ES2924342T3 - Procedimientos y composiciones para la firmeza de sandías - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona plantas de sandía únicas con un fenotipo de pulpa ultra firme y su descendencia. Tales plantas pueden comprender un QTL introgresado asociado con un fenotipo de pulpa ultra firme. En ciertos aspectos, se proporcionan composiciones, que incluyen distintos marcadores moleculares polimórficos, y métodos para producir, reproducir, identificar, seleccionar y similares de plantas o germoplasma con un fenotipo de pulpa ultrafirme. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos y composiciones para la firmeza de sandías
Antecedentes de la invención
La sandía [Citrullus lanatus], es un importante miembro comercial de la familia Cucurbitaceae. Los frutos presentan una amplia gama de coloración en la corteza exterior. El color del tejido comestible varía entre diferentes tonos de rojo, naranja, amarillo y blanco. En el mercado se puede encontrar una variación adicional con los tipos con y sin semillas. A diferencia de la coloración de la pulpa, que está causada por la variación de los loci genéticos, la distinción entre las variedades con y sin semillas suele estar causada por la variación de los niveles de ploidía. Es conocido que existe una correlación entre el nivel de ploidía y la firmeza de la carne. Las líneas diploides suelen tener los niveles más bajos de firmeza de la carne. Por razones que no están claras, el proceso de cambio de una línea diploide a una línea tetraploide se correlaciona con una pulpa de fruta más firme y, por tanto, las líneas tetraploides suelen tener una pulpa de fruta más firme que las diploides. Los triploides, al ser un cruce entre un tetraploide y un diploide, tienen un nivel intermedio de firmeza del fruto.
En el negocio de los productos frescos hay una creciente demanda por parte de los consumidores de productos que combinen calidad y comodidad. Algunos ejemplos de productos que cumplen estos criterios son las mini-zanahorias embolsadas y los cultivos de hoja, como la lechuga y las espinacas. Asimismo, hay demanda de frutas maduras cortadas, como sandía, melón, mango, piña, papaya y kiwi. En los frutos de la sandía, un criterio de calidad del consumidor es el dulzor. El dulzor puede estimarse midiendo los sólidos solubles totales, o Brix, usando un refractómetro. De hecho, se han establecido normas de calidad de la fruta para los niveles de Brix (United States Standards for Grades of Watermelon, U.S. Department of Agriculture (1978)). Según estas normas, las partes comestibles de la fruta que tienen no menos de 8 Brix se consideran "Buenas", mientras que las partes comestibles de la fruta que tienen no menos de 10 Brix se consideran "Muy buenas"
Un segmento creciente de las ventas al por menor de sandías ofrece al consumidor frutas cortadas y expuestas con la corteza adherida, o frutas con la corteza retirada y en las que la pulpa comestible está cortada en trozos más pequeños. El término de la industria para estos productos es "mínimamente procesado" En 1998, Perkins-Veazie et al. [(1998), Hortscience 33:605] estimó que el 10% del mercado de venta al por menor de sandías estaba mínimamente procesado.
Además de ofrecer comodidad al consumidor, una de las ventajas de los expositores de fruta cortada es que el consumidor puede inspeccionar visualmente la calidad de la fruta y, en particular, juzgar si está madura y lista para el consumo. A menudo, los frutos inmaduros no tendrán una pigmentación uniforme, y los frutos demasiado maduros mostrarán signos de descomposición.
La desventaja para el minorista de productos agrícolas de presentar productos de sandía mínimamente procesados es que las frutas cortadas tienen una vida útil corta. Los estudios sugieren que los productos mínimamente procesados tienen una corta vida útil de unos 2 a 3 días como máximo (ibidem Wehner et al. En: Sandías: Características, producción y comercialización. Maynard, editor. ASHS Press, Alexandria VA 2001).
Los frutos de sandía disponibles actualmente suelen sufrir un rápido deterioro de la calidad después de ser cortados. El deterioro se manifiesta en forma de fugas de zumo; en algunas variedades, la pulpa de una fruta de sandía recién cortada se vuelve rápidamente poco atractiva para el consumidor. El corte de la fruta también provoca la descomposición, que se observa como un ablandamiento de la textura de la fruta. El rápido deterioro de la fruta cortada de la sandía impone al minorista limitaciones de tiempo y espacio. Dado que las frutas cortadas tienen una vida útil corta, el minorista suele realizar el procesamiento en el sitio de venta al por menor, y tiene que supervisar los productos a menudo para asegurarse de que se desechan los productos deteriorados.
A diferencia de las normas de dulzor establecidas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, no existen normas industriales para describir la firmeza de las porciones comestibles de los frutos de la sandía. Así, hay una amplia gama de descriptores en uso, como "firme" y "crujiente" (descriptores del catálogo de Erma Zaden para las variedades Gil 104 y Erma 12), "carne muy firme" porZhang et al. (Publicación de Patente US n° 2004/0060085 y 2003/0217394) y por Seminis Vegetable Seeds, Inc. en su catálogo de sandías para describir la variedad Cooperstown. Seminis también ha descrito los cultivares Fenway, Royal Star y Sentinel como de "excelente textura crujiente", "carne firme" y "carne crujiente y jugosa", respectivamente. Rogers Seed Company anuncia la marca Tri-X 626 como "excepcionalmente firme" y la marca Tri-X 313 como de "textura firme" y "carne crujiente" Aunque la terminología publicitaria utilizada para describir la firmeza de la pulpa de la sandía es bastante variable, las mediciones cuantitativas muestran que el germoplasma comercial anterior a esta invención tiene una baja firmeza de la fruta. Por lo tanto, existe una necesidad en el mercado de líneas de sandías que produzcan frutas que tengan una vida útil más larga cuando se procesan.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona procedimientos de identificación de una planta de sandía, el procedimiento comprende:
(i) proporcionar una población de plantas de sandía;
(ii) genotipar al menos una planta de sandía de la población con respecto a al menos un ácido nucleico polimórfico situado en una región genómica flanqueada por los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0250266 (SEQ ID NO:18), y
(iii) seleccionar de la población al menos una planta de sandía que comprenda al menos un alelo asociado a un fenotipo de carne de sandía ultra firme.
La presente invención proporciona además procedimientos como los descritos anteriormente, en los que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico se localiza en una posición genómica flanqueada por:
a) los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0251011 (SEQ ID NO:12);
b) los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0252274 (SEQ ID NO:10);
c) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW0250266 (SEQ ID NO:18);
d) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW025101 1 (SEQ ID NO:12);
e) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW0252274 (SEQ ID NO:10);
f) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0250266 (SEQ ID NO:18);
g) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0251011 (SEQ ID NO:12); o
h) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
En una realización relacionada, la presente invención proporciona procedimientos como los descritos anteriormente, en los que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico se selecciona del grupo que consiste en NW0248953 (SEQ ID NO: 2), NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248949 (SEQ ID NO: 4), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), NW0249077 (SEQ ID NO: 6), NW0249132 (SEQ ID NO: 7), NW0252494 (SEQ ID NO: 8), NW0248163 (SEQ ID NO: 9), NW0252274 (SEQ ID NO: 10), NW0248905 (SEQ ID NO: 11), NW0251011 (SEQ ID NO: 12), NW0248869 (SEQ ID NO: 13), NW0251470 (SEQ ID NO: 14), NW0251308 (SEQ ID NO: 15), y NW0250718 (SEQ ID NO: 16), y NW0248059 (SEQ ID NO:17).
Los procedimientos pueden caracterizarse además en que dicha detección comprende detectar al menos dos ácidos nucleicos polimórficos que están asociados con un fenotipo de pulpa de sandía ultra firme seleccionado del grupo que consiste en NW0248953 (SEQ ID NO:2), NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248949 (SEQ ID NO:4), NW0248646 (SEQ ID NO:5), NW0249077 (SEQ ID NO:6), NW0249132 (SEQ ID NO:7), NW0252494 (SEQ ID NO:8), NW0248163 (SEQ ID NO:9), NW0252274 (SEQ ID NO:10), NW0248905 (SEQ ID NO:11), NW0251011 (SEQ ID NO:12), NW0248869 (SEQ ID NO:13), NW0251470 (SEQ ID NO:14), NW0251308 (SEQ IDNO:15), NW0250718 (SEQ ID NO:16), y NW0248059 (SEQ ID NO:17).
En otra alternativa de los procedimientos anteriores, dicho al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) se selecciona del grupo que consiste en NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5) y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
De manera similar, los procedimientos anteriores pueden comprender al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) que comprende al menos dos ácidos nucleicos polimórficos seleccionados del grupo que consiste en NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5), y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
En otra realización, los procedimientos anteriores se caracterizan porque dicho al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) comprende NW0250301 (SeQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5) y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
En un aspecto de estos procedimientos, el genotipo asociado con un genotipo de carne de sandía ultra firme comprende tener al menos uno de los siguientes: un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO:10); un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO:5); o un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO:3).
