JPS61115025A - Ｂ細胞分化因子 - Google Patents
Ｂ細胞分化因子Info
- Publication number
- JPS61115025A JPS61115025A JP60025301A JP2530185A JPS61115025A JP S61115025 A JPS61115025 A JP S61115025A JP 60025301 A JP60025301 A JP 60025301A JP 2530185 A JP2530185 A JP 2530185A JP S61115025 A JPS61115025 A JP S61115025A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bcdf
- cells
- human
- cell
- differentiation factor
- Prior art date
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- Granted
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
この発明は、人について活性を有するＢ細胞分化因子（
以下ｒＢｃＤＦＪと記す）蛋白標品に関する。
以下ｒＢｃＤＦＪと記す）蛋白標品に関する。
抗原刺激を受は活性化された成熟Ｂ細胞は、Ｔ細胞の助
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。この物質の存在はＲ，Ｗ、 Ｄｕｔｔｏｎら、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、 Ｒｅｖ、 ２３６６ （
１９７５） 、 Ａ、 Ｓｃｈｉｍｐｌと Ｅ、 Ｗｅ
ｃｋｅｒ ら、ＮａｔｕｒｅＮ、 Ｂｉｏｌ、 ２３７
．１５ （１９７２） 、により明らかにされた。彼ら
はマウスのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗
原やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培
養上清中に存在する物質が、マウスのＴ細胞を除去され
たリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球のヒ
ツジ赤血球（Ｓ ＲＢ Ｃ）に対する１次免疫応答を増
幅させることを見出し、そのような作用を有する活性物
質にＴリンパ球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を
与えた。それ以来ＴＲＦは、Ｂ細胞に作用し、Ｂ細胞の
分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を
誘導する液性因子であると定義されている。
けにより分裂増殖するが、さらにＢ細胞が抗体産生細胞
にまで最終的に分化するには、１種またはそれ以上のＴ
細胞由来の分化誘導性の物質が必須であることが知られ
ている。この物質の存在はＲ，Ｗ、 Ｄｕｔｔｏｎら、
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、 Ｒｅｖ、 ２３６６ （
１９７５） 、 Ａ、 Ｓｃｈｉｍｐｌと Ｅ、 Ｗｅ
ｃｋｅｒ ら、ＮａｔｕｒｅＮ、 Ｂｉｏｌ、 ２３７
．１５ （１９７２） 、により明らかにされた。彼ら
はマウスのリンパ球混合物培養後の培養上清中または抗
原やマイトゲンにより刺激を受けたマウスのリンパ球培
養上清中に存在する物質が、マウスのＴ細胞を除去され
たリンパ球細胞集団やヌードマウス由来のリンパ球のヒ
ツジ赤血球（Ｓ ＲＢ Ｃ）に対する１次免疫応答を増
幅させることを見出し、そのような作用を有する活性物
質にＴリンパ球代替因子、すなわちＴＲＦという呼称を
与えた。それ以来ＴＲＦは、Ｂ細胞に作用し、Ｂ細胞の
分裂増殖を誘導せず、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化を
誘導する液性因子であると定義されている。
その後、このようなり細胞分化因子の存在を示す証拠が
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
蓄積されており、人においてもマウス同様の分化因子の
存在が示唆されている。現在では上述のように定義され
たＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させる因子をＢＣＤＦと
総称するようになった。
このようにＢＣＤＦは人の体内でＢ細胞の抗体産生機能
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り“、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤ
Ｆのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に
用いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への
応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にとも
なうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣ
ＤＦ単独または他のリンホカインと共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。
に重要な働きをしている。ＢＣＤＦの臨床への応用は大
別して３つ考えられる。第１はＢＣＤＦによりＢＣＤＦ
抗体を作り“、ＢＣＤＦと抗ＢＣＤＦ抗体によるＢＣＤ
Ｆのイムノアッセイ系を用いて免疫学的な病態の解析に
用いることが出来る。第２の応用は各種疾患の治療への
応用である。例えば、Ｔ細胞のヘルパー機能低下にとも
なうＢ細胞抗体産生能低下による免疫不全症患者にＢＣ
ＤＦ単独または他のリンホカインと共に投与することに
より抗体産生機能を正常に戻すことが考えられる。
さらにＢＣＤＦの応用として次のことが考えられる。Ｂ
細胞増殖因子（Ｂ ＣＧ Ｉ” ） （Ｋ、 Ｙｏｓｈ
ｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｆ Ｌｎｎ＋ｕｎｏ１．１３０
．１２４１（１９８３）） 、その他のリンホカインを
含むＴ細胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を
長期培養できることが報告されている（ Ｂ、 ５ｒｅ
ｄｎｉら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
細胞増殖因子（Ｂ ＣＧ Ｉ” ） （Ｋ、 Ｙｏｓｈ
ｉｚａｋｉら、Ｊ、 ｏｆ Ｌｎｎ＋ｕｎｏ１．１３０
．１２４１（１９８３）） 、その他のリンホカインを
含むＴ細胞因子を培地に加えることにより正常Ｂ細胞を
長期培養できることが報告されている（ Ｂ、 ５ｒｅ
