CN103445068A - 乳酸菌发酵大麦提取物的制备方法及其抗肿瘤作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乳酸菌发酵大麦提取物的制备方法及其抗肿瘤作用，属于食品生物技术领域。利用从泡菜中筛选的乳酸菌(LactobacillusplantarumDy-1，CGMCC No.6016)，作为发酵菌株发酵大麦，控制发酵条件，从而获得到发酵大麦提取物；细胞试验表明该提取物对人结肠癌HT-29、胃癌SGC-7901细胞具有显著的促进凋亡和抑制增殖作用，人结肠癌HT-29荷瘤裸鼠模型试验表明该提取物具有显著的抑制肿瘤生长作用，并提高荷瘤裸鼠的免疫活性。本发明对大麦进行简单预处理，生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。

Description

乳酸菌发酵大麦提取物的制备方法及其抗肿瘤作用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，特指一种以大麦为原料，通过β-葡聚糖酶水解，通过乳酸菌发酵，实现营养物质的生物转化，制备具有抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的发酵大麦提取物（FBE），该发明产品可用于功能性食品或药物的制备。 

背景技术

目前，中国因恶性肿瘤导致死亡的人数占全球的1/4，且数量仍在不断攀升。而对于癌症的治疗主要有手术、化疗、放疗及靶向疗法（免疫疗法、基因疗法、血管生成抑制剂及定向疗法）等方式，其副作用仍会给患者带来许多痛苦。因此，开发天然安全、无毒副作用的抗肿瘤活性物质及其功能食品是癌症患者的渴求。 

大麦是我国传统的药食兼用作物，在我国资源丰富，但70%以上的大麦用作饲料和啤酒酿造，其资源尚未得到充分开发和利用。科学研究表明，大麦含有β-葡聚糖、黄酮、多酚类化合物、大麦芽碱等多种活性成分，具有清除自由基、抗衰老、改善记忆、治疗老年痴呆症、降血糖、降血脂、抗肿瘤等功能。但是，目前国内外关于微生物转化大麦的抗肿瘤研究未见报道。 

日本专利（JP2006319016）公开了一种脱壳大麦的乙醇提取物、碱提取物和发酵产物的制备方法，其活性成分具有抑制血管生成的作用，可作为食品添加剂、食品配料、饮料、食物、药品和饲料。 

日本崇城大学Kouta Funamoto, et al.在2008年研究得出大麦烧酒蒸馏后的残留物具有抗肿瘤和免疫活性，在体外能显著抑制人肺癌细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，在体内诱导能正常老鼠血清干扰素（IFN）-γ的产生，增加自然杀伤细胞（NK）的数量，通过尾静脉注射，无急性毒性。 

Masahiro Ohgidani, et al.在2012年研究得出SCID鼠注射HepG2肝癌细胞后，每天口服大麦烧酒蒸馏后的残留物2250mg/kg体重，连续21天，能显著减少肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，延长SCID鼠的寿命，且未见副作用。 

上述专利和文献报道关于大麦产物的抗肿瘤研究，主要是采用酵母菌发酵，而采用乳酸菌发酵大麦获得抗肿瘤提取物尚未见其专利或文献报道。 

本发明采用自行分离的乳酸菌作为出发菌株，优化发酵条件，以获得具有抗肿瘤效果和较高产量的FBE；采用该提取物进行了多种人源肿瘤细胞及其荷瘤动物试验，结果表明其提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的功能。 

发明内容

本发明提供的是一种以新鲜大麦为原料，通过乳酸菌发酵，从中提取、分离、纯化获得具有抑制肿瘤细胞增殖活性的FBE的制备方法及其应用技术。 

采用乳酸菌发酵大麦，控制发酵条件，获取发酵提取物；采用MTT研究FBE的体外抗肿瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型（人源肿瘤细胞）研究该提取物体内抗肿瘤功能；综合评价本发明FBE的抗肿瘤特性。 

本发明通过以下步骤实现： 

（1）菌种的筛选：从泡菜中筛选出1株乳酸菌(Lactobacillus plantarum Dy-1，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2012年4月18日；保藏编号：CGMCC  No.6016；分类命名：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum)、或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌（植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus case）等）一种或几种。 

（2）大麦发酵：称取脱壳磨成粉的大麦，过60～140目筛，按照重量与体积比1:6～1:15比例，优选1:9的比例加入蒸馏水；先用0.015%～0.045%的β-葡聚糖酶40～50℃水解15～30min，再加入筛选好的乳酸菌到大麦中，其中乳酸菌占大麦粉的质量为2～8%，混合均匀。将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20～40℃下发酵12～56h，其中优选发酵温度30～35℃，发酵时间24～48 后，发酵物在室温下6000～10000rpm/min离心15～40min，优选10000～12000rpm/min离心20～30min，收集上清液。并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到FBE。 

具有抗肿瘤活性食品的制备：将本发明的FBE以一定的比例直接加入到发酵乳制品以及其他酸性饮料中，制成功能性饮料。也可将其加入固体食品的制作中，如面包、面条、香肠以及饼干等。 

将本发明的FBE加入到食品中并无特别的重量要求，加入量一般优选1%～15%，优选4%～10%。 

本发明的优点：

（1）本发明以大麦原料，通过对其生物转化，丰富了大麦的营养与功能，为大麦生物转化功能性食品及作为功能性食品配料提供可靠而坚实的科学依据，为大麦的高效利用开创新的途径，为提升人类营养与健康水平作出积极的贡献。同时，对促进大麦的种植与精深加工及其产业发展具有重要的理论与实践意义。

