CN109312305A - 由树突状细胞产生的诱导性多能干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由源树突状细胞(DC)产生的诱导性多能干细胞(iPSC)。本发明还涉及合成DC，该合成DC从再分化iPSC并且显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型。本发明还涉及本发明的iPSC和DC的制备方法和使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及由源树突状细胞(DC)产生的诱导性多能干细胞(iPSC)。本发明还涉及合成DC再分化iPSC并且该iPSC显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型。本发明还涉及本发明的iPSC和DC的制备方法和使用方法。
背景技术
树突状细胞(DC)对肿瘤相关抗原(TAA)的致敏应答的使用为癌症免疫疗法提供了有前途的方法(Palucka et al.,Immunity 33,464-478(2010))，但临床相关应答经常令人失望(Engell-Noerregaard et al.,Cancer Immunol.Immunother.58,1-14(2009)；和Robson et al.,Curr.Opin.Immunol.22,137-144(2010))。这部分上是由于最常用的DC的特性。目前，从患者自身外周血单核细胞体外分化的自体同源DC仍然是癌症免疫疗法的优选细胞来源。这些单核细胞衍生的DC(moDC)显示出显著的供体-供体变异，这经常与化学疗法的副作用相结合。此外，moDC对抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的交叉致敏显示出有限的能力，从而产生对使用衍生自TAA的外源肽的依赖性，并进一步将这种方法的范围限制在已知免疫显性表位的那些HLA单倍型中。由于小鼠中CD8α+DC具有特殊的交叉呈递能力，最近对人类中作为其功能性等价物的CD141+XCR1+DC的鉴定(Bachem et al.,J.Exp.Med.207,1273-1281(2010)；和Crozat et al.,J.Exp.Med.207,1283-1292(2010))表明该亚类可能更适于诱导抗肿瘤反应(Gallois&Bhardwaj,Nature Med.16,854-856(2010))。然而，这些细胞仅以外周血的溯源号(trace number)存在，并且在由脐带血培养祖细胞后以低产量获得(Poulin et al.,J.Exp.Med.207,1261-1271(2010))。因此，这些树突状细胞不代表对癌症的可行治疗方法。
获得足量的合适的DC的一种方法是从诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)产生DC。然而，由ESC和iPS细胞分化的细胞类型(如心肌细胞、神经元细胞、肝细胞和红细胞)显示原始的“胎儿”或“新生儿”表型，这可能限制它们的治疗效用(Feric&Radisic,Adv.Drug Delivery Rev.96,110-134(2016)；and Avior et al.,Hepatol.62,265-278(2015))。在红细胞的情况下，细胞不能去核并很少越过胎儿血红蛋白的表达进展成成人同种型，这阻止了红细胞在输血医学中的用途(Lu et al.Blood 112,4475-4484(2008))。衍生自iPSC和ESC的DC显示出类似的胎儿表型，特征在于MHC II类分子和共刺激分子的低表达。此外，iPSC衍生的DC(ipDC)分泌Th1极化和细胞毒性T细胞(CTL)激活所需的IL-12的能力非常有限，从而限制了它们的免疫原性并使它们更具致耐受性。这种表型在人新生儿DC中已有报道，并且是由于IL-12的p35亚基的活性抑制而导致的(Goriely S,Vincart B,Stordeur P et al.J.Immunol.166,2141-2146(2001)；和Goriely S,Van Lint C,DadkhahR et al.:A defect in nucleosome remodelling prevents IL-12(p35)genetranscription in neonatal dendritic cells.J.Exp.Med.199,1011-1016(2004))。
发明内容
发明人令人惊讶地证明了，利用iPSC对衍生该iPSC的细胞类型所显示的表观遗传记忆以克服分化阻断是可行的。特别地，发明人令人惊讶地证明了，通过将终末分化的DC重新编程为多能性，由多能性细胞再分化的DC可以显示源群的许多特征，这些特征不同于由衍生自常规真皮成纤维细胞或任何其它体细胞类型的ESC或iPSC分化的DC。
出乎意料的是，发明人发现终末分化的DC对于重新编程为容易在转导后以高效率形成克隆的iPSC而言是易处理的候选物。此外，由该iPSC重新分化的DC高组成性表达MHCII类分子、CD40、CD80和CD86并分泌大量IL-12，不同于从成纤维细胞衍生的iPSC分化的ipDC。此外，在免疫原性(例如同种异基因混合白细胞反应)的标准试验中，与常规DC相比，这种新DC形式在每个细胞的基础上表现良好。因此，DC衍生的iPSC作为起始群，克服了与胎儿/新生儿表型相关的所有问题。
这些发现是出乎意料的，因为DC非常适于感知病毒病原体的存在并且对异源核酸作出强烈应答。因此，预期用重新编程因子转导DC的尝试仅仅导致DC快速成熟，随后2-3天后细胞死亡，从而阻碍重新编程为多能性。事实并非如此。尽管认为在体外大约10次传代后表观遗传记忆从iPSC中丢失，但发明人发现，出乎意料地，iPSC的传代不会对DC的表型产生不利影响，DC的表型在第10代之后保持高度免疫原性，在P15左右恢复到更多的胎儿表型。
该方法具有显著的临床意义，因为moDC很容易从患者的外周血中培养，并且可以用作生产iPSC系的起始材料而无需皮肤穿刺活组织检查。结果表明，起始材料的选择将影响ipDC的最终用途：虽然真皮成纤维细胞可能仍然是选择旨在诱导抗原特异性耐受性的DC的起始材料，但对接种目的来说，mo DC可能是更合乎逻辑的起始点。
因此，本发明提供了由源树突状细胞(DC)产生的诱导性多能干细胞(iPSC)。如下面更详细讨论的，可以修饰源DC以使该源DC在用于产生本发明的iPSC之前更具致耐受性。
本发明还提供：
-包含两个或更多个本发明的iPSC的群；
-包含超过5.0×105个本发明的iPSC的群；
-产生本发明的iPSC的群的方法，该方法包括在重新编程源DC以产生iPSC的条件下培养源DC；
-从由源DC所产生的iPSC再分化的合成DC，其中合成DC显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型；
-包含两种或更多种本发明的合成DC的群；
-包含超过5.0×105个本发明的合成DC的群；
-药物组合物，其包含：(a)本发明的合成DC或本发明的合成DC的群，和(b)药学上可接受的运载体或稀释剂；
-产生本发明的合成DC的群的方法，所述方法包括在诱导iPSC分化成DC的条件下培养本发明的iPSC；
-产生本发明的合成DC的群的方法，所述方法包括(a)实施本发明的方法，和(b)在诱导iPSC分化成DC的条件下培养步骤(a)中产生的iPSC；
-在有需要的患者中诱导针对抗原的T细胞应答的方法，所述方法包括将免疫有效量的负载有抗原或用抗原转染的本发明的合成DC给药至患者，从而在患者中诱导针对抗原的T细胞应答；和
-在有需要的患者中诱导针对抗原的耐受性的方法，所述方法包括将免疫有效量的本发明的致耐受性DC给药至患者，从而在患者中诱导针对抗原的耐受性，其中所述致耐受性DC负载有抗原或用抗原转染。
附图说明
图1：源DC的表征。在GM-CSF中培养7天的小鼠骨髓祖细胞产生混合的细胞群，其中一部分细胞表达DC限制性标记物CD11c(A)。当使用CD11c-磁珠纯化时，得到的骨髓衍生的DC(bmDC)显示出明显的树突状形态(B)，除CD11c(C)外还表达MHC II类分子、CD40和CD54，并在同种异基因混合白细胞反应中刺激原代T细胞应答(D)。
图2：从源DC重新编程的iPSC的表征。源DC的重新编程导致典型的iPSC集落的出现，所述iPSC集落由具有明显核的细胞组成，这是多能细胞的特征(A)。从源DC建立的iPSC系在核型上是正常的(B)并且表达多能性标记物Oct3/4、Nanog和SSEA-1(C)。在体外分化时，衍生自源DC的iPSC自发地形成胚状体(D)，所述胚状体在植入同基因受体小鼠的肾包膜下时，形成包含衍生自三个胚层中的各个胚层的组织的畸胎瘤，作为其多能性证据(E)
图3：由iPSC分化为合成DC。衍生自源DC的iPSC的定向分化产生大量未成熟的合成DC(A)，未成熟的合成DC在成熟时采用高菌幕(veil)且树突状的形态(B)。成熟诱导MHC II类分子和共刺激分子CD40、CD54、CD80和CD86的上调(C)。未成熟的合成DC加工可溶性蛋白质抗原，鸡卵溶菌酶(HEL)并将其呈递给抗原特异性T细胞杂交瘤(D)。合成DC在TLR4配体LPS中的暴露以剂量依赖性方式诱导IL-12的分泌(E)。
