CN116004742B - 一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法、及发酵产物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β‑葡聚糖、多酚含量的方法、及发酵产物的应用，以大麦麸皮为原料，接种乳酸菌进行固态发酵进行发酵，同时提取β‑葡聚糖含量和多酚；并严格控制发酵条件，同时提取并提升发酵产物中β‑葡聚糖和酚类物质的含量；具体包括制备大麦麸皮粉、制备发酵菌剂、固态发酵、烘干保存等步骤。该乳酸菌固态发酵大麦麸皮中β‑葡聚糖含量为3%～4.5%，多酚含量为10～12mg/g，相比于现有技术，效果非常显著，充分挖掘大麦中的β‑葡聚糖和多酚，为大麦防治人类慢性病的相关功能提供有力支持；并且本发明发酵工艺的科学、稳定，操作简单，发酵产物可用于制作用于治疗或改善代谢综合征的药品或食品，具有良好的实用价值及应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及提高大麦β-葡聚糖、多酚含量的方法，具体为一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，及发酵产物的应用。
背景技术
随着人类文明的进步和生活方式的改变，以代谢综合征为代表的代谢异常相关疾病已成为影响人类健康最主要的非传染性慢性疾病之一。据不完全统计，在过去的二十年里，大约32％的美国人、25％的欧洲和拉丁美洲成年人已经患有该慢性病，而目前作为发展中国家的中国，该现象也日益突出。中国肥胖人口超过3亿人，糖尿病前期的糖耐量受损(胰岛素抵抗)人群达到了1.48亿人，患病率为15.5％；而糖尿病患者患病率近10年翻了一番，成人糖尿病患病率为9.7％，患者总数已超过9000万，成为世界第一糖尿病大国。因此，如何控制代谢综合征的发生成为广大科技工作者研究的热点，而其中肥胖和胰岛素抵抗是代谢综合征的基础，对于肥胖和胰岛素抵抗的预防及干预已成为重中之重。目前，减肥和改善胰岛素抵抗的药物普遍具有一定的毒副作用，因此，寻找天然安全产物以预防和治疗肥胖，改善胰岛素抵抗，具有更大的意义和需求。
β-葡聚糖是由β-葡萄糖苷键连接D-葡萄糖而成的非淀粉多糖，在自然界中广泛存在，其主要来源有谷物、细菌和真菌。谷物β-葡聚糖是一种优良的可溶性膳食纤维，具有多种生理功能和作用。据研究，谷物β-葡聚糖可以调节血糖水平，预防二型糖尿病；降低血清胆固醇水平，预防心血管疾病；平衡肠道菌群，预防结肠癌；还具有调节血压和增强免疫细胞活性的功能。多酚类化合物在自然界中储量也非常丰富，且种类繁多。从低分子量的简单酚到结构复杂的大分子聚合物，多酚类化合物可分为单体多酚(如黄酮和酚酸)与多体多酚(如水解单宁和缩合单宁)。在多酚的化学结构中，以邻苯三酚和邻苯二酚为典型。其极易被氧化的邻位酚羟基赋予了多酚较强的抗氧化性与清除自由基的能力。研究表明，多酚类化合物具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂肪、增加身体抵抗力、防止动脉硬化和血栓形成的功能，还具有利尿、降血压、抑制细菌与癌细胞生长以及帮助消化等功能。
大麦(Hordeum vulgare L.)属禾本科一年生草本植物，是人类栽培的远古作物之一。研究揭示，大麦含有丰富的β-葡聚糖和酚类物质，关于这些物质的提取和利用的技术也一直备受关注。然而，现有的大麦提取β-葡聚糖和酚类物质的方式多和酿酒有关，以大麦整粒、麸皮或去除麸皮后的麦芽为原料，接入酵母菌进行发酵，获得含有β-葡聚糖和酚类物质的饮料或啤酒。例如，中国专利文献CN107308073A公开一种青稞发酵原浆及制备方法和应用，将青稞麸皮粉加入到水中，接种商品化酿酒活性干酵母，控制发酵条件，得到发酵液，经检测，每克青稞发酵原浆中含有42.35～46.25mg的β-葡聚糖、130.3～250.48U的超氧化物歧化酶、0.205～0.335mg/mL的小分子肽和1.3～1.7％的乙醇。由于一些患有特定病理状况的人群，以及儿童、老年人孕妇等特殊人群是不建议饮用含酒精的饮料的，有报道提出不产生酒精方式进行提取大麦多酚，例如，中国专利文献CN111263805A公开一种从大麦麦芽生产多酚组合物的方法，将大麦芽磨碎与水混合后连续加热处理，获得富含天然多酚且不含酒精的饮料，其含有的多酚总量约为300mg/L。然而，这些提取β-葡聚糖和酚类物质的方式提取成分单一，β-葡聚糖和酚类物质不能兼顾，且获得的β-葡聚糖和多酚含量均还处于较低水平，未能充分挖掘大麦的潜在功能。此外，现有的大麦发酵产物，不仅含有酒精，还含有大量的酸类物质，影响后续产品的口感，且现有的液态发酵，产物中含有大量水分，若要制成固态食品，需要进行冻干，工序繁琐，且耗费大量成本，不利于大量生产及应用。因此，如何进一步提高大麦提取β-葡聚糖和酚类物质产量，最大限度挖掘大麦防治人类慢性病的相关功能，仍为尚需探究的课题。
