yhdistelmä-E. colin (LE392/17C7) 20 faagilysaatista peräisin olevia proteiineja; kanava F on nollakoekontrolli·; kanava H on negatiivinen kontrolli (30 kD:n OMPrtä ilmentävän yhdistelmä-E. colin faagilysaatti, E. coli/8B6 -faagilysaatti) ; ja kanava G on positiivinen kontrolli (M. catarrhalis 035E:n ulkomembraanivesikke-• 25 leitä).

Edullisten sovellutusmuotojen yksityiskohtainen selitys Tämä keksintö liittyy siihen, että sen tekijät ovat tunnistaneet Moraxella catarrhaliksen tiettyjä nimenomaisia 30 ulkomembraaniproteiineja (OMP:t), joilla on havaittu olevan erityisen käyttökelpoisia ominaisuuksia esimerkiksi diagnostisten reagenssien valmistuksessa. Nämä proteiinit vaikuttavat luonnollisessa tilassaan olevan esillä solun pinnalla ja niiden moolimassat ovat noin 30 kD, 80 kD ja noin 35 200 - 700 kD:n alueella, vastaavassa järjestyksessä mainit tuna, SDS-PAGE:lla määritettynä. Tietyt nimenomaiset sovel- 14 106844 lutusmuodot liittyvät näiden proteiinien, antigeenisten osafragmenttien, varianttien ja muiden näitä vastaavia molekyylejä koodaavien jaksojen kloonaamiseen yhdistelmä-DNA-tekniikalla. Tämä keksintö liittyy myös menetelmään näitä 5 M. catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan suunnattujen mo-noklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseen. Tämän patent-tiselityksen suojapiiriin kuuluvat yhdistelmä-DNA-kloonit, jotka ilmentävät yhtä tai useampaa valittua OMP-molekyyliä ja joita voidaan käyttää puhdistettujen OMP-antigeenien se-10 kä mutatoituneiden tai varianttiproteiinityyppien valmistamiseen merkittävinä määrinä. Valitun OMP-antigeenin ja sen varianttien otaksutaan olevan merkittävässä määrin käyttökelpoisia M. catarrhalis -infektioiden diagnoosissa. Näitä OMP-antigeenejä tai peptidivariantteja ehdotetaan käytettä-15 väksi esimerkiksi mahdollisissa M. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetuissa immunomäärityksissä.

Alan ammattimiesten avustamiseksi tämän keksinnön kohteiden pitkälle menevien yksityiskohtien käytössä talletettiin sellaiset yhdistelmä-DNA-kloonit, joissa kussakin 20 oli 30 kD:n, 80 kD:n ja HMWP-OMP-antigeenejä koodaavat DNA-segmentit, talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC) 4.8.1992 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti. Yksityiskohtaisesti ilmoitettuna plasmidi pMEH300 (ATCC:n hakunumero 69 049), jossa on 30 kD:n OMP-antigeeniä 25 koodaava segmentti; plasmidi pMEH120 (ATCC:n hakunumero 75 285) , jossa on 80 kD.-n OMP-antigeeniä koodaava segmentti; ja faagi MEH 200 (ATCC:n hakunumero 75 286), jossa on HMWP-antigeeniä koodaava segmentti, talletettiin joko faa-gilysaatin muodossa (MEH 200), puhdistetun plasmidi-DNA:n 30 muodossa (pMEH120) tai yhdistelmä-E. coli -kannan RR1 « (pMEH300) muodossa.

pMEH300-plasmidi voidaan luonnehtia modifioiduksi pLG338-vektoriksi, jossa pLG338 oli pilkottu XhoI:llä ja johon oli lisätty Sacl-kytkijäjaksot. Tämä uusi vektori si-35 sältää Moraxella catarrhaliksen kromosomaalisesta DNAtsta koostuvan liitosjakson, joka on noin 20 ke:n suuruinen ja 15 106844 joka voidaan irrottaa pilkkomalla Sacl:llä. Tämä liitosjakso sisältää monoklonaalisen vasta-aineen 8B6 kanssa reagoivaa 30 kD:n antigeeniä koodaavan M. catarrhaliksen geenin. Koko vektori on siten noin 27 ke:n suuruinen ja vektori kä-5 sittää vain noin 7,3 ke.

80 kD:n OMPrtä koodaava geeni kloonattiin alunperin pBR322:een perustuvassa yhdistelmä-DNA-plasmidissa, jolle oli annettu nimitys pMEHlOO. Tämä geeni jatkokloonattiin myöhemmin pBluescriptissä sen jakson analysoimiseksi. 10 ATCC:hen talletettu plasmidi oli juuri tämä uusi plasmidi, jolle oli annettu nimitys pMEH120. Yhdistelmä-DNA-plasmidi pMEH120 on pBluescript II SK+ -vektori, joka sisältää M. catarrhaliksen kromosomaalisesta DNA:sta muodostuvan lii-tosjakson, jonka suuruus on noin 4,5 ke ja joka koodaa noin 15 80 kD:n suuruista proteiinia, joka kykenee reagoimaan mo noklonaalisen 10F3-vasta-aineen kanssa. pMEH120:n alustava restriktiokartta on esitetty kuviossa 2.

Mab 17C7:n kanssa reagoivaa HMWP-OMP-antigeeniä koodaavaa geeniä ei jatkokloonattu XGEM-ll-faagista MEH200, 20 jota käytettiin tuonnempana esitetyissä esimerkeissä kuvattuun kloonaustyöhön. λΘΕΜ-11-faagivektori sisältää M. catarrhaliksen kromosomaalisesta DNA:sta muodostuvan liitos-jakson, jonka on kooltaan noin 11 ke ja joka voidaan irrottaa faagin DNArsta pilkkomalla joko Sfil:llä tai Sacl:llä. 25 Alustava restriktiokartta on esitetty kuviossa 3.

Tässä keksinnössä esitetyn yksityiskohtaisen pa-tenttiselityksen valossa on tämän alan ammattimiehille selvää, että edellä olevien ATCC:hen talletettujen tai joidenkin muiden erityisten sovellutusmuotojen tarkoituksena ei 30 ole millään tavoin rajoittaa tätä keksintöä.

Tarkasteltavaksi valittua OMP-antigeeniä tai niiden variantteja koodaavat nukleiinihappojaksot voivat olla käyttökelpoisia M. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetussa hybridisaatio- tai polymeraasiketjureaktio (PCR) 35 -menetelmässä. Edellä olevien näkökohtien perusteella tämän keksinnön selitykseen sisältyy informaatiota, jota voidaan 1R 106844 16 keksinnön selitykseen sisältyy informaatiota, jota voidaan käyttää useiden sellaisten erilaisten DNA-fragmenttien valmistamiseen, joilla on lukuisia mahdollisia käyttömuotoja, kuten antigeenin suhteellisten lyhyiden immunogeenisten tai 5 antigeenisten peptidyyliosafragmenttien valmistus, DNA- tai RNA-jaksojen käyttö koettimina PCR- tai hybridisaatiotutki-muksissa bakteerin havaitsemiseksi in vitro -olosuhteissa, sekä M. catarrhalis -infektioiden tutkimukseen ja diagnoosiin liittyvät muut käyttökelpoiset lääketieteelliset ja 10 biolääketieteelliset sovellutukset.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetuista OMP-anti-geeneistä käytetään nimityksiä 30 kD:n OMP, 80 kD:n OMP ja HMWP-OMP. Nämä proteiinit tunnistetaan tässä keksinnössä monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka on valikoitu M. ca-15 tarrhaliksen ulkomembraanivesikkeleitä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kokoelmasta. Näitä vasta-aineita käytettiin Western-blottauskoettimina vastaavien antigeenien tunnistamiseksi M. catarrhalis 035E:n ulkomem-braanivesikkelipreparaattien SDS-PAGE-analyyseissä. 30 kD:n 20 OMP:n tunnistavalle monoklonaaliselle vasta-aineelle on annettu nimitys 8B6, 80 kD:n OMP:n tunnistavalle vasta- aineelle on annettu nimitys 10F3 ja HMWP kD-antigeeniä tunnistavasta vasta-aineesta on käytetty nimitystä 17C7 (nämä on esitetty kuvioissa 1, 4 ja 5).

* 25 Yhdistelmä-DNA-vektorien ja -kloonien talletusta vastaavasti talletettiin 30.7.1992 ATCC:hen Budapestin sopimuksen ehtoja noudattaen myös hybridoomat, jotka erittävät edullisia OMP-antigeenejä tunnistavia edellä mainittuja monoklonaalisia vasta-aineita. Talletetut hybridoomat erit-30 tävät 30 kD:n OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista ** vasta-ainetta 8B6 (ATCC:n hakunumero HB11 091); 80 kD:n OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta 10F3 (ATCC:n hakunumero HB11 092); ja HMWP-OMP-antigeenin tunnistavaa monoklonaalista vasta-ainetta 17C7 (ATCC:n ha-35 kunumero HB11 093).

• · 17 106844 Tässä keksinnössä nähdään mahdolliseksi saada käyttöön useita erilaisia tapoja sekä tuottaa että eristää tässä kuvattuja OMP-antigeeniproteiineja, joiden tapojen lähtökohtana on puhdistetun tai osittain puhdistetun proteii-5 nin eristäminen luonnollisista lähtömateriaaleista (esimerkiksi M. catarrhalis -bakteeerisoluista) tai yhdistelmä-DNA-lähtömateriaalin (esimerkiksi E. coli- tai mikrobisolu-jen) käyttö. Viimeksi mainitussa tapauksessa voidaan tässä kuvattuja OMP-antigeenejä tai näistä peräisin olevia anti-10 geenisiä peptidejä saada käyttöön olennaisesti antigeeneiltään puhtaina, koska niistä puuttuvat aina kunkin kysymyksessä olevan epitoopin ulkopuolelle jäävät M. catarrhalik-sen epitoopit.

Tässä keksinnössä esitetään, että OMP-antigeeni 15 voitaisiin tämän keksinnön mukaan eristää luonnollisista tai yhdistelmä-DNA-lähtömateriaaleista eristämällä joko so-luvaippapreparaatti tai solun ulkomembraanit ja puhdistamalla antigeeni sitten detergenttiin perustuvaa puhdistus-kaaviota käyttäen. Yhdistelmäsolujen ollessa kyseessä voi 20 haluttu antigeeni esiintyä inkluusiokappaleissa.

Koska tässä keksinnössä on kuvattu menetelmä 30 kD:n, 80 kD:n ja HMWP-OMP-antigeenejä vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi, odotetaan immunoabsorbenttimenetelmien olevan kelvollisia OMP-25 antigeenin tai sen immunologisesti ristireagoivien varianttien puhdistamisessa. Tähän tarkoitukseen käyttökelpoiset vasta-aineet ehdotetaan valmistettaviksi yleensä tuonnempana kuvattavilla menetelmillä tai monoklonaalisten vasta-aineiden valmistuksen alalla yleisesti tunnetuilla menetel-30 millä (tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa nro 4 514 498 ja 4 740 467) ja näistä poimitaan esiin halutun OMP-proteiinin tai haluttujen OMP-peptidien kanssa reagoivat vasta-aineet. Edellä olevan yleisen eristystavan arvellaan lisäksi toimivan yhtä hyvin 35 silloin, kun on tarkoitus eristää OMP-variantteja tai proteiinin antigeenisiä tai immunogeenisiä osafragmentteja, • ♦« 18 106844 mihin tarvitaan pelkästään sitä, että valmistetaan ja käytetään sellaisia vasta-aineita, joilla on affiniteettia haluttua peptidyylialuetta kohtaan.

DNA-mutageneesin tyyppisiä menetelmiä käyttämällä 5 on tämän keksinnön avulla lisäksi mahdollista valmistaa vaikeuksitta niin sanottuja "toisen sukupolven" molekyylejä, joiden proteiinirakenteet ovat modifioituja tai yksinkertaistettuja. Toisen sukupolven proteiineilla on täysimittaiseen antigeeniin verrattuna tyypillisesti yksi tai 10 useampi yhteinen ominaisuus, kuten tietty nimenomainen antigeeninen tai epitooppiydinjakso. Suhteellisen lyhyisiin molekyyleihin perustuvia epitooppijaksoja voidaan saada käyttöön peptidiä tai sen perustana olevaa DNA-jaksoa koskevan tiedon perusteella. Tällaiset molekyylivariantit ei-15 vät saata ainoastaan olla peräisin proteiinirakenteen valituista immunogeenisistä tai antigeenisistä alueista vaan niihin voi lisäksi tai vaihtoehtoisesti sisältyä yksi tai useampi toiminnallisesti vastaava aminohappo, joka on valittu luonnollisen jakson suhteen esiintyvien samankaltai-20 suuksien tai jopa eroavuuksien perusteella.

