BRPI0809020A2 - Método para selecionar plantas de dendezeiro haplóides ou haplóides duplicadas, plantas, clones, pólens ou óvulos de uma planta, método para produzir uma planta de dendezeiro homozigota haplóide duplicada, métodod para identificar plantas haplóides duplicadas em uma população de progênie de um precursor materno, população de plantas ou sementes de dendezeiro híbridas, produtos colhidos e extraídos, e, método para obter azeite de dendê. - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA SELECIONAR PLANTAS DE DENDEZEIRO HAPLÓIDES OU HAPLÓIDES DUPLICADAS, PLANTA, CLONES, PÓLENS OU ÓVULOS DE UMA PLANTA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE DENDEZEIRO HOMOZIGOTA HAPLÓIDE DUPLICADA, MÉTODO PARA IDENTIFICAR PLANTAS HAPLÓIDES DUPLICADAS EM UMA POPULAÇÃO DE PROGÊNIE DE UM PRECURSOR MATERNO, POPULAÇÃO DE PLANTAS OU SEMENTES DE DENDEZEIRO HÍBRIDAS, PRODUTOS COLHIDOS E EXTRAÍDOS, E, MÉTODO PARA OBTER AZEITE DE DENDÊ”

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a plantas de dendezeiro haplóides e plantas de dendezeiro haplóides duplicadas homozigotas. A invenção também diz respeito a métodos para produzir e selecionar plantas haplóides e haplóides duplos. Mais particularmente, mas não exclusivamente, o método pode ser usado para selecionar plantas de dendezeiro e tamareiras haplóides e haplóides duplicadas homozigotas.

Fundamentos da invenção

Embora os programas de desenvolvimento de planta mundiais tenham feito consideráveis progressos desenvolvendo novos cultivares com rendimento melhorado, resistência a pragas e doenças, e outros traços úteis, a desenvolvimento como uma todo conta com numerosas triagens de plantas para identificar novas características, desejáveis. Frequentemente, números muito grandes de progênie de cruzamentos devem ser cultivados e avaliados durante vários anos de modo a selecionar uma ou umas poucas plantas com uma combinação desejada de traços.

Em um programa de desenvolvimento de planta típico, duas plantas precursoras são cruzadas e a progênie resultante são triadas e uma ou mais plantas que possuem uma combinação desejável de traços fenotípicos são identificadas e selecionadas. A planta com os traços desejados podem depois se auto-fertilizar ou ser cruzadas para produzir uma população de plantas descendentes que devem ser individualmente analisadas para determinar quais plantas possuem a combinação desejada de traços fenotípicos originalmente introduzidos no primeiro desenvolvimento. Se, 5 como é freqüente o caso, os traços fenotípicos desejados são derivados do efeito combinado de diversos genes, depois o número de plantas descendentes que devem ser triadas depende do número de diferenças genéticas entre as plantas precursoras. Assim, quanto maior o número de diferenças geneticamente controladas entre precursores, maior o número de progênie que 10 deve ser cultivado e avaliado, e mais baixa a probabilidade de se obter progênie com todos os traços desejados. O problema é exacerbado quando alguns destes traços (tais como rendimento) requerem que as plantas atinjam a maturidade antes que eles possam ser avaliados.

Uma solução possível para o problema de triar números 15 grandes de progênie que segregam quanto aos traços desejados depende da capacidade para produzir ou identificar plantas haplóides derivadas das células gaméticas de indivíduos precursores. Os complementos de cromossomo destes haplóides algumas vezes espontaneamente se duplicam para produzir plantas diplóides ou ainda podem ser artificialmente duplicadas 20 usando colchicina ou por outros meios. Em particular, embora não exclusivamente, haplóides duplicados podem ser produzidos pela cultura in vitro de microesporos que normalmente dão origem a grãos de pólen. As plantas haplóides duplicadas resultantes, não obstante sejam derivadas, são imediata e completamente homozigotas. Isto significa que a semente gerada a 25 partir da auto-polinização de tais plantas são geneticamente idênticas ao clone precursor e assim pode ser multiplicado rapidamente pela semente. Além disso, quando dois de tais haplóides duplicados são sexualmente cruzados, a progênie de semente resultante é geneticamente constante e heterozigoto para todos os locais que diferem entre os dois precursores (isto é, estas são progênies F1 geneticamente uniformes).

O nível de ploidia de uma célula somática é definida como o número de conjuntos de genoma de cromossomos que ela contém. Um conjunto de genoma de cromossomos (também conhecido como o número de base, x) é mais simplesmente descrito como o número de cromossomos heterólogos presentes no genoma nuclear e é igual àquele presente nos gametófitos de um organismo diplóide. Por exemplo, os seres humanos são organismos diplóides, tendo 2n = 2x = 46 cromossomos em suas células somáticas e n = x = 23 em seus gametas (óvulos e esperma). Quando o nível de ploidia é maior do que um, a análise genética é feita mais difícil pelos efeitos de dominância; quando mais do que uma cópia de um gene está presente apenas uma cópia, a dominante, pode influenciar fenótipo ou ainda ambas as cópias contribuem para o fenótipo expressado (parcial ou nenhuma dominância). Com dominância, a outra cópia do gene, o alelo recessivo, é aparentemente 'mascarado’ porque a sua presença não é evidente ao nível fenotípico. Os organismos haplóide contêm o mesmo número de cromossomos (n) em suas células somáticas como o fazem os gametas normais da espécie. O termo esporófito haplóide é no geral usado para designar esporófitos tendo o número de cromossomos gamético (Palmer e Keller, 2005a) e em um organismo diplóide este complemento é o mesmo como o número base (x).

Haplóides de plantas superiores podem ser distinguidos do seu equivalente diplóide em muitos modos. Mais obviamente da perspectiva de fenótipo, estes são usualmente menores na aparência, parcialmente por causa do seu tamanho de célula menor; em termos gerais, o volume de célula em 25 plantas está positivamente correlacionado ao nível de ploidia. Diversos métodos para a designação provisória do estado haplóide de uma planta explora esta relação. O mais amplamente usado destes métodos fenotípicos é a medição do comprimento das células sentinela estomatais e teor de cloroplasto nestas células (por exemplo, Sari et al., 1999 Stanys et al., 2006), embora nenhum dos prognosticadores fenotípicos de haploidia são absolutamente confiáveis. Métodos que forneçam medições diretas do tamanho do genoma fornecem um diagnóstico muito mais confiável do estado haplóide. Estes incluem a medição direta do número de cromossomos usando técnicas de contagem de cromossomos convencionais, e medição do teor de DNA usando microdensitometria (por exemplo, Zhang et al., 1999) ou mais especialmente, citometria de fluxo (Coba de Ia Pena e Brown, 2001; Bohanec, 2003; Eeckhaut et al., 2005). A última técnica também foi aplicada para caracterizar os estágios do ciclo celular em vários tecidos de material de dendezeiro, embora não para a detecção de plantas ou tecidos haplóides (Srisawat e Kanchanapoom 2005; Srisawat et al., 2005). Também é possível explorar a ausência absoluta de heterozigosidade em haplóides e haplóides duplicados para detectar tais plantas usando vários métodos de marcador molecular codominantemente herdado (por exemplo, Chani et al., 2000; Tang et al., 2006).

Haplóides podem ter valor intrínseco por causa da sua redução global no tamanho comparada com diplóides. Os haplóides também têm valor em possibilitar a isolação de mutantes, que pode ser mascarada em um diplóide, particularmente onde o alelo mutante não é funcional. Haplóides 20 também têm valor em programas de transformação. Se haplóides são transformados diretamente, então o desenvolvimento verdadeiro de plantas transgênicas diplóides pode ser produzida em uma etapa a seguir da duplicação dos cromossomos. Deve ser mencionado que uma ampla faixa de técnicas para a duplicação de cromossomos são conhecidas (Kasha, 2005 e 25 referências incorporadas neste) e estas técnicas, ou modificações das mesmas, são aplicáveis e relevantes no contexto desta invenção. Alguns estudos sobre o desenvolvimento de técnicas de duplicação de cromossomos em dendezeiro já foram relatadas e embora estes dados digam respeito à duplicação de material diplóide (para dar poliplóides), o protocolo descrito também terá utilidade para a duplicação de haplóide (Madon et al., 2005a).

Um uso importante de haplóides está fundamentada no fato de que melhorias acentuadas na economia do desenvolvimento de planta podem ser obtidas por intermédio da produção de haplóide duplicado, visto que a 5 seleção e outras eficiências procedurais podem ser acentuadamente melhoradas através do fornecimento de progênies do desenvolvimento verdadeira de elite (homozigotos) (Nei, 1963; Choo, 1981; Melchers, 1972; Hermsen e Ramanna, 1981; Snape, 1984). Com os sistemas de produção de haplóide duplicado, a homozigosidade é obtida em um desenvolvimento. 10 Assim, o criador pode eliminar os numeroso ciclos de procriação consangüínea que é usualmente necessária para se obter níveis práticos de homozigosidade pelos métodos convencionais. Na verdade, a homozigosidade absoluta para todos os traços não é obtenível pelos métodos de desenvolvimento convencionais. Consequentemente, uma tecnologia de 15 haplóide duplicado eficiente possibilitaria que os criadores reduzissem o tempo e o custo de cultivar o desenvolvimento em relação às práticas de desenvolvimento convencionais.

Os haplóides espontâneos podem ocorrer em muitas espécies de plantas, embora em baixas frequências. Para a espécie de cultivo perene 20 tropical de importância comercial o seguinte resumo é relevante: - dendezeiro (nada relatado de nenhuma fonte), borracha (nenhum haplóide espontâneo relatado, embora dois relatos de cultura de antera e ovário quotado na Tabela 3-1 de Maluszynski et al., 2003b, são Chen et al., 1988, Jayasree et al., 1999), cana de açúcar (nenhum haplóide espontâneo, embora mais uma vez dois 25 relatos quotados em Maluszynski et al., 2003b, são Liu et al., 1980, e Fitch e Moore 1996), café (relatos de haplóides espontâneos, por exemplo, Lashermes et al., 1994) algodão (muitos exemplos de haplóides espontâneos), cacau (relatos de haplóides espontâneos, Dublin 1972). É importante mencionar no contexto da corrente invenção que em nenhum dos casos onde haplóides espontâneos foram descritos foi subsequentemente possível acumular números significantes de haplóides ou haplóides duplicados que tivessem utilidade para a melhora de cultivo, em outras palavras eles são raros em ocorrência. Por esta razão, ênfase tem se voltado para meios alternativos 5 de gerar haplóides e haplóides duplicados. As plantas haplóides de várias outras espécies também têm sido criadas a seguir de várias manipulações de laboratório, incluindo partenogênese, androgênese, eliminação de cromossomo, e métodos com base em cultura de tecido, embora progresso tenha sido escasso para os cultivos perenes, particularmente espécies tropicais 10 que habitualmente cruzam de modo não consanguíneo.

A falta geral de progresso sobre haplóide e produção de haplóide duplicado em espécies lenhosas (Stettler e Howe, 1966) é devido principalmente à presente ênfase sobre os métodos de produção que envolvem uma fase in vitro; existem numerosos problemas associados com a intransigência geral de espécies lenhosas para crescer sob tais condições

Além de ter valor por si mesmos como novas variedades potenciais, plantas homozigotas também têm utilidade para o desenvolvimento de plantas híbridas Fi, onde os cruzamentos são feitos entre machos e fêmeas homozigóticos selecionados. Estas plantas Fi 20 frequentemente exibem o chamado vigor de híbrido (heterose), uma característica frequentemente associada com aumentos dramáticos em rendimento comparado com cada precursor, e primeiro descrito por Shull (1908). Além disso, a produção de híbridos Fi permitem que o criador produza quantidades grandes de semente que compreende de um único 25 genótipo de linhagens precursoras homozigóticas. Esta propriedade terá muitas vantagens em uma mistura geneticamente heterogênea de genótipos por causa do potencial para selecionar genótipos de elite únicos que produzem rendimentos altos e/ou possuem outras características desejáveis. Existe também potencial para se obter rendimentos mais altos pela seleção de genótipos para a adaptação aos ambientes específicos e otimizar práticas agronômicas e de controle. Em muitos cultivos, a única alternativa realística para produzir um genótipo único em quantidades comerciais é pela clonagem assexual. Existem métodos bem desenvolvidos de propagação vegetativa, 5 usando brotos, cortes ou enxertos para produzir clones para alguns cultivos (por exemplo, borracha, cacau e café) mas nem todas os cultivos (por exemplo, dendezeiro e coco).

De acordo com Hermsen e Ramanna (1981): - “Exatamente como nos auto-polinizadores, a aplicação de haploidia em cultivos diplóides 10 polinizados está fundamentada no uso de linhagens DH (Linhagens de Haplóide Duplicado). Entretanto, devido à depressão da procriação consangüínea (nota: indivíduos homozigotos de uma espécie normalmente que tipicamente cruzam de modo não consanguíneo exibem vigor reduzido e isto é conhecido como depressão da procriação consangüínea), estas linhagens 15 não podem ser usadas diretamente mas apenas como linhagens consanguíneas precursoras para a produção de variedades híbridas. Quando linhagens consanguíneas estão sendo desenvolvidas por intermédio de haplóides, todas as barreiras para a auto-polinização repetida, que são características de polinizadores naturais são desviadas, por exemplo, dioicidade, auto 20 incompatibilidade e períodos juvenis longos. A economia de tempo é particularmente evidente em cultivos bienais e em cultivos com um período juvenil longo. Apenas por intermédio da haploidia as linhagens consanguíneas podem ser desenvolvidas nestes cultivos.”