发明内容
针对上述存在的问题，及为了达到上述的目的，本发明提供一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法、及发酵产物的应用，以大麦麸皮为原料，接种乳酸菌进行固态发酵进行发酵，同时提取β-葡聚糖含量和多酚；并严格控制发酵条件，使麸皮中β-葡聚糖含量和多酚含量均得到提升。具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，包括如下步骤：
S1：制备大麦麸皮粉：精选大麦籽粒，去除麦穗和稃壳后清洗晒干，然后放入碾米机中进行脱皮，收集所得麸皮过筛后，得到大麦麸皮粉，备用；
S2：制备发酵菌剂：将植物乳杆菌在MRS培养基中培养16h后离心取沉淀，加入蒸馏水制得植物乳杆菌发酵菌剂，备用；
S3：固态发酵：通过预测确定最优发酵条件，并按照设定的料液比将制备的大麦麸皮粉与蒸馏水混合获得大麦麸皮发酵基料，按照设定的接种量将制备的发酵菌剂接种到大麦麸皮发酵基料中，混合均匀，按照设定的发酵温度及时间，并进行固态发酵，获得大麦麸皮发酵料；
S4：烘干保存：固态发酵结束后，将获得的大麦麸皮发酵料烘干，获得乳酸菌固态发酵大麦麸皮，置于-20℃下保存；
经检测，该乳酸菌固态发酵大麦麸皮中β-葡聚糖含量为3％～4.5％，多酚含量为10～12mg/g。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，步骤S1中，所述麸皮过筛的筛孔大小为20～40目，所述灭菌处理为于100℃下，进行灭菌处理20min。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，步骤S2中，所述将植物乳杆菌在MRS培养基中培养16h，为先培养12h，然后移到新鲜的MRS培养基中继续培养4h再进行离心处理；所制得的植物乳杆菌发酵菌剂含菌量为1×106CFU/mL。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，所述植物乳杆菌发酵菌剂采用的菌株基因序列同时含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因和酯酶基因，优选采用的菌株为植物乳杆菌dy-1，其保藏编号为CGMCC No.6016。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，步骤S3中，所述固态发酵，发酵条件根据单因素试验采用响应面工艺进行预测，具体操作如下：
S3-1：设定单因素试验：
固定发酵时间、发酵温度和接种量，设定多个液料比；
固定发酵时间、发酵温度和液料比，设定多个接种量；
固定发酵时间、接种量和液料比，设定多个发酵温度；
固定发酵温度、接种量和液料比，设定多个发酵时间；
S3-2：发酵检测：按照设定的单因素试验进行固态发酵，并侧定发酵后的大麦麸中β-葡聚糖及多酚含量；
S3-3：建立综合评分公式：采用多指标试验公式法进行数据处理，以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理；再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数；获得兼顾各项指标的综合评分公式；
S3-4：单因素求解：将各单因素试验结果带入综合评分公式，求解最佳单因素发酵条件；
S3-5：响应面优化：以综合评分作为响应值，以发酵时间、发酵温度、接种量、液料比作为自变量，选取3个水平，用软件建立模型对乳酸菌固态发酵大麦麸皮工艺进行优化，获得发酵时间、发酵温度、液料比、接种量对综合评分的交互作用，预测乳酸菌固态发酵大麦麸皮的最佳发酵条件及此条件下的综合评分。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，其特征在于：步骤S3-1，单因素试验具体设定为：