图4：合成DC、源DC以及从衍生自常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的iPSC分化的DC之间的比较。(A)未成熟合成DC的MHC II类分子和CD86的组成型表达显著高于衍生自MEF的iPSC分化的对应物，并且在响应于LPS在成熟时上调，使得其表达谱与源DC的表达谱相当(红色直方图：成熟源DC的标记物的表达；橙色直方图：未成熟细胞的表达水平；蓝色直方图：同种型匹配的对照的背景染色)。(B)来自源DC衍生的iPSC的更大比例的胚状体产生合成DC，并且比衍生自常规iPSC的那些胚状体更快。合成DC在暴露于LPS后分泌IL-12，不同于自常规iPSC系分化的对应物(C)，而且分泌水平显著较低的IL-10(D)，具有与源DC相当的细胞因子谱。由合成DC对同种异基因混合白细胞反应的刺激增强可见合成DC的免疫原性表型是明显的(E)。
图5：由人外周血单核细胞分化的源DC的表征。使用CD14+细胞的MACS选择从健康志愿者的外周血中纯化单核细胞(A)。在rhGM-CSF和IL-4中培养7天的单核细胞产生具有经典树突状形态(C，插图)并表达表面标记物CD11c、HLA-DR和CD40(D)的同源DC的群(B)。
图6：由人单核细胞衍生DC重新编程的iPSC的表征。典型的克隆(A)和代表性iPSC系(C3)的细胞形态(B)。C：由两种独立的iPSC系(C3和C5)产生的NANOG和OCT4的细胞内表达以及SSEA-4的表面表达，表明其多能状态。
图7：由人单核细胞衍生的DC重新编程的iPSC沿DC途径再分化的能力。(A)用适当生长因子培养3周以上的从EB脱落的非贴壁细胞的显微照片。细胞包含表达未成熟表型的CD11c+DC的群(B)，但能够响应于炎性细胞因子而成熟(C)。
具体实施方式
应理解，所公开方法的不同应用可以适应本领域的特定需要。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方式的目的，而非意在限制。
另外，除非内容另有明确说明，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如提及“一个细胞”包括“多个细胞(cells)”，提及“一种抗原”包括两种或更多种这样的抗原，提及“一名患者”包括两名或更多名这样的患者等。
无论上文或下文中，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均整体并入本文供参考。
源DC
任何源DC都可用于本发明。可使用本领域已知的标准方法(包括形态学、谱系限制标记物的表达、结构和功能特征)将源DC鉴定为树突状细胞，。下面参考本发明的合成DC更详细地讨论这些。
源DC可以是终末分化的。源DC优选是常规骨髓DC、浆细胞样DC、表皮朗格汉斯细胞或真皮DC。常规DC是CD1c+常规DC或CD141+常规DC。浆细胞样DC优选为CD303+浆细胞样DC。技术人员将理解如何获得这些细胞。
源DC优选由从外周血分离的循环前体分化而来。循环前体优选为单核细胞。单核细胞可以在体外分化成常规DC，例如在50ng/ml的GM-CSF和100ng/ml的IL-4中培养6至8天。
优选在用于形成iPSC之前修饰源DC以增加其免疫原性。例如，优选通过暴露于具有或不具有用于模式识别受体的适当配体的炎性刺激来修饰源DC。使用免疫原性源DC允许产生根据本发明的免疫原性合成DC。
优选在用于形成iPSC之前修饰源DC以促进致耐受性表型。源DC可以用多种药理学试剂处理以使它们更具致耐受性。这些试剂包括但不限于维生素D3、地塞米松、白介素-10、雷帕霉素和转化生长因子β(Leishman et al.,Current Opinion in OrganTransplantation 2011,16,372–378)。这些调节影响抗原呈递给T细胞的结果的共刺激分子、细胞因子和抑制性受体的表达。由于这些关键分子的表达可以在表观遗传水平上进行控制，因此使用以这种方式调节的源DC以产生合成DC是有价值的，所述合成DC已经“捕获”了限定致耐受性表型的表观遗传谱。该方法能够从已经完全倾向于诱导耐受性的DC的适当iPSC系进行直接分化。
本发明还包括源DC(例如使用CRISPR/Cas9系统)的基因编辑以敲除基因例如CD40，从而增强致耐受性表型。
源DC通常是人。然而，源DC可以来源于另一种哺乳动物，例如商业养殖动物(例如马、牛、绵羊、鱼、鸡或猪)、实验动物(例如小鼠或大鼠)或宠物(例如豚鼠、仓鼠、兔子、猫或狗)。
本发明的iPSC
本发明的iPSC通常显示人胚胎干细胞(hESC)的特征形态，表达多能性相关标记物SSEA-4和TRA1-60、转录因子Oct-4和Nanog，并在体外分化成衍生自三个胚层中的每个胚层的细胞类型。
用于生产和培养iPSC的技术是本领域技术人员熟知的。在下文讨论合适的条件。
本发明的iPSC可以是分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的。如果iPSC完全不含任何其他组分，例如培养基、本发明的其他细胞或其他细胞类型，则iPSC是分离的或纯化的。如果iPSC与不会干扰其预期用途的运载体或稀释剂(例如培养基)混合，则iPSC是基本上分离的。可供选择地，如下所述，本发明的iPSC可以存在于生长基质中或固定在表面上。
产生本发明的iPSC的方法
本发明还提供了一种产生本发明的iPSC的群的方法，所述方法包括在重新编程源DC的条件下培养源DC以产生iPSC。可以使用上面讨论的任何源DC。
该方法优选包括用仙台病毒系统、逆转录病毒系统、慢病毒系统、微小RNA或能够使源DC重新编程的其他重新编程因子来培养源DC以产生iPSC。
诱导性多能干细胞及其产生方法是本领域已知的。Yamanaka首次公开了诱导分化细胞(如体细胞)的多能性的方法(WO 2007/069666)。在该方法中，使用三种主要的核重新编程因子来对体细胞，即Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因(优选Sox2)进行重新编程。所述因子优选为Oct3/4、Klf4和Sox2。还可以使用第四种重新编程因子，即Myc家族基因的产物(优选c-Myc)。已经公开了许多不同的方法用于诱导体细胞中的多能性。Hanna etal.,Cell 2010 143,508-25；和Stadtfeld&Hochedlinger,Genes Dev.2010 24,2239-63中评述了这些方法。Carpenter,L.et al.Blood 117,4008-4011(2011)中描述了一种方法。
用于重新编程的重要方法是使用对重新编程因子具有特异性的信使RNA，因为这不涉及细胞的任何遗传修饰和肿瘤发生风险。另一种方法是由重新编程基因产生重组蛋白，所述重组蛋白被修饰以允许其渗透血浆和核膜。其他重新编程因子包括但不限于通过药物化学合成的小化合物。
该方法优选地还包括分离本发明的iPSC克隆系。例如，优选地，该方法还包括通过有限稀释或手动“挑选”单个克隆来分离本发明的iPSC克隆系。
本发明的合成DC
本发明还提供由源DC产生的诱导性多能干细胞(iPSC)再分化成的合成DC，其中合成DC显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型。本发明的合成DC具有许多优点。在此将总结关键优点。然而，通过以下讨论，其他优点将变得显而易见。
合成DC有利地显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型。这意味着所述合成DC保留了最终衍生该合成DC的源DC的多数(如果不是全部)特征。优选地，合成DC有利地显示出与衍生该合成DC的源DC相当的成人表型。这将在下文更详细地讨论。然后，可以以任何可以使用源DC的方式在治疗上使用本发明的合成DC。
如上文更详细讨论的，人iPSC由可以取自人类个体的源DC产生。由于合成DC由这些iPSC产生，因而该合成DC对于待治疗的患者可以是自体同源的，从而避免了患者免疫排斥的风险。
原则上，可以从单个个体产生无限数量的iPSC，因为iPSC能够无限期地自我更新。当然可以从单个个体产生非常大量的iPSC。因此，可以大量制备本发明的合成DC。有利地，可以使用本发明提供更多的合成DC，而不从患者的外周血中分离相关细胞。有利地，还可以提供大量的、属于因其被限制在特定的解剖位置而不是在外周血中循环而通常不可接近的亚类的合成DC。这在下文更详细地解释。
iPSC可以无限期地保持在培养物中或用于产生可再生库，本发明的合成DC可以由该可再生库产生。本发明的许多合成DC的群可以由一个iPSC的群制成。这有利于患者的重复治疗，而无需采集大量样品，例如外周血。同样地，可以从一个iPSC的群产生许多合成DC亚类，从而使本发明的细胞能够适应患者的治疗需要。
本发明的合成DC在临床相关条件下，例如在不存在痕量内毒素和其他环境污染物以及动物产物(如胎牛血清)的情况下产生。这使得本发明的合成DC特别适合于向患者给药。
由于本发明的合成DC由iPSC产生，该合成DC基本上是同源的并且可以是自体同源的。该合成DC还避免了供体对供体变异，moDC经常发生这种情况。可以在任何其他癌症疗法(例如化学疗法或放射疗法)开始之前从取自患者的单个样品而制备本发明的许多合成DC的群。因此，本发明的合成DC可以避免这些治疗的任何有害作用。
本发明的合成DC也可以比来自其他多能细胞(例如人胚胎干细胞(hESC))的群的DC更快地制备。由iPSC产生DC可以少于30天，而由hESC产生DC耗费30至40天。
从iPSC产生合成DC的避免了使用其他类型的干细胞(例如人胚胎干细胞(hESC))所涉及的道德和伦理影响。
如下文更详细讨论的，本发明的合成DC可以令人惊讶地响应各种Toll样受体(TLR，尤其是TLR2、TLR3、TLR4、TLR7和TLR9)的配体，因此可以根据所产生的合成DC亚类来对其在体内交叉呈递抗原的能力进行微调。
本发明的合成CD141+DC可有利地用于在人患者中诱导对特定抗原的CTL应答。因此，合成DC可用于有效治疗其中偏爱CTL应答的各种疾病，例如癌症或因病原体慢性感染。
