CN114908141A - 一种通用型病毒样本保存液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通用型病毒样本保存液，其特征在于，以体积为1L的情况下，包括以下组分：10‑100mmol/L的缓冲化合物、核酸酶抑制剂1‑20mmol/L、表面活性剂质量比为0.01‑1％、螯合剂5‑50mmol/L、保护蛋白质量比为0.1‑2％、防腐剂Proclin300质量比为0.1％，保存液的制备方法，取配方量的各组分混合，调节pH值到5.0‑8.5，加液体生物防腐剂Proclin300；本发明的病毒样本保存液，在裂解病毒过程中，不破坏病毒功能蛋白结构，又能降低内源性核酸酶对病毒核酸的降解作用，经本发明的保存液处理的样本不仅可以用于病毒核酸检测，也可以用于病毒抗原的检测。

Description

一种通用型病毒样本保存液及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通用型病毒样本保存液及其制备方法。
背景技术
目前，针对病毒基因的核酸检测联合病毒蛋白N抗原检测仍是进行大规模人群筛查所采用的最有效的手段，新冠病毒抗原是否阳性成为了判断被检测者是否需继续进行核酸筛查的关键因素之一，对于快速控制疫情具有重大意义。目前，除了典型临床症状之外，确认人群是否阳性的金标准之一仍然是核酸检测，但是其对人员及场所要求较高，抗原检测则对人员和环境无特殊要求，操作简捷、迅速，能够快速获得检测结果。通过两种检测方法相结合的手段可以在病毒爆发早期进行大规模筛查中快速完成筛查，从而达到精准防控的目的。
现有技术中大多数的病毒样本保存液，只适用于单一的核酸检测或抗原检测的样本保存，缺乏一种通用型灭活的病毒样本保存液，能同时满足核酸检测和抗原检测检测所需的样本要求。因此，开发一种通用型病毒样本保存液，在裂解和灭活病毒过程中，既能减少内源性核酸酶对病毒核酸的降解，又能保存病毒功能蛋白的完整结构是设计样本保存液的核心，也是为后续核酸检测和抗原检测能正常进行的保证。
发明内容
本发明的目的就在于解决上述背景技术的问题，而提出一种通用型病毒样本保存液及其制备方法；包括特定浓度范围的缓冲液、核酸酶抑制剂、离液剂、表面活性剂和螯合剂，在裂解病毒过程中，不破坏病毒功能蛋白结构，又能降低内源性核酸酶对病毒核酸的降解作用，经本发明的保存液处理的样本不仅可以用于病毒核酸检测，也可以用于病毒抗原的检测。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种通用型病毒样本保存液，以体积为1L的情况下，包括以下组分： 10-100mmol/L的缓冲化合物、核酸酶抑制剂1-20mmol/L、表面活性剂质量比为0.01-1％、螯合剂5-50mmol/L、保护蛋白质量比为0.1-2％、防腐剂Proclin 300质量比为0.1％、pH为5.5-8.0；
通用型病毒样本保存液应用于的样本包括鼻咽拭子、血液样品，鼻、咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、粪便样品、眼结膜拭子样品；
防腐剂Proclin 300优选为0.1-0.5％，更优选为0.1％、0.2％、0.3％、 0.4％、0.5％；pH优选7.5-8.5，更优选7.5、8.0。
作为本发明进一步的方案：缓冲化合物为磷酸盐缓冲液，tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，硼酸盐缓冲液；其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为80-120mmol/L、磷酸盐为10-100mmol/L、硼酸盐20-80mmol/L；缓冲体系的浓度优选为2-10mmol/L，更优选为2mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、 10mmol/L。
作为本发明进一步的方案：核酸酶抑制剂为异硫氰酸胍；核酸酶抑制剂的浓度优选为8-10mmol/L，更优选为8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L。
作为本发明进一步的方案：表面活性剂为十二烷基磺酸钠，吐温20，聚乙二醇中的一种或多种，表面活性剂的浓度优选为0.1％、0.2％、0.3％、 0.4％、0.5％。
作为本发明进一步的方案：螯合剂为乙二胺四乙酸钠盐，螯合剂的浓度优选为20mmol/L、21mmol/L、22mmol/L、23mmol/L、24mmol/L、25mmol/L。
作为本发明进一步的方案：滤膜孔径为0.22μm。
作为本发明进一步的方案：保护蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，牛血清白蛋白的浓度优选为0.5-1％，更优选为0.8％、0.9％、1.0％。
一种通用型病毒样本保存液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
取配方量的各组分混合均匀，用NaOH或盐酸调节pH值到5.0-8.5，加液体生物防腐剂Proclin300，得到所述通用型病毒样本保存液。
作为本发明进一步的方案：。
本发明的有益效果：
本发明提供的通用型病毒样本保存液的配方组合，添加了能够快速灭活病毒的组分，降低了病毒传播感染的风险。通过抑制剂抑制内源性核酸酶的活性，有效避免病毒核酸的降解以致检测结果的假阴性，从而使病毒样本能够用于核酸检测，保证结果的准确性。本发明提供的通用灭活型病毒样本保存液的配方组合，快速裂解病毒抗原的同时，添加的保护蛋白在最大程度上保护病毒的相关蛋白，从而使得保存的样本可以用于胶体金，荧光免疫层析，胶乳微球等层析检测。通过一液多用，有效降低试剂盒生产厂家的采购成本，同时对于保存液的生产厂家来说，简单的配方更易于保持产品的稳定性和批件差。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明第一种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，0时间点的检测图；
图2是本发明第一种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，3时间点的检测图；
图3是本发明第一种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，6时间点的检测图；
图4是本发明第一种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，12时间点的检测图；
图5是本发明第二种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，0时间点的检测图；
图6是本发明第二种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，3时间点的检测图；