1)固定发酵温度31℃，接种量25％，液料比0.8，分别发酵0d、1d、3d、5d、7d；
2)固定发酵时间3d，接种量25％，液料比0.8，分别控制发酵温度为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃；
3)固定发酵时间3d，发酵温度31℃，液料比0.8，分别控制接种量为10％、12.5％、16.67％、25％、50％；
4)固定发酵时间3d，发酵温度31℃，接种量25％，分别控制液料比为0.5、0.6、0.7、0.8、1。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，步骤S3-3，所建立的综合评分公式为：
其中：
Pi为兼顾各项指标综合评分值；
其中RSD为粗脂肪的相对标准偏差，RSDj为第j个指标的相对标准差，Ej为重要程度，其值为1；
Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据，具体为：
i＝1，2，...，9；j＝1,2，...，8；其中Xij表示第i次试验第j个指标的测定值，即Xij表示正交试验的第i次试验的第j个指标的测定含量；(Xj)max表示第j个指标含量的最大值。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，，步骤S3-4，单因素求解结果为：
最佳发酵时间为7d；
最佳发酵温度为37℃；
最佳接种量为16.67％；
最佳液料比为0.7。
前述的乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，步骤S3-3，所述固态发酵，确定最优发酵条件为：大麦麸皮粉与蒸馏水混合的液料比为0.8；植物乳杆菌发酵菌剂的接种量为15.7％；固态发酵发酵温度控制为39℃、发酵时间为176h。
其次，本发明提供一种乳酸菌固态发酵大麦麸皮产物的应用，将根据上述方法获得的乳酸菌固态发酵大麦麸皮直接或回填到大麦精粉中，在制作用于治疗或改善代谢综合征的药品或食品中的应用。
本发明的有益效果是：
1)本发明采用大麦麸皮为发酵料，加入乳酸菌进行发酵，同时提取β-葡聚糖和多酚，并通过控制发酵条件，使大麦麸皮中的β-葡聚糖和多酚的含量同时得到提升，为进一步挖掘大麦防治人类慢性病的相关功能提供有力支持。
2)本发明采用的乳酸菌为植物乳杆菌dy-1，其同时含有葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因、和酯酶基因，其能将以结合肽形式存在发酵料大麦麸皮上的β-葡聚糖和酚类物质转化成游离态肽，实现同时提取并提升发酵产物中β-葡聚糖和酚类物质的含量。
3)本发明采用大麦麸皮作为发酵料，其含有的β-葡聚糖和酚类物质均以游离态的形式存在，更适合乳酸菌发酵。
4)本发明采用大麦麸皮作为发酵底物，获得的乳酸菌固态发酵大麦麸皮产物，直接或回填到大麦精粉中用于制作治疗或改善代谢综合征的药品或食品，不仅解决大麦发酵产物制备食品口味差的问题，且保证食品中含有大麦全物质营养，提高大麦制品的营养价值及食用体验感。此外，本申请采用固态发酵，免去冻干步骤，烘干后直接制得固体产物，节省成本，且经检测，固态发酵后的麸皮中β-葡聚糖含量可达3％～4.5％，多酚含量可达10～12mg/g，相比于现有技术提取产物均有显著提高。
5)本发明结合响应面法优化发酵条件，并根据预测确定最优发酵条件，保证发酵工艺的科学性、稳定性，为大麦麸皮发酵质量建立研究标准及提供依据。
6)本发明方法操作简单方便，乳酸菌为直投型发酵剂，直接加入大麦麸皮粉与蒸馏水中，混合均匀后直接进行发酵，无需复杂工艺和昂贵的设备，具有良好的实用价值及应用前景。
附图说明
图1是本发明发酵时间对发酵大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量及综合评分的影响图；
图2是本发明发酵温度对发酵大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量及综合评分的影响图；
图3是本发明接种量对发酵大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量及综合评分的影响图；
图4是本发明液料比对发酵大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量及综合评分的影响图；