Como tais, as plantas haplóide (e plantas haplóide duplas) 25 revelam toda a sua informação genética ou, em outras palavras, o seu genótipo é completamente demonstrado pelo seu fenótipo. A resistência às pragas e doenças ou fatores externos desfavoráveis (seca, salinidade, toxicidade de metal pesado, etc) pode ser assim diretamente reconhecido e selecionado. As plantas haplóides permitem a detecção de mutantes que são incapazes de passar através das fases embrionárias. Por razões similares o tecido de planta haplóide constitui veículos ideais para a transformação genética, por quaisquer técnicas de manipulação de gene que sejam relevantes, para dar material geneticamente modificado que na duplicação dê versões homozigotas do gene ou genes introduzidos.

As aplicações agrícolas para os haplóides centraliza na sua capacidade para o desenvolvimento rápido de genótipos homozigotos depois da duplicação do cromossomo:

■ Tempo reduzido para o desenvolvimento de variedade, por exemplo, de 10 para 6 anos ou menos;

■ Linhagens recombinantes homozigotas podem ser desenvolvidas em um desenvolvimento ao invés de depois de numerosas gerações de retrocruzamento; e

■ Seleção quanto a traços recessivos em linhagens recombinantes é mais eficiente porque os alelos recessivos não são ‘mascarados’

pelos efeitos de alelos dominantes.

■ Introdução de genes “alienígenas” acelerada por permitir que os homozigotos sejam facilmente desenvolvidos.

O cruzamento de duas linhagens de elite homozigotas (tais 20 como podem ser produzidas pelos haplóides duplicados) pode gerar variedades ‘híbridas’ geneticamente uniformes, altamente heterozigotas, como é exemplificado pelas variedades de milho híbrido altamente bem sucedidas primeiro produzidas nos USA durante os idos de 1930. Não é surpresa que tenha havido muitos esforços para reproduzir o aumento de 25 rendimento obtido nas variedades de milho híbrido em outros cultivos, através do desenvolvimento de ‘linhagens híbridas’. Por exemplo, variedades híbridas Fi de girassol e beterraba açucareira são agora amplamente cultivadas em uma base comercial, e linhagens híbridas de colza (canola) e arroz estão se tomando crescentemente disponíveis; mais do que metade do arroz cultivado na China é ‘híbrido’, com rendimentos pelo menos 20 % mais altos do que o equivalente não híbrido. Até agora, não houve nenhum progresso correspondente com o que tem a produção mais alta de todos os cultivos de sementes oleaginosas, o dendezeiro; embora rendimentos de óleo de 4,8 a 7 5 t/ha sejam de 3 a 8 vezes maiores do que os outros cultivos de sementes oleaginosas (Wahid et al., 2004). Em toda a parte, o dendezeiro é a fonte principal do mundo de óleos e gorduras vegetais, em média com a soja (Abdullah, 2005) mas não obstante tem ainda que se beneficiar da liberação de variedades híbridas.

A falta de progresso para o desenvolvimento de variedades

híbridas para dendezeiro é principalmente porque o sistema de desenvolvimento dos cultivos impede a produção simples de linhagens consanguíneas. O dendezeiro é essencialmente uma espécie de desenvolvimento não consangüínea, nas diferente do milho em que uma flor 15 masculina e uma feminina são produzidas na mesma planta ao mesmo tempo, cada planta de dendezeiro produz ou flores masculinas ou femininas a qualquer tempo, e portanto uma palmeira pode ser facilmente auto-polinizada apenas pelos métodos de polinização controlada usando pólen armazenado. O progresso na conversão do dendezeiro em um cultivo híbrido, e deste modo a 20 exploração do vigor híbrido potencial, depende do desenvolvimento de um processo para a produção confiável de plantas homozigotas. Até agora, entretanto, não houve nenhum exemplo publicado de nenhum haplóide, ou planta de dendezeiro diplóide homozigota. Não obstante houve estudos de desenvolvimento extensivo (Wahid et al., 2004), cultura de célula (Abdullah 25 2005; Abdullah et al., 2005; Rival e Parveez, 2005; Te-chato et al., 2005), e transformação (Pedido US 20030159175) dirigidos para a melhora genética da cultivo de dendezeiro.

Duas espécies principais de planta de dendezeiro são comercialmente cultivadas: Elaeis oleifera Kunth e Elaeis guineensis Jacq. A última tem três sub-tipos: dura, tenera, e pisifera. A maioria dos cultivares ou grupos plantados são tenera, que produz fruta com teor de óleo mais alto. As tamareiras são uma família da espécie que compreende Phoenix dactilifera e outras espécies Phoenix que são capazes de procriar de forma cruzada dentro 5 da dactilifera.

Todas as sementes de dendezeiro correntemente usadas para plantações comerciais são produzidas a partir de precursores selecionados de populações geneticamente heterogêneas de palmeiras não homozigotas. A variação no nível de heterozigosidade precursora e na divergência genética 10 entre linhagens precursoras significa que existe segregação genética extensiva entre a descendência da semente resultante. Assim, as sementes produzidas a partir de cruzamentos de palmeira portanto não são geneticamente uniformes. Esta variação genética impede que a indústria do dendezeiro selecione genótipos específicos para o rendimento alto ou outros traços desejáveis.

O dendezeiro apenas tem um único ponto de crescimento, e

diferente de algumas outras espécies de palmeira, incluindo a tamareira, não produz brotos. Por estas razões, clones não podem ser produzidos pelos métodos padrão de propagação vegetativa. Entretanto, é possível produzir clones somáticos pela cultura de tecido, em que pedaços pequenos de tecido 20 (explantes) de folhas, inflorescências ou raízes são primeiro cultivados em meio nutriente especial. O tecido em crescimento pode depois formar calo (uma massa de células sem diferenciação), e este pode ser tratado para produzir tecido embrióide, que por si só lentamente se desenvolvem em brotos de planta. Entretanto, tais técnicas de cultura de tecido são no geral 25 difíceis e laboriosos para realizar, e a biologia subjacente é escassamente entendida. Além disso, também existe um risco de variação somaclonal, induzida pelo próprio processo de cultura de tecido e que tem levado a anormalidades fenotípicas (Corley et al., 1986) que pode resultar na perda completa de rendimento. Menção deve ser feita da reivindicação evidente por Maluszynski et al. (2003b, ver a Tabela 3-1) de que Texeira et al. (1994) já tivesse publicado um protocolo para a produção de haplóide duplicado em dendezeiro. Esta reivindicação é errônea. De fato, a última publicação 5 descreve a embriogênese somática de tecido floral diplóide, e não descreve a cultura de anteras ou outro tecido reprodutivo para produzir embriões e plantas haplóides.

O único trabalho relatado sobre outra espécie de palmeira inclui tentativas fracassadas para produzir haplóides de coco (Cocos nucifera) por intermédio da cultura de antera (Thanh-Tuyen e De Guzman, 1983a,b; Monfort, 1984, 1985; Thanh-Tuyen, 1985, 1990; Pannetier e Buffard-Morel, 1986; Griffis e Litz, 1997; Perera, 2002a,b, 2003, Perera et al. 2006), e tamareira (Phoenix dactilifera) (Brochard, 1981; Bouguedoura, 1991; Chaibi et al., 2002). Existe um relato de tentativas sobre a cultura de óvulo em coco (Coconut Research Board, 2002). Entretanto nenhuma planta haplóide foi produzida de qualquer um destes estudos in vitro. Entretanto, existe um único exemplo de uma plantinha de coco haplóide isolada de uma muda gêmea (Whitehead e Chapman, 1962), e evidências citológicas de um número de cromossomos do haplóide (n = 16) observado de um único embrião da mesma espécie. Existe também uma reivindicação de que o tratamento de inflorescências de tamareira fêmea não polinizada com progênie “apomítica” de haplóide duplo induzido pelo ácido giberélico (Ben Abdallah et al., 2001). Entretanto, nenhuma destas publicações descreve um método eficaz para produzir e selecionar haplóides espontâneos ou haplóides duplicados ou fornecem divulgação relevante para a produção de material haplóide ou homozigoto de dendezeiro.

O dendezeiro é uma monocotiledônea perene, com um período de desenvolvimento grande tal que a criação do cultivo é um processo muito lento; no geral levando aproximadamente 20 anos para se desenvolver e testar a progênie de um novo desenvolvimento de palmeiras para a produção de semente comercial. Não existem relatos de criadores que produzissem linhagens consanguíneas pela procriação consangüínea (oito gerações de autopolinização) por que isto levaria um mínimo biológico de 40 anos para se 5 obter por causa do tempo requerido para realizar cruzamentos (6 meses), processar a semente (3 meses), cultivar mudas em viveiro (12 meses), plantar as mudas no campo — as inflorescências masculina e feminina desenvolverse-ão depois de 18 a 24 meses, coleta de pólen & auto polinização das palmeiras e colher o cacho (24 a 30 meses). Correntemente, melhorias 10 genéticas de dendezeiro são principalmente realizadas por meios convencionais. Comparadas com outros cultivos que produzem óleo, que são predominantemente anuais, a introdução de novos traços no dendezeiro é um processo extremamente prolongado; o mesmo pode requerer entre 12 a 14 anos para melhorar ou para introduzir um traço no dendezeiro. Além do 15 período de desenvolvimento grande, o desenvolvimento de perenes tais como o dendezeiro requer áreas grandes para o desenvolvimento de traços e uma série extensa de retrocruzamentos demorados.

Assim, a falta de progresso com dendezeiro é principalmente porque o sistema de desenvolvimento do cultivo impede a produção simples 20 de linhagens consanguíneas. O dendezeiro é essencialmente uma espécie exogâmica, mas diferente do milho em que uma flor masculina e uma feminina são produzidas na mesma planta ao mesmo tempo, cada planta de dendezeiro produz ou flores masculinas ou femininas a qualquer tempo, e portanto uma árvore não pode ser facilmente auto-polinizada. O progresso na 25 conversão do dendezeiro a um cultivo híbrido, e desse modo a exploração do vigor híbrido potencial, depende do desenvolvimento de um processo para a produção confiável de plantas homozigotas.

Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um método para selecionar plantas de dendezeiro ou tamareira haplóides ou haplóides duplos úteis para a produção de semente, multiplicação e melhora de cultivo, o método compreendendo

(a) fornecer uma população de plantas de palmeira;

(b) escolher da população um subconjunto de plantas individuais de

fenótipo atípico;

(c) avaliar a heterozigosidade das plantas no subconjunto em uma prétriagem;

(d) avaliar o teor de DNA de plantas no subconjunto;

(e) descartar do subconjunto plantas encontradas para serem

heterozigotas;

(f) classificar as plantas remanescentes no subconjunto como haplóide ou diplóide de acordo com os resultados da etapa (e).

As etapas (c) e (d) podem ser feitas em qualquer ordem. Similarmente, a etapa (e) pode preceder ou seguir a etapa (d), embora não possa preceder a etapa (c) porque é dependente dos resultados obtidos nesta etapa.

Preferivelmente, as plantas classificadas na etapa (f) como diplóide são ainda avaliadas quanto a heterozigosidade usando múltiplos marcadores moleculares, aquelas encontradas para serem heterozigotas sendo descartadas e as remanescentes classificadas como haplóides duplicados.

Preferivelmente, a etapa (c) para avaliar a heterozigosidade do subconjunto selecionado usa marcadores moleculares ou bioquímicos, em particular entre 2 e 40, por exemplo entre 10 a 20 marcadores de microssatélite, embora números similares de marcadores usando um dos muitos sistemas de marcador com base nos Polimorfismos de Nucleotídeo

r _______

Unico (SNPs) também possam ser aplicados (por exemplo, análise de Fusão de Alta Resolução ou pirossequenciamento).

Preferivelmente, o fenótipo atípico é a morfologia de crescimento atípica ou padrão de crescimento que pode aparecer durante os estágios de semente germinada ou muda, ou mais tarde. Mais preferivelmente, a morfologia de crescimento atípica é um ou mais do crescimento de radícula reduzido, radícula alterada: razão de comprimento da plúmula, ângulo modificado da radícula:plúmula, cor alterada da radícula ou plúmula, forma ou tamanho de semente alterados durante a germinação; e razão largura:comprimento da radícula alterada. O fenótipo atípico de uma semente germinada também pode ser a germinação de dois embriões de uma única semente. A seleção também pode ser realizada em uma população de palmeiras que compreende palmeiras plantadas em viveiros ou nos campos, quando a morfologia de crescimento ou padrão de crescimento atípico por exemplo podem ser um ou mais de crescimento vegetativo mais lento, razão reduzida de largura para comprimento de folíolo, distância reduzida de intemodos de fronde, ângulo da fronde para o eixo da planta, cor da folha, e florescimento precoce.

Por “fenótipo atípico” é intencionado qualquer fenótipo aberrante exibido pelos haplóides e haplóides duplicados que cai fora da faixa fenotípica normal esperada para o material não haplóide (isto é, usualmente diplóide mas poliplóide para alguns cultivos). Os limites de confidência que 20 constituem ‘a faixa normal’ podem mudar de espécie para espécie mas os indivíduos atípicos ordinariamente representariam menos do que 1 % da população triada. Por exemplo, no dendezeiro, as mudas haplóide candidatas podem ser selecionadas da semente germinada exatamente depois que a plúmula e a radícula tenham se desenvolvido. A germinação começará depois 25 de cerca de 10 dias de incubação na sala de germinação. Grupos de mudas de dendezeiro germinando tipicamente exibem um caminho de desenvolvimento absolutamente síncrono e um fenótipo razoavelmente homogêneo (ver a Figura I). A semente germinada anormal pode desviar do fenótipo característico em um de muitos modos (ver a Figura 2) e pode incluir características incluindo aquelas como crescimento de radícula diversa como reduzida, razão de comprimento radícula:plúmula alterada, ângulo modificado de radícula:plúmula (tipicamente em tomo de 180° nos tipos normais), cor alterada da radícula ou plúmula, mudanças de forma ou tamanho da semente, 5 razão modificada de larguraicomprimento da radícula e germinação de dois embriões a partir de uma única semente (mudas gêmeas). Um elemento chave de inovação aqui imputa na natureza reiterativa lógica da seleção de características que são usadas na definição de atípico. Além disso, visto que o número de haplóides identificados aumenta, métodos de ordenação são usados 10 para identificar aqueles traços que são os mais importantes na discriminação do conjunto atípico e estes são usados para redefinir o critério de pesquisa. Este processo progressivamente melhorará a precisão da triagem fenotípica visto que os números crescentes de haplóides realçam a força estatística e visto que os traços não informativos são descartados de consideração, e 15 continuarão até que não haja nenhum outro aumento na frequência de haplóide. Consequentemente, é uma característica da invenção usar como o fenótipo atípico pelos quais as plantas são selecionadas um ou mais fenótipos atípicos mostrados de testes anteriores para correlacionar com o caráter haplóide ou di-haplóide.

