CN103857798A - 对应于转基因事件kk179-2的苜蓿植物和种子及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转基因苜蓿事件KK179-2。本发明还提供了与所述事件相关的细胞、植物部分、种子、植物、商品以及对于所述事件是独特的并且通过将转基因DNA插入苜蓿植物的基因组来产生的DNA分子。本发明进一步提供了用于检测所述苜蓿事件核苷酸序列在样本中的存在的方法，用于检测诊断所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探针和引物。

Description

对应于转基因事件KK179-2的苜蓿植物和种子及其检测方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)有权要求于2011年6月30日提交的美国临时专利申请号61/503,373和2012年6月26日提交的美国临时专利申请号61/664,359的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。
序列表的并入
称为“57978_seq_listing.txt”的序列表为10,564字节(在MS-WINDOWS中测量)，以电子形式提交，创建于2012年5月1日，并且通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及苜蓿转基因事件KK179-2。本发明还提供了与所述事件相关的细胞、植物部分、种子、植物、商品，以及对于事件是独特的并且通过将转基因DNA插入苜蓿植物的基因组来产生的DNA分子。本发明进一步提供了用于检测所述苜蓿事件核苷酸序列在样本中的存在的方法，用于检测诊断所述苜蓿事件的存在的核苷酸序列的探针和引物。
发明背景
苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培最多的豆类作物，其中美国是头号苜蓿生产国。生物技术的方法已应用于苜蓿以改善产品的农艺性状和质量。一种这样的农艺性状是增加的木质素含量。
木质素是第二丰富的陆地生物聚合物且占有机碳的30％。木质素对于细胞壁的结构完整性是至关重要的并且其赋予茎硬度和强度。木质素含量与奶牛的饲料消化率逆相关。可通过表达能够提供木质素的减少并且同时提供增加的苜蓿消化率的RNA抑制构建体来在转基因植物中获得此类减少。已知外源基因或抑制分子在植物中的表达受很多因素影响，这些因素例如使用的调控元件、转基因插入物的染色体定位、靠近转基因插入位点的任何内源调控元件的接近度(proximity)、以及环境因素例如光和温度。例如，已观察到在类似产生的事件之间在转基因抑制的总体水平上或转基因抑制的空间或时间模式上存在变化。为此原因，通常必需筛选数百个独立转化事件以最终鉴定对于商业农业目的有用的一个事件。一旦被鉴定为具有期望的抑制表型、分子特征和改善的性状，那么可使用植物育种方法将这样的事件用于将该改善的性状渗入其他遗传背景。所得的后代可含有转基因事件，并且因此可具有原始转化体的该性状的相同特征。这可用于产生许多不同的包含改良的性状并且经适当地改造适合于特定地方生长条件的作物品种。
能够检测特定植物的转基因/基因组DNA的存在以便确定有性杂交的后代是否含有所关注的转基因/基因组DNA将是有利的。此外，用于检测特定植物的方法当遵守需要上市前批准和标记来源于转基因作物植物的食品的规程时将是有用的。
抑制元素的存在或不存在可通过任何公知的核酸检测方法例如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测。这些检测方法一般集中于常用的遗传元件例如启动子、终止子、标记基因等。这样，此类方法可能不用于区分不同转化事件，特别是使用相同DNA构建体产生的那些，除非邻近插入DNA(“侧翼DNA”)的染色体DNA的序列是已知的。事件特异性PCR测定例如由Tavemiers等(J.Agric.Food Chem.，53：3041-3052，2005)进行了讨论，其中显示了转基因玉米品系Bt11、Bt176和GA21以及油菜(canola)事件GT73的事件特异性跟踪系统。在该研究中，基于每个事件的基因组/转基因接合处的序列设计事件特异性引物和探针。转基因植物事件特异性DNA检测方法也在美国专利号7,632,985；7,566,817；7,368,241；7,306,909；7,718,373；7,189,514、7,807,357和7,820,392中描述。
发明概述
本发明为命名为事件KK179-2的苜蓿转基因事件，其具有以登录号PTA-11833保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的代表性种子样本。
本发明提供了植物、种子、细胞、后代植物或植物部分，它们包含来源于包含事件KK179-2的植物、细胞、植物部分或种子的事件。本发明因此包括，但不限于花粉、胚珠、花、牙、根和叶。
本发明的一个方面提供了用于检测来自苜蓿事件KK179-2植物或种子的DNA转基因/基因组接合区域的存在的组合物和方法。提供了包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及其互补序列的至少一个转基因/基因组接合DNA分子的DNA分子，其中接合分子横跨插入位点。苜蓿事件KK179-2和包含这些DNA分子的种子是本发明的方面。
提供了来自苜蓿事件KK179-2的DNA转基因/基因组区域SEQID NO：3或其互补序列的新颖DNA分子。其基因组中包含SEQ ID NO：3的苜蓿植物和种子为本发明的方面。在本发明的另一方面，提供了为DNA转基因/基因组区域SEQ ID NO：4或其互补序列的DNA分子，其中该DNA分子在苜蓿事件KK179-2中是新颖的。其基因组中包含SEQ ID NO：4的苜蓿植物和种子为本发明的方面。
本发明提供了涉及事件KK179-2的DNA分子。这些DNA分子可包含代表或来源于如下的核苷酸序列：事件KK179-2的转基因插入与侧翼基因组DNA的接合处、和/或位于插入DNA侧翼的基因组DNA的区域、和/或位于插入位点侧翼的所整合的转基因DNA的区域、和/或所整合的转基因表达盒的区域、和/或任何此类区域的连续序列。本发明还提供了用作诊断该事件的引物和探针的DNA分子。提供了包含这些分子的植物、细胞、植物部分、商品、后代和种子。
根据本发明的一个方面，提供了用于检测来自命名为KK179-2的新型苜蓿植物的转基因/基因组插入区域的存在的组合物和方法。提供了DNA序列，其包含选自SEQ ID NO：1(对应于SEQ ID NO：6的位置1038至1057，图1[F])和SEQ ID NO：2(对应于SEQ ID NO：6的位置3620至3639，图1[F])及其互补序列的KK179-2的至少一个接合序列；其中接合序列为横跨插入到基因组中的异源DNA与苜蓿细胞基因组DNA连接的点的核苷酸序列并且在含有苜蓿DNA的生物样本中该序列的检测诊断苜蓿事件KK179-2DNA在所述样本中的存在(图1)。苜蓿事件KK179-2和包含这些DNA分子的苜蓿种子为本发明的方面。
根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法的两个DNA分子，其中第一DNA分子包含具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的DNA分子的转基因区域的任何部分的足够长度的连续多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸，并且第二DNA分子包含SEQ ID NO：3的5’侧翼苜蓿基因组DNA区域的任何部分的类似长度的多核苷酸，其中所述DNA分子用作DNA引物，当所述DNA引物与来源于事件KK179-2的模板一起用于扩增反应时以产生诊断样本中的事件KK179-2DNA的扩增子。由与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子以及包含SEQ IDNO：1的任何扩增子为本发明的方面。
根据本发明的另一方面，提供了用于DNA检测方法的两个DNA分子，其中第一DNA分子包含具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的DNA分子的转基因区域的任何部分的足够长度的连续多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸，和包含SEQ ID NO：4的3’侧翼苜蓿基因组DNA的任何部分的类似长度的第二DNA分子，其中所述DNA分子用作DNA引物，当所述DNA引物与来源于事件KK179-2的模板一起用于扩增反应时以产生诊断样本中的事件KK179-2DNA的扩增子。由与SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的任何部分同源或互补的DNA引物产生的任何扩增子、以及包含SEQ ID NO：2的任何扩增子为本发明的方面。
本发明提供了用于检测来源于苜蓿事件KK179-2的DNA的存在的方法、组合物和试剂盒。某些方法包括(a)将包含DNA的样本与引物组接触，所述引物组当与来自苜蓿事件KK179-2的基因组DNA用于核酸扩增反应时产生诊断该事件的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；以及(c)检测扩增子，其中所述扩增子包含SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2。本发明还提供了通过如下步骤检测该事件的方法：(a)将包含DNA的样本与探针接触，所述探针当与来自事件的基因组DNA用于杂交反应时与对事件特异的DNA分子杂交；(b)使样本和探针经受严格杂交条件；以及(c)检测探针与DNA分子的杂交。还提供了包含用于检测来源于事件的DNA的存在的本发明的方法和组合物的试剂盒。