图5是本发明发酵时间和发酵温度交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图；
图6是本发明发酵时间和接种量交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图；
图7是本发明发酵时间和液料比交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图；
图8是本发明发酵温度和接种量交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图；
图9是本发明发酵温度和液料比交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图；
图10是本发明接种量和液料比交互作用下发酵大麦麸皮综合评分的响应曲面图和等高线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例为一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，具体包括如下步骤：
S1：制备大麦麸皮粉：精选籽粒饱满、完整的大麦籽粒，去除麦穗和稃壳，使用自来水清洗3遍，阳光下暴晒(翻看没有水迹方可使用)，将清洗好的大麦籽粒放入碾米机中进行脱皮，收集所得麸皮后过20～40目筛，以达到足够细度，有助于麸皮的乳酸菌固态发酵；然后于100℃下，进行灭菌处理20min得到大麦麸皮粉，备用。
S2：制备发酵菌剂：将植物乳杆菌dy-1(保藏编号为CGMCC No.6016)在37℃的MRS培养基中培养12h，然后转移到新鲜MRS培养基中继续培养4h进行扩大培养，然后离心，将上清的培养基倒掉，加入蒸馏水制备得到含菌量为1×106CFU/mL的植物乳杆菌发酵菌剂，备用。
S3：固态发酵：
首先，根据单因素试验采用响应面工艺进行预测，具体操作如下：
S3-1：设定单因素试验：以发酵时间、发酵温度、接种量和液料比为单因素变量，分别考察其对发酵大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的影响。每个实验取灭菌后的大麦麸皮粉10g进行发酵，具体设置如下：
1)固定发酵温度31℃，接种量25％，液料比0.8，分别发酵0d、1d、3d、5d、7d；
2)固定发酵时间3d，接种量25％，液料比0.8，分别控制发酵温度为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃；
3)固定发酵时间3d，发酵温度31℃，液料比0.8，分别控制接种量为10％、12.5％、16.67％、25％、50％；
4)固定发酵时间3d，发酵温度31℃，接种量25％，分别控制液料比为0.5、0.6、0.7、0.8、1。
S3-2：发酵检测：按照设定的单因素试验进行固态发酵，将发酵结束后的样品置于40℃烘箱中低温烘干，随后放置于-20℃冰箱中保藏。并侧定发酵后的大麦麸中β-葡聚糖及多酚含量。
β-葡聚糖含量检测方法：准确称量80～120mg大麦麸皮粉加入玻璃离心管，用0.2mL50％乙醇润湿样品，加入4mL磷酸钠缓冲溶液(20mM，pH6.5)，用漩涡振荡器混匀后置于沸水浴孵化1min；再用漩涡振荡器强烈震荡混匀后，置于100℃水浴锅中孵化2min，再混匀。冷却至50℃，置于50℃水浴锅中孵化5min后，加入0.2mL的地衣聚糖酶(10U)，混合均匀并用保鲜膜密封试管，50℃孵育1h，期间用漩涡振荡器混合3～4遍或在孵育期间一直搅拌；试管中加入5.0mL醋酸钠缓冲溶液(200mM，pH4.0)，震荡混匀后在室温下平衡5min，离心(1000g，10min)；分别准确吸取0.1mL上清液于三支试管中，其中两个试管中添加0.1mL的0.2Uβ-葡聚糖酶，另一支试管加入0.1mL醋酸钠缓冲溶液(50mM，pH4.0)作为空白对照，50℃孵育10min后，每支试管中加入3.0mL显色剂(GOPOD Reagen)，50℃反应20min，用分光光度计测定其510nm处的吸光值。
多酚含量检测方法：称取1g大麦麸皮粉溶于5ml蒸馏水中，用漩涡振荡器混匀后置于摇床中震荡2h，离心(8000rpm，15min)；取上清液稀释50倍后准确吸取1ml于试管中；称取一水合没食子酸0.11g，制得1mg/mL浓度的标品溶液，采用倍比稀释法依次制得0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的没食子酸标准溶液，随后加入5ml蒸馏水，3ml7.5％碳酸钠溶液，1ml福林-酚试剂，45℃水浴1.5h，在765nm波长下测定吸光值。
