CN114015754B - 一种通用型病毒样本保存液及其制备方法 - Google Patents

一种通用型病毒样本保存液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种病毒检测试剂相关的通用灭活型病毒样本保存液及其制备方法。本发明的病毒样本保存液，在裂解病毒过程中，不破坏病毒功能蛋白结构，又能避免内源性核酸酶对病毒核酸的降解，经本发明的保存液保存的样本不仅可以用于病毒核酸检测，还可以用于病毒抗原或抗体的检测。

Description

一种通用型病毒样本保存液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种病毒检测试剂相关的通用灭活型病毒样本保存液及其制备方法。
背景技术
2019年首次在人体内发现的一种新型毒株，新型冠状病毒(Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2,或SARS-CoV-2)自发现起至今仍然肆虐于全球范围，是目前最主流、传染性最大的呼吸道病毒。由于该病毒在潜伏期就表现出高传染性，二次接触造成的感染率居高不下，针对群体庞大的潜在患者和密切接触者，早发现、早报告、早隔离、早治疗是基本的防控举措。因此，是否携带新冠病毒抗原成为了判断被检测者是否感染的关键临床指标，对于疫情防控具有重大意义。目前最常用的检测方式是核酸检测，但是其对人员技术以及环境要求较高，操作复杂；胶体金检测则对人员和环境无特殊要求，操作简捷、迅速，能够快速获得检测结果。通过两种检测方法相结合的手段可以在前期大规模普筛中快速、精准的完成筛查，从而达到早期群体防控的目的。
现有技术中常见的病毒样本保存液，要么专门用于核酸检测的样本保存，提供对核酸的保护作用，通常含有相关的蛋白变性剂和核酸酶抑制剂，在提供核酸保护的同时，破坏病毒颗粒内部的功能蛋白质；要么是用于病毒抗原或抗体的检测，在裂解病毒颗粒的同时，缺乏对样本中核酸的保护。目前，缺乏一种通用型灭活的病毒样本保存液，能同时满足核酸检测和胶体金检测所需的样本要求。
因此，开发一种通用灭活型病毒样本保存液，在裂解病毒过程中，不破坏病毒功能蛋白结构，又能避免内源性核酸酶对病毒核酸的降解，是设计样本保存液的关键，也是保证后续样本检测结果可靠的重中之重。
发明内容
针对能够满足核酸检测和胶体金检测的样本保存需求的技术问题，本发明提供了一种应用于病毒检测试剂相关技术领域的通用灭活型病毒样本保存液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明一方面提供了一种通用型病毒样本保存液，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1～200mmol/L、核酸酶抑制剂1～50mmol/L、蔗糖0.5～5w/v％、氯化钠0.5～2w/v％、阴离子表面活性剂0.1～2w/v％、两性离子表面活性剂0.01～2w/v％、螯合剂5～50mmol/L、酪蛋白0.1～5w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300 0.1～2w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，pH为5.0～9.0。
在一些实施方案中，所述核酸酶抑制剂为亚氨基二琥珀酸四钠。
在一些实施方案中，所述阴离子表面活性剂为十二烷基磺酸钠。
在一些实施方案中，所述两性离子表面活性剂为Pluracare1307。
在一些实施方案中，所述螯合剂为乙二胺四乙酸。
在一些实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度选自50～150mmol/L，优选自80～120mmol/L，更优选自80mmol/L、85mmol/L、90mmol/L、95mmol/L、100mmol/L、105mmol/L、110mmol/L、115mmol/L、120mmol/L。
在一些实施方案中，所述核酸酶抑制剂的浓度选自1～30mmol/L，优选自8～15mmol/L，更优选自8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L。
在一些实施方案中，所述蔗糖的浓度选自0.5～3w/v％，优选自0.8～1.5w/v％，更优选自0.8～1.2w/v％，更优选自0.8w/v％、0.9w/v％、1.0w/v％、1.1w/v％、1.2w/v％。
在一些实施方案中，所述氯化钠的浓度选自0.8～1.3w/v％，优选自0.8～1.0w/v％，更优选自0.8w/v％、0.9w/v％、1.0w/v％。
在一些实施方案中，所述阴离子表面活性剂的浓度选自0.1～1.0w/v％，优选自0.1～0.5w/v％，更优选自0.1w/v％、0.2w/v％、0.3w/v％、0.4w/v％、0.5w/v％。
在一些实施方案中，所述两性离子表面活性剂的浓度选自0.5～2.0w/v％，优选自0.5～1.0w/v％，更优选自0.5w/v％、0.6w/v％、0.7w/v％、0.8w/v％、0.9w/v％、1.0w/v％。