ｄｎｉら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
１５４．１５００ （１９８１）参照）。これらの培
養正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細
胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることによ
り生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体
、例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞
などの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ
細胞をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞または
ＥＢウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他の
リンホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。
養正常Ｂ細胞あるいはＥＢウィルスで形質転換したＢ細
胞に対し、適当な時期にＢＣＤＦを作用させることによ
り生体外で抗体を産生させることが出来る。特定の抗体
、例えば、病原細菌、病原ウィルス、病原原虫、癌細胞
などの表面にある特定抗原を認識する抗体を産生ずるＢ
細胞をモノクローン化し、クローン化正常Ｂ細胞または
ＥＢウィルスで形質転換した細胞をＢＣＤＦとその他の
リンホカインを組合せて培養し、有用なモノクローナル
抗体を産生させることが出来る。これら抗体は感染症や
癌の治療および診断に利用できる。
従来ＢＣＤＦを得るには、人末梢血などより分離した正
常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激するごとによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。
常人Ｔ細胞をマイトゲン刺激するごとによりＢＣＤＦを
産生させる方法が採られてきた。
この方法では、Ｔ細胞を十分得ることが困デにである点
、マイトゲンを用いたため、ＢＣＤＦに有害なマイトゲ
ンが混入し、これを除去するのが困難である点、またＴ
細胞培養にはウシ胎児血清など血清成分を培地に添加す
る必要があり、これら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分
分離することが出来ず、、ＢＣＤＦを医療に用いるには
、純化ＢＣＤＦが得られぬことが障害となっている点な
ど問題が多く、工業的にＢＣＤＦを産生することは出来
なかった。また人Ｔ細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ
融合細胞を得、これによりＢＣＤＦを産生せしめる方法
も報告されている（ ０ｋａｄａら、Ｊ、 ＩＥｘｐ。
、マイトゲンを用いたため、ＢＣＤＦに有害なマイトゲ
ンが混入し、これを除去するのが困難である点、またＴ
細胞培養にはウシ胎児血清など血清成分を培地に添加す
る必要があり、これら添加タンパク質とＢＣＤＦを十分
分離することが出来ず、、ＢＣＤＦを医療に用いるには
、純化ＢＣＤＦが得られぬことが障害となっている点な
ど問題が多く、工業的にＢＣＤＦを産生することは出来
なかった。また人Ｔ細胞を人癌細胞と細胞融合して人Ｔ
融合細胞を得、これによりＢＣＤＦを産生せしめる方法
も報告されている（ ０ｋａｄａら、Ｊ、 ＩＥｘｐ。
Ｍｏｄ、、１５７，５８３ （１９８３））、しかし
、人融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低下して
ゆくことが多く、実用的ＢＣＤＦ産住人融合細胞は未だ
ない。
、人融合細胞は継代中、リンホカイン産生能が低下して
ゆくことが多く、実用的ＢＣＤＦ産住人融合細胞は未だ
ない。
従ってこの発明の目的は、ＢＣＤＦを含有する蛋白標品
を提供することにある。
を提供することにある。
本発明者らは１人Ｔ細胞白血病ウィルス（以下［ＨＴＬ
ＶＪと記ず）により形質転換された人１゛細胞が高い効
率でＢＣＤＦを生産するごとを見い出した。ｒ！１１ち
、この発明は、ＨＴＬ Ｖにより形質転換された人Ｔ細
胞より生産され、後記する性質を有するＢ細胞分化因子
を含有し、Ｂ細胞分化因子活性が５×１０４車位／ｍｐ
以−にである蛋白標品である。
ＶＪと記ず）により形質転換された人１゛細胞が高い効
率でＢＣＤＦを生産するごとを見い出した。ｒ！１１ち
、この発明は、ＨＴＬ Ｖにより形質転換された人Ｔ細
胞より生産され、後記する性質を有するＢ細胞分化因子
を含有し、Ｂ細胞分化因子活性が５×１０４車位／ｍｐ
以−にである蛋白標品である。
人ＢＣＤＦ産生人Ｔ細胞株の作製は以下のように行なう
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・駅帯血などよりフィ
ルコールバ、りなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ
球を分離し、Ｎ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ。
ことが出来る。人の末梢血・扁桃・駅帯血などよりフィ
ルコールバ、りなどを用いた密度勾配遠心法等でリンパ
球を分離し、Ｎ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ。
５ｃｉｅｎｃｅ ２１７，７３７ （１９８２）の方
法に【′！ζじてＨＴ Ｌ Ｖを用いて人Ｔ細胞を形質
転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下記
の方法を用いることができる。ウィルス産生細胞株ＭＴ
−２をＸ線照射（１２０００〜Ｌ４ＱＯＯラド）で不活
化した細胞ｌＸｌＯ７／ｍ７！と、上述のようにして得
た人リンパ球１×１０１／ｍ７！を２０％ＦＣ３，１０
０μｇ／ｍｎカナマイシン、２ μｇ ／ ｍ Ｉ
ＮａｆｌＣＯｓ、２５ｍＭ Ｎ −２ｈｙｄｒｏｘｙｅ
ｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ ’ −２−ｅｔ
ｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含む
ＲＰＭ１１６４０培地を入れたプラスチックシャーレ（
ファルコン＃３００８）に接種し５％ ＣＯ□ 存在下
３７゛Ｃで培養する。１週間に２回、半分の培地を新鮮
な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミケイン
グダイ゛ツユージョン法により株化する。株化した細胞
の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性を有
する株を得る。
法に【′！ζじてＨＴ Ｌ Ｖを用いて人Ｔ細胞を形質
転換（トランスフォーメーション）する。たとえば下記
の方法を用いることができる。ウィルス産生細胞株ＭＴ