S3-3：建立综合评分公式：采用多指标试验公式法进行数据处理，以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理；再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数；获得兼顾各项指标的综合评分公式。所建立的综合评分公式为：
其中：
Pi为兼顾各项指标综合评分值；
其中RSD为粗脂肪的相对标准偏差，RSDj为第j个指标的相对标准差，Ej为重要程度，其值为1；
Dij表示第j个指标下的第i个测定值的标准化数据，具体为：
i＝1，2，...，9；j＝1,2，...，8；其中Xij表示第i次试验第j个指标的测定值，即Xij表示正交试验的第i次试验的第j个指标的测定含量；(Xj)max表示第j个指标含量的最大值。
S3-4：单因素求解：将步骤S3-2各单因素试验检测结果带入综合评分公式，求解最佳单因素发酵条件，如图1至图4所示，结果为：最佳发酵时间为7d；最佳发酵温度为37℃；最佳接种量为16.67％；最佳液料比为0.7。
S3-5：响应面优化：
在单因素试验的基础上，设计响应面试验，以综合评分作为响应值，以发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、液料比(D)作为自变量，选取3个水平(0，±1)，采用DesignExpert8.0.5.0建立模型对乳酸菌固态发酵大麦麸皮工艺进行优化，试验设计因素与水平见表1，试验设计和试验结果见表2，表3。
表1.设计实验因素水平
表2.响应面试验各指标含量及权重系数
表3.Box-Behnken试验设计和结果
采用Design Expert 8.0.5.0软件对实验结果进行多项式拟合回归，得到回归方程：
Y＝0.75－5.667×10-4A+0.015B+8.717×10-3C+0.013D+6.475×10-3AB-7.5×10- 5AC+0.022AD+2.625×10-3BC+0.029BD-0.018CD-0.028A2-0.027B2-0.019C2-0.032D2。对该模型方差分析如表4所示。
表4.模型方差分析
注：P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著差异。
由表4可知，回归方程显著(P模型＜0.0001)，失拟项不显著(P＞0.05)，表明试验模型中的二项式方程较符合实际发酵情况，较好地反映了发酵时间、发酵温度、液料比、接种量对综合评分的交互作用具有高度显著影响。
根据回归方程绘制响应面图，属于响应值与各因素间相互作用的三维空间曲面，主要用于较直观分析两交作用的影响，分析当发酵时间、发酵温度、接种量、液料比四个因素中有一个因素固定时，另外三个因素及其交互作用对发酵大麦麸皮综合评分的影响。根据方程得出模型的响应面及等高线，如图5至图10所示。
由图5和图6所示的等高线和响应面图可以看出，随着发酵时间的增加，发酵大麦麸皮综合评分增加，当达到一定时间时，发酵大麦麸皮综合评分会下降，表明发酵时间对发酵大麦麸皮有较显著影响。同理，由7图至图10可以看出，发酵温度、接种量和液料比对发酵大麦麸皮综合评分也有较显著影响。
通过Design Expert软件求解方程得到，乳酸菌固态发酵大麦麸皮的最佳提取工艺为：发酵时间176.4h，发酵温度38.65℃，接种量15.67％，液料比0.78。此条件下综合评分的预测值为0.7567。考虑到实际操作，为了便于试验，在此基础上调整发酵参数，确定最佳发酵工艺条件为接种量15.7％、发酵温度39℃、发酵时间176h、液料比0.8。根据所确定的最优发酵条件，采用大麦麸皮粉作为底物，植物乳杆菌dy-1作为发酵菌剂，重复3组平行试验，固态发酵的产物中，β-葡聚糖平均含量为4.44％，多酚平均含量为11.51mg/g，综合评分为0.7561，与预测值接近，证明了优化的固态发酵大麦麸皮工艺条件的准确性和可靠性。
为进一步验证发酵底物(大麦麸皮粉)与所采用发酵菌剂(植物乳杆菌dy-1)之间的协同的作用，还分别采用去皮大麦精粉、大麦全粉作为底物，采用植物乳杆菌LP-1、嗜酸乳杆菌、酵母菌作为发酵菌剂进行对比，具体实验设计如下：