Preferivelmente, a etapa de avaliar ainda mais a

homozigosidade de uma planta selecionada, por exemplo, uma muda germinada, usando múltiplos marcadores moleculares compreende usando entre 50 e 200, por exemplo entre 70 e 120, marcadores de microssatélite. Mais preferivelmente, esta etapa é realizada com uma amostra reunida de 25 marcadores. Uma planta selecionada é identificada como um haplóide duplo se ela for homozigota para todos os marcadores moleculares usados.

Preferivelmente, a população de plantas compreende pelo menos 1.000.000 de indivíduos. Mais preferivelmente, a população de plantas compreende entre 5.000.000 e 20.000.000 de indivíduos. Ainda mais preferivelmente, a população de plantas individuais germinadas é uma população de sementes ou mudas germinadas.

Por “fornecer sementes ou mudas germinadas” é intencionado qualquer processo por meio do qual sementes, brotos e mudas começam a crescer. No caso de dendezeiro, isto inclui tanto as técnicas de germinação habitualmente usadas pelas unidades de produção de semente comerciais e de desenvolvimento de plantas: o método de calor úmido e o método do calor seco. O primeiro método é agora menos usado: o processo inteiro pode ser mais curto (95 dias contra 120 dias para o calor seco), mas alguma germinação ocorrerá durante o período de aquecimento e assim um conjunto menos uniforme de mudas será produzido. A semente do dendezeiro está dormente quando é colhida, e sob condições naturais germina esporadicamente em vários anos. A exigência crítica para quebrar a dormência é manter a semente em uma temperatura elevada de 39 a 40 0C por até 80 dias.

A natureza do sistema de marcador usado ou a ordem em que os elementos ou atividades são aplicadas no acima podem ser ajustadas de acordo com as circunstâncias.

O uso de marcadores, preferivelmente marcadores moleculares 20 codominantes, possibilita a identificação de indivíduos haplóides hemizigotos e diplóides homozigotos. Haplóides e haplóides duplicados têm apenas um alelo para todos os locais dentro dos seus genomas nucleares. Portanto, qualquer indivíduo que exiba dois alelos para qualquer local pode ser descartado como uma planta haplóide ou haplóide dupla potencial. É 25 preferido de acordo com a nossa invenção fornecer uma pré triagem de custo baixo para descartar números grandes de falsos candidatos e uma caracterização de genoma de alta resolução (ver abaixo) para confirmar o estado haplóide ou haplóide duplo a seguir da avaliação do teor de DNA (por exemplo, pela citometria de fluxo, ver abaixo). A citometria de fluxo é usada para avaliar o teor de genoma de células vegetais ou animais, e pode ser usado para distinguir entre material diplóide e haplóide. Pela “citometria de fluxo” é intencionado qualquer método para contar, examinar e classificar analito colocado em suspensão em 5 uma corrente de fluido. Isto possibilita a análise multiparamétrica simultânea das características desejadas de células únicas que fluem através de um aparelho de detecção óptica ou eletrônica. Nesta etapa, portanto, a citometria de fluxo é aplicada aos indivíduos que exibem um fenótipo anormal e também altos níveis de homozigosidade (identificados nas etapas b e c) para distinguir 10 entre os haplóides e diplóides. Assim, plantas haplóides são primeiro identificadas na conclusão desta etapa.

Uma avaliação molecular mais compreensiva de heterozigosidade genômica é usada para fornecer confirmação genética da identidade de plantas haplóides e também identifica indivíduos que são 15 diplóide e são derivadas da duplicação do cromossomo de indivíduos haplóides (também conhecidos como plantas haplóides duplicadas). Em ambos os casos, a avaliação é com base no fato de que os haplóides e haplóides duplicados serão completamente hemizigotas e homozigotos respectivamente. Preferivelmente, marcadores de microssatélite são usados 20 para este propósito, embora muitos outros sistemas de marcador poderiam ser igualmente usados. Por estes meios o estado de haplóides é confirmado e as plantas haplóides duplicadas identificadas.

A novidade neste método reside parcialmente na natureza reiterativa da triagem fenotípica e o uso do método de ligação-clonagem para 25 gerar números grandes de marcadores para confirmar o estado haplóide mas também na combinação de etapas para criar um método que sistematicamente identifique haplóides raros no meio de uma população grande de sementes que são o produto de um cruzamento sexual, que foi previamente considerado impraticável. De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido uma planta selecionada pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um método para produzir uma planta de dendezeiro haplóide duplicada homozigota, o método compreendendo:

(a) selecionar uma planta de dendezeiro haplóide usando um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção;

(b) obter uma planta de dendezeiro haplóide duplicada através da duplicação do cromossomo espontânea; ou pela duplicação do número de

cromossomos pela aplicação de um estímulo externo à planta haplóide; ou pela aplicação de um estímulo externo a uma célula ou células isoladas da planta haplóide, seguido pela regeneração de uma planta usando cultura de tecido; ou pela polinização ou clonagem da planta haplóide, ou pela auto15 polinização da planta haplóide pela exploração do número de cromossomos espontaneamente duplicado ocasional em células reprodutivas masculinas e femininas.

De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um método para produzir um híbrido F1 diplóide de dendezeiro, o método compreendendo:

(a) selecionar pelo menos duas plantas de dendezeiro haplóides duplos homozigotas usando um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção; ou obter pelo menos duas plantas de dendezeiro haplóides duplos homozigotas usando um método de acordo com o terceiro

ou oitavo aspecto da invenção;

(b) usando duas plantas de dendezeiro haplóides duplos homozigotas geneticamente diferentes identificadas acima e cruzando as mesmas sexualmente para produzir descendência híbrida Fi geneticamente uniforme. De acordo com um quinto aspecto da invenção, é fornecido uma planta de dendezeiro produzida pelo método de acordo com o terceiro e quarto aspectos da invenção.

De acordo com um sexto aspecto da invenção, é fornecido uma planta de dendezeiro haplóide.

De acordo com um sétimo aspecto da invenção, é fornecido uma planta de dendezeiro haplóide duplo homozigota.

A incorporação de fenótipo atípico no método descrito acima favorece a seleção de plantas haplóides em relação às plantas haplóides

duplicadas visto que os exemplos de elite da última podem realmente exibir um fenótipo normal. Por esta razão, nós também fornecemos um segundo método que preferencialmente seleciona a descendência de haplóide duplo do mesmo material de partida. Este é um método geral que tem aplicação tanto para dendezeiro e tamareira quanto para outros cultivos.

Assim, de acordo com um oitavo aspecto da invenção, também

é fornecido um método para identificar plantas haplóides duplicadas entre a progênie de um único precursor materno, o método compreendendo:

(a) identificar pelo menos 20 locais não ligados heterozigotos no precursor materno, preferivelmente usando marcadores moleculares

codominantes tais como marcadores com base em microssatélites ou SNP

(b) realizar uma triagem preliminar usando 1 a 5 dos marcadores selecionados; descartando heterozigotos; retendo o remanescente como haplóides duplicados candidatos

(c) aplicar a citometria de fluxo aos candidatos retidos;

descartar os haplóides; reter os diplóides como haplóides duplicados

potenciais

(d) aplicar pelo menos mais 15 dos marcadores remanescentes aos candidatos retidos, e classificar indivíduos que são diplóide e homozigotos para todos os marcadores aplicados como haplóides duplicados ΛΛ (a probabilidade disto ocorrer pela classificação independente é de 2 = 1/1.048.576: mais baixo, se mais do que 20 marcadores são usados)

Nós não estamos cientes de nenhum estudo que tenha por objetivo selecionar plantas haplóide duplicado, absolutamente homozigotas entre a descendência sexual que incorpora a caracterização anterior do precursor materno e seleção de um número fixo de locais heterozigotos não ligados como uma base para a triagem subsequente. Esta etapa permite a padronização entre experimentos, genótipos e espécie visto que embora os marcadores usados possam ser diferentes, a força de análise permanece a mesma (neste caso um 1/1.048.576 de descobrir um único homozigoto diplóide falso positivo conferiu tal pela classificação independente). Esta etapa do segundo método é portanto nova, como é a montagem de etapas para criar o método.

Programas de desenvolvimento de dendezeiro comerciais e governamentais não investiram em programas de pesquisa para identificar genótipos haplóides a despeito do valor inerente de haplóides (ou diretamente haplóides duplicados) para produzir linhagens de desenvolvimento verdadeiro precursoras e assim híbridos Ft. A descoberta de um processo para obter haplóides em qualquer cultivo tem o potencial para transformar a taxa de progresso de desenvolvimento porque estratégias de desenvolvimento bem avançadas e provadas podem ser adotadas a partir dos cultivos mundiais de cereal por exemplo, arroz, trigo, milho etc. Além disso, material de plantio comercial geneticamente homogêneo pode ser produzido que aumenta ainda mais o valor pela seleção de cruzamentos híbridos Fi específicos para as localizações particulares, práticas de controle, ou que têm certos traços selecionados.

Ao contrário a indústria de dendezeiro nos últimos trinta anos tem investido milhões de dólares na produção de clones de dendezeiro pela embriogênese somática. Isto é não obstante o problema principal com as anormalidades de florescimento que pode resultar em rendimento de cacho zero e a falha dos pesquisadores para entender completamente os mecanismos biológicos subjacentes que causam anormalidade de florescimento (este é amplamente assumido ser um fenômeno ‘epigenético’: uma modificação da 5 expressão de gene, que passa de um desenvolvimento de célula para o seguinte). A despeito destas dificuldades a indústria do dendezeiro tem ficado comprometida com novos investimentos em técnicas de clonagem de dendezeiro para produzir plantas superiores geneticamente uniformes. É portanto surpreendente que até agora um processo não foi desenvolvido para 10 triar quanto aos haplóides e haplóides duplos espontâneos que evitariam estes problemas. Nós estamos cientes de tentativas anteriores não publicadas pelas estações de pesquisa de dendezeiro da Malásia para triar mudas no viveiro quanto a haplóides mas sem nenhum sucesso aparente.

Descrição Resumida das Figuras De modo que a presente invenção possa ser totalmente

entendida e facilmente colocada em efeito prático, será agora descrita por intermédio de exemplos não limitantes apenas as formas de realização preferidas da presente invenção, a descrição sendo com referência às figuras ilustrativas anexas.

Nas figuras:

A Figura 1 mostra mudas normais depois da germinação;

A Figura 2 mostra mudas anormais depois da germinação;

A Figura 3 mostra mudas depois da transferência para um

viveiro;

A Figura 4A mostra um exemplo de gel usado para identificar

indivíduos que são homozigotos (uma faixa) e heterozigotos (duas faixas) para um marcador selecionado;

A Figura 4B é um diagrama de fluxo mostrando uma triagem hierárquica para identificar plantas homozigotas; A Figura 5 mostra um histograma de citometria de fluxo representativo de amostras de um genótipo diplóide (a) e um haplóide (b);

A Figura 6 é uma Tabela mostrando precursores de haplóides

confirmados;

A Figura 7A mostra haplóides e planta diplóide heterozigota correspondente;

A Figura 7B mostra imagens de um dendezeiro heterozigoto diplóide típico (fundo) e dois haplóides duplicados (topo) semeados no mesmo dia.

A Figura 8 mostra o teor de DNA de haplóide e plantas diplóides como medido usando citometria de fluxo.

A Figura 9 mostra uma fotografia de gel mostrando o uso de marcadores moleculares para identificar haplóides/diplóides homozigotos (uma faixa) de diplóides heterozigotos (duas faixas).

A Figura 10 mostra haplóide confirmado 50-03060260_0002 com primeira inflorescência dois anos e sete meses depois do plantio (esquerda fotografia de inflorescência e direita fotografia de muda haplóide).

A Figura 11 é uma fotomicrografia de células de um dendezeiro haplóide de acordo com a invenção.

Definições

As seguintes são definições de palavras usadas no relatório descritivo e reivindicações:

“planta” inclui plantas inteiras em qualquer estágio de desenvolvimento, por exemplo sementes, sementes germinadas, mudas, palmeiras em viveiro e plantada no campo; e progênie da mesma.

“haplóide” significa qualquer célula contendo o número de cromossomos gamético, ou qualquer tecido ou planta que compreenda tais células.

“homozigotos” caracteriza qualquer célula contendo dois ou mais conjuntos idênticos de cromossomos, ou qualquer tecido ou planta composta de tais células

“plantinha” significa qualquer planta pequena que não está totalmente desenvolvida.

Origem dos materiais usados

O germoplasma de dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq) usado nos experimentos a seguir foi obtido na Indonésia (Sumatra) onde o primeiro estágio dos procedimentos (seleção de material de fenótipo atípico) foi realizado. A origem histórica do dendezeiro (Elaeis guineensis) é reconhecida

r

ser a Afirica Ocidental, onde o mesmo foi cultivado por muitos anos: a espécie

r

foi introduzida da Africa Ocidental para a região do Pacífico na primeira metade do último século, desde então foi amplamente cultivado por toda esta região.

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

Exemplo

0 seguinte exemplo é apresentado para ilustrar ainda mais e explicar a presente invenção e não deve ser interpretado como limitante em nenhum aspecto. Este mostra a aplicação da invenção ao dendezeiro: mas é similarmente aplicável à tamareira.

Todas as referências aqui mencionadas são por meio deste incorporados por referência.