El procedimiento anterior puede proporcionar una fruta obtenida de dicha planta de sandía seleccionada que tiene una pulpa que resiste una presión de al menos 15,568 Newtons (3,5 libras-fuerza) cuando dicha pulpa se mide desde el centro de una fruta cortada con un penetrómetro que tiene una sonda de 8 milímetros de diámetro y se expresa como un promedio de tres a cinco mediciones.
En una realización relacionada, los procedimientos anteriores proporcionan carne cortada obtenida de una fruta de dicha planta de sandía seleccionada que pierde menos del cuatro por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados. Alternativamente, la pulpa cortada obtenida de un fruto de dicha planta de sandía seleccionada pierde menos del tres por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados.
Los procedimientos anteriores proporcionan plantas que tienen un genotipo asociado con un genotipo de carne de sandía ultra firme que comprende al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO:10); al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO:5); y al menos un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO:3).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. La figura 1 muestra las distribuciones de los fenotipos de firmeza en tres ambientes probados (Woodland, CA Año de prueba 1 y Año de prueba 3; Tifton, GA Año de prueba 1).
Figura 2. La Figura 2 muestra los principales QTL de firmeza identificados en el grupo de enlace 9 (del mapa genético de la población derivada 03LB3378-1 x WAS-35-2438) y los QTL co-localizados para el contenido de Brix y licopeno identificados utilizando QTL Cartographer. Las barras negras muestran las curvas de QTL que corresponden a los intervalos de confianza de 2LOD y los cuadrados blancos en cada barra identifican los picos de QTL.
Figura 3. QTL principal para la firmeza identificado en el grupo de enlace 9 utilizando Rqtl. A. El gráfico muestra la superposición de las curvas LOD de los escaneos genómicos de QTL único realizados por tres procedimientos de cartografía de intervalos (algoritmo EM), regresión de Haley-Knott e imputaciones múltiples para los 19 grupos de ligamiento del mapa genético 03LB3387 x WAS-35-2438. B. El gráfico de calor corresponde a los escaneos del genoma de dos QTL y muestra el efecto principal para la firmeza identificado en el grupo de enlace 9 por debajo de la diagonal y la falta de interacciones epistáticas de dos locus por encima de la diagonal.
Descripción detallada
Los títulos se proporcionan en la presente memoria únicamente para facilitar la lectura y no deben interpretarse como limitantes.
I. Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la materia en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional de los expertos en la materia.
Como se utiliza en el presente documento, el término "planta" incluye las células vegetales, los protoplastos vegetales, las células vegetales de cultivo de tejidos a partir de las cuales se pueden regenerar las plantas de sandía, los callos vegetales, los grupos de plantas y las células vegetales que están intactas en las plantas o en partes de las plantas como el polen, las flores, las semillas, las hojas, los tallos y similares.
Como se utiliza en el presente documento, tener un "fenotipo de carne ultrafirme" de sandía significa que la carne comestible de una sandía mide al menos unas 15,568 Newtons (3,5 libras de fuerza (lb/F)) de presión según se evalúa con un penetrómetro por los procedimientos descritos en el presente documento.
Un penetrómetro es un dispositivo utilizado para medir la fuerza, como el utilizado para medir la firmeza de la fruta. Puede utilizarse para medir la firmeza tanto de la pulpa como de la piel de la fruta. Para los datos presentados en la presente memoria, se utilizó un penetrómetro de mano con tres o cinco lecturas en la fruta madura, utilizando el modelo de penetrómetro FT011 (QA Supplies, Norfolk, VA) con una sonda de 8 milímetros (aproximadamente 5/16 pulgadas). La fuerza en kg, es la unidad que lee el penetrómetro modelo FT011, y se proporciona para las lecturas realizadas exclusivamente con la sonda de 8 milímetros.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "población" significa una colección genéticamente heterogénea de plantas que comparten una derivación parental común.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos "variedad" y "cultivar" significan un grupo de plantas similares que, por su pedigrí genético y su rendimiento, pueden ser identificadas a partir de otras variedades dentro de la misma especie.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "sólidos solubles" significa el porcentaje de material sólido que se encuentra en la porción comestible de la fruta. Como se utiliza en la presente memoria, los sólidos solubles se miden cuantitativamente con un refractómetro como grados Brix. El Brix se define formalmente como el porcentaje en peso de sacarosa: si el único sólido soluble presente en una solución acuosa es la sacarosa, se medirá entonces un porcentaje real de sacarosa. Sin embargo, si hay otros sólidos solubles, como ocurre casi siempre, la lectura no es igual al porcentaje de sacarosa, sino que se aproxima al porcentaje global de sólidos solubles en la muestra. En resumen, aunque los grados Brix se definen técnicamente como porcentaje en peso de sacarosa, los expertos en la materia reconocen que el porcentaje en peso de sólidos solubles, obtenido con un refractómetro, se aproxima al porcentaje en peso de sacarosa e indica con precisión el dulzor. Por lo tanto, cuanto mayor sea el porcentaje de sólidos solubles, indicado por el grado Brix, mayor será el dulzor percibido de la fruta.
Como se utiliza en la presente memoria, un "alelo" se refiere a una de las dos o más formas alternativas de una secuencia genómica en un locus determinado de un cromosoma.
Un "Locus de Rasgo Cuantitativo (QTL)" es una localización cromosómica que codifica para alelos que afectan a la expresividad de un fenotipo.
Como se utiliza en la presente memoria, un "marcador" significa una característica detectable que puede utilizarse para discriminar entre organismos. Algunos ejemplos de estas características son, entre otros, los marcadores genéticos, los marcadores bioquímicos, los metabolitos, las características morfológicas y las características agronómicas.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "fenotipo" significa las características detectables de una célula u organismo que pueden ser influenciadas por la expresión genética.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "genotipo" significa la composición alélica específica de una planta.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "introgresado", cuando se utiliza en referencia a un locus genético, se refiere a un locus genético que ha sido introducido en un nuevo antecedente genético. La introgresión de un locus genético puede lograrse, por tanto, mediante procedimientos de fitomejoramiento y/o por procedimientos de genética molecular. Tales procedimientos de genética molecular incluyen, pero no se limitan a, varias técnicas de transformación de plantas y/o procedimientos que proporcionan recombinación homóloga, recombinación no homóloga, recombinación específica de sitio, y/o modificaciones genómicas que proporcionan sustitución de locus o conversión de locus.
Como se utiliza en el presente documento, el término "ligado", cuando se utiliza en el contexto de marcadores de ácido nucleico y/o regiones genómicas, significa que los marcadores y/o las regiones genómicas están situados en el mismo grupo de unión o cromosoma.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "madurez" significa la madurez del desarrollo de la fruta. La madurez indica el momento en que el fruto de la sandía está listo para ser cosechado. En la sandía, la madurez viene asociada a cambios en el color de la pulpa y el contenido de azúcar.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "denotar" cuando se utiliza en referencia a un genotipo de planta se refiere a cualquier procedimiento por el que se indica que una planta tiene un determinado genotipo. Esto incluye cualquier medio de identificación de una planta que tenga un determinado genotipo. La indicación de un determinado genotipo puede incluir, pero no se limita a, cualquier entrada en cualquier tipo de medio escrito o electrónico o base de datos en la que se proporcione el genotipo de la planta. Las indicaciones de un determinado genotipo también pueden incluir, aunque no exclusivamente, cualquier procedimiento en el que se marque o etiquete físicamente una planta. Ejemplos ilustrativos de marcas o etiquetas físicas útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, un código de barras, una identificación por radiofrecuencia (RFID), una etiqueta, o similares.
II. Visión general
Ciertas realizaciones que no forman parte de la presente invención proporcionan plantas de sandía que comprenden en su genoma un locus alélico introgresado asociado con un fenotipo de carne de sandía ultrafirme en el que el locus alélico introgresado no ha sido previamente introgresado en el fondo genómico de una variedad o cultivar específico. Ciertas realizaciones proporcionan procedimientos para detectar en una planta de sandía un genotipo asociado con un fenotipo de carne ultra firme en una planta de sandía. Ciertas realizaciones proporcionan procedimientos de identificación y selección de una planta de sandía que comprende en su genoma un genotipo asociado con un fenotipo de carne ultra firme. Además, ciertas realizaciones que no forman parte de la invención proporcionan procedimientos para producir una planta de sandía que comprende en su genoma al menos un locus introgresado asociado con un fenotipo de carne ultra firme y procedimientos para introgresar dicho alelo en una planta de sandía. Las plantas de sandía y las partes de las mismas fabricadas por cualquiera de dichos procedimientos también están previstas en ciertas realizaciones que no forman parte de la invención.
