CN114250223A - 一种燕麦叶片基因组快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种燕麦叶片基因组快速提取方法，属于分子生物学技术领域。本发明公开的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，包括：将燕麦叶片剪碎，放入离心管中，加入缓冲液，用研磨机研磨；水浴后裂解细胞，离心，离心后取上清液加入等体积氯仿，混匀，离心；离心后取上清液加入等体积无水乙醇，‑20℃放置，离心，去上清，超净工作台吹干沉淀，加入ddH2O溶解DNA。本发明方法大幅减少了提取实验所用的时间，适用于燕麦叶片样品的基因组DNA提取；且本发明方法所用试剂成本低廉，容易配制，且操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种燕麦叶片基因组快速提取方法。
背景技术
基因组DNA是生物遗传信息的载体。目前，常用的燕麦基因组DNA提取方法主要有三种：SDS提取法、CTAB提取法和高盐低pH提取法。这三种方法存在提取程序繁琐、时间长、使用多种有毒有害的试剂等问题。试剂盒法虽然能有效减少有毒有害的试剂，但成本较高、提取DNA量较少，有时会有降解。
燕麦是一年生粮饲兼用禾本科作物，具有很高的营养、药用价值以及作为饲料带来的经济价值，播种面积及产量仅次于水稻、小麦、大麦、玉米和高粱。提取燕麦DNA是燕麦分子生物学研究的前提，因此研究燕麦叶片高质、高效的DNA提取方法，对燕麦DNA分子水平上的研究具有重要意义。
因此，提供一种燕麦叶片基因组快速提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种燕麦叶片基因组快速提取方法，简单、无毒、高效，且对实验室设备条件要求不高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种燕麦叶片基因组快速提取方法，具体步骤如下：
(1)将燕麦叶片剪碎，放入离心管中，加入缓冲液，研磨；
所述缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2ml，7.45g KCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后60-70℃水浴20-30min，期间颠倒混匀；
(3)冷却至室温后，离心，取上清液；
(4)向步骤(3)的上清液中加入等体积的氯仿，混合摇匀，离心；
(5)离心后取上清液，加入等体积的无水乙醇，-20℃放置20-40min；
(6)离心，弃上清，风干沉淀，加入ddH2O溶解DNA。
进一步，步骤(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中；加入600-800μl60-70℃预热的缓冲液；用组织研磨仪进行研磨，4000-5000r/min研磨4-6min。
进一步，步骤(2)所述水浴期间颠倒混匀4-5次。
进一步，步骤(3)和步骤(4)所述离心为10000-12000r/min离心8-12min。
进一步，步骤(5)所述无水乙醇为提前-20℃预冷的无水乙醇。
进一步，步骤(6)所述离心为10000-12000r/min离心4-6min。
进一步，步骤(6)所述ddH2O加入量为50-100μl。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种燕麦叶片基因组快速提取方法，具有以下有益效果：
(1)本发明对组织样品进行研磨时，只需在装有燕麦叶片的离心管中放入研磨钢珠，在研磨仪中进行研磨即可；省去了用液氮研磨的步骤，在提取大量样品的基因组时占优势，降低了成本，省时省力；
(2)本发明省去了异戊醇和异丙醇有害试剂的使用，有效降低了对实验人员身体健康潜在的伤害及实验废液对生态环境的破坏；
(3)本发明方法相较于CTAB法、SDS法等方法，所用的设备和药品相对较少，经济节约；
(4)本发明方法所用试剂普遍，实验流程简单，缩短了实验时间，能提取高质量燕麦基因组DNA，为燕麦种质资源遗传多样性分析、种质鉴定、分类等分子生物学研究提供重要技术支持。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可购买获得。
离心均在室温条件下进行。
实施例1
一种燕麦叶片基因组快速提取方法，具体步骤如下：
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入600μl 60℃预热的缓冲液，用组织研磨仪进行研磨，4000r/min研磨6min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2ml，7.45gKCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后60℃水浴30min，期间颠倒混匀4-5次；
(3)冷却至室温后，10000r/min离心12min，取上清液；
(4)向步骤(3)的上清液中加入等体积氯仿，混合摇匀，10000r/min离心12min；
(5)离心后取上清液，加入-20℃预冷的等体积的无水乙醇，-20℃放置20min；
(6)10000r/min离心6min，弃上清，风干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA。
实施例2
一种燕麦叶片基因组快速提取方法，具体步骤如下：
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入700μl 65℃预热的缓冲液，用组织研磨仪进行研磨，4500r/min研磨5min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2ml，7.45gKCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后65℃水浴25min，期间颠倒混匀4-5次；
(3)冷却至室温后，11000r/min离心10min，取上清液；
(4)向步骤(3)的上清液中加入等体积氯仿，混合摇匀，11000r/min离心10min；
(5)离心后取上清液，加入-20℃预冷的等体积的无水乙醇，-20℃放置40min；
(6)11000r/min离心5min，弃上清，风干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA。
实施例3
一种燕麦叶片基因组快速提取方法，具体步骤如下：
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入800μl 70℃预热的缓冲液，用组织研磨仪进行研磨，5000r/min研磨4min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2ml，7.45gKCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后70℃水浴20min，期间颠倒混匀4-5次；
(3)冷却至室温后，12000r/min离心8min，取上清液。
(4)向步骤(3)的上清液中加入等体积氯仿，混合摇匀，12000r/min离心8min；
(5)离心后取上清液，加入-20℃预冷的等体积的无水乙醇，-20℃放置30min；
(6)12000r/min离心4min，弃上清，风干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA。
对比例1
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入65℃预热的缓冲液700μl，放入组织研磨仪中，4000r/min研磨5min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10ml，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2ml，7.45gKCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后65℃水浴30min，期间颠倒混匀3～4次；
(3)冷却至室温后，12000r/min离心10min，取上清液；
(4)向步骤(3)的上清液中加入700μl氯仿/异戊醇/乙醇(体积比为20：1：4)，混合摇匀，12000r/min离心10min，转移上清至新的离心管中；
(5)加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min，12000r/min，离心10min，弃上清；
