CN101448391A - 使用高通量、非破坏性种子取样的种子选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过应用高通量、非破坏性种子取样促进种质改良工作的新的方法。在一个实施方案中，用于分析种子群体中单粒种子的高通量、非破坏性方法包括从群体的大量种子中提取样品，同时保持种子的发芽势，并且分析样品是否存在至少一个遗传或化学性状的一个或多个特征。

Description

使用高通量、非破坏性种子取样的种子选育方法

发明领域

本发明涉及植物育种领域。更准确地讲，本发明提供用高通量和非破坏性种子取样技术，提高并精简种质改良工作的方法。

发明背景

本部分的陈述仅提供与本公开内容有关的背景资料，并不构成现有技术。

在植物发育和改良中，通过选择育种或遗传操作对植物进行遗传改良，并且当获得所需要的改良时，经过若干代的种植并收获种子，从而发展成为商业用数量级。为了加速植物改良的过程，进行统计取样和检验，以便从已经遗传或具有所需性状的群体中选出种子。然而，这种统计取样必然使某些没有所需性状的种子保留在种子群体中，也可能无意中将具有所需性状的种子排除在所需的种子群体之外。不是所有种子都遗传或具有所需要的性状，因此，仍然需要将这些种子从群体中精选出来。

已经对高通量、非破坏性种子取样器和取样方法进行了描述，这些取样器和取样方法可供单粒种子分析使用，从而克服了统计样本方面的阻碍。例如，下列专利申请中公开了用于种子的自动取样器和自动取样系统以及种子的取样、检验和增加(bulking)方法：美国专利申请顺序号11/213,430(2005年8月26日申请)、美国专利申请顺序号11/213,431(2005年8月26日申请)、美国专利申请顺序号11/213,432(2005年8月26日申请)、美国专利申请顺序号11/213,434(2005年8月26日申请)和美国专利申请顺序号11/213,435(2005年8月26日申请)，所述专利申请都通过引用全部结合到本文中。

本发明利用高通量、非破坏性种子取样系统，满足了本领域改进育种方法的需求。

发明概述

本公开内容涉及通过用高通量、非破坏性种子取样来促进种质改良工作的系统和方法。用自动化非破坏性取样，可检测群体中的单粒种子，并且只选出具有一个或多个所需特征的种子。这就为种质改良和管理提供了新的更有效的方法，导致育种群体得到改良。

在一个实施方案中，本公开内容提供用于对种子群体中的单粒种子进行分析的高通量、非破坏性方法。该方法包括从群体的大量种子中选取样品，同时保持种子的发芽势，并且分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。

在另一个实施方案中，本公开内容提供用于分析单倍体种子群体的高通量方法。该方法包括从单倍体种子群体的大量种子中选取样品，同时保持种子的发芽势，并且分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。

在又一个实施方案中，本公开内容提供用于增加加倍单倍体种子群体的高通量方法。该方法包括提供包含单倍体种子的种子群体，从种子群体中选出一粒或多粒具有至少一个优选特征的种子。然后，由选出的种子培育出加倍单倍体种子，从每粒加倍单倍体种子中选取样品，同时保持种子的发芽势。分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。根据分析结果，选出一粒或多粒加倍单倍体种子，由选出的加倍单倍体种子培育出植物或植物组织。

在本发明的各个实施方案中，可以对样品的一个或多个指示至少一个化学性状的特征进行分析。这些特征的实例可包括蛋白质、油、糖类、脂肪酸、氨基酸、生物聚合物、药物、淀粉、发酵淀粉、次生化合物和代谢物。

在本发明的其它各个实施方案中，可以对样品的一个或多个指示至少一个遗传性状的特征进行分析。这些特征的实例可包括遗传标记、单核苷酸多态性、简单序列重复、限制性片段长度多态性、单元型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微小RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、双链mRNA、转录谱(transcriptional profile)和甲基化模式。

本发明教导实用性的其它方面从本文所提供的描述来看是显而易见的。应当理解的是，本文的描述和具体实施例仅用于说明目的，并不意味着限制本发明教导的范围。

附图简述

本文所描述的附图仅用于说明目的，并不意味着以任何方式限制本公开内容的范围。

图1是表示实施例3中所述进行PCR以检测特定SNP的玉米胚乳组织样品的等位基因图。

图2曲线图说明实施例6中所述的预选对驱动有利单元型频率的功效。

发明详述

下面的描述实质上只是示例性的，并不意味着限制本公开内容、应用或用途。

本发明提供通过用高通量、非破坏性种子取样来促进种质改良工作的新方法。该方法可用于种子分析以鉴定和选出包含一种或多种所需性状、标记和基因型的种子。在本发明的一个方面，分析方法能够对存在于大批或大量种子群体中的单粒种子进行分析，从而可以测定单粒种子的化学和/或遗传特征。

通过本发明制备的样品可以用于测定多种物理、形态、化学和/或遗传性状。一般通过对样品的一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征进行分析来测定这些性状。指示化学性状的特征的非限制性实例包括蛋白质、油、糖类、脂肪酸、氨基酸、生物聚合物、药物、淀粉、发酵淀粉、次生化合物和代谢物。因此，化学性状的非限制性实例包括氨基酸含量、蛋白质含量、淀粉含量、发酵产量、发酵效率、能量产量、油含量、蛋白质谱的测定、脂肪酸谱的测定、代谢物谱的测定，等等。

指示遗传性状的特征的非限制性实例可以包括例如遗传标记、单核苷酸多态性、简单序列重复、限制性片段长度多态性、单元型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、微小RNA、siRNA、数量性状基因座(QTL)、卫星标记、转基因、mRNA、双链mRNA、转录谱和甲基化模式。

在一个实施方案中，胚乳组织取样能够测定等位基因频率，从而可能推断出特定标记的亲本连锁相。此外，两个或更多个种质库之间等位基因频率数据的比较可供深入了解选择目标，从而推测与一个或多个性状分布转变有关的频率增加的等位基因与所述一个或多个目标性状连锁。同样，评价品系间的相对等位基因频率数据可有助于遗传连锁图的构建。