(1 a) Processamento de semente

1 O mesocarpo foi mecanicamente removido das sementes de dendezeiro e as sementes foram secadas ao ar por 24 horas na temperatura ambiente e depois por 24 horas em um ambiente com ar condicionado a 25 0C a um teor de umidade de semente de 15 a 18 %. As sementes foram depois armazenadas, usualmente por um a três meses em um ambiente com ar condicionado (25 °C) em sacos plásticos ou bandejas (embora seja possível armazenar sementes por até um ano deste modo). 2 As sementes foram embebidas por três dias para aumentar seu teor de umidade para 18 a 20 % e depois tratada por calor em sacos plásticos ou bandejas por 40 a 60 dias de 38 a 40 °C.

3 Depois de aquecer, as sementes foram embebidas por cinco dias para elevar seu teor de umidade para > 22 % e depois secado na

temperatura ambiente por aproximadamente quatro horas

4 As sementes foram transferidas para um ambiente de germinação onde sob temperatura ambiente a germinação usualmente começa depois de 7 a 10 dias e continua por dois a três meses.

(Ib) Triagem morfológica

Houve duas triagens morfológicas em larga escala de mudas de dendezeiro quanto a tipos morfológicos mais distantes. A primeira consistiu de 10.900.000 sementes germinadas, das quais 3.854 foram identificadas como sendo morfologicamente aberrante (3.801) ou sementes 15 gêmeas (53), com os indivíduos remanescentes todos sendo julgados ‘normais’ (ver as Figuras 1 e 2 para exemplos de ambos os tipos). Assim, neste caso 99,96 % das sementes avaliadas foram classificadas como exibindo um fenótipo normal e 0,035 % sendo aberrante. Na segunda triagem, aproximadamente 10.000.000 de mudas comerciais foram triadas, juntas com 20 aproximadamente 1.000.000 de mudas tiradas dos experimentos de desenvolvimento. Este teste gerou 5.704 candidatos morfológicos, dos quais 5.601 foram fenotipicamente anormais e 103 foram de semente gêmea. Nesta triagem, portanto, 99,95 % das mudas foram classificadas como normais e

0,05 % como aberrante antes da transferência para o viveiro (Figura 3).

(Tc) Pré-triagem molecular

Pré-triagem molecular para excluir indivíduos heterozigotos.

O protocolo aplicado para realizar uma pré-triagem molecular de mudas que mostram fenótipos anormais para descartar heterozigotos compreendeu os seguintes estágios: 1. Extração do DNA

2. Amplificação de marcadores de microssatélite pela PCR

3. Separação de produtos da PCR pela eletroforese em gel de

agarose

4. Contagem de resultados para descartar indivíduos com um

ou mais locais heterozigotos

Cada estágio é descrito abaixo:

1. Extração de DNA

Em tomo de 0,5 cm da radícula (em tomo de 50 mg) foi removido da muda e usado para extrair DNA usando o kit de extração Qiagen 96 DNeasy de acordo com as instruções do fabricante como descrito abaixo, embora outros sistemas para a extração de DNA também poderiam ser usados.

A. PREPARAÇÃO

I. Para kits novos, adicionar etanol a 100 % ao tampão AP3/E

e tampão AW

2. Ajustar a água do banho a 65 0C

3. Pré-aquecer AE e o tampão API a 65 0C

4. Se o tampão API tem uma aparência turva, aquecer a 65 0C e agitar até que a solução se tome clara

B. PROTOCOLO

1. Adicionar 50 mg de material vegetal em cada tubo em duas prateleiras de microtubo de coleta. Reter a tampa clara.

2. Adicionar uma pérola de carbeto de tungstênio em cada

microtubo.

3. Preparar a solução de lise: (400 μΐ APl + 1 μΐ de RNAse +

1 μΐ de Reagente DX)/reação mais 15 % de cada componente.

4. Romper a amostra usando MM 300, 30 Hz por 1,5 minuto.

5. Pulsar a centrifuga a 3000 rpm. 6. Remover e descartar as tampas, adicionar 130 μΐ de tampão AP2 em cada microtubo de coleta.

7. Fechar os microtubos com novas tampas. Colocar uma tampa clara (da etapa 1) sobre a placa de 96 reservatórios. Agitar a placa

vigorosamente por 15 s. Pulsar a centrífuga a 3000 rpm.

8. Incubar as prateleiras por 10 min a -20 °C.

9. Remover e descartar as tampas. Transferir 400 μΐ de cada sobrenadante para uma nova placa de microtubos de coleta (fornecido). Não transferir as pelotas e as partículas flutuantes. Manter as tiras e usar a

velocidade de pipeta mais baixa. Recuperar as pérolas de tungstênio.

10. Adicionar 1,5 volume (tipicamente 600 μΐ) de tampão

AP3/E.

11. Fechar os microtubos com tampas novas e misturar

vigorosamente.

12. Pulsar a centrífuga (3000 rpm) para coletar a solução).

13. Colocar a placa de 96 reservatórios no topo de S-Blocks

fornecidos.

14. Transferir 1 ml de amostra em cada reservatório da placa de 96 reservatórios.

15. Selar com folha de Airpore Tape e centrifugar por 4 min a

6000 rpm.

16. Adicionar 800 μΐ de Tampão AW a cada amostra.

17. Centrífuga por 15 min a 6000 rpm.

18. Adicionar 100 μΐ de tampão AE a cada amostra e selar com novas folhas de AirPore.

19. Incubar por 1 min na temperatura ambiente (15 a 25 °C).

20. Centrifugar por 2 min a 6000 rpm.

2. Amplificação de marcadores de microssatélite pela PCR Iniciadores Os seguintes marcadores de microssatélite foram usados:

Iniciador direto Iniciador inverso Marcador GAGATTACAAAGTCCAAACC TCAAAATTAAGAAAGTAT GC ; 1 (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 16) Marcador ACGCATGCAGCTAGCTTTT C CGCGTGAAAGATATGAAT CAAC 2 (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 17) 3 CACGCACGCAGTTTATTCTT GGATGTATGCTTTACCTCCGAAT (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 18) Marcador CCCCTIT TGCTTCCCTAITr CTCCTTTT CCCCATCACAGA 4 (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 19) Marcador GACACAAGCAAAAACAAAAGC ATTCTGAAAGGAGGGGGAAA 5 A (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 20) Marcador ATATGTGTGGGTGTGCGTGT TGCCTCTGGTTGTTAGTCTGG 6 (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 21) Marcador TCTCTCTCTCTCTCTCTATGTG TGGCAAT CAGCACACATTCT 7 TGTGT (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 22) Marcador GCAG CT CTTTCCACACCTCT TGTGGTCTCCTGAGGAAGATG 8 (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 23) Marcador TTTTCCCCATCACAGAATTG CCCCTITIGCTTCCCTATTT 9 (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 24) Marcador TAGCCGCACTCCCACGAAGC CCAGAATCATCAGACTCGGACA 10 (SEQ ID NO: 10) G (SEQ ID NO: 25) Marcador AGCTCTCATGCAAGTAAC TTCAACATACCGTCTGTA 11 (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 26) Marcador CCTTCAAGCAÁAGATACC GGCACCAAACACAGTAA 12 (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 27) Marcador GTAGCTTGAACCTGAAA AGAACCACCGGAGTTAC 13 (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 28) Marcador GC TCGlT I n GTTTAGGTGA TTf I CI CCAi AGTCCG Π AC 14 (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 29) Marcador CC rCGGGTTA I CCTTTT IACC T GGCT GGCTTCGGTCTTAG 15 (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 30) Nota: Os Marcadores de 10 a 15 foram obtidos de Billotte et al

(2005)

5

Misturas de Reação

Em todos os casos, 10 μΐ de uma mistura de reação de PCR conteve os seguintes reagentes; 1,0 μΐ de IOx tampão de PCR (Bioline), 0,3 μΐ de MgCl2 (10 mM), 0,4 μΐ de dNTPs (10 mM de cada um), 0,2 μΐ de cada par de iniciador (10 μΜ), 1 a 5 ng de DNA (extraído como acima) e I U de Taq DNA polimerase (5 U 1,11'1 Bioline).

Condições de PCR

As seguintes condições foram usadas para a Reação da Cadeia da Polimerase para todos os marcadores de microssatélite: uma etapa de desnaturação inicial a 94 0C por 2 min seguida por 35 ciclos de; 94 0C por 30 s, 52 0C por 30 s e 72 0C por 45 s, com uma etapa de extensão final de 72 0C por 7 min.

3. Separação de produtos da PCR pela eletroforese em gel de

agarose

A eletroforese em gel de agarose e o tingimento com brometo de etídio foram rotineiramente usados para fracionar e visualizar produtos gerados pela PCR microssatélite.

(1) Reagentes

Tampão de condução de TBE: 0,089 M de base Tris, 0,089 M de ácido

bórico (pH 8,3) e 2 mM de Na2EDTA Tampão de carregamento: 0,23 % (p/v) azul de bromofenol

60 mM

EDTA

40 % (p/v) de sacarose

Mancha de Brometo de etídio: 1 % (p/v) de brometo de

etídio

Ladder 100 pb (Gibco Life Science BRL)

(1) Preparação e carregamento do gel

1,0 a 1,5 % (p/v) de agarose (foi preparada em 1 x tampão TBE e submetido ao aquecimento em um microondas (700 W) por 2x1 min na potência máxima para criar uma solução em gel. A solução em gel foi esfriada até aproximadamente 55 0C antes da adição de brometo de etídio (3,5 μΐ por 100 ml de gel). As extremidades de um dispositivo de bandeja de gel adequado (bandeja de gel média para 100 ml de gel, bandeja de gel maxi para 5 250 ml de gel) foram seladas com fita de mascaramento e um número e tipo apropriado de pentes colocados em posição. Os pentes com 16 x 20 μΐ reservatórios foram mais frequentemente utilizados. A solução de gel foi cuidadosamente vertida na bandeja preparada e deixada esfriar por pelo menos 20 min. Os pentes e a fita foram depois removidos e a bandeja de gel 10 submergida em um tanque contendo 1 x tampão TBE.

No geral, 5 μΐ de amostra foram misturados com 2 μΐ de tampão de azul de bromofenol antes da carga. O tampão de carga serve para duas funções: primeiro, ele aumenta a gravidade específica da amostra prevenindo deste modo a difusão de DNA do topo do reservatório no tampão 15 circundante, e segundo, ele indica o progresso do produto conforme ele migra através do gel pela eletroforese (o pigmento azul migra aproximadamente na mesma posição como os fragmentos de DNA 200 pb no comprimento). Para estimar o tamanho dos amplicons, 4 μΐ de Ladder de 100 pb da Gibco (Gibco Life Science BRL) foram carregados junto com as amostras analisadas.

A eletroforese de gel média (100 ml) foi realizada a 120 Volts

em IX tampão de TBE por aproximadamente 1 hora. A seguir da eletroforese, os géis foram removidos do dispositivo e pós-tingidos em de solução aquosa a 5 mg/l de brometo de etídio por 40 min, destingido em água destilada por 2 min e depois visualizado sob Iluminação Ultra Violeta usando um UVP Bio25 Doc-system. As imagens dos géis foram capturados pelo UVP Bio-Doc system como formato jpeg e usadas para a contagem.

4. Contagem dos resultados para descartar indivíduos com um ou mais locais heterozigotos

Os produtos de PCR gerados por cada combinação de microssatélite-genótipo foram avaliados quanto a presença de uma ou duas faixas distintas depois do fracionamento pela eletroforese em gel de agarose (estágios 1 a 3 acima). Qualquer genótipo que produziu dois produtos para qualquer um dos locais de microssatélite foi julgado ser heterozigoto e assim 5 descartado como um possível planta haplóide ou haplóide duplicado candidata. Os indivíduos remanescentes foram enviados adiante para a etapa

(d) do fluxo de fornecimento (citometria de fluxo)

Resultados

Houve mais do que 2000 mudas fenotipicamente anormais identificadas a partir das duas triagens morfológicas descritas acima que foram aleatoriamente selecionadas para a triagem molecular. Além disso, houve um adicional de 150 indivíduos com o fenótipo normal. Houve também

24 clones tenera diplóides usados como controles (todos heterozigotos diplóides).

Quando estes foram triados usando até 15 dos marcadores de

microssatélite (1 a 15), 117 genótipos (ver Tabela na seção de citometria de fluxo para os códigos de identificação) exibiram um único alelo para todos os locais (um exemplo é mostrado na Figura 4, usando o marcador 09) e assim foram julgados ser altamente homozigotos.

Consequentemente, estes indivíduos foram considerados como

haplóides/haplóides duplicados candidatos e avançaram para a etapa d (citometria de fluxo).

A Figura 4 mostra perfis de faixa gerados pelo marcador 09 através de 25 genótipos de dendezeiro. Indivíduos mostrando dois alelos (marcados 2’) foram descartados da triagem.

(Id) Avaliação do teor de genoma nuclear pela citometria de

fluxo

Citometria de fluxo

Indivíduos identificados como morfologicamente anormais e altamente homozigotos (estágios b e c) foram submetidos à citometria de fluxo para estabelecer o seu nível de ploidia usando os seguintes protocolos. Preparação de Amostra

Os núcleos de célula foram isolados do material vegetal fresco (folhas ou raízes), picando-se o material vegetal (uns poucos cm2 /20 a 50 mg)) com uma lâmina de barbear afiada em um tampão gelado, em uma placa de petri plástica. O tampão de DNA (armazenado a 4 °C) é fundamentado em: Arumuganathan, K. e Earle, E. D. Estimation of Nuclear DNA Content of Plants by Flow Cytometry. Plant Molecular Biology Repórter, Vol 9(3) 1991, Páginas 229-233.