DC在其发育中具有不同的阶段，例如在发育期间DC主要摄取抗原而不是呈递抗原。例如，DC被认为可具有不成熟阶段和较成熟阶段，不成熟阶段的特征在于摄取大量潜在抗原，较成熟阶段的特征在于较低量的抗原摄取，而呈递其先前获得的抗原的能力增加。本发明的合成DC最初可能是未成熟的，但可以被诱导成熟，这通过合成DC将抗原呈递给成熟CD4+T细胞的能力增加，以及在指导合成DC分化成CD141+亚类的情况下向初始或记忆CD8+T细胞交叉呈递抗原的能力增加来证明。下文更详细地公开制备成熟DC的方法。当然可以在体外操纵该合成DC，并且这可以允许对细胞是否被暴露于促进DC成熟的刺激进行控制。因此，通过确保细胞暴露于负责诱导成熟的刺激，所得的细胞可以在其转移至患者时用于促进免疫应答。
可以使用本领域已知的标准方法，包括形态学、谱系限制标记物的表达、结构和功能特征，将本发明的合成DC鉴定为树突状细胞。合成DC会表达已知作为树突状细胞特征的、可检测水平的细胞表面标记物。特别地，合成DC可以表达可检测水平的CD11c、CD209(也被称为DC-SIGN)、CD13中的任何一种，低水平的CD200R、CD11b、CD83和CD40。细胞可以是CD14lo。在一些情况下，细胞可以表达CD11c、CD209和CD13全部，并且还可以是CD14lo。
本发明的合成DC通常表达MHC分子。本发明的DC通常表达MHC I类分子和MHC II类分子。本发明的合成DC优选表达可检测水平的MHC II类分子。任何HLA单倍型都可以存在于本发明的合成DC上，由衍生合成DC的供体所限定。
响应于成熟混合物，这样一种混合物包含肿瘤坏死因子-α(TNFα)、前列腺素-E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和干扰素-γ(IFNγ)，本发明的合成DC将分泌高浓度的促炎细胞因子IL-6。
在形态学上，DC通常以大量的细胞质的菌幕和具有许多树突的单个细胞为特征。DC的其他限定特征是它们在不成熟时吞噬颗粒物质和内吞可溶性蛋白质抗原的能力，以及它们在成熟时激活初始T细胞的能力，如同种异基因混合白细胞反应(MLR)所例证的。在MLR中，DC与初始同种异基因淋巴细胞一起培养。由于细胞之间的组织相容性错配，T细胞将由DC表达的同种异基因MHC分子识别为外来的并且通过在培养中以急剧增殖的方式来响应。
合成DC可以是上文结合源DC讨论的任何类型DC。合成DC可以是与最终衍生该合成DC的源DC相同类型的DC。或者，合成DC与最终衍生该合成DC的源DC可以是不同类型。
实质上，定义DC有两组特征。第一组是所有DC亚类共有的特征，第二组是亚类特有的。例如，所有DC都会表达某些分子(例如MHC II类分子和共刺激分子)，分泌IL-12，并且具有获得、加工和将蛋白质抗原呈递至初始T细胞的能力。但是，其他功能是个别亚类特有的。例如，CD141+DC特别适合于交叉呈递。CD303+浆细胞样DC分泌大量的I型干扰素(IFN)。
通过使用源DC作为衍生iPSC的材料，本发明在表观遗传水平上捕获“DC的本质”，即所有DC共有的那些特征，而不是亚类限制性特征。然而，一旦产生这样的iPSC，其多能性意味着，理论上，iPSC可以分化成任何DC亚类，其中每种DC亚类可以通过唤起源DC的表观遗传记忆来增强其功能能力，从而优化所有DC共有的特征。
换句话说，本发明可以以moDC作为源材料开始，并且经iPSC中间体，产生浆细胞样DC。可供选择地，本发明可以从朗格汉斯细胞开始并通过诱导多能性，可以产生CD141+交叉呈递DC。然而，关键问题是，无论分化成哪些DC亚类，它们都可能显示出与体内等同亚类相当的确定的成人表型，而不表现出与胎儿表型相关的分化阻断。下表显示了源DC和合成DC亚类的优选组合的实例(即特定行中的合成DC优选地由同一行中的源DC产生)。
| 源DC | 合成DC |
| moDC | 浆细胞样DC |
| moDC | CD141<sup>+</sup>交叉呈递DC |
| 浆细胞样DC | 浆细胞样DC |
| 朗格汉斯细胞 | CD141<sup>+</sup>交叉呈递DC |
成人表型
本发明的合成DC显示出确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型。合成DC显示衍生该合成DC的源DC的特征中的一个或多个特征，优选全部特征。本发明的合成DC优选地显示与衍生该合成DC的源DC相同的成人表型。本发明的合成DC可以显示和与衍生该合成DC的源DC不同类型的源DC相同的成人表型。在上表显示了不同类型的源DC和合成DC的优选组合。可以使用本文讨论的任何技术测量合成DC和源DC的表型。
合成DC优选显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型，因为合成DC表达可检测水平的(i)MHC II类分子、(ii)CD40、(iii)CD54、(iv)CD80、(v)CD86或(vi)(i)至(v)的任何组合。组合(vi)可以是{i}；{ii}；{iii}；{iv}；{v}；{i,ii}；{i,iii}；{i,iv}；{i,v}；{ii,iii}；{ii,iv}；{ii,v}；{iii,iv}；{iii,v}；{iv,v}；{i,ii,iii}；{i,ii,iv}；{i,ii,v}；{i,iii,iv}；{i,iii,v}；{i,iv,v}；{ii,iii,iv}；{ii,iii,v}；{ii,iv,v}；{iii,iv,v}；{i,ii,iii,iv}；{i,ii,iii,v}；{i,ii,iv,v}；{i,iii,iv,v}；{ii,iii,iv,v}或{i,ii,iii,iv,v}(其中逗号＝和)。该组合最优选为(i)至(v)的全部。
合成DC优选显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型，因为合成DC表达与源DC相当或更大的(i)至(vi)中任何一个的水平。当合成DC表达的(i)至(vi)中的任何一个的水平为源DC的(i)至(vi)中任何一个的表达水平的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％时，合成DC优选地表达与源DC相当的(i)至(vi)中的任何一个的水平。
合成DC优选显示确定的成人表型而不是原始胎儿/新生儿表型，因为合成DC比显示胎儿/新生儿表型并且从衍生自体细胞(例如常规真皮成纤维细胞)的iPSC所分化的DC表达的(i)至(vi)中任何一个的水平更高。优选地，当合成DC表达的(i)至(vi)中的任何一个的水平是显示胎儿/新生儿表型的DC的(i)至(vi)中任何一个的表达水平的至少120％、至少150％、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少10倍、至少100倍或至少1000倍时，合成DC比显示胎儿/新生儿表型的DC表达的(i)至(vi)中的任何一个的水平更高。
合成DC优选显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型，因为该合成DC分泌白细胞介素12(IL-12)。合成DC优选显示确定的成人表型而不是原始的胎儿/新生儿表型，因为该合成DC分泌的白细胞介素12(IL-12)水平与源DC相当或比源DC更高。优选地，如果合成DC分泌的IL-12水平是源DC的IL-12分泌水平的至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％，那么合成DC与源DC分泌的白细胞介素12(IL-12)水平相当。
合成DC优选显示确定的成人表型而不是原始胎儿/新生儿表型，因为合成DC比显示胎儿/新生儿表型并且由衍生自体细胞(例如常规真皮成纤维细胞)的iPSC所分化的DC分泌的IL-12水平更高。优选地，当合成DC分泌的IL-12水平是显示胎儿/新生儿表型的DC的至少两倍、至少三倍、至少四倍，至少五倍、至少10倍、至少100倍或至少1000倍时，合成DC比显示胎儿/新生儿表型的DC分泌的IL-12水平更高。
合成DC优选显示确定的成人表型，因为该合成DC在免疫原性的标准试验中表现出与源DC相当的水平。相当的水平优选为源DC水平的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。合成DC优选地显示成人表型，因为该合成DC在免疫原性的标准试验中表现得与源DC一样好或更好。该试验优选是同种异基因混合白细胞反应或能够跟踪抗原特异性T细胞的激活的另一种试验。
可以使用本领域已知的标准方法来确定上文讨论的各种标记物的可检测表达和表达水平。合适的方法包括但不限于免疫细胞化学、流式细胞术、蛋白质免疫印迹和定量PCR。还可以使用本领域已知的标准试验测量针对抗原的DC应答。合适的方法包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)和用于细胞因子分泌的ELISpot、通过流式细胞术测量混合白细胞反应的增强以及共刺激分子和成熟标记物的上调。实施例中公开了可以使用的具体方法。
合成浆细胞样DC
如上所述，本发明的合成DC可以是浆细胞样DC。这些通常从浆细胞样源DC以高效率衍生，但也可以从衍生自其它源材料的iPSC以低效率分化而来。本发明的合成DC优选表达可检测水平的浆细胞样DC标记物CD123和CD303。合成DC优选表达可检测水平的Toll样受体3(TLR3)和/或通过分泌I型干扰素对病毒攻击进行响应。
本发明的合成交叉呈递DC
优选地，合成DC能够将抗原交叉呈递给初始CD8+T淋巴细胞。本发明的合成DC优选表达可检测水平的CD141。该细胞表面抗原通常由能够进行抗原交叉呈递的细胞表达。