在另一个实施方案中，本发明的方法应用高通量、非破坏性种子取样与加倍单倍体技术一起以助于种质改良工作，包括只选择用于加倍的优选种子从而精简加倍单倍体程序、对用于基因型和化学特征两者的单倍体和加倍单倍体材料进行高通量分析、性状整合和评价以及标记辅助育种。

本发明的方法和装置可用于育种程序以选出具有所需遗传或化学性状的植物或种子，其中所需遗传性状包括基因型、单元型、等位基因、序列、转录物谱和甲基化模式。本发明的方法可与任何育种方法联用，并且可以用来选择单代或选择多代。育种方法的选择取决于植物繁殖的方式、待改良性状的遗传力和商用栽培种的类型(例如，F1杂交栽培种、纯系栽培种等)。精选的本发明植物育种的非限制性方法见下文。还要理解的是，任何商业用和非商业用的栽培种都可用于育种程序。包括例如但不限于出苗势、营养生长势(vegetative vigor)、胁迫抗性、抗病性、抽条、开花、结实、种子大小、种子容重、抗倒伏性(standability)和脱粒性等因素通常决定了选择。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法用来测定标记辅助育种程序中种子的遗传特征。该方法供改进标记辅助育种程序之用，其中可以进行非破坏性直接种子取样，同时又保持从种子取样器到田间的各粒种子的特性。因此，标记辅助育种程序导致“高通量”和更有效的平台，其中只需要用较少的土地和人力资源，就可以使具有所需性状、标记或基因型的种子群体在较短时间内更有效地增加。下面将更详细地描述这些优势。

在一个实施方案中，本发明提供用于具有遗传差异的种子群体内单粒种子的分析方法。该方法包括从群体内的种子中取出包含带有核酸的细胞的样品而又无需影响种子的发芽势；分析从样品中提取的核酸是否存在至少一个遗传标记；根据核酸分析结果从群体中选出种子，由选出的种子培育出植物。

如上所述，本发明的取样系统和方法保护种子的发芽势，因此是非破坏性的。发芽势是指取样后大多数样本种子(即所有样本种子的50％以上)保持活力。在一个具体的实施方案中，至少约75％的样本种子保持活力，在某些实施方案中至少约85％的样本种子保持活力。应当注意，在某些情况下或对于某些应用，较低比率的发芽势尚可接受，例如，基因分型成本随时间降低，因为在相同基因分型成本下可对更多种子取样。还应当注意，取样完全不必对发芽势产生任何影响。

在另一个实施方案中，发芽势在取样后至少约6个月保持不变，以确保样本种子直到到达田间用于种植时都可萌发。在具体的实施方案中，本发明的方法还包括对样本种子进行处理以保持萌发势不变。这类处理一般可包括在贮藏或运输时保护种子不受环境条件影响的本领域已知的任何方法。例如，在一个实施方案中，样本种子可以用聚合物和/或杀真菌剂处理，以便在贮藏中或在运输到田间种植之前保护样本种子。

在一个实施方案中，本发明的样品可用于种子群体中单粒种子的高通量、非破坏性分析方法。该方法包括从种子中取出样品，同时保持种子的发芽势；分析样品是否存在一个或多个指示遗传或化学性状的特征。该方法还可包括根据分析结果，从群体中选出种子；以及由选出的种子培育出植物或植物组织。

可以采用本领域技术人员已知的可以提供足够DNA产量、DNA质量、PCR反应和测序方法反应的任何DNA提取方法，从样品中提取DNA。合适的DNA提取方法的非限制性实例是基于SDS的提取和离心方法。另外，可以采用本领域技术人员已知的任何扩增方法，在提取DNA后对提取的DNA进行扩增。例如，一种合适的扩增方法是

 DNA扩增法(得自Amersham Biosciences)。

此外，可以采用本领域技术人员已知的可提供足够RNA产量、RNA质量、PCR反应和测序方法反应的任何RNA提取方法，从样品中提取RNA。合适的RNA提取方法的非限制性实例是基于SDS的提取和离心方法，同时需要考虑无RNA酶试剂和供应。另外，可以采用本领域技术人员已知的任何扩增方法，在RNA提取后对提取的RNA进行扩增。例如，一种合适的扩增方法是Full Spectrum^TM RNA扩增法(得自System Biosciences)。

分析提取的核酸是否存在合适的遗传多态性。用于遗传多态性分析的大量遗传标记是可获得的，并且为本领域技术人员所知。本文所用遗传标记包括但不限于简单序列重复(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、插入或缺失(Indel)、单特征多态性(single feature polymorphism，SFP，例如参见Borevitz等，2003 Gen.Res.13：513-523)或转录谱和核酸序列。分析核酸是否存在遗传标记，可用来从育种群体中选出种子。该分析可用来选择包含遗传标记或与遗传标记连锁的基因、QTL、等位基因或基因组区(单元型)。由此可见，分析方法是本领域已知的，包括但不限于基于PCR的检测方法(例如TaqMan分析法)、微阵列方法和核酸测序方法。可用最新分子生物学技术连同改进的经典育种策略一起鉴定待选择的基因、等位基因、QTL或单元型。

任何种子都可用于本发明的方法或装置。在一个具体的实施方案中，种子选自苜蓿种子、苹果种子、香蕉种子、大麦种子、菜豆种子、青花椰菜种子、蓖麻子种子、柑桔种子、三叶草种子、椰子种子、咖啡种子、玉米种子、棉花种子、黄瓜种子、北美黄杉种子、桉树种子、火炬松种子、亚麻籽种子、甜瓜种子、燕麦种子、橄榄种子、棕榈种子、豌豆种子、花生种子、胡椒种子、杨树种子、辐射松(Radiata pine)种子、油菜籽种子、水稻种子、黑麦种子、高粱种子、南部松种子、大豆种子、草莓种子、甜菜种子、甘蔗种子、向日葵种子、枫香种子、茶树种子、烟草种子、番茄种子、草坪草种子、小麦种子和拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子。在一个更具体的实施方案中，种子选自棉花种子、黄瓜种子、玉米种子、甜瓜种子、大豆种子、油菜籽种子、水稻种子和小麦种子。在一个甚至更具体的实施方案中，种子为玉米种子或大豆种子。

