CN104673886A - 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用 - Google Patents

转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104673886A
CN104673886A CN201410631662.9A CN201410631662A CN104673886A CN 104673886 A CN104673886 A CN 104673886A CN 201410631662 A CN201410631662 A CN 201410631662A CN 104673886 A CN104673886 A CN 104673886A
Authority
CN
China
Prior art keywords
real
probe
transgenic
strain
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410631662.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104673886B (zh
Inventor
刘二龙
卢丽
吕英姿
张旺
蒋湘
林惠娇
郑高彬
秦焯敏
林学勤
樊武疆
姚柏辉
王定国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Complex art service centre of Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE filed Critical HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE
Priority to CN201410631662.9A priority Critical patent/CN104673886B/zh
Publication of CN104673886A publication Critical patent/CN104673886A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104673886B publication Critical patent/CN104673886B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用引物和探针及检测方法和应用。本发明针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的美国孟山都公司转基因苜蓿草品系J163，首次提供了一对特异性引物及探针，通过对实时荧光PCR检测体系的优化，成功建立了苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测体系，操作简单，特异性和重复性好，检测结果准确、稳定性高，检测最低DNA浓度为15pg，能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析和鉴定。

Description

转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用引物和探针及检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草J163品系特异性的实时荧光PCR检测引物、探针及检测方法和应用。
背景技术
随着我国畜牧业特别是奶牛饲养量的增加，对于植物类饲料特别是苜蓿草的需求也在每年增加。苜蓿草是美国继玉米、小麦、大豆后第四大农作物，因其蛋白含量约占总干草质量的17％～20％，与其他豆科牧草相比是一种极好的饲料作物。截至今年7月份，在我国注册的美国苜蓿草生产厂商就已达71家，据统计，2014年1～6月中国进口苜蓿草总计40.56万吨，同比增26.94％；进口金额总计14966.77万美元，同比增23.08％。其中，6月中国进口苜蓿草6.22万吨，进口额2362.75万美元。
转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物进口安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，而后者应用最广泛的是荧光PCR检测技术，相较普通PCR技术，它具更高的灵敏度、特异性和稳定性。实时荧光PCR方法可通过荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，而后通过扩增曲线和标准曲线对未知模板进行定性或定量分析。
根据扩增目标片段位置的不同，基于核酸基础上的PCR检测又可以分为4种检测策略:1)筛查法:对转基因产品中的启动子中的启动子、终止子等通用基因进行筛查；2)基因特异性检测：对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3)构建特异性检测：对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4)品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。由于启动子、终止子、目的基因可以有多种组合关系，同一组合转化同一植物也可产生不同转化事件，特别对于进境监管，同一种作物有些转基 因品系是允许进口，而有些品系可能由于某种原因没有区得准入。因此筛查法、基因特异性检测和构建特异性检测具有局限性，不能完全满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。而品系特异性/转化事件是指某个外源基因表达框(或片段)插入到宿主基因组某个位置而形成的稳定遗传转化。因此转化事件一旦发生就具有唯一性，针对转化事件的检测可以起到身份识别的作用。
2014年年8月，国家质检总局近日依据福建检验检疫局和山东检验检疫局对苜蓿草的筛查出转基因成分的结果发布警示通报，发起对美国相关公司进境的转基因苜蓿进行为期6个月的检测。
抗草甘膦转基因苜蓿草J163(商品名Roundup Ready alfalfa events J163)是由美国孟山都公司研制开发一种转基因苜蓿草品系。2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前我国尚批准其进口。草甘膦(glvphosate)是孟山都(Monsanto)公司生产的是一种施用于叶面的广谱的、非选择性的有机膦类除草剂(商品名为Roundup)。它对于一年生和多年生杂草都有极强的控制能力。草甘膦特异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙酰转移酶(EPSPS)的活性。EPSPS是芳香族氨基酸合成途径中的一个酶，它可逆地催化S3P(shikimate-3-phosphate)和PEP(phosphoenopyrate)缩合成EPSP和无机膦。Monsanto公司将具有抗草甘膦除草剂能力的EPSPS基因转入苜蓿草中，使其具有抗草甘膦除草剂能力。
