CN108410857A - 一种有效提取互叶白千层基因组dna的方法 - Google Patents

一种有效提取互叶白千层基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其包括以下步骤：（1）用液氮研磨样品至粉末状后移至离心管，加入常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；（2）取出离心管冷却至室温，加入氯仿与异戊醇混合液，混匀后离心分离；（3）取上清液，加入氯仿，混匀后离心分离；（4）取上清液，加入常规预冷的无水乙醇，混匀后在‑20℃下静置30min后离心分离，弃上清液；（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀，室温下干燥并加入DNA溶解缓冲液，置于‑20℃保存备用。本方法能有效、快速地提取出纯度高、适用于PCR检测的互叶白千层基因组DNA，并且在提取过程中减少有毒药品的使用。

Description

一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于植物DNA提取技术领域，具体涉及互叶白千层的基因组DNA提取方法。
背景技术
互叶白千层（Melaleucaalternifolia）是桃金娘科（Myrlaceaca）白千层属（Melaleuca）常绿灌木至小乔木树种，自然分布于澳大利亚东北部的昆士兰州和新南威尔士州北部。互叶白千层新鲜枝叶可提取精油，杀菌效果佳，广泛应用于食品、制药、香料等行业。
互叶白千层精油根据组分不同分为三种不同生化类型。根据不同的利用目的，选择引种不同生化类型的互叶白千层可避免不必要的经济损失。但是不同生化类型互叶白千层表型特征区分困难，化学分析工艺复杂，所以目前普遍采用具有快速、准确特点的分子生物技术来鉴定植物的品种。其中PCR技术是分子生物学基本技术，是开展植物品种鉴定的基础，而高质量DNA的提取是进行PCR检测的前提，所以采用合适的方法提取互叶白千层基因组DNA对于它的品种鉴定尤为重要。
在研究植物DNA提取方法时需要注意的是一种植物DNA提取方法往往不能很好的应用于不同种类的植物DNA的提取。其原因是植物除了含有蛋白质、糖类、脂肪等主要物质外，还有一些存在于植物体内，虽然与植物的生长发育无直接关系、但却对植物适应不良环境或抵御病原物侵害以及植物的代谢调控等都有重要作用的有机物。这一类物质被称为次生物质，其种类繁杂，而且在植物体内合成和分解产生的次生代谢产物也是极其复杂，这使得不同植物之间的基因组DNA有较大的区别。因此DNA的提取方法也会有所区别。
目前，提取互叶白千层基因组DNA的方法还未见有报道，采用常规的SDS法和CTAB法提取互叶白千层基因组DNA时，所获得的DNA质量差、用于PCR扩增的效果差，而采用试剂盒提取互叶白千层基因组DNA，成本高、DNA得率低。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，该方法可以提取适合分子鉴定的高质量高浓度的互叶白千层基因组DNA，并且还具有毒性小、易操作、成本低的优点。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，包括以下步骤：
（1) 用液氮研磨互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；
（2) 取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：氯仿:异戊醇=24:1，混匀后于12000r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用。
步骤（1)所述的DNA提取缓冲液的配方为：2% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1M NaCl；
步骤（1）所述的鲜叶样重量为1-2g，所述的DNA提取缓冲液加入量为600μl-800μl；
步骤（5）所述的DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mMEDTA、20-30μg/ml RNA酶。
作为进一步优化，步骤（1）所述的鲜叶样重量为1g，所述的DNA提取缓冲液加入量为600μl。
作为进一步优化，步骤（5）所述的DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mM EDTA、20μg/ml RNA酶。
本发明方法与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明的互叶白千层DNA的提取方法与常用CTAB法相比，在DNA的提取纯化过程中避免使用有毒的β-巯基乙醇和酚类药品等；在DNA的提取缓冲液中也没有使用聚乙烯基吡咯烷酮，这样增强了互叶白千层DNA提取方法的安全性，并且减少药品的使用不仅节省实验操作时间也节省了实验的成本。
2、因为在溶液里，DNA以水合状态稳定存在的，所以本发明在步骤（4）中加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇可以有效夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合，而在混匀后于-20℃静置30min沉淀，是因为在低温环境下可以有效抑制DNA的降解。
3、本发明方法中所述的DNA溶解缓冲液里添加了20-30μg/ml RNA酶，这样可以降解DNA溶液中的RNA；因为RNA酶是一类催化RNA降解的核酸酶，其本质也是一种蛋白质，蛋白质含量过多会对DNA的检测或PCR扩增造成影响，所以为了提取到高质量的DNA，本发明科学添加适量的RNA酶，严格控制DNA溶液中的蛋白质含量。
4、由于树叶样品容易发生枯萎、腐烂和DNA降解等现象，选用1-2g的互叶白千层鲜叶用于提取DNA，可以保证提取到高质量的基因组DNA，加入600μl-800μl的DNA提取缓冲液保证有足量的CTAB与蛋白质等杂质形成复合物而沉淀分离。
5、本发明的互叶白千层DNA提取方法实验步骤简单、操作容易、实验结果稳定、重复性好，而且成本低、提取的DNA质量高，适用于PCR检测。
附图说明
图1为实施例1中用本方法提取的互叶白千层基因组DNA电泳检测图。
图2 为实施例2中用本方法提取的互叶白千层基因组DNA电泳检测图。
图3为实施例3中用本方法提取的互叶白千层基因组DNA电泳检测图。
图4为对比例1中用常规CTAB提取法提取互叶白千层基因组DNA电泳检测图。
图5为对比例2中用常规SDS提取法提取互叶白千层基因组DNA电泳检测图。
图6为应用例1中互叶白千层基因组DNA采用Embra203引物的SSR-PCR扩增带型。