−２をＸ線照射（１２０００〜Ｌ４ＱＯＯラド）で不活
化した細胞ｌＸｌＯ７／ｍ７！と、上述のようにして得
た人リンパ球１×１０１／ｍ７！を２０％ＦＣ３，１０
０μｇ／ｍｎカナマイシン、２ μｇ ／ ｍ Ｉ
ＮａｆｌＣＯｓ、２５ｍＭ Ｎ −２ｈｙｄｒｏｘｙｅ
ｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ ’ −２−ｅｔ
ｈａｎｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）を含む
ＲＰＭ１１６４０培地を入れたプラスチックシャーレ（
ファルコン＃３００８）に接種し５％ ＣＯ□ 存在下
３７゛Ｃで培養する。１週間に２回、半分の培地を新鮮
な培地と交換しつつ２〜３力月培養した後、リミケイン
グダイ゛ツユージョン法により株化する。株化した細胞
の培養上清のＢＣＤＦ活性を測定し、ＢＣＤＦ活性を有
する株を得る。
この方法により株化した細胞としてたとえばＶ Ｔ −
１と標識された人工細胞株を用いることが出来る。Ｖ
Ｔ−’１を増殖させるための特別な条件はなく、一般に
用いられている培養条件を適宜採用して行なえはよい。
１と標識された人工細胞株を用いることが出来る。Ｖ
Ｔ−’１を増殖させるための特別な条件はなく、一般に
用いられている培養条件を適宜採用して行なえはよい。
また− ＢＣＤＦの産生も一般的な方法で行なえばよい
が、好ましくはタンパク質を含まない培地を用いて行な
うへきである。
が、好ましくはタンパク質を含まない培地を用いて行な
うへきである。
以下に、ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを製造する方法の１
例を示す。
例を示す。
ＶＴ−１を増殖させるのに好適な条件、たとえはウシ胎
児血清（Ｆｅ２）を含む培地にてｖ ＝ｒ −１を培養
し、ＶＴ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄し
てＢＣＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦｅ２などのタ
ンパク質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培
養することにより夾雑タンパク質の少ないＢＣＤＦを得
ることができる。
児血清（Ｆｅ２）を含む培地にてｖ ＝ｒ −１を培養
し、ＶＴ−１の細胞数を増やした後、細胞を分離洗浄し
てＢＣＤＦ産生に最適な条件、たとえばＦｅ２などのタ
ンパク質を含まぬ完全合成培地に細胞を移し、さらに培
養することにより夾雑タンパク質の少ないＢＣＤＦを得
ることができる。
ＶＴ’−１を培養するのに用いる培地の主成分は市販の
培地でよい。例えばＲｐＭｚ６４ｏｉａ地、改良イーグ
ル培地（ＭＥＭ）、ダルヘノコ改良イーグル培地（Ｄ
Ｍ Ｅ Ｍ ）またはクリック培地でよい。これらの培
地に対する添加物としてｉ）１ｍ＆当り約２０〜２５０
単位、理碧、的には１ｍｆｆ当り約１００拳位のペニシ
リン、ｉｉ）１ｍβ当り１，１１ｇ ＝ ｌ ＯＯμｇ
、理想的には１ｍＡ当り１０μｇのゲンタマイシン、ｉ
ｉｉ）１ｍ６当り２０〜２５０μｇ、理想的には１００
μｇのストレプトマイシン、ｉｖ）１ｍｆｆ当り約１０
０〜１０００ ｔｔ ｇ、理想的には１ｍ＋２当り約３
００μｇの新鮮Ｌ−グルタミノ、ｖ）１０〜’６０ｍＭ
、理想的には２５ｍＭのヘペス緩衝液、ｖｌ）８〜２０
ｍＭ、理想的には１６ｒｎＭのＮａ１（Ｃｏ３− ｖｉ
ｉ） ５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−６Ｍ、理想的
には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールなどを
必要に応じて用いることか出来る。
培地でよい。例えばＲｐＭｚ６４ｏｉａ地、改良イーグ
ル培地（ＭＥＭ）、ダルヘノコ改良イーグル培地（Ｄ
Ｍ Ｅ Ｍ ）またはクリック培地でよい。これらの培
地に対する添加物としてｉ）１ｍ＆当り約２０〜２５０
単位、理碧、的には１ｍｆｆ当り約１００拳位のペニシ
リン、ｉｉ）１ｍβ当り１，１１ｇ ＝ ｌ ＯＯμｇ
、理想的には１ｍＡ当り１０μｇのゲンタマイシン、ｉ
ｉｉ）１ｍ６当り２０〜２５０μｇ、理想的には１００
μｇのストレプトマイシン、ｉｖ）１ｍｆｆ当り約１０
０〜１０００ ｔｔ ｇ、理想的には１ｍ＋２当り約３
００μｇの新鮮Ｌ−グルタミノ、ｖ）１０〜’６０ｍＭ
、理想的には２５ｍＭのヘペス緩衝液、ｖｌ）８〜２０
ｍＭ、理想的には１６ｒｎＭのＮａ１（Ｃｏ３− ｖｉ
ｉ） ５ Ｘ １０−’〜５ Ｘ １０−６Ｍ、理想的
には５Ｘ１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールなどを
必要に応じて用いることか出来る。
ＶＴ−１の細胞数を増やすのに最適な培地として、たと
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦｅ２を添加した培地を用いる。
えば上述の培地にさらに１〜３０％、好ましくは２０％
のＦｅ２を添加した培地を用いる。
Ｂ ＣＤ Ｉパ産生のための最適な培地としては、Ｆｅ
８を添加しない上述の培地でよい。Ｆｅ２を添加しない
完全合成培地中で４８時間培養後もＶＴ−１の生存率は
７０％以上が保持されている。
８を添加しない上述の培地でよい。Ｆｅ２を添加しない
完全合成培地中で４８時間培養後もＶＴ−１の生存率は
７０％以上が保持されている。
Ｔ細胞よりＢＣＤＦを生産する場合、従来は培地にＦｅ
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（、Ｔ、 Ｔｅｒａｎｉ
ｓｈｉら１．■、 ｎｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２
Ｂ。
２のようなタンパク質を添加したり、マイトゲンを添加
したりすることが必須であった（、Ｔ、 Ｔｅｒａｎｉ
ｓｈｉら１．■、 ｎｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １２
Ｂ。
１９０３ （１’９８２）、Δ、 Ｍｕｒａｇｕｃｈ
ｉら、Ｊ、 ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、 １２７． ４１
２ （１９８１）参照）。
ｉら、Ｊ、 ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、 １２７． ４１
２ （１９８１）参照）。
これに対してＶＴ−１を使用して１３ ＣＤ Ｆを生産
する場合、培地にＦｅ２のような血清、血液中のタンパ
ク質成分、その他タンパク質成分を加える必要がなく、
また通常用いられているＴ細胞またはＢ細胞に対するマ
イトゲンも加える必要がないことは特筆に値する。その
ため高価なＦｅ２を用いないで安価にＢＣＤＦを生産す
ることが出来るばかりでなく、人体に有害な異種タンパ
ク質やマイトチ゛ンを含まない安全なりＣＤＦを容易に
得ることか出来る。
する場合、培地にＦｅ２のような血清、血液中のタンパ
