CN107119045A - 一种口腔拭子基因组dna提取方法及试剂盒 - Google Patents

一种口腔拭子基因组dna提取方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种口腔拭子DNA提取方法，在现有一般DNA提取方法的基础上，在以DNA结合柱提纯处理后，以ddH2O为洗脱液，并优选在60‑80℃条件下进行加热处理，极大的提高了口腔拭子提取的DNA的浓度与质量，避免了提取的DNA因浓度与质量不达标而需要重提带来的一系列不良影响，有效的节省了DNA的提取时间，提高了生产效率，有助于节省成本。

Description

一种口腔拭子基因组DNA提取方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种口腔拭子DNA提取方法及试剂盒。
背景技术
DNA提取是分子生物学的基本实验，它是不断发展的基因芯片检测中最基本的方法，也是基因芯片制备、分析和诊断的前提，因此，DNA提取是生物学最基础的技术之一。
成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解、核蛋白复合体的变性、核酸酶的灭活以及污染物的去除，通过理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。
目前，常用的DNA提取方法主要有玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法等物理方法，CTAB法、异硫氰酸胍法、碱裂解法等化学方式，以及酶提取法等生物提取方式；根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂提取等。其中，植物来源的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法、SDS法和高盐低pH法等；细菌、真菌来源的DNA提取方法为碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等；动物来源的DNA最为经典的提取方法主要有酚抽提法、异丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法，现行的很多方法都是在此基础上改进得来。
口腔黏膜为复层鳞状上皮，具有代谢旺盛、更新快、易脱落的特点，它由多层细胞组成，基底层具有旺盛分裂能力，其上皮脱落细胞虽然细胞核固缩，但与其他组织细胞一样具有完整的基因组DNA，从而成为法医学和遗传学DNA多态性检测分型的生物性检验材料。既往多采用酚氯仿法或 Chelex-100等方法，存在酚、氯仿污染或收获率低、纯度不高等缺点。
采用口腔拭子法(口腔脱落细胞)提取口腔上皮细胞是一种非介入、无痛苦、无创伤、简单的DNA标本采集方法，该方法适用于采集任何年龄段人群的DNA样本，同时也可应用于新生儿、婴幼儿或老弱病残者等不便采血人群之用。目前，随着口腔拭子法的广泛应用，单个样本下客户需求对应检测的项目越来越多，普通的DNA提取方法得到的DNA在浓度、质量方面已日益不能满足生产需求，很难满足单个样本需要检测多项项目中所要求的DNA的浓度与质量；而且整个提取方法用时较长、影响了实验检测的进度.迫切开发出一种DNA提取浓度高、质量好，能充分满足实验生产的要求的口腔拭子DNA提取方法。
发明内容
本发明提供了一种口腔拭子DNA提取方法，以解决了现有技术中DNA 提取方法提取产物浓度低、质量差的问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种口腔拭子DNA提取方法，包括如下步骤：
(1)取口腔拭子样品进行细胞的裂解和酶解处理，得到DNA酶解液；
(2)取处理后的DNA酶解液，以DNA结合柱进行纯化提取；
(3)将提取DNA后的结合柱以ddH2O为洗脱液，于60-80℃进行DNA 洗脱处理；
(4)收集所得洗脱液，即为所需的含DNA母液。
优选的，所述步骤(3)中，所述ddH2O的pH值为7.0-8.5。
进一步的，所述步骤(3)中，在进行洗脱处理之前，还包括将所述ddH2O 进行预热至60-80℃的步骤。
所述步骤(1)中，所述细胞的裂解和酶解处理步骤，具体包括：取所述口腔拭子加入裂解液和蛋白酶k充分混匀进行细胞裂解和酶解；随后加入缓冲液，静置反应至溶液变清亮，并加入无水乙醇混匀，固液分离后收集液体部分，即为所得DNA酶解液。
可选的，所述步骤(1)中，所述裂解液为Buffer ATL，所述裂解步骤的温度为50-60℃；所述缓冲液为Buffer AL，所述静置反应步骤的温度为 65-75℃。
所述步骤(2)中，所述纯化提取步骤具体包括：
取所述DNA结合柱加入所述DNA酶解液，离心，弃滤液；
取处理后的所述DNA结合柱，加入第一漂洗液混匀，离心并弃滤液；
取处理后的所述DNA结合柱，加入第二漂洗液混匀，离心并弃滤液，即可。
所述步骤(2)中，还包括对所述DNA结合柱进行预处理的步骤，即取部分所述DNA酶解液与所述DNA结合柱混匀，离心并弃滤液；以及对提纯后的所述DNA结合柱进行后处理的步骤，即将纯化提取后的所述DNA结合柱于原收集管内再次离心，并弃滤液。
所述第一漂洗液为乙醇稀释的Buffer GW1，所述第二漂洗液为乙醇稀释的BufferGW2，所述DNA结合柱为HiPure DNA MiniColumn I。
本发明还公开了一种口腔拭子DNA提取试剂盒，包括：
HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