El uso de marcadores para inferir un fenotipo de interés resulta en la economización de un programa de cultivo mediante la sustitución de ensayos de fenotipado costosos y que requieren mucho tiempo por el genotipado. Además, los programas de mejora pueden diseñarse para impulsar explícitamente la frecuencia de fenotipos favorables específicos dirigiéndose a genotipos concretos (Patente US n° 6.399.855). La fidelidad de estas asociaciones puede supervisarse continuamente para garantizar el mantenimiento de la capacidad de predicción y, por lo tanto, de las decisiones de cultivo informadas (Publicación de Patente US n° 2005/0015827).
El éxito de la producción de sandías depende de la atención que se preste a diversas prácticas hortícolas. Estos incluyen el manejo del suelo con especial atención a la fertilización adecuada, el establecimiento del cultivo con un espaciamiento apropiado, el control de las malas hierbas, la introducción de abejas para la polinización, el riego, el manejo de plagas y, si se produce fruta a partir de plantas triploides, una fuente de polen adecuada para producir sandía sin semillas (triploide). El tamaño y la forma del fruto de la sandía, el color, el grosor y la dureza de la corteza, el tamaño, el color y el número de semillas, el color, la textura y el contenido de azúcar de la pulpa y la ausencia de defectos en el fruto son características importantes que deben tenerse en cuenta en la selección de las variedades de sandía. Las empresas comerciales de semillas suelen ofrecer al agricultor la oportunidad de observar estos criterios en parcelas de demostración de sus variedades, y algunas universidades agrícolas proporcionan datos de análisis de cultivares a los agricultores locales (Roberts et al. (2004), Maynard y Sidoti (2003), Schultheis y Thompson (2004), y Leskovar et al. (2004).
Los cultivos de sandía pueden establecerse a partir de semillas o de trasplantes. El trasplante se ha vuelto más común porque el trasplante puede dar lugar a una cosecha más temprana en comparación con una cosecha producida a partir de la siembra directa. Cuando un agricultor quiere cultivar una cosecha con frutos sin semillas, es preferible el trasplante. El trasplante ayuda a conseguir rápidamente masas de plantas completas, especialmente cuando los costes de las semillas son más elevados, como en el caso de las semillas triploides, lo que hace que la siembra directa sea arriesgada.
La sandía es la única cucurbitácea de importancia económica con hojas pinnatifidas (lobuladas); todas las demás especies tienen hojas enteras (no lobuladas). El hábito de crecimiento de la sandía es el de una enredadera de arrastre. Los tallos son finos, peludos, angulosos, acanalados y con zarcillos ramificados en cada nudo. Los tallos están muy ramificados y tienen hasta 9 metros de longitud (Wehner et al. En: Sandías: Características, producción y comercialización. Maynard, editor. ASHS Press, Alexandria, VA (2001)).
Los cultivadores de sandías se enfrentan al reto de anticiparse a los cambios en las condiciones de cultivo, a la nueva presión de los patógenos y a los cambios en las preferencias de los consumidores. Con estas proyecciones, un cultivador intentará crear nuevos cultivares que se ajusten a las necesidades en desarrollo de los cultivadores, los transportistas, los minoristas y los consumidores. Así pues, el cultivador se enfrenta al reto de combinar en un solo genotipo el mayor número posible de atributos favorables para una buena distribución del cultivo y el consumo. Una característica importante para el cultivador es el tamaño del fruto. El tamaño de la fruta es una consideración importante porque hay diferentes requisitos de mercado para grupos particulares de cargadores y consumidores. Las categorías generales son: nevera (< 5,4 kg), pequeña (5,4-8,1 kg), mediana (8,1-10,8 kg), grande (10,8-14,5 kg) y gigante (>14,5). El tamaño de los frutos se hereda de forma poligénica, con unos 25 genes implicados. La fruta se distribuye desde el productor hasta el minorista a través de los transportistas, que se centran en determinadas categorías de peso, como 8,1-10,8 kg para los que tienen semillas y 6,3-8,1 kg para los que no las tienen. Aunque históricamente se han consumido frutos de este tamaño, existe una tendencia creciente en el mercado de una nueva clase de híbridos de sandía de fruto pequeño (con un peso de fruto entre 1,3-4,1 kg).
La firmeza de la pulpa de la fruta es otra característica importante. Los consumidores tienen diferentes preferencias en cuanto a la textura de la sandía, y la firmeza de la pulpa está relacionada con la textura. Además, la firmeza de la fruta es un parámetro crítico que determina la duración de la fruta cortada en el estante del minorista. La investigación sobre la vida útil de la fruta cortada suele ser cualitativa, con evaluaciones sobre el momento en que la fruta se vuelve "viscosa" (Perkins-Veazie et al. 1998 HortScience 33:605). Una evaluación más cuantitativa de la vida útil de la fruta cortada consiste en medir directamente la firmeza de la pulpa utilizando un penetrómetro y/o la purga de líquido de la fruta cortada.
Otra importante característica interna de la fruta es la calidad(Véase Wehner et al. En: Sandías: Características, producción y comercialización. Maynard, editor. ASHS Press, Alexandria, VA (2001)). Una de las características más importantes es el dulzor, medido en grados Brix, sin sabor amargo. Los datos del panel de degustación demostraron una correlación directa de las puntuaciones de buen sabor con niveles de Brix más altos (Nip et al. (1968) Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 93:547). Los niveles de grados Brix aumentan a medida que la fruta se desarrolla y madura en la vid. Así, los frutos inmaduros tendrán un dulzor inaceptable para el consumidor; si se recogen demasiado pronto, el tejido comestible tampoco tendrá un color uniforme. Se han publicado recomendaciones cuantitativas para los frutos de la sandía. Mientras que Wehner et al. sugieren niveles de Brix entre el 10% y el 14% de Brix, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) también ha establecido normas de calidad de la fruta para los niveles de Brix (United States Standards for Grades of Watermelon, U.S. Department of Agriculture (1978)). Según estas normas, las partes comestibles de la fruta que tienen no menos de 8 Brix se consideran "Buenas", mientras que las partes comestibles de la fruta que tienen no menos de 10 Brix se consideran "Muy buenas" III. Sandía de carne ultra firme
La firmeza de la pulpa de la sandía es un rasgo importante de la calidad de la fruta con varios beneficios para los productores, procesadores, minoristas y clientes. Las sandías con pulpa más firme tienen un mayor aguante en el campo, lo que permite a los productores cosechar con menos frecuencia y/o cosechar la fruta en un estado más maduro (85-95% de madurez frente al 70% del estándar actual del mercado). Conservan el agua, los nutrientes y el sabor durante el procesado, por lo que tienen un mayor rendimiento de corte fresco para los procesadores, una menor purga y una mayor vida útil para los minoristas y los consumidores. Los productos de sandía comercializados actualmente suelen tener una firmeza de aproximadamente 8,8 N, mientras que las sandías con un fenotipo de carne ultra firme tienen una carne comestible que resiste una presión de al menos 15,5 N. La tabla 1 muestra los datos de firmeza de la pulpa de los híbridos comerciales y de las líneas endógamas.
Tabla 1. Estudio de la firmeza en los cultivares típicos de sandía y en las líneas endógamas.
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En el presente documento se informa de que se ha identificado un locus de rasgo cuantitativo (QTL) con efectos importantes para la firmeza y marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la proximidad de este locus que pueden utilizarse para la introgresión de esta región genómica en el germoplasma deseable, como por ejemplo mediante selección asistida por marcadores y/o retrocruzamiento asistido por marcadores. Se obtuvo una población de plantas de un cruce entre las líneas de sandía 03LB3378-1 y WAS-35-2438. A partir de esta población, se construyó un mapa de ligamiento compuesto por 19 grupos de ligamiento utilizando 404 marcadores polimórficos. El análisis de la cartografía de QTLs reveló un locus principal que controla la firmeza de la pulpa en el extremo proximal del grupo de enlace 9. Este descubrimiento de un QTL de firmeza importante facilitará el desarrollo de productos de sandía de carne ultra firme.
La Tabla 2 muestra la firmeza de la pulpa y el contenido de azúcar de la línea endogámica PI296341, y de otras líneas endogámicas creadas a partir de PI296341. PI29634 es resistente a la marchitez por Fusarium, patógeno de raza 2 (Fusarium oxysporum), y se caracteriza por tener frutos redondos muy pequeños de entre 10,16 y 15,24 cm de diámetro y un peso de entre 0,45 y 1,17 kg. La pulpa de su fruta es blanca, muy firme y con pocos azúcares. Las evaluaciones organolépticas de estas frutas van desde la no percepción del dulzor hasta el amargor.
Tabla 2. Firmeza y contenido de azúcar de las líneas endogámicas y su fuente PI296341.