本发明的合成DC优选地表达可检测水平的某些TLR或响应于特定TLR的配体。TLR是结合在微生物中被称为病原体相关分子模式(PAMP)的保守部分的模式识别受体。TLR配体与TLR的结合启动DC内部的信号传导级联，该信号传导级联导致在启动免疫应答中重要的促炎细胞因子的产生和共刺激分子的上调。本发明的合成DC对各种TLR配体的响应能力是有利的，因为它使得合成DC将抗原体内交叉呈递至初始CD8+T细胞的能力通过TLR的配体得到改善。
还可以使用本领域已知的标准试验来测量DC对TLR配体的响应。合适的方法包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)和用于细胞因子分泌的ELISpot、通过流式细胞术测量混合白细胞反应的增强以及共刺激分子和成熟标记物的上调。实施例中公开了可以使用的具体方法。
本发明的合成DC优选表达可检测水平的TLR9。TLR9识别通常存在于细菌和病毒中但在哺乳动物细胞中少见的非甲基化2'-脱氧核糖(胞苷-磷酸-鸟苷)(CpG)DNA基序。由于本发明的DC表达TLR9，因而本发明的DC能够识别CpG DNA基序。本发明的DC可用于治疗慢性细菌或病毒感染。本发明的治疗方法还可以涉及本发明的DC与一种或多种CpG基序的组合疗法。从人外周血分离的CD141+XCR1+DC不表达可检测水平的TLR9(Bachem et al.,J.Exp.Med.207,1273-1281(2010)；和Crozat et al.,J.Exp.Med.207,1283-1292(2010))。
本发明的合成DC优选表达可检测水平的TLR3。TLR3最初被鉴定为识别双链RNA(dsRNA)的合成类似物，即聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(I:C))，聚肌胞苷-聚胞苷酸模拟病毒感染并通过促进I型干扰素和炎性细胞因子的产生来诱导抗病毒免疫应答。(Choe et al.,Science 309,581–585(2005))。本发明的合成DC可用于治疗慢性病毒感染。本发明的治疗方法可以涉及本发明的合成DC与一种或多种TLR3激动剂(例如poly(I:C))的组合疗法。
本发明的合成DC优选表达可检测水平的TLR7。TLR7以非依赖复制方式识别RNA病毒。
当通过流式细胞术确定时，本发明的合成DC优选表达低水平的TLR2和TLR4。在任何情况下，本发明的合成DC优选在通过ELISA试验检测的功能性试验(例如IL-6的分泌)中响应于TLR2和TLR4的配体。TLR-2(也称为CD282)是在病原体识别和先天免疫的激活中起基础作用的表面膜受体蛋白。该蛋白质在外周血白细胞中表达最丰富，并通过NF-κB的刺激介导宿主对革兰氏阳性细菌和酵母的应答。TLR2参与识别来自细菌、真菌、寄生虫和病毒的各种PAMP(Akira,et al.,Cell 124,783–801(2006))。这些PAMP包括来自细菌的脂肽、来自革兰氏阳性细菌的肽聚糖和脂磷壁酸、来自分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖、来自真菌的酵母聚糖，来自克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的tGPI-粘蛋白和来自麻疹病毒的血球凝集素蛋白。TLR2通常与TLR1或TLR6形成异二聚体。具体地，TLR2-TLR1异二聚体识别来自革兰氏阴性细菌和支原体的三酰化脂肽，而TLR2-TLR6异二聚体识别来自革兰氏阳性细菌和支原体的二酰化脂肽。本发明的合成DC可用于治疗细菌、真菌、寄生虫和病毒引起的慢性感染。本发明的治疗方法可以涉及本发明的合成DC与一种或多种脂肽、肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、酵母聚糖、tGPI-粘蛋白和血球凝集素蛋白的组合疗法。
TLR4(也称为CD284；Akira,et al.,Cell 124,783–801(2006))是用于检测革兰氏阴性细菌上的脂多糖的细胞表面蛋白，并且因此对先天免疫系统的激活是重要的。本发明的合成DC可用于治疗慢性革兰氏阴性细菌感染。本发明的治疗方法可以涉及本发明的合成DC与一种或多种细菌脂多糖的组合疗法。
本发明的合成DC优选能够将抗原交叉呈递给初始CD8+T细胞。合成DC中抗原加工和呈递的经典途径是外源途径(涉及MHC II类分子)和内源途径(依赖于MHC I类分子)。CD4+T淋巴细胞应答由MHC II类分子上的抗原呈递来指导，而CD8+CTL应答由MHC I类分子上的抗原呈递来指导。DC能够摄取外源抗原，将其加工并经MHC II类分子在其细胞表面呈递所得肽以刺激CD4+T淋巴细胞应答。可以衍生自合成DC本身或来自细胞内病原体(如病毒)的内源性抗原经MHC I类分子加工并在DC的表面上呈递以刺激CD8+CTL。
CD8+CTL应答对抗病毒和抗肿瘤免疫是特别重要的，因为CTL细胞能够杀死感染细胞或肿瘤细胞。然而，使用经典的抗原呈递内源途径，如果DC自身被侵染性(incriminating)病毒病原体感染或转化，则DC仅会激活基于CTL的应答。许多常规DC(包括moDC)具有非常有限的经MHC I类分子加工并呈递外源抗原的能力，从而刺激抗肿瘤或抗病毒CTL应答。
交叉呈递是这样的现象：有限的DC亚类能够摄取、加工和呈递MHC I类分子上的外源抗原，从而刺激CTL应答。在本文中，“外源”抗原特别包括不是源自DC本身的蛋白质、多肽或肽(例如合成多肽和合成肽)。因此，本发明的合成DC能够将抗原交叉呈递给初始CD8+T细胞。因此，本发明的合成DC能够通过MHC I类分子摄取、加工和呈递外源抗原。因此，细胞可以负载有肿瘤衍生的或病原体衍生的抗原或用肿瘤衍生的或病原体衍生的抗原转染，并在体内使用以诱导针对肿瘤或病原体的CTL应答。这将在下文更详细地讨论。
抗原或由该抗原衍生的肽将经MHC I呈递。通常，抗原可以由MHC I类分子和MHCII类分子两者呈递。
可以使用本领域已知的任何试验来测试本发明的合成DC交叉呈递抗原的能力。如下文更详细讨论，本发明的合成DC可以负载有抗原或用抗原转染。本发明的合成DC通常负载有测试抗原或在测试抗原存在下培养，并确定细胞使用MHC I类分子呈递由测试抗原衍生的肽的能力。可以通过将交叉呈递DC与合适的CD8+HLA限制性T淋巴细胞一起培养并使用合适的四聚体追踪抗原特异性细胞的致敏来测量呈递。可供选择地，已知的抗原特异性的充分表征的MHC I类限制性T细胞克隆可用作整个外源抗原交叉呈递的读数。在实施例中公开了具体的试验。
本发明的致耐受性DC
本发明还提供致耐受性的合成DC，其中源DC在用于形成iPSC之前被修饰以促进致耐受性表型，或者合成DC被修饰以促进致耐受性表型。这可以如上文所述(例如通过将源DC或合成DC暴露于试剂，例如但不限于维生素D3、地塞米松、IL-10、TGF-β或雷帕霉素)进行。
合成DC的其他特征
本发明的合成DC可以是分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的。如果合成DC完全不含任何其他组分，例如培养基、本发明的其他细胞或其他细胞类型，则合成DC是分离的或纯化的。如果合成DC与不会干扰其预期用途的运载体或稀释剂(例如培养基)混合，则该合成D是基本上分离的。可供选择地，如下所述，本发明的DC可以存在于生长基质中或固定在表面上。
可以使用包括基于抗体的技术的多种技术分离本发明的合成DC。可以基于单克隆抗体与合成DC上存在的那些表面标记物的结合使用阴性和阳性选择技术分离细胞。因此，可以使用包括FACS和磁珠分离的任何基于抗体的技术来分离DC。
如下文更详细讨论的，合成DC可以离体处理。因此，细胞可以负载有抗原或用抗原转染，然后在治疗上用于本发明的方法中。因此，本发明提供负载有抗原或用抗原转染的本发明的合成DC。在下文讨论合适的抗原。本发明进一步提供包含编码抗原的核酸的本发明的合成DC。本发明还提供已经被病毒颗粒或另一种能够表达抗原的载体感染的本发明的合成DC。
本发明的群
本发明还提供两种或更多种本发明的iPSC的群或合成DC的群。所述群中可以存在任何数量的细胞。
在本发明的一种优选实施方式中，本发明的群包含多于5.0×105个本发明的DC。所述群更优选包含至少5.1×105个、至少5.2×105个、至少5.5×105个、至少6.0×105个、至少6.5×105个、至少7.0×105个、至少7.5×105个、至少8.0×105个、至少8.5×105个、至少9.0×105个、至少9.5×105个或至少1.0×106个本发明的DC。在一些情况下，所述群可包含至少1.0×107个、至少1.0×108个、至少1.0×109个、至少1.0×1010个、至少1.0×1011个或至少1.0×1012个本发明的iPSC或DC。
使用本发明可以实现这样的数字。可以通过按比例增加所述方法中使用的培养容器的数量或通过使用生物反应器来产生任何数量的本发明的iPSC或DC。该方法的可扩展性仅取决于可以获得的源DC和人类iPSC的数量。这个数量几乎是无限的。下文更详细地讨论用于从人获得源DC和iPSC的方法。
如下所述，本发明的合成DC的群对于疗法是有利的。这种产生包含大量的DC(属于具有关键特征的亚类)的群的能力是本发明的关键优势之一，所述关键特征例如CD141+DC情况下的抗原交叉呈递或CD303+浆细胞样DC情况下的I型干扰素分泌。本发明允许产生可持续的数量足够的合成DC的群，以允许对患者进行重复循环的有效治疗。本发明还允许产生可持续的合成DC的群，该合成DC的群属于特定亚类，通常由于其解剖学分布而不能从患者获得。