本发明还公开了所述的口腔拭子DNA提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取口腔拭子的头端部位置于离心管内，加入所述裂解液和酶解液，于50-60℃充分混匀进行处理；随后加入所述缓冲液，于60-80℃静置反应至溶液变清亮，并加入所述无水乙醇混匀，固液分离后收集液体部分，即为DNA酶解液；
(2)把所述HiPure DNA MiniColumn I装在收集管中，加入部分所述 DNA酶解液混匀，离心并弃滤液；
把处理后的DNA结合柱装回收集管中，并加入剩余DNA酶解液，离心并弃滤液和收集管；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第一漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第二漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述结合柱装回收集管中，离心并收集所述HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
(3)将处理后的结合柱装在新的离心管中，加入预热至60-80℃的所述ddH2O至柱子的膜中央，并于60-80℃恒温洗脱处理；
(4)收集所得洗脱液，即为所需的含DNA母液。
有益效果：
本发明实施例提供了一种口腔拭子DNA提取方法，在现有一般DNA 提取方法的基础上，在以DNA结合柱提纯处理后，以ddH2O为洗脱液，并优选在60-80℃条件下进行加热处理，极大的提高了口腔拭子提取的DNA 的浓度与质量，避免了提取的DNA因浓度与质量不达标而需要重提带来的一系列不良影响，有效的节省了DNA的提取时间，提高了生产效率，有助于节省成本。
本发明所述口腔拭子DNA提取试剂盒，特别的以ddH2O为洗脱液，极大的提高了口腔拭子提取的DNA的浓度与质量，同时所述试剂盒使用方便，提取效率较高。
具体实施方式
实施例1
耗材：HiPure Blood&Tissue DNA Kit、移液枪(100-1000μl)、移液枪(10-100μl)、移液枪(0.1-2.5μl)、吸头1000μl、20μl、10μl、1.5/2.0ml 离心管、医用剪刀、吸水纸、无水乙醇(96-100％)、1.5ml EP管架；
实验器材：干式恒温器(K30)、涡旋混匀器、冰箱、NANODROP2000、台式离心机；
实验准备：将Protease K粉末加入适量的Protease Dissolve Buffer溶解至浓度为20mg/ml的酶解液，Protease K干粉可在2-8℃保存一年，但溶解的 Protease K需分装保存于-20℃，且反复冻融Protease K会影响其活性。
本实施例所述口腔拭子DNA提取方法，具体包括如下步骤：
(1)用剪刀将拭子头部分从其杆上剪入2.0ml离心管中，加入500μl Buffer ATL裂解液和20ul Proteinase k酶解液溶液，涡旋15sec混匀，并置于干式恒温器于56℃加热处理40min，其间每10min涡旋混匀，且混匀的时间不低于15s；
加入500μl Buffer AL缓冲液，涡旋15sec混匀，并于70℃放置处理10 min，此时溶液应变清亮；
加入500μl无水乙醇，涡旋15s混匀，并简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，得到DNA酶解液；
(2)把HiPure DNA MiniColumn I装在2ml收集管中，并转移750ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g离心处理1minn；
倒弃滤液，并把柱子装回收集管中，同时转移剩余混合液(包括沉淀) 至柱子中，10000×g离心处理1min，并弃去滤液和收集管；
把处理后的柱子装在新的收集管中，加入500ul Buffer GW1(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装在新的收集管中，加入650ul Buffer GW2(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装回收集管中，10000×g离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验；
(3)将漂洗后的柱子装在新的1.5ml离心管中，并加入50μl已提前预热至70℃的ddH2O(pH8.0)至柱子的膜中央，于70℃干式恒温器(K30)中恒温处理5min，10000×g离心处理1min；
将离心得到的洗脱溶液再加入至HiPure DNA MiniColumn中，室温下放置2min，10000×g离心2min；
(4)丢弃所述DNA结合柱，收集所得洗脱溶液，即为含DNA母液；将所得DNA母液保存于2-8℃，若长期保存需保存于-20℃；或者将所述 DNA母液加水稀释，稀释液4℃保存，母液放-20℃下保存。
实施例2
本实施例所述口腔拭子DNA提取方法，具体包括如下步骤：
(1)用剪刀将拭子头部分从其杆上剪入2.0ml离心管中，加入400μl Buffer ATL裂解液和15ul Proteinase k酶解液溶液，涡旋15sec混匀，并置于干式恒温器于50℃加热处理40min，其间每10min涡旋混匀，且混匀的时间不低于15s；
加入400μl Buffer AL缓冲液，涡旋15sec混匀，并于60℃放置处理10 min，此时溶液应变清亮；