目前，国内转基因苜蓿草检测策略大多采用检测启动子、终止子或EPSPS基因等筛查检测从而确定是否转基因苜蓿草，但对于不同品系的转基因苜蓿草不能进行鉴别性检测，无法满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。国内尚无J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草采用的筛查检测技术不能准确地检测具体的转基因品系的不足，提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用引物和探针，其具有高特异性和灵敏度及稳定性，基于所述引物和探针，可成功建立转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法。
本发明要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法。
本发明还一要解决的技术问题是提供所述检测方法的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明通过创造性地分析和大量实验研究总结，在转基因苜蓿草J163品系的5‘端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，设计得到一对特异性的引物，以及探针。并确定了精确地检测步骤和条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草J163品系特异性TaqMan实时荧光PCR检测方法。
具体地，提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用引物J163-1和J163-2，，其序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：J163-1：5‘-CGATTACCCCCTCCTACTTTTTTC-3‘。
SEQ ID NO.2：J163-2：5‘-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT-3‘。
提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用探针J163-p，其序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：J163-p:5‘-FAM-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT–TAMRA-3‘。
提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探针J163-p进行实时荧光PCR定性和/或定量检测；
其中，S2所述实时荧光PCR检测反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L引物J163-1和J163-2各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，探针J163-p 0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
S2所述实时荧光PCR检测反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage 2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
优选地，S1所述提取DNA的具体方法为：称取100mg左右研磨成干粉的待测样品，使用DNA提取试剂盒并按照其操作说明书提取基因组DNA。提取的基因组DNA用微量分光光度计nanodrop2000c测定浓度，提取的DNA溶液在-20℃保存备用。
优选地，所述定量检测的方法为：
S21.提取转基因苜蓿J163基因组DNA进行梯度稀释，分别加入J163品系特异性引物J163-1和J163-2和探针J163-p，以及内源基因acc引物和探针，进行扩增；
所述内源基因acc引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；探针的序列如SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.4:acc-1:GATCAGTGAACTTCGCAAAGTAC；
SEQ ID NO.5:acc-2:CAACGACGTGAACACTACAAC；
探针为:SEQ ID NO.6:acc-p:TGAATGCTCCTGTGATCTGCCCATGC。
S22.扩增后得到各稀释浓度对应的Ct值，该Ct值与浓度的自然对数(lg)呈线性关系，据此绘制J163标准曲线和acc标准曲线； 
S23.提取待检样品的基因组DNA，加入本发明设计的品系特异性引物J163-1和J163-2和探针J163-p，进行扩增，扩增后得到的Ct值，根据绘制J163的标准曲线，代入其线性方程，可以得到样品转基因的基因组DNA量。
本发明采用以下方法验证本发明方法的特异性、灵敏性和准确性：
采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探针J163-p对常见作物进行实时荧光PCR检测，测试检测体系特异性；
采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探针J163-p，对不同浓度的J163基因组DNA进行实时荧光PCR检测，建立标准曲线。同时参考文献(Alexander TW et al.,2007)选择苜蓿内源基因acc用于检测本发明中提取苜蓿草基因组DNA的质量及是否适合进行荧光PCR检测，并对不同浓度的J163基因组DNA进行实时荧光PCR检测，建立acc标准曲线。
采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探针J163-p，对不同浓度的J163基因组DNA进行实时荧光PCR检测，测试检测体系灵敏度。