(6)加70％乙醇500μl洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清；
(7)超净台吹干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA，置于-20℃保存。
对比例2
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入65℃预热的缓冲液700μl，放入组织研磨仪中，4000r/min研磨5min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2mL，5.85gNaCl，SDS 20％(质量体积比)，ddH2O定容到100ml。
(2)研磨后65℃水浴30min，期间颠倒混匀3～4次；
(3)冷却至室温后，12000r/min离心10min，取上清液。
(4)向上清液中加入等体积的氯仿，混合摇匀，12000r/min离心10min，转移上清至新的离心管中；
(5)加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min，12000r/min，离心10min，弃上清；
(6)加70％乙醇500μl洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清；
(7)超净台吹干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA，置于-20℃保存。
对比例3
(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中，加入65℃预热的缓冲液700μl，放入组织研磨仪中，4000r/min研磨5min；
缓冲液配方为：1M Tris-HCl(pH8.0)10mL，0.5M EDTA二钠盐(pH8.0)2mL，5.85gNaCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后65℃水浴30min，期间颠倒混匀3～4次；
(3)冷却至室温后，12000r/min离心10min，取上清液；
(4)向上清液中加入等体积的氯仿，混合摇匀，12000r/min，离心10min，转移上清至新的离心管中；
(5)重复步骤(4)两到三次；
(6)加入与上清液等体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min，12000r/min离心10min，弃上清；
(7)超净台吹干沉淀，加入100μl ddH2O溶解DNA，置于-20℃保存。
分别利用实施例1-3和对比例1-3的方法提取燕麦叶片的基因组DNA，并利用超微量紫外分光光度计对提取得到的燕麦叶片基因组DNA进行浓度和纯度分析，结果见表1。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | |
| 浓度ng/μl | 839.2 | 826.3 | 857.5 | 701.8 | 509.6 | 494.0 |
| A260/A280 | 1.97 | 1.98 | 1.97 | 2.01 | 1.96 | 2.04 |
| A260/A230 | 1.98 | 1.97 | 1.99 | 1.95 | 1.82 | 1.90 |
表1结果表明，6种提取方法提取得到的燕麦叶片基因组DNA在纯度方面基本相当，但本发明实施例1-3的提取方法得到的燕麦叶片基因组DNA浓度较高；表明采用本发明实施例1-3的方法提取燕麦基因组DNA的得率高，纯度好。纯度好的DNA A260/A280的比值应该在1.8-2.0，A260/A230的比值在2.0左右。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将燕麦叶片剪碎，放入离心管中，加入缓冲液，研磨；
所述缓冲液配方为：1M Tris-HCl pH8.010ml，0.5M EDTA二钠盐pH8.02ml，7.45g KCl，ddH2O定容到100ml；
(2)研磨后60-70℃水浴20-30min，期间颠倒混匀；
(3)冷却至室温后，离心，取上清液；
(4)向步骤(3)的上清液中加入等体积的氯仿，混合摇匀，离心；
(5)离心后取上清液，加入等体积的无水乙醇，-20℃放置20-40min；
(6)离心，弃上清，风干沉淀，加入ddH2O溶解DNA。
2.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(1)将0.1g燕麦叶片剪碎，放入2ml离心管中；加入600-800μl 60-70℃预热的缓冲液；用组织研磨仪进行研磨，4000-5000r/min研磨4-6min。
3.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(2)所述水浴期间颠倒混匀4-5次。
4.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)所述离心为10000-12000r/min离心8-12min。
5.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(5)所述无水乙醇为提前-20℃预冷的无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(6)所述离心为10000-12000r/min离心4-6min。
7.根据权利要求1所述的一种燕麦叶片基因组快速提取方法，其特征在于，步骤(6)所述ddH2O加入量为50-100μl。
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| CN202111546466.8A Pending CN114250223A (zh) | 2021-12-16 | 2021-12-16 | 一种燕麦叶片基因组快速提取方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN115058532A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-09-16 | 山西农业大学 | 用于燕麦成熟期基因表达分析的内参基因及应用 |
| CN115058533A (zh) * | 2022-06-06 | 2022-09-16 | 吉林省白城市农业科学院(吉林省向日葵研究所) | 用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用 |
Citations (1)
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| CN108410857A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-08-17 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种有效提取互叶白千层基因组dna的方法 |
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2021
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Patent Citations (1)
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| CN108410857A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-08-17 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种有效提取互叶白千层基因组dna的方法 |
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| CN115058532B (zh) * | 2022-06-06 | 2024-03-19 | 山西农业大学 | 用于燕麦成熟期基因表达分析的内参基因及应用 |
| CN115058533B (zh) * | 2022-06-06 | 2024-05-24 | 吉林省白城市农业科学院(吉林省向日葵研究所) | 用于燕麦茎中基因表达分析的内参基因及应用 |
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