本发明进一步提供了产生苜蓿植物的方法，其包括：(a)将KK179-2苜蓿植物与第二苜蓿植物杂交，从而产生种子；(b)使所述种子生长以产生多个后代植物；以及(c)选择包含KK179-2的后代植物或具有减少的木质素含量的后代植物。
本发明的前述和其他方面将从以下详述而变得更加显而易见。
附图简述
图1.苜蓿事件KK179-2的基因组中的转基因插入物的图解表示；[A]对应于SEQ ID NO：1的相对位置，其形成SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5之间的接合处；[B]对应于SEQ ID NO：2的相对位置，其形成SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5之间的接合处；[C]对应于SEQID NO：3的相对位置，其含有苜蓿基因组侧翼区域和转基因DNA插入物的任意指定的5’末端的一部分；[D]对应于SEQ ID NO：4的相对位置，其含有苜蓿基因组侧翼区域和转基因DNA插入物的任意指定的3’末端的一部分；[E]表示SEQ ID NO：5，其为包括整合到事件KK179-2的基因组中的CCOMT抑制盒的转基因DNA插入物的序列；[F]表示SEQ ID NO：6，其为包含如图中从左到右表示的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4的连续序列，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2如上所述并入，因为这些序列存在于事件KK179-2的基因组中。LB：是指T-DNA的左边界；RB：是指T-DNA的右边界。
序列简述
称为“57978_seq_listing.txt”的序列表为10,564字节(在MS-WINDOWS中测量)，以电子形式提交，创建于2012年5月1日，并且通过引用并入本文。
SEQ ID NO：1-代表苜蓿基因组DNA与所整合的DNA插入物之间的左边界接合处的20bp核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的位置1038至1057，并且对应于SEQ ID NO：3的位置1038至1047(图1的[C])。此外，SEQ ID NO：1对应于在SEQ ID NO：5的位置1至10处的表达盒的所整合的左边界(图1的[E])。
SEQ ID NO：2-代表所整合的DNA插入物和苜蓿基因组DNA之间的右边界接合处的20bp核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的位置3620至3639，并且对应于SEQ ID NO：4的位置91至111(图1的[D])。此外，SEQ ID NO：2对应于SEQ ID NO：5的位置2573至2582(图1的[E])。
SEQ ID NO：3-包括位于事件KK179-2的插入DNA侧翼的5’苜蓿基因组序列(1047bp)加上所整合的DNA的区域(100bp)的1147bp核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的位置1至1047。
SEQ ID NO：4-包括位于事件KK179-2的插入DNA侧翼的3’苜蓿基因组序列(1256bp)加上所整合的DNA的区域(100bp)的1356bp核苷酸序列。该序列对应于SEQ ID NO：6的位置3529至4885。
SEQ ID NO：5-所整合的表达盒的序列，包括整合后的左和右边界序列。SEQ ID NO：5对应于SEQ ID NO：6的核苷酸位置1048至3629。
SEQ ID NO：6-代表位于KK179-2的插入DNA侧翼的5’序列(SEQ ID NO：3)、所整合的DNA插入物的序列(SEQ ID NO：5)和位于KK179-2的插入DNA侧翼的3’序列(SEQ ID NO：4)的重叠群的4885bp核苷酸序列。
SEQ ID NO：7：用于鉴定KK179-2事件的引物SQ20901的序列。使用引物SQ20901和SQ23728(SEQ ID NO：8)的组合产生81bp PCR扩增子对于事件KK179-2的存在是阳性结果。
SEQ ID NO：8-用于鉴定KK179-2事件的引物SQ223728的序列。
SEQ ID NO：9-用于鉴定KK179-2事件的探针PB10164的序列。其为6FAMTM-标记的合成寡核苷酸。
SEQ ID NO：10-在端点
Figure BPA0000182537270000071
测定中用作内部对照的引物SQ1532的序列。
SEQ ID NO：11-在端点
Figure BPA0000182537270000072
测定中用作内部对照的引物SQ1533的序列。
SEQ ID NO：12-在端点
Figure BPA0000182537270000073
测定中用作内部对照的VICTM-标记的合成寡核苷酸探针PB0359的序列。
详述
下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和在本发明的实施中指导本领域普通技术人员。除非另外指出，否则将根据相关领域普通技术人员常规使用的含义来理解术语。分子生物学中常见术语的定义也可在Rieger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，Genes V，OxfordUniversity Press：New York，1994中发现。
本发明提供了转基因苜蓿事件KK179-2。本文中所用的术语“事件”是指由于在染色体上的特定位置处将转基因DNA插入到植物基因组中而产生的植物、种子、后代、细胞、其植物部分和DNA分子。事件KK179-2是指由于将具有在本文以SEQ ID NO：5提供的序列的转基因DNA插入到苜蓿(Medicago sativa)基因组的特定染色体位置中而产生的植物、种子、后代、细胞、其植物部分和DNA分子。含有KK179-2的种子样本已经在美国美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-11833保藏。
如本文中所用，术语“苜蓿”是指苜蓿(Medicago sativa)并且包括可与苜蓿育种的所有植物变种，包括野生苜蓿种类。苜蓿也称为苜蓿属植物(medic)，具有与相关丁香的那些类似的蓝色或黄色的花的苜蓿属(Medicago)旧大陆草本的任何植物的名称。与玉米或大豆不同，苜蓿植物是同源四倍体；因此，每个特征由存在于四个染色体(而不是两个)的基团决定。这使基因研究复杂化也增加利用苜蓿的难度。商业的苜蓿种子常常由克隆混合物构成，所述克隆混合物可组成通过所选克隆中的随机交互授粉、随后一至三代单独的开放授粉而产生的合成栽培品种。此外，苜蓿的复合栽培品种也可通过掺混两种或更多种克隆的种子或交互授粉单独的克隆而开发。当形成复合栽培品种时，等量的来自每个组分克隆的种子将掺混以形成初始的育种家种子储备。
转基因“事件”通过以下方式来产生：用异源DNA即包含所关注基因的RNA抑制的核酸构建体转化植物细胞、再生由将转基因盒插入植物的基因组而获得的独立转化的转基因植物群体以及选择具有所需分子特征(例如将转基因插入特定基因组位置中)的特定植物。包含事件的植物可以指包括插入植物的基因组中的特定位置的转基因的原始转化体。包含事件的植物还可指在植物的基因组中的相同特定位置处保留转基因的原始转化体的后代。这样的后代可通过转化体或其后代与另一种植物之间的有性异型杂交(outcross)来产生。这样的其他植物可以是包含相同或不同的转基因的转基因植物；或可以是非转基因植物，例如来自不同种类的非转基因植物。甚至在与轮回亲本重复回交后，来自转化的亲本的事件DNA在相同的基因组位置处存在于杂交的后代中。
包含事件KK179-2的DNA分子是指包含插入的转基因DNA的至少一部分(以SEQ ID NO：5提供)和紧邻插入DNA的侧翼基因组DNA的至少一部分的DNA分子。这样，包含事件KK179-2的DNA分子具有代表转基因DNA插入物的至少一部分和将转基因DNA插入其中的植物的基因组的特定区域的至少一部分的核苷酸序列。与周围植物基因组相关的事件KK179-2中的插入DNA的排列对于事件KK179-2是特异性的和独特的，并且因此，这样的DNA分子的核苷酸序列是诊断性的并鉴定事件KK179-2。这样的DNA分子的序列的实例在本文中以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4和SEQ ID NO：6提供。该DNA分子也是包含事件KK179-2的植物的染色体的完整部分并且可被传递至植物的后代。
如本文中所用，“重组DNA分子”为包含不能一起天然存在的DNA分子的组合并且为人干预的结果的DNA分子，例如，由至少两个彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或为人工合成的并且包含来源于通常存在于自然界中的多核苷酸序列的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工并入宿主细胞的基因组DNA的转基因和宿主细胞基因组的相关侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例为本文中描述的由将转基因插入至苜蓿基因组内而产生的DNA分子，其可最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中的抑制。核苷酸序列或由其衍生的任何片段也可被视为重组DNA分子(如果该DNA分子可从细胞或组织、或来自植物或种子或植物组织的匀浆物提取)；或者可作为扩增子由从细胞或组织、或来自植物或种子或植物组织的匀浆物提取的DNA或RNA产生，其任何一个来源于源自事件KK179-2的此类材料。就此而言，如在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的接合序列，以及来源于也含有这些接合序列的事件KK179-2的核苷酸序列被认为是重组DNA，不论这些序列存在于事件KK179-2的细胞的基因组内或以可检测量存在于来源于事件KK179-2的组织、后代、生物样本或商品中。如本文中所用，术语“转基因”是指人工并入宿主细胞的基因组的多核苷酸分子。这样的转基因对于宿主细胞可以是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。“转基因植物”包括其基因组已通过重组DNA的稳定整合而发生改变的植物、植物部分、植物细胞或种子。转基因植物包括从原始转化的植物细胞以及来自经转化植物的后生代或杂交的后代转基因植物再生的植物。由于这种基因组变化，转基因植物明显不同于相关野生型植物。转基因植物的实例是本文描述为包含事件KK179-2的植物。