加入400μl无水乙醇，涡旋15s混匀，并简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，得到DNA酶解液；
(2)把HiPure DNA MiniColumn I装在2ml收集管中，并转移500ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g离心处理1minn；
倒弃滤液，并把柱子装回收集管中，同时转移剩余混合液(包括沉淀) 至柱子中，10000×g离心处理1min，并弃去滤液和收集管；
把处理后的柱子装在新的收集管中，加入400ul Buffer GW1(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装在新的收集管中，加入600ul Buffer GW2(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装回收集管中，10000×g离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验；
(3)将漂洗后的柱子装在新的1.5ml离心管中，并加入20μl已提前预热至60℃的ddH2O(pH7.0)至柱子的膜中央，于60℃干式恒温器(K30)中恒温处理5min，10000×g离心处理1min；
将离心得到的洗脱溶液再加入至HiPure DNA MiniColumn中，室温下放置2min，10000×g离心2min；
(4)丢弃所述DNA结合柱，收集所得洗脱溶液，即为含DNA母液；将所得DNA母液保存于2-8℃，若长期保存需保存于-20℃。
实施例3
本实施例所述口腔拭子DNA提取方法，具体包括如下步骤：
(1)用剪刀将拭子头部分从其杆上剪入2.0ml离心管中，加入600μl Buffer ATL裂解液和25ul Proteinase k酶解液溶液，涡旋15sec混匀，并置于干式恒温器于60℃加热处理40min，其间每10min涡旋混匀，且混匀的时间不低于15s；
加入600μl Buffer AL缓冲液，涡旋15sec混匀，并于80℃放置处理10 min，此时溶液应变清亮；
加入600μl无水乙醇，涡旋15s混匀，并简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，得到DNA酶解液；
(2)把HiPure DNA MiniColumn I装在2ml收集管中，并转移750ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g离心处理1minn；
倒弃滤液，并把柱子装回收集管中，同时转移剩余混合液(包括沉淀) 至柱子中，10000×g离心处理1min，并弃去滤液和收集管；
把处理后的柱子装在新的收集管中，加入600ul Buffer GW1(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装在新的收集管中，加入700ul Buffer GW2(已用乙醇稀释)漂洗液至柱子上，10000×g离心处理1min；
倒弃滤液，把柱子装回收集管中，10000×g离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验；
(3)将漂洗后的柱子装在新的1.5ml离心管中，并加入100μl已提前预热至80℃的ddH2O(pH8.5)至柱子的膜中央，于80℃干式恒温器(K30) 中恒温处理5min，10000×g离心处理1min；
将离心得到的洗脱溶液再加入至HiPure DNA MiniColumn中，室温下放置2min，10000×g离心2min；
(4)丢弃所述DNA结合柱，收集所得洗脱溶液，即为含DNA母液；将所得DNA母液保存于2-8℃，若长期保存需保存于-20℃。
实施例4试剂盒
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒，包括：
HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)取口腔拭子的头端部位置于离心管内，加入所述裂解液和酶解液，于50-60℃充分混匀进行处理；随后加入所述缓冲液，于60-80℃静置反应至溶液变清亮，并加入所述无水乙醇混匀，固液分离后收集液体部分，即为DNA酶解液；
(2)把所述HiPure DNA MiniColumn I装在收集管中，加入部分所述 DNA酶解液混匀，离心并弃滤液；
把处理后的DNA结合柱装回收集管中，并加入剩余DNA酶解液，离心并弃滤液和收集管；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第一漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第二漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述结合柱装回收集管中，离心并收集所述HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
(3)将处理后的结合柱装在新的离心管中，加入预热至60-80℃的所述ddH2O至柱子的膜中央，并于60-80℃恒温洗脱处理；离心并得到的洗脱溶液再加入至HiPure DNAMiniColumn中，室温下放置2min，离心洗脱液；
(4)收集所得洗脱液，即为所需的含DNA母液，保存备用。