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Para la mayoría de los objetivos de cultivos, los cultivadores comerciales trabajan con el germoplasma que a menudo se denomina "tipo cultivado" Este germoplasma es más fácil de criar porque, en general, se comporta bien cuando se evalúa su rendimiento hortícola. La ventaja de rendimiento que proporciona el tipo cultivado se ve a veces compensada por la falta de diversidad alélica. Esta es la contrapartida que acepta un cultivador cuando trabaja con germoplasma cultivado: mejor rendimiento general, pero falta de diversidad alélica. Los cultivadores suelen aceptar esta contrapartida porque el progreso es más rápido cuando se trabaja con material cultivado que cuando se cultivo con fuentes genéticamente diversas.
Por el contrario, cuando un cultivador realiza cruces intraespecíficos o cruces interespecíficos, se produce una compensación inversa. En estos ejemplos, un cultivador suele cruzar germoplasma cultivado con un tipo no cultivado. En estos cruces, el cultivador puede acceder a nuevos alelos del tipo no cultivado, pero puede tener que superar el arrastre genético asociado al padre donante. Debido a la dificultad de esta estrategia de cultivo, este enfoque suele fracasar por problemas de fertilidad y fecundidad. La dificultad de este enfoque de mejora se extiende a muchos cultivos, y se ejemplifica con un importante fenotipo resistente a las enfermedades que se describió por primera vez en el tomate en 1944 (Smith, Proc. Am. Soc. Hort. Sci. 44:413-16). En este cruce, se transfirió una resistencia a la enfermedad del nematodo desde L. peruvianum (PI128657) a un tomate cultivado. A pesar de la intensa labor de cultivo, no fue hasta mediados de los años 1970 cuando los cultivadores pudieron superar el lastre genético y liberar líneas exitosas portadoras de este rasgo. De hecho, incluso hoy en día, los cultivadores de tomates aportan este gen de resistencia a la enfermedad a una variedad híbrida de un solo progenitor. Esto permite enmascarar el arrastre genético restante. La inventiva de lograr este enfoque de cultivo ha sido reconocida por la USPTO (Patente US n° 6,414,226, 6,096,944, 5,866,764 y 6,639,132).
En la sandía, las accesiones de introducción de plantas son típicamente líneas que producen frutos con cualidades indeseables de producción y consumo. A pesar de que estas líneas tienen escasas cualidades hortícolas, algunos cultivadores de sandías, al igual que otros cultivadores de cultivos, intentan criar con estas líneas PI porque contienen potencialmente nuevos alelos. Hasta la fecha, el objetivo de mejora más comúnmente intentado para el uso de las líneas PI es la introgresión de nuevos genes de resistencia a las enfermedades. El proceso de introgresión de nuevos genes de resistencia de las líneas de IP en tipos comerciales aceptables es un proceso largo y a menudo arduo. Este proceso puede ser difícil porque el rasgo puede ser poligénico, o tener una baja heredabilidad, o tener arrastre de enlaces o alguna combinación de ellos.
Algunos fenotipos están determinados por el genotipo a nivel de un locus. Estos rasgos simples, como los estudiados por Gregor Mendel, se dividen en categorías discontinuas, como las semillas verdes o amarillas. Sin embargo, la mayor parte de las variaciones observadas en la naturaleza son continuas, como el rendimiento del maíz en el campo o la presión arterial humana. A diferencia de los rasgos simplemente heredados, la variación continua puede ser el resultado de la herencia poligénica. Los loci que afectan a la variación continua se denominan loci de rasgos cuantitativos (QTL). La variación del fenotipo de un rasgo cuantitativo es el resultado de la composición alélica en los QTL y del efecto ambiental. La heredabilidad de un rasgo es la proporción de la variación fenotípica atribuida a la varianza genética. Esta proporción varía entre 0 y 1,0. Así, un rasgo con una heredabilidad cercana a 1,0 no se ve muy afectado por el entorno. Los expertos en la materia reconocen la importancia de crear líneas comerciales con rasgos hortícolas de alta heredabilidad porque estos cultivares permitirán a los productores producir una cosecha con especificaciones de mercado uniformes.
La sandía mínimamente procesada tiene una vida útil corta de 2 a 3 días (Perkins-Veazie et al. (1998) Hortscience 33:605; Wehner et al. en Sandías: Características, producción y comercialización. Maynard, editor. ASHA Press, Alexandria, VA (2001)). Aunque la vida útil máxima de la fruta cortada de la sandía es de sólo unos días, la calidad del producto comienza a deteriorarse rápidamente después de ser procesado. En los productos cortados presentados en envases de plástico para alimentos, el consumidor puede ver este rápido deterioro porque el líquido se escapa de los productos cortados y se acumula en el fondo del envase.
La fuga de agua (también denominada purga), puede evaluarse mediante la siguiente prueba de retención de agua. La prueba se realiza a 4 °C. Para medir la pérdida de líquido, la parte comestible de los frutos se cortó en cubos de aproximadamente 2,54 cm y se pesó. Se eligió el tamaño del cubo porque es el que mejor se aproxima al tamaño del producto procesado que se encuentra en los puntos de venta. Durante un periodo de 16 días, las muestras sólidas se vuelven a pesar y la pérdida de líquido se estima calculando el porcentaje de pérdida de peso.
Experimentos anteriores han mostrado que aunque los productos cortados de cultivares estándar pueden tener una vida útil de hasta 2 o 3 días, el deterioro medido por la fuga de agua comienza casi inmediatamente después del corte. Por el contrario, las líneas de pulpa firme resistieron la rápida fuga de líquido de las frutas de sandía estándar. En ciertas realizaciones de la invención, la pulpa cortada del fruto de una sandía de la invención con un genotipo asociado a un fenotipo de pulpa ultrafirme pierde menos de un cuatro por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados. En ciertas realizaciones de la invención, la pulpa cortada del fruto de una sandía de la invención con un genotipo asociado a un fenotipo de pulpa ultrafirme pierde menos de un tres por ciento o menos de un dos por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados. La fruta de la sandía que retiene el líquido cuando se corta logrará un período más largo de aceptación por parte del consumidor después de su procesamiento en el mercado de la sandía mínimamente procesada.
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Los solicitantes han descubierto una región genómica, QTL, alelos, ácidos nucleicos polimórficos, marcadores ligados y similares que, cuando están presentes en ciertas formas alélicas, se asocian con un fenotipo de carne de sandía ultra firme. La región genómica se encuentra en el extremo proximal del grupo de enlace 9 de la sandía (del mapa genético de la población 03LB3378-1 x WAS-35-2438) y está flanqueada por los loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18). En esta región se encontró un importante QTL de firmeza de la pulpa de la sandía. Algunas de las diversas realizaciones de la invención utilizan un QTL o un marcador de ácido nucleico polimórfico o un alelo situado en esta región genómica. Las subregiones de esta región genómica asociadas a un fenotipo de carne de sandía ultra firme pueden describirse como flanqueadas por:
a) loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12);
b) loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10);
c) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18);
d) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12);
e) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10);
f) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18);
g) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12); o
h) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10).
Algunas de las diversas realizaciones de la invención utilizan un QTL o un marcador de ácido nucleico polimórfico o un alelo situado en una o más de estas subregiones.
Marcadores de ácido nucleico polimórficos situados en la región flanqueada por los loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18) incluyen, pero no se limitan a: NW0248953 (SEQ ID NO: 2), NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248949 (SEQ ID NO: 4), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), NW0249077 (SEQ ID NO: 6), NW0249132 (SEQ ID NO: 7), NW0252494 (SEQ ID NO: 8), NW0248163 (SEQ ID NO: 9), NW0252274 (SEQ ID NO: 10), NW0248905 (SEQ ID NO: 11), NW0251011 (SEQ ID NO: 12), NW0248869 (SEQ ID NO: 13), NW0251470 (SEQ ID NO: 14), NW0251308 (SEQ ID NO: 15), NW0250718 (SEQ ID NO: 16), y NW0248059 (SEQ ID NO: 17). Se cree que estos marcadores están asociados con el fenotipo de carne ultra firme de la sandía debido a su ubicación y proximidad al QTL de firmeza principal. Algunas de las diversas realizaciones de la invención utilizan uno o más ácidos nucleicos polimórficos seleccionados de este grupo. En ciertas realizaciones, se utilizan al menos dos de estos marcadores.