OMP-antigeenien epitooppien ydinjaksot

Kuten edellä mainittiin, tässä keksinnössä on tehty se ehdotus, että epitooppisia tai immunogeenisiä ydinjakso-ja sisältävien synteettisten peptidien valmistamisesta voi-25 täisiin saada tiettyjä nimenomaisia etuja. Näiden epitooppiydinjakso j en on tunnistettu olevan tässä keksinnössä sen tietyissä nimenomaisissa kohteissa OMP-antigeenin hydrofii-lisiä alueita. Tässä keksinnössä on tehty se ehdotus, että nämä alueet edustavat sellaisia alueita, jotka todennäköi-30 simmin edistäisivät T-solujen tai B-solujen stimuloitumista : ja saisivat siten aikaan spesifisten vasta-aineiden muodos tumisen. Epitooppiydinjakso on tässä keksinnössä suhteellisen lyhyt aminohappojen muodostama jakso, joka on "komple-mentäärinen" OMP:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden si-35 toutumiskohtien suhteen ja se sitoutuu tämän vuoksi näihin. Epitooppiydinjakso on tämän lisäksi tai vaihtoehtoisesti 19 106844 sellainen jakso, joka saa aikaan sellaisten vasta-aineiden muodostumisen, jotka ristireagoivat OMP:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa. On selvää, että tässä patent-tiselityksessä termi "komplementäärinen" tarkoittaa amino-5 happoja tai peptidejä, joilla on kyky vetää toisiaan puoleensa. Tässä kuvatut tietyt epitooppiydinjaksot voidaan siten määritellä toiminnallisesti sillä perusteella, että ne kykenevät kilpailemaan halutun OMP-antigeenin kanssa sitoutumisesta vastaavaa OMP:tä vastaan suunnattuihin anti-10 seerumeihin tai ehkä syrjäyttämään tämän antigeenin.

Polypeptidiantigeenin koon ei tavallisesti uskota olevan erityisen ratkaiseva, mikäli polypeptidin koko on ainakin sitä luokkaa, että tunnistettu ydinjakso tai ydin-jaksot mahtuvat siihen. Tämän patenttiselityksen edellyttä-15 män pienimmän käyttökelpoisen ydinjakson pituus tulisi olemaan noin 15 aminohapon luokkaa. Se vastaa siten suuruudeltaan tavallisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja pienimpiä peptidiantigeenejä. Antigeeni voi kuitenkin haluttaessa olla kooltaan suurempi kunhan se vain sisältää 20 keskeisen epitooppiydinjakson.

Edellä olevien näkökohtien mukaan tämän keksinnön tekijän aikomuksena on peptidijaksojen analyysiin tarkoitettua tietokoneohjelmaa {DNAStar Software, DNAStar, Inc. Madison, Wise.) käyttäen tunnistaa 30 kD:n, 80 kD:n tai . 25 HMWP-OMP-antigeenin tietyt nimenomaiset hydrofiiliset pep- tidyylialueet, joiden arvellaan muodostavan proteiinin tiettyihin nimenomaisiin epitooppeihin sisältyviä epitooppiydin j aksoj a.

Epitooppijaksoja tai sellaisia peptidejä, joiden 30 jaksoon sisältyy antigeeninen epitooppi, syntetisoidaan ·* vaikeuksitta tavanomaisilla synteesimenetelmillä, kuten kiinteän faasin menetelmällä (esimerkiksi käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa peptidisynteesilaitetta, kuten Applied Biosystems -yhtiön mallin 430A -peptidisynteesi-35 laitetta). Tällä tavoin syntetisoidut peptidit voidaan jakaa ennakolta määrätyn suuruisiin eriin ja varastoida ennen • i .

20 106844 niiden käyttöä tavanomaisin keinoin, kuten vesiliuoksina tai vieläkin edullisemmin jauheena tai lyofilisoituina.

Peptidejä voidaan niiden suhteellisen hyvän pysyvyyden johdosta säilyttää kätevästi vesiliuoksina melko 5 pitkiä aikoja, esimerkiksi jopa kuusi kuukautta tai tätäkin pidempään käytännöllisesti katsoen missä tahansa vesiliuoksessa niiden merkittävästi hajoamatta tai niiden antigeenisen aktiivisuuden häviämättä. Mikäli peptidejä aiotaan säilyttää vesiliuoksissa pitkään, on liuoksissa tavallisesti 10 haluttua käyttää puskureita, kuten Tris- tai fosfaattipus-kureita pH:n säilyttämiseksi alueella 7,0 - 7,5. Voi lisäksi olla haluttua lisätä liuoksiin mikrobien kasvua estäviä aineitta, kuten natriumatsidia tai mertiolaattia. Vesipitoisessa . olomuodossa tapahtuvaa pitkäaikaista varastointia 15 varten on haluttua varastoida liuokset 4 °C:ssa tai edullisemmin pakastettuna. Mikäli peptidi(t) varastoidaan lyofi-lisoitu(i)na tai jauhemaisena(ina), niitä voidaan luonnollisesti varastoida rajoittamattoman pitkään esimerkiksi määrätyn suuruisina erinä, jotka voidaan ennen käyttöä hyd-20 ratoida uudelleen ennakolta määrätyllä määrällä vettä (edullisesti tislattua vettä) tai puskuria.

Antigeenisiltä toiminnallisilta ominaisuuksiltaan toisiaan vastaavat aminohapot

Kuten edellä mainittiin, halutun OMP-antigeenin tai 25 sen antigeenisten tai immunogeenisten rakenneosien rakennetta otaksutaan voitavan muuttaa monien eri modifikaatioiden tai muutosten avulla, ja tuloksena olisi silti ominaisuuksiltaan vastaavanlainen tai muulla tavoin haluttu molekyyli .

30 On esimerkiksi tunnettua, että tiettyjen proteiinin rakenteeseen kuuluvien aminohappojen tilalla voidaan käyttää muita aminohappoja proteiinin antigeenisen tai immuno-geenisen aktiivisuuden muokkaamiseksi tai parantamiseksi (tätä on käsitelty esimerkiksi julkaisuissa Kyte, et ai., 35 tai Hopp, US-patenttijulkaisu nro 4 554 101. Antigeeniseen peptidiin voidaan esimerkiksi tehdä pieniä konformaatioon . · · r 21 106844 vaikuttavia muutoksia käyttämällä alkuperäisten aminohappojen tilalla vaihtoehtoisia aminohappoja, mikä johtaa antigeenin ja vasta-aineen sitovien alueiden affiniteetin suurenemiseen. Toisena vaihtoehtona on se, että tiettyihin 5 OMP:n antigeenisiin peptideihin tehtyjä aminohapposubsti-tuutioita voidaan käyttää sellaisten ryhmien aikaansaamiseksi, jotka voidaan sitten liittää muihin molekyyleihin sellaisten peptidin ja tämän molekyylin konjugaattien aikaansaamiseksi, joissa alkuperäisen peptidin antigeenisyys 10 on säilynyt riittävässä määrin ollakseen kelvollinen muihin tarkoituksiin käytettäväksi. Voitaisiin esimerkiksi konstruoida jokin kiinteään kantaja-aineeseen sidottu OMP-peptidi, josta olisi tiettyjä etuja diagnostisissa sovellu-tusmuodoissa.

15 Kysymystä, joka koskee aminohappojen hydropaatti- suuskertoimen tärkeyttä proteiinin vuorovaikutteisten biologisten toimintojen syntymiselle on tarkasteltu yleisesti julkaisussa Kyte, et ai., (1982), jossa on päädytty siihen, että tietyt aminohapot voidaan korvata muilla sellaisilla 20 aminohapoilla, joiden hydropaattisuuskerroin tai arvo on samansuuruinen, biologisen aktiivisuuden säilyessä kuitenkin samanlaisena. Aminohapoille on annettu hydropaattisuuskerroin niiden hydrofobisuus- ja varausominaisuuksien perusteella, kuten tuonnempana esitettävästä taulukosta käy 25 ilmi. Aminohapon suhteellisen hydropaattisen luonteen arvellaan määräävän tuloksena olevan proteiinin sekundäärira-kenteen, jonka perusteella puolestaan proteiinin ja sen substraattimolekyylien välinen vuorovaikutus määräytyy. Si-toutumiskykyyn vaikuttavien ominaisuuksien kannalta edulli-30 sinä substituutioihin käytettävinä aminohappoina tarkastel-; laan tavallisesti aminohappoja, joiden kertoimien arvot poikkeavat toisistaan ±2 yksikköä, edullisemmin ±1 yksikköä ja tätäkin vielä edullisemmin ±0,5 yksikköä.

35 22 106844

Taulukko I

Hydropaat t i suus-Aminohappo kerroin

Isoleusiini 4,5 5 Väliini 4,2

Leusiini 3,8

Fenyylialaniini 2,8

Kysteiini/kystiini 2,5 Metioniini 1,9 10 Alaniini 1,8

Glysiini -0,4

Treoniini -0,7

Tryptofaani -0,9

Seriini -0,8 15 Tyrosiini -1,3

Proliini -1,6

Histidiini -3,2

Glutamiinihappo -3,5

Glutamiini -3,5 20 Asparagiinihappo -3,5

Asparagi ini -3,5

Lysiini -3,9

Arginiini -4,5 25 Siten esimerkiksi isoleusiini, jonka hydropaatti- suuskerroin on +4,5, vaihdetaan edullisesti sellaiseen aminohappoon kuin väliini (+4,2) tai leusiini (+3,8). Vaihtoehtoisesti asteikon toisessa päässä olevan lysiinin (-3,9) tilalla käytetään edullisesti arginiinia (-4,5) jne.

30 Toisiaan muistuttavat aminohapot voidaan korvata 1 · toisillaan hydrofiilisyyden perusteella varsinkin silloin, kun tällä tavoin muodostettua biologisesti toiminnallisesti vastaavaa proteiinia tai peptidiä aiotaan käyttää immunologisissa sovellutusmuodoissa. US-patenttijulkaisussa nro 35 4 554 101, on mainittu, että proteiinin suurin paikallinen hydrofiilisyys, jonka määräytyy siihen kuuluvien peräkkäis- • · 23 106844 ten aminohappojen perusteella, korreloi tämän immunogeeni-syyteen ja antigeenisyyteen, toisin sanoen proteiinin biologiseen ominaisuuteen.

Kuten US-patenttijulkaisussa nro 4 554 101 on yksi-5 tyiskohtaisesti esitetty, on aminohapporyhmille annettu seuraavat hydrofiilisyysarvot: arginiini (+3,0); lysiini (+3,0); aspartaatti (+3,0 ±1); glutamaatti (+3,0 ±1); se-riini (+0,3); asparagiini (+0,2); glutamiini (+0,2); gly-siini (0); (0 ±1); treoniini (-0,4); alaniini (-0,5); his-10 tidiini (-0,5); kysteiini (-1,0); metioniini (-1,3); väliini (-1,5); leusiini (-1,8); isoleusiini (-1,8); tyrosiini (-2,3); fenyylialaniini (-2,5); tryptofaani (-3,4). On selvää, että aminohappo voidaan korvata toisella aminohapolla, jonka hydrofiilisyysarvo on samanlainen ja saada silti syn-15 tymään biologisesti vastaava proteiini ja varsinkin immuno-logisesti vastaava proteiini. Näissä muutoksissa on edullista korvata toisilla aminohapoilla sellaiset aminohapot, joiden hydrofiilisyysarvot ovat +2 yksikön alueella ja näistä ovat erityisen edullisia ne, joiden arvot ovat 20 ±1 yksikön alueella ja vielä tätäkin edullisempia ovat +0,5 yksikön alueella olevat arvot.

Edellä sanotun perusteella nämä aminohapposubsti-tuutiot perustuvat tavallisesti R-ryhmäsubstituenttien suhteelliseen samankaltaisuuteen esimerkiksi koon, elektrofii-25 lisen luonteen, varauksen ja muiden näitä vastaavien ominaisuuksien suhteen. Tavallisesti edullisiin substituutioihin, joissa monet edellä kuvatuista ominaisuuksista on huomioitu, kuuluvat seuraavat substituutiot: } ♦ « · • · .

24 106844

Taulukko II

Alku- Esimerkkinä peräinen olevat ryhmä substituutiot 5 Ala gly; ser

Arg lys

Asn gin; his

Asp glu

Cys ser 10 Gin asn

Glu asp

Gly ala

His asn; gin

Ile leu; vai 15 Leu ile; vai

Lys arg; gin; glu

Met leu; ala

Ser thr

Thr ser 20 Trp tyr

Tyr trp; phe

Vai ile; leu M. catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan suunnat-25 tujen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja Moraxella catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan voidaan valmistaa spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen tavanomaisia immunisaatiomenetelmiä. Valmistus voidaan aloittaa 30 immunisoimalla koe-eläin, kuten hiiri, koostumuksella, ku- i *. ten ulkomembraanivesikkelipreparaatilla, joka sisältää OMP:n antigeenisiä epitooppeja, josta eläimestä hankitaan myöhemmässä vaiheessa käyttöön perna- tai lymfasolupopulaa-tio. Perna- tai lymfasolut voidaan tämän jälkeen fuusioida 35 solulinjoihin, kuten humaani- tai hiirimyeloomakantoihin, vasta-aineita erittävien hybridoomien aikaansaamiseksi. Nä- j · · 25 106844 mä hybridoomat voidaan eristää yksittäisinä klooneina, joista voidaan sitten seuloa esiin haluttua OMPrtä vastaan suunnattua vasta-ainetta erittävät kloonit.