Hepes 5 mM

10 mM de Sulfato de Magnésio heptaidratado 50 mM de Cloreto de Potássio 0,2 % de Triton X-IOO 2 % de DTT (Ditiotreitol)

2 mg/litro de DAPI pH 8

DAPI, um corante fluorescente que seletivamente se liga para formar um complexo com DNA de filamento duplo e dá um produto que 20 fluoresce a 465 nm, foi introduzido na solução. DAPI tem propriedades de ligação ao DNA específicas, com preferência para seqüências ricas em adenina-timina (AT). Depois de picar, o tampão (cerca de 2 ml), contendo os constituintes celulares e o restante do tecido grande, é passado através de um filtro de náilon de malha de 40 micrômetros. Este método produzirá milhares 25 de núcleos a partir de um pedaço de folha de uns poucos cm .

A solução contendo núcleos tingidos foi passada através do citômetro de fluxo. Controles são requeridos de ploidia conhecida (teor de DNA) como referência - para o dendezeiro, tecido de palmeiras tenera diplóides foram usados porque a espessura da casca deve ser heterozigoto e portanto a palmeira não pode ser haplóide.

A fluorescência dos núcleos tingidos, passando através do foco de um feixe de luz de uma lâmpada de mercúrio de alta pressão, foi medida por um fotomultiplicador e convertido em pulsos de voltagem.

Estes pulsos de voltagem foram eletronicamente processados

para produzir sinais integrais e de pico que podem ser processados por um computador. Quando as amostras são conduzidas com os ajustes de filtração apropriados para excitação e emissão, histogramas de DNA podem ser produzidos.

Material

Citômetro de Fluxo: CyFlow ML (Partec GmbH, Otto Hahnstrasse 32, D-4400 Munster, Alemanha) com uma lâmpada de mercúrio de alta pressão, OSRAM HBO 100 vida longa. Objetiva: 40 x N.A. 0,8 ar (Partec)

Combinação de filtro com DAPI:

Filtro de proteção térmica KG-I Filtros de Excitação: UG-I e BG-38.

Espelhos Dicróicos: TK 420 e TK 560.

Filtro de emissão: GG 435 Software: Flomax versão 2.4 d (Partec)

Resultados

Dos 117 genótipos identificados como altamente homozigotos na etapa c, 83 foram identificados como haplóide pela citometria de fluxo, com 34 indivíduos remanescentes sendo diplóides (ver a Tabela 1 abaixo)

Tabela 1. Nível de ploidia (x ou 2x; haplóide ou diplóide) de clones homozigotos identificados usando marcadores de 1 a 15

Candidato Código da amostra de Σ Iniciadores Resultados da DNA usados na citometria de triagem fluxo 50-Mix5-7 11260406301 9 Inieiador X 50-03060367C 07280501801 15 Inieiador X 50-03060260C-2 07280501901 15 Inieiador X 53-03080954C-2 09270500101 10 Iniciador X 53-03090761C-5 09280504501 10 Iniciador X BATCH 51 ;03060318C;I 060728 0010 01 a 15 Iniciador X BATCH 53;03090761C;5 060728 0018 01 a 15 Inieiador X 0623/172;05095508C;l 060728 0021 Ola 15 Inieiador X BATCH 50;03060260C;2 060728 0027 01 a 15 Inieiador X 0611/32;05050248C;1 060728 0032 01 a 15 Inieiador X 0611/16,05050228C;1 060728 0034 01 a 15 Inieiador X BATCH 53;03080954C;2 060728 0035 01 a 15 Iniciador X 06412;04059061B;3 060728 0050 01 a 14 Iniciador 2x 0628/152;05100720C;1 060729 0021 01 a 15 Inieiador X 0628/185;0510035IC ; 1 060729 0063 01 a 15 Iniciador X BATCH 51;03060626C;1 060729 0127 02 a 15 Inieiador X BATCH 67;0409034MC;2 060729 0130 02 a 14 Inieiador 2x BATCH 67;0409034MC;4 060729 0131 02 a 15 Inieiador 2x BATCH 67;0409034MC;15 060729 0132 02a 15 Inieiador 2x BATCH 65;0409034MC;7 060729 0134 02 a 15 Inieiador 2x BATCH 65;0409034MC;35 060729 0138 02 a 15 Inieiador 2x BATCH 65;0409034MC;56 060729 0139 02 a 15 Inieiador 2x BATCH 65;0409034MC;50 060729 0141 02a 15 Inieiador 2x BATCH 65;0409034MC;47 060729 0142 02 a 15 Inieiador 2x 0628/53;05090595C;l 060731 0043 01 a 15 Inieiador X 0627/125;05090717C;2 060731 0065 01 a 15 Inieiador X 0627/12;05080220C;1 060731 0080 01 a 15 Inieiador X 0627/6;05080095C;l 060731 0086 01 a 14 Inieiador X 063 l/Normal;05039033B;31 060731 0265 01 a 14 Inieiador X 64-0409021MC-34 02130604301 15 Inieiador 2x 64-0410040MC-1 02130604801 15 Inieiador 2 x 51-03060626C 02130605301 15 iniciador X 64-0410040MC-20 02140600401 15 iniciador 2x 64-0410040MC-16 02140600801 15 iniciador 2x 65-0409021 MC-2 02140601001 15 iniciador 2x 06 412B-04059061 B-3 02170605501 15 Iniciador 2x 06 412B-04129091B 02170605801 15 Iniciador 2x 0550-15/05010827C 02200602401 15 Iniciador X 0550-17/05010442C-1 02200602601 15 Iniciador X 0550-23/05020059C 02200603101 15 Iniciador X 0550-33/05020568C 02200603401 15 Iniciador X 0550-36/05020420C-2 02200603701 15 Iniciador X 0550-40/05010880C 02200607501 14 Iniciador X 0551-36/0502051IC 02200607601 15 Iniciador X 0551-32/0502036IC-I 02210600401 15 Iniciador X 0552-4/0501083 6C-2 02210600901 15 Iniciador X 0552-3 8/0502050IC 02210603101 14 Iniciador X 0552-39/05020415C 02210603201 15 Iniciador X 0552-31/05020858C 02210603701 15 Iniciador X 0552-91/05020375C 02210603901 15 Iniciador X 0552-111/05020626C 02210607201 15 Iniciador 0552-128/05020558C-1 02210607701 15 Iniciador X 0601-35/05020946C 02210608201 15 Iniciador X 0601-42/05030201C-6 02210609501 15 Iniciador X 0601-51/05030224C-2 02220600201 15 Iniciador X 0607-21/05040317C-3 02220601801 14 Iniciador X 0606-32/05040240C 02220606201 13 Iniciador X 0601-77/05020961C 02230600701 15 Iniciador X 0601-62/05030147C 02230601401 15 Iniciador X 0601 -54/05 03 0462C 02230601901 15 Iniciador X 05 51-21/05 020271C-1 02200605801 14 Iniciador X 0601 -9/05020843C-2 02230603101 15 Iniciador X 0602-17/0502063IC-I 02230605501 16Iniciador X 0607-111/05040970C-1 03010600201 15 iniciador 0607-81/05040578C-1 03010600501 15 iniciador X 0607-73/05040573C-1 03010605101 15 Iniciador X 0607-89/05040748C-3 03010605501 15 iniciador X 0607-102/05050016C-2 03010606601 15 iniciador X 0608-15/05040519C-3 03010606901 15 iniciador X 0608-45/05041003C-1 03150603401 15 Iniciador X 0610-60/05041024C-2 03150604401 15 iniciador X 0610-124/05055039C-1 03150604601 15 iniciador X 0609-54/05050089C-2 03150604701 15 iniciador X 0610-41/05050352C-1 03150606701 15 iniciador X 0609-58/05050255C-1 03220600201 15 iniciador X 0610-82/05050099C-2 03220601401 15 iniciador X 0610-77/05 05 03 53 C-1 03220602701 15 iniciador X 0610-121/05055090C-1 03220603301 15 Iniciador X 0610-81/05050099C-1 03220605901 15 iniciador X 0609-100/05055311 C-I 03290600301 15 iniciador X 0610-11/05040938C-1 03290601101 15 iniciador X 0610-68/05050376C-3 03290602001 15 iniciador X 0610-5 8/05 05 0344C-1 03290602201 15 iniciador X 0610-73/05050594C-3 03290603301 15 iniciador X 0611-84/05050714C-4 03290605001 15 iniciador X 0611-70/05050223C-1 03290606701 15 iniciador X 0611-73/05050351 C-I 03290608001 15 Iniciador X 0610-67/05050376C-2 04050600501 15 iniciador X 0610-40/05050102C-2 04050600901 15 iniciador X 0611-99/05050544C-1 04050602601 15 iniciador X 0611-110/0505501IC-I 04050603601 15 iniciador X 0612-2/05 050017C-1 04050609101 15 iniciador X 0612-70/05050530C-1 04050609201 15 iniciador X 0612-76/05050512C-1 04050610301 15 Iniciador X 0611-109/05055144C-1 04120600101 15 Iniciador X 0611-31/05050220C-1 04120600601 15 Iniciador X 0611-38/05050284C-4 04120600901 15 Iniciador X 0611-40/05050171C-1 04120601101 14 Iniciador X 0612-80/05050713C-1 04120603101 15 Iniciador X 65-0409034 MC-66 060829 0001 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-68 060829 0002 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-72 060829 0003 02 a 14 Iniciador 2x 65-0409034 MC-111 060829 0005 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-94 060829 0011 02 a 14 Iniciador 2x 65-0409034 MC-120 060829 0012 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-144 060829 0013 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-133 060829 0015 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-187 060829 0020 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-193 060829 0021 02 a 14 Iniciador 2x 65-0409034 MC-199 060829 0023 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-135 060829 0025 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-114 060829 0026 02 a 13 Iniciador 2x 65-0409034 MC-147 060829 0027 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-36B 060829 0030 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-39 A 060829 0031 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-73 A 060829 0034 02 a 15 Iniciador 2x 65-0409034 MC-71 A 060829 0035 02 a 14 Iniciador 2x Os histogramas de exemplo são mostrados na Figura 5.

Caracterização de Genoma

A caracterização de genoma foi usada para dois propósitos. Primeiro, para confirmar a falta de heterozigosidade entre as plantas 5 identificadas como haplóides pela avaliação morfológica, pela triagem molecular e pela citometria de fluxo. Segundo, para identificar haplóides duplicados com base de serem diplóides e carecerem de qualquer heterozigosidade detectável. O método usado para avaliar ambos os conjuntos de plantas foi idêntico e é descrito abaixo.

Estratégia de Marcador

A caracterização de genoma (quanto a heterozigosidade) foi realizada usando 96 locais de microssatélite. Ao invés de triar todos os iniciadores contra todas as amostras de candidato usando iniciadores rotulados, uma estratégia de reunião (como proposto por Cryer et al., 2005) 15 foi adotada que evita a necessidade quanto a números grandes de iniciadores SSR caros, rotulados. O método envolve amplificar cada local de microssatélite para todos candidatos haplóides usando iniciadores não rotulados, volumosos e ligando os produtos juntos em um vetor, e depois realizando uma segunda amplificação usando um iniciador de vetor 20 fluorescentemente rotulado para expor formas alélicas. O número de alelos em cada local para todos os indivíduos pode ser depois avaliado pelo fracionamento no sequenciador capilar. A validade dos resultados obtidos por este método foi verificado comparando-se os perfis gerados usando a estratégia reunida com aqueles obtidos em 10 amostras representativas

(diplóide e haplóide) usando um subconjunto de 24 marcadores de microssatélite rotulados, fracionados e detectados pela eletroforese capilar convencional.

Caracterização de genoma usando ligação volumosa de produtos de PCR

A primeira etapa na triagem envolvida amplificando 12

amostras candidatas; usando 96 marcadores de microssatélite listados na Tabela 2 (abaixo). Para todas as reações, a mistura de reação de 10 microssatélites conteve os seguintes reagentes; 1,0 μΐ de IOx tampão de PCR (Bioline), 0,3 μΐ de MgCl2 (10 mM), 0,4 μΐ de dNTPs (10 mM de cada um),

2,0 μΐ de cada par de iniciador (1 μΜ), 1 a 5 ng de DNA (extraído em BLRS) 10 e I U de Taq DNA polimerase (5 U μΓ1 Bioline). O ciclador térmico foi programado com uma etapa de desnaturação inicial de 94 0C por 2 min seguido por 35 ciclos de; 94 0C por 30 s, 52 0C por 30 s e 72 0C por 45 s, com uma etapa de extensão final de 72 0C por 7 min. Os produtos de PCR foram avaliados quanto ao tamanho pela eletroforese através de um gel de agarose a 15 1 % p/v por 30 min a 120 V.