在另一个实施方案中，通过本文所述方法分析的作物包括饲料作物、油料种子作物、谷类作物、果树、观赏植物、蔬菜作物、纤维作物、食用香料作物、坚果作物、草坪草作物(turfcrop)、糖料作物、饮料作物、块茎作物、块根作物和森林作物。

在一个实施方案中，根据遗传上与QTL连锁的一个或多个特征是否存在来选择种子。常常是有益的QTL的实例包括但不限于除草剂耐受性、抗病性、昆虫或有害生物抗性、脂肪酸、蛋白质或糖类代谢改变、谷物产量增加、油含量增加、营养含量增加、生长速度加快、胁迫耐受性增强、优先成熟(preferred maturity)、感官特性改善、形态特征改变、其它农艺性状、工业用途性状或适应消费者需求的性状或性状的组合(作为多性状指数)。或者，根据在遗传上与QLT相关单元型联锁的一个或多个特征是否存在来选择种子。这种QTL的实例同样可包括但不限于除草剂耐受性、抗病性、昆虫或有害生物抗性、脂肪酸、蛋白质或糖类代谢的改变、谷物产量增加、油含量增加、营养含量增加、生长速度加快、胁迫耐受性增强、优先成熟、感官特性改善、形态特征改变、其它农艺性状、工业用途的性状或适应消费者需求的性状或性状的组合(作为多性状指数)。

如果在最初的育种杂交中采用纯合近交亲本，则育种群体的选择可早至F2育种水平时便可开始。如果一个或多个杂交亲本对于目标等位基因或标记是杂合的，则也可以在F1代取样并继续育种。育种人员可分析F2群体以在群体中重新得到每一粒种子的标记基因型。可以调整最初的群体大小(只局限于可获得的用于分析的种子数量)，以满足成功鉴定所需个体数量的所需概率。参见Sedcole，J.R.＂Number of plants necessary to recover a trait(恢复性状所必需的植物数量)＂Crop Sci.17：667-68(1977)。因此，可以改变测定所需基因型的概率、最初的群体大小和目标所得群体大小，用于各种不同的育种方法和抽样群体的育种水平。

可以根据育种方法和目标，将选出的种子合在一起保存，或者分开保存。例如，当育种人员要分析F2群体的抗病性时，可将具有所需基因型的所有个体混合在一起，并种植在育种区内。相反地，如果要从给定群体中选出具有性状变化效应(例如谷物产量)的多个QTL，则育种人员可以保护各个特性，种植到田间以区分开具有不同目标QTL组合的个体。

在将种子从取样地点转移到田间时，可以采用保护单粒种子特性的若干方法。方法包括但不限于将选出的个体转移到种子条(seedtape)、盒式盘(cassette tray)或刻度盘(indexing tray)中，用泥炭营养钵移栽以及用单个种子袋进行人工种植。

可根据育种目标和遗传复杂性使用多轮筛选。

采用本发明方法的优势包括但不限于节约每个群体或育种系所需的人力资源和土地资源，提高评价每块田间单元较大量的育种群体的能力，提高在种植前分析育种群体所需性状的能力。通过限制所需基因型生长所需的田间空间来节约每个群体的土地资源。例如，按25粒种子/行种植1,000个体的群体在田间总共占用40行。采用常规组织取样，可将所有1,000株植物加上标签，通过进行人工采样截取叶片组织。授粉前可能需要分子标记结果，并且只对含有所需遗传组成的植物授粉。因此，如果对含有所需遗传组成的50粒种子进行测定，常规育种方法则可能需要种植1000株植物才会留存所需的50粒种子。相比之下，本发明的方法使得育种人员能够在实验室中对1,000粒种子进行分析，并且在种植前选出50粒所需种子。然后，可将50粒种植到田间，仅占用两行，每行25粒种子。另外，本发明的方法不需要加标签或在田间取样，从而大大节约了所需要的人力资源。

除减少每个群体的田间行数以外，本发明的方法还可增加在规定育种区内育种人员可评价的群体数。用上述实例为例，其中每1000粒种子群体中有50粒种子含有所需遗传组成，育种人员采用本发明的方法，分别用由单个群体占用相同的农田面积，采用常规田间组织采样技术，便可评价20个群体的各50粒种子。即使选择群体的单个等位基因，对于F2群体采用1:2:1的预期分离比率，育种人员也能按单个田间组织抽样群体在相同农田面积上评价4个群体。

本发明方法又一个潜在的优势是降低与在某些地区栽培植物有关的风险，植物可能在这些地区生长不良，或者遭受恶劣的环境条件，或者甚至在暴风雨中被摧毁。例如，可将具有“最佳”基因型或标记组成的种子种植在地区1，可将具有“次佳”基因型的种子种植在地区2。在这种情况下，地区2可能是备份，以防在地区1栽培的植物发生任何问题。这对于从用于基因分型的发芽植物中提取组织样品的传统方法是非常困难的，因为这些植物甚至还可能需要连根拨起，并移栽到第二地区。应用本发明的方法避免了移栽的问题，还简化了育种程序中的物流。

本发明的方法还可用于将性状渐渗到植物中的育种程序。该方法包括提取包含细胞的样品，该细胞具有得自某一群体种子的核酸，分析从每粒种子中提取的核酸是否存在至少一个遗传标记，根据核酸分析结果从群体中选出种子；由种子培育出能育植物；利用能育植物作为母本或父本与另一植物杂交。