Tämän keksinnön tietyissä nimenomaisissa kohteissa 5 käytetään M. catarrhaliksesta peräisin olevia ulkomembraa-nifragmentteja aiheuttamaan immuunivaste koe-eläimissä. Immunisoinnin jälkeen pernasolut poistetaan ja fuusioidaan plasmasytoomasoluihin käyttäen fuusioinnin suorituksessa tavanomaista menettelytapaa (tätä on käsitelty esimerkiksi 10 julkaisussa The Cold Spring Harbor Manual for Hybridoma Development) sellaisten hybridoomien aikaansaamiseksi, jotka erittävät ulkomembraaniproteiineja vastaan suunnattuja mo-noklonaalisia vasta-aineita. Hybridoomat, jotka tuottavat valittua OMPrtä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-15 aineita, tunnistetaan tavanomaisia menetelmiä, kuten ELISA: a ja Western-blottausmenetelmiä, käyttäen.

Hybridoomaklooneja voidaan tämän jälkeen viljellä nestemäisissä kasvatusliuoksissa ja niistä voidaan puhdistaa viljelmäsupernatantit OMP-spesifisten monoklonaalisten 20 vasta-aineiden aikaansaamiseksi.

OMP-antigeenejä vastaan suunnattujen monoklonaalis-ten vasta-aineiden käyttö

Haluttua M. catarrhaliksen OMP-antigeeniä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tavaili-25 sesti käyttää esimerkiksi M. catarrhalis -infektioiden diagnoosissa.

Tämän keksinnön tekijöiden näkemyksen mukaan tulee tämän keksinnön mukaisesti valmistetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla olemaan käyttökelpoisia sovellutuksia tavan-30 omaisissa immunokemiallisissa menetelmissä, kuten ELISA:ssa « ·. ja Western-blottausmenetelmissä, sekä muissa menetelmissä, . · joissa voidaan käyttää hyväksi OMP-epitooppeja vastaan spesifistä vasta-ainetta.

Vielä yhden tämän keksinnön tekijöiden näkemyksen 35 mukaan voidaan tiettyä OMPrtä vastaan spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita käyttää muissa käyttökelpoisissa so- 26 106844 vellutuksissa. Niiden käyttö iramunoabsorbenttimenetelmissä voi esimerkiksi olla käyttökelpoinen tapa natiivien tai yh-distelmä-OMP-tyyppien tai niiden varianttien puhdistamisessa .

5 M. catarrhaliksen OMP-tyyppejä koodaavien geenien kloonaus yhdistelmä-DNA-tekniikalla

Keksintöön liittyvässä menetelmässä eristetään M. catarrhaliksen OMP-geenejä tai jakson variantteja, liitetään 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP-geeniä koodaavat DNA-10 segmentit sopivaan vektoriin, ja transformoidaan sopiva isäntä menetellen niin, että yhdistelmäproteiinit tai tämän variantit ilmentyvät transformanteissa. Alan ammattimiehil-le on selvää, että tämän patenttiselityksen valossa tämä keksintö soveltuu myös mistä tahansa sopivasta asianmukai-15 set koodaavat jaksot sisältävästä lähtömateriaalista, kuten mistä tahansa haluttua OMP:tä ilmentävästä M. catarrhaliksen alalajista tai isolaatiosta, peräisin olevien OMP-geenisekvenssien eristämiseen ja käyttöön. Tällaiset mate-riaalilähteet ovat helposti tunnistettavissa seulomalla 20 lähtömateriaaleja immunologisesti valittua OMP:tä vastaan suunnatuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla.

Tämän keksinnön edullinen käyttömuoto OMP:tä koo-daavan DNA:n eristämiseksi ja tämän käyttämiseksi sisältää tavallisesti vaiheet, jotka ovat (1) eristetään Moraxellan 25 genomin DNA; (2) pilkotaan genomin DNA osittain restriktio-entsyymeillä, kuten PstI-entsyymillä (valittu restriktio-entsyymi ei ole ratkaiseva) sellaisen DNA:n saamiseksi käyttöön, jonka pituus on keskimäärin esimerkiksi 6 -23 ke; (3) ligoidaan osittain pilkottu DNA valitussa vekto-30 rissa, kuten pBR322:ssa, olevaan valikoituun kohtaan . (tässäkin vaiheessa voidaan haluttaessa käyttää muita plas- midi- tai faagivektoreita) ; (4) transformoidaan tai trans- fektoidaan sopivat isäntäsolut, esimerkiksi E. coli -solut yhdistelmävektorilla, tai suoritetaan näille soluille 35 elektroporaatio tällä vektorilla; ja (5) valikoidaan haluttua OMP:tä ilmentävien pesäkkeiden erityisellä tavalla * · t 27 106844 suunniteltuja seulontamenetelmiä käyttäen. Kun OMP-geenin sisältävä klooni on tunnistettu, voi olla haluttua siirtää geeni muokkaustoimenpiteillä edulliseen isäntä/vektori/pro-moottorijärjestelmään, jotta ulkomembraaniproteiinia tai 5 sen jakson variantteja voitaisiin ryhtyä tuottamaan tehokkaasti.

Tämän keksinnön tekijät ovat edellä olevia yleisiä vaiheita käyttämällä onnistuneet tunnistamaan ja valikoimaan joukon klooneja, jotka sisältävät sillä tavoin järjes-10 tyneinä olevia M. catarrhaliksen OMP-geenejä, että kloonit kykenevät tuottamaan vastaavia ulkomembraaniproteiineja.

Näiden menetelmien edullisessa käyttömuodosssa eristettiin Moraxella catarrhalis -kannan 035E bakteereista peräisin oleva genomin DNA käsittelemällä soluja SDS:llä, 15 ribonukleaasilla ja proteinaasi K:11a, uuttamalla DNA fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksella ja saosta-malla se etanolilla. Määritettiin ne olosuhteet, joissa restriktioentsyymillä suoritettavassa pilkkomisessa rest-riktioentsyymiä, kuten Pstl:tä, käyttäen saavutetaan sel-20 lainen asianmukainen osittainen pilkkoutumistulos, että syntyvät fragmentit ovat 6 - 23 ke:n suuruusluokkaa. Kun osittain pilkotun Moraxella-DNA:n valittua kokoluokkaa olevien fragmenttien fraktiointi niiden koon perusteella oli suoritettu, ne ligoitiin sitten täydellisesti pilkottuun 25 vektoriin, kuten pBR322:een, joka oli pilkottu täydellisesti Pstlrlla yhteensopivien kohtien aikaansaamiseksi genomin DNA-fragmenttien kanssa suoritettavaa ligaatiota varten.

Sopiva isäntä, kuten E. coli RR1, transformoitiin ligaation jälkeen yhdistelmävektoreilla sellaisen yhdistel-30 mäkirjaston aikaansaamiseksi, johon kuuluvat kloonit ilmen-j tävät DNA-fragmentteihin sisältyvien jaksojen koodaamia M.

catarrhaliksen proteiinityyppejä. Yhdistelmämikrobikloonit kasvatetaan edullisesti ravintoagarin pinnalla silmin havaittaviksi pesäkkeiksi. Ne pesäkkeet, jotka ilmentävät 35 bakteerin pinnalla esiintyviä M. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiineja, tunnistetaan sitten M. catarrhaliksen * · 28 106844 OMP-tyyppejä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen pesäkeblottausradioimmunomäärityksessä, jotka ilmentävät E. coli -yhdistelmäklooneja, jotka ilmentävät anti-OMP-vasta-aineiden kanssa reaktiokykyisiä epi-5 tooppeja sisältäviä proteiineja, voidaan sitten viljellä halutuissa määrissä.

Isäntäsoluviljelmät ja vektorit Tässä keksinnössä käyttökelpoisten DNA-jaksojen al-kukloonaukseen ja tässä keksinnössä käyttökelpoisten vekto-10 rien konstruointiin on luonnollisesti edullista käyttää prokaryootteja. Esimerkiksi E. coli -kanta RR1 on erityisen käyttökelpoinen. Muihin käytettäviksi soveltuviin mikrobi-kantoihin kuuluvat sellaiset E. coli -kannat kuten E. coli LE392, E. coli B ja E. coli X 1776 (ATCC nro 31 537). Näi-15 den esimerkkien tarkoituksena on luonnollisesti kuvata eikä rajoittaa tätä keksintöä.

On myös edullista käyttää prokaryootteja geenien ilmentämiseen. Keksinnössä voidaan käyttää edellä mainittuja kantoja sekä E. coli W3110:aa (F-, lambda-, prototrofi-20 nen, ATCC nro 273 325), bacilluksia, kuten Bacillus subti-lista tai muita enterobacteriaceae-ryhmän jäseniä, kuten Salmonella typhimuriumia tai Serratia marcescensia ja useita erilaisia Pseudomonas-lajeja.

Näiden isäntien kanssa käytetään yleensä plasmidi-25 vektoreita, jotka sisältävät isäntäsolun kanssa yhteensopivasta lajista peräisin olevan replikonin ja tällaisesta lajista peräisin olevia kontrollijaksoja. Vektorissa on tavallisesti replikaatiokohta sekä markkerijaksot, joiden avulla on transformoituneissa soluissa mahdollista suorit-30 taa fenotyyppinen selektio. E. coli transformoidaan tyypil- , · ;·, lisesti esimerkiksi käyttäen pBR322:ta, joka on E. coli -lajista peräisin oleva plasmidi [Bolivar, et ai., (1977)]. pBR322 sisältää ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssi-geenit, mikä siten tarjoaa käyttöön kätevän keinon trans-35 formoitujen solujen tunnistamiseksi. pBR-plasmidin tai muun mikrobiplasmidin tai faagin täytyy myös sisältää, tai sen • * 29 106844 on oltava modifioitu sellaiseksi, että se sisältää, promoottoreja, joita mikrobiorganismi voi käyttää omien prote-iiniensa ilmentämiseen.

Faagivektoreita, jotka sisältävät replikonin ja 5 isäntämikro-organismin kanssa yhteensopivia kontrollijakso-ja, voidaan käyttää transformaatiovektorina näiden isäntien yhteydessä. Esimerkiksi lambda GEM™-ll-faagia voidaan käyttää sellaisen yhdistelmäfaagivektorin valmistamisessa, jolla isäntäsolut, kuten E. coli LE392, voidaan transformoida. 10 Yhdistelmä-DNA-konstruktioissa tavallisimmin käy tettyihin promoottoreihin kuuluvat B-laktamaasi-(penisilli-naasi-) ja laktoosipromoottorijärjestelmät [Chang, et ai., (1978); Itakura, et ai., (1977); Goeddel, et ai., (1979)] sekä tryptofaani- (trp-) promoottorijärjestelmä [Goeddel, 15 et ai., (1980); EPO-patenttihakemusjulkaisu nro 0 036 776]. Vaikkakin nämä ovat yleisimmin käytettyjä järjestelmiä, on löydetty muita mikrobipromoottoreja, joita on otettu käyttöön ja joista on julkaistu nukleotidijaksoja koskevia yksityiskohtia, joiden avulla alan ammattimies kykenee ligoi-20 maan ne toimivassa muodossa plasmidivektoreihin (EPO-patenttihakemusjulkaisu nro 0 036 776).

Prokaryoottien lisäksi voidaan myös käyttää eukary-oottisia mikrobeja, kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces ce-revisiae, eli leivontahiiva, on eukaryoottisistä mikro-25 organismeista yleisimmin käytetty, vaikka useita muitakin kantoja on yleisesti saatavilla. Saccharomyceksessä suoritettavaan ilmentämiseen käytetään esimerkiksi yleisesti plasmidia YRp7 [Stinchcomb, et ai., (1979); Kingsman, et ai., (1979); Tschemper, et ai., (1980)]. Tässä plasmidissa 30 on jo valmiina trpl-geeni, josta saadaan selektiomarkkeri, joka soveltuu käytettäväksi hiivan mutanttikannalle, esi- <. 1 merkiksi kannalle ATCC nro 44 076 eli PEP4-1 (Jones, 1977), jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänissä. Hiivaisäntäsolun genomille luonteenomaisena piirteenä oleva Trpl-vaurio muo-35 dostaa tehokkaan taustan transformaation havaitsemiseksi 30 106844 sen perusteella, että solujen kasvu ei tarvitse tryptofääniä. Sopiviin hiivavektoreissa käytettäviin promoottorijaksoihin kuuluvat 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottori [Hitzeman, et ai., (1980] tai muiden glykolyyttisten ent-5 syymien, kuten enolaasi, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydro-genaasi, heksokinaasi, pyruvaattidekarboksylaasi, fos-fofruktokinaasi, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi, 3-fosfo-glyseraattimutaasi, pyruvaattikinaasi, trioosifosfaatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja glukokinaasi, pro-10 moottorit [Hess, et ai., (1968); Holland, et ai., (1978)]. Sopivien ilmentämisplasmidien konstruoinnissa ligoidaan il-mentämisvektoriin ilmennettäväksi halutun jakson 3'-puolelle myös näihin geeneihin liittyvät terminaatiojaksot, jotka muodostavat polyadenyloidun mRNA:n ja transkription 15 terminaatiojakson. Muita promoottoreja, joilla on se lisäetu, että niiden transkriptio on säännösteltävissä kasvuolosuhteita muuttamalla, ovat alkoholidehydrogenaasi 2:n, isosytokromi C:n, happaman fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien hajottavien entsyymien ja edellä mainitun glyse-20 raldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin ja maltoosin ja galak-toosin hyväksikäytöstä vastuussa olevien entsyymien promoottorit . Tarkoitukseen soveltuu mikä tahansa plasmidivek-tori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, replikaation alkukohdan ja terminaatiojaksot.

