CN113462741A - 一种常温下长期保存核酸的试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种保存核酸的试剂及方法，尤其涉及一种常温下长期保存核酸的试剂及方法；本发明的常温下核酸长期保存试剂，其中溶解有0.15‑0.30g/L的载银沸石抗菌剂，0.15‑0.30mg/L的维生素E，0.25‑0.35mg/L的维生素C，并调节pH至6.0‑9.0；本发明常温下核酸长期保存方法，包括提取好的核酸与保存试剂充分混匀，常温下密闭干燥储存；本发明的常温下长期保存核酸的试剂及方法，适用于常温下长期保存核酸（DNA和RNA）、操作简单、适用性较好、空间占用少、能源消耗少，可应用于大规模样品储存。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样本保存试剂及方法，尤其涉及一种常温下核酸长期保存试剂及方法。
背景技术
核酸是生物特有的重要的大分子化合物，广泛存在于各类生物细胞中。核酸携带有生物遗传信息，是遗传研究、疾病研究等重要的研究材料，然而，核酸在许多条件下均可能发生降解。造成核酸降解的外界物理因素如温度、湿度、紫外线等；化学因素如pH值、水解反应、氧化反应等；生物因素如酶解及微生物侵染等。这造成核酸在自然环境下无法稳定保存。
目前已经有一些研究核酸的长期保存，例如：一种DNA分子长期保存且可视化的保存方法及其装置（申请号200810017680 .2）所用方法存在一些不足，如：（1）DNA分子与EB等核酸染料结合，而EB等染料往往存在致癌等生物毒性；（2）需在紫外线下对目的DNA分子进行割胶，由于紫外线会引起DNA分子的损伤，能诱导胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，导致DNA分子信息的失真，失去DNA分子保存的价值和意义；（3）需要通过电泳对DNA分子进行分离，电泳过程潜在会对DNA分子产生损伤。为保持人体基因组DNA基因结构的完整性、理化性质及生物学活性的稳定性，国内外开展基因样本保存服务的公司或机构通常将制备得到的基因组DNA样本存贮在超低温条件下，避免物理、化学和生物因素对人体基因组DNA样本产生不利影响。然而，这种超低温保存策略也带来了诸多弊端，如费用甚为昂贵、需要专业冷冻设备、耗费大量电力、个人难以实施等问题，而且存在由于停电导致的样本损坏风险。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用于常温下长期保存核酸的试剂及方法，常温下实现DNA和RNA的长期保存且保证其不发生降解、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品储存的常温下核酸长期保存试剂及方法。
本发明的常温下核酸长期保存试剂及方法，其中保存试剂溶解有0.15-0.30g/L的载银沸石抗菌剂，0.15-0.30mg/L的维生素E，0.25-0.35mg/L的维生素C，并调节pH至6.0-9.0；核酸长期保存方法包括提取好的核酸与保存试剂充分混匀，常温下真空干燥，常温下密闭干燥储存。
进一步的，所述保存试剂中溶解有0.20-0.30g/L的载银沸石抗菌剂。
具体的，所述保存试剂中溶解有0.25g/L的载银沸石抗菌剂。
进一步的，所述保存试剂中溶解有0.20-0.30mg/L的维生素E。
具体的，所述保存试剂中溶解有0.255mg/L的维生素E。
进一步的，所述保存试剂中溶解有0.30-0.35mg/L的维生素C。
具体的，所述保存试剂中溶解有0.32mg/L的维生素C。
进一步的，所述保存试剂调节pH至7.0-9.0。
具体的，所述保存试剂调节pH至8.0。
进一步的，所述长期保存方法要求核酸与保存试剂充分混匀。
进一步的，所述长期保存方法中核酸可以是DNA也可以是RNA。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：按照以上配方配制保存试剂及按照方法进行保存，将提取好的核酸直接置于保存试剂中，真空干燥后，无需冻存，即可达到保护其中的DNA和RNA不发生降解。使用该试剂和方法保存的核酸，可以在常温下达到-80℃冰箱保存的效果，从而无需昂贵的保存设备，也节省电费，绿色环保；也可以实现核酸样本的常温运输。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是按照本发明方法常温保存3个月后人非小细胞肺癌组织DNA与在-80℃冰箱冷冻保存的同样的人非小细胞肺癌组织DNA电泳对比图，其中M1道是电泳Marker，1-3道是按照本发明方法常温保存3个月后人非小细胞肺癌组织DNA，2-6道是在-80℃冰箱冷冻保存的人非小细胞肺癌组织DNA。
图2是按照本发明方法常温保存3个月后人非小细胞肺癌组织RNA进行Agilent2200Tapestation毛细管电泳获得的结果图。
图3是在-80℃冰箱冷冻保存的人非小细胞肺癌组织RNA进行Agilent2200Tapestation毛细管电泳获得的结果图。
图4是按照本发明方法常温保存3个月后人非小细胞肺癌组织RNA与在-80℃冰箱冷冻保存的同样的人非小细胞肺癌组织RNA电泳对比图，其中M1道是电泳Marker，1道是按照本发明方法常温保存3个月后人非小细胞肺癌组织RNA，2道是在-80℃冰箱冷冻保存的人非小细胞肺癌组织RNA。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一。
1.按照表1成分组成配置核酸长期保存试剂。
2.配置好的核酸长期保存试剂置于高压蒸汽灭菌锅中，压力为103.4kPa（1.05kg/cm2），温度为121.3°C条件下，灭菌30分钟。
实施例二
1.提取手术切除的新鲜非小细胞肺癌组织DNA，DNA提取均按照如下方案进行：
(1)取组织20mg；
(2)加入180μl Buffer ATL ,使用Tissuelyser进行组织匀浆后再加入20ul蛋白酶K，混匀，56℃消化1-3h或直至消化完全；
(3)向步骤(2)所得消化后的样本中加入4μl RNase A(Takara ,10mg/ml)，上下颠倒混匀后，常温消化2mins；
(4)向步骤(3)所得的消化后的样本加入200μl Buffer AL，用移液枪吸打混匀，再加入200μl乙醇(96％-100％)混匀，用移液枪吸打混匀后得混合液；
(5)转移混合液到过滤柱Spin column，采用2ml收集管，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；