本发明的群优选是同源的。换句话说，群中的所有iPSC或DC优选在基因型和表型上是相同的。所述群优选是自体同源的。然而，所述群也可以是半同种异基因的。半同种异基因群通常由从另一患者获得或从公共库获得的临床批准的、部分匹配的源DC的重新编程和任选地再分化而产生。换句话说，所述群中的所有细胞优选地在遗传上相同或在遗传上足够相同，使得所述群与将要用该群来进行给药的患者在免疫上相容。由于本发明的合成DC可以通过经iPSC从患者获得，因此所述合成DC与待治疗的患者可以是自体同源的(即与患者在遗传上是相同的或在遗传上足够相同以使该合成DC与对患者相容以进行给药)。
本发明的群可以是分离的、基本上分离的、纯化的或基本上纯化的。如果群完全不含任何其他组分，例如培养基和其它细胞，则所述群是分离或纯化的。如果群与不会干扰其预期用途的运载体或稀释剂(例如培养基)混合，则所述群是基本上分离的。在下文将更详细地讨论其他运载体和稀释剂。基本上分离的或基本上纯化的群不包含除本发明的iPSC或合成DC之外的细胞。在一些实施方式中，如下所述，本发明的群可以存在于生长基质中或固定在表面上。
通常在体外培养所述群。本领域技术人员公知用于培养细胞的技术。通常在37℃，5％CO2的标准条件下在无血清的培养基中培养细胞。细胞可以在任何合适的烧瓶或容器(包括平底板(例如标准6孔板)的孔)中培养。这种板可从Fisher scientific,VWR供应商,Nunc,Starstedt或Falcon在商业上获得。所述孔的容量通常为约1ml至约4ml。如上所述，每个孔的DC数量通常为1.1×104至4.5×104或7.5×105。该方法通常符合现代优良生产实践(Current Good Manufacturing Practice，cGMP)。生物反应器也可用于按比例增加生产。
可以修饰其中包含或培养所述群的烧瓶、容器或孔以促进iPSC和/或合成DC的操作。例如，可以修饰烧瓶、容器或孔以促进细胞的培养，例如通过包含生长基质。可以修饰烧瓶、容器或孔以允许iPSC和/或合成DC贴附或允许DC固定在表面上。一个或多个表面可以涂覆有胞外基质蛋白，例如层粘连蛋白或胶原蛋白或与细胞结合并将细胞固定或捕获在所述表面上的任何其他捕获分子。
可以使用本文描述的任何技术对所述群进行离体修饰。然后可以将所述群用于下文更详细讨论的治疗方法中。因此，本发明提供负载有抗原或用抗原转染或内源性地表达所述抗原的本发明的合成DC的群。本发明还提供包含编码抗原的核酸的本发明的合成DC的群。本发明还提供已经被病毒颗粒或另一种能够表达抗原的载体感染的本发明的合成DC的群。
产生本发明的合成DC的方法
本领域已知适于诱导性多能干细胞分化成DC的条件。例如，Tseng,S-Y.etal.Regen.Med.4,513-526(2009)中公开了用于人ESC的分化的合适条件。然而，令人惊讶的是，在这些条件下培养人iPSC得到能够将抗原交叉呈递给初始CD8+T淋巴细胞的DC。
如果合成DC通过单核细胞前体阶段，该方法优选包括(a)在包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的培养基中将iPSC培养足够时间以产生单核细胞，(b)在诱导未成熟树突状细胞形成的条件下培养单核细胞，和(c)在包含诱导DC成熟的生长因子的培养基中培养未成熟树突状细胞。这产生包含CD141+和CD1c+DC的混合群。然后可以按下文所述分离每种类型。
步骤(a)中的足够时间通常为13至17天。在步骤(a)中，培养基优选还包含干细胞因子(SCF)，血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白(BMP-4)中的一种或多种。所述培养基更优选最初包含SCF、VEGF和BMP-4中的所有三种，并且各自陆续被移除。步骤(a)最优选包括最初在包含GM-CSF、SCF、VEGF和BMP-4的培养基中培养iPSC，从第5天起移除BMP-4，从第14天起移除VEGF并从第19天起移除SCF直至产生单核细胞。
步骤(b)中的足够时间通常为9至15天。本领域已知用于由单核细胞形成未成熟DC的合适条件。步骤(b)优选涉及在含有GM-CSF和白细胞介素-4(IL-4)的培养基中将单核细胞培养足够时间以产生未成熟DC。
步骤(c)耗费36小时至4天，优选约2天(48小时)。步骤(c)中的培养基优选包含GM-CSF、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、前列腺素-E2(PGE2)、白细胞介素-1β(IL-1β)和干扰素-γ(IFNγ)。
步骤(a)至(c)通常耗费21至32天。
各种生长因子的优选浓度如下：
GM-CSF–25ng/ml至75ng/ml，更优选50ng/ml；
SCF–10ng/ml至30ng/ml，更优选20ng/ml；
VEGF–25ng/ml至75ng/ml，更优选50ng/ml；
BMP-4–25ng/ml至75ng/ml，更优选50ng/ml；
IL-4–10ng/ml至150ng/ml，更优选25或100ng/ml；
TNFα–10ng/ml至30ng/ml，更优选20ng/ml；
PGE2–0.5ng/ml至1.5ng/ml，更优选1.0ng/ml；
IL-1β–5ng/ml至15ng/ml，更优选10ng/ml；和
IFNγ–10ng/ml至20ng/ml，更优选15ng/ml。
用于本发明方法的生长因子通常为人类形态。用于本发明方法的生长因子通常是重组的。这些因子的使用意味着本发明的DC在临床相关条件下产生，即在没有痕量内毒素和其他环境污染物(例如脂磷壁酸、脂肽和肽聚糖等)的情况下产生。这使得本发明的DC适于向患者给药。
该方法优选还包括分离本发明的合成DC。可以使用上文讨论的任何方法。
本发明还提供用于产生适合于向患者给药的本发明的合成DC的群的方法，其中该方法包括从自患者获得的源DC产生iPSC并使用本发明的上述方法由那些iPSC产生本发明的合成DC的群。所述群与患者会是自体同源的，因此在植入时不会被排斥。本发明还提供适于向患者给药并以该方式产生的本发明的合成DC的群。可供选择地，本发明提供用于产生适于向患者给药的本发明的合成DC的群的方法，其中该方法包括重新编程为多能性以及随后的从另一患者或临床批准的样品(例如脐带血)的公共库获得的部分匹配的DC的再分化。
药物、方法和治疗用途
本发明的合成DC可用于人体或动物体的疗法的方法中。因此，本发明提供的本发明的合成DC或本发明的群用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。特别地，本发明涉及使用本发明的合成DC，该合成DC的确定的成人表型有助于在患者中诱导针对抗原的T细胞应答。抗原可以从肿瘤或病原体衍生。在一种实施方式中，T细胞是细胞毒性T细胞(CTL)，并且诱导的CTL应答将有助于从患者中除去肿瘤或病原体(即CTL应答是治疗性的)。在另一种实施方式中，T细胞是辅助性T细胞(Th细胞)，诱导的Th应答响应于抗原而优化CTL的激活。在另一种实施方式中，T细胞是辅助性T细胞(Th细胞)，诱导的Th细胞应答促进针对抗原的体液免疫并优化针对抗原的抗体的产生。在另一种实施方式中，T细胞是调节性T细胞(Treg细胞)，诱导的Treg应答调节针对自身抗原或无害外来抗原的有害的免疫应答。
在所有情况下，本发明的合成DC优选从患者或与患者在呈递抗原所需的MHC限制性元件中的一种或多种上匹配的个体衍生。从患者(通过源DC和iPSC)衍生本发明的合成DC应确保合成DC本身不被患者的免疫系统排斥。提供者和接受者之间的任何差异将最终导致合成DC的清除，但在合成DC刺激有效的抗原特异性应答之前不会。
本发明提供在有需要的患者中诱导针对抗原的T细胞应答的方法，包括将免疫有效量的负载有抗原或用抗原转染或内源性地表达所述抗原的本发明的合成DC给药至患者，从而在患者中诱导针对抗原的T细胞应答。免疫有效量是在患者中诱导针对抗原的T细胞应答的数量。本发明还提供本发明的合成DC或本发明的合成DC的群，所述合成DC或合成DC的群用于在有需要的患者中诱导针对抗原的T细胞应答的方法中，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。本发明还提供本发明的合成DC或本发明的合成DC的群在制备用于在有需要的患者中诱导针对抗原的T细胞应答的药物中的用途，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。所述抗原可以是任何蛋白质、多肽或肽。下面结合肿瘤和病原体讨论合适的抗原。T细胞应答优选是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。CTL应答优选是CD8+CTL应答。在所有实施方式中，CTL应答可以是治疗性的(即治疗患者的疾病或病症)。
在一种实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原，并且所述方法用于治疗或预防患者的肿瘤。因此，本发明提供治疗有需要的患者的肿瘤的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的合成DC给药至患者，所述合成DC负载有来自肿瘤的抗原或用来自肿瘤的抗原转染，从而在患者中诱导针对抗原的T细胞应答并治疗肿瘤。治疗有效量是有效改善肿瘤的一种或多种症状的数量。通常，这样的数量使肿瘤从患者中去除。
本发明还提供本发明的合成DC或本发明的群，本发明的合成DC或本发明的群用于通过诱导对来自患者的肿瘤的抗原的T细胞应答来治疗有需要的患者的肿瘤的方法中，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。本发明还提供本发明的合成DC或本发明的合成DC的群在制备用于通过在患者中诱导对来自肿瘤的抗原的T细胞应答来治疗有需要的患者的肿瘤的药物中的用途，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。