在一些实施方案中，所述螯合剂的浓度选自10～30mmol/L，优选自20～25mmol/L，更优选自20mmol/L、21mmol/L、22mmol/L、23mmol/L、24mmol/L、25mmol/L。
在一些实施方案中，所述酪蛋白的浓度选自0.5～3.0w/v％，优选自0.5～2w/v％，更优选自0.8～1.2w/v％，更优选自0.8w/v％、0.9w/v％、1.0w/v％、1.1w/v％、1.2w/v％。
在一些实施方案中，所述液体生物防腐剂Proclin 300的浓度选自0.1～1.0w/v％，优选自0.1～0.5w/v％，更优选自0.1w/v％、0.2w/v％、0.3w/v％、0.4w/v％、0.5w/v％。
在一些实施方案中，所述保存液的pH为7.0～9.0，优选7.5～8.5，更优选7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5。
在一些实施方案中，所述保存液中：所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为80～120mmol/L、所述核酸酶抑制剂为8～15mmol/L、所述蔗糖为0.8～1.2w/v％、所述氯化钠为0.8～1.0w/v％、所述阴离子表面活性剂为0.1～0.5w/v％、所述两性离子表面活性剂为0.5～1w/v％、所述螯合剂为20～25mmol/L、所述酪蛋白为0.8～1.2w/v％、所述液体生物防腐剂Proclin 300为0.1～0.5w/v％，所述pH为7.5～8.5。
本发明还提供一种通用型病毒样本保存液，包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100mmol/L、亚氨基二琥珀酸四钠为12mmol/L、蔗糖为1w/v％、氯化钠为0.9w/v％、十二烷基磺酸钠为0.2w/v％、Pluracare 1307为0.8w/v％、乙二胺四乙酸为20mmol/L、酪蛋白为0.8w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300为0.2w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，pH为8.0。
本发明还提供如上所述的通用型病毒样本保存液的制备方法：将三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、核酸酶抑制剂、蔗糖、氯化钠、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、螯合剂、酪蛋白，加无RNA酶纯化水溶解；
上述混合溶液，用NaOH调节pH值到5.0～9.0，加液体生物防腐剂Proclin 300，加无RNA酶纯化水至1L，使各组分达到对应浓度；
用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述通用灭活型病毒样本保存液。
在一些实施方案中，所述滤膜孔径为0.15μm～0.35μm。
在一些实施方案中，所述的通用型病毒样本保存液是通用灭活型冠状病毒样本保存液，优选是新型冠状病毒样本保存液。
在一些实施方案中，所述保存液的适用样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液样品、血清样品、粪便样品、眼结膜拭子样品。
本发明还提供了一种新型冠状病毒样本的保存装置，其包括装置本体，以及设置于所述装置本体内的前述的通用灭活型病毒样本保存液。
有益效果：本发明提供的通用型病毒样本保存液的配方组合，添加了能够快速裂解病毒抗原的组分，降低了病毒传播感染的风险。通过抑制裂解过程中内源性核酸酶的降解作用，有效避免核酸的降解，从而使得保存的病毒样本能够用于核酸检测，保证检测结果的准确性。本发明提供的通用灭活型病毒样本保存液的配方组合，快速裂解病毒抗原的同时，添加的部分组分在一定程度上保护目的蛋白，从而使得保存的样本可以用于胶体金检测，保证检测结果的准确性。
附图说明
图1：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的ORF1ab基因(病毒保存液1)；
图2：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的N基因(病毒保存液1)；
图3：RT-qPCR检测新冠病毒培养物ORF1ab&N gene&VIC(内标)(病毒保存液1)；
图4：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的ORF1ab基因(病毒保存液2)；
图5：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的N基因(病毒保存液2)；
图6：RT-qPCR检测新冠病毒培养物ORF1ab&N gene&VIC(内标)(病毒保存液2)；
图7：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的ORF1ab基因(病毒保存液3)；
图8：RT-qPCR检测新冠病毒培养物的N基因(病毒保存液3)；
图9：RT-qPCR检测新冠病毒培养物ORF1ab&N gene&VIC(内标)(病毒保存液3)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作出详细说明。