25 Mikro-organismien lisäksi voidaan isäntinä käyttää soluviljelmiä, jotka ovat peräisin monisoluisista organismeista. Periaatteessa minkä tahansa tällaisen soluviljelmän käyttö on mahdollista riippumatta siitä, onko se saatu selkärankaisista tai selkärangattomista peräisin olevasta vil-30 jelmästä. Suurin mielenkiinto on kuitenkin kohdistunut sel-. kärankaissoluihin ja selkärankaissolujen kasvatuksesta vil jelmässä (kudosviljely) on tullut viime aikoina rutiinime-netelmä [Tissue Culture, (1973)]. Esimerkkejä tällaisista käyttökelpoisista isäntäsolulinjoista ovat VERO- ja HeLa-35 solut, kiinanhamsterin munasarja- (CHO) solulinjat, ja 1 i · si 106844 W138-, BHK-, COS-7-, 293- ja MDCK-solulinjat. Näille so luille soveltuviin ilmentäraisvektoreihin kuuluu tavallisesti (tarvittaessa) replikaation alkukohta, ilmennettävää geeniä edeltävä promoottori, jonka ohella niissä on kaikki 5 tarvittavat ribosomin sitoutumiskohdat, RNA:n silmikoitu-miskohdat, polyadenylaatiokohta ja transkription terminaa-tiojaksot.

Ilmentämisvektoreissa olevat ja nisäkässoluissa käytettäväksi soveltuvat säätelytoiminnot saadaan usein vi-10 rusperäisestä materiaalista. Tavallisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin polyomasta, adenovirus 2:sta ja useimmissa tapauksissa Simian Virus 40:stä (SV 40). SV40:n varhaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska kumpikin niistä saadaan viruksesta kätevästi 15 fragmenttina, joka sisältää viruksen replikaation alkukohdan [Fiers, et ai., (1978)]. Voidaan myös käyttää tätä fragmenttia pienempiä tai suurempia SV40:n fragmentteja edellyttäen, että niihin sisältyy noin 250 ep:n suuruinen jakso, joka alkaa Hind III -kohdasta ja jatkuu viruksen 20 replikaation alkukohdassa olevaa Bgl I -kohtaa kohti. Lisäksi on mahdollista ja usein haluttua käyttää haluttuun geenijaksoon tavallisesti liittyviä promoottori- tai säätely jakso ja, edellyttäen, että nämä säätelyjaksot ovat yhteensopivia isäntäsolujärjestelmien kanssa.

25 Vektoriin voidaan saada replikaation alkukohta joko konstruoimalla vektori sellaiseksi, että siihen sisältyy ulkopuolinen alkukohta, kuten SV40:Stä tai jostain muusta virusmateriaalista (kuten polyomaviruksesta, adenovirukses-ta, VSV:stä tai BPV:stä) peräisin oleva alkukohta, tai tämä 30 alkukohta voidaan saada käyttöön isäntäsolun kromosomaali-sesta replikaatiomekanismista. Mikäli vektori liittyy isäntäsolun kromosomiin, on viimeksi mainittu usein riittävä ratkaisu.

32 106844 OMP-geenien sekvenssointi

Valittua OMP:ta koodaavan geenin kloonauksen jälkeen on haluttua tehdä restriktiokartoitus ja analysoida DNA:n jakso käyttäen esimerkiksi Sanger, et al.:n (1977) 5 dideoksimenetelmää. Sekä DNA:ta että pääteltyä aminohappo-jaksoa voidaan sitten verrata tunnettuihin jaksoihin, jotta homologiat tunnettujen proteiinien homologisiin osiin voidaan määrittää. Proteiinin aminohappojaksosta saadaan selville eri domeenien, esimerkiksi sytoplasmamembraanin lä-10 päisevän ja substraattia sitovan domeenin, luonne, ja siitä saadaan merkittävää informaatiota, joka koskee geneettisten muokkaustoimenpiteiden avulla suoritettavia ratkaisutapoja entsyymin rakenteen parantamiseksi.

Peptidijaksojen tietokoneanalyysiohjelmaa (DNAStar 15 software, DNAStar, Inc., Madison, Wise.) apuna käyttäen voidaan tunnistaa OMP-antigeenin tiettyjä nimenomaisia hyd-rofiilisiä peptidyylialueita, joissa on todennäköisesti niitä muodostavia epitooppisia ydinjaksoja ja jotka käsittävät proteiinin tietyt nimenomaiset epitoopit sekä edellä 20 olevien peptidien biologisesti toiminnallisia vastineita, kuten tuonnempana esitettävästä yksityiskohtaisesti tarkastelusta käy ilmi.

OMP-varianttien valmistus

Kohdemutageneesi on OMP:n antigeenijaksosta peräi-25 sin olevien yksittäisten peptidien tai biologisesti toiminnallisesti vastaavien proteiinien tai peptidien valmistamisessa käyttökelpoinen menetelmä, jossa käytetään hyväksi jaksojen perustana olevan DNA:n spesifistä mutageneesiä. Tämä menetelmällä kyetään DNA:n nukleotidijaksoa yhdestä 30 tai useammasta kohdasta muuttamalla lisäksi kätevästi val-mistamaan ja tutkimaan jaksojen variantteja, joissa on esimerkiksi huomioitu yksi tai useampia edellä mainituista tarkasteltavista seikoista. Kohdemutageneesillä on mahdollista valmistaa mutantteja käyttämällä spesifisiä oligonu-35 kleotidijaksoja, jotka koodaavat halutun mutaation DNA-jaksoa, sekä riittävää määrää tämän vieressä olevalla alu- 33 106844 eella sijaitsevia nukleotideja, joista saadaan riittävän suuri ja riittävän monimutkainen jakso pysyvän dupleksin muodostamiseksi sen deleetioliitoskohdan molemmille puolille, jonka jakson on ylitettävä. Tyypillisesti on edullista 5 käyttää noin 17 - 25 nukleotidin mittaista aluketta, jossa muunnettavan jakson liitoskohdan molemmin puolin on noin 5-10 ryhmää.

Kohdemutageneesimenetelmä on tällä alalla yleisesti tunnettu, mistä ovat esimerkkinä sitä koskevat julkaisut 10 [Adelman, et ai., (1983)]. On huomattava, että tässä menetelmässä käytetään tyypillisesti sekä yksinauhaisessa että kaksinauhaisessa muodossa esiintyvää faagivektoria. Kohde-mutageneesissä käyttökelpoisiin tyypillisiin vektoreihin kuuluvat vektorit, kuten M13-faagi [Messing, et ai., 15 (1981)]. Näitä faageja on yleisesti kaupallisesti saatavil la ja niiden käyttö on alan ammattimiesten yleisesti tuntemaa .

Tässä keksinnössä suoritetaan kohdemutageneesi tavallisesti hankkimalla ensin käyttöön yksinauhainen vekto-20 ri, jonka jaksoon sisältyy OMP-antigeeniä koodaava DNA-jakso. Halutun mutatoituneen jakson sisältävä oligonukleo-tidialuke valmistetaan tavallisesti synteettisesti esimerkiksi Crea, et al.:n (1987) menetelmällä. Tämän alukkeen annetaan liittyä sitten pituussuunnassaan yksinauhaiseen .v 25 vektoriin ja sitä käsitellään DNA:ta polymeroivilla entsyymeillä, kuten E. colin polymeraasi l:n Klenow-fragmentilla, jotta mutaation sisältävä nauha saadaan syntetisoitua valmiiksi. Menetelmässä muodostuu siten heterodupleksi, jossa toinen nauha koodaa alkuperäistä mutatoitumatonta jaksoa ja 30 toisessa nauhassa on haluttu mutaatio. Sopivat solut, kuten ·* E. coli -solut, transformoidaan sitten tällä heteroduplek- sivektorilla ja transformanteista valikoidaan klooneja, joissa on mutatoituneen kokoonpanon sisältäviä yhdistelmä-vektoreita.

35 Tässä keksinnössä on ehdotettu käytettäväksi kohde- mutageneesia keinona tuottaa valitun OPM-geenin jakson va- 34 106844 riantteja mahdollisesti käyttökelpoisen OMP-tyypin valmistamiseksi, eikä sitä ole tarkoitettu tätä keksintöä rajoittavaksi, koska muitakin mahdollisia keinoja OMP:n jakson varianttien aikaansaamiseksi on olemassa. Jakson variantti-5 en aikaansaamiseksi voidaan haluttua OMP-geeniä koodaavia yhdistelmävektoreita esimerkiksi käsitellä mutageeneillä (tätä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Eichenlaub, 1979, kuvatussa menetelmässä) plasmidi-DNArhan hydroksyy-liamiinilla aiheutettavien mutaatioiden kyseessä ollessa.

10 Nukleiinihappojaksojen käyttö

Kuten edellä mainittiin, on tämän patenttiselityk-sestä saatavan DNA-jaksoa koskevan informaation avulla mahdollista valmistaa tämän keksinnön tietyissä kohteissa suhteellisen lyhyitä DNA- (tai RNA-) jaksoja, jotka kykenevät 15 hybridisoitumaan spesifisesti kulloinkin kyseessä olevan OMP-antigeenigeenin geenijaksoihin. Näissä tämän keksinnön kohteissa valmistetaan sopivan mittaisia nukleiinihappoko-ettimia, jotka perustuvat OMP-geenin luonnollisen jakson tai sen viereisiltä alueilta peräisin olevan jakson, kuten 20 plasmidissa pBR322 olevan geenistä myötäsuuntaan sijaitsevan jakson, tarkasteluun. Tällaisten nukleiinihappokoetti-mien kyky hybridisoitua spesifisesti OMP- geenijaksoihin tekee ne erityisen käyttökelpoisiksi useissa eri sovellu-tusmuodoissa. Tärkeimpänä näkökohtana on se, että näitä ko- • 25 ettimia voidaan käyttää useissa erilaisissa diagnostisissa määrityksissä tietyissä näytteissä olevien patogeenisten organismien havaitsemiseen. Näillä jaksoilla katsotaan olevan useita muitakin käyttömuotoja, joihin kuuluvat jaksoa koskevan informaation käyttö mutatoitujen molekyylityyppien 30 alukkeiden valmistamiseksi tai sen käyttö muiden geneettis- • ten konstruktioiden valmistamisessa käytettävien alukkeiden valmistamiseksi.

Tiettyjen tämän keksinnön mukaisten etujen aikaansaamiseksi sisältyy hybridisaatiotutkimuksiin tai määrityk-35 siin käytettyihin edullisiin nukleiinihappojaksoihin jaksoja, jotka ovat komplementaarisia ainakin noin 10 - • « 35 106844 20 nukleotidia sisältävän jakson osaa kohtaan. Ainakin 10 nukleotidin mittaisella fragmentilla saadaan varmuus siitä, että pituus riittää sekä pysyvän että selektiivisen dupleksimolekyylin muodostamiseen. Hybridin pysyvyyden ja 5 selektiivisyyden lisäämiseksi ovat kuitenkin edullisia sellaiset molekyylit, joiden jaksot ovat komplementaarisia yli 10 emäksen mittaisten yhtenäisten jaksojen osalta, millä kyetään parantamaan aikaansaatujen hybridimolekyylien laatua ja spesifisyystasoa. On siten tavallisesti edullista 10 suunnitella nukleiinihappomolekyylejä, joissa on 15 -20 nukleotidin mittaisia tai vieläpä haluttaessa tätäkin pitempiä OMP-geeneille komplementäärisiä alueita. Tällaisia fragmentteja voidaan valmistaa kätevästi esimerkiksi syntetisoimalla fragmentti suoraan kemiallisin keinoin, käyttä-15 mällä nukleiinihappojen lisääntymiseen perustuvaa tekniikkaa, kuten US-patenttijulkaisun nro 4 603 102 mukaista PCR-menetelmää, tai liittämällä valitut jaksot yhdistelmä-vektoreihin niiden valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tek-niikalla.