选择用于种子性状整合的遗传分析的实例包括但不限于鉴定高轮回亲本等位基因频率、跟踪目标转基因或筛选不存在不需要的转基因、选择杂交检验种子、选择表达目标基因的种子、选择表达可遗传表型的种子、鉴定具有精选遗传基因座的种子和接合性试验。

通过本发明的方法鉴定出高的轮回对等位基因频率再次使得种植在给定田间单元内的行数/群体减少、群体数或者近交系增加。因此，本发明的方法还可有效减少完成近交系转变所需要的资源。

本发明的方法还可以通过确保在种植前鉴定出并去除受管制的或不必要的转基因、不良的遗传性状或不良的遗传表型，来提供质量保证(QA)和质量控制(QC)。质量保证能力方面，本申请可有效排除无意带出的违规(unintentional release infraction)。本发明方法的进一步延伸到筛选存在的感染因子，并在运输前除去受污染的种子。

本发明的方法还可适于鉴定用于转基因测试的杂交种子。例如，在BCnF1阶段近交系的转变中，育种人员可以有效生产出一批50％对于目标性状为半合的、50％对于缺乏的性状为纯合的杂交种子(不包括配子选择)，从而生产出用于测试的杂交种子。然后，育种人员可以对在测交中产生的所有F1种子进行分析，鉴定和选出是半合子的种子。这种方法是有利的，因为得自杂交试验的推论可以表示有关性状接合性的商业化杂交遗传性。

本发明用于鉴定、跟踪和堆积目标性状的方法的其它应用具有如上所述的有关所需土地和人力资源的相同优势。转基因转换程序一般在多季节性地点进行，具有高得多的土地和管理成本结构。因此，减少每个群体的行需求或者增加规定田间单元内的群体数对成本基础与适度应用之间的影响更加引人注目。

本发明的方法可用于得自具有两种或更多种转基因的植物的种子，其中通过转化、或通过含有不同转基因区的亲本植物或品系杂交或这些方法的任何组合来加入转基因，以达到转基因区在植物或品系中的积蓄或堆积。可以在与至少一个转基因有关的一个或多个特征存在的基础上进行分析以便选出各粒种子。这类特征包括但不限于转基因本身、与转基因连锁的遗传标记、由转基因表达的mRNA和转基因的蛋白质产物。

本发明的方法另还可通过在单倍体阶段选择所需要的基因型并鉴定倍性水平，以便从正在处理并准备种植到田间的种子中清除掉非单倍体种子，从而提高加倍单倍体程序的效率。两种应用同样也都导致土地资源/群体的减少，形成评价规定田间单元内较大群体数量的能力。

加倍单倍体(DH)植物为植物育种人员提供了十分宝贵的工具，特别是用于产生近交系。因为纯合系基本是立即形成，不需要多代常规近交，所以节省了大量时间。

具体地说，由于加倍单倍体植物是完全纯合的，非常适于定量遗传学研究。可以从加倍单倍体群体估算加性方差和加性x加性遗传方差。其它应用包括鉴定上位效应和连锁效应。育种人员已将加倍单倍体群体特别用于QTL作图、胞质转换和性状渐渗。此外，在检验和评价用于植物育种程序的纯合系中颇具价值。所有的遗传方差都在育种杂交子代之中，这就改善了选择增益。

然而，本领域众所周知的是，加倍单倍体生产方法的效率低下，可能相当耗费劳力。虽然自然界中加倍单倍体植物也可自然地发生，但这是十分罕见的。大多数研究和育种应用都依赖于加倍单倍体产生的人工方法。最初的步骤包括植物的单倍化，这就导致了包含单倍体种子的群体产生。将非纯合系与诱导亲本(inducer parent)杂交，导致单倍体种子的产生。将具有单倍体胚，但是有正常三倍体胚乳的种子继续育种到第二阶段。也就是说，单倍体种子和植物是独立于胚乳倍性水平的具有单倍体胚的任何植物。

从群体中选出单倍体种子后，选出的种子经历染色体加倍以产生加倍单倍体种子。在细胞谱系中，自发染色体加倍将导致产生正常的配子，或者从单倍体细胞谱系产生不减数配子。化合物(例如秋水仙素)的应用，可以用来增加二倍化的速度。秋水仙素与微管蛋白结合，防止其聚合成为微管，因此抑制中期有丝分裂，可用来提高二倍化(即染色体数加倍)的速度。这些嵌合植物自花授粉，产生二倍体(加倍单倍体)种子。培育这类DH种子，随后进行评价并用于杂种测交产生。

然而，加倍单倍体种子的生产方法一般都遇到功效低的问题，即使已经开发出致力于增加DH产生频率的方法，包括用秋水仙素处理。突出的问题包括单倍体种子的产量低，配子成活率降低导致用于加倍单倍体植物形成的自花授粉减少，以及对于育种应用的DH种子产量不足。

本发明的方法由于在单倍体以及二倍体种子阶段提高了选择潜力，从而代表了育种应用中的一个进步。例如，在一个实施方案中，本发明提供单倍体种子群体的高通量分析法。该方法一般包括从群体的大量种子中非破坏性地选取样品，分析样品是否存在指示至少一个本文所述遗传或化学性状的一个或多个特征。

在另一个实施方案中，本发明提供加倍单倍体种子群体的高通量选育方法。该方法包括从单倍体种子群体中选出具有至少一个优选特征的一粒或多粒种子，并由选出的种子生产加倍单倍体种子群体。然后，对每粒加倍单倍体种子进行非破坏性取样，并分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。根据分析结果，选出一粒或多粒加倍单倍体种子，并且从选出的加倍单倍体种子培育出植物或植物组织。

在不同的实施方案中，本发明的方法包括分析种子的一个或多个特征(例如遗传标记)，以确定种子是处于单倍体还是二倍体状态。本发明还提供用于对单倍体和加倍单倍体种子的一个或多个特征进行分析的方法，所述特征例如转基因或与之连锁的标记或转基因的诊断剂、与事件性能、事件评价和性状整合有关的特征。此外，本发明提供为了选择优选的基因型和表型类别经历加倍的单倍体种子的测定方法。