本实施例所述试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。若所述试剂盒在2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。若缓冲液中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
实施例5试剂盒
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒，包括：
HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒的使用方法同实施例4。
实施例6试剂盒
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒，包括：
HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
本实施例所述口腔拭子DNA提取试剂盒的使用方法同实施例4。
对比例
本对比例所述口腔拭子DNA提取方法同实施例1，其区别仅在于，所述步骤(3)中，以现有技术一般洗脱液Buffer AE在常温下进行洗脱处理。
实验例
分别按照实施例1和对比例1中方法，对同一批口腔拭子样本进行DNA 提取处理，并记录各项参数于下表1。
表1口腔拭子DNA提取结果
从上表数据可知，本发明所述口腔拭子DNA提取方法，在DNA结合柱提纯处理后，以ddH2O为洗脱液，并在60-80℃条件下加热处理有助于进一步提高DNA的得率和质量，同时有效节省了DNA的提取时间。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取口腔拭子样品进行细胞的裂解和酶解处理，得到DNA酶解液；
(2)取处理后的DNA酶解液，以DNA结合柱进行纯化提取；
(3)将提取DNA后的结合柱以ddH2O为洗脱液，于60-80℃进行DNA洗脱处理；
(4)收集所得洗脱液，即为所需的含DNA母液。
2.根据权利要求1所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述ddH2O的pH值为7.0-8.5。
3.根据权利要求1或2所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在进行洗脱处理之前，还包括将所述ddH2O进行预热至60-80℃的步骤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述细胞的裂解和酶解处理步骤，具体包括：取所述口腔拭子加入裂解液和蛋白酶k充分混匀进行细胞裂解和酶解；随后加入缓冲液，静置反应至溶液变清亮，并加入无水乙醇混匀，固液分离后收集液体部分，即为所得DNA酶解液。
5.根据权利要求4所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述裂解液为Buffer ATL，所述裂解步骤的温度为50-60℃；所述缓冲液为Buffer AL，所述静置反应步骤的温度为65-75℃。
6.根据权利要求1-5任一项所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述纯化提取步骤具体包括：
取所述DNA结合柱加入所述DNA酶解液，离心，弃滤液；
取处理后的所述DNA结合柱，加入第一漂洗液混匀，离心并弃滤液；
取处理后的所述DNA结合柱，加入第二漂洗液混匀，离心并弃滤液，即可。
7.根据权利要求6所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括对所述DNA结合柱进行预处理的步骤，即取部分所述DNA酶解液与所述DNA结合柱混匀，离心并弃滤液；以及对提纯后的所述DNA结合柱进行后处理的步骤，即将纯化提取后的所述DNA结合柱于原收集管内再次离心，并弃滤液。
8.根据权利要求6或7所述的口腔拭子DNA提取方法，其特征在于，所述第一漂洗液为乙醇稀释的Buffer GW1，所述第二漂洗液为乙醇稀释的Buffer GW2，所述DNA结合柱为HiPureDNA MiniColumn I。
9.一种口腔拭子DNA提取试剂盒，其特征在于，包括：
10.权利要求9所述的口腔拭子DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取口腔拭子的头端部位置于离心管内，加入所述裂解液和酶解液，于50-60℃充分混匀进行处理；随后加入所述缓冲液，于60-80℃静置反应至溶液变清亮，并加入所述无水乙醇混匀，固液分离后收集液体部分，即为DNA酶解液；
(2)把所述HiPure DNA MiniColumn I装在收集管中，加入部分所述DNA酶解液混匀，离心并弃滤液；
把处理后的DNA结合柱装回收集管中，并加入剩余DNA酶解液，离心并弃滤液和收集管；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第一漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述HiPure DNA MiniColumn I装入新的收集管中，加入所述第二漂洗液混匀，离心并弃滤液；
把所述结合柱装回收集管中，离心并收集所述HiPure DNA MiniColumn I结合柱；
(3)将处理后的结合柱装在新的离心管中，加入预热至60-80℃的所述ddH2O至柱子的膜中央，并于60-80℃恒温洗脱处理；
(4)收集所得洗脱液，即为所需的含DNA母液。
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