20 Koska tämän keksinnön mukaisten OMP-antigeenien us kotaan viittaavan patogeenisten Moraxella-lajien esiintymiseen, toimii tämä keksintö erityisen käyttökelpoisena perustana diagnostisille hybridisaatiomäärityksille OMP:lie spesifisen RNA:n tai DNA:n havaitsemiseksi kliinisissä • ·. 25 näytteissä. Esimerkkejä kliinisistä näytteistä, joita voi daan käyttää infektioiden diagnoosissa, ovat siten mitkä tahansa Moraxellan nukleiinihappoa mahdollisesti sisältävät näytteet, mukaan lukien välikorvaneste, sylki, bronkoalveo-laarihuuhteluneste, sikiövesi tai muut näitä vastaavat 30 näytteet. Tunnetaan useita erilaisia hybridisaatiomenetel- < miä ja järjestelmiä, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten hybridisaatiokohteiden yhteydessä, ja näihin kuuluvat diagnostiset määritykset, kuten Falkow, et ai.:n US-patenttijulkaisussa 4 358 535 kuvatut määritykset.

35 Tämän keksinnön mukaiset nukleotidijaksot ovat edellä esitetyn mukaisesti tärkeitä siinä, että niiden 36 106844 avulla kyetään selektiivisesti muodostamaan dupleksimole-kyylejä vastaavien OMP-geenien komplementääriSten alueiden kanssa. Ajatellun sovellutuksen mukaan on haluttua käyttää vaihtelevia hybridisaatio-olosuhteita, jotta koettimen se-5 lektiivisyys kohdejaksoaan kohtaan saataisiin asettumaan eri tasoiseksi. Suurta selektiivisyyttä vaativia sovellutuksia varten halutaan hybridien muodostamiseen käytettävien olosuhteiden olevan tyypillisesti suhteellisen rajoittavia, voidaan esimerkiksi valita olosuhteet, joissa suolapi-10 toisuus on suhteellisen matala ja/tai lämpötila suhteellisen korkea, jollaiset olosuhteet saadaan aikaan käyttämällä 0,02 - 0,15-molaarista NaCl:ää 50 °C - 70 °C lämpötiloissa. Nämä olosuhteet ovat erityisen selektiiviset ja koettimen sekä templaatin tai kohdenauhan välillä voi esiintyä vain 15 pientä yhteensopimattomuutta, mikäli sitä voi esiintyä ollenkaan.

Joihinkin sovellutuksiin, esimerkiksi haluttaessa valmistaa mutantteja vastintemplaatille hybridisoitua muta-toitua alukenauhaa käyttäen, on luonnollisesti välttärcättö-20 mänä edellytyksenä se, että heterodupleksi muodostuu melko vähän rajoittavissa hybridisaatio-olosuhteissa. Tällaisissa tapauksissa on haluttua käyttää olosuhteita, jollaiset ovat 0,15 - 0,9-molaarinen suolapitoisuus ja 20 °C:sta 55 °C:seen oleva lämpötila. Joka tapauksessa on tavallises-.*« 25 ti selvää, että olosuhteiden rajoittavuutta voidaan tiuken taa lisäämällä seokseen lisätyn formamidin määrää, mikä heikentää hybrididupleksin pysyvyyttä samalla tavoin kuin lämpötilan kohottaminen. Hybridisaatio-olosuhteita voidaan siten kätevästi muokata ja tämä onkin haluttujen lopputu-30 losten mukaan tavallisesti suositeltavin menettelytapa.

* »

Tietyissä sovellutusmuodoissa voi olla haluttua käyttää nukleiinihappokoettimia varianttien eristämiseksi mutatoituja klooneja sisältävistä kloonipankeista. Erityisissä sovellutusmuodoissa voitaisiin kiinteillä kasvatus-35 alustoilla kasvavia ja OMP-jakson variantteja sisältäviä mutanttikloonipesäkkeitä tunnistaa rinnakkaisilla suodatti- 37 106844 millä käyttäen hybridisaatio-olosuhteita ja menetelmiä, kuten pesäkeblottimäärityksissä käytettäviä menetelmiä, joissa on tarkoitus saada aikaan jakson variantteja sisältävien koettimien hybridisaatio yksinomaan tietyissä pesäkkeissä 5 oleviin jakson variantteihin. Tällä tavalla voidaan OMP-geenin lyhyitä varianttijaksoja sisältäviä pieniä hy-bridisaatiokoettimia käyttää niiden kloonien identifioimiseen, jotka kasvavat kiinteillä kasvatusalustoilla ja jotka sisältävät koko OMP-geenin jakson variantteja. Näitä kloo-10 ne ja kasvattamalla voidaan sitten saada aikaan haluttuja määriä OMP-nukleiinihappojakson variantteja tai vastaavaa OMP-antigeenia.

Tämän keksinnön mukaisia nukleiinihappojaksoja käytetään hybridisäätiön määritykseen kliinisissä diagnosti-15 sissa sovellutusmuodoissa yhdessä asiaankuuluvien keinojen, kuten leiman, kanssa. Tällä alalla tunnetaan suuri määrä useita erilaisia asiaankuuluvia indikaattorikeinoja, joihin kuuluvat radioaktiiviset, entsymaattiset ja muut ligandit, kuten esimerkiksi avidiini/biotiini-systeemi, joista kye-20 tään saamaan havaittava signaali. Edullisissa diagnostisissa sovellutusmuodoissa on mahdollisesti radioaktiivisen tai muun ympäristön kannalta haitallisten reagenssien tilalla haluttua käyttää entsyymileimaa, kuten ureaasia, alkalista fosfataasia tai peroksidaasia. Mikäli kysymyksessä ovat 25 entsyymileimat, joita käytetään tunnistamaan spesifisen hybridisaatio patogeenin nukleiinihappoa sisältäviin näytteisiin, niin tunnettuja leimoja ovat kolorimetriset indikaat-torisubstraatit, joita voidaan käyttää tuottamaan silmin havaittava keino tai joita voidaan käyttää spektrofotomet-30 risesti.

*

On nähtävissä, että tässä keksinnössä kuvatut hy-bridisaatiokoettimet ovat tavallisesti käyttökelpoisia sekä reagensseina liuoshybridisaatioissa että sovellutusmuodoissa, joissa käytetään kiinteää faasia. Kiinteän faasin si-35 sältävissä sovellutusmuodoissa valittuun matriksiin tai pintaan adsorboidaan tai kiinnitetään jollakin muulla ta- • .

38 106844 valla tutkittava DNA (tai RNA), joka on peräisin kliinisistä näytteistä, kuten eksudaateista, ruumiinnesteistä (esimerkiksi sikiövedestä, välikorvanesteestä, bronkoalveo-laarihuuhtelunesteestä) tai jopa kudoksista, joissa orga-5 nismia epäillään esiintyvän. Tämä kiinnitetty yksinauhainen nukleiinihappo hybridisoidaan sitten spesifisesti valittuihin koettimiin halutuissa olosuhteissa. Valitut olosuhteet ovat riippuvaiset tietyistä nimenomaisista olosuhteista, jotka perustuvat tiettyihin vaadittaviin nimenomaisiin rat-10 kaiseviin tekijöihin (nämä ovat riippuvaiset esimerkiksi G+C-sisällöstä, kohteena olevan nukleiinihapon tyypistä, nukleiinihapon lähteistä, hybridisaatiokoettimen koosta jne) . Spesifinen hybridisaatio havaitaan tai jopa kvanti-toidaan leiman avulla sen jälkeen, kun hybridisoitu pinta 15 on pesty epäspesifisesti sitoutuneiden koetinmolekyylien poistamiseksi.

Muissa sovellutusmuodoissa ehdotetaan sitä, että OMP-jaksoja tai tämän variantteja voitaisiin käyttää erittäin spesifisen ja herkän M. catarrhaliksen havaitsemisen 20 aikaansaamiseksi käytettäessä niitä reagensseina polymeraasiketjureaktio (PCR) -määrityksissä. Soveltamalla PCR- tekniikkaa esimerkiksi US-patenttijulkaisussa nro 4 60 102 kuvatulla tavalla voidaan useita erilaisia OMP-jakson osia käyttää tavallisesti oligonukleotidikoettimina näytteissä .\ 25 olevan OMP-nukleiinihapon rajoitetun osan amplifioimiseksi PCR:n avulla. OMP-jakson amplifioitu osa voidaan tämän jälkeen havaita hybridisoimalla komplementaarisen jakson sisältävällä hybridisaatiokoettimella. Tällä tavoin voidaan OMP-jaksojen avulla havaita näytteestä erittäin pieniä M. 30 catarrhaliksen nukleiinihappokonsentraatioita.

·* Muissa sovellutusmuodoissa voidaan PCR-muotoon saa tettuja OMP-jaksoja käyttää OMP-geenin valittujen osien valmistamiseksi in vitro -olosuhteissa haluttuina määrinä. Amplifroimalla valitun OMP-geenin valittuja geenin osia ja 35 liittämällä nämä osat sitten vektoreihin voidaan myös valmistaa yhdistelmäklooneja, jotka ilmentävät OMP-vari antte- 39 106844 ja, OMP-antigeenin osafragmentit mukaan luettuina. Tällä tavoin voidaan valmistaa ulkomembraaniproteiinin antigee-niepitooppeja sisältäviä peptidejä ja käyttää näitä eri tarkoituksiin.

5 Immunoxnääritykset

Kuten edellä mainittiin, ehdotetaan tämän keksinnön mukaisten OMP-peptidien olevan käyttökelpoisia esimerkiksi immunogeeneinä tai antigeeneinä anti-OMP-antigeenin reagoivien vasta- aineiden havaitsemiseen tarkoitetuissa immuno-10 määrityksissä. Ensimmäiseksi käsiteltävien immunomääritys-ten ollessa kyseessä niiden yksinkertaisimmassa ja välittö-mimmässä mielessä kuuluvat tämän keksinnön mukaisiin immu-nomäärityksiin useat erilaiset tällä alalla tunnetut ent-syymivälitteiset immunosorbenttimääritykset (ELISA: t). On 15 kuitenkin hyvin ilmeistä, että OMP-peptidien käyttökelpoisuus ei rajoitu näihin määrityksiin ja että muihin käyttökelpoisiin sovellutusmuotoihin kuuluvat RIA:t ja muut vasta- aineen sitoutumiseen perustuvat määritykset tai menettelytavat, joihin ei liity entsyymejä.

20 Edullisessa ELISA-määrityksessä immobilisoidaan OMP-antigeenijaksoja sisältäviä peptidejä valittuun pintaan, joka on edullisesti pinta, kuten polystyreenimikro-tiitterilevyn kuopat, jolla on affiniteettia proteiinia kohtaan. Epätäydellisesti adsorboituneen materiaalin pois-. 25 tamiseksi suoritetun pesun jälkeen on haluttua kiinnittää kuoppaan tai sitoa siihen epäspesifistä proteiinia, kuten naudan seerumialbumiinia (BSA:ta) tai kaseiinia, jonka tiedetään olevan antigeenisesti neutraali tutkittavan antiseerumin suhteen. Tällä kyetään estämään epäspesifisten ad-30 sorptiokohtien toiminta immobilisoivalla pinnalla, mikä si-* ten vähentää taustaa, joka aiheutuu antiseerumin epäspesi fisestä sitoutumisesta tähän pintaan.

Sitten kun antigeenimateriaali on sidottu kuoppaan, tämä on päällystetty taustan vähentämiseen käytettävällä 35 reagoimattomalla materiaalilla ja kuoppa on pesty sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi, saatetaan immobilisoiva « · 40 106844 pinta kosketukseen antiseerumin tai tutkittavan kliinisen tai biologisen uutteen kanssa immuunikompleksin (antigee-ni/vasta-aine-kompleksi) muodostumiseen johtavalla tavalla. Tällaisiin olosuhteisiin kuuluu edullisesti se, että anti-5 seerumi laimennetaan laimentimilla, kuten BSA:lla, naudan gammaglobuliinilla (BGG:llä) sekä fosfaatilla puskuroidun fysiologisen suolaliuoksen (PBS:n) ja Tweenin seoksella. Näillä seokseen lisätyillä aineilla on myös epäspesifistä taustaa pienentävä vaikutus. Antiseerumikerroksen annetaan 10 sitten inkuboitua 2-4 tuntia edullisesti 25 - 27 °C:n alueella olevissa lämpötiloissa. Antiseerumin kanssa kosketukseen saatettu pinta pestään inkuboinnin jälkeen immuno-kompleksia muodostamattoman materiaalin poistamiseksi. Edulliseen pesumenetelmään sisältyy pesu liuoksella, kuten 15 PBS:n ja Tweenin seoksella, tai boraattipuskurilla.