采用所述引物J163-1和J163-2、所述的探针J163-p对不同浓度的J163基因组DNA进行实时荧光PCR的重复性检测，测试检测体系稳定性。
上述实时荧光PCR检测反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L所述引物J163-1和J163-2各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，、所述的探针J163-p 0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
上述实时荧光PCR检测反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage 2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
本发明同时提供所述转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的应用，应用于鉴别转基因苜蓿草J163品系与其他作物。尤其是与非转基因紫花苜蓿、大叶苜蓿、转基因玉米MIR162、转基因玉米Btll、转基因玉米MON98140、转基因玉米NK603、转基因大米(cry IA(b/c))、转基因大豆GTS40-3.2、非转基因油菜籽、大豆、椰子粕、豌豆、木薯和/或小麦。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
目前对转基因产品的检测主要包括对蛋白质和核酸检测两大类，而后者因为操作简便、稳定性好以及易于推广等优点被广泛应用。根据扩增目标片段位置的不同，基于核酸基础上的PCR检测又可以分为4种检测策略，即筛选检测、基因特异性检测、构建特异性检测和品系(转化事件)特异性检测(徐茂军，2001)，其中品系特异性检测由于可以鉴定出具体的转基因作物品系，因此是特异性最高的检测方法。由于进境农作物特别是含多种品系的作用，有的只有一部分品系允许进口，另一些尚未曾颁发证书，采用筛选检测、基因特异检测、构建特异性检测均无法区分具体的品系，无法对进境产品的转基因成份进行标识。
本发明首次揭示一对转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用引物J163-1和J163-2，并设计得到特异性的探针，为成功建立了苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测体系提供有力的技术基础。
进一步地，本发明成功建立了苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测体系，操作简单、检测结果准确、稳定性高。通过对苜蓿草J163等农作物进行的特异性试验表明，本发明建立的TaqMan实时荧光PCR方法仅对苜蓿草J163品系的检测结果为阳性；检测最低DNA浓度为(1imit of detection，LOD)为15pg，相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA；重复性试验显示，其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。本发明建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好，灵敏度高，能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。
本发明建立的J163品系特异性实时荧光PCR方法，一方面可通过荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，通过扩增曲线和标准曲线对未知模板进行定性或定量分析，具有比普通PCR方法有更高的灵敏度、特异性和稳定性，另一方面基于外源插入片段P-eFMV启动子和转基因苜蓿J163基因组DNA的5’端旁邻序列建立了转基因转基因苜蓿草J163品系特异性(event-specific)实时荧 光PCR方法可以特异性的鉴别目前尚未批准的苜蓿草J163品系，对我国进境转基因作物的监管提供有力的技术支撑。
附图说明
图1是实时荧光PCR检测的特异性结果示意图。
图2是实时荧光PCR检测J163基因组DNA的灵敏度扩增曲线图。
图3是实时荧光PCR检测J163品系的标准曲线。
图4是实时荧光PCR检测J163品系内源基因acc的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的生物材料、试剂原料为常规市购或商业途径获得的生物材料和试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1：建立J163品系特异性实时荧光PCR检测体系
设计引物和探针：
本发明通过创造性分析结合大量实验研究，基于转基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，采用press 3.0软件(AppliedBiosystems，USA)设计引物和探针。将设计的引物和探针在NCBI网站数据库中进行Blast比对，确定引物和探针理论上的特异性。并针对性确定工艺条件，建立特异性强、灵敏度高、稳定性良好的转基因苜蓿草J163品系特异性TaqMan实时荧光PCR检测方法。
所述转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用引物J163-1和J163-2，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示：
J163-1：5’-CGATTACCCCCTCCTACTTTTTTC-3’。
J163-2：5’-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT-3’。
提供一种转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测用探针J163-p，其序列如SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.3：J163-p:5’-FAM-TTGGAGACTCTGTACCCTGACCTT-TAMRA-3’。
所述引物和探针可以采用本领域常规方法合成。本实施例应用的引物和探针均委托宝生物合成。
本发明实施例所述实时荧光PCR检测使用的仪器为荧光定量PCR仪ABI7500。
本实施例基于上述引物、探针，提供一种化脓隐秘杆菌的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