如本文中所用，术语“异源的”是指在遗传环境(其中目前发现序列)中通常不存在于给定宿主基因组的序列。在这方面，序列可原产于宿主基因组，但是相对于宿主序列中的其他基因序列重排。
本发明提供了DNA分子及其相应的核苷酸序列。如本文中所用，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常从5’(上游)末端至3’(下游)末端呈现的DNA分子的核苷酸的序列。本文中使用的命名法为美国联邦法规法典(United States Code of FederalRegulations)§1.822的第37条标题所要求的和WIPO StandardST.25(1998)，附录2中的表1和3中所示的命名法。本发明公开仅关于转基因事件KK179-2中提供的两条核苷酸序列链的一条链。因此，通过暗示和推导，互补序列(在本领域中也称为完全互补序列或反向互补序列)在本发明的范围内，并且从而也预期在所述要求保护的主题的范围内。
对应于插入的转基因DNA的完全核苷酸序列和位于插入的转基因DNA的任一末端侧翼的苜蓿基因组DNA的大部分区段的核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO：6提供。该核苷酸序列的小部分为以SEQ ID NO：5提供的插入的转基因DNA。位于插入的转基因DNA的5’末端和插入的DNA的5’末端的一部分侧翼的基因组DNA的核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO：3提供。位于插入的转基因DNA的3’末端和插入的DNA的3’末端的一部分侧翼的基因组DNA的核苷酸序列在本文中以SEQ ID NO：4提供。横跨其中转基因DNA连接于和联接于基因组DNA的位置的区域，在本文中称为接合处(junction)。“接合序列(junction sequence)”或“接合区域(junction region)”是指横跨插入的转基因DNA和相邻侧翼基因组DNA的DNA序列和/或相应DNA分子。事件KK179-2的接合序列的实例在本文中以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2提供。来源于苜蓿植物或种子的核苷酸分子中这些接合序列之一的鉴定确定了DNA获自事件KK179-2并且诊断来自事件KK179-2的DNA的存在。SEQ ID NO：1为横跨基因组DNA与插入DNA的5’末端之间的接合处的20bp核苷酸序列。SEQ ID NO：2为横跨基因组DNA与插入DNA的3’末端之间的接合处的20bp核苷酸序列。来源于转基因事件KK179-2的包括SEQ ID NO：1的连续核苷酸的DNA的任何区段在本发明的范围内。来源于转基因事件KK179-2的包括SEQ ID NO：2的连续核苷酸的DNA的任何区段在本发明的范围内。此外，包含与本段落内描述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸分子在本发明的范围内。图1举例说明了苜蓿事件KK179-2的基因组中的转基因DNA插入物，和以5’至3’排列的SEQID NO：1-6的相对位置。
本发明进一步提供了可用作用于诊断来源于事件KK179-2的DNA在样本中的存在的引物或探针的示例性DNA分子。此类引物或探针对于靶核酸序列是特异性的，并且因此对于通过本文中描述的本发明的方法鉴定事件KK179-2核酸序列是有用的。
″探针″是可检测标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶所连接的分离的核酸。这样的探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自苜蓿事件KK179-2的基因组DNA的链互补(不管来自苜蓿植物或来自包含来自事件的DNA的样本)。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸而且还包括特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其他探针材料，并且这样的结合的检测可用于诊断/确定/确认该靶DNA序列在特定样本中的存在。
″引物″通常是分离的多核苷酸，其被设计来用于特异性退火或杂交法以与互补的靶DNA链杂交以形成引物与靶DNA链之间的杂交体，然后通过聚合酶例如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。可将引物对与模板DNA例如苜蓿基因组DNA的样本一起用于热扩增或等温扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)或其他核酸扩增方法，以产生扩增子，其中从这样的反应产生的扩增子可具有对应于位于其中引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，“扩增子”为一条或一段已使用扩增技术合成的DNA，例如扩增反应的产物。在本发明的一个实施方案中，诊断事件KK179-2的扩增子包含未在苜蓿基因组中天然存在的序列。如在本发明中所用，引物对意图是指为了线性扩增被引物对的单个成员靶向结合的位置之间的多核苷酸区段，通常在热扩增或等温扩增反应或其他核酸扩增方法中使用结合双链核苷酸区段的相反链的两个引物。用作引物的示例性DNA分子以SEQ ID NO：7-9提供，可用作第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子，并且两个分子各自具有充足长度的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的连续核苷酸或其互补序列以用作DNA引物，以便当与来源于事件KK179-2的模板DNA一起用于扩增反应时，可产生对于转基因事件KK179-2是特异性和独特的扩增子。术语“扩增子”的使用特别排除可在DNA扩增反应中形成的引物-二聚体。
根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全序列同一性，虽然可通过常规方法设计与靶序列不同的保持优先与靶序列杂交的能力的引物和探针。为了核酸分子能够用作引物或探针，仅需在序列上充分互补以能够在所使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。任何核酸杂交或扩增方法可用于鉴定来自事件KK179-2的转基因DNA在样本中的存在。探针和引物的长度通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸和至少约30个核苷酸或更多个核苷酸。此类探针和引物在高度严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。
用于制备和使用探针和引物的方法例如在Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，1-3卷，Sambrook等编著，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(在下文为″Sambrook等，1989″)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(在下文为″Ausubel等，1992”)；和Innis等，PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，Academic Press：San Diego，1990中描述。PCR-引物对可来源于已知序列，例如通过使用意图用于该目的的计算机程序例如Primer(版本0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA)。
基于本文公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于通过已知方法例如通过对此类序列进行重新克隆和测序来确认公开的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何核酸杂交或扩增方法可用于鉴定来自转基因事件的DNA在样本中的存在。核酸分子或其片段能够在某些环境下与其他核酸分子特异性杂交。如本文中所用，如果两个核酸能够形成反向平行双链核酸结构，则两个核苷酸分子被认为能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子显示完全互补性，则一个核酸分子被认为是另一个核酸分子的“互补序列”。如本文中所用，当分子之一的每个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则分子被认为显示“完全互补性”。如果两个分子可以以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在至少“低严格”条件下保持彼此退火，则它们被认为是“最低程度互补”。类似地，如果分子可以以足够的稳定性彼此杂交以允许它们在“高严格”条件下保持彼此退火，则它们被认为是“互补的”。严格条件由Sambrook等，1989和由Haymes等，见：Nucleic Acid Hybridization，APractical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)描述。因此偏离完全互补性是可允许的，只要这样的偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。为了核酸分子用作引物或探针，仅需要在序列上充分互补以能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