在另一个实施方案中，本发明提供测定连锁相的基础。可以通过用从二倍体植物获得的种子胚乳组织，采用能够检测DNA样品中不同等位基因频率的基因分型系统，来测定亲本标记单元型。由于胚乳组织为三倍体，具有从雌配子得到的2个拷贝，通过仔细研究杂合子代基因型，就可得到亲本系的连锁相(参见图1)。得自胚乳组织的DNA样品可用于测定遗传标记的倍性水平。遗传标记中的二倍体倍性水平表明母性遗传，遗传标记中的单倍体倍性水平表明父性遗传。

此外，使用上述等位基因频率调用(allele frequency calling)，可用差别等位基因频率数据来推断遗传连锁图，但是这不同于需要单倍体材料的方法(Gasbarra等，2006 Genetics 172：1325-1335)。测定遗传连锁图在单元型表征、标记(或单元型)作图-性状联合的情况下特别有用。该方法在单粒与大量种子基础方面都特别稳定，因此十分适于本发明。

在具体的实施方案中，本发明还提供用于预测特定目标基因(GOI)的胚接合性的实验法。该实验法根据每个细胞或每个基因组的GOI与内部对照(internal control，IC)基因的相对拷贝数比率，预测出胚接合性。大体上讲，该实验法使用的是已知接合性的IC基因，例如在基因座上的纯合基因(每二倍体细胞两个IC拷贝)，用于GOI的归一化测量。IC与GOI的相对拷贝数比率预测了细胞内的GOI拷贝数。在纯合细胞中，对于任何指定基因(或单一遗传序列)，基因拷贝数等于细胞的倍性水平，因为该序列存在于所有同源染色体的同一基因座上。当细胞对于特定基因是杂合的(或在转基因的情况下是半合的)，则基因拷贝数将小于细胞的倍性水平。如果检测不到GOI，则细胞缺乏该基因座，正如对于转基因事件的阴性分离子，或者在诱变群体中可能发生的一样。因此可通过细胞中的基因拷贝数，来测定任何基因座上的细胞接合性。

在另一个具体实施方案中，本发明提供用于预测玉米胚接合性的实验法。在玉米种子中，胚乳组织是三倍体，而胚组织是二倍体。胚乳拷贝数反映出胚的接合性：纯合(阳性或阴性)胚乳伴随纯合胚，杂合胚乳(不论GOI拷贝数是1还是2)表示杂合(GOI拷贝数为1)胚。对于IC是纯合的胚乳可含有3个IC拷贝。胚乳GOI拷贝数的范围由0(纯合阴性胚)至3(纯合阳性胚)；胚乳GOI拷贝数为1或2的，则见于其中对于GOI是杂合(或如果GOI是转基因，则对于GOI是半合)的胚的种子。可以用胚乳IC拷贝数与胚乳GOI拷贝数的比率(其范围可为0/3至3/3，也就是说0-1)来测定胚乳GOI拷贝数(其范围可为0-3个拷贝)，然后可用来预测胚的接合性。

可用拷贝数定量测定的任何简便的实验技术，来测定GOI的拷贝数或IC的拷贝数，正如本领域已知的一样。合适的实验法的实例包括但不限于实时PCR(Applied Biosystems，Foster City，CA)和

(Third Wave Technologies，Madison，WI)实验法。优选以IC和GOI序列两者的扩增效率相等或非常相似的方式发展这些实验法。例如，在实时

 PCR实验中，一次扩增循环检测到的来自单一拷贝GOI的信号(源细胞确定为对于GOI是杂合的)迟于来自2个拷贝的IC信号，因为GOI的量是IC的1/2。对于同一杂合样品，实验可测得GOI/IC比率约为1:2或0.5。对于GOI和IC两者都是纯合的样品，将在检测IC信号

的同时检测出GOI信号，Invader实验可测得GOI/IC比率约为2:2或1。

这些指导适用于任何多倍体细胞或单倍体细胞(例如花粉细胞)，因为GOI的拷贝数或IC的拷贝数与细胞的基因组拷贝数(或倍性水平)成比例。因此，可以在三倍体组织(例如玉米胚乳)中进行这些接合性实验法。此外，可以测得GOI的拷贝数超过2个拷贝或数值不同于细胞倍性值。在GOI存在于自发复制的染色体或质粒上以及其它情况下，在GOI通过转座进行复制后，在插入的转基因>2个拷贝的某些转基因事件中，该方法也适于检测多倍体中的GOI。

在植物育种中，为了评价近交的水平(也就是说基因固定的程度)、分离异常(即在转基因种质、母性遗传检测中或用于影响配子适合度的基因座)以及远交水平(即纯合性和杂合性的相对比例)，在一个或多个基因座上测定接合性是有益的。同样，接合性在一个或多个基因座上的程度可用于评价杂种性以及一批特定的种子是否符合销售的商业或法规标准而成为被认证的杂交种子。另外，在转基因种质中，为了区分质量事件并有助于性状整合策略，了解倍性或拷贝数是有益的。

在另一个实施方案中，本发明为改进监测一个或多个种质库的一个或多个遗传特征的变化频率的能力提供了基础，其中所述遗传特征包括标记、等位基因和单元型。该方法为本领域所知，用来比较最新得到的群体与它们的祖先品系之间的遗传标记频率，以便鉴定频率随时间增加的遗传基因座(美国专利号5,437,697和5,746,023)。已经对推测频率超过预期等位基因频率的基因座进行了选择。此外，假定育种程序的主要选择标准是产量，则预期频繁增加的等位基因可能与产量有关。

