BRPI0708486A2 - Métodos não destrutivo de alto rendimento par analisar sementes individuais em uma população de sementes, de alto rendimento par a análise de uma população de sementes haplóide, e de alto rendimento para agrupar uma população de sementes duplo haplóides - Google Patents

Abstract

MéTODOS NãO DESTRUTIVO DE ALTO RENDIMENTO PARA ANALISAR SEMENTES INDIVIDUAIS EM UMA POPULAçãO DE SEMENTES, DE ALTO RENDIMENTO PARA A ANáLISE DE UMA POPULAçãO DE SEMENTES HAPLóIDE, E DE ALTO RENDIMENTO PARA AGRUPAR UMA POPULAçãO DE SEMENTES DUPLO HAPLõIDES A presente invenção refere-se a novos processos para facilitar as atividades de melhoria de germopíasma através do uso de amostragem de sementes não-destrutiva de alta circulação. Em uma modalidade, um processo não-destrutivo de alta circulação para a análise de sementes individuais em uma população de sementes compreende a remoção de uma amos- tra de um grande número de sementes na população enquanto a viabilidade de germinação da semente é preservada e a análise da amostra em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características de pelo menos uma característica genética ou química.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCES-SOS DE CULTIVO DE SEMENTES UTILIZANDO AMOSTRAGEM DE SE-MENTES NÃO-DESTRUTIVA DE ALTA CIRCULAÇÃO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de cultivo de plantas.

Mais especificamente, esta invenção fornece métodos para aumentar e eco-nomizar atividades de melhoria de germoplasma utilizando técnicas de a-mostragem de sementes de alta circulação e não-destrutivas.

Antecedentes da Invenção

As afirmações nesta seção fornecem meramente informação

antecedente relacionada com a presente descrição e podem não constituir atécnica anterior.

No desenvolvimento e na melhoria de plantas, são feitas melho-rias genéticas na planta, através do cruzamento seletivo ou da manipulaçãogenética e quando uma melhoria desejável é atingida, uma quantidade co-mercial é desenvolvida através do plantio e da colheita de sementes ao lon-go de várias gerações. Para acelerar o processo de melhoria de plantas,amostras estatísticas são coletadas e testadas para melhorar sementes dapopulação que herdou ou que exibe a característica desejada. Entretanto,esta amostragem estatística permite necessariamente que algumas semen-tes sem a característica desejada permaneçam na população e ainda podeexcluir inadvertidamente algumas sementes com a característica desejávelda população desejada. Nem todas as sementes herdam ou exibem as ca-racterísticas desejadas e assim estas sementes ainda precisam ser separa-das da população.

Foram descritos os aparelhos e os métodos para a amostragemde sementes não-destrutiva de alta circulação que superariam os obstáculosde amostras estatísticas permitindo a análise de sementes individuais. Porexemplo, o Pedido de Patente U.S. N2 de Série 11/213.430 (depositado em26 de agosto de 2005); o Pedido de Patente U.S. N- de Série 11/213.431(depositado em 26 de agosto de 2005); o Pedido de Patente U.S. N- de Sé-rie 11/213.432 (depositado em 26 de agosto de 2005); o Pedido de PatenteU.S. N2 de Série 11/213.434 (depositado em 26 de agosto de 2005); e o Pe-dido de Patente U.S. N- de Série 11/213.435 (depositado em 26 de agostode 2005), que são incorporados aqui como referência em sua totalidade,descrevem aparelhos e sistemas para a amostragem automatizada de se-mentes assim como métodos de amostragem, testagem e agrupamento desementes.

A presente invenção dedica-se às necessidades na técnica paramétodos de cruzamento melhorados utilizando sistemas de amostragem desementes não-destrutivos de alta circulação.

Sumário da Invenção

A presente descrição refere-se a sistemas e métodos para facili-tar atividades de melhoria de germoplasmas através do uso de amostragemde sementes não-destrutiva de alta circulação. Com a amostragem não-destrutiva automatizada, é possível testar sementes individuais em uma po-pulação e selecionar apenas as sementes que possuem uma ou mais carac-terísticas desejadas. Isto permite métodos novos e mais eficientes para amelhoria e manejo de germoplasmas, que levam a populações com cultivomelhorado.

Em uma modalidade, a presente descrição fornece um métodonão-destrutivo de alta circulação para a análise de sementes individuais emuma população de sementes. O método compreende a remoção de umaamostra de um grande número de sementes na população enquanto preser-va a viabilidade de germinação da semente e a análise da amostra em rela-ção à presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico genético ou químico.

Em uma modalidade adicional, a presente descrição fornece ummétodo de alta circulação para a análise de uma população de sementeshaplóides. O método compreende a remoção de uma amostra de um grandenúmero de sementes em uma população de sementes haplóides enquantopreserva a viabilidade de germinação da semente e a análise das amostrasem relação à presença ou à ausência de uma ou mais características indica-tivas de pelo menos um traço característico genético ou químico.Ainda em uma modalidade adicional, a presente descrição for-nece um método de alta circulação para o agrupamento de uma populaçãode sementes duplo haplóides. O método compreende o fornecimento deuma população de sementes que compreende sementes haplóides e a sele-ção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelo menos uma ca-racterística preferida da população de sementes. As sementes duplo haplói-des são então produzidas partindo das sementes selecionadas e uma amos-tra é removida de cada semente duplo haplóide enquanto preserva a viabili-dade de germinação das sementes. As amostras são analisadas em relaçãoà presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de peloI menos um traço característico genético ou químico. Com base nos resulta-dos da análise, uma ou mais sementes duplo haplóides individuais são sele-cionadas e plantas ou tecido vegetal é cultivado partindo da semente duplohaplóide selecionada.

Nas várias modalidades da presente invenção, as amostras po-dem ser analisadas em relação a uma ou mais características indicativas depelo menos um traço característico químico. Os exemplos de tais caracterís-ticas podem incluir proteínas, óleos, carboidratos, ácidos graxos, aminoáci-dos, biopolímeros, agentes farmacêuticos, amido, amido fermentável, com-postos secundários e metabólitos

Em outras várias modalidades da presente invenção, as amos-tras podem ser analisadas em relação a uma ou mais características indica-tivas de pelo menos um traço característico genético. Os exemplos de taiscaracterísticas podem incluir um marcador genético, um polimorfismo de umúnico nucleotídeo, uma repetição de seqüência simples, um polimorfismo decomprimento de fragmento de restrição, um haplotipo, SNPs marcados, ale-los de um marcador genético, um gene, uma seqüência derivada de DNA,uma seqüência derivada de RNA, um promotor, uma região não-traduzida a5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siR-NA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, dsmRNA, um per-fil de transcrição e um padrão de metilação.

Áreas adicionais de aplicabilidade dos presentes ensinamentosse tornarão evidentes partindo da descrição fornecida aqui. Deve ser enten-dido que a descrição e os exemplos específicos são pretendidos apenascom a finalidade de ilustração e não é pretendido que limitem o âmbito dospresentes ensinamentos.

Breve Descrição das Figuras

As figuras descritas aqui têm apenas finalidade de ilustração enão é pretendido que limitem o âmbito da presente descrição de forma al-guma.

A figurai é um alelograma que representa amostras de tecido deendosperma de milho que sofreram PCR para a detecção de um SNP parti-cular como descrito no Exemplo 3.

A figura2 é uma ilustração gráfica da eficiência da pré-seleçãosobre o controle da freqüência de haplotipos favoráveis como descrito noExemplo 6.

Descrição Detalhada

A descrição a seguir tem natureza meramente de exemplo e nãoé pretendido que limite a presente descrição, a aplicação ou os usos.

A presente invenção fornece novos métodos para facilitar as ati-vidades de melhoria de germoplasma através do uso de amostragem desementes não-destrutiva de alta circulação. Os métodos são úteis na análisede sementes para identificar e selecionar sementes que compreendem umaou mais características, marcadores e genótipos desejados. Em um aspectoda invenção, os métodos analíticos permitem que sementes individuais queestão presentes em uma batelada ou uma população em massa de semen-tes sejam analisadas de forma que as características químicas e/ou genéti-cas das sementes individuais possam ser determinadas.