(6)加500μlBuffer AW1到过滤柱中，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；
(7)加500μlBuffer AW2到过滤柱中，涡旋混匀15s，14000rpm离3min，弃滤液及旧收集管；
(8)将过滤柱转移至新1 .5ml离心管，100μlBuffer AE温室孵育1min，14000rpm离心1min洗脱；
(9)进行DNA定量。
2.将提取好的非小细胞肺癌组织DNA按照体积平均分成2份，1份置于-80℃冰箱冷冻保存3个月；1份按照本发明方法常温保存3个月，具体方法如下：
(1)向DNA溶液中加入等体积的实施例1配置的保存试剂，涡旋30s，充分混匀；
(2)盖紧离心管管盖，瞬时离心20s，然后用封口膜密封离心管口；
(3)将密封后的离心管置于通风干燥处。
3.结果
(1)按照本发明方法常温保存3个月后的非小细胞肺癌DNA无明显降解，与-80℃冰箱冷冻保存的DNA没有明显差异。
(2)将按照本发明方法常温保存3个月后的非小细胞肺癌DNA与-80℃冰箱冷冻保存的同样的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图1。
实施例三
1.提取手术切除的新鲜小细胞肺癌组织RNA，RNA提取均按照如下方案进行：
(1)取组织20mg；
(2)匀浆处理：向20 mg组织加300 μl裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨；
(3)随后向匀浆液中加入590 μl RNase-Free ddH2O和10 μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20 min；
(4)12,000 rpm离心5 min，取上清进行以下操作；
(5)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中12,000 rpm离心 60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
(6)向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(7)向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室温放置15 min；
(8)向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
(9)向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW ，室温静置 2 min，12,000 rpm离心60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
(10)重复步骤8；
(11)12,000 rpm离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置5分钟；
(12)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30- 100 μl RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到 RNA溶液；
(13)进行RNA定量。
2.将提取好的非小细胞肺癌组织RNA按照体积平均分成2份，1份置于-80℃冰箱冷冻保存3个月；1份按照本发明方法常温保存3个月，具体方法如下：
(1)向RNA溶液中加入等体积的实施例1配置的保存试剂，涡旋30s，充分混匀；
(2)盖紧离心管管盖，瞬时离心20s，然后用封口膜密封离心管口；
(3)将密封后的离心管置于通风干燥处。
3.结果
(1)按照本发明方法常温保存3个月后的非小细胞肺癌RNA无降解，见图2。
(2)将按照本发明方法常温保存3个月后的非小细胞肺癌RNA和-80℃冰箱冷冻保存的同样的RNA进行Agilent 2200Tapestation毛细管电泳，结果见图2-图3。
(3)将按照本发明方法常温保存3个月后的非小细胞肺癌RNA与-80℃冰箱冷冻保存的同样的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图4。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：其中溶解有0.15-0.30g/L的载银沸石抗菌剂，0.15-0.30mg/L的维生素E，0.25-0.35mg/L的维生素C，并调节pH至6.0-9.0。
2.一种常温下核酸长期保存方法，包括提取好的核酸与保存试剂充分混匀，常温下密闭干燥储存。
3.根据权利要求1所述的常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：所述保存试剂中溶解有0.20-0.30g/L的载银沸石抗菌剂。
4.根据权利要求2所述的常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：所述保存试剂中溶解有0.25g/L的载银沸石抗菌剂。
5.根据权利要求1所述的常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：所述保存试剂中溶解有0.255mg/L的维生素E。
6.根据权利要求1所述的常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：所述保存试剂中溶解有0.32mg/L的维生素C。
7.根据权利要求1所述的常温下核酸长期保存试剂，其特征在于：所述保存试剂调节pH至8.0。
8.根据权利要求2所述的核酸长期保存方法，其特征在于：将提取好的核酸与权利要求1所述的保存试剂充分混匀。
9.根据权利要求11所述的核酸长期保存方法，其特征在于：提取好的核酸可以是DNA也可以是RNA。
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| 范铁彬等: "载银沸石抗菌剂的研制", 《沈阳理工大学学报》, vol. 33, no. 4, 15 August 2014 (2014-08-15), pages 21 - 23 * |
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