在具体的实施方案中，本发明提供能够进行单元型辅助育种(haplotype-assisted breeding)的方法。通过对出现具有单元型频率(haplotype frequency)的优良品系的单元型频率与祖先优良品系的单元型频率进行比较(通过谱系分析测定)，鉴定出偏离预期单元型频率的单元型是可能的。此外，通过评价单元型效应(haplotype effect)来评价所述单元型，还可能将频率增加的所述单元型与一套农艺性状的表型结果相关联。可以采用遗传标记对从大量种子中取样的单粒种子的单元型组成进行测定，选出具有优选单元型的种子，继续育种。因此，该项技术使更全面的育种方案和建立高级品系开发程序成为可能。

实施例

下面的实施例只是说明性的，并不以任何方式限制本公开内容。

实施例1

本实施例描述了用基因座上纯合的内部对照(IC)基因(即二倍体胚中的2个IC拷贝和三倍体胚乳中3个IC拷贝)，来预测玉米胚接合性的实验法。在二倍体(或更高倍性)生物(例如玉米)的近交系中，内源性内部对照基因通常是纯合的；在这类生物第一代的转基因事件(在玉米中称为“R0”)通常是半合的(也就是说转基因通常仅存在于两个或更多个同源染色体的一个上)。玉米(Zea mays)是二倍体生物，因此“单一拷贝”R0事件每个细胞具有1拷贝的GOI，而每单倍体基因组仅0.5个拷贝，“两个拷贝”R0事件每个细胞具有2个拷贝的GOI，而每单倍体基因组仅1个拷贝，以此类推。

在本实施例中，微管蛋白被用作IC基因，GOI为编码新霉素磷酸转移酶II(NPT II)的转基因，被用于筛选卡那霉素抗性。胚乳(三倍体)组织取自种子(通过人工取样或通过用本发明的自动取样器刮擦种子)。使已取胚乳样品的种子萌发，另从成功发芽的植物中采取叶片组织(二倍体)的样品用于遗传分析。该叶片组织与胚接合性直接相关，因此用来证明一般预示胚接合性的胚乳接合性，并证实纯合性由胚乳中调用。从胚乳组织和叶片组织中提取了总的基因组DNA，并采用

实验法与对目标基因NPT II或对内部对照基因微管蛋白特异性的寡核苷酸探针进行了了定量分析。采用常规分子生物学技术测定了GOI与IC的比率。参见表1。多项实验的结果概括于表2。

结果表明胚乳接合性一般预示着胚的接合性(正如叶接合性所表示的一样)，对于所有萌发的种子，在预测纯合性时都是可靠的。此外，胚乳接合性分析几乎未给出假阴性纯合预测结果(尤其当用自动取样器获得胚乳组织时)。这些结果证实，对于已知倍性水平的细胞，GOI拷贝数与IC拷贝数的比率表明细胞的接合性。此外，本发明的接合性实验法可以预测一个组织基于另一个组织接合性的接合性，也就是说，该实验法可以预测基于胚乳接合性的胚接合性。

表1

表2

 

胚乳取样方法	胚乳分析鉴定的纯合种子数	不萌发纯合种子预测数	基于叶片分析的确定纯合调用数	基于胚乳分析的假阴性纯合调用数
					人工	8/36	0	8(所有)	5(13.9％)
自动	6/24	1	5	0
					人工	6/36	0	6(所有)	2(5.6％)
自动	6/24	1	5	0
					人工	5/36	0	5(所有)	7(19.4％)
自动	7/24	2	5	0
					人工	7/36	1	6	0
自动	5/24	2	3	0

实施例2

本实施例说明本发明方法在用于标记辅助选择低亚麻酸大豆的程序中的用途。

大豆是最有价值的豆科作物，由于其独特的化学组成而具有许多营养和工业用途。大豆种子是植物油的重要来源，用于全球性的食物产品。大豆油的亚麻酸(18:3)水平相对较高(通常约8％)，降低了其稳定性和香味。大豆油的氢化用来降低亚麻酸(18:3)的水平，并改进大豆油的稳定性和香味。然而，氢化作用导致反式脂肪酸的形成，当食用后增加了冠心病的风险。该性状的数量性质使得低亚麻酸大豆的开发变得十分复杂。研究发现已经开发出来的低亚麻酸大豆品种的产量低，限制了其在大多数商业情况下的实用性。要开发出具有商业重要性的产品，在大多数大豆栽培种发育程序中最优先的便是种子产量。

本发明方法应用的实例是选出具有产量高和亚麻酸含量低的大豆植物。大豆子代由于涉及低亚麻酸，因此其性能主要依赖于Fad3-1b和Fad3-1c上的两个重要的数量性状基因座(QTL)。对分离植物的分析证实，Fad3-1b和Fad3-1c互作控制大豆中的亚麻酸含量。因此，通过采用Fad3-1b和Fad3-1c的标记组合，育种人员可以应用本发明的方法准确地预测大豆植物中的亚麻酸含量。所述标记可以用来推测在育种过程任何阶段中种子的基因型状况，例如，在已完成的近交系阶段或F1、F2、F3等。

可通过让两个近交大豆品系进行杂交(例如，将含有与低亚麻酸含量有关的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因的植物与缺乏这些等位基因的植物杂交)，随后通过天然自花授粉，产生杂交种子F1。由于标记可以用来推测从该近交系相互杂交所获得的单粒种子的基因型状况，因此可以进行早期子代(例如F2)标记辅助育种。

在环境温度和湿度下，大豆种子通常在水分8％(以干重计)时达到平衡。在该水分水平下，大豆种子在取样时往往开裂。为了降低种子开裂，应使种子湿润至12％的水分水平。如果按此方式预处理，则种子开裂将显著减少至<5％。

选出的具有所需基因型的F2种子可以根据育种目的合在一起保存，或者分开保存。如果从规定群体中选出具有变化效应的多个QTL，则育种人员应当保护单粒种子特性，以便与具有目标抗性QTL不同组合的单粒种子区分开来。将这些种子种植到具有适当田间识别特性(field identification)的田间。在将种子从取样实验室移栽到田间时，可以采用保持单粒种子特性的若干方法。该方法包括将选出的个体转移到园艺用种子条，该种子条还可包括射频鉴定以辅助鉴定单粒基因分型种子。其它方法可以是用刻度盘、将种子种植在泥炭营养钵中然后移栽，或者从各个种子袋中人工种植。