As amostras preparadas através da presente invenção podemser utilizadas para a determinação de uma ampla variedade de traços carac-terísticos físicos, morfológicos, químicos e/ou genéticos. Geralmente, taistraços característicos são determinados através da análise das amostras emrelação a uma ou mais características indicativas de pelo menos um traçocaracterístico genético ou químico. Os exemplos não-limitantes de caracte-pepino, semente de Pseudotsuga, semente de eucalipto, semente de Pinustaeda, semente de linhaça, semente de melão, semente de aveia, sementede oliva, semente de palma, semente de ervilha, semente de amendoim,semente de pimenta, semente de álamo, semente de Pinus radiata, semente5 de colza, semente de arroz, semente de centeio, semente de sorgo, semen-te de pinheiro do sul, semente de soja, semente de morango, semente debeterraba, semente de cana de açúcar, semente de girassol, semente deLiquidambar, semente de chá, semente de tabaco, semente de tomate, se-mente de turfa, semente de trigo e semente de Arabidopsis thaliana.

22. Método de alto rendimento para a análise de uma populaçãode sementes haplóide, caracterizado pelo fato de que compreende:fornecer uma população de sementes que compreendem se-mentes haplóides;

remover uma amostra de tecido de uma ou mais sementes indi-viduais na população enquanto a viabilidade de germinação da semente épreservada; e

analisar a amostra de tecido em relação à presença ou à ausên-cia de uma ou mais características indicativas de pelo menos uma caracte-rística genética ou química.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda a determinação da característica genotípi-ca da semente selecionada.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda:

selecionar uma ou mais sementes individuais que exibem pelomenos uma característica preferida da população de sementes; e

produzir semente duplo haplóides partindo de uma ou mais se-mentes individuais selecionadas.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pe-lo fato de que pelo menos uma característica preferida é uma característicafenotípica.

26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que a amostra de tecido é analisada em relação a uma ou maiscaracterísticas selecionadas do grupo que consiste em um marcador genéti-co, um polimorfismo de um único nucleotídeo, uma repetição de seqüênciasimples, um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, umhaplotipo, uma marcação SNP, um alelo de um marcador genético, um gene,uma seqüência derivada do DNA1 uma seqüência derivada do RNA, umpromotor, uma região não-traduzida a 5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satéli-te, um transgene, mRNA, dsmRNA, um perfil de transcrição e um padrão demetilação.

27. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes indi-viduais da população com base na presença de uma ou mais característicasassociadas com um ou mais transgenes.

28. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes indi-viduais que exibem uma ou mais características genéticas indesejáveis dapopulação de sementes e o descarte das sementes selecionadas.

29. Método de alto rendimento para agrupar uma população desementes duplo haplóides, caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer uma população de sementes que compreende semen-tes haplóides;

selecionar uma ou mais sementes individuais que exibem pelomenos uma característica preferida partindo da população de sementes;a produção de sementes duplo haplóides partindo das sementes seleciona-das;

remover uma amostra de tecido de cada semente duplo haplóideenquanto a viabilidade de germinação das sementes amostradas é preser-vada;

analisar as amostras de tecido em relação à presença ou à au-sência de uma ou mais características indicativas de pelo menos uma carac-terística genética ou química;que possui uma característica, um marcador ou um genótipo desejado podeser eficientemente agrupada em um período de tempo mais curto, com me-nos recursos do campo e de trabalho necessárias. Tais vantagens serãomais completamente descritas abaixo.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um métodopara analisar sementes individuais dentro de uma população de sementesque possui diferenças genéticas. O método compreende a remoção de umaamostra que compreende células com ácidos nucléicos provenientes de se-mentes na população sem afetar a viabilidade de germinação das sementes;

a análise dos ácidos nucléicos extraídos da amostra em relação à presençaou à ausência de pelo menos um marcador genético; a seleção de sementesda população baseada nos resultados das análises de ácidos nucléicos; e ocultivo de plantas partindo da semente selecionada.

Como descrito anteriormente, os sistemas e os métodos de a-mostragem desta invenção protegem a viabilidade de germinação das se-mentes de forma a serem não-destrutivos. A viabilidade de germinação sig-nifica que um número predominante de sementes que tiveram amostras reti-radas, (isto é, mais de 50% das sementes que tiveram amostras retiradas)permanece viável após a amostragem. Em uma modalidade particular, pelomenos aproximadamente 75% das sementes que tiveram amostras retiradase em algumas modalidades pelo menos aproximadamente 85% das semen-tes que tiveram amostras retiradas permanecem viáveis. Deve ser observa-do que taxas menores de viabilidade de germinação podem ser toleradassob certas circunstâncias ou para certas aplicações, por exemplo, uma vezque os custos de genótipo diminuem com o tempo porque um número maiorde sementes poderia ter amostras retiradas com o mesmo custo de genóti-po. Também deve ser observado que a amostragem não precisa de formaalguma ter qualquer efeito sobre a viabilidade.

Em uma outra modalidade, a viabilidade de germinação é manti-da durante pelo menos aproximadamente seis meses após a amostragempara garantir que a semente que teve amostras retiradas será viável até quechegue ao campo para o plantio. Em uma modalidade particular, os métodosda presente invenção compreendem ainda o tratamento das sementes quetiveram amostras retiradas para manter a viabilidade de germinação. Tal tra-tamento pode incluir geralmente quaisquer meios conhecidos na técnica pa-ra a proteção de uma semente das condições ambientais durante o armaze-namento e o transporte. Por exemplo, em uma modalidade, as sementesque tiveram amostras retiradas podem ser tratadas com um polímero e/ouum fungicida para proteger a semente que teve amostras retiradas durante oarmazenamento ou o transporte para o campo antes do plantio.

Em uma modalidade, as amostras da presente invenção são uti-lizadas em um método não-destrutivo de alta circulação para a análise desementes individuais em uma população de sementes. O método compre-ende a remoção de uma amostra da semente enquanto preserva a viabilida-de de germinação da semente; e a análise da amostra em relação à presen-ça ou à ausência de uma ou mais características indicativas de uma caracte-rística genética ou química. O método pode compreender ainda a seleção desementes da população com base nos resultados das análises; e o cultivode plantas ou de tecido vegetal partindo da semente selecionada.

O DNA pode ser extraído da amostra utilizando quaisquer méto-dos de extração de DNA conhecidos pelos versados na técnica que fornece-rão rendimento de DNA, qualidade de DNA, resposta de PCR e resposta demétodos de seqüenciamento suficientes. Um exemplo não-limitante de mé-todos de extração de DNA é a extração baseada em SDS com centrifuga-ção. Em adição, o DNA extraído pode ser amplificado utilizando qualquermétodo de amplificação conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo,um método de amplificação adequado é a GenomiPhi® DNA amplificationprep da Amersham Biosciences.

Ainda, o RNA pode ser extraído da amostra utilizando quaisquermétodos de extração de RNA conhecidos pelos versados na técnica quefornecerão rendimento de RNA, qualidade de RNA, resposta de PCR e res-posta de métodos de seqüenciamento suficientes. Um exemplo não-limitantede métodos de extração de RNA adequados é a extração baseada em SDScom centrifugação considerado reagentes e suprimentos isentos de RNase.Em adição, o RNA extraído pode ser amplificado após a extração utilizandoqualquer método de amplificação conhecido pelos versados na técnica. Porexemplo, um método de amplificação adequado é o Full Spectrum™ RNAAmplification da System Biosciences.

Os ácidos nucléicos extraídos são analisados em relação à pre-sença ou à ausência de um polimorfismo genético adequado. Uma amplavariedade de marcadores genéticos para a análise de polimorfismos genéti-cos está disponível e é conhecida pelos versados na técnica. Como utilizadoaqui, os marcadores genéticos incluem, mas não estão limitados a repeti-ções de seqüência simples (SSRs), polimorfismos de um único nucleotídeo(SNPs), inserções ou deleções (Indels), polimorfismos de uma única caracte-rística (SFPs, por exemplo, como descrito em Borevitz e outros 2003 Gen.Res. 13:513-523) ou perfis de transcrição e seqüências de ácidos nucléicos.Uma análise de ácido nucléico em relação à presença ou à ausência domarcador genético pode ser utilizada para a seleção de sementes em umapopulação para cruzamento. A análise pode ser utilizada para selecionargenes, QTL, alelos ou regiões genômicas (haplotipos) que compreendem ouestão ligadas a um marcador genético. Aqui, os métodos de análise são co-nhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a métodos de de-tecção baseados na PCR (por exemplo, ensaios de TaqMan), métodos demicroarranjo e métodos de seqüenciamento de ácidos nucléicos. Os genes,os alelos, os QTL ou os haplotipos que serão selecionados podem ser identi-ficados utilizando técnicas mais novas de biologia molecular com modifica-ções de estratégias de cruzamento clássicas.