ク質成分、その他タンパク質成分を加える必要がなく、
また通常用いられているＴ細胞またはＢ細胞に対するマ
イトゲンも加える必要がないことは特筆に値する。その
ため高価なＦｅ２を用いないで安価にＢＣＤＦを生産す
ることが出来るばかりでなく、人体に有害な異種タンパ
ク質やマイトチ゛ンを含まない安全なりＣＤＦを容易に
得ることか出来る。
ＶＴ−１を用いてＢＣＤＦを生産する上記方法は種々の
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１０
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に（”１＝Ｊｉずへ
きである。また、理想的には培地のｐＨは約７，０〜７
．４と僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。
環境的条件で行なわれる。しかし、好ましくはＶＴ−１
培養物は約３５〜３８℃の温度範囲において約５〜１０
％の炭酸ガスを含む湿度調節空気中に（”１＝Ｊｉずへ
きである。また、理想的には培地のｐＨは約７，０〜７
．４と僅かにアルカリ性の条件下に保持すべきである。
ＶＴ−１は平底ミクロプレーしなど種々のタイプの培−
俣器」二１００μ！単位などの種々の容量で接種される
。ファルコン・ラフウェア・ディライジョン、ヘクトン
・ディッキンソン・エンド・コーポレーション（Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ、 Ｂｅｃｔ
ｏｎ、 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄＣｏ、 ）か
ら市販されているフラスコＮｏ、３０１３または３０２
５のような組織培養フラスコも使用できる。別法として
上記ファルコン・ラブウェアから市販されているボトル
Ｎａ３０２７のような回転びんち培養容器として使用で
きる。
俣器」二１００μ！単位などの種々の容量で接種される
。ファルコン・ラフウェア・ディライジョン、ヘクトン
・ディッキンソン・エンド・コーポレーション（Ｆａｌ
ｃｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、 Ｄｉｖ、 Ｂｅｃｔ
ｏｎ、 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄＣｏ、 ）か
ら市販されているフラスコＮｏ、３０１３または３０２
５のような組織培養フラスコも使用できる。別法として
上記ファルコン・ラブウェアから市販されているボトル
Ｎａ３０２７のような回転びんち培養容器として使用で
きる。
ＶＴ−１を培養して細胞数を増やすための最適条件とし
て、細胞の当初密度は培地１ｍｌあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５ＸｌＯＳ細胞、好ましくは２×１０４細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｍｌ当り５×１０’細胞から２×１０４細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地１ｍ１当りｌ Ｘ １０’〜５Ｘ１０ｓ細胞にま
で細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにして
目的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後
、細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含ま
ぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種
する。この時の細胞の当初密度は培地１ｍ６あたり約Ｉ
Ｘ ｌ Ｏ’細胞ないしｌ×１０７細胞であることか
好ましく、理想的には培地１ ｍ ７！あたりｌ Ｘ
ｌ ０６細胞である。
て、細胞の当初密度は培地１ｍｌあたりｌＸｌ０’細胞
ないし５ＸｌＯＳ細胞、好ましくは２×１０４細胞であ
る。上述の条件でＶＴ−１を培養すると、通常２〜７日
で培地１ｍｌ当り５×１０’細胞から２×１０４細胞程
度まで細胞密度が増加するので、再び新しい培地を加え
て培地１ｍ１当りｌ Ｘ １０’〜５Ｘ１０ｓ細胞にま
で細胞密度を下げ、再び培養を続ける。このようにして
目的とする細胞数になるまでＶＴ−１の培養を続けた後
、細胞を遠心分離等で分離し、細胞をタンパク質を含ま
ぬ完全合成培地で洗ってから新しい完全合成培地に接種
する。この時の細胞の当初密度は培地１ｍ６あたり約Ｉ
Ｘ ｌ Ｏ’細胞ないしｌ×１０７細胞であることか
好ましく、理想的には培地１ ｍ ７！あたりｌ Ｘ
ｌ ０６細胞である。
ＶＴ−１を培養することによって生産される１３ Ｃ，
Ｄ Ｆ ７は経時的に変化ずろ。例えｊ、Ｌｌ ｎｌρ
ｄｉすｔｘｉｏ６初発細胞密度でＶＴ−１をＲＰ Ｍ
１１６４０培地（１ｍｅ当りベニシ゛ＪンＬ ＯＯ、ｉ
Ｐ−位、ストレプトマイシン１００ ｐ ｇ 、ケンタ
マイノン１ｏｔｔｇ８よびＮａＨＣＯ３１６μ＼／ｌを
含し・）て培養すると、Ｂ ＣＤ Ｆ活性は４８時間後
にビークレバ・ルに達する。さらに、次の２４時間に存
在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このようにＲＰ
ＭＩ１６４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産する至
適培養時間は約２・１〜７８時間である。
Ｄ Ｆ ７は経時的に変化ずろ。例えｊ、Ｌｌ ｎｌρ
ｄｉすｔｘｉｏ６初発細胞密度でＶＴ−１をＲＰ Ｍ
１１６４０培地（１ｍｅ当りベニシ゛ＪンＬ ＯＯ、ｉ
Ｐ−位、ストレプトマイシン１００ ｐ ｇ 、ケンタ
マイノン１ｏｔｔｇ８よびＮａＨＣＯ３１６μ＼／ｌを
含し・）て培養すると、Ｂ ＣＤ Ｆ活性は４８時間後
にビークレバ・ルに達する。さらに、次の２４時間に存
在するＢＣＤＦ活性は僅かに減少する。このようにＲＰ
ＭＩ１６４０培地中のＶＴ−１でＢＣＤＦを生産する至
適培養時間は約２・１〜７８時間である。
ＢＣＤＦの精製
ＢＣＤＦは塩析、真空透析、限外濾過、ケル濾過クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清からａ
縮して精製できる（実施例１参照）。
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、クロマトフオーカシング
、逆相クロマトグラフィー、焦点電気泳動およびゲル電
気泳動等の種々の方法によって上述の培養物上清からａ
縮して精製できる（実施例１参照）。
ＢＣＤＦの物理化学的性質
上述の方法でＶＴ−１より生産されるＢＣ，ＤＦは以下
の性質を有する。
の性質を有する。
（１１分子量
前もってＰＢＳで平衡化したＡｃＡ ３４カラム（Ｌ
ＫＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦを含
む、濃縮されたＶＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出