其中，S1提取DNA具体方法为：称取100mg左右研磨成干粉的待测样品，使用天根植物基因组DNA提取试剂盒并按照其操作说明书提取基因组DNA。提取的基因组DNA用微量分光光度计nanodrop2000c测定浓度。提取的DNA溶液在-20℃保存备用。
S2中所述实时荧光PCR检测反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L引物J163-1和J163-2各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，探针引物J163-p 0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
S2中所述实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
实施例2：本发明方法的特异性试验
本发明采用多种农作物进行特异性实验，以下以15种农作物，包括J163、转基因玉米MIR162、转基因玉米Btll、转基因玉米MON98140、转基因玉米NK603、转基因大米(cry IA(b/c))、转基因大豆GTS40-3.2、非转基因紫花苜蓿、大叶苜蓿非转基因油菜籽、大豆、椰子粕、豌豆、木薯和小麦。(均来自常规随机取样后储存，并不因此限定本发明范围)的基因组DNA为模板，采用本发明建立的转基因苜蓿J163品系特异性实时荧光PCR方法进行扩增，检测本发明建立的方法的特异性。观察有无扩增曲线产生。实验结果见附图1所示。实验结果表明，有且只有J163有指数扩增，其他菌均无典型扩增曲线产生，表明本发明建立的J163品系特异性的TaqMan实时荧光PCR方法特异性良好。
实施例3：本发明检测体系灵敏度测试及标准曲线建立
J163基因组DNA初始模板浓度经ND2000C微量分光光度计测得其浓度为200ng/μL。经TE稀释后对100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL的J163基因组DNA模板进行检测，每个浓度设置3个重复。以大于15pg(10pg/μL，1.5μL)基因组DNA为模板时，扩增反应均出现荧光增幅，每个浓度的三个平行测得的Ct值的SD介于0.017～0.213，均小于0.25，实验数据表1所示。而以1.5pg(1pg/μL,1.5μL)基因组DNA为模板时，无阳性扩增曲线。表明该实 时荧光PCR体系可以检测J163基因组DNA的最低检测限为15pg，由于苜蓿草的基因组DNA的估算为1510Mbp，相应的，重量大约估算为1.6pg(arumuganthan,K，1991)则可检测到9个拷贝的J163基因组DNA。扩增结果见附图2所示。附图2中，从左到右为模板量分别为150ng、15ng、1.5ng、150pg、15pg，1.5pg(未有扩增曲线)的J163基因组DNA扩增产物。
同样地，利用5个浓度梯度的转基因苜蓿J163成分的基因组DNA溶液(100、10、1、0.1、0.01ng/μL苜蓿草J163基因组DNA)为模板，采用内源基因acc内源基因的引物和探针及转基因苜蓿草J163品系特异性引物探针进行荧光PCR扩增，以log(DNA浓度)为横坐标，Ct值为纵坐标分别建立标准曲线，以实现对转基因苜蓿草J163成分的相对定量分析。结果表明，苜蓿草内源基因acc的标准曲线回归方程为y＝-3.5020x+38.246，线性相关系数(R2)为0.9989，扩增效率E为93％，见附图4所示。转基因苜蓿草J163品系特异性序列扩增的线性回归方程为y＝-3.032x+38.216，线性相关系数(R2)为0.9908，扩增效率E为114％，见附图3所示，表明标准曲线的线性良好，扩增效率高。因此，建立的苜蓿草内源基因acc和转基因苜蓿草J163品系特异性序列标准曲线适于J163成分的定量分析。本发明涉及到的拷贝数的计算方法和公式为：拷贝数＝DNA模板量(pg)/1.6。
本实施例所述acc引物和探针委托宝生物合成，其序列为：
SEQ ID NO.4:acc-1:GATCAGTGAACTTCGCAAAGTAC
SEQ ID NO.5:acc-2:CAACGACGTGAACACTACAAC
探针为:SEQ ID NO.6:acc-p:TGAATGCTCCTGTGATCTGCCCATGC 
所述实时荧光PCR检测反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L所述的引物acc-1和acc-2各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，所述探针acc-p0.6μL，DNA模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
所述实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage 2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
表1 实时荧光PCR检测J163基因组DNA的灵敏度测试结果
a：参考arumuganthan,K,；Earle,E.D文献及计算方法，苜蓿草基因组的大小为1510Mbp进行计算估算，苜蓿的基因组DNA的重量约为1.6pg.[arumuganthan,K,；Earle,E.D.Nuclear DNA content of some important plant species.Plant Mol.Biol Rep.1991,9,208-218.] 
实施例4：本发明的检测体系的重复性测试
采用4个浓度梯度(150、30、6、1.2ng)的基因组DNA进行的扩增结果表明，4组Ct值3次平行重复间的标准偏差(SD)介于0.05～0.13，相对标准偏差(RSD)介于0.17％～0.42％均在可接受的范围之内(ENGL，2008)表明本文建立的转基因苜蓿J163品系特异性实时荧光PCR方法具有很好的可重复性。建立的实时荧光PCR方法的重复性测试结果表2所示。本发明涉及到的拷贝数的计算方法和公式为：拷贝数＝DNA模板量(pg)/1.6。
图2 本发明实时荧光PCR检测J163重复性测试结果
a：参考arumuganthan,K,；Earle,E.D文献及计算方法，苜蓿草基因组的大小为1510Mbp进行计算估算，苜蓿的基因组DNA的重量约为1.6pg.[arumuganthan,K,；Earle,E.D.Nuclear DNA content of some important plant species.Plant Mol.Biol Rep.1991,9,208-218.] 
SEQUENCE LISTING
 