图7是本发明第二种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，6时间点的检测图；
图8是本发明第二种病毒保存液使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，12时间点的检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明为一种通用型病毒样本保存液，包括第一种病毒保存液和第二种病毒保存液；
其中，第一种病毒保存液包括以下组分：磷酸盐缓冲液为10mmol/L、异硫氰酸胍10mmo/lL、十二烷基磺酸钠为0.2％、乙二胺四乙酸钠 20mmol/L、牛血清白蛋白为0.8w％、防腐剂Proclin 300为0.1％，保存液的pH为7.0；
第二种病毒保存液包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为 50mmol/L、十二烷基磺酸钠为0.2％、乙二胺四乙酸钠为30mmol/L、牛血清白蛋白2％、防腐剂Proclin 300为0.2％，保存液的pH7.5。
实施例2
一种通用型病毒样本保存液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：按照上述组分配比称取各个原料，并将各组分原料混合均匀，得到病毒样本保存液；
步骤2：用NaOH调节pH值到5.0-8.5，加防腐剂Proclin300用滤膜过滤除菌，分装保存，得到通用灭活型病毒样本保存液。
实施例3
病毒保存液核酸保存效果的核酸检测验证：
在实施例1的2种样本保存液中加入新型冠状病毒(2019-nCOV)的已灭活病毒培养物，稀释至500TCID50浓度。分别在0h,3h,6h,12h，以经认可上市的核酸检测试剂盒(PCR荧光法)进行扩增获得各个时间段所对应的Ct值。
RT-qPCR荧光定量检测：按照新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒(达安基因)说明书设置PCR反应体系。使用实时定量PCR系统，程序设置参考试剂盒说明书。
荧光定量PCR检测数据结果
本发明通用灭活型病毒保存液，通过将病毒培养物在保存液中保存相应的时间，经RNA提取和RT-qPCR检测，获得时间点保存物对应的Ct值。
第一种病毒保存液结果如图1-4所示，使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，0,3,6,12h时间点，两种目标基因 (ORF1ab和N gene)呈阳性检出，判断标准：CT≤38；
第二种病毒保存液结果如图5-8所示，使用新冠病毒RT-qPCR检测试剂盒对提取的RNA样本进行检测，0,3,6,12h时间点两种目标基因(ORF1 ab 和N gene)均被检出，判断标准：CT≤38。
可以看出，使用本发明的第一种病毒保存液和第二种病毒保存液得到的样本，在经过0,3,6,12h后通过核酸提取获得病毒核酸，仍然可以可以被用作后续的qPCR实验；说明本保存液对病毒裂解物的保存效果良好。
实施例4
以上述实施例3同批的病毒保存液稀释配置的浓度梯度的病毒培养物，使用广州万孚的新冠抗原检测试剂盒(胶体金法)和(荧光免疫层析法)进行检测，按说明书流程进行检测。
新冠抗原胶体金检测结果
本发明病毒保存液稀释配置的实施例3，同批浓度梯度的病毒培养物，使用新冠抗原胶体金检测试剂盒进行检测：
第一种病毒保存液：在500TCID50的培养物浓度下，0,3,6,12h为阳性检出；24h的培养物检测为阴性显示，说明，保存液1具有裂解病毒抗原的效果，且在12h内可用于免疫层析试剂盒的新冠抗原检测。
第二种病毒保存液：在500TCID50的培养物浓度下，0,3,6,12h为阳性检出；24h的培养物检测为阴性显示，说明，保存液1具有裂解病毒抗原的效果，且在12h内可用于免疫层析试剂盒的新冠抗原检测。
荧光免疫层析法荧检测新冠病毒培养物的结果
第一种病毒保存液：在500TCID50的培养物浓度下，0,3,6,12h为阳性检出；24h的培养物检测为阴性。保存液1具有裂解病毒抗原的效果， 12h内可用荧光免疫层析试剂盒的新冠抗原检测。
第二种病毒保存液：在500TCID50的培养物浓度下，0,3,6,12h为阳性检出；24h的培养物检测为阴性。保存液2具有裂解病毒抗原的效果， 12h内可用于荧光免疫层析试剂盒的新冠抗原检测。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种通用型病毒样本保存液，其特征在于，以体积为1L的情况下，包括以下组分：10-100mmol/L的缓冲化合物、核酸酶抑制剂1-20mmol/L、表面活性剂质量比为0.01-1％、螯合剂5-50mmol/L、保护蛋白质量比为0.1-2％、防腐剂Proclin 300质量比为0.1％、pH为5.5-8.0；
通用型病毒样本保存液应用于的样本包括鼻咽拭子、血液样品，鼻、咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、粪便样品、眼结膜拭子样品。
2.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，缓冲化合物为磷酸盐缓冲液，tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，硼酸盐缓冲液；其中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐为80-120mmol/L、磷酸盐为10-100mmol/L、硼酸盐20-80mmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，核酸酶抑制剂为异硫氰酸胍。
4.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，表面活性剂为十二烷基磺酸钠，吐温20，聚乙二醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，螯合剂为乙二胺四乙酸钠盐。
6.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，滤膜孔径为0.22μm。
7.根据权利要求1所述的一种通用型病毒样本保存液,其特征在于，保护蛋白为牛血清白蛋白。
8.一种如权利要求1-7所述的通用型病毒样本保存液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
取配方量的各组分混合均匀，用NaOH或盐酸调节pH值到5.0-8.5，加液体生物防腐剂Proclin300，得到所述通用型病毒样本保存液。
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