すると、分子量３．５±０．５ｘｌＯ’ダルトンに対応
する位置にＢＣＤＦが溶出する。上述の方法で精製した
ＢＣＤＦを上述の方法でＨＰＬＣ用ＴＳＫ−２０００Ｓ
ＷＧ（東洋ソーダー）を用いてゲル濾過すると、分子量
３．５±０．５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣ
ＤＦ’が溶出する。又５ＤＳ−ＰＡＧＥ （ＳＤＳ・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）にて泳動すると２．２
±０．２×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが
溶出される。
ＫＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 Ｓｗｅｄ、）にＢＣＤＦを含
む、濃縮されたＶＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出
すると、分子量３．５±０．５ｘｌＯ’ダルトンに対応
する位置にＢＣＤＦが溶出する。上述の方法で精製した
ＢＣＤＦを上述の方法でＨＰＬＣ用ＴＳＫ−２０００Ｓ
ＷＧ（東洋ソーダー）を用いてゲル濾過すると、分子量
３．５±０．５×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣ
ＤＦ’が溶出する。又５ＤＳ−ＰＡＧＥ （ＳＤＳ・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）にて泳動すると２．２
±０．２×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦが
溶出される。
（２）等電点
前述の方法でＶＴ−１より得た＋３ ＣＤ Ｆを含む培
養液を限外濾過により濃縮し、ＡＣＡ ３４カラムに
より分離精製したＢＣＤＦをｐ Ｉ−ｉ ７〜４の範囲
テファルマシマＭｏｎｏ Ｐカラムを用いてクロマト
フオーカシングを行なうと、ｐ ｌ−１ｌＬ ９〜５．
１の位置にＢ ＣＤ Ｆが溶出する。これよりＢ ＣＤ
Ｆの等電点はｐ Ｈ４，９〜５．１と推定される。
養液を限外濾過により濃縮し、ＡＣＡ ３４カラムに
より分離精製したＢＣＤＦをｐ Ｉ−ｉ ７〜４の範囲
テファルマシマＭｏｎｏ Ｐカラムを用いてクロマト
フオーカシングを行なうと、ｐ ｌ−１ｌＬ ９〜５．
１の位置にＢ ＣＤ Ｆが溶出する。これよりＢ ＣＤ
Ｆの等電点はｐ Ｈ４，９〜５．１と推定される。
（３）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ 、Ｇｌｕ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ１ａ ＢＣＤＦＣＤ側定法 人ＢＣＤＦに反応してｒｇｃを産生ずる人Ｂ細胞を朱Ｃ
Ｅ Ｓ Ｓ （Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ ら
、 、Ｊ、 ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋１３２．
２９４８ （１９８４））を用いてＢＣＤＦ活性を測
定した。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６ＸＩＯ’（固
のＣＥＳＳを２００ ｐ ｅ ）ｌ Ｏ％ＦＣ５を含む
ＲＰＭ ［１６４ｏ培地（］ｍρ当りブーシリン１００
単位、ストレプトマ・イシ７１００μｇ、ゲンタマイシ
ン１０μｇおよびＮａＨＣＯ＋１６ｍＭを含む）に入れ
る。この混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、
５％ ＣＯ２存在下、３７゛Ｃで培養し、培養上清のＩ
ｇＧ量を酵素免疫測定法により、測定する。この条件に
おいて最大のＩｇＧ生産量（最高のｃＥｓｓの反応）の
５０％を示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍ＃とじた。
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ１ａ ＢＣＤＦＣＤ側定法 人ＢＣＤＦに反応してｒｇｃを産生ずる人Ｂ細胞を朱Ｃ
Ｅ Ｓ Ｓ （Ｋ、 Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ ら
、 、Ｊ、 ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋１３２．
２９４８ （１９８４））を用いてＢＣＤＦ活性を測
定した。ＢＣＤＦ活性を測定する検液と６ＸＩＯ’（固
のＣＥＳＳを２００ ｐ ｅ ）ｌ Ｏ％ＦＣ５を含む
ＲＰＭ ［１６４ｏ培地（］ｍρ当りブーシリン１００
単位、ストレプトマ・イシ７１００μｇ、ゲンタマイシ
ン１０μｇおよびＮａＨＣＯ＋１６ｍＭを含む）に入れ
る。この混合物を９６穴マイクロプレート中で３日間、
５％ ＣＯ２存在下、３７゛Ｃで培養し、培養上清のＩ
ｇＧ量を酵素免疫測定法により、測定する。この条件に
おいて最大のＩｇＧ生産量（最高のｃＥｓｓの反応）の
５０％を示すＢＣＤＦの活性をＩＵ／ｍ＃とじた。
一力、本発明におけるＨ Ｔ Ｌ Ｖを′「細胞に感染
させるごとにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前
述のＢＣＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中
に産生ずる点、この細胞株は紙代培養が出来、継代中に
ＢＣＤＦ産生能力が低下することがない点、又、この細
胞株は、蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、
マイトーゲンのような刺激剤をまったく加えることなく
ＢＣＤＦを産生じ、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、
比較的容易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる
点などの特徴をもち、本発明によりはしめて人ＢＣＤＦ
の工業的生産が可能となった。
させるごとにより得た形質転換された人Ｔ細胞株は、前
述のＢＣＤＦ産生方法に比べ、大量のＢＣＤＦを培地中
に産生ずる点、この細胞株は紙代培養が出来、継代中に
ＢＣＤＦ産生能力が低下することがない点、又、この細
胞株は、蛋白質をまったく含まない完全合成培地中で、
マイトーゲンのような刺激剤をまったく加えることなく
ＢＣＤＦを産生じ、混入蛋白質の少ないＢＣＤＦを得、
比較的容易な精製方法で、純化したＢＣＤＦを得られる
点などの特徴をもち、本発明によりはしめて人ＢＣＤＦ
の工業的生産が可能となった。
実施例１
（Ｌ）ＶＴ−１によるＢＣＤＦの製造
２１容プラス千ツクローラー培養器（ファルコン＃３０
２７） （以下ローラーと称する）中のｌβの２０％
ＦＣ５含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５ ｘ １０−５Ｍ ２ＭＥ、１００単位／ ｍ ｆ