Se encontró que el pico del QTL estaba muy cerca de al menos NW0249132 (SEQ ID NO: 7), NW0248163 (SEQ ID NO: 9), NW0251011 (SEQ ID NO: 12), y NW0250266 (SEQ ID NO:18). Hasta la fecha, NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), y NW0252274 (SEQ ID NO:10) han sido validadas como predictoras del fenotipo de carne ultra-firme en diversos germoplasmas de sandía. En algunas de las diversas realizaciones de la invención, al menos un ácido nucleico polimórfico seleccionado del grupo que consiste en NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), y NW0252274 (SEQ ID NO: 10). En ciertas realizaciones, se utilizan al menos dos ácidos nucleicos polimórficos seleccionados de este grupo. En ciertas realizaciones, al menos los tres NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), y NW0252274 (SEQ ID NO: 10).En ciertas realizaciones de la invención, es útil detectar en, o determinar si, una planta de sandía tiene un estado alélico que está asociado con un fenotipo de carne ultra firme (Tabla 3). En algunas otras realizaciones, es útil detectar en, o determinar si, una planta de sandía tiene un estado alélico que no está asociado con un fenotipo de carne ultra firme (Tabla 3) (La posición del sitio polimórfico identificado en la Tabla 3 para cada una de estas secuencias de marcadores está contenida en la Tabla 6 y en el Listado de Secuencias adjunto).
En ciertas realizaciones, se identifica una planta en la que se detecta al menos un alelo en un locus polimórfico asociado a un fenotipo de carne de sandía ultra firme. Por ejemplo, una planta diploide en la que el estado alélico en un locus polimórfico comprende un alelo asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme y un alelo que no está asociado con un fenotipo de carne ultra firme (es decir, heterocigoto en ese locus). En ciertas realizaciones de la invención, puede ser útil cruzar una planta que es heterocigota en un locus asociado con un fenotipo de carne ultra firme con una planta que es similarmente heterocigota o que no contiene ningún alelo asociado con un fenotipo de carne ultra firme en el locus, para producir una progenie con un cierto porcentaje de plantas que son heterocigotas en ese locus. Las plantas homocigotas en el locus pueden entonces producirse mediante diversos procedimientos de reproducción, como el autocruzamiento o la dihaploidización. En otro ejemplo, se identifica una planta de sandía triploide o tetraploide en la que el estado alélico en un locus comprende al menos un alelo asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme, en el que otros alelos del locus pueden o no ser también un alelo asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme. Los ejemplos ejemplares no limitantes incluyen la identificación de una planta que: tiene al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO: 10); tiene al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO: 5); o tiene al menos un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO: 3); cualquier combinación de dos de estos estados alélicos, o que comprenda los tres. Ciertas realizaciones incluyen la identificación de una planta de sandía que: es una planta diploide que tiene un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SeQ ID NO: 10) y un alelo del estado alélico T del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO: 10); es una planta diploide que tiene un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO: 5) y un alelo del estado alélico A del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO: 5); o es una planta diploide que tiene un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y un alelo del estado alélico A del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO: 3); cualquier combinación de dos de estos estados alélicos, o que comprenda los tres. Un experto en la materia también reconocerá que puede ser útil identificar en un locus genético un marcador de ácido nucleico polimórfico que no esté asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme en una planta, como cuando se introgresa un QTL asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme en un fondo genético no asociado con dicho fenotipo.
En ciertas realizaciones, se identifica una planta en la que se detectan al menos dos alelos asociados con un fenotipo de carne de sandía ultra firme en un locus. Por ejemplo, una planta diploide en la que ambos estados alélicos en un locus polimórfico se asocian con un fenotipo de carne de sandía ultra firme (es decir, homocigoto en ese locus). Por ejemplo, una planta de sandía triploide o tetraploide en la que el estado alélico comprende al menos dos alelos en un locus que están asociados con un fenotipo de carne de sandía ultra firme, en el que otros alelos en el locus pueden o no ser también un alelo asociado con un fenotipo de carne de sandía ultra firme. Ciertos ejemplos ejemplares no limitantes incluyen la identificación de: una planta de sandía diploide que tiene el estado alélico CC del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO: 5); una planta de sandía diploide que tiene el estado alélico CC del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO: 5); o una planta de sandía diploide que tiene el estado alélico GG del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO: 3); cualquier combinación de dos de estos estados alélicos, o la planta comprende los tres.
Los marcadores y estados alélicos anteriores son ejemplares. A partir de la Tabla 3, un experto en la materia reconocería cómo identificar plantas de sandía con otros marcadores de ácido nucleico polimórficos y estados alélicos de los mismos relacionados con la firmeza de la sandía, de acuerdo con la presente invención. Un experto en la materia también sabría cómo identificar el estado alélico de otros marcadores polimórficos de ácido nucleico situados en la(s) región(es) genómica(s) o vinculados al QTL u otros marcadores identificados en el presente documento, para determinar su asociación con la firmeza de la sandía.
Tabla 3. Posiciones genéticas* y estados alélicos alternativos de los marcadores polimórficos de ácido nucleico de la invención que indican el estado alélico asociado con el QTL de carne de sandía ultrafirme.
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Al igual que los seres humanos, las sandías son diploides naturales, con sus cromosomas dispuestos en pares. Sin embargo, las plantas de sandía pueden sufrir una duplicación de todo su conjunto de cromosomas y existir como tetraploides. Aunque no es habitual que las sandías produzcan tetraploides espontáneos, este proceso puede producirse de forma rutinaria en el laboratorio mediante técnicas de biología celular. Las semillas triploides pueden producirse cruzando un progenitor tetraploide por otro diploide. Cuando se cultivan plantas triploides, la formación de semillas en el fruto se aborta debido a las diferencias en el nivel de ploidía, lo que da lugar a frutos sin semillas. En ciertas realizaciones de procedimientos que no forman parte de la invención, una planta diploide parental masculina es homocigota para el QTL o un alelo marcador de ácido nucleico polimórfico asociado con el fenotipo de carne firme de sandía. El padre macho diploide masculino se cruza con una hembra tetraploide que carece del QTL o de un alelo marcador de ácido nucleico polimórfico asociado al fenotipo de carne firme de sandía, para producir una progenie híbrida triploide. Esto resulta en una copia del QTL o alelo marcador polimórfico asociado con el fenotipo de carne firme de sandía (del padre diploide) y dos alelos no QTL/marcadores (del padre tetraploide) en el híbrido triploide.
Ciertas realizaciones que no forman parte de la invención contemplan el uso de la dihaploidización para producir una línea endogámica. Una planta haploide sólo tiene una copia de cada cromosoma en lugar del par normal de cromosomas de una planta diploide. Las plantas haploides pueden producirse, por ejemplo, tratando con un inductor haploide. Las plantas haploides pueden ser sometidas a un tratamiento que hace que el conjunto de cromosomas de una sola copia se duplique, produciendo una copia duplicada del conjunto original. La planta resultante se denomina "doble haploide" y contiene pares de cromosomas que generalmente se encuentran en un estado alélico homocigótico en cualquier locus. La dihaploidización puede reducir el tiempo necesario para desarrollar nuevas líneas endógamas en comparación con el desarrollo de líneas mediante rondas sucesivas de retrocruzamiento. Como se utiliza en la presente memoria, en una planta diploide, un estado alélico homocigótico se representa como AA, CC, GG o TT, donde la posición polimórfica designada del alelo comprende bases nucleotídicas alternas. Como se utiliza en la presente memoria, en una planta diploide, un estado alélico homocigótico se representa como DD, donde la posición polimórfica designada del alelo comprende una deleción de una o más bases en comparación con un alelo alternativo.
Un experto en la materia entenderá que los ácidos nucleicos polimórficos adicionales que se encuentran en las regiones genómicas identificadas pueden utilizarse en ciertas realizaciones de los procedimientos que no forman parte de la invención. Dadas las disposiciones de una región genómica, QTL y marcadores polimórficos identificados en el presente documento, se pueden obtener marcadores adicionales ubicados dentro o cerca de esta región genómica que estén asociados con el fenotipo mediante la tipificación de nuevos marcadores en varios germoplasmas. La región genómica, los QTL y los marcadores polimórficos identificados en el presente documento también se pueden cartografiar en relación con cualquier mapa físico o genético disponible públicamente para situar la región descrita en el presente documento en dicho mapa. Un experto en la materia también entendería que también pueden utilizarse ácidos nucleicos polimórficos adicionales que estén genéticamente vinculados al QTL asociado con un fenotipo de carne de sandía firme y que se cartografien dentro de 40 cM, 20 cM, 10 cM, 5 cM o 1 cM del QTL asociado con un fenotipo de carne de sandía firme.