实施例1：病毒保存液的制备
第一种病毒保存液(简称“保存液1”)：包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100mmol/L、亚氨基二琥珀酸四钠为12mmol/L、蔗糖为1w/v％、氯化钠为0.9w/v％、十二烷基磺酸钠为0.2w/v％、Pluracare 1307为0.8w/v％、乙二胺四乙酸为20mmol/L、酪蛋白为0.8w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300为0.2w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，保存液的pH＝8.0。
第二种病毒保存液(简称“保存液2”)：包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100mmol/L、亚氨基二琥珀酸四钠为5mmol/L、蔗糖为2w/v％、氯化钠为1.5w/v％、十二烷基磺酸钠为0.2w/v％、Pluracare 1307为1w/v％、乙二胺四乙酸为30mmol/L、酪蛋白为2w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300为1w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，保存液的pH＝8.0。
第三种病毒保存液(简称“保存液3”)：包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100mmol/L、亚氨基二琥珀酸四钠为5mmol/L、蔗糖为0.5w/v％、氯化钠为1.2w/v％、十二烷基磺酸钠为1.5w/v％、Pluracare 1307为1w/v％、乙二胺四乙酸为30mmol/L、酪蛋白为0.5w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300为0.2w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，保存液的pH＝8.0。
保存液制备方法：称取配置1L保存液所需的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、亚氨基二琥珀酸四钠、蔗糖、氯化钠、十二烷基磺酸钠、Pluracare 1307、乙二胺四乙酸、酪蛋白，加入无RNA酶纯化水搅拌溶解。上述混合溶液搅拌均匀后，用NaOH调节pH值到8.0，加入液体生物防腐剂Proclin 300，加入无RNA酶纯化水定容至1L，使各组分达到对应浓度。用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述通用灭活型病毒样本保存液。
实施例2：病毒保存液核酸保存效果的核酸检测验证
1)在实施例1的三种样本保存液中加入新型冠状病毒(2019-nCOV)的已灭活病毒培养物，使其稀释至如下浓度梯度：800个TCID50、400TCID50、200TCID50、100TCID50、50TCID50、25TCID50。以经认可上市的核酸检测试剂盒(PCR荧光法)进行扩增获得各浓度其对应的Ct值。
2)病毒RNA提取：上述浓度梯度的样本，各取200μL，按照病毒核酸提取试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，Cat.RC311-C1)说明书流程进行核酸提取。最终病毒RNA纯化产物洗脱体积为50μL。
3)RT-qPCR荧光定量检测：按照新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，Cat.CD302-02)说明书流程配置PCR反应体系。总体系50μL，其中病毒RNA纯化产物加入20μL，使用QuantStudio 3实时定量PCR系统，程序设置参考试剂盒说明书。具体如下表所示：
表1：PCR反应体系制备
组分 体积(μL/管)
检测缓冲液 26
<u>酶</u>Mix 4
从标本中提<u>取的RNAuq</u>it 20
总体积 50
表2：PCR扩增程序设置
Figure BDA0003369784920000051
4)荧光定量PCR检测数据结果
本发明通用灭活型病毒保存液，通过将病毒培养物稀释不同浓度梯度，经RNA提取和RT-qPCR检测，获得各浓度对应的Ct值。
保存液1结果如图1-3所示，使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，两种目标基因(ORF1ab和N gene)呈阳性检出，判断标准：CT≤38；
保存液2结果如图4-6所示，使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，两种目标基因(ORF1ab和N gene)均未被检出，判断标准：CT＞38.
保存液3结果如图7-9所示，使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，两种目标基因(ORF1ab和N gene)均未被检出，判断标准：CT＞38.