＋、ペニシリン、１００μｇ ／ ｍ Ｑストレプトマ
イシン、２０ ｐ ｇ／−ｍ ｅゲンタマイシン、１６
ｍ Ｍ Ｎａ１ｌＣＯｚを含有）に２ＸＩＯ’／ｍｊ
２細胞数にＶＴ−１を接種し、ａ ｒｐｔｎで回転させ
つつ３日間、３７℃で培養した。培養後、培養物を遠心
分離して細胞を集めＲＰＭＩ１６４０培地で２回細胞を
洗った後、細胞を２１容ローラー中１１のＲＰＭ１１６
４０培地にＩＸＬＱ６／ｍｆｆ細胞濃度に懸濁した。ロ
ーラーを３ ｒｐｍで回転させつつ２日間、３７°Ｃで
培養する。培養後培養物を遠心分離して、培養上清を得
た。
２７） （以下ローラーと称する）中のｌβの２０％
ＦＣ５含有ＲＰＭ１１６４０培地（２ｍＭグルタミン、
５ ｘ １０−５Ｍ ２ＭＥ、１００単位／ ｍ ｆ
＋、ペニシリン、１００μｇ ／ ｍ Ｑストレプトマ
イシン、２０ ｐ ｇ／−ｍ ｅゲンタマイシン、１６
ｍ Ｍ Ｎａ１ｌＣＯｚを含有）に２ＸＩＯ’／ｍｊ
２細胞数にＶＴ−１を接種し、ａ ｒｐｔｎで回転させ
つつ３日間、３７℃で培養した。培養後、培養物を遠心
分離して細胞を集めＲＰＭＩ１６４０培地で２回細胞を
洗った後、細胞を２１容ローラー中１１のＲＰＭ１１６
４０培地にＩＸＬＱ６／ｍｆｆ細胞濃度に懸濁した。ロ
ーラーを３ ｒｐｍで回転させつつ２日間、３７°Ｃで
培養する。培養後培養物を遠心分離して、培養上清を得
た。
上述のように、ＶＴ−１を培養して得たＢ ＣＤ Ｉ”
を含む培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。
を含む培養上清よりＢＣＤＦを以下の方法で精製した。
無細胞上清１０ｆｆを限外濾過膜（アミコンＹＭ−１０
、アミコン・コーポレーション、マサチューセノツ、Ｉ
ｊＳＡ）を装着した限外濾過装置（アミコン大量、処理
用セル２０００型、アミコン・コーポレーション、マサ
チューセ７ツ、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより、ｉ
’ｋｇ ／ ｃＩ（の圧力をかけ濾過した。濾過膜上部
に残った１００ｍ／のＲ前液をさらに限外濾過膜（アミ
コンＹＭ−１０）を装着した限外濾過装置（アミコン、
スタンダードセル５２型）を用い窒素ガスにより４ ｋ
ｇ／ ｃｍの圧力をかけて濾過した。ｄコ過股上部に残
った５ ｍ ＩＩの濃縮液を採取した。
、アミコン・コーポレーション、マサチューセノツ、Ｉ
ｊＳＡ）を装着した限外濾過装置（アミコン大量、処理
用セル２０００型、アミコン・コーポレーション、マサ
チューセ７ツ、ＵＳＡ）を用いて窒素ガスにより、ｉ
’ｋｇ ／ ｃＩ（の圧力をかけ濾過した。濾過膜上部
に残った１００ｍ／のＲ前液をさらに限外濾過膜（アミ
コンＹＭ−１０）を装着した限外濾過装置（アミコン、
スタンダードセル５２型）を用い窒素ガスにより４ ｋ
ｇ／ ｃｍの圧力をかけて濾過した。ｄコ過股上部に残
った５ ｍ ＩＩの濃縮液を採取した。
上述の濃縮した上清をＡｃΔ−３４ゲル′濾過カラム（
１，ＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、 Ｓｗｅｄｅｎ、 ２．
６ Ｘ ９０’ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラ
ムはあらかじめＰＢＳ ｌ：ホスフェート・ハッファ
ーセイライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフ
ェート・ハソＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を
有する分画は分子、Ｈ（３，ｓ±０．５Ｘｌ’Ｏ’ダル
トンに相当するフラクションにＢＣＤＦが含まれている
ことがわかった。ケル濾過カラムは次の分子量マーカー
で検定した。ブルーデキストラン２０００（ファルマシ
ア・ファインケミカルス、スウェーデン）２×１０４、
フェリチン４．５ＸｌＯ″、アルドラーゼ１．５８×１
０４、オフアルブミン４．５×１０４、キモトリプンノ
ーゲン２．５ＸＩＯ’、チトクロームＣ１，１７ｘｌＯ
’また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾過
■９．（アミコンＹＭ−’１０）を装置した限外ｄこ過
装置を用いて２５’ｍＭピペラジンー塩酸緩衝液（ｐＨ
６，３）に置換した。
１，ＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｅｒ、 Ｓｗｅｄｅｎ、 ２．
６ Ｘ ９０’ｃｍ）で処理した。なお、ゲル濾過カラ
ムはあらかじめＰＢＳ ｌ：ホスフェート・ハッファ
ーセイライン、０．１５Ｍ食塩を含む０．０１Ｍホスフ
ェート・ハソＢＣＤＦ活性を測定した。ＢＣＤＦ活性を
有する分画は分子、Ｈ（３，ｓ±０．５Ｘｌ’Ｏ’ダル
トンに相当するフラクションにＢＣＤＦが含まれている
ことがわかった。ケル濾過カラムは次の分子量マーカー
で検定した。ブルーデキストラン２０００（ファルマシ
ア・ファインケミカルス、スウェーデン）２×１０４、
フェリチン４．５ＸｌＯ″、アルドラーゼ１．５８×１
０４、オフアルブミン４．５×１０４、キモトリプンノ
ーゲン２．５ＸＩＯ’、チトクロームＣ１，１７ｘｌＯ
’また、ＢＣＤＦを含むフラクションを集め、限外濾過
■９．（アミコンＹＭ−’１０）を装置した限外ｄこ過
装置を用いて２５’ｍＭピペラジンー塩酸緩衝液（ｐＨ
６，３）に置換した。
クロマトフＡ・−力シング
ＡＣＡ３４カラムクロマトクラフィーで分画されたＢＣ
ＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液
（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎ。
ＤＦ画分をあらかじめ２５ｍＭピペラジン−塩酸緩衝液
（ｐＨ６，３）で平衡化したＭｏｎ。
Ｐカラム（ファルマシア・ファインケミカルス、スウェ
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０
ｍ１の１／１０希釈ポリバツフアー７４ （ファルマシ
ア・ファインケミカルス、スウェーデン）で？容出した
。カラム操作はファースト・プロティン・リキッド・ク
ロマ１−グラフィー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファイ
ンケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．
５ ｍ ｌで行なった。溶出液を１ｍｊ２ずつ分取し、
ＢＣＤＦ活性とｐＨを測定した。ＢＣＤＦ活性は１）Ｈ
４，９〜５．１の位置に溶出された。
ーデン）に通した。このカラムを２５ｍＭピペラジン−
塩酸緩液で洗った後、塩酸でｐＨ４，５に調製した４０
ｍ１の１／１０希釈ポリバツフアー７４ （ファルマシ
ア・ファインケミカルス、スウェーデン）で？容出した
。カラム操作はファースト・プロティン・リキッド・ク
ロマ１−グラフィー、ＦＰＬＣ（ファルマシア・ファイ
ンケミカルス、スウェーデン）を用い、流速は毎分０．