IV. Introgresión de un locus genómico asociado a un fenotipo de carne firme
Se proporcionan en la presente memoria germoplasmas únicos de sandía o plantas de sandía que comprenden una región genómica introgresada que está asociada con un fenotipo de carne firme de sandía y un procedimiento para obtenerla. La introgresión asistida por marcadores implica la transferencia de una región cromosómica, definida por uno o más marcadores, de un germoplasma a un segundo germoplasma. La descendencia de un cruce que contenga la región genómica introgresada puede identificarse mediante la combinación de marcadores característicos de la región genómica introgresada deseada de un primer germoplasma (por ejemplo, un germoplasma de fenotipo de pulpa de sandía firme) y marcadores vinculados y no vinculados característicos del fondo genético deseado de un segundo germoplasma. Los marcadores de flanqueo que identifican una región genómica asociada a un fenotipo de carne firme de sandía son los loci NW0251464 (SeQ ID NO: 1) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18), y los que identifican sub-regiones de la misma incluyen, pero no se limitan a:
a) loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12);
b) loci NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10);
c) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18);
d) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12);
e) loci NW0248953 (SEQ ID NO: 2) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10);
f) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18);
g) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0251011 (SEQ ID NO: 12); y
h) loci NW0250301 (SEQ ID NO: 3) y NW0252274 (SEQ ID NO: 10)..
Los marcadores de flanqueo que caen tanto en el extremo proximal del telómero como en el extremo proximal del centrómero (como los proporcionados en el presente documento) de cualquiera de estos intervalos genómicos pueden ser útiles en una variedad de esfuerzos de mejora que incluyen, pero no se limitan a, la introgresión de regiones genómicas asociadas con un fenotipo de carne ultra firme de sandía en un fondo genético que comprende marcadores asociados con germoplasma que normalmente contiene un genotipo asociado con un fenotipo de carne no firme. Se proporcionan marcadores que están vinculados y son inmediatamente adyacentes o adyacentes al QTL identificado del fenotipo de la pulpa de la sandía ultra firme que permite la introgresión del QTL en ausencia de ADN vinculado extraño del germoplasma de origen que contiene el QTL. Los expertos en la materia apreciarán que cuando se busque introgresar una región genómica más pequeña que comprenda un QTL asociado con un fenotipo de carne de sandía ultrafirme descrito en el presente documento, cualquiera de los marcadores proximales del telómero o proximales del centrómero que sean inmediatamente adyacentes a una región genómica más grande que comprenda el QTL puede utilizarse para introgresar esa región genómica más pequeña.
Se proporcionan así plantas o germoplasma de sandía que comprenden una región introgresada que está asociada con un fenotipo de pulpa ultra firme de sandía en la que al menos el 10%, 25%, 50%, 75%, 90% o 99% de las secuencias genómicas restantes llevan marcadores característicos de la planta o el germoplasma que de otro modo u ordinariamente comprenden una región genómica asociada con un fenotipo de pulpa no ultra firme. Además, se proporcionan plantas de sandía que comprenden una región introgresada en la que se encuentran regiones estrechamente vinculadas adyacentes y/o inmediatamente adyacentes a las regiones genómicas, QTL y marcadores proporcionados en el presente documento que comprenden secuencias genómicas que llevan marcadores característicos de las plantas de sandía o del germoplasma que de otro modo u ordinariamente comprenden una región genómica asociada al fenotipo.
V. Técnicas de reproducción asistida por procedimientos moleculares
Los marcadores genéticos que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), repeticiones de secuencia simple (SSR), Polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), polimorfismos de inserción/deleción (Indels), repeticiones en tándem de número variable (VNTR), y ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), y otros conocidos por los expertos en la materia. El descubrimiento y desarrollo de marcadores en los cultivos proporciona el marco inicial para las aplicaciones de las actividades de mejora asistida por marcadores (Publicación de Patente US n° 2005/0204780, 2005/0216545, 2005/0218305 y 2006/00504538). El "mapa genético" resultante es la representación de la posición relativa de los loci caracterizados (marcadores de ácido nucleico polimórficos o cualquier otro locus para el que puedan identificarse alelos) entre sí.
Como conjunto, los marcadores polimórficos sirven como herramienta útil para la toma de huellas dactilares de las plantas para informar del grado de identidad de las líneas o variedades (Patente US n° 6.207.367). Estos marcadores constituyen la base para determinar las asociaciones con los fenotipos y pueden utilizarse para impulsar la ganancia genética. En ciertas realizaciones de los procedimientos de la invención, los ácidos nucleicos polimórficos pueden utilizarse para detectar en una planta de sandía un genotipo asociado con un fenotipo de carne de sandía firme, identificar una planta de sandía con un genotipo asociado con un fenotipo de carne de sandía firme, y seleccionar una planta de sandía con un genotipo asociado con un fenotipo de carne de sandía firme. En ciertas realizaciones de procedimientos que no forman parte de la invención, los ácidos nucleicos polimórficos pueden utilizarse para producir una planta de sandía que comprenda en su genoma un locus introgresado asociado a un fenotipo de carne firme de sandía. En ciertas realizaciones que no forman parte de la invención, los ácidos nucleicos polimórficos pueden utilizarse para criar plantas de sandía de progenie que comprendan un locus asociado con un fenotipo de carne firme de sandía.
Algunos marcadores genéticos útiles en la presente invención incluyen marcadores "dominantes" o "codominantes". los marcadores "codominantes" revelan la presencia de dos o más alelos (dos por individuo diploide). los marcadores "dominantes" revelan la presencia de un solo alelo. La presencia del fenotipo del marcador dominante (por ejemplo, una banda de ADN) es una indicación de que un alelo está presente en la condición homocigota o heterocigota. La ausencia del fenotipo del marcador dominante (por ejemplo, la ausencia de una banda de ADN) es simplemente una prueba de que está presente "algún otro" alelo indefinido. En el caso de poblaciones en las que los individuos son predominantemente homocigóticos y los loci son predominantemente dimórficos, los marcadores dominantes y codominantes pueden ser igualmente valiosos. A medida que las poblaciones se vuelven más heterocigotas y multialélicas, los marcadores codominantes suelen ser más informativos del genotipo que los dominantes.
Los análisis basados en el ácido nucleico para determinar la presencia o la ausencia del polimorfismo genético (es decir, para el genotipado) pueden utilizarse en programas de cultivo para la identificación, la selección, la introgresión y similares. Existe una gran variedad de marcadores genéticos para el análisis de polimorfismos genéticos y son conocidos por los expertos en la materia. El análisis puede utilizarse para seleccionar genes, porciones de genes, QTL, alelos o regiones genómicas que comprenden o están vinculados a un marcador genético que está vinculado o asociado a un fenotipo de pulpa firme de sandía.
Como se utiliza en el presente documento, los procedimientos de análisis de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de detección basados en la PCR (por ejemplo, ensayos TaqMan), procedimientos de microarrays, procedimientos basados en la espectrometría de masas y/o procedimientos de secuenciación de ácidos nucleicos, incluida la secuenciación del genoma completo. En ciertas realizaciones que no forman parte de la invención, la detección de sitios polimórficos en una muestra de ADN, ARN o ADNc puede facilitarse mediante el uso de procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos. Dichos procedimientos aumentan específicamente la concentración de polinucleótidos que abarcan el sitio polimórfico, o incluyen ese sitio y secuencias situadas distal o proximalmente a él. Dichas moléculas amplificadas pueden detectarse fácilmente mediante electroforesis en gel, procedimientos de detección por fluorescencia u otros medios.
Un procedimiento para lograr dicha amplificación emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis et al.
1986 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, Patente europea 50.424, Patente europea 84.796, Patente Europea 258.017, Patente Europea 237.362, Patente Europea 201,l84, Patente US n° 4.683.202, Patente US n° 4.582.788 y Patente US n° 4.683.194), utilizando pares de cebadores capaces de hibridar con las secuencias proximales que definen un polimorfismo en su forma de doble cadena. También pueden utilizarse procedimientos de tipificación del ADN basados en la espectrometría de masas. Tales procedimientos se divulgan en las Patentes US n° 6.613.509 y 6,503,710 y las referencias que se encuentran en las mismas.
Los polimorfismos en las secuencias de ADN pueden detectarse o tipificarse mediante una variedad de procedimientos eficaces bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los divulgados en las Patentes US n° 5.468.613,5,217,863,5,210,015,5,876,930,6,030,787,6,004,744, 6,013,431 5, 595,890, 5,762,876, 5,945,283, 5,468,613, 6,090,558; 5,800, 944, 5,616, 464, 7,312, 039, 7,238, 476, 7,297, 485; 7,282, 355, 7,270,981 y 7,250,252. Sin embargo, las composiciones y procedimientos de la presente invención pueden utilizarse junto con cualquier procedimiento de tipificación de polimorfismos para tipificar polimorfismos en muestras de ADN genómico. Estas muestras de ADN genómico utilizadas incluyen, entre otras, el ADN genómico aislado directamente de una planta, el ADN genómico clonado o el ADN genómico amplificado.
Por ejemplo, los polimorfismos en las secuencias de ADN pueden detectarse mediante la hibridación con sondas de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO), como se describe en las Patentes US n° 5.468.613 y 5,217,863. La Patente US n° 5.468.613 divulga hibridaciones de oligonucleótidos específicas para cada alelo en las que se pueden detectar variaciones de uno o varios nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos mediante un proceso en el que la secuencia que contiene la variación de nucleótidos se amplifica, se mancha en una membrana y se trata con una sonda de oligonucleótidos específica de la secuencia etiquetada.