如本文中所用，基本上同源的序列是在高严格条件下与所比较的核酸序列的互补序列特异性杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格条件，例如在约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃下2.0x SSC洗涤，是本领域技术人员已知的或可在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃下约2.0xSSC的低严格条件至50℃下约0.2x SSC的高严格条件。此外，洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃的低严格条件增加到约65℃的高严格条件。温度和盐均可以变化，或者温度或盐浓度中的任一个可以保持恒定，而另一个变量发生变化。在一个实施方案中，本发明的核酸在高严格条件下与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2或其互补序列或片段中所示的一个或多个核酸分子特异性杂交。探针与靶DNA分子的杂交可通过本领域技术人员已知的许多方法来检测。这些可包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。
关于使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)，″严格条件″是使得引物对仅与具有相应的野生型序列(或其互补序列)的引物将结合的靶核酸序列杂交的条件，并优选在DNA扩增反应中产生独特的扩增产物(扩增子)。DNA扩增方法的实例包括PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)(参见例如美国专利号7,485,428)、链置换扩增(SDA)(参见例如，美国专利号5,455,166和5,470,723)、转录介导的扩增(TMA)(参见例如，Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874-1878(1990))、滚环扩增(RCA)(参见例如，Fire和Xu，Proc.Natl.Acad Sci.USA92：4641-4645(1995)；Lui，等，J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594(1996)；Lizardi等，Nature Genetics19：225-232(1998)，美国专利号5,714,320和6,235,502))、解链酶依赖性扩增(HDA)(参见例如Vincent等，EMBO Reports5(8)：795-800(2004)；美国专利号7,282,328)和多重置换扩增(MDA)(参见例如Dean等，Proc.Natl.AcadSci.USA99：5261-5266(2002))。
术语″对于(靶序列)特异性的″指示探针或引物在严格杂交条件下仅与包含靶序列的样本中的靶序列杂交。
如本文中所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与通常以其原始或天然状态与其联接的其他分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的”是指这样的DNA分子，其至少部分地与以原始或天然状态通常位于所述DNA分子侧翼的核酸分离。因此，例如作为重组技术的结果融合于它们通常不与其联接的调控或编码序列的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时亦被认为是分离的。
本领域技术人员公知的许多方法可用于分离和操作本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段还可通过其他技术例如通过利用化学方法直接合成片段(这通常通过使用自动寡核苷酸合成仪来实施)来获得。
因此，本文中提供的DNA分子和相应核苷酸序列可用于(除其他用途之外)鉴定事件KK179-2，选择包含事件KK179-2的植物品种或杂交体，检测来源于事件KK179-2的DNA在样本中的存在，和监测样本的事件KK179-2的存在和/或不存在或包含事件KK179-2的植物和植物部分。
本发明提供了植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、和叶)。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商品包含可检测量的本发明的多核苷酸，即例如包含以SEQ ID NO：1的连续核苷酸和SEQ ID NO：2的连续核苷酸提供的序列中的至少一个的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商品还可含有一个或多个另外的抑制靶。
本发明提供了来源于包含事件KK179-2的转基因植物的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织以及叶。为了使得能够进行本发明，已按照布达佩斯条约 (Budapest Treaty)保藏了包含事件KK179-2的种子的代表性样本。经 选择用于接收保藏物的贮藏处为美国美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，地址为10801UniversityBoulevard，Manassas，Virginia USA， 邮政编码20110。ATCC贮藏处已对事件KK179-2种子指定了登录号 PTA-11833。
本发明提供了包含具有选自SEQ ID NO：1的连续核苷酸、SEQID NO：2的连续核苷酸的核苷酸序列的DNA分子的微生物。这样的微生物的实例为转基因植物细胞。微生物例如本发明的植物细胞在许多工业应用中是有用的，所述工业应用包括但不限于：(i)用作用于科学调查或工业研究的研究工具；(ii)用在用于产生可用于随后的科学研究或用作工业产品的内源或重组碳水化合物、脂质、核酸、酶或蛋白质产物或小分子的培养物中；和(iii)与现代植物组织培养技术一起使用以产生随后可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物例如转基因植物细胞的产生和使用利用现代微生物学技术和人干预来产生人造的独特的微生物。在该方法中，将重组DNA插入植物细胞的基因组以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。该转基因植物细胞可随后使用现代微生物技术进行培养(与细菌和酵母细胞非常相似)，并且可以以未分化的单细胞状态存在。新型植物细胞的遗传组成和表型为通过将异源DNA整合入细胞的基因组而产生的技术作用。本发明的另一个方面为使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物例如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合入细胞的基因组，并且然后使用该细胞衍生具有相同异源DNA的另外的细胞来产生转基因细胞的方法；(ii)使用现代微生物技术培养含有重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养细胞产生并且纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸、酶或蛋白质产物的方法；和(iv)使用现代植组织培养技术利用转基因植物细胞产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
如本文中所用，“后代”包括包含来源于具有以SEQ ID NO：1的连续核苷酸或SEQ ID NO：2的连续核苷酸提供的序列中的至少一个的祖先植物和/或多核苷酸的事件DNA的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。植物、后代和种子对于转基因序列的存在可以是杂合的。后代可从由包含事件KK179-2的植物产生的种子和/或从由利用包含事件KK179-2的植物的花粉授精的植物产生的种子生长而来。
可对后代植物异型杂交，例如用另一种植物育种，以产生品种或杂种种子或植物。另一种植物可以为转基因或非转基因的。本发明的品种或杂种种子或植物因此可通过如下方式来衍生：将不存在事件KK179-2的特异性和独特的DNA的第一亲本与包含事件KK179-2的第二亲本杂交，从而产生包含事件KK179-2的特异性和独特的DNA的杂种。每一个亲本可以为杂种或近亲育种(inbred)/品种，只要杂交或育种产生本发明的植物或种子，例如具有包含事件KK179-2的特异性和独特的DNA和/或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的连续核苷酸。还预期与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，同样地涉及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述可见于几篇参考文献之一，例如，Fehr，见Breeding Methods for CultivarDevelopment，Wilcox J.编著，American Society of Agronomy，MadisonWI(1987)中。