a.取灭菌处理的大麦麸皮粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种植物乳杆菌dy-1菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h；
b.取灭菌处理的去皮大麦精粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种植物乳杆菌dy-1菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h；
c.取灭菌处理的大麦全粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种植物乳杆菌dy-1菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h；
d.取灭菌处理的大麦麸皮粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种植物乳杆菌LP-1菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h；
e.取灭菌处理的大麦麸皮粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种嗜酸乳杆菌菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h；
f.取灭菌处理的大麦麸皮粉5g，以液料比0.8加入蒸馏水，接种酵母菌菌剂15.7％；控制发酵温度39℃，发酵176h。
各组实验均进行重复3组平行试验；去皮大麦粉、大麦全粉均为精选的大麦制成，且过30目筛，取灭菌处理均为100℃，处理20min；植物乳杆菌LP-1菌剂、嗜酸乳杆菌菌剂、酵母菌菌剂的含菌也均为1×106CFU/mL。
发酵结束后，将各组发酵物烘干，-20℃下保存，然后根据上述β-葡聚糖含量检测方法和多酚含量检测方法进行检测发酵物中β-葡聚糖和多酚的含量，结果如表5所示。
表5.不同发酵底物及发酵菌剂固态发酵产物中β-葡聚糖和多酚的含量平均水平
从表5可以看出，就发酵底物而言，采用大麦麸皮粉作为底物，固态发酵的产物中β-葡聚糖和多酚的平均含量均为最高，说明大麦麸皮粉中的β-葡聚糖和多酚的存在状态更适合该条件下的固态发酵；而以去皮大麦粉作为底物，产物中β-葡聚糖平均含量为4.37％，多酚平均含量为8.17mg/g；以大麦全粉作为底物，产物中β-葡聚糖平均含量为4.42％，多酚平均含量为9.02mg/g，这可能是由于大麦精粉中含有大量的蛋白质等物质，其在发酵过程中消耗了部分发酵菌剂的作用，且其发酵过程中会产生大量酸性物质，这对β-葡聚糖酶及多酚代谢相关酶的活性有一定的影响，从而抑制了β-葡聚糖和多酚含量的提升。此外，采用麦全粉或去皮大麦粉作为底物，发酵产生的酸性物质会影响口感，不利于产物后续在食品方面的开发及利用。
而就发酵菌剂而言，采用植物乳杆菌dy-1作为发酵菌剂，固态发酵的产物中β-葡聚糖和多酚的平均含量均远高于采用植物乳杆菌LP-1、嗜酸乳杆菌、酵母菌作为发酵菌剂的平均含量。基因测序发现，植物乳杆菌dy-1菌株的基因序列同时含有葡聚糖酶基因(SEQID NO.1)、葡萄糖苷酶基因(SEQ ID NO.2)和酯酶基因(SEQ ID NO.3)，推测可能是这些酶的作用将大麦麸皮粉中以结合肽形式存在的β-葡聚糖和酚类物质转化成游离态肽，实现同时提取β-葡聚糖和酚类物质，并实现使提取的β-葡聚糖和酚类物质含量显著提升。
本发明采用大麦麸皮作为发酵底物，获得的乳酸菌固态发酵大麦麸皮产物，直接或回填到大麦精粉中用于制作治疗或改善代谢综合征的药品或食品，不仅解决大麦发酵产物制备食品口味差的问题，且保证食品中含有大麦全物质营养，提高大麦制品的营养价值及食用体验感。此外，本申请采用固态发酵，免去冻干步骤，烘干后直接制得固体产物，节省成本，且经检测，固态发酵后的麸皮中β-葡聚糖含量可达3％～4.5％，多酚含量可达10～12mg/g，相比于现有技术提取产物均有显著提高。
总体而言，本发明采用大麦麸皮为发酵料，加入乳酸菌进行发酵，同时提取β-葡聚糖和多酚，并通过控制发酵条件，时大麦麸皮中的β-葡聚糖和多酚的含量同时得到提升，为进一步挖掘大麦防治人类慢性病的相关功能提供有力支持。并且，本发明结合响应面法优化发酵条件，保证发酵工艺的科学性、稳定性，为大麦麸皮发酵质量建立研究标准及提供依据。且发酵方法操作简单方便，乳酸菌为直投型发酵剂，直接加入大麦麸皮粉与蒸馏水中，混合均匀后直接进行发酵，无需复杂工艺和昂贵的设备，具有良好的实用价值及应用前景。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (2)