La secuencia de ácido nucleico objetivo también puede ser detectada por procedimientos de ligadura de sonda como se divulga en la Patente US n° 5.800.944, en la que la secuencia de interés se amplifica y se hibrida con sondas, seguido de la ligadura para detectar una parte etiquetada de la sonda.
Los microarrays también pueden utilizarse para la detección de polimorfismos, en los que los conjuntos de sondas de oligonucleótidos se ensamblan de forma superpuesta para representar una única secuencia, de forma que una diferencia en la secuencia objetivo en un punto daría lugar a una hibridación parcial de las sondas (Borevitz et al., Genome Res. 13:513-523 (2003) Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). En cualquier microarray, se espera que haya una pluralidad de secuencias objetivo, que pueden representar genes y/o regiones no codificantes en las que cada secuencia objetivo está representada por una serie de oligonucleótidos superpuestos, en lugar de por una única sonda. Esta plataforma permite el cribado de alto rendimiento de una pluralidad de polimorfismos. La tipificación de secuencias objetivo mediante procedimientos basados en microarrays se divulga en las Patentes US n° 6.799.122, 6, 913,879 y 6,996,476.
La secuencia de ácido nucleico objetivo también puede ser detectada por procedimientos de enlace de sonda como se divulga en la Patente US n° 5.616.464 que emplean al menos un par de sondas que tienen secuencias homólogas a porciones adyacentes de la secuencia de ácido nucleico diana y que tienen cadenas laterales que se unen de forma no covalente para formar un tallo tras el emparejamiento de bases de las sondas con la secuencia de ácido nucleico diana. Al menos una de las cadenas laterales tiene un grupo fotoactivable que puede formar un enlace cruzado covalente con el otro miembro de la cadena lateral del tallo.
Otros procedimientos para detectar SNPs e Indels incluyen procedimientos de extensión de base única (SBE). Los ejemplos de procedimientos SBE incluyen, pero no se limitan, a los divulgados en las Patentes US n° 6.004.744, 6,013,431, 5,595,890, 5,762,876 y 5,945,283. Los procedimientos SBE se basan en la extensión de un cebador de nucleótidos adyacente a un polimorfismo para incorporar un residuo de nucleótido detectable tras la extensión del cebador. En ciertas realizaciones, el procedimiento SBE utiliza tres oligonucleótidos sintéticos. Dos de los oligonucleótidos sirven como cebadores de la PCR y son complementarios a la secuencia del locus de ADN genómico que flanquea una región que contiene el polimorfismo que se quiere ensayar. Tras la amplificación de la región del genoma que contiene el polimorfismo, el producto de la PCR se mezcla con el tercer oligonucleótido (llamado cebador de extensión) que está diseñado para hibridarse con el ADN amplificado adyacente al polimorfismo en presencia de la ADN polimerasa y de dos dideoxinucleosidetrifosfatos marcados diferencialmente. Si el polimorfismo está presente en la plantilla, uno de los dideoxinucleosidetrifosfatos marcados puede añadirse al cebador en una extensión de cadena de una sola base. El alelo presente se infiere entonces determinando cuál de las dos etiquetas diferenciales se añadió al cebador de extensión. Las muestras homocigotas harán que sólo se incorpore una de las dos bases marcadas y, por tanto, sólo se detectará una de las dos etiquetas. Las muestras heterocigotas tienen ambos alelos presentes y, por lo tanto, incorporarán directamente ambas etiquetas (en diferentes moléculas del cebador de extensión) y, por lo tanto, se detectarán ambas etiquetas.
En otro procedimiento para detectar polimorfismos, los SNP e Indels pueden ser detectados por procedimientos divulgados en las Patentes US n° 5,210,015, 5,876,930 y 6,030,787 en las que una sonda de oligonucleótidos que tiene un colorante reportero fluorescente en 5' y un colorante quencher en 3' unidos covalentemente a los extremos 5' y 3' de la sonda. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante reportero al colorante quencher provoca la supresión de la fluorescencia del colorante reportero, por ejemplo, por transferencia de energía de tipo Forster. Durante la PCR, los cebadores directo e inverso se hibridan con una secuencia específica del ADN diana que flanquea un polimorfismo, mientras que la sonda de hibridación se hibrida con la secuencia que contiene el polimorfismo dentro del producto amplificado de la PCR. En el siguiente ciclo de PCR, la ADN polimerasa con actividad exonucleasa 5' ^ 3' escinde la sonda y separa el colorante reportero del colorante quencher, lo que provoca un aumento de la fluorescencia del reportero.
En otra realización, el locus o los loci de interés pueden secuenciarse directamente utilizando tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos. Los procedimientos para la secuenciación de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica e incluyen tecnologías proporcionadas por 454 Life Sciences (Branford, CT), Agencourt Bioscience (Beverly, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), LI-COR Biosciences (Lincoln, NE), NimbleGen Systems (Madison, WI), Illumina (San Diego, CA) y VisiGen Biotechnologies (Houston, TX). Dichas tecnologías de secuenciación de ácidos nucleicos comprenden formatos como las matrices de cuentas paralelas, la secuenciación por ligadura, la electroforesis capilar, los microchips electrónicos, los "biochips", los microarrays, los microchips paralelos y las matrices de una sola molécula, como revisa R.F. Service Science 2006311:1544-1546.
Los marcadores a utilizar en los procedimientos de la presente invención deben ser preferentemente de diagnóstico de origen para poder hacer inferencias sobre las poblaciones posteriores. La experiencia adquirida hasta la fecha sugiere que los marcadores SNP pueden ser ideales para la cartografía, ya que la probabilidad de que un alelo SNP concreto derive de orígenes independientes en las poblaciones existentes de una especie concreta es muy baja. Así, los marcadores SNP parecen ser útiles para rastrear y ayudar a la introgresión de los QTL.
Ejemplos
Las siguientes realizaciones divulgadas son meramente representativas de la invención, que puede ser plasmada en diversas formas. Por lo tanto, los detalles estructurales, funcionales y de procedimiento específicos divulgados en los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1: Sandía de carne firme
Se han identificado accesiones de sandía de carne firme en diferentes especies y variedades del género Citrullus, incluyendo C. colocynthis, C. lanatus var. citroides y C. lanatus var. lanatus. PI296341 es una accesión de C. lanatus var. citroides originaria de África disponible a través de la Red de Información de Recursos de Germoplasma. PI296341 se retrocruzó durante varias generaciones con todas las líneas endógamas de élite de tipo dulce (C. lanatus var. lanatus) para obtener la línea de sandía de carne ultra firme 03LB3387-1.
Se desarrolló una población segregante a partir del cruce de 03LB3387-1 y WAS-35-2438 por descendencia de una sola semilla para cartografiar el rasgo de carne ultra-firme. La población 03LB3387-1 x WAS-35-2438 constaba de 186 líneas F4:5 y se plantó en tres ambientes: Woodland, CA y Tifton, GA Año de prueba 1, y Woodland, CA en el año de prueba 3. Los dos experimentos en Woodland, CA, se plantaron en diseños de bloques completos al azar, mientras que el ensayo del año de prueba 1 en Tifton fue un diseño completo al azar. Las líneas parentales 03LB3387-1 y WAS-35-2438 y su híbrido F1 se utilizaron como controles en cada uno de los tres ensayos. Se recogieron datos sobre la firmeza, los sólidos solubles totales (Brix) y el licopeno en los ensayos del año 1 de Woodland y Tifton. Los datos de firmeza y Brix se recogieron en el bosque en el año de prueba 3. Los datos de firmeza se recogieron como tres lecturas del penetrómetro por fruto. El objetivo era situar las lecturas longitudinalmente en los tercios proximal, medio y distal de cada fruta, y transversalmente a medio camino entre la corteza y el centro. Los valores Brix se midieron con un refractómetro manual (Atago, modelo PAL-1) utilizando zumo extraído con un exprimidor de cítricos de muestras de fruta (~11,5 cm3) con color rojo maduro. El contenido de licopeno se cuantificó por HPLC utilizando un conjunto de 4 a 5 muestras de núcleo (~21 cm3 cada una) tomadas de múltiples posiciones de la pulpa de la fruta con color rojo maduro. Los datos se obtuvieron en el año de prueba 1 utilizando un penetrómetro con una lectura máxima de 53,3 N; por lo tanto, es posible que para los ensayos del año de prueba 1, un valor reportado de 53,3 pueda en realidad representar un valor mayor a 53,3 N. Durante el ensayo del año 3, los datos se obtuvieron con un instrumento que tenía un rango de lecturas de 4,4 a 133,4 N. Por lo tanto, los datos de cada uno de los tres ensayos se analizaron por separado en lugar de derivar las medias fenotípicas y realizar el análisis de la cartografía de QTL en los tres ambientes.