可以通过人类干预来完成或促成一种植物与另一种植物有性杂交，例如异花授粉(cross-pollinating)，例如：通过人手工收集一种植物的花粉和将该花粉与第二种植物的花柱或柱头接触；通过人手和/或行动除去、破坏或覆盖植物的雄蕊或花药(例如，通过人工干预或通过施用化学杀配子剂)以便防止自然的自花受粉并且使得必将发生异花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过在果园或田间设置蜂房或通过将植物和传粉昆虫笼养)；通过人为开放或去除花的部分以允许外来花粉在花柱或柱头上安置或接触；通过选择性放置植物(例如，有意地将植物种植于传粉邻近区)；和/或通过施用化学药品以促使开花或培养(柱头对花粉)的感受性。
在实施本方法中，可通过人工干预来完成或促成一种植物与其自身有性杂交例如自花受粉或自交的步骤，例如：通过人手工收集植物的花粉和将该花粉与相同植物的花柱或柱头接触，和然后任选地阻止植物的进一步受精；通过人手和/或行动除去、破坏或覆盖其他附近植物的雄蕊或花药(例如，通过去雄或通过施用化学杀配子剂)以便防止天然异花受粉并且使得必将发生自花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过与传粉昆虫笼养单独的植物)；通过人工操作花或其部分以允许自花受粉；通过选择性放置植物(例如，有意地在传粉邻近区之外种植植物)；和/或通过施用化学药品以促使开花或培养(柱头对花粉)的感受性。
本发明提供了来源于包含事件KK179-2的植物的植物部分。如本文中所用，“植物部分”是指由从包含事件KK179-2的植物衍生的材料组成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于细胞、花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、纤维及叶。植物部分可以是活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。
本发明提供了从包含事件KK179-2的植物衍生的商品。如本文中所用，“商品”是指由从包含事件KK179-2的植物、种子、植物细胞或植物部分衍生的材料组成的任何组合物或产品。商品可售予消费者并且可以是活的或不能存活的。不能存活的商品包括但不限于不能存活的种子和谷物；经加工的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和经加工的植物组织；经加工用于陆生和/或水生动物消费的动物饲料的种子和植物部分、油、粗粉、面粉、薄片、麸皮、纤维和用于人消费的任何其他食品；和生物质及燃料产品。经加工的苜蓿是世界上豆类作物饲料的最大来源。因此包含事件KK179-2的植物可用于制造通常从苜蓿植物获得的任何商品。来源于包含事件KK179-2的植物的任何此类商品可含有至少可检测量的对应于事件KK179-2的特异性和独特的DNA，并且特别地可含有可检测量的具有SEQ ID NO：1的连续核苷酸和SEQ ID NO：2的连续核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸。可使用检测多核苷酸分子的任何标准方法，包括本文中公开的检测方法。如果在商品中存在任何可检测量的SEQ ID NO：1的连续核苷酸或SEQ ID NO：2的连续核苷酸，那么商品在本发明的范围内。
因此本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)以及商品尤其对于生长植物以产生用于农业目的的包含事件KK179-2的种子和/或植物部分、产生用于植物育种和研究目的的包含事件KK179-2的后代是有用的，可与用于工业和研究应用的微生物学技术一起使用和售予消费者。
本发明提供了用于产生具有减少的木质素的植物和包含事件KK179-2的植物的方法。事件KK179-2植物通过与美国专利5,914,451中所述的方法类似的土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化方法，使用用构建体pFG118近亲育种的苜蓿系来产生。构建体pFG118含有用于在苜蓿植物细胞中下调CCOMT酶的植物抑制盒。将转基因苜蓿细胞再生到完整苜蓿植物中并且个别植物选自显示所需分子特征(例如转基因盒的完整性、构建体主链序列的缺失和解链的卡那霉素抗性选择盒的损失)的独立转化的转基因植物群体。而且，进行反向PCR和DNA序列分析以确定5’和3’插入物至植物基因组接合处，以确认元件在插入物内的组织(图1)，以及确定插入物在苜蓿事件KK179-2中的全DNA序列(SEQ ID NO：5)。此外，在田地条件下针对减少的木质素筛选并选择转基因植物。其基因组中含有pFG118的抑制盒的苜蓿植物为本发明的方面。
提供了用于产生包含转基因事件KK179-2的具有减少的木质素的植物的方法。这些方法中使用的转基因植物对于转基因可以是杂合的。通过这些方法产生的后代植物可以是品种或杂种植物；可从由植物产生的种子和/或从由利用包含事件KK179-2的植物的花粉授精的植物产生的包含事件KK179-2的种子生长而来；以及对于转基因可以是纯合的或杂合的。随后可将后代植物自花受粉以产生植物的纯育种系，例如对于转基因是纯合的植物，或可选择地将后代植物异型杂交，例如与另一种无关植物育种以产生品种或杂种种子或植物。如本文中所用，术语“接合性”是指植物中DNA在特定染色体位置(基因座)处的相似性。在本发明中，DNA特异性是指连同接合序列(事件DNA)一起的转基因插入物。如果具有接合序列的转基因插入物存在于染色体对的每条染色体(4个等位基因)上的相同位置处，那么植物是纯合的。如果具有接合序列的转基因插入物存在于染色体对的仅一条染色体(1个等位基因)上，那么植物被认为是杂合的。野生型植物对于事件DNA是无效的(null)。
由这些方法涵盖的和通过使用这些方法产生的后代植物和种子与其他植物截然不同，例如因为所述后代植物和种子是重组的并且通过人工干预产生；含有至少一个由本发明的转基因DNA组成的等位基因；和/或含有可检测量的选自SEQ ID NO：1的连续核苷酸或SEQID NO：2的连续核苷酸的多核苷酸序列。种子可选自单株后代植物，并且只要种子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，其就可在本发明的范围内。
可评估本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)和商品的DNA组成、基因表达和/或蛋白质表达。这样的评估可通过使用各种方法例如PCR、测序、northern印迹、southern分析、western印迹、免疫沉淀和ELISA或通过使用本文中提供的检测方法和/或检测试剂盒来进行。
提供了检测对于事件KK179-2是特异性的组合物在样本中的存在的方法。一种方法由检测对于包含事件KK179-2的细胞、组织、种子、植物或植物部分是特异性的DNA以及来源于所述细胞、组织、种子、植物或植物部分的DNA的存在组成。该方法提供了待与引物对接触的模板DNA样本，所述引物对能够在经历适合于扩增的条件后从事件KK179-2DNA产生扩增子，特别是包含SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2或其互补序列的扩增子。扩增子从来源于事件KK179-2的模板DNA分子产生，只要模板DNA分子结合SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的特异性和独特的核苷酸序列。扩增子可以为单链或双链DNA或RNA，这取决于被选择用于产生扩增子的聚合酶。该方法提供了检测在任何这样的扩增反应中产生的扩增子分子，和确认对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其互补序列的核苷酸在扩增子的序列中的存在。扩增子中对应于SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2或其互补序列的核苷酸的检测确定和/或诊断事件KK179-2特异性DNA和从而包含事件KK179-2的生物材料在样本中的存在。
提供了用于检测对应于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的DNA分子在由来源于植物或植物组织的材料组成的样本中的存在的另一种方法。该方法由如下步骤组成：(i)从植物或从一组不同的植物获得DNA样本，(ii)将DNA样本与包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的核苷酸的DNA探针分子接触，(iii)允许探针和DNA样本在严格杂交条件下杂交，和然后(iv)检测探针与靶DNA样本之间的杂交事件。杂交组合物的检测诊断SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4(视具体情况而定)在DNA样本中的存在。杂交的不存在可选择地诊断转基因事件在样本中的不存在，如果适当的阳性对照同时进行测试的话。或者，确定特定植物包含对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列或其互补序列之任一或两者确定植物含有至少一个对应于事件KK179-2的等位基因。
因此可能通过任何公知的核酸扩增和检测方法例如聚合酶链式反应(PCR)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或使用核酸探针的DNA杂交检测本发明的核酸分子的存在。事件特异性PCR测定例如由Taverniers等(J.Agric.Food Chem.，53：3041-3052，2005)进行了论述，其中显示了转基因玉米品系Bt11、Bt176和GA21以及转基因事件RT73的事件特异性跟踪系统。在本研究中，基于每一个事件的基因组/转基因接合处的序列设计事件特异性引物和探针。转基因植物事件特异性DNA检测方法已在美国专利号7,632,985；7,566,817；7,368,241；7,306,909；7,718,373；7,189,514、7,807,357和7,820,392中描述。