图7为应用例2中互叶白千层基因组DNA采用UBC826引物的ISSR-PCR扩增带型。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，具体包括如下步骤：
（1）用液氮研磨1g互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入600µl常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min，其中DNA提取缓冲液的配方为：2% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1M NaCl；
（2）取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：氯仿:异戊醇=24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲，置于-20℃保存备用；其中DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mM EDTA、20μg/ml RNA酶。
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用本实施例的互叶白千层基因组DNA提取方法，进行互叶白千层DNA的提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（见图1）和NanaDrop2000超微量分光光度计检测，计算得到DNA浓度以及DNA质量参数（OD260/OD280）如表1。
表1
实施例2：
一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，具体包括如下步骤：
（1）用液氮研磨2g互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入800µl常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；其中DNA提取缓冲液的配方为：2% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1M NaCl；
（2）取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：氯仿:异戊醇=24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用；其中DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mMEDTA、30μg/ml RNA酶。
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用本实施例的互叶白千层基因组DNA提取方法，进行互叶白千层DNA的提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（见图2）和NanaDrop2000超微量分光光度计检测，计算得到DNA浓度以及DNA质量参数（OD260/OD280）如表2。
表2
实施例3：
一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，具体包括如下步骤：
（1）用液氮研磨1.5g互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入700µl常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；其中DNA提取缓冲液的配方为：2% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1M NaCl；
（2）取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：氯仿:异戊醇=24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用；其中DNA溶解缓冲液的配方为： PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mMEDTA、25μg/ml RNA酶。
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用本实施例的互叶白千层基因组DNA提取方法，进行互叶白千层DNA的提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（见图3）和NanaDrop2000超微量分光光度计检测，计算得到DNA浓度以及DNA质量参数（OD260/OD280）如表3。
表3
对比例1：
采用常规CTAB提取法提取互叶白千层基因组DNA，具体包括以下步骤：
（1） 用液氮研磨1g互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入600µl常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；其中DNA提取缓冲液的配方为： 3% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1.4M NaCl、0.2% β-巯基乙醇、5% 聚乙烯基吡咯烷酮；
（2）取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用；其中DNA溶解缓冲液的配方为： PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mMEDTA、20μg/ml RNA酶。
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用本对比例的互叶白千层基因组DNA提取方法，进行互叶白千层DNA的提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（见图4）和NanaDrop2000超微量分光光度计检测，计算得到DNA浓度以及DNA质量参数（OD260/OD280）如表4。
表4
对比例2：
采用常规SDS提取法提取互叶白千层基因组DNA，具体包括以下步骤：
（1）用液氮研磨1g互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入1.2 ml常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；其中DNA提取缓冲液的配方为： 3% SDS、PH为8.0的50mM Tris-HCl、PH为8.0的50mM EDTA、1M NaCl、1% β-巯基乙醇；