可能衍生抗原的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、淋巴瘤以及白血病或肺、肝、胰腺、前列腺、乳腺、结肠和卵巢的肿瘤。合适的肿瘤抗原包括但不限于Melan-A、酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黑色素瘤抗原gp75、Hker 8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1、Tyr2、pMel 17基因家族成员、c-Met、PSA(前列腺抗原)、PSM(前列腺粘蛋白抗原)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、前列腺分泌蛋白、甲胎蛋白、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1和BRCA-2抗原。如果本发明涉及治疗患者的肿瘤，则优选从肿瘤本身获得抗原，例如通过活组织检查提取并进行体外鉴定。在另一种实施方式中，所述抗原是可在商业上获得的重组蛋白。这些抗原包括但不限于上面列出的那些肿瘤抗原。
在另一种实施方式中，所述抗原来自病原体，并且所述方法用于治疗患者的病原体感染。因此，本发明提供治疗有需要的患者的慢性病原性感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的负载有来自病原体的抗原或用来自病原体的抗原转染的本发明的合成DC给药至患者，从而在患者中诱导对抗原的T细胞应答并治疗感染。治疗有效量是有效改善感染的一种或多种症状的数量。通常，这样的数量使病原体从患者中去除。
本发明还提供本发明的合成DC或本发明的合成DC的群，所述合成DC或合成DC的群用于通过在患者中诱导对来自病原体的抗原的T细胞应答来治疗有需要的患者的慢性病原性感染的方法中，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。本发明还提供本发明的合成DC或本发明的合成DC的群在制备用于通过在患者中诱导对来自病原体的抗原的T细胞应答来治疗有需要的患者的病原性感染的药物中的用途，其中所述合成DC负载有抗原或用抗原转染。可根据本发明治疗或预防的合适病原体包括但不限于细菌(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、病毒(例如HIV)、寄生虫和原生动物(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum))以及真菌。通常，这样的微生物会产生对常规治疗有抗性的慢性感染。在另一种实施方式中，所述方法用于去除对抗原的免疫耐受性。所述抗原通常是自身抗原，例如肿瘤抗原。所述抗原可以是上文讨论的任何肿瘤抗原。诱导对肿瘤抗原的有效免疫应答的主要障碍之一是自身耐受性，因为肿瘤抗原是自身分子而不是病原体衍生的。这种自身耐受性通常由对抗原具有特异性的调节性T细胞(Treg)维持，这抑制对相同抗原特异性的效应T细胞的致敏。然而，Treg相对不稳定，并且可能响应于IL-6，转变为强烈促炎的Th17细胞。Th17细胞分泌IL-17。由于本发明的合成DC在成熟时分泌高水平的IL-6，它们能够绕过Treg障碍，将Treg转化为Th17细胞，从而除去对抗原的免疫耐受性。
在另一种实施方式中，本发明提供在有需要的患者中诱导对抗原的耐受性的方法，所述方法包括将本发明的免疫有效量的致耐受性DC给药至患者，从而在患者中诱导对抗原的耐受性，其中所述DC负载有抗原或用抗原转染或内源性地表达抗原。
本发明还提供本发明的致耐受性DC或致耐受性DC的群，该致耐受性DC或致耐受性DC的群用于在有需要的患者中诱导对抗原的耐受性的方法中，其中所述DC负载有抗原或用抗原转染或内源性地表达抗原。本发明还提供本发明的致耐受性DC或致耐受性DC的群在制备用于在有需要的患者中诱导对抗原的耐受性的药物中的用途，其中所述致耐受性DC负载有抗原或用抗原转染或内源性地表达抗原。所述抗原优选地涉及患者的自身免疫疾病或会促进细胞或酶替代疗法以纠正患者的先天性病症。
免疫导致针对所选抗原促进免疫应答。可促进或实现由本文提及的有负载的或经转染的合成DC所产生的任何效果。特别地，将在患者中增加所选抗原的呈递水平。通常会看到在患者中经MHC I和/或MHC II类分子，特别是经MHC I类分子的呈递增加。在优选的情况下，实现的抗原呈递水平可以使得与未发生初始免疫的情况相比，再次遭遇相同的抗原时观察到免疫应答增加。特别是，提高了治疗性和/或保护性免疫应答。因此，本发明可以确保当下次遭遇抗原时，例如在以合成DC的群连续给药时，观察到更高水平的免疫应答，以进一步增强对抗原的应答。
与在不存在有负载的或经转染的合成DC的情况下以等量的抗原给药相比，本发明可用于增强抗原呈递水平或其任何下游效应，例如本文提及那些效应中的任一种。可以增加两倍、三倍或更多倍，在一些情况下，可以增加至少10倍，优选至少20倍，甚至更优选至少100倍，或1000倍或更多。可能看到治疗性应答，然而在没有使用有负载的或经转染的合成DC的情况下，则不能看到治疗性应答。
可以将有负载的或经转染的合成DC给药至任何合适的患者。所述患者通常是人类患者。所述患者可以是婴儿、青少年或成年人。在一种实施方式中，所述患者易患相关疾病或处于相关疾病的风险中。例如，所述患者可能在遗传上倾向于罹患肿瘤。可供选择地，患者可能已暴露于特定抗原(特别是病原体)或将处于存在暴露于特定抗原(特别是病原体)风险的地区，例如HIV-1从母亲到儿童的垂直传播。
本发明可以与其他免疫手段和免疫物质组合使用。在一些情况下，有负载的或经转染的合成DC可以与在有负载的或经转染的DC中不存在的抗原(即游离抗原)同时、依次或分开给药。有负载的或经转染的合成DC可以与用于特定抗原的现有疫苗组合使用于，并且可以例如简单地与这些疫苗混合。因此，本发明可用于增加现有疫苗(包括例如基于肽、多肽、蛋白质、核酸、病毒和/或细菌的抗原)的功效。
在一种优选实施方式中，有负载的或经转染的合成DC与模式识别受体(PRR)或TLR的一种或多种配体同时、依次或分开给药。这将改善DC在体内交叉呈递抗原的能力。合适的配体包括但不限于2'-脱氧核糖(胞苷-磷酸鸟苷)(CpG)DNA基序、聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly(I:C))、脂肽、肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、酵母聚糖、tGPI-粘蛋白、血球凝集素蛋白和脂多糖。
本发明涉及有负载的或经转染的合成DC的用途。可以使用本领域已知的任何方法使合成DC负载或转染合成DC。合成DC的负载可以在体外或离体进行。在每种情况下，合成DC可以简单地与培养物中的抗原接触。本发明的合成DC能够内吞、吞噬或以其他方式摄取外源肽、多肽或蛋白质抗原，并且在内化和加工后，呈递在合成DC表面上与MHC产物结合的抗原性肽片段。可供选择地，合成DC可以通过将抗原与表面分子特异性的单克隆抗体(例如CD205和DNGR-1)缀合而负载抗原。这些分子在本领域中是已知的。
合成DC的转染可以在体外或离体进行。可供选择地，可以在iPSC阶段进行稳定转染，从而允许由iPSC分化成表达转基因的DC。用编码抗原的核酸转染所述合成DC。例如，可以使用编码所述抗原的病毒颗粒或其他质粒载体。这样做的方法在本领域中是已知的。
核酸在合成DC中引起抗原的表达，并随后由细胞呈递抗原。核酸分子优选包含启动子，所述启动子与编码抗原的序列可操作地连接，在合成DC中是有活性的或可在合成DC中被诱导。
在特别优选的实施方式中，编码抗原的核酸可以通过病毒颗粒递送。病毒颗粒可包含靶向分子以确保有效转染。靶向分子通常全部或部分地提供于病毒表面上，以便使分子能够将病毒靶向于所述合成DC。
在这些实施方式中可以使用任何合适的病毒。例如，所述病毒可以是仙台病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒。在特别优选的实施方式中，所述病毒可以是慢病毒。所述慢病毒可以是适合用于递送基因的经修饰的HIV病毒。所述慢病毒可以是基于SIV、FIV或马传染性贫血病毒(EQIA)的载体。该病毒可以是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。用于本发明的病毒优选为复制缺陷型。
并非必须使用病毒颗粒。可以使用任何能够转染本发明的合成DC的载体，例如常规质粒DNA或RNA转染。
所述核酸分子还可以编码其他序列，例如所述核酸可以包含表达增强对抗原的免疫应答的蛋白质的序列。核酸可以编码细胞因子，包括本文提及的那些细胞因子中的任何一种，特别是IL-1、IL-2和/或IL-12。核酸还可以编码共刺激分子，例如增强免疫应答的细胞表面分子。所述核酸可以编码例如CD80和/或CD86。所述核酸分子优选编码本文公开的一种或多种Toll样受体配体。
可通过几种已知的转染技术，例如包括使用转染剂的那些转染技术，来增强核酸构建体的摄取。这些试剂的实例包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖(DEAE-Dextran)和脂质转染剂，所述脂质转染剂例如lipofectAmine、fugene、TransIT-LT1和transfectam。