提供了DNA检测试剂盒。一种类型的试剂盒含有至少一种具有足够长度的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的连续核苷酸的DNA分子以用作对于检测来源于转基因事件KK179-2的DNA在样本中的存在是特异性的DNA引物或探针。利用试剂盒检测的DNA分子包含SEQ ID NO：1所示的序列的连续核苷酸。或者，试剂盒可含有至少一种具有足够长度的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的连续核苷酸的DNA分子以用作对于检测来源于转基因事件KK179-2的DNA在样本中的存在是特异性的DNA引物或探针。利用试剂盒检测的DNA分子包含SEQ ID NO：2所示的连续核苷酸。
备选试剂盒使用这样的方法，其中将靶DNA样本与上述引物对接触，然后进行足以产生包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的连续核苷酸的扩增子的核酸扩增反应。扩增子的检测和确定SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的连续核苷酸或其互补序列在扩增子的序列中的存在诊断事件KK179-2特异性DNA在DNA样本的存在。
提供了足以用作DNA探针的DNA分子，其对于测定、检测或对于诊断对于事件KK179-2DNA是特异性和独特的DNA在样本中的存在或甚至不存在是有用的。DNA分子含有SEQ ID NO：1的连续核苷酸或其互补序列和SEQ ID NO：2的连续核苷酸或其互补序列。
可利用本领域已知的多种核酸扩增方法(包括热扩增和等温扩增方法)的任一方法实现核酸扩增。可通过使用来源于本文中提供的序列的引物，然后进行扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证来自事件KK179-2(包含事件KK179-2的代表性种子样本以ATCCPTA-11833保藏)的异源DNA插入物、接合序列或侧翼序列。
可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。一种这样的方法为遗传位点分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov等Nucleic Acid Res.22：4167-4175，1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在热扩增目标区域(使用插入的序列中的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物)后，单链扩增子可与固定的寡核苷酸杂交，并将其用作模板以使用DNA聚合酶和对于预期的下一个碱基是特异性的标记的ddNTP进行单碱基延伸反应。读数可以是基于荧光或ELISA的。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，荧光或其他信号的检测指示插入物/侧翼序列的存在。
另一个方法为由Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的焦磷酸测序技术。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域的单链扩增子杂交(一个引物在插入的序列中以及一个引物在侧翼基因组序列中)，并且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和萤光素的存在下进行孵育。单独地添加ddNTP，并且掺入导致被测量的光信号。归因于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号指示转基因插入物/侧翼序列的存在。
由Chen等，(Genome Res.9：492-498，1999)描述的荧光偏振为可用于检测扩增子的方法。通过使用该方法，设计与基因组侧翼序列和插入DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域的单链扩增子杂交(一个引物在插入DNA中并且一个引物在侧翼基因组DNA序列中)，并且在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下进行孵育。单碱基延伸导致ddNTP的并入。并入可使用荧光计测量为偏振的改变。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，偏振的改变指示转基因插入物/侧翼序列的存在。
使用由制造商提供的说明书，
Figure BPA0000182537270000241
(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)也可用于检测和/或定量DNA序列的存在。简而言之，设计与基因组侧翼序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。在耐热聚合酶和dNTP的存在下，循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入DNA序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致荧光部分的切割和释放，与FRET探针上的猝灭部分分离。归因于成功扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。
已描述了分子信标用于序列检测，如Tyangi等(NatureBiotech.14：303-308，1996)中所描述的。简而言之，设计与侧翼基因组序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。RRET探针的独特结构导致其包含使荧光与猝灭部分保持紧密靠近的二级结构。在耐热聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入DNA序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。在成功的扩增后，FRET探针与靶序列的杂交导致探针二级结构的消除以及荧光部分与猝灭部分的空间分离，从而导致荧光信号的产生。归因于成功的扩增和杂交，荧光信号指示侧翼/转基因插入序列的存在。
其他描述的方法例如微流体学(microfluidics)(美国专利公布号2006068398、美国专利号6,544,734)提供了分离和扩增DNA样本的方法和装置。光学染料用于检测和测量特异性DNA分子(WO/05017181)。包括用于检测结合特异性DNA分子并且随后可被检测的DNA分子或纳米珠粒的电子传感器的纳米管装置(WO/06024023)。
可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域内公知的方法来开发DNA检测试剂盒。试剂盒用于鉴定样本中的事件KK179-2并且可被应用于用于培育包含适当的事件DNA的植物的方法。试剂盒可含有与SEQ ID NO：1-6或其片段或互补序列相似或互补的DNA引物或探针。
本发明的试剂盒和检测方法因而可用于(除其他用途之外)鉴定事件KK179-2，选择包含事件KK179-2的植物品种或杂交体，检测来源于事件KK179-2的DNA在样本中的存在，和监测样本的事件KK179-2的存在或不存在或包含事件KK179-2的植物、植物部分或商品。
包括下列实施例来举例说明本发明的某些实施方案的实例。本领域技术人员应当理解，下列实施例中公开的技术代表本发明人已发现非常适合于本发明的实施，并从而被认为构成用于其实施的优选模式的实例。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中进行许多改变，并且获得类似或相似的结果。
实施例
实施例1：使用反向PCR分离侧翼序列以及通过测序鉴定侧翼序列
该实施例描述了针对事件KK179-2使用反向PCR分离位于转基因DNA插入物侧翼的苜蓿基因组DNA序列，以及通过测序鉴定侧翼基因组序列。
在事件KK179-2中位于T-DNA插入侧翼的序列使用反向PCR确定，如在Ochman等，1990(PCR Protocols：A guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.)中描述。植物基因组DNA从来自在温室条件下生长的组织的野生型R2336和转基因系分离。冰冻的叶组织用研钵和研杵在液氮中磨碎或通过机械研磨进行磨碎，随后使用本领域已知的方法进行DNA提取。该方法可由本领域技术人员改进以从任何组织(包括但不限于种子)提取DNA。
用基于转基因DNA的限制分析选择的限制内切核酸酶消化来自每个样本的DNA的等份试样。限制片段的自连接后，使用从转基因序列设计的引物进行PCR扩增，所述引物将扩增从转基因DNA的5’和3’末端延伸的序列。可使用多种Taq聚合酶和扩增系统。表2显示使用Phusion高保真DNA聚合酶(目录号F531S或F531L，NewEngland Biolabs)和Thermalcyclers Applied Biosystems GeneAmp9700，ABI9800Fast Thermal Cycler与MJ Opticon进行侧翼序列分离的PCR扩增的实例。
表1.用于侧翼序列分离的反向PCR扩增的实例
Figure BPA0000182537270000261