（2）本发明对大麦进行简单预处理，生产成本低，采用直投式发酵，方便快捷，安全稳定，便于质控。 

（3）本发明利用自主分离的乳酸菌，制备具有抗肿瘤功能的发酵提取物，具有自主知识产权。 

附图说明

图1 FBE对结肠癌HT-29细胞的生长抑制率 

图2 FBE对荷瘤裸鼠瘤体积的影响

 图3 FBE对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制率

图4 FBE对荷瘤裸鼠肝脏中丙二醛含量的影响

图5 FBE对荷瘤鼠肝脏中总超氧化物歧化酶活力的影响

 图6 FBE对荷瘤鼠肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

 图7荷瘤裸鼠血清干扰素-γ的含量

 图8荷瘤裸鼠血清白细胞介素-4的含量

 图9荷瘤裸鼠血清肿瘤坏死因子-α含量

具体实施方式

（1）体外抗肿瘤功能：将本发明的FBE以一定的浓度加入到人的肿瘤细胞中，培养一段时间（如48h），与未加本发明乳酸菌发酵大麦提取物的情况相比较，用MTT法测定其抗肿瘤效果。 

与未加本发明FBE的情况相比较，肿瘤活细胞数可降至50%或以下，最优的可使活细胞数降至10%或以下。 

（2）体内抗肿瘤功能：将4～6周龄的BALB/c 裸鼠的腹部皮下接种人结肠癌HT-29细胞（接种量：1×10⁶～2×10⁷细胞/裸鼠），2～15天后肉眼可见裸鼠接种部位有肿瘤长出后开始灌胃；将荷瘤裸鼠随机分成5组，即阴性对照组、5-FU阳性对照组、FBE高剂量组、FBE低剂量组和FBE高剂量组+5-FU组，每组10～12只裸鼠，连续灌胃14～50天；每日测定瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，根据肿瘤重量计算抑瘤率；在试验末期测定荷瘤裸鼠血清中干扰素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）和肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度和测定荷瘤裸鼠肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）和生物大分子氧化损伤丙二醛（MDA）的含量。 

与阴性对照组相比较，灌胃FBE组的抑瘤率可达30%～60%。 

下面结合实例对本发明做进一步阐述。 

实施例1

称取粉碎过60目筛的大麦粉20.0g于500mL锥形瓶中，向其中加入1:6比例的水混合均匀，先用0.015%的β-葡聚糖酶40℃水解30min，再用4%的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Dy-1）在30℃下发酵48h，发酵完成后将FBE在室温下6000rpm/min离心20min，收集上清液，并将其进行冷冻干燥24h，从而获得到FBE。

称取0.5g的FBE溶于50ml的去离子水中，过0.22um的滤膜，将滤液按照0.125 mg/mL 、0.25mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/ml、4.0 mg/ml分别加入到HT-29肿瘤细胞中，培养细胞24h、48h、72h，并分别通过MTT法测定FBE对结肠癌HT-29细胞的抑制率。结果表明，提取物浓度与肿瘤细胞增殖抑制率呈正相关，最大抑制率达到95.6%(图1)。 

实施例2

将上述制备的FBE溶解于生理盐水中，制备成浓度为0.2g/ml和0.1g/ml，并且通过无菌膜处理备用。将人的HT-29结肠癌细胞接种到4-6周龄的BALB/c裸鼠腹部皮下，2天后采用2g/kg/d、1g/kg/d、2g/kg/d+5-FU（25 mg/kg/d，i.p，7天）剂量的FBE给荷瘤裸鼠灌胃，连续灌胃30天，同时与灌胃相同剂量的生理盐水组和腹腔注射（25 mg/kg/d, 7天）的5-FU组做比较，通过用游标卡尺测量的移植瘤体积和最后的抑瘤率来确证FBE的抗肿瘤作用(图2,3)。结果表明，2g/kg/d+5-FU混合剂量组的抑瘤率可达到53.36%。

用试剂盒测定荷瘤裸鼠肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）（图5）、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）（图6）和生物大分子氧化损伤丙二醛MDA的含量（图4）。发现FBE可以增加SOD和 GSH-PX的酶活，降低MDA的含量。 

用酶联免疫试剂盒测定荷瘤裸鼠血清中干扰素（IFN-γ）（（图7）、白介素-4（图8）和肿瘤坏死因子(TNF-α)（图9）的浓度。结果表明，FBE可以同时增加IFN-γ、白介素-4以及TNF-α的含量。 

Claims (2)

1.乳酸菌发酵大麦提取物的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）菌种的筛选：乳酸菌Lactobacillus plantarum Dy-1，CGMCC  No.6016；或者是选择商业上已鉴定好的优良乳酸菌（植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus case）等）一种或几种；

（2）大麦发酵：称取脱壳磨成粉的大麦，过60～140目筛，按照重量与体积比1:6～1:15比例，优选1:9的比例加入蒸馏水；先用0.015%～0.045%的β-葡聚糖酶40～50℃水解15～30min，再加入筛选好的乳酸菌到大麦中，其中乳酸菌占大麦粉的质量为2～8%，混合均匀；将锥形瓶用纱布封口，置于恒温培养箱中，在20～40℃下发酵12～56h，其中优选发酵温度30～35℃，发酵时间24～48 后，发酵物在室温下6000～10000rpm/min离心15～40min，优选10000～12000rpm/min离心20～30min，收集上清液；并将其进行热风干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥，从而获得到FBE。

2.权利要求1所述的乳酸菌发酵大麦提取物在制备具有抗肿瘤活性食品的应用：将本发明的FBE以一定的比例直接加入到发酵乳制品以及其他酸性饮料中，制成功能性饮料，或将其加入固体食品的制作中；将本发明的FBE加入到食品中并无特别的重量要求，加入量一般优选1%～15%，优选4%～10%。

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