说明，使用本发明的病毒保存液1得到的样本，通过核酸提取获得病毒核酸，可以被用作后续的qPCR实验；而病毒保存液2和保存液3得到的样本，并不能用作后续的qPCR实验检测。
实施例3：病毒保存液病毒蛋白保存效果的胶体金检测验证
1)以上述实施例2同批的病毒保存液稀释配置的浓度梯度的病毒培养物，使用新冠抗原胶体金检测(南京诺唯赞医疗科技有限公司，Cat.C8602CA)说明书流程进行检测。在检测开始后10分钟时观察检测卡，判定结果，15分钟之后观察结果无效。
2)检验结果按如下方法进行判定：
阴性结果：肉眼观察仅可见一条红色质控线(C线)。
阳性结果：肉眼观察可见两条清晰的红色线条，一条为质控线(C线)，一条为T检测线。
无效结果：未出现肉眼可见的红色线条或仅出现T检测线而未出现质控线(C线)，提示该项目检测错误或检测结果无效，应对该项目重新测试。
3)新冠抗原胶体金检测结果
本发明病毒保存液稀释配置的实施例2同批浓度梯度的病毒培养物，使用新冠抗原胶体金检测试剂盒进行检测：
保存液1：在800TCID50、400TCID50、200TCID50、100TCID50、50TCID50的培养物浓度下，为阳性检出；25TCID50的培养物检测为阴性显示。说明，保存液1具有裂解病毒抗原的效果，可用于胶体金试剂盒的新冠抗原检测。
表3：PCR荧光法与胶体金法检测新冠病毒培养物的结果(病毒保存液1)
Figure BDA0003369784920000061
保存液2：在800TCID50、400TCID50、200TCID50、100TCID50的培养物浓度下，为阳性检出；50TCID50、25TCID50的培养物检测为阴性显示。保存液2具有裂解病毒抗原的效果，可用于胶体金试剂盒的新冠抗原检测。
表4：PCR荧光法与胶体金法检测新冠病毒培养物的结果(病毒保存液2)
Figure BDA0003369784920000062
Figure BDA0003369784920000071
保存液3：在800TCID50的培养物浓度下，为弱阳性检出；400TCID50、200TCID50、100TCID50、50TCID50、25TCID50的培养物检测为阴性显示。保存液3具有微弱的病毒抗原裂解效果，不适用于胶体金试剂盒的新冠抗原检测。
表5：PCR荧光法与胶体金法检测新冠病毒培养物的结果(病毒保存液3)
Figure BDA0003369784920000072

Claims (6)

1.一种通用型病毒样本保存液，其特征在于，由以下组分组成：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为100 mmol/L、亚氨基二琥珀酸四钠为12 mmol/L、蔗糖为1 w/v％、氯化钠为0.9 w/v％、十二烷基磺酸钠为0.2w/v％、Pluracare 1307为0.8 w/v％、乙二胺四乙酸为20mmol/L、酪蛋白为0.8 w/v％、液体生物防腐剂Proclin 300 为0.2 w/v％，溶剂为无RNA酶纯化水，pH为8.0。
2.根据权利要求1所述的保存液的制备方法，包括称取适量三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、亚氨基二琥珀酸四钠、蔗糖、氯化钠、十二烷基磺酸钠、Pluracare 1307、乙二胺四乙酸、酪蛋白，加入无RNA酶纯化水搅拌溶解；上述混合溶液搅拌均匀后，用NaOH调节pH值到8.0，加入液体生物防腐剂Proclin 300，加入无RNA酶纯化水定容至1L，使各组分达到对应浓度；用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述通用型病毒样本保存液。
3.根据权利要求1所述的保存液作为通用型冠状病毒样本保存液的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述冠状病毒样本保存液是新型冠状病毒样本保存液。
5.根据权利要求1所述的保存液，适用样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、血液样品、血清样品、粪便样品、眼结膜拭子样品。
6.一种新型冠状病毒样本的保存装置，其包括装置本体，以及设置于所述装置本体内的权利要求1所述的通用型病毒样本保存液。
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