Se generaron medias de mínimos cuadrados para la firmeza, los grados Brix y el contenido de licopeno para cada familia en cada uno de los tres ambientes. Los fenotipos de firmeza mostraron una distribución bimodal, lo que implica que un único QTL principal segrega la firmeza en la población de la cartografía (FIGURA 1). Las líneas parentales 03LB3387-1 y WAS-35-2438 y su híbrido F1 mostraron fenotipos consistentes en todas las localidades y años (Tabla 4).
Tabla 4. Medias fenotípicas de firmeza, Brix y contenido de licopeno de las líneas parentales (03LB3387-1 y WAS-35-2438) y su híbrido F1 para cada uno de los tres ensayos.
Figure imgf000016_0002
Ciento ochenta y seis líneas 03LB3387-1 x WAS-35-2438 fueron genotipadas en la generación F4 utilizando 1.536 marcadores SNP. Se construyó un mapa de ligamiento de la población segregante utilizando 404 marcadores polimórficos con el software JoinMap. El mapa genético constaba de 19 grupos de enlace cuya longitud oscilaba entre 4,5 y 142,1 cM, y tenía una longitud media de 64,1 cM. La distancia media entre marcadores SNP adyacentes en los 19 grupos de ligamiento fue de 3,9 cM.
El análisis de la cartografía de QTL utilizando la cartografía de intervalo compuesto en QTL Cartographer identificó un locus principal que controla la firmeza en el extremo proximal del grupo de acoplamiento 9 ([FIGURA 2). Los QTL para el contenido de Brix y licopeno también fueron cartografiados en el mismo intervalo genómico y tuvieron efectos QTL de moderados a bajos (Tabla 5).
Tabla 5. Identificadores de QTL para firmeza, Brix y contenido de licopeno en el grupo de enlace 9 del mapa genético de la población derivada 03LB3378-1 x WAS-35-2438. Se informa de la posición del QTL en el grupo de ligamiento (cM), de los efectos aditivos y de dominancia del QTL y de los intervalos de confianza 2-LOD. (Woodland, CA Año de prueba 1 (Wdl1); Tifton, GA Año de prueba 1 (Tft1); Woodland, CA Año de prueba 3 (Wdl3)).
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0002
Los QTL fueron consistentes en los tres ambientes ensayados y sus intervalos 2-LOD se superpusieron (FIGURA 2; Tabla 5). Los resultados también se confirmaron con escaneos genómicos de uno y dos QTL en Rqtl (FIGURA 3) (El análisis presentado en la FIGURA 3B utiliza datos fenotípicos del ensayo Woodland Test Año 1. También se realizó un análisis y se obtuvieron resultados similares utilizando los datos fenotípicos de los ensayos de Tifton Año 1 y Woodland Año 3). El QTL para la firmeza de la carne se localizó en la región genómica flanqueada por NW0251464 (SEQ ID NO: 1) y NW0250266 (SEQ ID NO: 18), y el pico del QTL estaba muy cerca de NW0251011 (SEQ ID NO: 12), NW0249132 (SEQ ID NO: 7), NW0248163 (SEQ ID NO: 9), y NW0250266 (SEQ ID NO: 18). El grupo de enlace 9 del mapa genético de la población 03LB3378-1 x WAS-35-2438 se alineó posteriormente con el grupo de enlace 2 de un mapa de SNP de sandía de consenso construido con tres poblaciones segregantes adicionales (Tabla 3). Se identificaron marcadores adicionales dentro del intervalo QTL, incluyendo: NW0248953 (SEQ ID NO:2); NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248949 (SEQ ID NO: 4), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), NW0249077 (SEQ ID NO: 6), NW0252494 (SEQ ID NO: 8), NW0252274 (SEQ ID NO: 10]), NW0248905 (SEQ ID NO: 11), NW0248869 (SEQ ID NO: 13), NW0251470 (SEQ ID NO: 14), NW0251308 (SEQ ID NO: 15), NW0250718 (SEQ ID NO: 16), y NW0248059 (SEQ ID NO: 17). Los marcadores NW0252274 (SEQ ID NO: 10), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), y NW0250301 (SEQ ID NO: 3) predijeron con precisión el fenotipo de carne firme en diversos germoplasmas de sandía.
Tabla 6. Secuencias de ciertos marcadores polimórficos de ácido nucleico en la proximidad de un locus QTL asociado a un fenotipo de carne ultrafirme.
Figure imgf000017_0001

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de identificación de una planta de sandía, el procedimiento comprende:
(i) proporcionar una población de plantas de sandía;
(ii) genotipar al menos una planta de sandía de la población con respecto a al menos un ácido nucleico polimórfico situado en una región genómica flanqueada por los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0250266 (SEQ ID NO:18), y
(iii) seleccionar de la población al menos una planta de sandía que comprenda al menos un alelo asociado a un fenotipo de carne de sandía ultra firme.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico está localizado en una posición genómica flanqueada por:
a) los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0251011 (SEQ ID NO:12);
b) los loci NW0251464 (SEQ ID NO:1) y NW0252274 (SEQ ID NO:10);
c) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW0250266 (SEQ ID NO:18);
d) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW025101 1 (SEQ ID NO:12);
e) los loci NW0248953 (SEQ ID NO:2) y NW0252274 (SEQ ID NO:10);
f) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0250266 (SEQ ID NO:18);
g) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0251011 (SEQ ID NO:12); o
h) los loci NW0250301 (SEQ ID NO:3) y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico se selecciona del grupo que consiste en NW0248953 (SEQ ID NO: 2), NW0250301 (SEQ ID NO: 3), NW0248949 (SEQ ID NO: 4), NW0248646 (SEQ ID NO: 5), NW0249077 (SEQ ID NO: 6), NW0249132 (SEQ ID NO: 7), NW0252494 (SEQ ID NO: 8), NW0248163 (SEQ ID NO: 9), NW0252274 (SEQ ID NO: 10), NW0248905 (SEQ ID NO: 11), NW0251011 (SEQ ID NO: 12), NW0248869 (SEQ ID NO: 13), NW0251470 (SEQ ID NO: 14), NW0251308 (SEQ ID NO: 15), NW0250718 (SEQ ID NO: 16), y NW0248059 (SEQ ID NO:17).
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha detección comprende detectar al menos dos ácidos nucleicos polimórficos que están asociados con un fenotipo de carne de sandía ultra firme seleccionado del grupo que consiste en NW0248953 (SEQ ID NO:2), NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248949(SEQ ID NO:4), NW0248646 (SEQ ID NO:5), NW0249077 (SEQ ID NO:6), NW0249132 (SEQ ID NO:7), NW0252494(SEQ ID NO:8), NW0248163 (SEQ ID NO:9), NW0252274 (SEQ ID NO:10), NW0248905 (SEQ ID NO:11),NW0251011 (SEQ ID NO:12), NW0248869 (SEQ ID NO:13), NW0251470 (SEQ ID NO:14), NW0251308 (SEQ IDNO:15), NW0250718 (SEQ ID NO:16), y NW0248059 (SEQ ID NO:17).
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) se selecciona del grupo que consiste en NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5) y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) comprende al menos dos ácidos nucleicos polimórficos seleccionados del grupo que consiste en NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5), y NW0252274 (SEQ ID NO:10).
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho al menos un ácido nucleico polimórfico genotipado en la etapa (ii) comprende NW0250301 (SEQ ID NO:3), NW0248646 (SEQ ID NO:5), y NW0252274 (SEQ ID NO:10) son genotipados.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el genotipo asociado con un genotipo de carne de sandía ultra firme comprende tener al menos uno de los siguientes: un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO:10); un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO:5); o un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO:3).
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que una fruta obtenida de dicha planta de sandía seleccionada tiene una pulpa que resiste una presión de al menos 15,568 Newtons cuando dicha pulpa se mide desde el centro de una fruta cortada con un penetrómetro que tiene una sonda de 8 milímetros de diámetro y se expresa como una media de tres a cinco mediciones.
10. El procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en el que la pulpa cortada obtenida de un fruto de dicha planta de sandía seleccionada pierde menos del cuatro por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados.
11. El procedimiento de una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, en el que la pulpa cortada obtenida de un fruto de dicha planta de sandía seleccionada pierde menos del tres por ciento de agua después de tres días de almacenamiento a 4° centígrados.
12. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la planta tiene un genotipo asociado con un genotipo de carne de sandía ultra firme que comprende al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0252274 (SEQ ID NO:10); al menos un alelo del estado alélico C del ácido nucleico polimórfico de NW0248646 (SEQ ID NO:5); y al menos un alelo del estado alélico G del ácido nucleico polimórfico de NW0250301 (SEQ ID NO:3).
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