（2) 取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入0.45 ml 5M醋酸钾，混匀后冰浴20min，在10000 r/min离心20 min；
（5）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的冰预冷的异丙醇，混匀后在-20℃温度下静置30分钟沉淀核酸；
（6）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用；其中DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mMEDTA、20μg/ml RNA酶。
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用本对比例的互叶白千层基因组DNA提取方法，进行互叶白千层DNA的提取，经1.5%琼脂糖凝胶电泳（见图5）和NanaDrop2000超微量分光光度计检测，计算得到DNA浓度以及DNA质量参数（OD260/OD280）如表5。
表5
在现有技术中一般认为，高纯度DNA的OD260/OD280的比值应在1.8-2.0之间。当这一比值小于1.8时，说明DNA样品中存在蛋白质的污染；当比值大于2.0时，说明DNA样品中的RNA含量较高。在实施例1-3和对比例1里提取的DNA达到质量要求，但是采用对比例1方法提取的DNA浓度普遍较低，而且各样品间浓度值相差较大，这说明了对比例1的方法实验稳定性和重复性较差。采用对比例2方法提取到的DNA质量普遍较差且浓度不高，不适合用于互叶白千层基因组DNA的提取。由此可知本发明所提供的方法相比常规的植物DNA提取方法更适合从互叶白千层新鲜叶样中抽提出浓度高、质量高、适用于PCR检测的DNA。
下面结合具体应用例，对本发明方法使用效果作进一步的说明。
应用例1：
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用上述实施例1的方法提取互叶白千层基因组DNA，并将其用于SSR-PCR检测：
利用筛选的2对SSR引物对提取的互叶白千层基因组DNA进行PCR扩增，所用引物序列见表6。
表6用于扩增的2对SSR引物序列
SSR-PCR反应体系（20μl），包括10×PCRbuffer、1.2mMMgCl2、0.4 mMdNTPS、0.8 mM上游引物、0.8 mM下游引物、20ngDNA模板、0.2UTaq酶。
SSR-PCR扩增程序为：94℃预变性3min，然后进行35个循环，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸1min，最后4℃保存。
用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，如图6所示。扩增结果表明，采用本实施例1的提取方法提取的DNA能够稳定扩增出条带，适用于SSR-PCR检测。
应用例2：
选取24份互叶白千层新鲜嫩叶为试验材料，采用上述实施例2的方法提取提取互叶白千层基因组DNA，并将其用于ISSR-PCR检测：
利用筛选的2条特异ISSR引物对提取的互叶白千层基因组DNA进行PCR扩增，所用引物序列见表7。
表7 用于扩增的2条ISSR引物序列
ISSR-PCR反应体系（20μl），包括1×PCRbuffer、2.0mMMgCl2、0.1 mMdNTPS、0.5 mMISSR引物、20ngDNA模板、0.2UTaq酶。
ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性3min，然后进行30个循环，94℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸1min，最后4℃保存。
用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图7所示。扩增结果表明，采用本实施例2的提取方法提取的DNA能够稳定扩增出条带，适用于ISSR-PCR检测。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1) 用液氮研磨互叶白千层新鲜叶样至粉末状，迅速移至离心管，加入常规预热的DNA提取缓冲液，混匀后于65℃水浴30min；
（2) 取出离心管冷却至室温，加入与DNA提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇混合液，其混合液体积比为：氯仿:异戊醇=24:1，混匀后于12000 r/min离心10min；
（3）取上清液置于新的离心管，加入与上清液等体积的氯仿，混匀后于12000 r/min离心10min；
（4）取上清液置于新的离心管，加入上清液1.5倍体积的常规预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃静置30min，12000 r/min离心10min，弃上清液；
（5）用体积浓度75%乙醇清洗沉淀2次，室温下干燥5min，加入DNA溶解缓冲液，置于-20℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（1)所述的DNA提取缓冲液的配方为：2% CTAB、PH为8.0的100mM Tris-HCl、PH为8.0的20mM EDTA、1M NaCl。
3.根据权利要求1所述的一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（1）所述的新鲜叶样的重量为1-2g，所述的DNA提取缓冲液加入量为600μl-800μl。
4.根据权利要求1所述的一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（5）所述的DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mM EDTA、20-30μg/ml RNA酶。
5.根据权利要求3所述的一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（1）所述的新鲜叶样的重量为1g，所述的DNA提取缓冲液加入量为600μl。
6.根据权利要求4所述的一种有效提取互叶白千层基因组DNA的方法，其特征在于：步骤（5）所述的DNA溶解缓冲液的配方为：PH为8.0的10mM Tris-HCl、PH为8.0的1mM EDTA、20μg/ml RNA酶。
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CN114250223A (zh) * 2021-12-16 2022-03-29 吉林省白城市农业科学院(吉林省向日葵研究所) 一种燕麦叶片基因组快速提取方法

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