Qualquer semente pode ser utilizada em um método ou um dis-positivo da presente invenção. Em uma modalidade particular, a semente éselecionada do grupo que consiste em semente de alfafa, semente de maçã,semente de banana, semente de cevada, semente de feijão, semente debrócolis, semente de mamona, semente de fruta cítrica, semente de trevo,semente de coco, semente de café, semente de milho, semente de algodão,semente de pepino, semente de Pseudotsuga, semente de eucalipto, se-mente de Pinus taeda, semente de linhaça, semente de melão, semente deaveia, semente de oliva, semente de palma, semente de ervilha, semente deamendoim, semente de pimenta, semente de álamo, semente de Pinus radi-ata, semente de colza, semente de arroz, semente de centeio, semente desorgo, semente de pinheiro do sul, semente de soja, semente de morango,semente de beterraba, semente de cana de açúcar, semente de girassol,semente de Liquidambar, semente de chá, semente de tabaco, semente detomate, semente de turfa, semente de trigo e semente de Arabidopsis thalia-na. Ainda, em uma modalidade mais particular, a semente é uma sementede milho ou uma semente de soja.

Em uma outra modalidade, as plantas de cultivo analisadas pe-los métodos descritos aqui incluem plantas de cultivo de forragem, plantasde cultivo de semente oleosa, plantas de cultivo de grãos, plantas de cultivode frutos, plantas ornamentais, plantas de cultivo vegetais, plantas de cultivode fibras, plantas de cultivo de tempero, plantas de cultivo de noz, plantas decultivo dê turfà, plantas de cultivo de açúcar, plantas de cuítivo de bebidas,plantas de cultivo de tubérculos, plantas de cultivo de raiz e plantas de culti-vo de floresta.

Em uma modalidade, a semente é selecionada com base napresença ou ausência de uma ou mais características que estão ligadas ge-neticamente a um QTL. Os exemplos de QTLs que são freqüentemente deinteresse incluem, mas não estão limitados a tolerância a herbicida, resis-tência à doenças, resistência a insetos ou a pragas, metabolismo alterado deácidos graxos, proteínas ou carboidratos, maior rendimento de grãos, maiorteor de óleo, maior teor nutricional, maiores taxas de crescimento, maior to-lerância a estresse, maturidade preferida, propriedades organolépticas me-lhoradas, características morfológicas alteradas, outras características agro-nômicas, características para usos industriais ou características para aumen-tar o interesse do consumidor ou uma combinação de características comoum índice de várias características. Alternativamente, a semente pode serselecionada com base na presença ou na ausência de uma ou mais caracte-rísticas que estão geralmente ligadas a um haplotipo associado com um Q-TL. Os exemplos de tal QTL podem novamente incluir, sem limitação, tole-rância a herbicida, resistência a doenças, resistência a insetos ou pragas,metabolismo alterado de ácidos graxos, proteínas ou carboidrato alterado,maior rendimento de grãos, maior teor de óleo, maior teor nutricional, maio-res taxas de crescimento, maior tolerância a estresse, maturidade preferida,propriedades organolépticas melhoradas, características morfológicas alte-radas, outras características agronômicas, características para usos indus-triais ou características para aumentar o interesse do consumidor ou umacombinação de características como um índice de várias características.

A seleção de uma população de cruzamento poderia ser iniciadatão logo quanto o nível de cruzamento F2, se parentais intracruzados homo-zigotos forem utilizados no cruzamento inicial. Uma geração F1 também po-deria ter amostras retiradas e ser levada à etapa seguinte se um ou maisdos parentais do cruzamento forem heterozigotos em relação aos alelos ouaos marcadores de interesse. O agricultor pode analisar uma população F2para recuperar o genótipo marcador de cada indivíduo na população. Ostamanhos iniciais da população, limitados apenas pelo número de sementesdisponíveis para análise, podem ser ajustados para satisfazer a probabilida-de desejada de identificar de forma bem sucedida o número desejado deindivíduos. Vide Sedcole, J.R. "Number of plants necessary to recover atrait". Crop Sei. 17:667-68 (1977). Conseqüentemente, a probabilidade deencontrar o genótipo desejado, o tamanho de população inicial e o tamanhode população resultante alvo pode ser modificada para várias metodologiasde cruzamento e nível de intracruzamentos da população que teve amostrasretiradas.

As sementes selecionadas podem ser agrupadas ou mantidasseparadas dependendo da metodologia de cruzamento e do alvo. Por exem-plo, quando um agricultor está analisando uma população F2 em relação àresistência a doenças, todos os indivíduos com o genótipo desejado podemser agrupados e plantados na sementeira de cultivo. De forma inversa, sevários QTL com efeitos variáveis em relação a uma característica tal como orendimento de grãos estiverem sendo selecionados de uma certa população,o agricultor pode manter a identidade individual preservada, levando para ocapo para diferenciar os indivíduos com várias combinações do QTL alvo.

Vários métodos de preservação da identidade de uma única se-mente podem ser utilizados enquanto a semente é transferida da localizaçãode amostragem para o campo. Os métodos incluem, mas não estão Iimita-dos à transferência de indivíduos selecionados para "seed tape", "cassetetray" ou "indexing tray", transplantando com vasos de turfa e plantando ma-nualmente partindo de embalagens individuais de sementes.

Vários ciclos de seleção podem ser utilizados dependendo dosalvos de cruzamento e da complexidade genética.

As vantagens de utilizar os métodos desta invenção incluem,sem limitação, a redução de trabalho e de recursos do campo requeridos porpopulação ou linhagem de cruzamento, maior capacidade de avaliar um nú-mero maior de populações de cruzamento por unidade de campo e maiorcapacidade de analisar populações de cruzamento em relação a caracterís-ticas desejadas antes do plantio. Os recursos do campo por população sãoreduzidos limitando o espaço no campo requerido para levar adiante os ge-nótipos desejados. Por exemplo, uma população de 1.000 indivíduos podeser plantada a 25 sementes por fileira consumindo um total de 40 fileiras nocampo. Utilizando a amostragem de tecido convencional, todas as 1.000 plantas seriam marcadas e teriam amostras retiradas manualmente atravésda atribuição de escores ao tecido foliar. Os resultados dos marcadores mo-leculares seriam necessários antes da polinização e apenas as plantas con-tendo a composição genética desejada seriam polinizadas. Assim, se fossedeterminado que 50 sementes continham a composição genética desejada,a metodologia de cruzamento convencional teria requerido o plantio de 1000plantas para manter as 50 sementes desejadas. Em contraste, os métodosdesta invenção permitem que o agricultor analise as 1.000 sementes no la-boratório e que selecione as 50 sementes desejadas antes do plantio. Os 50indivíduos podem então ser plantados no campo, consumindo duas fileirasde 25 sementes. Adicionalmente, os métodos desta invenção não requeremmarcação ou amostragem no campo, reduzindo significativamente assim osrecursos de trabalho manual requeridos.Em adição à redução do número de fileiras no campo por popu-lação, os métodos desta invenção podem ainda aumentar o número de po-pulações que o agricultor pode avaliar em uma certa sementeira de cruza-mento. Utilizando o exemplo anterior em que 50 sementes de cada popula-ção de 1000 continham a composição genética desejada, um agricultor apli-cando os métodos desta invenção poderia avaliar 20 populações de 50 se-mentes cada utilizando a mesma área do campo consumida por uma únicapopulação utilizando técnicas de amostragem de tecidos no campo conven-cional. Mesmo se as populações forem selecionadas para um único alelo,utilizando uma proporção de segregação esperada de 1:2:1 para uma popu-lação F2, o agricultor poderia avaliar 4 populações na mesma área do campocomo uma única população com tecido que teve amostras retiradas no campo.