可以在合适的条件下使细菌负载或转染细胞。细胞与抗原或载体可以例如接触5分钟至10天，优选1小时至5天，更优选5小时至2天，甚至更优选12小时至1天。
本发明还提供负载有抗原或用抗原转染的合成DC。这些合成DC可用于本发明的治疗性实施方式中。有负载的或经转染的细胞可以包含抗原的表位。所述细胞还可以包含靶向分子和/或其分解产物。本发明提供如上所述的分离形式的这些细胞。转染的细胞可以包含编码抗原的核酸，特别是可以包含编码抗原的病毒载体。优选地，所述病毒载体为复制缺陷型。
通常，有负载的或经转染的合成DC带有肽，特别是在合成DC表面上与MHC I类或II类分子结合(特别是与MHC I类分子结合)的衍生自所选择的抗原的抗原表位。在一种实施方式中，每个DC在其表面上具有至少100，优选至少200，例如至少或约500或1000个负载有产物的I类和/或II类分子，特别是I类分子。在一些情况下，合成DC可以带有标记或被标记，例如，用荧光分子如绿色荧光蛋白(GFP)标记。
在一些实施方式中，源DC可以从患者重新获得，使用本发明将其转化为合成DC，在体外负载或转染，然后返回到相同的对象中。在这种情况下，本发明中使用的合成DC将是自体同源细胞并且与患者的MHC I类HLA-A或HLA-B；和/或MHC II类完全匹配。在优选的情况下，从患者中重新获得本发明中使用的细胞并离体使用，随后返回同一患者。
在另一种实施方式中，源DC可以从另一个患者中分离或者从临床批准的样品的公共库中培养，以便确保源DC与患者共享将指定抗原呈递给接受者的免疫系统所需的一种或多种MHC分子。
药物组合物、疫苗和给药
本发明另外提供一种药物组合物，其包含(a)本发明的合成DC和本发明的合成DC的群，和(b)药学上可接受的运载体或稀释剂。本发明还提供一种疫苗组合物，其包含本发明的合成DC和本发明的合成DC的群。该疫苗和组合物可包含本文提及的任何合成DC或群，并且在一些实施方式中，可包含本文所述的核酸分子、载体、病毒或抗原。本发明提供一种接种方法，所述方法包括将有效量的本发明的疫苗组合物给药至患者。
可以使用任何合适的方法来配制本发明的各种组合物和疫苗。可以使用制药领域的常规方法进行细胞与标准的药学上可接受的运载体和/或赋形剂的配制。制剂的确切性质取决于若干因素，包括待给药的细胞和所需的给药途径。Remington's PharmaceuticalSciences,19th Edition,Mack Publishing Company,Eastern Pennsylvania,USA中充分地描述了合适的制剂类型。
细胞可以通过任何途径给药。合适的途径包括但不限于静脉内、肌肉内、腹膜内或其他合适的给药途径。优选将细胞给药至抗原呈递的位点，例如引流淋巴结。
组合物和疫苗可与生理学上可接受的运载体或稀释剂一起制备。通常，将这种组合物和疫苗制备成细胞的液体悬浮液。细胞可以与赋形剂混合，赋形剂是药学上可接受的并且可与活性成分相容。合适的赋形剂为，例如水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。
此外，如果需要，本发明的疫苗和/或药物组合物可含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强有效性的佐剂。
在一些实施方式中，所述药物组合物或疫苗可包含佐剂。换句话说，佐剂可以存在于本发明的各种制剂中，或者与各种制剂同时、分开或依次给药。合适的佐剂包括，例如增强对象对抗原的免疫应答的任何物质(包括当通过本发明的多核苷酸递送时)。所述佐剂可以通过影响任何数量的途径来增强免疫应答，例如，通过稳定抗原/MHC复合物、通过使细胞表面上存在更多的抗原/MHC复合物、通过增强DC的成熟或通过延长APC的寿命(例如，抑制细胞凋亡)。
可以使用的佐剂的实例包括细胞因子。某些细胞因子(例如TRANCE、flt-3L)或试剂(例如CD40L)可增强抗原呈递细胞的免疫刺激能力，并且可以使用。可单独或组合使用的细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素11(IL-11)中、c-kit配体、血小板生成素(TPO)、CD40配体(CD40L；也称为CD154)、肿瘤坏死因子相关激活诱导因子(TRANCE)和flt3配体(flt-3L)。可能有效的佐剂的另外的实例包括但不限于：氢氧化铝，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637、称为去甲MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A、称为MTP-PE)和RIBI，RIBI含有在2％角鲨烯/吐温80乳液中的提取自细菌的三种组分，即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。特别优选的佐剂包括上面讨论的模式识别受体的配体。
在本发明使用用编码抗原的核酸转染的合成DC的情况下，所述核酸也可以编码能够充当佐剂的分子。因此，所述核酸可以导致产生本文提及的任何佐剂，特别是细胞因子或共刺激分子。细胞因子可以是例如优选从抗原呈递细胞分泌的IL-1、IL-2和/或IL-12。共刺激分子可以是例如优选在合成DC的细胞表面上表达的CD80或CD86。
合成DC以与剂量制剂相容的方式给药，并且这种量将是免疫、预防和/或治疗有效的。给药量取决于待治疗的对象、对象的免疫系统对抗原应答的能力、以及所需的CTL应答程度。需要给药的合成DC的精确量可取决于从业者的判断，并且可能是对每个对象特有的。
本文描述的方法优选与标准化学疗法或放射疗法联合进行。已经显示这些疗法与细胞接种策略，例如本发明的方法，协同作用。垂死的肿瘤细胞释放出肿瘤抗原的来源，有助于维持细胞接种产生的免疫应答。
可以将任何合适数量的细胞给药至对象。例如，可以以至少或约105、106、107、108、109个细胞进行给药。作为指导，待给药的本发明的细胞的数量可以是105至109个，优选106至108个。可以以上文结合本发明的群的讨论的任何具体数量来进行给药。在以细胞进行给药或存在细胞的这种情况下，可以存在培养基以促进细胞的存活。在一些情况下，本发明的细胞可以冷冻等分试样提供，并且可以存在诸如DMSO的物质以促进冷冻期间的存活。通常将这种冷冻细胞解冻，然后置于缓冲液或培养基中进行养护或用于给药。在一些情况下，本发明的合成DC可首先在有丝分裂后照射或以其他方式呈现，以减轻可能由未分化的iPSC被偶然携带到接种物中而引起的任何肿瘤发生风险。
以下实施例说明了本发明。
实施例1
图1至4证明了本发明在产生合成DC上的效用，该合成DC显示出确定的成人表型而不是原始胎儿或新生儿表型。由于从小鼠多能干细胞培养的细胞类型特别容易受到在其分化中越过原始表型的阻断的影响，因此使用小鼠骨髓衍生的DC(bmDC)作为源材料。使用磁珠分离从造血细胞的混合群中纯化出经典CD11c+DC(图1A)，所述造血细胞的混合群来自骨髓祖细胞，并在GM-CSF中体外培养7天。纯化的细胞显示终末分化DC的预期菌幕形态(图1B)，表达表面MHC II类分子、CD80和CD54(图1C)并刺激初始同种异基因T细胞的增殖应答(图1D)，这是能够将DC与抗原呈递细胞的其它细胞类型和群区分的功能性试验。
使用用于瞬时引入重新编程因子的仙台病毒系统将纯化的源DC重新编程为多能性。转导后9天出现的克隆包含显示多能细胞的特征性形态(包括明显的细胞核和核仁)的细胞(图2A)。已经发现由这些克隆建立的细胞系在核型上是正常的(图2B)，并表达多能性的常规标记物，包括细胞表面蛋白SSEA-1和转录因子Oct 4和Nanog(图2C)。在体外分化后，iPSC自发形成胚状体(图2D)，当将胚状体植入同基因受体小鼠的肾包膜下时产生畸胎瘤。畸胎瘤包含多种细胞类型和组织，包括中胚层来源的平滑肌(图2E)、外胚层来源的角质化上皮(图2F)和内胚层组织例如肠上皮(图2G)，从而确认源DC的重新编程已经达到了明确的多能性状态。
衍生自源DC的iPSC的定向分化证实了该iPSC轻易地沿着DC谱系再分化以产生大量的未成熟DC的能力(图3A)，未成熟DC在成熟时采取高树突状形态(图3B)并显示在确定的成人DC的主要特征。特别是，合成DC表达包括MHC II类分子和共刺激分子CD40、CD54、CD80和CD86的表面分子的预期图谱，所有这些表面分子都在成熟后响应于LPS而显著上调(图3C)。合成DC还能够加工常规外来抗原鸡卵溶菌酶(HEL)并将其呈递至抗原特异性T细胞杂交瘤(图3D)，并且在用LPS攻击时，以剂量依赖的方式分泌IL-12(图3E)，表明合成DC克服了胎儿或新生儿DC中明显的IL-12分泌的严重阻断。
对本发明的合成DC与源DC或由衍生自小鼠胚胎成纤维细胞的常规iPSC分化的DC的仔细比较，揭示了该合成DC在其表面表型上(图4A)和细胞因子谱上与源DC更加相当。特别地，发现本发明的合成DC分泌高水平的IL-12(图4C)和低IL-10(图4D)，而由常规MEF衍生的iPSC分化的的对应物几乎不能产生可检测水平的IL-12，但是分泌的IL-10浓度高10倍，这是原始胎儿或新生儿DC典型的促致耐受性表型。因此，本发明的合成DC比由MEF衍生的iPSC分化的的对应物在同种异基因混合白细胞反应中持续表现出更高的免疫原性(图4)。
实施例2
为了证明本发明对人源细胞的效用，从HLA-A*0201+健康志愿者中采集外周血，并使用CD14微珠(Miltenyi Biotec)纯化单核细胞(图5A)。将单核细胞在人重组GM-CSF和IL-4中培养7天以产生同源的源DC的群(图5B)，在高放大倍数下显示典型的树突状形态(图5C)，包括广泛的细胞质的菌幕(插图)。源DC表达DC特异性标记物CD11c以及HLA-DR和CD40(图5D)。