Tabela 2. Marcadores de microssatélite usados para a triagem de ligação volumosa (Billote et al. 2005). Marcador Iniciador direto Iniciador inverso Marcador. GACCTTTGTCAGeATACTTGGT GCAGGCCT GAAAT CCCAAAT 16 GTG (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 127) Marcador AIGCATGT GArfTiATTAGGTGA CGACCCTCAGT CAAT CAGTAAG 17 GA (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 128) Marcador. AAGCTAGCGACCTATGATTTTAG AAACAAGTAAT GT GCATAAGCT 18 A (SEQ ID NO: 33) TTC (SEQ ID NO: 129) Marcador CCCACC ACCCCTAGCTT CTC ACCCCGGTCCAAATAAAATC 19 (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 130) Marcador AGAGAGAGAGAGTGCGTATG GTCCCTGTGGCTGCTGTTTC 20 (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 131) Marcador GGGTAGCAAACCTTGTATTA ACTTCCATTGTCTCATTATTCT 21 (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 132) Marcador CGAGGCCCAAAAACATTCAC GGTCCCGATCCCGTCTACTG 22 (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 133) Marcador TTGCGGCCCATCGTAATC TCCCTGCAGTGTCCCTCTTT 23 (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 134) Marcador AGGGAATTGGAAGAAAAGAAAG TCCTGAGCTGGGGTGGTC 24 (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 135) Marcador AGCAAGAGCAAGAGCAGAACT CTTGGGGGCTTCGCTATC 25 (SEQ ID NO: 40) (SEQ ID NO: 136) Marcador TAGCCATGCCGCCACCACTT CAATCCATTAGCGT GCCCTT CT 26 (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 137) Marcador CTTACCCCGCCTCCTCTCCT CGAAAT GCCCTT CCTTTACACT 27 (SEQ ID NO: 42) A (SEQ ID NO: 138) Marcador CCTTATAT CGCACGGGTTCC TTCTTGGGGTCTCGCTACGG 28 (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 139) Marcador GCAAGAT GCAAT GGAGTT CA CAAACCGCAGCAAGT CAGA 29 (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 140) Marcador G C AAAATT CAAAGAAAACTTA CT GACAGTGCAGAAAAT GTTAT 30 (SEQ ID NO: 45) AGT (SEQ ID NO: 141) Marcador CGTTCATCCCACCACCTTTC GCTGCGAGGCCACTGATAC 31 (SEQ ID NO: 46) (SEQ ID NO: 142) Marcador GAAT GT GGCT GTAAAT GCT GAG AAGCCGCATGGACAACTCTAGT 32 TG (SEQ ID NO: 47) AA (SEQ ID NO: 143) Marcador ACATT CCCT CT ATTATT CT CAC GTTTTGTTTGGTATGCTTGT 33 (SEQ ID NO: 48) (SEQ ID NO: 144) Marcador AAGCCAACTT CACAGATATGTT G ATGAGCCTAACAAAGCACATTC 34 AT (SEQ ID NO: 49) TAA (SEQ ID NO: 145) Marcador AGTGAGGTATGGTTGATTAGGA TATTGATAGCATTTGGGATTAG 35 (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 146) Marcador CTCCGATGGTCAAGTCAGA AAATGGGGAAGGCAATAGTG 36 (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 147) Marcador GCCGTTCAAGTCAATTAGAC Π TGGGAGCAAGCA1 TATCA 37 (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 148) Marcador TGCTTCTTGTCCTTGATACA CCACGT CTACGAAAT GATAA 38 (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 149) Marcador CACCACAT GAAGCAAGCAGT CCTACCACAACCCCAGTCTC 39 (SEQ ID NO: 54) (SEQ ID NO: 150) Marcador ΤΓΤIAirnCCClCICI I I IGA ATTGCGT CT CTTTCCATT GA 40 (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 151) Marcador CATATGGCGCACAGGCAC GCAATACAAGAG CACCCAAAT 41 (SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 152) Marcador AGTT GGTTT GCT GATTT G TGTTGCTTCTTTGATTTTC 42 (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 153) Marcador GCT GAAGAT GAAATT GAT GTA TTCAGGTCCACTTTCATTTA 43 (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 154) Marcador AT GACCTAAAAATAAAAT CT CAT ACAGAT CATGCTTGCT CACA 44 (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 155) Marcador GGTGCAAGAGAGGAGGAAT G I Γ TGG rAGTCGGGCG I I IIA 45 (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 156) Marcador GTTTGGCTTTGGACATG TCCATCACAGGAGGTATAG 46 (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 157) Marcador TGTTTTtiTI TCGTGCATGTG GGCT GACATGCAACACTAAC 47 (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 158) Marcador CGG N I l GI CGCAfCTATG (SbQ GT CGT CAGGG AACAACAGT 48 ID NO: 63) (SEQ ID NO: 159) Marcador CAATCATTGGCGAGAGA (SEQ CGTCACCTTTCAGGATATG 49 ID NO: 64) (SEQ ID NO: 160) Marcador GAGCAT GACGCAAACAAAGG GCAACAT GTTT GATGCATTAAT 50 (SEQ ID NO: 65) AGTC (SEQ ID NO: 161) Marcador T C CAAGTAGCAAAT GAT GAC TGCCCTGAAAC CCTTGA (SEQ 51 (SEQ ID NO: 66) ID NO: 162) Marcador GAAGGGGCATT GGATTT (SEQ TACCTATTACAGCGAGAGT G 52 ID NO: 67) (SEQ ID NO: 163) Marcador AACACT CCAGAAGCCAGGT C GGTTTAGGTATTGGAACTGATA 53 (SEQ ID NO: 68) GAC (SEQ ID NO: 164) Marcador GATCCCAATGGTAAAGACT AAGCCTCAAAAGAAGACC (SEQ 54 (SEQ ID NO: 69) ID NO: 165) Marcador TGTGGTTTGAGGCATCTTCT GCCCACCAAAAGAAAGTAGT 55 (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 166) Marcador TAGCCGCACTCCCACGAAGC CCAGAAT CATCAGACT CGGACA 56 (SEQ ID NO: 71) G (SEQ ID NO: 167) Marcador T CAAAGAGCCGCACAACAAG ACTTTGCTGCTTGGTGACTTA 57 (SEQ ID NO: 72) (SEQ ID NO: 168) Marcador GGGGAT GAGTTT GTTT GTT C CCTGCTTGGCGAGATGA (SEQ 58 (SEQ ID NO: 73) ID NO: 169) Marcador TCTAATGCTCCCAAGGTACA GGCTTGGTCCACGATCTT (SEQ 59 (SEQ ID NO: 74) ID NO: 170) Marcador AGCTCTCATGCAAGTAAC (SEQ TTCAACATACCGTCTGTA (SEQ 60 D NO: 75) ID NO: 171) Marcador TCCTCACTGCTCCTCTAATC ACTCCCTATGGACCTTAGTC 61 (SEQ ID NO: 76) (SEQ ID NO: 172) Marcador AGGGAGGCGAACGAGAAACA CGACT GCT GAT GGGGAAGAG 62 (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 173) Marcador CTACGGACT CACACCTATAT ATGGTT CAT CAAT GAGAT C 63 (SEQ ID NO: 78) (SEQ ID NO: 174) Marcador GTGAGCGATTGAGGGGTGTG GGGGCTTGATT GAGTATTT CCA 64 (SEQ ID NO: 79) (SEQ ID NO: 175) Marcador AGGGCAAGTCATGTTTC (SEQ TATAAGGGCGAGGTATT (SEQ 65 ID NO: 80) ID NO: 176) Marcador GAAGCCTGAGACCGCATAGA TT CGGT GAT GAAGATT GAAG 66 (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 177) Marcador TTT CTTATGGCAAT CACACG GGAGGGCAGGAACAAAAAGT 67 (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 178) Marcador GT7 TATCAI I' ITGGGGTCAG CGGTGTCCCTCAGGATGTA 68 (SEQ ID NO: 83) (SEQ ID NO: 179) Marcador CAT GCACGTAAAGAAAGT GT CCAAATGCACCCTAAGA (SEQ 69 (SEQ ID NO: 84) ID NO: 180) Marcador AATCCAAGTGGCCTACAG (SEQ CATGGCTTTGCTCAGTCA (SEQ 70 ID NO: 85) ID NO: 181) Marcador TGTAGGTGGTGGTTAGG (SEQ TGT CAGACCCACCATTA (SEQ 71 ID NO: 86) ID NO: 182) Marcador AGCAAG ACACC AT GTAGT C GACACGTGGGAT CTAGAC 72 (SEQ ID NO: 87) (SEQ ID NO: 183) Marcador AAAAGCCGATAGTGGGAACA ATGCT GAGAGGT GGAAAATAG 73 (SEQ ID NO: 88) AG (SEQ ID NO: 184) Marcador GT CCAT GT GCATAAGAGAG CT CTT GGCATTT CAGATAC 74 (SEQ ID NO: 89) (SEQ ID NO: 185) Marcador AGCCAAT GAAGGATAAAGG CAAGCTAAAACCCCTAATC 75 (SEQ ID NO: 90) (SEQ ID NO: 186) Marcador CAATTCCAGCGT CACTATAG AGT GGCAGTGGAAAAACAGT 76 (SEQ ID NO: 91) (SEQ ID NO: 187) Marcador GGGC Π ΓΟΑI HTCCACIAI GCTCAACCTCATCCACAC (SEQ 77 (SEQ ID NO: 92) ID NO: 188) Marcador GACAGCTCGTGATGTAGA (SEQ GTT CTT GGCCG CT ATAT (SEQ 78 ID NO: 93) ID NO: 189) Marcador ACTTGTAAACCCTCTTCTCA GTTT CATTACTT GGCTT CT G 79 (SEQ ID NO: 94) (SEQ ID NO: 190) Marcador CCTT CAAGCAAAGATACC (SEQ GGCACCAAACACAGTAA (SEQ 80 ID NO: 95) ID NO: 191) Marcador CCACTGCTTCAAATTTACTAG GCGTCCAAAACATAAATCAC 81 (SEQ ID NO: 96) (SEQ ID NO: 192) Marcador GGGAGAGGAAAAAATAGAG CCTCCCT GAGACT GAGAAG 82 (SEQ ID NO: 97) (SEQ ID NO: 193) Marcador AGCAGGGCAAGAGCAATACT TT CAG CAG CAG G AAACAT C 83 (SEQ ID NO: 98) (SEQ ID NO: 194) Marcador GCCTATCCCCT GAACTAT CT TGCACATACCAGCAACAGAG 84 (SEQ ID NO: 99) (SEQ ID NO: 195) Marcador CATCAGAGCCTT CAAACTAC AGCCTGAATTGCCTCTC (SEQ 85 (SEQ ID NO: 100) ID NO: 196) Marcador ATTCATTGCCATTCCCTTCA TTGTCCCCT CT GTT CACT CA 86 (SEQ ID NO: 101) (SEQ ID NO: 197) Marcador ATTGCAGAGAT GAT GAGAAG GAGATGCT GACAATGGTAGA 87 (SEQ ID NO: 102) (SEQ ID NO: 198) Marcador TCTCCCAAATCACTAGAC (SEQ AT CT GCAAGGCATATT C (SEQ 88 D NO: 103) ID NO: 199) Marcador ACGrrTTGGCAACTCTC (SEQ ID ACTCCCCTCTTTGACAT (SEQ 89 NO: 104) ID NO: 200) Marcador TCCACTCTGGCAACTCC (SEQ AAGGATGGGCTTTGTAGT (SEQ 90 D NO: 105) ID NO: 201) Marcador TTTAGAGGACAAGGAGATAAG CGACCGTGTCAAGAGTG “(SEQ 91 (SEQ ID NO: 106) D NO: 202) Marcador AGCAAAATGGCAAAGGAGAG GGTGTGTGCTATGGAAGATCAT 92 (SEQ ID NO: 107) AGT (SEQ ID NO: 203) Marcador GTAGCTTGAACCTGAAA (SEQ ID AGAACCACCGGAGTTAC (SEQ 93 NO: 108) ID NO: 204) Marcador AAGCCACCAGGATCATC (SEQ GTCATTGCCACCTCTAACT 94 ID NO: 109) (SEQ ID NO: 205) Marcador TTACTT GCTAAGCT CT CTAGC TGGCTGTTTAATCTGTCTG 95 (SEQ ID NO: 110) (SEQ ID NO: 206) Marcador TCTATATTTGGTTGGCTTGA ACTCATTTCAATCTCAGTGTC 96 (SEQ ID NO: 111) (SEQ ID NO: 207) Marcador TGCTACGTGCTGAAATA (SEQ ID ATTTCAGGTTCGCTTCA (SEQ 97 NO: 112) ID NO: 208) Marcador CCT CCACTT CT CTT CAT CTT CTT CCT CAAGCT CAAACAAT 98 (SEQ ID NO: 113) (SEQ ID NO: 209) Marcador GAT GTT GCCGCT GTTT G (SEQ CAT CCCATTT CCCT CTT (SEQ 99 ID NO: 114) ID NO: 210) Marcador ATGCTCCACCAAGTTTA (SEQ ID CACATCCTAGCATCATTG (SEQ 100 NO: 115) ID NO: 211) Marcador AAGCAATATAGGTTCAGTTC TCATTTTCTAATTC CAAA CAAG 101 (SEQ ID NO: 116) (SEQ ID NO: 212) Marcador GCTCGTTTTTGTTIAGGTGA TTTTCTCCATAGTCCGTrAC 102 (SEQ ID NO: 117) (SEQ ID NO: 213) Marcador CAGCACACAAATGACAT (SEQ ID CACCTTTCCTITl IOIO (StQ ID 103 NO: 118) NO: 214) Marcador CCTATT CCTT ACCTTT CTGT GACTTACTATCTTGGCTCAC 104 (SEQ ID NO: 119) (SEQ ID NO: 215) Marcador CCTTGCATTCCACTATT (SEQ ID AGTTCTCAAGCCTCACA (SEQ 105 NO: 120) ID NO: 216) Marcador CCTCCTTTGGAATTATG (SEQ ID GT GTTT GAT GGGACATACA 106 NO: 121) (SEQ ID NO: 217) Marcador ATT GGAGAGCACTTGGATAG TTCTCTTCCTTCTCACTTGT 107 (SEQ ID NO: 122) (SEQ ID NO: 218) Marcador AGCCAGATGGAAATACAC (SEQ GTGCGATAAAGAGGAGAGT 108 ID NO: 123) (SEQ ID NO: 219) Marcador TAGnTTCCCATCACAGAGT ACAATATTTAGACCTTCCATGA 109 (SEQ ID NO: 124) G (SEQ ID NO: 220) Marcador GTGCAGATGCAGATTATATG CCTTTAGAATTGCCGTATC 110 (SEQ ID NO: 125) (SEQ ID NO: 221) Marcador ACAATAACCTGAGACAACAAGA ATACATCCCCT CCCCT CT CT 111 AAC (SEQ ID NO: 126) (SEQ ID NO: 222) Dois volumes foram construídos para cada um dos 12 indivíduos com cada volume contendo 48 marcadores. Os produtos de PCR avolumados foram depois purificados usando colunas de QIAquick PCR Purification (QIAGEN) como pelas instruções do fabricante. Os produtos 5 purificados foram depois ligados em vetor de clonagem pDrive (QIAGEN) para permitir um sítio de ligação universal para a segunda rodada de PCR. O vetor pDrive foi selecionado por causa da sua alta eficiência de ligação e devido ao fato de que ele contém os sítios de ligação dos iniciadores Ml3 direto e Ml3 inverso. O vetor linear é designado para explorar o 10 comportamento da Taq polimerase, que produz uma única projeção de nucleotídeo de adenosina nos fragmentos de PCR resultantes, por conter uma base complementar (base U) nos pontos de inserção. Com uma reação de ligação simples a base de adenosina do produto de PCR e a base U do vetor ligam-se entre si resultando na recircularização do plasmídeo. Isto foi obtido 15 pela adição de 5 μΐ de 2x Mistura de Ligação Master, 4 μΐ de produto de PCR e 1 μΐ do vetor pDrive (50 ng^L"1) em um tubo de eppendorf de 0,2 ml. Os reagentes foram coletados pela centrifugação pulsada e a reação de ligação foi realizada a 4 0C por aproximadamente 15 h. O produto de ligação foi diluído 1:10 com água nanopura e isto formou o padrão para a segunda PCR 20 envolvendo um único iniciador específico de local de microssatélite em combinação com um iniciador universal Ml3 fluorescentemente rotulado (direto ou inverso). O Ml 3 direto (-40) foi rotulado com o corante fluorescente (FAM) e o inverso com HEX (ambos fornecidos pela SIGMA ALDRICH). As condições de PCR foram as mesmas como na etapa de amplificação inicial desta vez usando o produto de ligação diluído como o padrão de DNA. Os produtos foram diluídos 1 em 5 e dispostos em volumes 5 com base no tamanho esperado de fragmento e o corante fluorescente usados, que permitiu que numerosas amostras fossem avaliadas em uma única rodada do sequenciador capilar. Estes produtos foram separados pela eletroforese capilar em um sequenciador ABI Prism 3100. O sequenciador usa um meio que flui linearmente, a saber o polímero POP-6® (Applied Biosystems), para 10 separar fragmentos nos capilares e a fluorescência emitida do iniciador rotulado incorporado é registrada pelo programa de software Genescan Versão 3.1® (Applied Biosystems). O arquivo de saída permite comparações dos perfis genéticos de indivíduos pela formação de picos que representam os fragmentos de AFLP-DNA. Esta análise de fragmento foi realizada usando o 15 software ABI PRISM Genotyper® 3.6NT (Applied Biosystems), que permite a análise do tamanho dos fragmentos (em pares de base) e também pode avaliar a concentração do produto amplificado. Os tamanhos de alelo foram avaliados usando o software ABI PRISM Genotyper® 3.6NT (Applied Biosystems). Qualquer indivíduo que gerou dois picos alélicos para qualquer 20 marcador de microssatélite foi julgado parcialmente heterozigoto e assim descartado como não sendo um haplóide ou haplóide duplicado possível (dependendo dos resultados da citometria de fluxo).