Sitten kun tutkittavan näytteen ja alustaan sidotun antigeenin väliset spesifiset immuunikompleksit ovat muodostuneet ja pesu on suoritettu, voidaan immuunikompleksin syntyminen sekä sen määrä määrittää käsittelemällä komplek-20 siä ensimmäiselle vasta-aineelle spesifisellä toisella vasta-aineella. Siinä mielessä, että tutkittava näyte on tyypillisesti peräisin ihmisestä, on luonnollista, että toinen vasta-aine on edullisesti vasta-aine, joka on tavallisesti spesifinen humaani-IgG:tä kohtaan. Havaitsemiskeinon ai-·. 25 kaansaamiseksi on toiseen vasta-aineeseen liitetty edulli sesti entsyymi, joka aiheuttaa värin kehittymisen inkuboi-taessa tätä asianmukainen kromogeenisen substraatin kanssa. On siten haluttua esimerkiksi saattaa antiseerumin sitonut pinta kosketukseen ureaasin tai peroksidaasilla konjugoidun 30 anti-humaani-IgG:n kanssa ja inkuboida tätä yhdistelmää sen * mittainen aika ja sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat suotuisat immuunikompleksin muodostumiselle (esimerkiksi 2 h:n inkubointi huoneenlämmössä PBS:ää sisältävässä liuoksessa, kuten PBS-Tween-liuoksessa).

35 Sitten kun inkubointi entsyymileimalla varustetulla toisella vasta-aineella on suoritettu ja kuoppa on pesty • < 41 106844 sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi, kvantitoidaan leiman määrä inkuboimalla seosta kromogeenisen substraatin, kuten urean ja bromikresolipunan, tai, mikäli entsyymilei-mana oli käytetty peroksidaasia, 2,2'-atsino-di-(3-5 etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihapon [ABTS] ja H202:n kanssa. Kvantitoinnissa määritetään sitten muodostuneen värin määrä esimerkiksi näkyvän spektrialueen spektrofotometril-lä.

Rokotteiden valmistus 10 Immunogeenisiä koostumuksia, joiden on tässä kek sinnössä ehdotettu soveltuvan rokotekäyttöön, voidaan valmistaa kätevimmin suoraan tässä keksinnössä kuvatulla tavalla valmistetuista immunogeenisistä OMP-proteiineista ja/tai -peptideistä. Antigeeninen materiaali dialysoidaan 15 haitallisten pienimoolimassaisten molekyylien poistamiseksi edullisesti suurta puskurimäärää vastaan ja/tai lyofilisoi-daan, mikä edistää sen formuloimista haluttuun kantaja-aineeseen.

Sellaisten rokotteiden valmistaminen, jotka sisäl-20 tävät aktiivisina ainesosina peptidijaksoja, on tällä alalla yleisesti tunnettua, mistä ovat esimerkkeinä US-patenttijulkaisut nro 4 608 251; 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230; 4 596 792 ja 4 578 770. Nämä rokotteet valmistetaan tyypillisesti injektioliuoksiksi. Voidaan myös valmistaa sellai-25 siä kiinteitä muotoja, jotka soveltuvat liuotettaviksi tai suspendoitaviksi nesteeseen. Preparaatti voidaan myös emul-goida. Aktiivinen immunogeeninen ainesosa sekoitetaan usein lisäaineisiin, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja yhteensopivia aktiivisen ainesosan kanssa. Sopivia lisäai-30 neita ovat esimerkiksi vesi, fysiologinen suolaliuos, glukoosi, glyseroli, etanoli tai muut näiden vastaavat aineet ja näiden yhdistelmät. Rokote voi lisäksi haluttaessa sisältää pieniä määriä apuaineita, kuten kostutus- ja emul-gointiaineita, pH:ta puskuroivia aineita tai adjuvantteja, 35 jotka voimistavat rokotteiden tehokkuutta.

42 106844

Rokotteen lisäksi muihin antotapoihin soveltuviin muunlaisiin formulaatioihin kuuluvat peräpuikot ja joissakin tapauksissa oraaliset formulaatiot. Peräpuikkojen ollessa kyseessä voi tavanomaisiin sideaineisiin ja kanta-5 ja-aineisiin sisältyä esimerkiksi polyalkaleeniglykoleja tai triglyseridejä; tällaiset peräpuikot voidaan valmistaa seoksista, jotka sisältävät 0,5 %:sta 10 %:iin aktiivista ainesosaa, jota on edullisesti 1 - 2 %. Oraalisiin formulaatioihin kuuluvat sellaiset tavallisesti käytetyt lisäai-10 neet, kuten esimerkiksi farmaseuttista laatuluokkaa olevat mannitoli, laktoosi, tärkkelys, magnesiumstearaatti, natriums akkariini, selluloosa, magnesiumkarbonaatti ja muut näitä vastaavat aineet. Nämä koostumukset ovat liuosten, suspensioiden, tablettien, pillereiden, kapseleiden, lääke-15 aineita jatkuvasti vapauttavien formulaatioiden tai jauheiden muodossa ja ne sisältävät 10 - 95 % aktiivista ainesosaa, jonka määrä on edullisesti 25 - 70 %.

Proteiinit voidaan formuloida rokotteeksi neutraaleina tai suolamuotoinaan. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin 20 suoloihin kuuluvat happoadditiosuolat (jotka on muodostettu peptidin vapaiden aminoryhmien kanssa) ja jotka on valmistettu käyttämällä epäorgaanisia happoja, kuten esimerkiksi suola- tai fosforihappoja tai orgaanisia happoja, kuten etikka-, oksaali-, viini- tai mantelihappoja tai muita näi-25 tä vastaavia happoja. Vapaiden karboksyyliryhmien kanssa muodostettujen suolojen valmistukseen voidaan myös käyttää epäorgaanisia emäksiä, kuten esimerkiksi natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium- tai rautahydroksideja ja orgaanisia emäksiä, kuten isopropyyliamiinia, trimetyyliamiinia, 30 2-etyyliaminoetanolia, histidiiniä, prokaiinia ja muita « · · näitä vastaavia emäksiä.

Niihin useisiin erilaisiin menetelmiin, joiden avulla rokotteiden adjuvanttivaikutus saadaan aikaan, kuuluu se, että rokotteissa käytetään aineita, kuten alumi-35 niumhydroksidia tai -fosfaattia (alum), joita käytetään tavallisesti 0,05 - 0,1-prosenttisena liuoksena fosfaatilla « 43 106844 puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa, että rokotteisiin sekoitetaan synteettisiä sokeripolymeerejä (Carbo-pol) , joita käytetään 0,25-prosenttisena liuoksena, että rokotteessa oleva proteiini aggregoidaan lämpökäsittelyllä, 5 joka suoritetaan käyttäen 70 °C:sta 101 °C:een olevaa lämpötilaa ja käsittelyaikaa, jonka kesto on 30 sekunnista 2 minuuttiin. Voidaan myös käyttää albumiinia vastaan suunnattuja pepsiinillä käsiteltyjä (Fab)-vasta- aineita uudelleen aktivoimalla aiheutettua aggregaatiota, rokotteisiin 10 sekoitettuja bakteerisoluja, kuten C. parvumia, tai gramne-gatiivisten bakteerien endotoksiini- tai lipopolysakkaridi-komponentteja, emulgointia fysiologisesti hyväksyttäviin öljypohjaisiin kantaja-aineisiin, kuten mannidimono-ole-aattiin (Aracel A:hän), tai emulgointia blokkisubstituent-15 tina käytettävään 20-prosenttiseen perfluorihiililiuokseen (Fluosol-DA:han).

Esimerkki I

EDTAsaan perustuva ulkomembraanifragmenttien uutto OMP-antigeenejä vastaan suunnatun vasta-aineen ai-20 kaansaamiseksi valmistettiin immunogeeniksi M. catarrhalis -kannasta 035E peräisin olevia ulkomembraanifragmentteja. M. catarrhalis -kannan 035E soluja kasvatettiin agarmal-joilla käyttäen aivo-sydän-infuusioelatusainetta. Maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa kynttiläkammiossa. Näistä soluista . 25 valmistettiin sitten ulkomembraanifragmentit käyttäen EDTA:aan perustuvaa uuttomenetelmää, joka on esitetty julkaisussa Murphy, et ai., Microb. Path., (1989).

Esimerkki II

M. catarrhaliksen OMP-molekyylien eristys 30 Siinä valossa, että tässä keksinnössä on tunnistet- e * tu ja tässä patenttiselityksessä kuvattu valittuja M. catarrhaliksen OMP-molekyylejä vastaan suunnattuja spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, siinä ehdotetaan vastaavan OMP-antigeenin puhdistamista seuraavalla yleisellä menetel- 35 mällä. Kokonaisista M. catarrhalis -soluista valmistetaan soluvaippapreparaatti käsittelemällä niitä ultraäänellä tai > · • · 44 106844 soluista eristetään ulkomembraanifragmentit EDTA:han perustuvalla käsittelyllä. Näitä membraaneja käsitellään ionit-tuvilla tai ionittumattomilla detergenteillä haluttujen proteiinien vapauttamiseksi, jotka voidaan sitten puhdistaa 5 käyttäen tavanomaista pylväskromatografiaa tai immunoaffi-niteettimenetelmiä.

Esimerkki III

M. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiinien suhteen spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus 10 Tämä esimerkki kuvaa vaiheita, joita tässä keksin nössä on käytetty sen tiettyjen kohteiden soveltamisessa käytäntöön. Tämä esimerkki liittyy erityisesti sellaisten hybridoomien valmistamiseen ja tunnistamiseen, jotka tuottavat 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP-antigeeniä vastaan 15 suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita. Kun M. catarrha-liksesta peräisin olevia ja solun pinnalla esiintyviä OMP-antigeenejä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hybridoomat oli tunnistettu, poimittiin niistä määritysten perusteella esiin näitä OMP-antigeenejä 20 vastaan suunnattua vasta-ainetta tuottavat hybridoomat, ja viljelemällä näitä hybridoomia tuotettiin vasta-ainetta, joka oli tarkoitettu käytettäväksi muihin tutkimuksiin, kuten niihin tutkimuksiin, joihin liittyi M. catarrhaliksen poistuminen keuhkoista.

.·, 25 BALB/c-hiiriä immunisoitiin ruiskuttamalla niiden vatsaonteloon M. catarrhalis -kannan 035E ulkomembraanif-ragmentteja, jotka oli valmistettu EDTA:han perustuvalla eristysmenetelmällä. Kukin eläin immunisoitiin käyttäen 50 - 100 μg proteiinia 0,1 ml:ssa Freundin täydellistä ad-30 juvanttia. Kuukauden kuluttua eläimille annettiin tehoste-·' rokotus samansuuruisella määrällä tätä samaa proteiinival mistetta epätäydellisessä Freundin adjuvantissa. Kolme viikkoa myöhemmin hiiriin ruiskutettiin suonensisäisesti (häntälaskimoon) 50 μg proteiinia samasta PBS:ään suspen-35 doidusta membraanipreparaatista.

» i 45 106844 "Pannukakku"-fuusiomenetelmää käytettäessä meneteltiin seuraavasti. Kokeessa käytettiin SP2/0-Agl4-plasmasy-toomasoluja. Näitä soluja kasvatettiin DMEM:stä (Dulbeccon modifioima Eaglen medium) ja penisilliinin, streptomysiinin 5 ja glutamiinin seoksesta valmistetussa seoksessa, joka sisälsi 15 % fetaalista naudanseerumia, 1 % Fungizonia ja 8-atsaguaniinia. Kaksi viikkoa ennen fuusiota jotkin näistä soluista erotettiin kasvatusliuoksiin, joissa oli 1 % Fungizonia, mutta joissa ei ollut 8-atsaguaniinia. Näitä solu-10 ja kasvatettiin 10 päivän ajan solutiheydessä, jossa solujen määrä ei ollut yli 1 - 2 x 105/ml. Kolme päivää ennen fuusiota aloitettiin joka 24 tunnin välein suoritettu SP2/0-solujen jatkoviljely ja näitä kasvatettiin solut iheydessä, joka oli noin 2 - 3 x 105/ml. Kolme päivää ennen 15 fuusiota hiirille annettiin tehosterokotukseksi suonensisäisesti noin 50 μg proteiini-immunogeeniä. Fuusiopäivänä kaksi hiirtä tapettiin niskasta taittamalla.

Pernat poistettiin aseptisesti ja ne hienonnettiin. Pernasolut koottiin talteen 10 ml:n eriin DMEM-HY-mediumeja 20 (60 ml NCTC-109, 6 putkea hypoksantiinin, tymidiinin ja glysiinin seoksen kantaliuosta, 6 putkea oksaalietikkaha-posta ja naudan insuliinista tehtyä kantaliuosta, 12 ml penisilliinin, streptomysiinin ja glutamiinin seosta, 2,7 ml 100-millimolaarista Na-pyruvaattia ja 508 ml DMEM:ää).

. 25 SP2/0-solut ja pernasolut koottiin talteen huoneenlämmössä sentrifugoimalla 170 x g:ssa li minuutin ajan omissa koeputkissaan. Sekä SP2/0-solut että pernasolut suspendoitiin uudelleen yhteensä 5 ml:aan DMEM-HY-liuosta.