Uma vantagem potencial adicional para os métodos da presenteinvenção é a mitigação de riscos associados com as plantas que crescemem certas geografias em que plantas podem crescer fracamente ou passarpor condições ambientais pobres ou podem ainda ser destruídas durantetempestades. Por exemplo, as sementes com o "melhor" genótipo ou com-posição de marcação poderiam ser plantadas na geografia 1 e as sementescom o genótipo "melhor seguinte" poderiam ser plantadas na geografia 2.Neste caso, a geografia 2 seria uma reserva no caso de qualquer problemaocorrer com as plantas cultivadas na geografia 1. Isto é muito difícil de fazercom o método tradicional de tirar amostras de tecido de plantas germinadaspara genotipagem, porque estas plantas necessitariam então ser arrancadaspela raiz e transplantadas para a segunda geografia. A utilização dos méto-dos desta invenção evita o problema do transplante e ainda simplifica a lo-gística do programa de cultivo.

Os métodos da invenção podem ainda ser utilizados em um pro-grama de cruzamento para a introgressão uma característica em uma planta.Tais métodos compreendem a remoção de uma amostra que compreendecélulas com ácidos nucléicos de sementes em uma população, a análise dosácidos nucléicos extraídos de cada semente em relação à presença ou àausência de pelo menos um marcador genético, a seleção de sementes dapopulação com base nos resultados da análise de ácidos nucléicos; o cultivode uma planta fértil partindo da semente; e a utilização da planta fértil comoum parental do sexo feminino ou um parental do sexo masculino em um cru-zamento com uma outra planta.

Os exemplos de análises genéticas para selecionar sementesem relação à integração de características incluem, sem limitação, a identifi-cação de freqüências alélicas parentais de alta recorrência, o rastreamentode transgenes de interesse ou a verificação em relação à ausência de trans-genes indesejados, a seleção de semente de teste híbrida, a seleção de se-mente expressando um gene de interesse, a seleção de semente expres-sando um fenótipo que pode ser herdado, a identificação de semente comIoci genéticos selecionados e o teste de zigosidade.

A identificação de freqüências alélicas de pares com alta recor-rência através dos métodos da presente invenção novamente permite queum número reduzido de fileiras por população e um maior número de popu-lação ou linhagens intracruzadas, sejam plantados em uma certa unidade docampo. Assim, os métodos da presente invenção podem também reduzireficientemente os recursos requeridos para completar a conversão de Iinha-gens intracruzadas.

Os métodos da presente invenção fornecem ainda garantia dequalidade (QA) e controle de qualidade (QC) assegurando que transgenesregulados ou indesejados, traços característicos genéticos indesejados oufenótipos herdados indesejados sejam identificados e descartados antes doplantio. Este pedido de patente em uma capacidade de QA poderia eliminareficientemente infrações de liberação não intencionais. Uma extensão adi-cional do método é verificar a presença de agentes infecciosos e remover asemente contaminada antes do envio.

Os métodos da presente invenção podem ainda ser aplicadospara identificar semente híbrida para testar um transgene. Por exemplo, emuma conversão de uma linhagem intracruzada no estágio BCnFi, um agricul-tor poderia criar eficientemente um lote de sementes híbridas (excluindo aseleção de gametas) que são 50% hemizogotas em relação à característicade interesse e 50% homozigotas para a ausência da característica com afinalidade de gerar semente híbrida para teste. O agricultor poderia entãoanalisar todas as sementes Fi produzidas no cruzamento de teste e identifi-car e selecionar as sementes que são hemizogotas. Tal método é vantajosopelo fato de que inferências provenientes de testes de híbridos representari-am uma genética híbrida comercial em relação à zigosidade da característica.

Outras aplicações dos métodos desta invenção para a identifica-ção, o rastreamento e o acúmulo de características de interesse carregamas mesmas vantagens identificadas anteriormente em relação aos recursosdo campo e de trabalho requeridos. Geralmente, os programas de conversãotransgênica são executados em localizações em várias estações que carre-gam uma estrutura de custos de terra e de controle muito mais altos. Comotal, o impacto de reduzir as necessidades de fileiras por população ou deaumentar o número de populações dentro de uma certa unidade de campo ésignificativamente mais drástico sobre aplicações com base nos custos ver-sus temperadas.

Os métodos desta invenção podem ser utilizados para sementesde plantas com dois ou mais transgenes, em que o acúmulo ou o agrupa-mento de regiões transgênicas em plantas ou linhagens é conseguido atra-vés da adição de transgenes através da transformação ou do cruzamento deplantas ou linhagens parentais contendo regiões transgênicas diferentes ouqualquer combinação dos mesmos. As análises podem ser realizadas paraselecionar sementes individuais com base na presença de uma ou mais ca-racterísticas associadas com pelo menos um transgene. Tais característicasincluem, mas não estão limitadas a um transgene per se, um marcador ge-nético ligado a um transgene, um mRNA expresso partindo de um transgenee um produto de proteína de um transgene.

Ainda adicionalmente, os métodos desta invenção podem serutilizados para aumentar a eficiência do programa de haploidia duplicadaatravés da seleção de genótipos desejados no estágio haplóide e da identifi-cação do nível de ploidia para eliminar sementes não-haplóides de seremprocessadas e seguirem a diante para o campo. Ambas as aplicações resul-tam novamente na redução de recursos do campo por população e na capa-cidade de avaliar um número maior de populações dentro de uma certa uni-dade do campo.

As plantas duplo haplóides (DH) fornecem uma ferramenta ines-timável para os cultivadores de plantas, particularmente para gerar linhagensretrocruzadas. Uma grande quantidade de tempo é poupada uma vez que aslinhagens homozigotas são essencialmente geradas instantaneamente, anu-lando a necessidade de intracruzamentos convencionais multigerações.

Em particular, devido ao fato de que as plantas DH são inteira-mente homozigotas, são muito susceptíveis a estudos genéticos quantitati-vos. Tanto a variância aditiva quanto as variâncias aditivas χ genéticas aditi-vas podem ser estimadas partindo das populações DH. Outras aplicaçõesincluem a identificação de epistasia e de efeitos de ligação. Para os agricul-tores, as populações DH foram particularmente úteis no mapeamento deQTL, nas conversões citoplasmáticas e na introgressão de características.Além disso, há valor no teste e na avaliação de linhagens homozigotas paraprogramas de cruzamento de plantas. Toda a variância genética fica entre aprogênie em um cruzamento para cultivo, que aumenta o ganho da seleção.

Entretanto, é bem sabido na técnica que o processo de produ-ção de DH é ineficiente e pode ser bastante trabalhoso. Embora plantas du-plo haplóides possam ocorrer espontaneamente na natureza, isto é extre-mamente raro. A maior parte das aplicações de pesquisa e de cruzamentose baseia em métodos artificiais de produção de DH. A etapa inicial envolvea haploidização da planta que resulta na produção de uma população quecompreende semente haplóide. As linhagens não-homozigotas são cruzadascom um parental indutor, resultando na produção de semente haplóide. Asemente que possui um embrião haplóide, mas endosperma triplóide normal,segue adiante para o segundo estágio. Ou seja, a semente e as plantas ha-plóides são qualquer planta com um embrião haplóide, independente do ní-vel de ploidia do endosperma.Após a seleção de sementes haplóides da população, as semen-tes selecionadas sofrem duplicação cromossômica para produzir sementesduplo haplóides. Uma duplicação cromossômica espontânea em uma linha-gem de células levará à produção de gametas normais ou à produção degametas não reduzidos partindo de linhagens de células haplóides. A aplica-ção de um composto químico, tal como colchicina, pode ser utilizada paraaumentar a taxa de diploidização. A colchicina se liga à tubulina e previnesua polimerização em microtúbulos, interrompendo assim a mitose na metá-fase e pode ser utilizada para aumentar a taxa de diploidização, isto é, a du-plicação do número de cromossomos. Estas plantas quiméricas são autopo-Iinizadas para produzir semente diplóide (duplo haplóide). Esta semente DHé cultivada e subseqüentemente avaliada e utilizada na produção de cruza-mento de teste híbrido.

Entretanto, os processos para a produção de semente DH so-frem geralmente de baixa eficiência muito embora os métodos tenham sidodesenvolvidos em uma tentativa de aumentar a freqüência de produção deDH, incluindo o tratamento com colchicinas. Os resultados notáveis incluema baixa produção de semente haplóide, a viabilidade reduzida de gametasresultando na autopolinização diminuída para a geração de plantas DH e orendimento inadequado de sementes DH para aplicações de cultivo.