Resultados

Caracterização de genoma Um subconjunto de 8 dos 24 candidatos identificados depois

da triagem molecular incluindo tanto indivíduos diplóides quanto haplóides (listados na Tabela abaixo) foi submetido à caracterização molecular mais extensiva com 80 marcadores de microssatélite adicionais usando a técnica de ligação de volume descrita acima (e). Tabela 3

Referência do genótipo Código da Amostra Nível de Ploidia 2 BATCH 060728_0018_01_a Haplóide 53;03090761C;5 4 BATCH 060728_0027_01_a Haplóide 50;03060260C;2 7 BATCH 060728_0035_01_a Haplóide 53;03080954C;2 13 BATCH 060729_013l_02_a Haplóide 67;0409034MC;4 16 BATCH 060729 013 8_02_a Diplóide 65,0409034MC;35 18 BATCH 060729014l_02_a Diplóide 65;0409034MC;50 22 0627/125;05090717C;2 060731 0065 01 a Haplóide 24 0629/97;05100048C;3 060731 0105 01 a Haplóide Como esperado, todos os indivíduos identificados como

haplóides pela citometria de fluxo conteve apenas um único alelo através de todos os 80 locais avaliados. Assim, estes indivíduos são hemizigotas para os 95 locais no total (incluindo os 15 marcadores usados na triagem) e isto foi julgado confirmar o seu estado haplóide. Ao contrário, os dois diplóides foram heterozigotos para muitos dos locais triados.

Verificação da técnica de ligação de volume

Quando os perfis de dez indivíduos foram submetidos à análise de microssatélite pela eletroforese capilar convencional e usando os iniciadores de microssatélite rotulados, os perfis obtidos indicaram contagens idênticas para o estado alélico através dos 24 marcadores.

Identificação de haplóides duplicados

Aqui, nós triamos todos os 34 candidatos diplóides que foram 15 homozigotos para todos os 15 marcadores como descrito acima e aplicamos um adicional de 32 marcadores de microssatélite fluorescentemente rotulados (listados abaixo) usando eletroforese capilar convencional através de um sequenciador de DNA ABI Prism 3100. Houve dois genótipos (65-0409034 MC-144 e 65-0409034 MC-114) que foram homozigotos para todos os 20 marcadores. Assim, estas plantas foram homozigotas para um total de 47 marcadores de microssatélite e assim foram julgados ser plantas de dendezeiro haplóides duplicados.

Os microssatélites usados para esta etapa de caracterização foram como segue:

Marcador de Seqüência de Iniciador Seqüência de Iniciador Microssatélite Direto Inverso Marcador GACCITTTGTCAGCATACTTG GCAGGCCTGAAATCCCAAAT 16 GTGTG (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 127) Marcador GGGTAGCAAACCTTGTATTA ACTTCCATT GTCT CATTATTCT 21 (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 132) Marcador TTGCGGCCCATCGTAATC (SEQ TCCCTGCAGTGTCCCTCTTT (SEQ 23 ID NO: 38) ID NO: 134) Marcador GCAAGATGCAATGGAGTTCA CAAACCGCAGCAAGTCAGA (SEQ 29 (SEQ ID NO: 44) ID NO: 140) Marcador CTCCGATGGTCAAGTCAGA AAAT GGGGAAGGCAATAGT G 36 (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 147) Marcador ATGACCTAAAAATAAAAT CTCAT ACAGATCATGCTTGCTCACA (SEQ 44 (SEQ ID NO: 59) ID NO: 155) Marcador CGGIT TTGTCGCATCTATG GTCGTCAGGGAACAACAGT (SEQ 48 (SEQ ID NO: 63) ID NO: 159) Marcador TCCAAGTAGCAAATGATGAC TGCCCTGAAACCCTTGA (SEQ ID 51 (SEQ ID NO: 66) NO: 162) Marcador GAT CCCAATGGTAAAGACT AAGCCT CAAAAGAAGACC (SEQ 54 (SEQ ID NO: 69) ID NO: 165) Marcador TGT GGTTT GAGGCAT CTTCT GCCCACCAAAAGAAAGTAGT 55 (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 166) Marcador AGGGAGGCGAACGAGAAACA CGACT GCT GATGGGGAAGAG 62 (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 173) Marcador TTT CTTATGGCAAT CACACG GGAGGGCAGGAACAAAAAGT 67 (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 178) Marcador GTTTATCATI T TGGGGICAG CGGTGTCCCTCAGGATGTA (SEQ 68 (SEQ ID NO: 83) ID NO: 179) Marcador CAT GCACGTAAAGAAAGT GT CCAAATGCACCCTAAGA (SEQ ID 69 (SEQ ID NO: 84) NO: 180) Marcador TGTAGGTGGTGGTTAGG (SEQ TGTCAGACCCACCATTA (SEQ ID 71 ID NO: 86) NO: 182) Marcador AGCAAGACACCAT GTAGT C GACACGT GGGAT CTAGAC (SEQ 72 (SEQ ID NO: 87) ID NO: 183) Marcador GT CCAT GT GCATAAGAG AG CT CTT GGCATTT CAGATAC (SEQ 74 (SEQ ID NO: 89) ID NO: 185) Marcador GGGCTTTCATTTTCCACTAT GCTCAACCTCATCCACAC (SEQID 77 (SEQ ID NO: 92) NO: 188) Marcador GACAGCT CGT GAT GTAGA(SEQ GTTCTTGGCCGCTATAT (SEQ ID 78 ID NO: 93) NO: 189) Marcador ACTT GTAAACCCT CTT CT CA GTTTCATTACTTGGCTTCTG (SEQ 79 (SEQ ID NO: 94) ID NO: 190) Marcador C CAC-T G CTT CAAATTTACTAG GCGTCCAAAACATAAATCAC (SEQ 81 (SEQ ID NO: 96) ID NO: 192) Marcador GCCTATCCCCT GAACTAT CT T GCACATACCAGCAACAGAG 84 (SEQ ID NO: 99) (SEQ ID NO: 195) Marcador TCTCCCAAATCACTAGAC (SEQ ATCTGCAAGGCATATTC (SEQ ID 88 D NO: 103) NO: 199) Marcador ACGTTTT GGCAACT CT C (SEQ ACTCCCCTCTTTGACAT (SEQ ID 89 D NO: 104) NO: 200) Marcador AGCAAAAT GGCAAAGGAGAG GGTGTGTGCTATGGAAGATCA 92 (SEQ ID NO: 107) TAGT (SEQ ID NO: 203) Marcador TCTATATTTGGTTGGCTTGA ACT CATTT CAATCT CAGT GT C 96 (SEQ ID NO: 111) (SEQ ID NO: 207) Marcador CCT CCACTT CT CTT CAT CTT CTTCCTCAAGCTCAAACAAT (SEQ 98 (SEQ ID NO: 113) ID NO: 209) Marcador CCTATTCCTTACCTTTCTGT GACTTACTATCTTGGCTCAC (SEQ 104 (SEQ ID NO: 119) ID NO: 215) Marcador CCTT GCATT CCACTATT (SEQ AGTTCTCAAGCCTCACA (SEQ ID 105 ID NO: 120) NO: 216) Marcador GT GCAGAT GCAGATTATAT G CCTTTAGAATTGCCGTATC (SEQ 110 (SEQ ID NO: 125) ID NO: 221) Marcador ACAATAACCT GAGACAACAA ATACATCCCCTCCCCTCTCT (SEQ 111 GAAAC (SEQ ID NO: 126) ID NO: 222) Marcador GAACTTGGCGTGTAACT (SEQ TGGTAGGTCTATTTGAGAGT (SEQ 112 ID NO: 223) ID NO: 224) A Figura 7B mostra imagens de um dendezeiro heterozigoto diplóide típico (fundo) e dois haplóides duplicados (topo) semeados no mesmo dia.

Desenvolvimento de haplóides duplicados a partir de haplóides 5 As células haplóides algumas vezes sofrerão “duplicação

espontânea” por meio da qual a falha de mitose completa dá uma duplicação dos cromossomos. Se isto ocorre cedo no desenvolvimento, a semente, plantinha e planta derivadas são um haplóide duplicado. Se nenhuma de tal duplicação ocorre então um haplóide é obtido e na maioria das circunstâncias, 10 tais plantas haplóides são intrinsecamente inférteis, em que o processo de meiose é incapaz de gerar gametas capazes de fertilização. De modo a produzir uma planta fértil a parti da qual a progênie sexual pode ser produzida é necessário dobrar o número de cromossomos de um haplóide pela aplicação de um estímulo externo, ou confiar no processo raro pelo qual uma célula 15 haplóide pode espontaneamente duplicar. O primeiro método é o mais usualmente adotado, e usualmente envolve a aplicação de um agente químico capaz de inibir a mitose e deste modo induzir a formação de uma célula diplóide. Existem diversos produtos químicos conhecidos para induzir um tal processo de duplicação de cromossomos e destes a colchicina é o melhor conhecidos, e o mais habitualmente utilizado. Outros agentes similares incluem inibidores de microtúbulo tais como os herbicidas trifluralin e orizalin. Tais produtos químicos podem ser aplicados a uma planta inteira e sementes férteis podem ser produzidas nesta planta, ou eles podem ser 5 aplicados in vitro às células isoladas a partir da qual uma planta inteira pode ser regenerada usando técnicas de cultura de tecido convencionais. Para uma descrição completa de produtos químicos e outros métodos disponíveis e seus meios de aplicação ver Kasha (2005) e referências nesta.

Uma alternativa para a aplicação externa de estímulos é a 10 exploração da duplicação espontânea. Por exemplo, em um haplóide, o núcleo de uma célula individual pode ocasionalmente falhar em dividir normalmente na mitose e assim forma uma célula diplóide que por fim dá origem a um setor(es) diplóide(s) que pode(m) abranger a maior parte ou todo do eixo do broto principal ou (se isto ocorre na primeira divisão embrionária) uma planta 15 haplóide duplicada. Em cada caso, a semente auto-polinizada assegurada de tais indivíduos será completamente homozigota e geneticamente idêntica ao precursor. Este processo pode ocorrer durante a formação de células reprodutivas e neste caso é possível que gametas férteis (pólen ou células de ovo) possam ser produzidos. Se tanto os gametas masculinos quanto os 20 femininos se formam na mesma planta então a fusão bem sucedida de gametas pode ocorrer e um embrião desenvolver-se-á. Um tal embrião será um homozigoto diplóide, e produzirão sempre progênie com as características dos pais em todas as gerações autopolinizadas futuras; toda a sua progênie autopolinizada será geneticamente idêntica. No dendezeiro, as inflorescências 25 são usualmente masculinas ou femininas (embora saiba-se que inflorescências hermafrodita ocorram ocasionalmente) e portanto a auto-polinização de uma planta haplóide particular pode requerer a armazenagem de pólen de uma inflorescência masculina até que uma inflorescência feminina adequada esteja disponível para a polinização. Tais procedimentos são habitualmente usados no desenvolvimento de dendezeiro.

No presente exemplo da invenção, verificou-se que as plantas de dendezeiro haplóides obtidas pelo processo da invenção produzem suas primeiras inflorescências depois de aproximadamente dois 5 anos de crescimento vegetativo, e é provável que tais plantas produzirão uma frequência baixa, mas utilizável de gametas férteis, a partir dos quais progênie homozigota pode ser isolada. Uma planta haplóide começou agora a florescer.

