CN103548670A - 利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法 - Google Patents

利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法 Download PDF

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CN103548670A CN201310520240.XA CN201310520240A CN103548670A CN 103548670 A CN103548670 A CN 103548670A CN 201310520240 A CN201310520240 A CN 201310520240A CN 103548670 A CN103548670 A CN 103548670A
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Abstract

本发明涉及分子育种领域，具体地涉及利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法。所述方法包括步骤：（1）根从种胚及种皮的高密度基因型导出杂交种父本及母本的高密度基因型；（2）温室种植该玉米杂交种F1代，套袋自交产生F2种粒；（3）提取玉米F2群体的叶片DNA；（4）以玉米192个SNP位点的低密度基因芯片测定F2群体的SNP的基因型；（5）选择基因型与母本，父本相似度最高的植株套袋自交产生F3种粒；（6）得到的种粒再在温室种植并自交，建立与杂交种父本或母本相似的自交系。与传统杂交种二环系选育的方法相比，这种方法具有周期短（1～2年），且杂优模式固定，有利基因利用率高等特点。

Description

利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法
技术领域
本发明涉及分子育种领域，具体地涉及利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法。
背景技术
玉米是世界和我国播种面积第一的作物。随着玉米需求的进一步增加，耕地在减少，玉米供需关系很可能进一步趋紧。
近几十年来，农业发达国家如美国的玉米育种发展极快。种质资源是种业公司的核心资源，但经常被垄断。欧美玉米杂交种由于具有高产、耐密、品质好、适合机收等特点，目前国内种业企业普遍采用引进专利过期欧美自交系或欧美杂交种二环系选育的方式进行种质资源补充和品种培育。过往这种选育过程主要依靠育种家经验和组配杂交种产量测定（图1），因此周期较长（6～7年），且杂优模式不固定，有利基因利用率低。时间（品种研发周期）决定了商业育种的成败。目前跨国公司品种单产增幅每年约1.2%，平均6-7年即可开发形成新一代品种。单纯采用常规育种手段利用欧美杂交种和专利过期自交系，由于育种周期较长，无法实质缩小与跨国公司的水平差距，更无法形成研发推动销售，销售反哺研发的产业良性循环发展模式。
近年来，大量的玉米SNP分子标记被发现，相应的高通量玉米指纹芯片已被商业化。
反向育种概念由Dirks等提出（Dirks R等人(2006),Reverse Breeding.United StatesPatent20060179498;Dirks R等人(2009),Plant Biotechnology Journal,2009,7:837-845）。基本思路是通过使染色体重组酶失去活性，进而在杂交种的分离后代中的染色体重组现象消失，再使用数量较少的分子标记（每条染色体一个分子标记），结合双单倍体技术，即可在后代中分别选择出与杂交种父本、母本完全一样的可育自交系，由此父本、母本又可以配出原先的杂交种，实现了原杂交种的无限复制。这项技术的核心在于抑制染色体重组酶，可使用基因敲除或直接使用染色体重组酶活性缺失的植株实现。但这项技术无法直接在跨国公司的商业玉米杂交种上使用，因为商业玉米杂交种中染色体重组酶活性正常，除非将杂交种进一步做基因敲除等有相当难度的复杂处理。
近反向育种概念由van Dun等提出（van Dun等人(2008),Near Reverse Breeding.United States Patent20080098496Al.）。基本思路是通过获得部分分离重组2倍体的孢子，再结合双单倍体技术，在后代中分别选择出互补的可育自交系。由此互补自交系又可以配出原先的杂交种，实现了原杂交种的无限复制。这项技术的核心在于促使植物产生2倍体孢子，且成功识别、分离此类孢子。仍然或需要使用转基因技术，或需要流式细胞仪、荧光激活细胞分选术等复杂设备与技术，且仅能选出互补而非与杂交种父母本相似的互补自交系，若应用于商业玉米杂交种，则可能改变杂优模式，产生的自交系无法在杂优群内循环利用。
发明内容
本发明的目的是提供利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法。
根据本发明的利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法包括以下步骤：
（1）根据玉米全基因组重测序结果，提取杂交种种胚，及杂交种种皮的DNA，之后进行DNA的杂交及芯片扫描，检测出杂交种种胚及种皮的高密度基因，由此从种胚及种皮的高密度基因型导出杂交种父本及母本的高密度基因型；