Os métodos da presente invenção representam um avanço nasaplicações de cruzamento facilitando o potencial para seleção no estágio desemente haplóide assim como diplóide. Por exemplo, em uma modalidade, ainvenção fornece a análise de alta circulação de uma população de semen-tes haplóides. O método compreende geralmente a remoção não-destrutivade uma amostra de um grande número de sementes na população e a análi-se da amostra em relação à presença de uma ou mais características indica-tivas de pelo menos um traço característico genético ou químico como des-crito aqui.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece o acúmulo de altacirculação de uma população de sementes duplo haplóides. O método com-preende a seleção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelomenos uma característica preferida partindo de uma população de sementeshaplóides e a produção de uma população de sementes duplo haplóides.Gada semente duplo haplóide tem então amostras retiradas de forma não-destrutiva e as amostras são analisadas em relação à presença ou à ausên-cia de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço ca-racterístico genético ou químico. Com base nos resultados da análise, umaou mais sementes duplo haplóides individuais são selecionadas e as plantasou o tecido vegetal é cultivado partindo das sementes duplo haplóides selecionadas.

Em várias modalidades, os métodos da invenção incluem a aná-lise da semente em relação a uma ou mais características, tais como marca-dores genéticos, para determinar se a semente está em um estado haplóideou diplóide. A presente invenção fornece ainda métodos para analisar a se-mente haplóide ou duplo haplóide em relação a uma ou mais características,tais como transgenes ou marcadores ligados a ou diagnósticos de transge-nes, em relação a características relacionadas ao desempenho do evento,avaliação do evento e integração da característica. Ainda, a presente inven-ção fornece um método para analisar a semente haplóide com a finalidadede selecionar classes genotípicas e fenotípicas preferidas para sofrerem du-plicação.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece umabase para a determinação da fase de ligação. Utilizando o tecido de endos-perma da semente derivada de uma planta diplóide, os haplotipos marcado-res parentais podem ser determinados utilizando um sistema de genotipa-gem que possibilita a detecção de freqüências alélicas diferentes em amos-tras de DNA. Uma vez que o tecido é triplóide, com duas cópias derivadasdo gameta feminino, a fase de ligação da linhagem parental pode ser inves-tigada através da dissecção de genótipos de progênie heterozigotos (vide afigurai). A amostra de DNA do tecido de endosperma permite uma determi-nação do nível de ploidia do marcador genético. Um nível de ploidia diplóideno marcador genético indica herança materna e um nível de ploidia haplóideno marcador genético indica herança paterna.Ainda, dados de freqüências alélicas diferenciais também podemser utilizados para inferir o mapa de ligação genética, mas, ao contrário dosmétodos que requerem material haplóide (Gasbarra e outros 2006 Genetics172:1325-1335), utilizando a classificação de freqüência alélica descrita an-teriormente. A determinação do mapa de ligação genética possui utilidadetremenda no contexto da caracterização de haplotipo, mapeamentos dasassociações de marcador (ou haplotipo) - característica. Este método é par-ticularmente vigoroso em uma base de sementes isoladas vs. agrupadas e éassim bem adequado para a presente invenção.

Em uma modalidade particular, a invenção fornece ainda umensaio para prever a zigosidade do embrião para um gene de interesse par-ticular (GOI). O ensaio prevê a zigosidade do embrião com base na propor-ção do número de cópias relativo de um GOI e de um gene de controle in-terno (IC) por célula ou por genóma. Geralmente, este ensaio utiliza um ge-ne IC que tem zigosidade conhecida, por exemplo, homozigoto no lócus (du-as cópias de IC por célula diplóide), para normalizar a medida do GOI. Aproporção do número de cópias relativo do IC em relação ao GOI prevê onúmero de cópias de GOI na célula. Em uma célula homozigota, para qual-quer gene fornecido (ou seqüência genética única), o número de cópias dogene é igual ao nível de ploidia da célula uma vez que a seqüência está pre-sente no mesmo lócus em todos os cromossomos homólogos. Quando umacélula for heterozigota para um gene particular (ou hemizigota no caso deum transgene), o número de cópias do gene será menor que o nível de ploi-dia da célula. Se o GOI não for detectado, a célula é nula em relação ao ló-eus, como pode acontecer para um segregante negativo de um eventotransgênico ou em uma população que sofreu mutagênese. A zigosidade deuma célula em qualquer lócus pode ser assim determinada através do núme-ro de cópias do gene na célula.

Em uma outra modalidade particular, a invenção fornece um en-saio para prever a zigosidade do embrião de milho. Na semente de milho, otecido do endosperma é triplóide, enquanto que o tecido do embrião é diplói-de. O número de cópias do endosperma reflete a zigosidade do embrião: umendosperma homozigoto (positivo ou negativo) acompanha um embrião ho-mozigoto, um endosperma heterozigoto (seja um número de cópias de GOIde 1 ou 2) reflete um embrião heterozigoto (número de cópias de GOI de 1).O endosperma que é homozigoto em relação ao IC conterá três cópias deIC. O número de cópias de GOI do endosperma pode variar de O (embriãonegativo homozigoto) até 3 (embrião positivo homozigoto); e o número decópias de GOI do endosperma de 1 ou 2 é observado na semente em que oembrião é heterozigoto para o GOI (ou hemizigoto para o GOI se o GOI forum transgene). O número de cópias de GOI do endosperma (que pode vari-ar de O até 3 cópias) pode ser determinado partindo da proporção dó númerode cópias de IC do endosperma em relação ao número de cópias de GOI doendosperma (que pode variar de 0/3 até to 3/3, ou seja, de O até 1), que po-de então ser utilizado para prever a zigosidade do embrião.

Os números de cópias do GOI ou do IC podem ser determinadosatravés de qualquer técnica de ensaio conveniente para a quantificação dosnúmeros de cópias, como é conhecido na técnica. Os exemplos de ensaiosadequados incluem, mas não estão limitados a ensaios de PCR em TempoReal (TaqMan®) (Applied Biosystems, Foster City, CA) e Invader® (Third WaveTechnologies, Madison, Wl). Preferencialmente, tais ensaios são desenvolvi-dos de tal maneira que a eficiência de amplificação de ambas as seqüênciasde IC e de GOI é igual ou muito similar. Por exemplo, em um ensaio de PCRem Tempo Real com TaqMan®, o sinal proveniente de um GOI em uma únicacópia (a célula fonte é determinada como sendo heterozigota para o GOI) se-rá detectado um ciclo de amplificação depois que o sinal proveniente de umIC em duas cópias, porque a quantidade do GOI é a metade daquela do IC.Para a mesma amostra heterozigota, um ensaio Invader® mediria uma pro-porção de GOI/IC de aproximadamente 1:2 ou 0,5. Para uma amostra que éhomozigota tanto para GOI quanto para IC, o sinal de GOI seria detectadoao mesmo tempo que o sinal de IC (TaqMan®) e o ensaio Invader mediria uma proporção de GOI/IC de aproximadamente 2:2 ou 1.

Estas diretrizes se aplicam a qualquer célula poliplóide ou àscélulas haplóides (tais como células de pólen), uma vez que o número decópias do GOI ou do IC permanece proporcional ao número de cópias dogenoma (ou nível de ploidia) da célula. Assim, estes ensaios de zigosidadepodem ser realizados em tecidos triplóides tal como o endosperma do milho.Além disso, o número de cópias para um GOI pode ser medido além de 2cópias ou em valores numericamente diferentes que a ploidia da célula.O método é ainda apropriado para a detecção de GOI em poliplóides, emalguns eventos transgênicos com > 2 cópias do transgene inserido, após areplicação do GOI por transposição, quando o GOI existe em cromossomosou plasmídeos que se replicam de forma autônoma e outras situações.

No cruzamento de plantas, é útil determinar a zigosidade em umou mais Ioci com a finalidade de avaliar o nível de intracruzamento (ou seja,o grau de fixação gênica), a distorção da segregação (isto é, no germoplas-ma transgênico, o teste de herança materna ou para os Ioci que afetam aaptidão dos gametas) e o nível de cruzamento externo (isto é, a proporçãorelativa de homozigosidade e heterozigosidade). Similarmente, a extensãoda zigosidade em um ou mais Ioci pode ser utilizada para estimar a hibrideze se um lote particular de sementes satisfaz um padrão comercial ou regula-dor para venda como semente híbrida certificada. Em adição, no germo-plasma transgênico, é útil conhecer a ploidia ou o número de cópias, com afinalidade de distinguir eventos de qualidade e para auxiliar as estratégias deintegração de características.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece umabase para aumentar a capacidade de monitorar um ou mais conjuntos degermoplasma em relação a alterações nas freqüências de uma ou mais ca-racterísticas genéticas, em que as ditas características genéticas incluemmarcadores, alelos e haplotipos. É conhecida na técnica a metodologia paracomparar a freqüência do marcador genético entre populações originadasrecentemente e suas linhagens ancestrais com a finalidade de identificar osIoci genéticos que estão aumentando em relação à freqüência ao longo dotempo (Patentes U.S. N- 5.437.697 e 5.746.023). Tais Ioci com freqüênciasque excedem a freqüência alélica esperada são inferidos como tendo sidosubmetidos à seleção. Ainda, dado que o critério de seleção predominantenos programas de cruzamento é o rendimento, é esperado que aqueles ale-los que estão aumentando em relação à freqüência possam ser ligados aorendimento.

Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece ummétodo para possibilitar o cruzamento auxiliado pelo haplotipo. Comparandoa freqüência dos haplotipos em linhagens de elite emergentes com a fre-qüência do haplotipo nas linhagens de elite ancestrais (como determinadoatravés da análise do pedigree), é possível a identificação de haplotipos queestão se desviando da freqüência de haplotipo esperada. Ainda, através daavaliação das estimativas do efeito do haplotipo para os ditos haplotipos, étambém possível ligar os ditos haplotipos com freqüência crescente com osresultados fenotípicos para um conjunto de características agronômicas.A composição de haplotipo de sementes individuais que tiveram amostrasretiradas de um grande número de sementes pode ser determinada utilizan-do marcadores genéticos e as sementes com haplotipos preferidos são sele-cionadas e levadas à etapa seguinte. Assim, decisões de cruzamento maisinformadas e o estabelecimento de programas de desenvolvimento de linha-gens superiores são possibilitados através dessa tecnologia.

Exemplos

Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos e não-limitàntes desta descrição de forma alguma.

Exemplo 1

Este exemplo descreve um ensaio para prever a zigosidade deembriões de milho utilizando um gene de controle interno (IC) homozigoto nolócus (isto é, duas cópias de IC no embrião diplóide e três cópias de IC noendosperma triplóide). Em uma linhagem intracruzada de um organismo di-plóide (ou com ploidia superior) tal como o milho, o controle interno endóge-no é tipicamente homozigoto; os eventos transgênicos em tais organismosna primeira geração (denominada "RO" no milho) são tipicamente hemizigo-tos (ou seja, o transgene está tipicamente presente em apenas um dos doisou mais cromossomos homólogos). O milho (Zea mays) é um organismodiplóide, assim um evento RO "de uma única cópia" possui uma cópia doGOI por célula, mas 0,5 cópia por genoma haplóide, um evento RO "de duascópias" possui duas cópias do GOI por célula, mas 1 cópia por genoma ha-plóide e assim por diante.

Neste exemplo, a tubulina foi utilizada como o gene IC e o GOIera um transgene codificando a neomicina fosfotransferase Il (NPT II), que éutilizada para a seleção por resistência à canamicina. O tecido do endos-perma (triplóide) foi tirado da semente (por amostragem manual ou por ras-pagem de uma semente com um aparelho de amostragem automatizado dapresente invenção). A semente que teve uma amostra de endosperma reti-rada foi germinada e o tecido foliar (diplóide) de plantas germinadas de for-I ma bem sucedida também teve amostras retiradas para análise genética. Otecido foliar se correlaciona diretamente com a zigosidade do embrião e foiassim utilizado para demonstrar que a zigosidade do endosperma geralmen-te prevê a zigosidade do embrião e para confirmar a classificação de homo-zigosidade do endosperma. O DNA genômico total foi extraído do tecido deendosperma e do tecido foliar e foi analisado quantitativamente utilizando umensaio Invader® com sondas de oligonucleotídeo específicas para o gene deinteresse, NPT Il ou para o gene de controle interno, tubulina. A proporçãodo GOI em relação ao IC foi medida utilizando técnicas de biologia molecularconvencionais. Vide a Tabela 1. Um resumo dos resultados de vários expe-rimentos é mostrado na Tabela 2.

Os resultados indicaram que a zigosidade do endosperma ge-ralmente previa a zigosidade do embrião (como indicado pela zigosidadefoliar) e era confiável na previsão da homozigosidade para todas as semen-tes que germinaram. Além disso, a análise de zigosidade do endospermaforneceu algumas previsões homozigotas falso negativas (especialmentequando tecido do endosperma foi obtido com o aparelho de amostragemautomatizado). Estes resultados demonstram que para uma célula com umnível de ploidia conhecido, a proporção do número de cópias de um GOI emrelação ao de um IC indica a zigosidade de tal célula. Além disso, o ensaiode zigosidade da presente invenção pode prever a zigosidade de um tecidocom base na zigosidade de um outro, ou seja, o ensaio pode prever a zigo-sidade do embrião com base na zigosidade do endosperma.

TABELA 1 <table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>

TABELA 2

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Exemplo 2

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente inven-ção em um programa para a seleção auxiliada por marcador de sojas emrelação ao baixo teor de ácido linolênico.

A soja é a planta de cultivo Ieguminosa mais valiosa, com muitosusos nutricionais e industriais devido a sua composição química exclusiva. Assementes de soja são uma fonte importante de óleo vegetal, que é utilizadoem produtos alimentícios por todo o mundo. O nível relativamente alto (geral-mente aproximadamente 8%) de ácido linolênico (18:3) no óleo de soja reduzsua estabilidade e sabor. A hidrogenação do óleo de soja é utilizada para di-minuir o nível de ácido linolênico (18:3) e aumentar tanto a estabilidade quan-to o sabor dos óleos de soja. Entretanto, a hidrogenação resulta na produçãode ácidos graxos trans, que aumentam o risco de doença cardíaca coronaria-na quando consumidos. O desenvolvimento de soja com baixo teor de ácidolinolênico tem sido complicado devido à natureza quantitativa da característi-ca. Foi observado que as variedades de soja com baixo teor de ácido linolêni-co que foram desenvolvidas têm rendimento baixo, limitando a sua utilizaçãona maior parte das unidades comerciais. O desenvolvimento de um produtocom rendimento de semente comercialmente significativo é uma prioridadealta na maior parte dos programas de desenvolvimento de cultivares de soja.

Um exemplo da aplicação dos métodos da presente invenção éa seleção de plantas de soja tanto com alto rendimento quanto com menorteor de ácido linolênico. O desempenho da progênie da soja quando se refe-re ao baixo teor de ácido linolênico se baseia principalmente em dois Ioci decaracterísticas quantitativas principais (QTL) em Fad3-1b e Fad3-1c. A aná-lise de plantas segregantes demonstrou que Fad3-1b e Fad3-1c controlamaditivamente o teor de ácido linolênico na soja. Portanto, utilizando umacombinação de marcadores para Fad3-1b é Fad3-1c, um agricultor que utili-za a invenção pode prever de forma acurada o teor de ácido linolênico emplantas de soja. Os marcadores podem ser utilizados para inferir o estadogenotípico de uma semente em qualquer estágio no processo de cruzamen-to, por exemplo, no estágio de linhagem intracruzada final ou F1, F2, F3 etc.

Um híbrido F1 seminal pode ser produzido através do cruzamentode duas linhagens de soja intracruzadas (por exemplo, o cruzamento de umaplanta contendo os alelos Fad3-1b e/ou Fad3-1c associados com o conteúdode ácido linolênico diminuído com uma planta que não possui estes alelos)seguido pela autopolinização natural. Uma vez que os marcadores podem serutilizados para inferir o estado genotípico de uma semente isolada obtida deum intercruzamento de tais linhagens intracruzadas, pode ser realizado o cru-zamento auxiliado por marcador da geração a seguir (isto é, F2).

A semente de soja à temperatura ambiente e umidade tipica-mente equilibrada a 8% em uma base em peso seco. A semente de sojaneste nível de umidade tende a se partir quando é retirada uma amostra.Para reduzir essa divisão, a semente deve ser umedecida até um nível deumidade de 12%. Quando pré-tratada desta maneira, a divisão é significati-vamente reduzida em <5%.