A Figura 10 mostra o haplóide 50-03060260_0002 confirmado com a primeira inflorescência dois anos e sete meses depois do plantio (fotografia esquerda de inflorescência e fotografia direita de muda haplóide). Triagem de Homozigosidade de Candidatos Haplóides Seis dendezeiros identificados como haplóide a partir da citometria de fluxo foram triadas para confirmar o estado homozigoto. Isto foi obtido pela identificação de marcadores heterozigotos de cada precursor materno candidato e registrando o número destes marcadores que foram também homozigotos no candidato. Para um haplóide verdadeiro, a expectativa é que todos os locais individuais devem conter um alelo (hemizigota). Um total de 96 marcadores (listados na Tabela 5) foram triados em cada uma das palmeiras mãe e aqueles que foram mostrados serem heterozigotos foram depois avaliados nas palmeiras candidatas da progênie. Os marcadores usados consistiram de uma seqüência âncora universal que foi usada para incorporar um corante fluorescente nos produtos de PCR, permitindo que os tamanhos de alelo sejam avaliados pelo fracionamento através da eletroforese capilar. Todas as seis palmeiras candidatas mostraram ser 100 % homozigotas em relação a todos os locais heterozigotos identificados no precursor (Tabela 3). As palmeiras foram portanto julgadas ser completamente homozigotas, como esperado para as plantas haplóides. Tabela 4. Lista dos dendezeiros candidatos haplóides usados na triagem de confirmação de homozigosidade e suas respectivas palmeiras precursoras fêmeas.

Candidato Haplóide Precursor feminino 0710/20;06041160;0002 BL1222/33-14 0702/122;06030674;0002 BL1233/21-06 07101N;06010987;0028 BL10868/31-07 0650/80;06030324; 0003 BL1230/43-22 0701/154;06030903;0001 BL10883/35-12 0704/251;060313 85 ;0001 BL10868/13-28 Tabela 5 - Marcadores de microssatélite usados para triagem de homozigosidade para candidatos haplóides e haplóides duplos.

1 m0163 25 m0772 49 m0793 73 m0772 2 m0192 26 m0779 50 m0795 74 m0779 3 m0195 27 m0790 51 m0800 75 m0790 4 m0353 28 m0878 52 m0801 76 m0827 m0399 29 m3298 53 m0882 77 m0878 6 m0409 30 m3346 54 m2347 78 m3298 7 m0425 31 m3739 55 m2492 79 m3346 8 m0433 32 m3750 56 m2577 80 m3739 9 m0445 33 m3232 57 m2628 81 mEgUWA07 m0773 34 m3260 58 Π12813 82 mEgUWA44 11 m0782 35 m3311 59 m3160 83 mEgUWA50 12 m0783 36 m3387 60 m3194 84 m3535 13 m0788 37 m3399 61 m3293 85 m3310 14 m0803 38 m3400 62 m3296 86 ml716 m0825 39 m3526 63 m3305 87 m3705 16 m0844 40 m3544 64 m3363 88 m3826 17 m0894 41 m3555 65 m3376 89 m0146 18 m0905 42 m3557 66 m3427 90 m0369 19 m0906 43 m3574 67 m3543 91 m0408 m0910 44 m3607 68 m3567 92 m0832 21 ml 492 45 m3691 69 m3590 93 m0588 22 ml977 46 m3716 70 m3869 94 ml 773 23 m2029 47 m3718 71 m0230 95 m0059 24 m2110 48 m3737 72 m0328 96 m2860 - 2 1 m0195 m0425 m0195 m0195 m0425 m0788 2 m0788 m0825 m0905 m0425 m2628 m0894 3 m0825 m2628 m3360 m2628 m0588 m3160 4 m0801 m3543 m3543 ml 773 m3311 m3543 m3360 m0146 ml 773 m3739 m3544 ml773 6 m3543 m3311 m3557 mEgUWA m3557 m0779 50 7 ml773 m0779 m0779 m2518 m3737 m0878 8 m3737 m0878 m0878 m3535 m0779 m3739 9 m0779 m3739 m3739 m3310 m0878 mEgUW A44 mEgUW m2518 mEgUWA4 m3693 m3739 mEgUWA07 A50 4 11 mEgUW m0059 mEgUW AO m3705 mEgUWA44 m2518 A07 7 12 m2518 m0445 m3826 m0059 mEgUWA07 OPSSR30 13 m3826 m0773 m3310 OPSSR30 m2518 m0445 14 m3693 m0782 m3705 m0353 m3826 m0773 m3705 m3194 m0353 m0399 m3535 m0782 16 m3298 m3293 m0399 m0409 m3693 m3194 17 m3346 m3296 m0409 m3387 m0059 m3293 18 m3739 m3387 m0906 m3399 OPSSR30 m3296 19 m0445 m3399 m3574 m3526 OPSSR32 m0163 m0773 m3526 m3691 m3574 m3298 m0192 21 m0782 m0163 m3718 m3691 m3346 m3607 22 m0353 m0192 m3607 m3718 m3739 m3716 23 m0399 m0772 m3716 m0906 m3718 24 m0409 m0790 m3718 m3194 m0906 m0793 m0772 m3293 26 m3607 m0800 m0790 m3296 27 m3716 m0882 m3387 28 m3718 m3399 29 m3526 m0408 31 m2860 Tabela 7. Marcadores usados em BLRS para triar quanto à heterozigosidade

nos precursores dos candidatos de haplóide duplo.

1 OPSSRl 2 OPSSR2 3 OPSSR3 4 OPSSR4 OPSSR5 6 OPSSR6 7 OPSSR7 8 OPSSR8 9 OPSSR9 OPSSRIO 11 OPSSRl 1 12 0PSSR12 13 0PSSR13 14 OPSSR14 VSl Tabela 8. Lista das palmeiras candidatas haplóide duplo usadas na triagem de homozigosidade e suas respectivas palmeiras precursoras fêmeas.

Candidato Haplóide Duplo Precursor Feminino 1 0619/142;05069109;0002 Al 124/39-15 2 0640/68;0512123 6;0004 BL10882/34-18 3 0642/235;05059119;0003 BL701/13-09 4 0644/47;06011226;0001 BL1231/06-11 0644/219;05049082;0003 BLO13/12-06 6 0622/193 ;0412903 8;0001 BLl 129/09-11 7 06261N;04129038;0032 BLl 129/09-11 8 0626/N;0412903 8;0005 BLl 129/09-11 9 0626/N;04129038;0025 BL1129/09-11 06261N;04129038;0039 BLl 129/09-11 11 0626/N;0412903 8;0009 BLl 129/09-11 12 06261N;04129038;0016 BLl 129/09-11 13 0626/N;04069109;0015 Al 124/39-15 14 0706/397;06039153;0002 BL1232/47-05 0706/367;06029106;0001 BL1223/03-23 16 0706/368;06029106;0002 BL1223/03-23 17 0622/216;04069109;0006 Al 124/39-15 18 0626/N;04069109;0024 Al 124/39-15 19 0626/N;04069109;0026 Al 124/39-15 B67 ;0409034MC; 15 287/10626/07-21 21 B65,0409034MC;35 287/10626/07-21 22 64-0409021 MC-34 287/10625/09-15 23 64-0410040MC-1 286/10622/09-06 24 64-0410040MC-20 286/10622/09-06 64-0410040MC-16 286/10622/09-06 26 65-0409021MC-2 287/10625/09-15 Tabela 9. Marcadores de microssatélite identificados como heterozigoto no precursor materno e homozigotos no candidato haplóide duplo 5;

ID - 0644/219;05049082;0003.

m0195 19 VSl 2 m0425 20 m3737 3 m0788 21 m0779 4 m0825 22 m0878 m0894 23 m3739 6 m0905 24 mEgUWA44 7 m0801 25 mEgUWA50 8 m2577 26 mEgUW AO 7 9 m2628 27 m2518 m3160 28 m3826 11 m3360 29 m3535 12 m3543 30 m3310 13 m0146 31 m3693 14 m0588 32 m3705 ml773 33 m0059 16 m3311 34 OPSSR30 17 m3544 35 OPSSR32 18 m3557 Referências

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Claims (29)

1. Método para selecionar plantas de dendezeiro haplóides ou haplóides duplicadas úteis para a produção, multiplicação e melhoria de cultivo de semente, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma população de plantas de palmeira; (b) escolher da população um subconjunto de plantas individuais com fenótipo atípico; (c) avaliar a heterozigosidade das plantas no subconjunto; (d) classificar as plantas no subconjunto como haplóide ou diplóide de acordo com os resultados da etapa (c).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (e) avaliar a heterozigosidade das plantas diplóides no subconjunto; (f) descartar do subconjunto daquelas plantas verificadas para serem heterozigotas; (g) classificar as plantas diplóides remanescentes como haplóides duplicadas.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é realizada antes da etapa (e).

4. Método de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que as plantas classificadas como diplóides na etapa (e) são avaliadas ainda quanto a heterozigosidade usando múltiplos marcadores moleculares, aquelas encontradas para serem heterozigotas sendo descartadas e o restante sendo classificadas como haplóides duplicados.

5. Método de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem de heterozigosidade (c) usa marcadores moleculares ou bioquímicos.

6. Método de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem de heterozigosidade (c) usa marcadores moleculares codominantes múltiplos, por exemplo entre 2 e 40 marcadores de microssatélite ou marcadores de regiões Polimórficas Caracterizadas Sequenciadas (SCARs) ou marcadores de Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o fenótipo atípico é uma morfologia de crescimento atípica ou padrão de crescimento atípico.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a morfologia de crescimento atípica é um ou mais de crescimento de radícula reduzido, razão de radícula alterada:crescimento de plúmula, radícula modificada: ângulo da plúmula, cor alterada da radícula ou plúmula, forma, tamanho ou densidade de semente alterada e razão alterada de larguraxomprimento de radícula.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a população de palmeiras compreende palmeiras plantadas em viveiros ou nos campos em que a morfologia de crescimento ou padrão de crescimento atípico são um ou mais de crescimento vegetativo mais lento, razão reduzida de largura de folíolo para comprimento, distância reduzida de intemodos de fronde, ângulo de fronde para eixo de planta, cor da folha, e florescimento precoce.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o fenótipo atípico é a germinação de dois ou mais embriões a partir de uma única semente.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o fenótipo atípico pelo qual as plantas são selecionadas é selecionado dos fenótipos atípicos mostrados de testes anteriores correlacionar-se com o caráter haplóide ou di-haplóide.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a avaliação adicional de heterozigosidade usando marcadores de DNA múltiplos compreende usar entre 50 e 200, por exemplo entre 70 e120 marcadores de microssatélite.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de1 a 8 e 10 a .12, caracterizado pelo fato de que a planta é uma semente germinada ou muda.

14. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de avaliar ainda mais a homozigosidade das plantas selecionadas usando múltiplos marcadores moleculares usa amostras reunidas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma planta selecionada é classificada como carecendo de heterozigosidade se ela mostra apenas um alelo por local para cada marcador molecular usado.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a população compreende pelo menos 1.000.000 de plantas.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a população de plantas compreende entre 5.000.000 e20.000.000 de indivíduos.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de1 a 17, caracterizado pelo fato de que uma ou mais plantas classificadas como haplóides ou haplóides duplicados são subsequentemente usadas no desenvolvimento, multiplicação ou produção de semente.

19. Planta, caracterizada pelo fato de que é descendente de células somáticas ou reprodutivas de uma planta selecionada por um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18.

20. Clones, pólens ou óvulos de uma planta, caracterizados pelo fato de que são selecionados por um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 ou de uma planta como definida na reivindicação 19.

21. Método para produzir uma planta de dendezeiro homozigota haplóide duplicada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) selecionar uma planta haplóide usando um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 5 a 17; (b) obter uma planta haplóide duplicada através da duplicação de cromossomos espontânea; ou pela duplicação do número de cromossomos pela aplicação de um estímulo externo à planta haplóide; ou pela aplicação de um estímulo externo a uma célula ou células isoladas da planta haplóide, seguido pela regeneração de uma planta usando cultura de tecido; ou pela auto-polinização ou clonagem ou polinização da planta haplóide.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar dois haplóides duplicados distintos obteníveis pelos métodos como definido na reivindicação 4 ou como definido na reivindicação 21, ou progênie de tais haplóides duplicados.

23. Método para identificar plantas haplóides duplicadas em uma população de progênie de um precursor matemo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) identificar pelo menos 20 locais não ligados heterozigotos no precursor matemo, usando marcadores moleculares codominantes tais como microssatélites ou marcadores com base em SNP; (b) realizar uma triagem preliminar da população usando 1 a 5 dos marcadores identificados; descartando os heterozigotos; retendo o restante como haplóides duplicados candidatos (c) aplicar a citometria de fluxo ou outro método para medir DNA aos candidatos retidos; descartar os haplóides; reter os diplóides como haplóides duplicados potenciais; (d) aplicar pelo menos um adicional de 15 dos marcadores remanescentes aos candidatos retidos, e classificar indivíduos que são diplóide e homozigotos para todos os marcadores aplicados como haplóides duplicados.

24. Plantas, caracterizadas pelo fato de que são de progênie de células somáticas ou reprodutivas de uma planta haplóide duplicada identificada pelo método como definido na reivindicação 23.

25. Planta de dendezeiro, caracterizada pelo fato de que é haplóide.

26. Planta de dendezeiro, caracterizada pelo fato de que é haplóide duplicada.

27. População de plantas ou sementes de dendezeiro híbridas Fi geneticamente uniformes, caracterizada pelo fato de serem obteníveis do cruzamento de duas plantas como definidas na reivindicação 26.

28. Produtos colhidos e extraídos, incluindo óleo e sementes, caracterizados pelo fato de que são de uma planta condições como definidas na reivindicação 26 ou 27.

29. Método para obter azeite de dendê, caracterizado pelo fato de que compreende a extração da fruta de um dendezeiro híbrido F; criado a partir de precursores haplóides duplicados.