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离并且使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。直接使用标准的测序方案对随后的产物进行测序。使用这两种方法，延伸到包括CCOMT抑制盒的所整合的DNA插入物的左边界序列中的5’侧翼序列得以鉴定并以SEQ ID NO：3呈示(图1的[C])。延伸到包括CCOMT抑制盒的所整合的DNA插入物的右边界序列中的3’侧翼序列得以鉴定并以SEQID NO：4呈示(图1的[D])。整合到R2336基因组DNA中的转基因DNA以SEQ ID NO：5呈示(图1的[E])。
将分离的序列与T-DNA序列相比较以鉴定侧翼序列和共分离的T-DNA片段。通过利用基于推断的侧翼序列数据和已知T-DNA序列设计的引物的PCR确认表达盒的存在。使用从KK179-2中的侧翼序列设计的引物，分离对应于其中T-DNA整合到转化系中的同一区域的R2336野生型序列。针对多个核苷酸和蛋白数据库分析KK179-2中的侧翼序列以及R2336野生型序列。该信息用于检查转基因与植物基因组的关系以及查看插入位点的完整性。使用侧翼序列和野生型序列来设计实施例2中所述的用于鉴定事件的
Figure BPA0000182537270000271
端点测定的引物。
实施例2：事件特异性端点
Figure BPA0000182537270000272
该实施例描述了用于鉴定样本中的事件KK179-2DNA的事件特异性端点
Figure BPA0000182537270000273
热扩增方法。
用于事件KK179-2-特异性端点方法的条件的实例描述于表2和表3中。用于端点测定的DNA引物为引物SQ20901(SEQID NO：7)和SQ23728(SEQ ID NO：8)以及6-FAMTM标记的寡核苷酸探针为PB10164(SEQ ID NO：9)。6FAMTM为与DNA探针连接的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。对于
Figure BPA0000182537270000275
MGB(Minor Groove Binding)探针，Taq DNA聚合酶的5’外切核酸酶活性在荧光团与淬灭剂之间从5’-末端切割探针。当与靶DNA链杂交时，淬灭剂和荧光团充分分离以产生荧光信号。
当如所述与探针PB10146(SEQ ID NO：9)一起使用时，引物SQ20901(SEQ ID NO：7)和SQ23728(SEQ ID NO：8)产生诊断事件KK179-2DNA的81nt的扩增子。分析包括来自已知含有事件KK179-2DNA的苜蓿的阳性对照、来自非转基因苜蓿的阴性对照和不含有模板DNA的阴性对照。
优化这些测定以与Applied Biosystems GeneAmp PCR System9700、ABI9800Fast Thermal Cycler与MJ Research DNA EnginePTC-225一起使用。本领域技术人员已知的其他方法和装置可用于产生鉴定事件KK179-2DNA的扩增子。
表2.苜蓿KK179-2事件特异性端点
Figure BPA0000182537270000281
PCR条件
Figure BPA0000182537270000282
Figure BPA0000182537270000291
表3.端点
Figure BPA0000182537270000292
热循环仪条件
Figure BPA0000182537270000293
上文公开的和权利要求中引用的代表性苜蓿事件KK179-2种子已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA.20110在布达佩斯条约下进行保藏。ATCC登录号为PTA-11833。将保藏物在最近的请求后将在贮藏所维持30年或5年的时期，或维持专利的有效使用期(以更长的时间为准)，并且在该期间必要时可替换保藏物。
由于已举例说明和描述了本发明的原理，因此对于本领域技术人员来说显而易见的是可在不背离这些原理的情况下在排列和详情上修改本发明。我们要求保护在所附权利要求的精神和范围内的所有修改。
实施例3.
实施例3：减少的木质素苜蓿事件的茎下部中的ADL测量
表4.2008年来自3个位置的两个秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿事件的茎下部ADL测量
Figure BPA0000182537270000301
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表4中的事件阳性植物显示相较于汇集的阴性对照时茎下部ADL的显著性(p≤0.05)下降，下降范围为18-31％。KK179-2苜蓿事件具有由“最佳击球点(sweet spot)”选择方法鉴定的减少的木质素表型。
表5.2009年在4个位置中生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部ADL测量
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表6.2009年在2个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部ADL测量
Figure BPA0000182537270000321
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表7.2009年在4个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部ADL测量。
Figure BPA0000182537270000331
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表8.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部ADL测量
Figure BPA0000182537270000332
Figure BPA0000182537270000341
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表6-8显示分别在4个和2个位置的秋眠(FD)和不休眠(ND)种质中的茎下部ADL的2009年数据。6条事件阳性线显示相较于汇集的阴性对照时ADL的显著性(p≤0.05)下降，下降范围为12-26％，ADL中的引导事件KK179显示18-22％的下降。
实施例4.
实施例4：减少的木质素苜蓿事件的茎下部中的NDFD测量
表9.2008年在3个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部NDFD测量
Figure BPA0000182537270000342
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
在3个位置的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素事件的茎下部NDFD。事件阳性植物显示相较于汇集的阴性对照时茎下部NDFD的显著性(p≤0.05)增加，增加范围为18-35％。
表10.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部NDFD测量
Figure BPA0000182537270000361
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表11.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部NDFD测量
Figure BPA0000182537270000362
Figure BPA0000182537270000371
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表12.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部NDFD测量
Figure BPA0000182537270000381
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表13.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的茎下部NDFD测量
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表11-13显示分别在4和2个位置的秋眠(FD)和不休眠(ND)种质中的茎下部NDFD的2009年数据。6个事件阳性减少的木质素苜蓿事件显示相较于汇集的阴性对照时NDFD的显著性(p≤0.05)增加，增加范围为22-36％，而引导事件KK179-2显示NDFD增加22-28％。
实施例5.
实施例5：减少的木质素苜蓿事件的活力评级
表14.相较于商业检查和无效对照在3个位置的2个减少的木质素苜蓿事件JJ266和KK179-2的活力评级。减少的木质素事件KK179-2导致无活力评级量表的非典型。
事件 位置1 位置2 位置3 平均值
JJ266 8.0 7.4 7.8 7.7
JJ266，无效 7.8 7.4 8.0 7.7
KK179-2 8.0 7.6 7.6 7.7
KK179，无效 7.4 7.7 8.1 7.7
商业检查1 6.9 6.7 7.1 6.9
商业检查2 7.1 7.0 6.7 6.9
商业检查3 7.8 8.1 8.1 8.0
商业检查4 7.3 7.6 7.9 7.6
对于这些试验所收集的数据如下：在先前收成后21天和春天评分的五月第二周获取的植物活力(评分1-10，10为最好)，每季收成之前1-5天获取的抗倒伏性(评分1-10，10为完全笔直)。植物干燥后获取的植物产量(每株植物的干物质(DM)克数)，NDFD(使用RL苜蓿的CAI NIR校准)和ADL(使用RL苜蓿的NIR校准)。
实施例6.