A semente F2 selecionada que possui o genótipo desejado podeI ser agrupada ou mantida separada dependendo dos objetivos de cruzamento.Se vários QTLs com efeitos variáveis tiverem sendo selecionados de uma cer-ta população, o agricultor poderia preservar a identidade da semente individu-al para diferenciar indivíduos com várias combinações do QTL de resistênciaalvo. Estas sementes poderiam ser plantadas no campo com identificação decampo apropriada. Vários métodos de preservação da identidade de semen-tes individuais podem ser utilizados enquanto a semente é transferida do labo-ratório de amostragem para o campo. Os métodos incluem a transferência deindivíduos selecionados para "horticultural seed tape" que poderia incluir aindaidentificação por freqüência de rádio para auxiliar a identificação da sementegenotipada individual. Outros métodos seriam o uso de um "indexing tray",sementes de plantas em vasos de turfa e então transplantá-las ou plantar ma-nualmente partindo de embalagens individuais de sementes.

Exemplo 3

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente inven-ção em um programa para alelos parentais recorrentes em um programa decultivo com retrocruzamento.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para aseleção de transgenes assim como para a identificação de alelos parentaisrecorrentes. A identificação de genótipos com freqüências alélicas parentaisrecorrentes desejadas antes do plantio permite que o número de fileiras porpopulação seja reduzido ao longo de todo o programa de cruzamento juntocom um aumento no número de populações incluídas no programa de con-versão dentro de uma certa unidade do campo. Isto resulta no uso melhora-do da terra, em custos reduzidos de terra e de trabalho etc.

Um exemplo de análise do tecido de endosperma do milho emrelação a alelos parentais recorrentes em um programa de cultivo com retro-cruzamento é mostrado na figura 1.

Exemplo 4

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente inven-ção para o uso no "fingerprinting" de linhagens de DNA e na determinaçãoda fase de ligação.

Combinado com o agrupamento do DNA de uma semente isola-da, o "fingerprinting" de linhagens poderia ser realizado sem a necessidadede retirar amostras da linhagem no campo.

Utilizando o tecido de endosperma da semente (revestimento dasemente na soja) derivada de uma planta diplóide, os haplotipos marcadoresparentais podem ser determinados utilizando um sistema de genotipagemque possibilita a detecção de freqüências alélicas diferentes nas amostrasde DNA. Uma vez que o tecido de endosperma é triplóide, com duas cópiasderivadas do gameta feminino, a fase de ligação da linhagem parental podeser investigada através da dissecção dos genótipos de progênie heterozigo-tos. A amostra de DNA do tecido de endosperma permite uma determinaçãodo nível de ploidia do marcador genético. Um nível de ploidia diplóide nomarcador genético indica herança materna e um nível de ploidia haplóide nomarcador genético indica herança paterna.

Exemplo 5

Este exemplo demonstra os métodos da presente invenção paraa avaliação da semente transgênica em relação à distorção da segregação.As sementes de um cruzamento Fi entre a Linhagem A (Evento Homozigoto1 e Evento 2) e a Linhagem B (Evento Homozigoto 1) foram induzidas emum isolamento de indução haplóide materno. As sementes resultantes foramselecionadas utilizando a coloração da plúmula para a obtenção de uma po-pulação de supostas sementes haplóides.As supostas sementes haplóides individuais provenientes da po-pulação de supostas sementes haplóides foram selecionadas e foram tiradasamostras de forma não-destrutiva utilizando um sistema de amostragem desementes automatizado que é descrito de forma geral no Pedido de PatenteU.S. N2 de Série 11/213.435 (Publicação N2 US 2006/004624), que é incorpo-rado aqui como referência em sua totalidade. Os marcadores foram aplicadosnas amostras para determinar a presença do gene do Evento 2 e do gene doEvento 1. O processo de amostragem corta parte do tecido do pericarpo e doendosperma e utiliza como a base para a análise. É importante citar que otecido do endosperma é triplóide e contém contribuição genética de ambos osparentais. Se o gene de interesse for detectado utilizando este método, prevêde forma acurada a presença do gene desejado no embrião haplóide. Para asfinalidades deste estudo, amostras de 180 sementes foram analisadas e osdados foram obtidos em 175 devido a problemas de amostragem.

Como mostrado na Tabela 3 abaixo, cada uma das amostras desementes tiveram testes positivos em relação ao gene do Evento 1 comoesperado e aproximadamente 50% das amostras de sementes tiveram tes-tes positivos em relação ao gene do Evento 2, confirmando nenhuma distor-ção da segregação.

TABELA 3

<table>table see original document page 30</column></row><table>Os resultados deste estudo indicam que características gênicasindividuais podem ser selecionadas em uma base haplóide utilizando amos-tragem de sementes não-destrutiva de alta circulação como um mecanismode seleção.

Exemplo 6

Este exemplo demonstra a utilidade da amostragem de alta cir-culação automatizada na pré-seleção de sementes haplóides de uma popu-lação de sementes.

O experimento compreendia a amostragem de 20 populações F2utilizando um sistema de amostragem de sementes de alta circulação não-destrutivo e analisando as amostras para verificar a pré-seleção de semen-tes haplóides. Cada população de sementes F2 teve amostras retiradas deforma não-destrutiva ou as plantas F2 tiveram amostras retiradas de tecidospara análise do DNA. As amostras não-destrutivas de sementes foram cole-tadas de sementes individuais na população de sementes utilizando um sis-tema de amostragem de sementes automatizado que é descrito de formageral no Pedido de Patente U.S. N- de Série 11/213.435 (Publicação N2 US2006/004624), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

A seleção de genótipos desejáveis se baseava na seleção de materiais comas freqüências alélicas mais altas dos haplotipos desejados com base nosparâmetros de modelagem. As plantas F2 selecionadas foram polinizadascom polinizadores do sexo masculino indutores haplóides e a semente resul-tante foi colhida. Após a colheita, as sementes haplóides foram selecionadasdas sementes não-haplóides e as haplóides tiveram amostras retiradas emuma base de embrião utilizando amostragem de alta circulação não-destrutiva e foram genotipadas substancialmente. A semente haplóide prefe-rida foi selecionada e submetida a um procedimento de duplicação cromos-sômica para produzir duplo haplóides. Esta abordagem permite que genóti-pos não preferidos sejam separados antes da duplicação e aumenta a fre-qüência de material preferido que é processado através do processo de du-plicação intensiva de recursos.

Os resultados que comparam a semente haplóide selecionada eque ilustram a eficiência desta abordagem são mostrados na figura2.

Quando são introduzidos os elementos ou as características dasmodalidades contidas aqui, é pretendido que os artigos "um", "uma", "o", "a","dito" e "dita" signifiquem que há um ou mais de tais elementos ou caracte-rísticas. É pretendido que os termos "compreendendo", "incluindo" e "possu-indo" incluam e signifiquem que podem haver elementos ou característicasadicionais sem ser os citados especificamente. Deve ser ainda entendidoque as etapas, processos e operações do método descrito aqui não devemser interpretados como requerendo necessariamente seu desempenho naordem particular discutida ou ilustrada, a não ser que seja identificada espe-cificamente como uma ordem de desempenho. Deve ainda ser entendidoque etapas adicionais ou alternativas podem ser empregadas.

A descrição da descrição tem uma natureza meramente de e-xemplo e, assim, é pretendido que variações que não saem da essência dadescrição estejam dentro do âmbito da descrição. Tais variações não devemser consideradas como um desvio do espírito e do âmbito da descrição.