５ ｍ ｌで行なった。溶出液を１ｍｊ２ずつ分取し、
ＢＣＤＦ活性とｐＨを測定した。ＢＣＤＦ活性は１）Ｈ
４，９〜５．１の位置に溶出された。
Ｍｏｎｏ Ｐカラムより得たＢＣＤＦＣＤ側分を０．１
％ ＴＦＡ （１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラムＰ ｒ。
％ ＴＦＡ （１−リフルオロ酢酸水溶液）で緩衝化し
た逆相クロマトグラフィー用カラムＰ ｒ。
ＲＰＣＨＲ５／１０（ファルマシア・ファイン・ケミカ
ルズ）にかけ、溶出液、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニ
トリル濃度をＯから６０％まで直線的に増加させＢＣＤ
Ｆを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出され
る。Ｏ，Ｄ、 ｚｓ。のピークは他のｏ、 Ｄ、 ２
１１１１のピークとは完全に分離しており、このピーク
に対応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍
帖乾燥して精製Ｂ（、ＤＦを得た。
ルズ）にかけ、溶出液、０．１％ ＴＦＡ中のアセトニ
トリル濃度をＯから６０％まで直線的に増加させＢＣＤ
Ｆを溶出した。アセトニトリル５０〜５５％で溶出され
る。Ｏ，Ｄ、 ｚｓ。のピークは他のｏ、 Ｄ、 ２
１１１１のピークとは完全に分離しており、このピーク
に対応してＢＣＤＦ活性が検出された。このピークを凍
帖乾燥して精製Ｂ（、ＤＦを得た。
ＶＴ−１のＦＣ５無添加培養上清１．８βから精製した
ＢＣＦは、表１に示すごとく活性の回収率１８％で蛋白
量当りの活性は約ｉ、 ｏ ｏ ｏ倍に上がった。
ＢＣＦは、表１に示すごとく活性の回収率１８％で蛋白
量当りの活性は約ｉ、 ｏ ｏ ｏ倍に上がった。
表 １
（２）ＢＣＤＦ精製蛋白の性質
（１）分子量
前もってＰＢＳで平面化したＡｃＡ ３４カラム（Ｌ
ＫＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 ５ｈｅｄ、）にＢＣＤＦを含
む、濃縮されたＶＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出
したところ、分子量３．５±０．５×１０４ダルトンに
対応する位置にＢＣＤＦが溶出した。上述の方法で精製
したＢＣＤＦを上述の方法でｌ（Ｐ Ｌ Ｃ用ＴＳＫ−
２０００ＳＷＧ （東洋ソーダー）を用いてケル濾過し
たところ、分子量３．５±０．５Ｘ１０′ダルトンに対
応する位置にＢＣＤＦがＣ６出した。
ＫＢ、 Ｂｒｏｍｍａ、 ５ｈｅｄ、）にＢＣＤＦを含
む、濃縮されたＶＴ−１培養上清を流し、ＰＢＳで溶出
したところ、分子量３．５±０．５×１０４ダルトンに
対応する位置にＢＣＤＦが溶出した。上述の方法で精製
したＢＣＤＦを上述の方法でｌ（Ｐ Ｌ Ｃ用ＴＳＫ−
２０００ＳＷＧ （東洋ソーダー）を用いてケル濾過し
たところ、分子量３．５±０．５Ｘ１０′ダルトンに対
応する位置にＢＣＤＦがＣ６出した。
又５ＤＳ−ＰＡＧＥ （ＳＤＳ・ポリアクリルアミ
−ドゲル電気泳動法）にて泳動したところ、分子量２．
２±０．２×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦ
が溶出された。
−ドゲル電気泳動法）にて泳動したところ、分子量２．
２±０．２×１０４ダルトンに対応する位置にＢＣＤＦ
が溶出された。
（ｉｉ）等電点
前述の方法でＶＴ−１より得たＢＣＤＦを含む培養液を
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭｏ
ｎｏ Ｐカラムを用いてクロマトフオーカシングを行な
ったところ、ｐＨ４，９〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶
出した。これよりＲＣ叶の等電点はｐＨ４，９〜５．１
と推定される。
限外濾過により濃縮し、ＡｃＡ３４カラムにより分離精
製したＢＣＤＦをｐＨ７〜４の範囲でファルマシアＭｏ
ｎｏ Ｐカラムを用いてクロマトフオーカシングを行な
ったところ、ｐＨ４，９〜５．１の位置にＢＣＤＦが溶
出した。これよりＲＣ叶の等電点はｐＨ４，９〜５．１
と推定される。
（ｉｉｉ ）アミノ酸配列
ＢＣＤＦ蛋白のアミノ酸配列を決定するために６μｇの
精製ＢＣＤＦをプロティン・セクエンサ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、、 Ｃａ１ｆ、Ｍｏ
ｄｅｌ ４７０＾）に忠犬した。アミノ酸配列の決定方
法は１． Ｂｉｏｌ。
精製ＢＣＤＦをプロティン・セクエンサ−（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｃｏ、、 Ｃａ１ｆ、Ｍｏ
ｄｅｌ ４７０＾）に忠犬した。アミノ酸配列の決定方
法は１． Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、 １９３．２６５〜２７５ （１９５１）
に記載されている方法により行なった。
に記載されている方法により行なった。
Ｎ−末端からのアミノ酸配列は以下のとおりであった。
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ＧｌｕＡ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ≠Ｐ−
Ｔ （３）ＢＣＤＦの免疫学的性質 （ｉ）人末梢血よりＢ細胞を調製し、こ＋１．より−１
′ラスト化ＢＩ１１胞を分離した（’に、 Ｙｏｓｈｉ
ｚａｋｉら１，１゜ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
３２．２９４８（１９８４）参照）つすなわち、人Ｂ細
胞をパーコールのクラージエント（５０％〜７０％）中
で遠心分離（・ドＣ１４００Ｇ、１５分）し、パーコー
ルＰＢＳ：容液５０％〜５５％に存在する細胞層を分取
フッラスト化した低比重Ｂ細胞を集めた。
ｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｌａ≠Ｐ−
Ｔ （３）ＢＣＤＦの免疫学的性質 （ｉ）人末梢血よりＢ細胞を調製し、こ＋１．より−１
′ラスト化ＢＩ１１胞を分離した（’に、 Ｙｏｓｈｉ
ｚａｋｉら１，１゜ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
３２．２９４８（１９８４）参照）つすなわち、人Ｂ細
胞をパーコールのクラージエント（５０％〜７０％）中
で遠心分離（・ドＣ１４００Ｇ、１５分）し、パーコー
ルＰＢＳ：容液５０％〜５５％に存在する細胞層を分取
フッラスト化した低比重Ｂ細胞を集めた。
低比重Ｂｆ＋Ｉ胞を１ｍｇあｆコリ２Ｘ Ｉ Ｏ”６＋
”１０次こ９６穴プラスチノクマ、イクロプレート中Ｃ
”） ２１１ ｔｌμｌのＲ１）Ｍ！１６４０培地に）
ｕ／罰した。培地る二は１車位／ ｍ ｅのＢ ＣＤ
Ｉ”を含むＶＴ−１培頁」７清、１０％ＦＣ５，０，０
０２５％ＳＡＣ，１ｍｊ！あタリｉ ｏ ｏ ＜ｒ−位