<110>  中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局
 
<120>  转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用引物和探针及检测方法和应用
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  引物J163-1
 
<400>  1
cgattacccc ctcctacttt tttc                                            24
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  引物J163-2
 
<400>  2
ttggagactc tgtaccctga cctt                                            24
 
 
<210>  3
<211>  24
<212>  DNA
<213>  探针J163-p
 
<400>  3
ttggagactc tgtaccctga cctt                                            24
 
 
<210>  4
<211>  23
<212>  DNA
<213>  引物acc-1
 
<400>  4
gatcagtgaa cttcgcaaag tac                                             23
 
 
<210>  5
<211>  21
<212>  DNA
<213>  引物acc-2
 
<400>  5
caacgacgtg aacactacaa c                                               21
 
 
<210>  6
<211>  26
<212>  DNA
<213>  探针acc-p
 
<400>  6
tgaatgctcc tgtgatctgc ccatgc                                          26

Claims (9)

1.一种转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用引物J163-1和J163-2，其特征在于，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用引物J163-1和J163-2在Taqman实时荧光PCR定量检测转基因苜蓿草J163品系的应用。
3.一种转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用探针J163-p，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求3中所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测用探针J163-p在Taqman实时荧光PCR定量检测转基因苜蓿草J163品系的应用。
5.一种转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取DNA作为反应的模板；
S2.采用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针进行实时荧光PCR定性和/或定量检测；
其中，S2所述实时荧光PCR检测的反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L权利要求1所述的引物各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL ，权利要求2所述的探针0.6μL，DNA 模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
S2所述实时荧光PCR检测的反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage 2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
6.根据权利要求5所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述定量检测的方法包括以下步骤：
S21.提取转基因苜蓿J163基因组DNA进行梯度稀释，分别加入J163品系特异性引物J163-1和J163-2和探针J163-p，以及内源基因acc的引物和探针，进行扩增；
S22.扩增后得到各稀释浓度对应的Ct值，该Ct值与浓度的自然对数（lg）呈线性关系，据此绘制J163标准曲线和acc标准曲线；
S23.提取待检样品的基因组DNA，加入本发明设计的品系特异性引物J163-1和J163-2和探针J163-p，进行扩增，扩增后得到的Ct值，根据绘制J163的标准曲线，代入其线性方程，可以得到样品转基因的基因组DNA量。
7.根据权利要求6所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述内源基因acc的引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；探针的序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求7所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测方法，其特征在于，S21或S23所述扩增的反应体系为20μL：Premix Ex Taq TM 10μL，10μmol/L内源基因acc的引物各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，内源基因acc的探针0.6μL，DNA 模板1.5μL和ddH2O 6.9μL；
检测反应程序为：Stage 1：预变性95℃30s；Stage 2：95℃5s，60℃34s，40个循环，并收集荧光信号。
9.权利要求5至8任一项所述转基因苜蓿草J163品系实时荧光PCR检测方法的应用，其特征在于，应用于鉴别转基因苜蓿草J163品系与非转基因紫花苜蓿、大叶苜蓿、转基因玉米MIR162、转基因玉米Btll、转基因玉米MON98140、转基因玉米NK603、转基因大米cry IA（b/c）、转基因大豆GTS40-3.2、非转基因油菜籽、大豆、椰子粕、豌豆、木薯和/或小麦。
CN201410631662.9A 2014-11-11 2014-11-11 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用 Active CN104673886B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410631662.9A CN104673886B (zh) 2014-11-11 2014-11-11 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410631662.9A CN104673886B (zh) 2014-11-11 2014-11-11 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104673886A true CN104673886A (zh) 2015-06-03
CN104673886B CN104673886B (zh) 2017-01-18