Claims (32)

1. Processo não-destrutivo de alta circulação para analisar se-mentes individuais em uma população de sementes, o processo compreen-dendo:a remoção de uma amostra de um grande número de sementes na popula-ção enquanto a viabilidade de germinação da semente é preservada; ea análise da amostra em relação à presença ou à ausência de uma ou maiscaracterísticas indicativas de pelo menos uma característica genética ouquímica.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a amostraé analisada em relação a uma ou mais características indicativas de pelomenos uma característica química.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a amostraé analisada em relação a uma ou mais características selecionadas do grupoque consiste em proteínas, óleos, carboidratos, ácidos graxos, aminoácidos,biopolímeros, agentes farmacêuticos, amido, amido que pode ser fermenta-do, compostos secundários e metabólitos.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a amostraé analisada em relação a uma ou mais características indicativas de pelomenos uma característica genética.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a amostraé analisada em relação a uma ou mais características selecionadas do grupoque consiste em um marcador genético, um polimorfismo de um único nu-cleotídeo, uma repetição de seqüência simples, um polimorfismo de compri-mento de fragmento de restrição, um haplotipo, uma marcação SNP, um ale-lo de um marcador genético, um gene, uma seqüência derivada do DNA,uma seqüência derivada do RNA, um promotor, uma região não-traduzida a-5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siR-NA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, dsmRNA, um per-fil de transcrição e um padrão de metilação.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o proces-so compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação de sementes com base na presença de uma ou mais característi-cas que estão ligadas geneticamente com um QTL selecionado do grupoque consiste em tolerância a herbicida, resistência a doenças, resistência ainsetos ou pragas, metabolismo alterado de ácidos graxos, proteínas ou car-boidratos, maior rendimento de grãos, maior teor de óleo, maior teor nutri-cional, maiores taxas de crescimento, maior tolerância ao estresse, maturi-dade preferida, propriedades organolépticas melhoradas, característicasmorfológicas alteradas, outras características agronômicas, característicaspara usos industriais, características para aumentar o interesse do consumi-dor e uma combinação de características como um índice de várias caracte-rísticas.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o proces-so compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação de sementes com base na presença de uma ou mais característi-cas que estão ligadas geneticamente com um haplotipo associado com umQTL selecionado do grupo que consiste em tolerância a herbicidas, resistên-cia a doenças, resistência a insetos ou pragas, metabolismo alterado de áci-dos graxos, proteínas ou carboidratos, maior rendimento de grãos, maiorteor de óleo, maior teor nutricional, maiores taxas de crescimento, maior to-lerância ao estresse, maturidade preferida, propriedades organolépticas me-lhoradas, características morfológicas alteradas, outras características agro-nômicas, características para usos industriais, características para aumentaro interesse do consumidor e uma combinação de características como umíndice de várias características.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o proces-so compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação de sementes com base na presença de uma ou mais característi-cas que indicam a associação com um ancestral recorrente para facilitar aseleção em relação ao retrocruzamento auxiliado por marcadores.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o proces-so compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação de sementes com base na presença de uma ou mais característi-cas que estão associadas com um ou mais transgenes.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pro-cesso compreende ainda:a quantificação de uma ou mais características de um grande número deamostras; ea comparação das características quantificadas com as características dedois ou mais grupos de germoplasma conhecidos para a identificação dasalterações de freqüência.

11. Processo da reivindicação 10, em que os dois ou mais gru-pos de germoplasma representam uma planta de cultivo selecionada de umaplanta de cultivo de forragem, uma planta de cultivo de semente oleosa, umaplanta de cultivo de grãos, uma planta de cultivo de frutos, plantas ornamen-tais, uma planta de cultivo vegetal, uma planta de cultivo de fibras, uma plan-ta de cultivo de tempero, uma planta de cultivo de noz, uma planta de cultivode turfa, uma planta de cultivo de açúcar, uma planta de cultivo para bebi-das, uma planta de cultivo de tubérculo, uma planta de cultivo de raiz e umaplanta de cultivo para floresta.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pro-cesso compreende a remoção de uma amostra do tecido do endosperma dasemente enquanto a viabilidade de germinação da semente é preservada.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o pro-cesso compreende ainda:a análise da amostra em relação a um ou mais alelos; ea determinação do nível de ploidia de pelo menos um lócus.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o nívelde ploidia é determinado através da análise da amostra em relação a umalelo derivado do ancestral materno da semente.

15. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o nívelde ploidia é determinado através da análise da amostra em relação a umalelo derivado do ancestral paterno da semente.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pro-cesso compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação de sementes com base nos resultados da análise; e o cultivo deplantas ou de tecido vegetal partindo das sementes selecionadas.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o pro-cesso compreende ainda o revestimento das sementes selecionadas comum polímero e/ou um fungicida após a amostragem para preservar adicio-nalmente a viabilidade de germinação.

18. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o pro-cesso compreende ainda a determinação da característica genotípica daprole da semente antes da seleção das sementes da população.

19. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o pro-cesso compreende ainda a utilização de plantas férteis cultivadas partindoda semente selecionada na forma de um ancestral do sexo feminino ou dosexo masculino em um cruzamento com uma outra planta.

20. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o pro-cesso compreende ainda a pré-seleção da população de sementes com ba-se na presença ou na ausência de uma característica física ou morfológica.

21. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a popu-lação de sementes compreende sementes selecionadas do grupo que con-siste em semente de alfafa, semente de maçã, semente de banana, sementede cevada, semente de feijão, semente de brócolis, semente de mamona,semente de fruta cítrica, semente de trevo, semente de coco, semente decafé, semente de milho, semente de algodão, semente de pepino, sementede Pseudotsuga, semente de eucalipto, semente de Pinus taeda, sementede linhaça, semente de melão, semente de aveia, semente de oliva, semen-te de palma, semente de ervilha, semente de amendoim, semente de pimen-ta, semente de álamo, semente de Pinus radiata, semente de colza, semen-te de arroz, semente de centeio, semente de sorgo, semente de pinheiro dosul, semente de soja, semente de morango, semente de beterraba, sementede cana de açúcar, semente de girassol, semente de Liquidambar, sementede chá, semente de tabaco, semente de tomate, semente de turfa, sementede trigo e semente de Arabidopsis thaiiana.

22. Processo de alta circulação para a análise de uma popula-ção de semente haplóide, o processo consistindo de:fornecimento de uma população de sementes que compreendemsementes haplóides;remoção de uma amostra de um grande número das sementesna população enquanto a viabilidade de germinação da semente é preservada; eanálise da amostra em relação à presença ou à ausência deuma ou mais características indicativas de pelo menos uma característicagenética ou química.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o pro-cesso compreende ainda a determinação da característica genotípica dasemente selecionada.

24. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o pro-cesso compreende ainda:a seleção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelomenos uma característica preferida da população de sementes; ea produção de semente duplo haplóides partindo das sementesselecionadas.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, em que a pelomenos uma característica preferida é uma característica fenotípica.

26. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que a amostra é anali-sada em relação a uma ou mais características selecionadas do grupo queconsiste em um marcador genético, um polimorfismo de um único nucleotí-deo, uma repetição de seqüência simples, um polimorfismo de comprimentode fragmento de restrição, um haplotipo, uma marcação SNP, um alelo deum marcador genético, um gene, uma seqüência derivada do DNA, uma se-qüência derivada do RNA, um promotor, uma região não-traduzida a 5' deum gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siRNA, umQTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, dsmRNA, um perfil detranscrição e um padrão de metilação.

27. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o pro-cesso compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuais dapopulação com base na presença de uma ou mais características associa-das com um ou mais transgenes.

28. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o pro-cesso compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes individuaisque exibem uma ou mais características genéticas indesejáveis da popula-ção de sementes e o descarte das sementes selecionadas.

29. Processo de alta circulação para agrupar uma população desementes duplo haplóides, o processo compreendendo:o fornecimento de uma população de sementes que compreendesementes haplóides;a seleção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelomenos uma característica preferida partindo da população de sementes;a produção de sementes duplo haplóides partindo das sementes seleciona-das;a remoção de uma amostra de cada semente duplo haplóideenquanto a viabilidade de germinação das sementes é preservada;a análise das amostras em relação à presença ou à ausência deuma ou mais características indicativas de pelo menos uma característicagenética ou química;a seleção de uma ou mais sementes duplo haplóides individuaiscom base nos resultados da análise; eo cultivo de plantas o do tecido vegetal partindo das sementes duplo haplói-des selecionadas.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que as a-mostras são analisadas em relação a uma ou mais características selecio-nadas do grupo que consiste em um marcador genético, um polimorfismo deum único nucleotídeo, uma repetição de seqüência simples, um polimorfismode comprimento de fragmento de restrição, um haplotipo, uma marcaçãoSNP, um alelo de um marcador genético, um gene, uma seqüência derivadado DNA, uma seqüência derivada do RNA, um promotor, uma região não-traduzida a 5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, mi-croRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, ds-mRNA, um perfil de transcrição e um padrão de metilação.

31. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que o pro-cesso compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes duplo haplói-des individuais com base na presença de uma ou mais características asso-ciadas com um ou mais transgenes.

32. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que o pro-cesso compreende ainda a análise das amostras em relação à presença deum DNA indutor e o descarte das sementes duplo haplóides que exibem apresença de um DNA indutor antes da seleção de sementes duplo haplóidespara o cultivo de plantas ou de tecido vegetal.