实施例3

本实施例说明本发明方法在回交育种程序的轮回亲本等位基因程序中的用途。

可以采用本发明方法用于选出转基因以及鉴定轮回亲本等位基因。种植前鉴定具有所需轮回亲本等位基因频率的基因型，使得行数/群体在整个育种程序中减少，并使在规定田间单元内转变程序中所包括的群体数增加。这就导致了土地利用得到改善，土地和人力成本降低等。

用于回交育种程序轮回亲本等位基因的玉米胚乳组织分析的实例见图1。

实施例4

本实施例说明本发明方法在DNA品系指纹分析和连锁相测定中的用途。

结合单粒种子DNA的聚集，品系指纹分析无需在田间采集品系样品便可完成。

通过使用得自二倍体植物的种子胚乳组织(大豆种皮中)，可以采用能够检测DNA样品中不同等位基因频率的基因分型系统测定亲本标记单元型。由于胚乳组织是三倍体，具有从雌配子得到的2个拷贝，因此可以仔细分析杂合子代基因型得到亲本系的连锁相。得自胚乳组织的DNA样品可用于测定遗传标记的倍性水平。遗传标记中的二倍体倍性水平表明母性遗传，遗传标记中的单倍体倍性水平表明父性遗传。

实施例5

本实施例说明用于评价分离异常的转基因种子的本发明方法。在母体单倍体诱导分离中，诱导了A系(纯合事件1和事件2)和B系(纯合事件1)之间杂交的F1种子。所得种仁用胚芽颜色进行选择以获得推定的单倍体种子群体。

选择得自推定单倍体种子群体的个体推定单倍体种仁，并且按照美国专利申请顺序号11/213,435(公布号：US 2006/004624)中的概述，用自动化种子取样器系统进行非破坏性取样，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。将标记应用于样品中以测定事件2基因和事件1基因的存在。取样过程是剪开少许果皮和胚乳组织，将其用作分析基料。重要的是注意，胚乳组织是三倍体，含有来自两个亲本的遗传供给。如果用这个方法检测目标基因，则可准确地预测单倍体胚中所需基因的存在。对于本项研究的目的，对得自180粒种仁的样品进行了分析，数据得自175个取样结果。

如下表3所示，对于事件1基因，测试为阳性的每个种子样品，与预期一样，对于事件2基因，大约50％的种子样品测试为阳性，证实无分离异常。

表3

 

谱系	事件2	事件1
			染色体	6	8
位置	38	63
亲代检查
			A系	阳性	阳性
B系	阴性	阳性
			KHI1	阴性	阴性
			选出的种仁	175	175
阳性总数	92/175	175/175
			阴性总数	83/175	0/175

本项研究结果表明，可在单倍体基础上采用高通量、非破坏性种子取样选择个体基因性状作为筛选机制。

实施例6

本实施例说明利用自动化、高通量取样在从种子群体中预选单倍体种子中的效用。

该实验包括用非破坏性、高通量种子取样系统抽取20个F2群体样品，对于样品进行分析以验证预选的单倍体种子。对每个群体的F2种子进行非破坏性取样，或者对F2植物进行组织取样用于DNA分析。按美国专利申请顺序号11/213,435(公布号：US 2006/004624)中的概述，用自动化种子取样器系统从种子群体的单粒种子中收集未受破坏的种子样品，所述专利通过引用全部结合到本文中。基于建模参数，选择具有所需单元型的最大等位基因频率的材料，由此选择所需基因型。选出的F2植物用诱导性雄性授粉者(inducing male pollinator)的单倍体进行授粉，收获所得种子。收获种子后，从非单倍体种子中分捡出单倍体种子，用非破坏性、高通量取样，在种仁基础上对单倍体进行取样，随后进行基因分型。选择优选的单倍体种子，进行染色体加倍程序以产生加倍单倍体。该方法使得在加倍前剔除非优选的基因型，增加优选材料的频率，所述优选材料将通过资源密集型加倍方法处理。

选出的单倍体种子的比较结果和该方法的功效说明见图2。

当描述本发明实施方案的各种要素或特征时，要素或特征未用数词修饰时意指一个或多个这样的要素或特征。术语“包含”、“包括”和“具有”是开放式撰写方式，表示除了具体指明的要素或特征以外还可能存在额外的要素或特征。因此要理解的是，本文所述的方法步骤、程序和操作不得解释为必需按所论述或说明的特定顺序实施，除非明确规定了实施顺序。还要理解的是可以采用额外步骤或替代步骤。

本公开内容的描述实质上只是示例性的，因此，不偏离本公开内容要点的各种变化也落入本公开内容的范围内。这些改变不得视为偏离了本公开内容的精神和范围。

Claims (32)

1.一种用于分析种子群体中单粒种子的高通量、非破坏性方法，该方法包括：

从所述群体的大量种子中提取样品，同时保持种子的发芽势；和

分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。

2.权利要求1的方法，其中对所述样品的一个或多个指示至少一个化学性状的特征进行分析。

3.权利要求2的方法，其中对所述样品的一个或多个选自以下的特征进行分析：蛋白质、油、糖类、脂肪酸、氨基酸、生物聚合物、药物、淀粉、发酵淀粉、次生化合物和代谢物。

4.权利要求1的方法，其中对所述样品的一个或多个指示至少一个遗传性状的特征进行分析。

5.权利要求4的方法，其中对所述样品的一个或多个选自以下的特征进行分析：遗传标记、单核苷酸多态性、简单序列重复、限制性片段长度多态性、单元型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微小RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、双链mRNA、转录谱和甲基化模式。