Hypoksantiinin, tymidiinin ja glysiinin seoksen 30 kantaliuos valmistettiin lisäämällä 136 mg hypoksantiinia « * 100 ml:aan 0,1-molaarista HCl:ää, 38,7 mg tymidiiniä 100 ml:aan H20:ta ja 2,3 mg glysiiniä 20 ml:aan H20:ta. Nämä liuokset liuotettiin erikseen, yhdistettiin ja jaettiin 2,2 ml:n suuruisiin eriin.

35 Oksaalietikkahappoa ja naudan insuliinia sisältävä kantaliuos valmistettiin liuottamalla 80,3 mg naudan insu- v « · 46 106844 liinia 100 ml:aan H20:ta, lisäämällä 1,32 ml oksaalietikka-happoa ja jakamalla liuos 1 ml:n suuruisiin eriin.

Tämän jälkeen pernasolut laimennettiin solutihey-teen 2 x 108 solua/5 ml ja SP2/0-solut laimennettiin soluti-5 heyteen 2 x 107 solua/5 ml. Pernasolujen ja SP2/0-solujen välinen suhde oli 10 : 1. Tämän jälkeen pernasolut sekoitettiin SP2/0-soluihin suhteessa 1 : 1. Perna-SP2/0-seosta käsiteltiin 3 ml:11a DMEM-HY-mediumia, jossa oli 50 % PEG:tä, 35 sekunnin ajan. Fuusioidut perna- ja SP2/0-solut 10 pestiin välittömästi DMEM-HY:11a ja niitä inkuboitiin 30 % HY : HIFCS -seoksessa (35 ml DMEM-HY, 15 ml FBS, suodatettu liuos) 24 tunnin ajan 37 °C:ssa. 24 tuntia fuusion jälkeen kasvatusliuokset ja fuusioidut solut koottiin talteen 20 % HY : HIFCS -seokseen (80 ml DMEM-HY, 20 ml FBS, suodatettu 15 liuos) sentrifugoimalla 170 x g:ssa 5 minuuttia. Fuusioidut solut suspendoitiin sitten uudelleen 100 ml:aan 20 % HAT : HIFCS -seosta ja ne siirrettiin 96-kuoppaisiin mikrotiitte-rilevyihin 100 ml:n suuruisina erinä kuoppaa kohti. Viikon kuluttua fuusiosta kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μΐ 20 % 20 HY : HIFCS -seosta. Kahden viikon kuluttua fuusiosta, kun lisääntyviä hybridisoluja sisältävät kuopat antoivat happa-men reaktion, jaettiin kukin positiivinen kuoppa 2 ml:n kuoppaan 24-kuoppaisella levyllä ja viljelmäsupernanteista suoritettiin määritys vasta-aineen luonnehtimiseksi.

•*i 25 Näistä klooneista peräisin olevista supernatant e is- ta seulottiin esiin M. catarrhalista vastaan suunnatut vasta-aineet käyttäen ELISA:an perustuvaa sitoutumismenetelmää sekä Western-blottausmenetelmää, joissa ELISA:a varten tarkoitettuna antigeeninä käytettiin EDTA:lla uutettuja M. ca-30 tarrhalis -kannan 035E ulkomembraanifragmentteja ja Wes- • ♦ tern-blottausta varten tarkoitettuna antigeeninä tämän kannan kokosolulysaatteja. Positiiviset supernatantit tutkittiin tämän jälkeen vasta-aineen luoksepääsevyyden määrittämiseen käytettävällä epäsuoralla RIA:lla sen tutkimiseksi, 35 ovatko ulkomembraaniantigeenit esillä solun pinnalla, jul- 47 106844 kaisuissa Kimura, et ai., (1985 ja 1986), kuvatulla tavalla.

Tämän jälkeen positiivisia hybridoomia viljeltiin normaalissa DMErssa ja monoklonaaliset vasta-aineet puhdis-5 tettiin viljelmäsupernatanteista Sepharose CL-4B:hen sidotulla proteiini-A:11a julkaisussa Ey, et ai., (1978), kuvatulla tavalla.

Kukin Mab, jonka Western-blottaustutkimuksessa oli määritetty reagoivan M. catarrhaliksen kanssa, tutkittiin 10 epäsuorassa vasta-aineen luoksepääsevyysmäärityksessä sen määrittämiseksi, olivatko nämä Mab-molekyylit reagointiky-kyisiä tämän organismin solun pinnalla esiintyvien determinanttien kanssa. Vasta-aineen luoksepääsevyysmääritys suoritettiin julkaisussa Patrick, et ai., (1987) kuvatulla ta-15 valla.

Mab 10F3:n, joka reagoi Western-blottianalyysissa antigeenin kanssa, jonka näennäinen moolimassa oli noin 80 000, osoitettiin sitoutuvan kannan 035E kokonaisten solujen pintaan. Tutkituista kymmenestä erilaisesta M. ca-20 tarrhalis -kannasta oli tämän Mab:n kanssa reagoivia neljä määritettynä Gulig, et al.':n (1987) menetelmän mukaan suoritetulla pesäkeblotti-RIA-analyysillä.

Mab 17C7 reagoi kahden erikokoisen vyöhykkeen kanssa Western-blottausanalyysissä. Tämä Mab reagoi geelin ylä-.* 25 osan läheisyydessä olevan vyöhykkeen kanssa, joka liikkui diffuusissa muodossa, ja joskus toisen vyöhykkeen kanssa, joka liikkui siten, että sen näennäinen moolimassa oli alueella noin 200 - noin 700 kD. Selvyyden vuoksi tämä Mab on määritelty "HMWP"-antigeenin kanssa reagoivaksi Mabrksi. 30 Tämä Mab sitoutui 035E-kannan pintaan ja se reagoi pesäke-'** blotti-RIA:ssa kaikkien kymmenen erilaisen tutkitun M. ca- tarrhalis -kannan kanssa.

Mab 8B6 reagoi sellaisen antigeenin kanssa, jonka näennäinen moolimassa Western-blottausanalyysissä oli noin 35 30 000. Tämä Mab reagoi myös kannan 035E pinnan kanssa ja • · 48 106844 se reagoi pesäkeblotti-RIA:ssa kaikkien kymmenen erilaisen tutkitun M. catarrhalis -kannan kanssa.

Esimerkki V

M. catarrhaliksesta peräisin olevan 80 kD:n OMP:tä 5 (10F3:n kanssa reaktiokykyinen) koodaavan geenin kloonaus Tämä esimerkki kuvaa tässä keksinnössä käytettyjä vaiheita M. catarrhaliksesta peräisin olevan 80 kD:n OMP:tä koodaavan geenin kloonaamisessa. Tässä esimerkissä on kuvattu seuraavilla menetelmillä eristetty yksi tai useampi 10 80 kD:n OMP-antigeeniä ilmentävä yhdistelmä-E. coli .

-klooni.

Ά. Genomin DNA:n eristys Tässä tutkimuksessa käytettiin edustavana Moraxel-la-patogeenina M. catarrhalis -kantaa 035E. M. catarrhalik-15 sen kannasta 035E peräisin oleva genomin DNA eristettiin ja puhdistettiin seuraavasti. M. catarrhalis -soluja (märkä-painoltaan noin 2 g) kaavittiin agarmaljojen pinnalta ja solut suspendoitiin uudelleen 20 mlraan PBS:ää. Tähän suspensioon lisättiin 3,2 ml 10-prosenttista (w/v) SDS:ää ja 20 1 ml RNaasia (10 mg/ml). Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa ja siihen lisättiin sitten 3 mg proteinaasi- K:ta, jonka jälkeen seosta inkuboitiin vielä 55 °C*.ssa yön yli. Inkuboitu seos uutettiin sitten kerran fenolilla, 2 kertaa fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksella ja 3 kertaa .·· . 25 kloroformin ja isoamyylialkoholin seoksella. Tulokseksi saatu DNA saostettiin tämän jälkeen kahdella tilavuusosalla absoluuttista etanolia ja koottiin talteen pasteurpipetil-lä.

B. M. catarrhaliksen genomikirjaston valmistus 30 pBR322:ssa • <

Genomin DNA pilkottiin osittain inkuboimalla 100 μg:n eriä M. catarrhaliksen genomin DNA:ta erisuuruisilla määrillä restriktioentsyymiä PstI noin 1,5 ml:n reak-tiotilavuudessa 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Osittain pilkottu 35 genomin DNA fraktioitiin sitten koon mukaan sakkaroositi-heysgradienttisentrifugoinnilla. Noin 6 - 23 ke:n pituisia 49 106844 DNA-fragmentteja sisältävät fraktiot erotettiin muista fraktioista ja dialysoitiin sellaisten puhdistettujen geno-min DNA-fragmenttien saamiseksi käyttöön, jotka on tarkoitettu ligoitaviksi pBR322:een.

5 Plasmidivektori pBR322 pilkottiin täydellisesti

PstI:11a inkuboimalla 15 μg:n eriä pBR322:ta 50 yksiköllä Pstlrtä 100 μ1:η reaktiotilavuudessa 37 °C:ssa 18 tunnin ajan. Puhdistetut DNA-fragmentit ligoitiin Pstl:lla pilkottuun pBR322-vektoriin inkuboimalla 300 ng puhdistettuja 10 DNA-fragmentteja ja Pstlrlla pilkottua pBR322:ta yhdessä ATP:n ja T4-DNA-ligaasin kanssa olosuhteissa, jotka on kuvattu teoksessa Maniatis, et ai., (1982). Ligaation jälkeen DNA laimennettiin suhteessa 1 : 5 10-millimolaarisella

Tris-HCl-seoksella (pH 8,0) ja tällä transformoitiin 15 CaCl2-menetelmällä kompetentiksi tehty E. coli RR1.

C. Transformoitujen RR1-pesäkkeiden seulonta M. ca-tarrhaliksen OMP:n ilmentymistä määrittävällä pesäkeblotti-radioimmunomäärityksellä

Seuraavaksi suoritettiin pesäkeblotti-RIA Gulig, et 20 al.':n (1987) julkaisussa kuvatulla tavalla käyttäen primäärisenä vasta-aineena monoklonaalista vasta-ainetta 10F3.

D. M. catarrhaliksen OMP-antigeenejä ilmentävien yhdistelmä-E. coli-kloonien luonnehtiminen

Pesäkeblotti-RIA:ssa monoklonaalisen vasta-aineen .·* , 25 10F3 kannan kanssa reagoineita klooneja viljeltiin käyttäen LB-mediumia, joka sisälsi tetrasykliini-antibioottia (15 μg/ml). M. catarrhaliksen OMP-antigeenejä ilmentävien yhdistelmä-E. coli RR1 -solujen kokosolulysaatit valmistettiin julkaisussa Patrick, et ai., (1987), kuvatulla taval-30 la. Suoritus tapahtui pääpiirteittäin niin, että eriä näis-tä kokosolulysaateista käsiteltiin SDS-PAGE:lla julkaisussa Gulig, et ai., (1987) kuvatulla tavalla ja ne värjättiin sitten Coomassiesinellä tai siirrettiin nitroselluloosalle Western-blottausanalyysia varten. Kuviossa 1 esitetyt tu-35 lokset viittaavat siihen, että 80 kD:n yhdistelmä-OMP-geeni ilmentyy monoklonaalisen vasta-aineen 10F3 tunnistamassa 50 106844 kloonissa. Tälle kloonille on annettu myöhemmin nimitys pMEHlOO. Jakson analyysia varten jatkokloonattiin pMEH100:n 2,5 ke:n suuruinen osafragmentti pBluescript SK+ -vektoriin (pMEH120). pMEH120:n alustava restriktioanalyysi on esitet-5 ty kuviossa 2.

Esimerkki VI

M. catarrhaliksen 30 kD:n (8B6:n kanssa reagoiva) ja 100 kD:n (17C7:n kanssa reagoiva) ulkomembraaniproteii-neja koodaavien geenien kloonaus 10 A. Genoxnin DNA:n eristäminen M. catarrhaliksen genomin DNA eristettiin ja puhdistettiin muissa kloonausmenetelmissä kannasta 035E ja 100 μg:n suuruiset näytteet pilkottiin osittain Sau3A:lla (Promega Biotech) huoneenlämmössä samoin kuin edellä on ku-15 vattu Pstlrtä käytettäessä.