のペニシリン、１ｍ／あたり１００μｇのストレプトマ
イシン、１ｍｐあたり１０．！ｆｌ’；のケンタマイン
ン、１６ ｍ Ｍの＼ａＨｃＯｔを含有させた。
”１０次こ９６穴プラスチノクマ、イクロプレート中Ｃ
”） ２１１ ｔｌμｌのＲ１）Ｍ！１６４０培地に）
ｕ／罰した。培地る二は１車位／ ｍ ｅのＢ ＣＤ
Ｉ”を含むＶＴ−１培頁」７清、１０％ＦＣ５，０，０
０２５％ＳＡＣ，１ｍｊ！あタリｉ ｏ ｏ ＜ｒ−位
のペニシリン、１ｍ／あたり１００μｇのストレプトマ
イシン、１ｍｐあたり１０．！ｆｌ’；のケンタマイン
ン、１６ ｍ Ｍの＼ａＨｃＯｔを含有させた。
培長物を空気中５％炭酸カスな灯の湿度調ｈ１１環鏡上
３７゛Ｃに保ら、５日後Ｂ細胞を集めた。この子■胞の
抗体産生能力をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検
定した。表２に示すように、ＢＣＤＦの添加量に対応し
た抗体産生Ｂ ｍ胞によるプラークを検出した。
３７゛Ｃに保ら、５日後Ｂ細胞を集めた。この子■胞の
抗体産生能力をＢＣＤＦ活性検定の項に記述した通り検
定した。表２に示すように、ＢＣＤＦの添加量に対応し
た抗体産生Ｂ ｍ胞によるプラークを検出した。
表２
（１１）人末梢皿よ？）Ｂ細胞を調製し、５ＡＣ０，０
０２５％を含む培地（１０％Ｆ ＣＳ 、 ０．００２
５％ＳΔＣ，１ｍｐあたり１００単位のペニシリン。
０２５％を含む培地（１０％Ｆ ＣＳ 、 ０．００２
５％ＳΔＣ，１ｍｐあたり１００単位のペニシリン。
ｌ ｍ ｅあｌこり１００μｇのスト１／プトマインン
。
。
１ｍｇあたり１０μｇのゲンタマインン、１６ｍＭのＮ
ａ ＨＣＯ３を含有するＲ Ｐ Ｍ Ｉ １６４０培
地）にて３日間培養後、（１）と同様のパーコールグラ
ーンエン［処理をしてプラス１化［’Ｊ ｉ：Ｉｉｌ胞
を分１’！Ｉｆした。
ａ ＨＣＯ３を含有するＲ Ｐ Ｍ Ｉ １６４０培
地）にて３日間培養後、（１）と同様のパーコールグラ
ーンエン［処理をしてプラス１化［’Ｊ ｉ：Ｉｉｌ胞
を分１’！Ｉｆした。
以下（１）と同し方法により、Ｆ３細胞の抗体産生能力
を検定した。結果を表３に示づ７表 ３ ］ ’ ３４５ ’ｉ ０．１！ １、−一一一一」−２７０ｉ −−１゛
を検定した。結果を表３に示づ７表 ３ ］ ’ ３４５ ’ｉ ０．１！ １、−一一一一」−２７０ｉ −−１゛
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 人Ｔ細胞白血病ウィルスにより形質転換された人細胞に
より生産され、下記の性質を有するＢ細胞分化因子を含
有し、Ｂ細胞分化因子活性が５×１０＾６単位／ｍｌ以
上である蛋白標品。 （１）分子量 ３．５±０．５×１０＾４ダルトン（ゲル濾過法）２．
２±０．２×１０＾４ダルトン（ＳＤＳ・ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法） （２）等電点ｐＨ４．９〜５．１ （３）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列 Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ＧｌｕＡｓ
ｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡｌａ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60025301A JPH0657720B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ細胞分化因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60025301A JPH0657720B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ細胞分化因子 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59235199A Division JPH0657157B2 (ja) | 1984-11-09 | 1984-11-09 | Ｂ細胞分化因子の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61115025A true JPS61115025A (ja) | 1986-06-02 |
| JPH0657720B2 JPH0657720B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=12162190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60025301A Expired - Lifetime JPH0657720B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ細胞分化因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0657720B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0585957A1 (en) * | 1986-08-06 | 1994-03-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Recombinant B-cell differentiation factor |
| US6284237B1 (en) | 1986-07-08 | 2001-09-04 | Steven C. Clark | Methods of treatment using IL-6 |
| US6348191B1 (en) | 1986-07-08 | 2002-02-19 | Genetics Institute, Inc. | Production and use of IL-6 |
-
1985
- 1985-02-14 JP JP60025301A patent/JPH0657720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF IMMNOLOGY=1984 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5541088A (en) * | 1986-08-06 | 1996-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Recombinant process of producing non-glycosylated B-cell defferentiation factor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0657720B2 (ja) | 1994-08-03 |
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