6.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据遗传上与QTL连锁的选自以下的一个或多个特征的存在，从种子群体中选出一粒或多粒种子：除草剂耐受性、抗病性、昆虫或有害生物抗性、脂肪酸、蛋白质或糖类代谢的改变、谷物产量增加、油含量增加、营养含量增加、生长速度加快、胁迫耐受性增强、优先成熟、感官特性改善、形态特征改变、其它农艺性状、工业用途的性状或适应消费者需求的性状和性状的组合作为多性状指数。

7.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据遗传上与QTL相关单元型连锁的选自以下一个或多个特征的存在，从种子群体中选出一粒或多粒种子：除草剂耐受性、抗病性、昆虫或有害生物抗性、脂肪酸、蛋白质或糖类代谢的改变、谷物产量增加、油含量增加、营养含量增加、生长速度加快、胁迫耐受性增强、优先成熟、感官特性改善、形态特征改变、其它农艺性状、工业用途的性状或适应消费者需求的性状和性状的组合作为多性状指数。

8.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据表明与轮回亲本结合以助于选择标记辅助回交的一个或多个特征的存在，从种子群体中选出一粒或多粒种子。

9.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据与一个或多个转基因有关的一个或多个特征的存在，从种子群体中选出一粒或多粒种子。

10.权利要求1的方法，其中该方法还包括：

从大量样品中定量测定一个或多个特征；和

将所述定量特征与两个或更多个已知种质库的特征进行比较以鉴定频率变化。

11.权利要求10的方法，其中所述两个或更多个种质库是选自以下的作物：饲料作物、油料种子作物、谷类作物、果树、观赏植物、蔬菜作物、纤维作物、食用香料作物、坚果作物、草坪草作物、糖料作物、饮料作物、块茎作物、块根作物和森林作物。

12.权利要求1的方法，其中该方法包括从种子胚乳组织中提取样品，同时保持种子的发芽势。

13.权利要求12的方法，其中该方法还包括：

对样品的一个或多个等位基因进行分析；和

测定至少一个基因座的倍性水平。

14.权利要求13的方法，其中通过分析样品中得自种子母本的等位基因来测定所述倍性水平。

15.权利要求13的方法，其中通过分析样品中得自种子父本的等位基因来测定所述倍性水平。

16.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据分析结果，从种子群体中选出一粒或多粒种子；由选出的种子培育植物或植物组织。

17.权利要求16的方法，其中该方法还包括在取样后用聚合物和/或杀真菌剂涂覆选出的种子以进一步保护萌发势。

18.权利要求16的方法，其中该方法还包括在从群体中选出种子之前测定种子子代的基因型性质。

19.权利要求16的方法，其中该方法还包括使用由选出的种子培育出来的能育植物作为母本或父本与其它植物杂交。

20.权利要求1的方法，其中该方法还包括根据物理或形态性状存在与否对种子群体进行预分类。

21.权利要求1的方法，其中所述种子群体包括选自以下的种子：苜蓿种子、苹果种子、香蕉种子、大麦种子、菜豆种子、青花椰菜种子、蓖麻子种子、柑桔种子、三叶草种子、椰子种子、咖啡种子、玉米种子、棉花种子、黄瓜种子、北美黄杉种子、桉树种子、火炬松种子、亚麻籽种子、甜瓜种子、燕麦种子、橄榄种子、棕榈种子、豌豆种子、花生种子、胡椒种子、杨树种子、辐射松种子、油菜籽种子、水稻种子、黑麦种子、高粱种子、南部松种子、大豆种子、草莓种子、甜菜种子、甘蔗种子、向日葵种子、枫香种子、茶树种子、烟草种子、番茄种子、草坪草种子、小麦种子和拟南芥种子。

22.一种用于分析单倍体种子群体的高通量方法，该方法包括：

提供包含单倍体种子的种子群体；

从群体的大量种子中提取样品，同时保持种子的发芽势；和

分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征。

23.权利要求22的方法，其中该方法还包括测定选出种子的基因型性质。

24.权利要求22的方法，其中该方法还包括：

从种子群体中选出一粒或多粒具有至少一个优选特征的种子；和

由选出的种子产生加倍单倍体种子。

25.权利要求24的方法，其中所述至少一个优选特征是表型特征。

26.权利要求22的方法，其中对所述样品的一个或多个选自以下特征进行分析：遗传标记、单核苷酸多态性、简单序列重复、限制性片段长度多态性、单元型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微小RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、双链mRNA、转录谱和甲基化模式。

27.权利要求22的方法，其中该方法还包括根据与一个或多个转基因有关的一个或多个特征的存在，从种子群体中选出一粒或多粒种子。

28.权利要求22的方法，其中该方法还包括从种子群体中选出具有一个或多个不良遗传性状的一粒或多粒种子并弃去所选出的种子。

29.一种用于聚集加倍单倍体种子群体的高通量方法，该方法包括：

提供包含单倍体种子的种子群体；

从种子群体中选出具有至少一个优选特征的一粒或多粒种子；

从选出的种子中产生加倍单倍体种子；

从各个加倍单倍体种子中提取样品，同时保持种子的发芽势；

分析样品是否存在一个或多个指示至少一个遗传或化学性状的特征；

根据分析结果选择一粒或多粒加倍单倍体种子；和

从选出的加倍单倍体种子培育出植物或植物组织。

30.权利要求29的方法，其中对所述样品的一个或多个选自以下的特征进行分析：遗传标记、单核苷酸多态性、简单序列重复、限制性片段长度多态性、单元型、标签SNP、遗传标记的等位基因、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5′非翻译区、基因的3′非翻译区、微小RNA、siRNA、QTL、卫星标记、转基因、mRNA、双链mRNA、转录谱和甲基化模式。

31.权利要求29的方法，其中该方法还包括根据与一个或多个转基因有关的一个或多个特征的存在，选出一粒或多粒加倍单倍体种子。

32.权利要求29的方法，其中该方法还包括分析样品存在的诱导物DNA并在选择用于培育植物或植物组织的加倍单倍体种子之前，弃去存在诱导物DNA的加倍单倍体种子。

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