B. M. catarrhaliksen genomin DNA-kirjaston valmistus bakteriofaagivektoria λΘΕΜ-ΙΙ käyttäen

Pilkottu DNA fraktioitiin koon mukaan sakkaroositi-heysgradienteissa ja tästä koottiin talteen 15 ke:n suurui-20 set ja tätä suuremmat DNA-fragmentit käytettäväksi kirjaston konstruoinnissa. Nämä DNA-fragmentit (1 μg) täytettiin aukkopaikoistaan Klenow-menetelmällä (Promega) 14 °C:ssa 90 minuutin ajan). Nämä fragmentit puhdistettiin tämän jälkeen vakiomenetelmillä ja ligoitiin faagin DNA- käsivarsiin ··. 25 ja pakattiin menetelmillä ja reagensseilla, jotka saatiin käyttöön Promegan toimittamassa LambdaGEM-11* Xho I Half-Site Arms Cloning System -pakkauksessa lukuun ottamatta sitä, että käytettiin pBRL:sta saatua T4-DNA-ligaasia. Pakkauksen jälkeen faagiin perustuva kirjasto titrattiin 30 käyttäen E. coli LE392:ta. Tämä genomikirjasto sisälsi * * 50 000 yhdistelmäkloonia.

51 106844 C. Bakteriofaagiin perustuvan genomin DNA-kirjaaton seulonta monoklonaalisilla 17C7- ja 8B6-vasta-aineilla

Kloonipankin seulomiseksi annettiin 20 000 plakin reagoida immmunologisesti 17C7- ja 8B6-Mab-molekyylien 5 kanssa käyttäen julkaisussa Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience) kuvattua plakkiseulontamene-telmää käyttäen koettimena radioaktiivisella jodileimalla varustettua vuohessa tehtyä anti-hiiri Ig:tä plakkimateri-aaliin sitoutuneiden Mab-molekyylien havaitsemiseksi. Ko-10 keissa tunnistettiin lopulta yksi kummankin Mab:n kanssa reagointikykyinen yhdistelmätaagi.

D. Mab-molekyylien 17C7 ja 8B6 kanssa reagointikyky! s ten yhdistelmätaagien luonnehtiminen Näiden yhdistelmäfaagien nestelysaattiviljelmät 15 valmistettiin julkaisussa Currrent Protocols in Molecular Biology kuvatuilla vakiomenetelmillä. DNA eristettiin vaki-omenetelmillä. Nestelysaateista talteenotettu faagi kuumennettiin 100 °C:een 3 minuutin ajaksi tavallisessa SDS-hajotuspuskurissa ja sille suorittiin SDS-PAGE ja Wes-20 tern-blottausanalyysi sen varmistamiseksi, että nämä yhdis-telmäfaagit ilmensivät asianmukaisia M. catarrhaliksen antigeenejä.

Mab 17C7:n kanssa reagointikykyisen yhdistelmäfaa-gin, jolle oli annettu nimitys MEH200, havaittiin käsittä-·· , 25 vän HMWP:tä koodaavaa DNA:ta. MEH200:n alustavan restrik- tiokartan on kuviossa 3 esitetty käsittävän noin 11 ke:n suuruisen liitosjakson. Toisen kloonin, jolle oli annettu nimitys pMEH3000, havaittiin sisältävän noin 18 ke:n suuruisen DNA-jakson, joka koodasi Mab 8B6:n kanssa reagoivaa 30 30 kD:n antigeeniä.

• «

Kuvio 4 on kuvaava esimerkki 30 kD:n OMP-antigeeniä ilmentävästä E. coli -kloonista LE392/8B6 peräisin olevien proteiinien Western-blottianalyysistä. Tässä tutkimuksessa suoritettiin kuviossa esitetyille eri näytteille PAGE, teh-35 tiin siirto nitroselluloosamembraanille ja membraani käsiteltiin 30 kD:n OMP:lle spesifisellä monoklonaalisella vas- 52 106844 ta-aineella 8B6. Kuten kuviosta voidaan nähdä, siinä havaitaan LE392/8B6-kanavassa (kanavassa C) oleva noin 30 kD:n moolimassainen vyöhyke ja positiokontrollin sisältävässä kanavassa (kanava F) havaitaan esiintyvän samanlainen vyö-5 hyke. Kahden LE392/8B6-kanavassa (kanavassa C) havaitun muun vyöhykkeen luonne on epäselvä, mutta ne saattavat johtua yhdistelmäproteiinin muokkautumisesta tai geelin liiallisesta kuormittumisesta. Negatiivisen kontrollin sisältävissä kanavissa (kanavat D ja E) havaitut vyöhykkeet ovat 10 selvästi kanavista C ja F peräisin olevaa niihin tunkeutunutta materiaalia.

Kuvio 5 esittää samanlaisen Western-blottianalyysin faagilysaatista, joka oli peräisin HMWP-OMP:tä ilmentävästä LE 392/17C7:ksi nimitetystä kloonista ja jota oli käsitelty 15 käyttäen koettimena monoklonaalista vasta-ainetta 17C7. Kanavat C - E käsittävät kloonista LE 392/17C7 peräisin olevia faagilysaattiproteiineja. Näissä kanavissa esiintyy vähäistä reagoivuutta hyvin suuren moolimassan alueella.

Tämä keksintö on kuvattu sen tiettyjen nimenomais-20 ten sovellutusmuotojen avulla, joiden on tässä keksinnössä havaittu tai ehdotettu käsittävän sen käyttöön soveltuvat edulliset käyttötavat. Alan ammattimiehet ymmärtävät, että tämän keksinnön selityksen valossa sen tiettyihin nimenomaisiin esimerkkeinä esitettyihin sovellutusmuotoihin voi-' ··', 25 daan tehdä useita modifikaatioita ja muutoksia keksinnön aiotusta suojapiiristä poikkeamatta. Samanmerkityksisten kodonien vuoksi voidaan esimerkiksi perustana olevaa DNA-jaksoa muuttaa proteiinijaksoon vaikuttamatta. Lisäksi biologisten toiminnallisten vastaavuuksien perusteelta tar-30 kasteltuna proteiinirakenteeseen voidaan tehdä muutoksia • · .. vaikuttamatta näillä biologisen toiminnan laatuun tai mää rään. Kaikki tällaiset modifikaatiot on tarkoitettu kuulumaan tähän keksintöön liitettyjen patenttivaatimusten suo-japiiriin.

35 Seuraavat kirjallisuusviitteet on liitetty nimen omaisesti tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten 53 106844 nojalla siinä määrin, kuin ne tarjoavat esimerkkejä tässä keksinnössä esitettyjen työvaiheiden ja muiden yksityiskohtien lisäksi.

AdeIinan, et ai., DNA 2 (1983) 183 5 Bolivar, et ai., Gene 2 (1977) 95

Campagnari, et ai., Infect. Immun. 55 (1987) 882 - 7 Chang, et ai., Nature 375 (1978) 615

Consensus, Pediater. Infect. Dis. J. 8 (1989) S94 - S97

Crea, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 75 (1978) 5765 10 Eichenlaub, R., J. Bacteriol. 138 (1979) 559 - 566 EPO Appi. Pubi. No. 0036776 Ey, et ai., Immunochem 5 (1978) 429 - 436 Fiers, et ai., Nature 273 (1978) 113 Goeddel, et ai., Nature 281 (1979) 544 15 Goeddel, et ai. Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057

Goldblatt, et ai., Jrnl. Infect. Dis. 162 (1990) 1128 - 1135

Gulig, et ai., Infect. Immun. 55 (1987) 513 - 520 Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149 20 Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073 Holland, et ai., Biochemistry 17 (1978) 4900 Itakura, et ai., Science 198 (1977) 1056 Jones, Genetics 85 (1977) 12

Kimura, et ai., Infect. Immun. 50 (1986) 69 - 79 .··-- 25 Kimura, et ai., Infect. Immun. 47 (1985) 253 - 259

Kingsman, et ai., Gene 7 (1979) 141 Kyte, et ai., J. Mol. Biol. 157 (1982) 105 - 132.

Maniatis, et ai., Molecular cloning: a laboratory manual

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 30 (1982)

Messing, et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, toim. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)

Murphy, Pediat. Infect. Dis. J., 8 (1989) S75 - S77 35 Murphy, et al., Microb. Path., 6 (1989) 159 - 174 64 106844

Murphy, et ai., Am. Jrnl. Med., 88 (1990) 5A-41S-5A-45S

Patrick, et ai., Infect. Immun., 55 (1987) 2902 - 2911 Sanger, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467 5 Stinchcomb, et ai., Nature 282 (1979) 39

Tissue Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson, toim. (1973)

Tschemper, et ai., Gene 10 (1980) 157 • « • · • ·

Claims (30)

1. 55 106844
2. 1. Menetelmä antigeenikoostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää puhdistetun proteiini- tai peptidiantigeenin, 5 joka sisältää Moraxella catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-0MP:n kanssa immunologisesti ristireagoivan epitoopin, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: a) valikoidaan solut, jotka kykenevät ilmentämään sellaisen epitoopin sisältävää proteiini- tai peptidianti-10 geeniä, joka ristireagoi immunologisesti M. catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n kanssa; b) viljellään soluja antigeenin ilmentymisen mahdollistavissa olosuhteissa; c) kootaan antigeeni talteen koostumuksen valmis-15 tamiseksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeenissä ei ole olennaisesti M. catarrhaliksen muista antigeeneistä peräisin olevia antigeenisiä epitooppeja.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että antigeeni on tällaisen epitoopin sisältävä peptidi.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni käsittää 15 - 50 amino- i·.. 25 hapon suuruisen peptidin.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni käsittää 15 - 30 amino hapon suuruisen peptidin.
7. 6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että peptidiantigeeni sisältää M. catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n epitoopin.
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni käsittää M. catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n. se 106844
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut käsittävät M. catarrha-lis -solut.
10. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että solut käsittävät yhdistelmäisän- täsolut, jotka ilmentävät antigeeniä koodaavaa yhdistelmä - DNA- s egment t i ä .
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmäisäntäsolut käsittävät 10 bakteeri-isäntäsolut.
12. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että bakteeri-isäntäsolut käsittävät E. coli, H. influenzae, Salmonella, Mycobacterium tai Bacillus subtilis -solut.
13. 12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-segmentti koo-daa M. catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:tä tai näiden antigeenistä osafragmenttia.
14. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 20 nettu siitä, että se lisäksi käsittää sen, että antigeeni puhdistetaan menetelmällä, johon sisältyy M. catarrhaliksen ulkomembraanivesikkelien detergenttiuutto.
15. 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan rokotekoostumus, joka ·’·· 25 käsittää mainitun antigeenin yhdessä farmaseuttisesti hy väksyttävän kantaja-aineen, laimentimen tai adjuvantin kanssa.
16. 15. DNA-segmentti, tunnettu siitä, että se koodaa proteiini-tai peptidiantigeeniä, johon sisältyy Mo- 30 raxella catarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:n kanssa immunologisesti ristireagoiva epitooppi.
17. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-segmentti, tunnettu siitä, että se lisäksi rajoittuu Moraxella catarrhaliksen 30 kD-.n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:tä koodaavaan 35 segmenttiin. « 57 106844
18. 17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-segmentti, tunnettu siitä, että se lisäksi rajoittuu segmenttiin, joka koodaa tällaista epitooppia sisältävää peptidiä.
19. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen DNA-segmentti, 5 tunnettu siitä, että segmentin koodaama peptidi on 15 - 50 aminohapon suuruinen.
20. 19. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että siihen sisältyy patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-seg-mentti.
21. 20. Yhdistelmäisäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 15 mukaisen DNA-segment in.
22. 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että DNA-segmentti tuodaan soluun 15 yhdistelmä-vektorin avulla.
23. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että isäntäsolu kykenee ilmentämään antigeenin valmistamiseen tarkoitettua DNA-segmenttiä.
24. 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen isäntäsolu, 20 tunnettu siitä, että se lisäksi rajoittuu sellaiseen isäntäsoluun, joka kykenee ilmentämään Moraxella ca-tarrhaliksen 30 kD:n, 80 kD:n tai HMWP-OMP:tä.
25. 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että vasta-aine rajoittuu lisäksi . 25 isäntäsoluun, joka kykenee ilmentämään liiallisesti 80 kD OMPrtä suhteessa Moraxella catarrahlis -soluissa tapahtuvaan ilmentämiseen.
26. 25. Menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vasta-aine valmistetaan käyttäen im- 30 munogeeninä patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä antigeeniä. *. 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine.
27. 27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että valmistetaan monoklonaalinen vasta-aine, joka ristireagoi saman antigeenin kanssa kuin 58 106844 monoklonaalinen vasta-aine 10F3, jota tuottaa hybridooma, jonka talletusnumero on HB11092.
28. 28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan monoklonaalinen 5 vasta-aine, joka ristireagoi saman antigeenin kanssa kuin monoklonaalinen vasta-aine 17C7, jota tuottaa hybridooma, jonka talletusnumero on HB11093.
29. 29. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan monoklonaalinen 10 vasta-aine, joka ristireagoi saman antigeenin kanssa kuin monoklonaalinen vasta-aine 8B6, jota tuottaa hybridooma, jonka talletusnumero on HB11091.
30. 30. Patenttivaatimusten 25 tai 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan farmaseut-15 tinen koostumus, joka käsittää mainitun vasta-aineen yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen, laimenti-men tai adjuväntin kanssa. • · · > ·« > · t 59 106844