1.一种乳酸菌固态发酵提高大麦麸皮β-葡聚糖、多酚含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：制备大麦麸皮粉：精选大麦籽粒，去除麦穗和稃壳后清洗晒干，然后放入碾米机中进行脱皮，收集所得麸皮过筛、灭菌处理后，得到大麦麸皮粉，备用；
S2：制备发酵菌剂：将植物乳杆菌在MRS培养基中培养16h后离心取沉淀，加入蒸馏水制得植物乳杆菌发酵菌剂，备用；所述将植物乳杆菌在MRS培养基中培养16h，为先培养12h，然后移到新鲜的MRS培养基中继续培养4h再进行离心处理；所制得的植物乳杆菌发酵菌剂含菌量为1×106CFU/mL；所述植物乳杆菌发酵菌剂采用的菌株基因序列同时含有如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示的葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因和酯酶基因的植物乳杆菌dy-1，其保藏编号为CGMCC No.6016；
S3：固态发酵：通过预测确定最优发酵条件，并按照设定的料液比将制备的大麦麸皮粉与蒸馏水混合获得大麦麸皮发酵基料，按照设定的接种量将制备的发酵菌剂接种到大麦麸皮发酵基料中，混合均匀，按照设定的发酵温度及时间，并进行固态发酵，获得大麦麸皮发酵料；所述固态发酵，发酵条件根据单因素试验采用响应面工艺进行预测，具体操作如下：
S3-1：设定单因素试验：
固定发酵温度31℃，接种量25%，液料比0.8，分别发酵0d、1d、3d、5d、7d；
固定发酵时间3d，接种量25%，液料比0.8，分别控制发酵温度为29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃；
固定发酵时间3d，发酵温度31℃，液料比0.8，分别控制接种量为10%、12.5%、16.67%、25%、50%；
固定发酵时间3d，发酵温度31℃，接种量25%，分别控制液料比为0.5、0.6、0.7、0.8、1
S3-2：发酵检测：按照设定的单因素试验进行固态发酵，并侧定发酵后的大麦麸中β-葡聚糖及多酚含量；
S3-3：建立综合评分公式：采用多指标试验公式法进行数据处理，以各指标的最大值作为参照，对同一指标各数据进行标准化处理；再按各指标的重要程度和各组数据的相对标准偏差确定权重系数；获得兼顾各项指标的综合评分公式；所建立的综合评分公式为：
，
其中：
为兼顾各项指标综合评分值；
，其中/>为粗脂肪的相对标准偏差，/>为第/>个指标的相对标准差，/>为重要程度，其值为1；
表示第/>个指标下的第/>个测定值的标准化数据，具体为：
，/>=1，2，...，9；/>=1,2，...，8；其中/>表示第/>次试验第/>个指标的测定值，即/>表示正交试验的第/>次试验的第/>个指标的测定含量；/>表示第/>个指标含量的最大值
S3-4：单因素求解：将各单因素试验结果带入综合评分公式，求解最佳单因素发酵条件为：
最佳发酵时间为7d；
最佳发酵温度为37℃；
最佳接种量为16.67%；
最佳液料比为0.7；
S3-5：响应面优化：以综合评分作为响应值，以发酵时间、发酵温度、接种量、液料比作为自变量，选取3个水平，用软件建立模型对乳酸菌固态发酵大麦麸皮工艺进行优化，获得发酵时间、发酵温度、液料比、接种量对综合评分的交互作用，预测乳酸菌固态发酵大麦麸皮的最佳发酵条件及此条件下的综合评分，然后确定最优发酵条件：大麦麸皮粉与蒸馏水混合的液料比为0.8；植物乳杆菌发酵菌剂的接种量为15.7%；固态发酵发酵温度控制为39℃、发酵时间为176h；
S4：烘干保存：固态发酵结束后，将获得的大麦麸皮发酵料烘干，获得乳酸菌固态发酵大麦麸皮，置于-20℃下保存；
经检测，该乳酸菌固态发酵大麦麸皮中β-葡聚糖含量为3%～4.5%，多酚含量为10～12mg/g。
2.一种乳酸菌固态发酵大麦麸皮产物的应用，其特征在于：将根据权利要求1所述的方法获得的乳酸菌固态发酵大麦麸皮直接或回填到大麦精粉中，在制作用于治疗或改善代谢综合征的药品或食品中的应用。
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