CN102893862B - 一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法，是切取油棕母株茎干生长点上的油棕茎段，然后取油棕嫩叶修剪成片样，接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养得到愈伤组织；将愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行培养得到胚性愈伤组织。本发明步骤简单，以油棕幼嫩叶片为外植体诱导形成胚性愈伤组织，建立高效的油棕胚性愈伤组织培养体系，提高油棕胚性愈伤组织的产量，有效地解决了油棕胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低的问题，为建立油棕组织培养体系、快速繁育油棕组培苗奠定基础，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
Description
技术领域
本发明属植物组织培养技术领域，涉及一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法。
背景技术
油棕属多年生单子叶植物，是热带木本油料作物，其果肉、果仁含油丰富，是世界重要的木本油料作物，单位面积的产油量是花生的7～8倍，被誉为“世界油王”。油棕组织培养技术是一种油棕新型繁育技术，通过油棕组织培养技术培育的油棕优良无性系具有产量高、抗逆性强等优良性状，具有良好的市场应用前景。
目前，油棕组织培养技术中，主要采用油棕嫩叶和花序作为外植体材料，由于棕榈属植物本身的生物学特性，外植体材料中含多酚类等物质含量高，因此通过组织培养途径获得离体再生植株比较困难，特别是在胚性愈伤组织诱导、体细胞胚发生等阶段诱导率较低，目前胚性愈伤组织的平均诱导率在2%～10%，因此能否获得油棕胚性愈伤组织，并达到相对较高的诱导率水平是影响油棕无性繁殖效率的主要瓶颈之一，是整个技术的主要难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法，以油棕幼嫩叶片为外植体诱导形成胚性愈伤组织，建立高效的油棕胚性愈伤组织培养体系，提高油棕胚性愈伤组织的产量，为建立油棕组织培养体系、快速繁育油棕组培苗奠定基础，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
本发明所采用的技术方案：
一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法，其步骤如下：
1、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。油棕母株的切面在外植体采集后，对切面进行防护处理，待恢复生长后可以重新取样。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养得到愈伤组织，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。所述愈伤组织诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加激素和活性炭1～5g/L，pH值为5.0～6.0，所述激素是NAA、2,4-D或TCPP中的一种、两种或三种，其添加量分别为：NAA200mg/L以下、2,4-D 60mg/L以下、TCPP 2mg/L以下。
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整其中的肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行培养得到胚性愈伤组织，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加激素和活性炭1～5g/L，pH值为5.0～6.0，所述激素是NAA或2，4-D中的一种或两种，其添加量分别为：NAA 140mg/L以下、 2，4-D 20mg/L以下。
本发明步骤简单，以油棕幼嫩叶片为外植体诱导形成胚性愈伤组织，建立高效的油棕胚性愈伤组织培养体系，提高油棕胚性愈伤组织的产量，有效地解决了油棕胚性愈伤组织诱导困难、诱导率低的问题，为建立油棕组织培养体系、快速繁育油棕组培苗奠定基础，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
附图说明
图1为油棕叶片培养3个月后获得的油棕愈伤组织。
图2为油棕愈伤组织培养3个月后获得的油棕胚性愈伤组织。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
1、外植体的选取
选取树龄8年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上25cm至60cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 180mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+NAA20mg/L+活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
实施例二
1、外植体的选取
选取树龄约9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上30cm至60cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干后的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+2,4-D 40mg/L+活性炭2.5g/L，pH值为5.8）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+2,4-D2mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.8）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
实施例三
1、外植体的选取
选取树龄约9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上20cm至70cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干后的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 60mg/L + TCPP 1mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+ NAA10mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养得到胚性愈伤组织，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
实施例四
1、外植体的选取
选取树龄约10年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至85cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干后的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+2,4-D 20 mg/L + TCPP 1mg/L +活性炭2.0g/L，pH值为5.8）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+ 2,4-D 2.5mg/L +活性炭2.0g/L，pH值为5.8）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
实施例五
1、外植体的选取
选取树龄约9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上45cm至90cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干后的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 30mg/L+2,4-D 10mg/L+TCPP 2mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+ NAA20mg/L+活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
实施例六
1、外植体的选取
选取树龄9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上25cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干后的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基（改良MS培养基+NAA 20mg/L+2,4-D 20 mg/L+ TCPP 2mg/L+活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养6个月后在油棕叶片的次级叶脉出开始出现油棕愈伤组织，所得结果见表1。
3、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基（改良MS培养基+ NAA10mg/L +2,4-D 10 mg/L +活性炭2.5g/L，pH值为5.6）中进行培养，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次。培养3个月后可得到油棕胚性愈伤组织。所得结果见表1。
表1组织培养的效果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种油棕胚性愈伤组织的诱导方法，其特征在于，其步骤如下：
1）、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶；
2）、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中进行培养得到愈伤组织，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次；所述愈伤组织诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加激素和活性炭1～5g/L，pH值为5.0～6.0，所述激素是NAA、2,4-D或TCPP中的一种、两种或三种，其添加量分别为：NAA200mg/L以下、2,4-D 60mg/L以下、TCPP 2mg/L以下；
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整其中的肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L；
3）、胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行培养得到胚性愈伤组织，培养条件：暗培养，培养温度26～30℃，每3个月继代一次；所述胚性愈伤组织培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加激素和活性炭1～5g/L，pH值为5.0～6.0，所述激素是NAA或2，4-D中的一种或两种，其添加量分别为：NAA 140mg/L以下、2，4-D 20mg/L以下。
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