使用仙台病毒(Cytotunes II)作为载体来递送多能性基因以对源DC进行重新编程。将细胞铺布到未激活有丝分裂的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上并培养直至克隆出现，随后以克隆方式保持并在基质胶包被的平板上传代。衍生出的若干iPSC细胞系显示出经典的克隆形态(图6A)以及多能细胞典型的细胞核与细胞质高比率和高放大倍数下高度独特的核仁(图6B)。NANOG和OCT4的细胞内染色显示在两种不同的iPSC系(C3和C5)中任一转录因子的表达。同样地，表面标记物SSEA-4的表达与多能表型一致(图6C)。
为了证明衍生自终末分化DC的人iPSC沿着DC谱系体外再分化的能力，收获iPSC并使用我们以前公开的方案(Silk K et al.Gene Therapy 19:1035-1040(2012))使iPSC在体外形成EB。在3周时间以上从EB释放的非贴壁细胞(图7A)含有高度表达CD11c的细胞(图7B)。CD11c+细胞的电子门(Electronic gating)揭示了未成熟的DC表型，如CD40和CD86的表达水平所证明。还揭示了通过上调这些共刺激分子，CD11c+对炎性细胞因子混合物响应从而成熟的能力(图7C)。
Claims (44)
1.一种诱导性多能干细胞(iPSC)，其由源树突状细胞(DC)产生。
2.根据权利要求1所述的iPSC，其特征在于，所述源DC是常规DC、浆细胞样DC、表皮朗格汉斯细胞或真皮DC。
3.根据权利要求2所述的iPSC，其特征在于，所述常规DC是CD1c+常规DC或CD141+常规DC。
4.根据权利要求1或2所述的iPSC，其特征在于，所述浆细胞样DC是CD303+浆细胞样DC。
5.根据前述权利要求中任一项所述的iPSC，其特征在于，所述源DC由从外周血分离的循环前体分化而来。
6.根据权利要求5所述的iPSC，其特征在于，所述循环前体是单核细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的iPSC，其特征在于，在用于形成iPSC之前对所述源DC进行修饰以(a)增加其免疫原性或(b)促进致耐受性表型。
8.根据前述权利要求中任一项所述的iPSC，其特征在于，所述iPSC和所述源DC为人。
9.一种包含两个或更多个根据前述权利要求中任一项所述的iPSC的群。
10.一种包含超过5.0×105个根据前利要求1至8所述的iPSC的群。
11.根据权利要求9或10所述的群，其特征在于，所述群是自体同源的。
12.根据权利要求9或10所述的群，其特征在于，所述群是同种异基因的或半同种异基因的。
13.一种产生根据权利要求9至12中任一项所述的iPSC的群的方法，所述方法包括在使源DC重新编程的条件下培养所述源DC以产生所述iPSC。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括用仙台病毒系统、包含重新编程因子的逆转录病毒系统、慢病毒系统、信使RNA、微小RNA、小分子和化合物、或能够使源DC重新编程的其他重新编程因子培养所述源DC以产生iPSC。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离根据权利要求7至9中任一项所述的iPSC的克隆系。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其特征在于，所述源DC如权利要求2至8中任一项所限定。
17.一种合成树突状细胞(DC)，其由源DC所产生的诱导性多能干细胞(iPSC)分化而来，其中，所述合成DC显示确定的成人表型而不是原始胎儿/新生儿表型。
18.根据权利要求17所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型，因为所述合成DC表达可检测水平的(i)MHC II类分子、(ii)CD40、(iii)CD54、(iv)CD80、(v)CD86或(vi)(i)至(v)的任何组合。
19.根据权利要求18所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型，因为所述合成DC表达与所述源DC相当或比所述源DC更高的(i)至(vi)中任何一个的水平。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型，因为所述合成DC分泌白细胞介素12(IL-12)。
21.根据权利要求20所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC显示成人表型而不是胎儿/新生儿表型，因为所述合成DC分泌与所述源DC相当或比源DC更高的白细胞介素12(IL-12)水平。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC显示成人表型，因为所述合成DC在免疫原性的标准试验中表现得与所述源DC一样好或比所述源DC更好。
23.根据权利要求22所述的合成DC，其特征在于，所述试验是同种异基因混合白细胞反应或能够跟踪抗原特异性T细胞的激活的另一种试验。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的合成DC，其特征在于，所述源DC如权利要求2至8中任一项所限定。
25.根据权利要求17至24中任一项的合成DC，其特征在于，所述合成DC能够将抗原交叉呈递至初始CD8+T淋巴细胞。
26.根据权利要求25所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC表达可检测水平的(a)XCR1、(b)Toll样受体9(TLR9)、(c)TLR3、(d)TLR7或(e)其任意组合。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的合成DC，其特征在于，所述树突状细胞负载有抗原、用抗原转染、或内源性地表达抗原。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的合成DC，其特征在于，所述合成DC是致耐受性的，并且，在所述源DC用于形成所述iPSC之前对所述源DC进行修饰以有促进致耐受性表型，或者对所述合成DC进行修饰以促进致耐受性表型。
29.一种包含两种或更多种根据权利要求17至28中任一项所述的合成DC的群。
30.包含超过5.0×105个根据权利要求17至28中任一项所述的合成DC的群。
31.一种药物组合物，其包含：(a)根据权利要求17-28中任一项所述的合成DC或根据权利要求19或30所述的合成DC的群，和(b)药学上可接受的运载体或稀释剂。
32.一种产生根据权利要求17至28中任一项所述的合成DC的群的方法，所述方法包括在诱导iPSC分化成DC的条件下培养根据权利要求1至8中任一项所述的iPSC。
33.一种产生根据权利要求17至28中任一项所述的合成DC的群的方法，所述方法包括(a)实施根据权利要求13至16中任一项所述的方法，和(b)在诱导iPSC分化成DC的条件下培养步骤(a)中产生的iPSC。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述条件符合现代优良生产实践(cGMP)。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离根据权利要求17至28中任一项所述的合成DC的群。
36.一种在有需要的患者中诱导针对抗原的T细胞应答的方法，包括将免疫有效量的根据权利要求25或26所述的合成DC给药至患者，从而在所述患者中诱导针对所述抗原的T细胞应答，所述合成DC负载有病毒或用病毒转染。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述方法诱导针对所述抗原的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
38.权利要求36或37所述的方法，其特征在于，所述方法诱导辅助性T细胞(Th细胞)应答，辅助性T细胞应答响应于所述抗原而优化CTL的激活。
39.根据权利要求36至38中的任一项，其特征在于，所述方法诱导Th细胞应答，所述Th细胞应答促进针对所述抗原的体液免疫并优化针对所述抗原的抗体应答的产生。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的方法，其特征在于，，
(a)所述抗原是肿瘤抗原，所述方法用于治疗患者的癌症；或
(b)所述抗原来自病原体，所述方法用于治疗患者的病原体感染。
41.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述方法诱导调节性T细胞(Treg)应答，以便调节针对自身抗原或无害外来抗原的有害免疫应答。
42.一种在有需要的患者中诱导针对抗原的耐受性的方法，所述方法包括：将免疫有效量的根据权利要求28所述的致耐受性DC给药至患者，从而在所述患者中诱导对所述抗原的耐受性，其中，所述DC负载有所述抗原、或用所述抗原转染、或内源性地表达所述抗原。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述抗原涉及患者的自身免疫疾病或将促进细胞或酶替代疗法以纠正患者的先天性病症。
44.根据权利要求36至43中任一项所述的方法，其特征在于，所述源DC从患者或与患者在呈递抗原所需的MHC限制性元件中的一种或多种上匹配的个体中衍生。
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