（2）温室种植该玉米杂交种F1代，套袋自交产生F2种粒；
（3）提取玉米F2群体的叶片DNA；
（4）以玉米192个SNP位点的低密度基因芯片测定F2群体的SNP的基因型：
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；
（5）选择基因型与母本，父本相似度最高的植株套袋自交产生F3种粒；
（6）得到的种粒再在温室种植并自交，建立与杂交种父本或母本相似的自交系。
根据本发明的具体实施方式，利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法包括以下步骤，将玉米杂交种还原成与原杂交种父本、母本相似自交系：
（1）根据玉米全基因组重测序结果，Illumina公司开发出了玉米Infinium50K高密度商业芯片，芯片覆盖了遍布玉米全基因组的5万6千个SNP位点，使用该商业芯片测量玉米杂交种及杂交种种皮的高密度指纹。用Qiagen的植物DNA提取试剂盒提取一粒杂交种种胚，及从3粒杂交种上分离的种皮的DNA，之后使用Illumina公司的标准实验步骤进行DNA的杂交及芯片扫描，检测出杂交种种胚及种皮的高密度基因型（指纹）。玉米杂交种的种皮DNA全部来源于母本，而种胚DNA一半来源于母本，一半来源于父本，因此我们可以从种胚及种皮的高密度基因型导出杂交种父本及母本的高密度基因型。
（2）找出192个均匀分布在10条染色体的SNP（如表1所示），且此192SNP位点上杂交种父母本基因型不同。
（3）设计（2）中所选择的192个SNP位点的Illumina低密度基因芯片。
（4）温室种植该玉米杂交种（F1），套袋自交产生F2种粒。
（5）温室种植288株该玉米F2群体，于6叶期每株取10mg叶片组织；使用Qiagen的96孔板DNA自动提取仪提取叶片DNA。
（6）使用（3）中设计的Illumina低密度基因芯片测定（5）中DNA的192位点SNP的基因型。
（7）选择基因型与母本，父本相似度最高的植株套袋自交产生F3种粒。；
（8）重复步骤（5）-（7）2次。
（9）得到的种粒再在温室种植并自交两次建立与杂交种父本或母本相似的自交系。
本发明提供一种简单快速的分子育种方法，可以将任何玉米杂交种还原成与原杂交种父本、母本任意要求相似度的自交系，从而实现逆向玉米分子育种。与传统杂交种二环系选育的方法相比，这种方法具有周期短（1～2年），且杂优模式固定，有利基因利用率高等特点。
附图说明
图1显示已有的欧美杂交种的利用方法。
图2显示根据本发明的逆向分子育种方法。
图3显示根据本发明的逆向分子育种方法
具体实施方式
实施例1玉米杂交种的反向分子育种
杂交种：“郑丹958”，两亲本：“郑58”、“昌7-2”
（1）使用玉米Infinium50K商业芯片测量该玉米杂交种及杂交种种皮的高密度指纹。用Qiagen的植物DNA提取试剂盒提取一粒杂交种种胚，及从3粒杂交种上分离的种皮的DNA，之后使用Illumina公司的标准实验步骤进行DNA的杂交及芯片扫描，检测出杂交种种胚及种皮的高密度基因型（指纹）。导出杂交种父本及母本的高密度基因型。
（2）找出192个均匀分布在10条染色体的SNP，且此192SNP位点上杂交种父母本基因型不同。该192个SNP位点的具体见表1；
（3）设计（2）中所选择的192个SNP位点（如表1所示）的Illumina低密度基因芯片；
（4）温室种植该玉米杂交种（F1），套袋自交产生F2种粒；
（5）温室种植该288株该玉米F2群体，于6叶期每株取10mg叶片组织；使用Qiagen的96孔板DNA自动提取仪提取叶片DNA；
（6）使用（3）中设计的Illumina低密度基因芯片测定（5）中DNA的192位点SNP的基因型；
（7）选择基因型与母本，父本相似度最高的植株套袋自交产生F3种粒；
（8）重复步骤（5）-（7）2次；所得的各代群体根据192个位点的基因型计算出的与父本相似度及纯合度见图2。从图中可清楚看到，随着代数增加，各代群体的纯度不断增加，所获得群体清晰分化成类父本群和类母本群；
（9）得到的种粒再在温室种植并自交两次建立与杂交种父本或母本相似的自交系；获得的类父本及类母本自交系的照片见图3，其中类父本自交系与美国标准父系群Lancaster非常相似，类母本自交系与美国标准母系群SS（StiffStalk）非常相似。

Claims (2)

1.利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）根据玉米全基因组重测序结果，提取杂交种种胚，及杂交种种皮的DNA，之后进行DNA的杂交及芯片扫描，检测出杂交种种胚及种皮的高密度基因，由此从种胚及种皮的高密度基因型导出杂交种父本及母本的高密度基因型；
（2）温室种植该玉米杂交种F1代，套袋自交产生F2种粒；
（3）提取玉米F2群体的叶片DNA；
（4）以玉米192个SNP位点的低密度基因芯片测定F2群体的SNP的基因型，所述SNP位点为：
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；
（5）选择基因型与母本，父本相似度最高的植株套袋自交产生F3种粒；
（6）得到的种粒再在温室种植并自交，建立与杂交种父本或母本相似的自交系。
2.根据权利要求1所述的利用玉米杂交种种质的逆向分子育种方法，其特征在于，重复步骤（3）～（5）两次。
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