实施例6：减少的木质素苜蓿事件的整个植物中的ADL测量
表15.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000401
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表16.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000411
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表17.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000421
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
来自2009年的横跨4个位置的整个植物ADL数据示于表17和19中。秋眠种质中6个减少的木质素阳性事件显示相较于汇集的阴性对照时ADL的显著性(p≤0.05)下降，下降范围为8-19％。秋眠种质中ADL的事件KK179-2分别减少9.8％和9.45。
表18.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000431
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
LSD＝最小显著差异
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
来自2009年的横跨2个位置的整个植物ADL数据示于表18和20中。不休眠种质中6个减少的木质素阳性事件显示相较于汇集的阴性对照时ADL的显著性(p≤0.05)下降，下降范围为10-16％。6个事件中的5个显示相较于汇集的阴性对照时ADL的显著性下降，下降范围为10-18％。不休眠种质中ADL的事件KK179-2分别下降12.3％和10.9％。
表19.相较于商业检查，2009年在4个位置生长的两个秋眠(FD)种质中的减少的木质素苜蓿事件KK179-2的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000441
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表20.相较于商业检查，2009年在2个位置生长的两个不休眠(ND)种质中的减少的木质素苜蓿事件KK179-2的整个植物干草ADL测量
Figure BPA0000182537270000451
下表中所用的缩写：
ADL＝酸性洗涤木质素，干物质％
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表19和20含有相较于商业检查减少的木质素苜蓿事件KK179-2的整个植物ADL数据。KK179-2事件显示相较于4个秋眠商业检查中的3个时ADL的显著性(p≤0.1)下降，下降范围为6.8-16.7％(表19，来自4个位置的数据)。不休眠背景种质(ND1)中的KK179-2事件显示相较于所有4个不休眠商业检查时ADL的下降(p≤0.2)，下降范围为7.6-10.6％(表20，来自2个位置的数据)。不休眠背景种质(ND2)中的KK179-2事件显示相较于所有4个不休眠商业检查时ADL的整体下降(p≤0.2)，而相较于商业事件4(ND2，来自2个位置的数据)时8.8％的显著性(p≤0.1)下降。
实施例7.减少的木质素苜蓿事件的整个植物中的NDFD测量
表21.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中的6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草NDFD测量
Figure BPA0000182537270000461
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表22.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草NDFD测量
Figure BPA0000182537270000471
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表23.2009年在4个位置生长的秋眠(FD)种质中6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草NDFD测量
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
来自2009年的横跨4个位置的整个植物NDFD数据示于表23和25中。秋眠种质中6个减少的木质素阳性事件显示相较于汇集的阴性对照时NDFD的显著性(p≤0.05)增加，增加范围为7-16％。秋眠种质中NDFD的事件KK179-2分别增加7.5％和9.2％。
表24.2009年在2个位置生长的不休眠(ND)种质中6个减少的木质素苜蓿引导事件的整个植物干草NDFD测量
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
来自2009年的横跨2个位置的整个植物NDFD数据示于表24和26中。不休眠种质中6个减少的木质素阳性事件显示相较于汇集的阴性对照时NDFD的显著性(p≤0.1)增加，增加范围为8-15％。不休眠种质中NDFD的事件KK179-2分别增加14.0％和11.5％。
表25.2009年在4个位置生长的两个秋眠(FD)种质中减少的木质素苜蓿事件KK179-2相较于商业检查的整个植物干草NDFD测量
Figure BPA0000182537270000501
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
FD＝秋眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表26.2009年在2个位置生长的两个不休眠(ND)种质中减少的木质素苜蓿事件KK179-2相较于商业检查的整个植物干草NDFD测量
Figure BPA0000182537270000511
下表中所用的缩写：
NDFD＝中性洗涤纤维消化率，NDF％(NDF＝中性洗涤纤维。表示植物细胞壁中难消化的且缓慢消化的组分
(纤维素、半纤维素、木质素(单位＝干物质％))
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表25和26含有相较于商业检查减少的木质素苜蓿事件KK179-2的整个植物NDFD数据。KK179-2事件显示相较于4个秋眠商业检查中的3个时NDFD的显著性(p≤0.2)增加，增加范围为4.2-16.8％(表25，来自4个位置的数据)。KK179-2事件显示相较于所有4个不休眠商业检查(ND1)时NDFD的增加(p≤0.2)，增加范围为9.8-19.4％(表26，来自2个位置的数据)。KK179-2事件显示相较于所有4个不休眠商业检查(ND2)时NDFD的增加(p≤0.2)，增加范围为8.8-16.3％(表26，来自2个位置的数据)。
实施例8.
实施例8：减少的木质素苜蓿事件的产量跨位置分析
表27.秋眠(FD)和不休眠(ND)背景中6个减少的木质素事件相较于汇集的阴性对照的产量跨位置分析
Figure BPA0000182537270000521
Figure BPA0000182537270000531
下表中所用的缩写：
产量＝基于以克数计的每株植物基础计算的产量
FD＝秋眠
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
表27中的数据显示相较于汇集的阴性对照，秋眠(FD)和不休眠(ND)中6个减少的木质素事件的跨位置产量分析。对于KK179-2检测的产量相较于汇集的阴性对照无显著性下降。
表28.事件KK179-2相较于商业检查的产量跨位置分析
Figure BPA0000182537270000532
Figure BPA0000182537270000541
下表中所用的缩写：
产量＝基于以克数计的每株植物基础计算的产量
FD＝秋眠
ND＝不休眠
KK179＝KK179-2个减少的木质素苜蓿引导事件
Δ＝事件和对照平均值之差值(事件-对照)
差值％＝事件和对照之差值百分比(Δ/对照*100)
ΔLCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间下限
ΔUCI@90％＝使用0.10的α水平时Δ值的置信区间上限
P-值＝在零假设下较大绝对差值的概率(双尾检验用于显著性)。
秋眠(FD)和不休眠(ND)种质中减少的木质素苜蓿引导事件的产量数据导致相较于8个商业检查无显著性产量下降。
Figure IPA0000182537220000021
Figure IPA0000182537220000031
Figure IPA0000182537220000041
Figure IPA0000182537220000061
Figure IPA0000182537220000071

Claims (16)

1.一种命名为KK179-2的苜蓿植物种子，其具有以专利保藏号PTA-11833保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的代表性种子。
2.一种苜蓿植物KK179-2或其部分，其通过使权利要求1所述的种子生长而产生。
3.如权利要求2所述的苜蓿植物KK179-2或其部分，其包含花粉、胚珠、花、芽、根或叶。
4.如权利要求2所述的苜蓿植物KK179-2的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含苜蓿事件KK179-2。
5.如权利要求4所述的后代植物或其部分，进一步包含花粉、胚珠、花、芽、根或叶。
6.如权利要求4所述的苜蓿植物KK179-2或种子或其部分，其基因组产生包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的DNA分子的扩增子。
7.一种重组DNA分子，其包含
a.选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多核苷酸分子；
b.与SEQ ID NO：6具有至少90％同一性的多核苷酸分子；或
c.与a)或b)互补的多核苷酸分子。
8.如权利要求7所述的DNA分子，其中所述DNA分子来源于事件KK179-2，已于ATCC登录号PTA-11833下保藏的种子的代表性样本。
9.如权利要求7所述的DNA分子，其中所述DNA分子是由来源于事件KK179-2的DNA的模板分子产生的扩增子。
10.一种诊断事件KK179-2DNA的存在的多核苷酸探针，其中所述多核苷酸探针具有充分长度以结合包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或其互补序列的核酸分子，并且其中所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或其互补序列的DNA分子杂交，并且在严格杂交条件下不与不包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其互补序列的DNA分子杂交。
11.一种检测来源于事件KK179-2的DNA分子在DNA样本中的存在的方法，所述方法包括：
a.将所述DNA样本与根据权利要求6所述的多核苷酸探针接触：
b.将所述DNA样本和所述多核苷酸探针经历严格杂交条件；和
c.检测所述多核苷酸探针对所述DNA样本中的来源于事件KK179-2的所述DNA分子的杂交。
12.一种DNA分子对，其由第一DNA分子和与所述第一DNA分子不同的第二DNA分子组成，其中所述第一和第二DNA分子包含具有SEQ ID NO：6的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸分子，以用作当与来源于事件KK179-2的模板一起用于扩增反应时产生诊断样本中的事件KK179-2DNA的扩增子的DNA引物。
13.一种DNA检测试剂盒，其包含SEQ ID NO：6的足够长度的连续核苷酸或其互补序列的至少一种多核苷酸分子，以用作对检测来源于事件KK179-2的DNA的存在特异的DNA引物或多核苷酸探针，其中所述DNA的检测诊断所述KK179-2DNA在样本中的存在。
14.如权利要求13所述的DNA检测试剂盒，其中至少一种多核苷酸分子选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
15.一种微生物，其包含如权利要求7所述的DNA分子。
16.如权利要求15所述的微生物，其中所述微生物为植物细胞。
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