Family

ID=53309473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410631662.9A Active CN104673886B (zh) 2014-11-11 2014-11-11 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104673886B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803092A (zh) * 2016-05-04 2016-07-27 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN106676176A (zh) * 2017-01-18 2017-05-17 天津农学院 一种利用多重pcr对四倍体紫花苜蓿进行ssr分析的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060272042A1 (en) * 2003-01-31 2006-11-30 Beazley Kim A Glyphosate tolerant alfalfa events and methods for detection
CN103857798A (zh) * 2011-06-30 2014-06-11 孟山都技术公司 对应于转基因事件kk179-2的苜蓿植物和种子及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060272042A1 (en) * 2003-01-31 2006-11-30 Beazley Kim A Glyphosate tolerant alfalfa events and methods for detection
CN103857798A (zh) * 2011-06-30 2014-06-11 孟山都技术公司 对应于转基因事件kk179-2的苜蓿植物和种子及其检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803092A (zh) * 2016-05-04 2016-07-27 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN106676176A (zh) * 2017-01-18 2017-05-17 天津农学院 一种利用多重pcr对四倍体紫花苜蓿进行ssr分析的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104673886B (zh) 2017-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108504780A (zh) 同时检测8种羊常见病毒及细菌Taqman荧光定量PCR试剂盒及方法
CN107988427A (zh) 对虾肝胰腺细小病毒（hpv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN106434959A (zh) 一种食品及饲料中鸡源成分快速检测试剂盒及其应用
CN110592268A (zh) 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
CN104673886A (zh) 转基因苜蓿草j163品系实时荧光pcr检测用引物和探针及检测方法和应用
CN106480203A (zh) 用于检测鸡源成分的内标基因及其应用
CN103397108A (zh) 猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN100395346C (zh) 一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌核苷酸片段的引物和探针序列
CN111850135B (zh) 一种15种动物源性成分的pcr高分辨熔解检测试剂盒及检测方法
TWI399436B (zh) 用於定量檢測蘭花病毒之引子及引子對與套組暨方法
CN102965435A (zh) 一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法
CN103740822B (zh) 一种spf小鼠病原菌核酸荧光定量pcr联合快速检测试剂盒及检测方法
CN105002166A (zh) 褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法
CN112359098A (zh) 一种实时荧光定量pcr检测耐除草剂转基因大豆j12含量的方法
CN111218520A (zh) 转基因大豆gts-40-3-2品系efirm检测探针及其应用
Millard et al. Detection of infectious haematopoietic necrosis virus and infectious salmon anaemia virus by molecular padlock amplification
CN104745686A (zh) 转基因苜蓿草j163品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用
CN104372098A (zh) 转基因苜蓿草j163品系特异性定性pcr检测用引物及检测方法
CN103937878B (zh) 转基因玉米mir604结构特异定量pcr检测的引物和探针及方法
CN104561262A (zh) 转基因苜蓿草J101品系Taqman实时荧光定量PCR检测用引物和探针及检测方法
CN102586242A (zh) 转基因大豆bps-cv127-9转化事件外源插入载体旁侧基因及其应用
CN116064888A (zh) 用于转基因玉米Mon87403品系定量检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN104630367B (zh) 红颈常室茧蜂特异性coi引物、含有其的试剂盒及应用
CN106048004B (zh) 一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的实时荧光定量pcr引物和探针及其试剂盒
CN104962635A (zh) 同时检测桔小实蝇两种内寄生蜂实时荧光定量pcr方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 510730 Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong Road, No. 17

Patentee after: Complex art service centre of Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau

Address before: 510730 Guangzhou Development Zone, Guangdong Road, No. 17

Patentee before: HUANGPU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANINE