CN105802978B - 一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM在调控植物单荚结实率中发挥作用，丰富了紫花苜蓿种子产量调控研究内容。

Description

一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa)是苜蓿属多年生豆科植物，因其产量高、适口性好、品质优良，而在全世界广泛种植，素有“牧草之王”的美誉，全世界的种植面积超过千万公顷。在美国，由紫花苜蓿干草生产带来的经济效益每年可以达到80亿美金。
紫花苜蓿具有耐寒、耐旱、耐盐碱、耐瘠薄、适应性强等优点，被广泛种植于我国北方特别是西北部干旱少雨地区，在改善生态环境、调整农业产业结构方面发挥了重要作用。随着畜牧业的发展和人类生活水平的不断提高，对高蛋白牧草的需求不断增加，2014年，我国紫花苜蓿的种植面积超过100万亩。随着紫花苜蓿种植面积的逐年扩大，对苜蓿种子的需求量迅速增加。2014年进口0.25万吨，同比增加30.91％，是2011年进口量的6.4倍，进口金额1283.5万美元，同比增加43.16％，苜蓿种子价格飙升至50元/千克以上。要想摆脱这种进口依赖性，提高紫花苜蓿种子产量是当务之急。
紫花苜蓿的种子产量直接关系到紫花苜蓿的种植业发展。植物种子产量除了受到环境和灌溉条件等的影响外，在遗传上主要受基因的调控。影响种子产量的性状主要有：种子粒重，花序数，果荚数，单荚种子数等。在过去的研究中发现，GS3和GS5基因影响水稻籽粒重，QTL位点GW5与籽粒大小有关。OsSPL16调控籽粒的大小，形状和质量。在Gn1a与花序籽粒数相关。与大豆产量相关的QTL分析研究也多集中在百粒重和千粒重的性状上。到目前为止，与作物结实率相关的基因还鲜见报道。开展紫花苜蓿单荚结实率相关基因的研究，可以为揭示紫花苜蓿种子产量的调控机理提供理论基础，为紫花苜蓿种子产量的遗传改良和种子生产提供理论依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM及其应用。
一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
本发明所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
本发明所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM在调控植物育性中的应用。
本发明所述的应用，所述的紫花苜蓿育性相关基因MsDAM降低了植物的单荚结实率。
一种包括本发明所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM的载体。
一种包括本发明所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM的宿主细胞。
本发明紫花苜蓿单荚结实率相关基因MSDAM与现有技术不同之处在于：
试验证明本发明紫花苜蓿育性相关基因MSDAM增强表达后，转基因拟南芥的结实率显著下降，表明DAM基因参与了植物的种子产量调控。序列比对结果显示，该序列目前在NCBI中没有同源序列，是一个与种子产量相关的新基因，在植物种子产量的调控中发挥作用，丰富了牧草种子产量调控研究内容。
本发明发现了一个与紫花苜蓿单荚结实率相关的基因MsDAM，目前作物上对籽实产量相关基因和QTL的研究报道主要集中于籽实重量(百粒重，千粒重)，籽实大小等性状，与结实率相关的基因还未见报道。对该基因的发现和功能阐述将极大地丰富牧草乃至作物种子产量调控机制的内容，并且为紫花苜蓿种子产量的遗传改良和种质创新奠定理论基础。
下面结合附图对本发明的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MSDAM及其应用作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例2中的质粒载体结构图；
图2为本发明实施例3中单荚种子数统计图。
具体实施方式
实施例1紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM的制备
本发明提供的紫花苜蓿MsDAM基因是通过以下方法筛选得到的：
根据紫花苜蓿转录组数据，获得一个受盐诱导增强表达的Unigene片段，如序列表中SEQ ID NO:1所示。
根据此片段序列信息，设计RACE扩增引物GSP1和GSP2。利用SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech，USA)分别对该序列进行5’RACE和3’RACE克隆，最后获得了该基因全长序列。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下：
1、紫花苜蓿总RNA的提取：
紫花苜蓿总RNA的提取采用Trizol试剂法，具体步骤如下：
(1)将0.3g左右紫花苜蓿组织材料加入大约3000μl Trizol试剂，加入液氮快速磨碎，放在无菌环境中直至变为匀浆。
(2)用移液枪吸取大约1mL匀浆到1.5mL Eppendorf离心管中，剧烈振荡混匀，于室温放置5min，4℃，13，000rpm离心10min。
(3)取上清，加入200μL氯仿，剧烈振荡，室温放置2-3min，4℃，13,000rpm离心15min。
(4)溶液从下到上依次分为三层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新Eppendorf离心管，加等体积氯仿，重复第3步。
(5)取其上清加入等体积异丙醇，混合混匀，室温放置10min左右，4℃，13,000rpm离心10min，得到白色RNA沉淀。
(6)弃上清，加1000μL 75％乙醇(用DEPC水配制，即diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)，将沉淀冲起，于4℃，13000rpm离心10min，倒掉乙醇，留下沉淀。
(7)重复第6步，在无菌环境下晾干。加20～50μl无菌DEPC水溶解。
进行RNA电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
2、RACE克隆基因cDNA全长
RACE-ready cDNA的合成
(1)准备缓冲液：2.0μl 5×第一链缓冲液(First-Strand Buffer)，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP Mix(10mM)；
(2)制备用于5’RACE的cDNA反应液：2.75μl RNA，1.0μl 5'-CDS Primer A，制备用于3’RACE的cDNA反应液：3.75μl RNA，1.0μl 3'-CDS Primer A；
(3)将步骤(2)中制备好的液体混匀，短暂离心，72℃孵育3分钟，再于42℃冷却2分钟，短暂离心收集反应液液体；
(4)向5’RACE的cDNA反应液中加入1μl的SMARTer IIA oligo，短暂离心收集液体；
(5)制备5’RACE和3’RACE-Ready cDNA反应液(Master Mix)：4.0μl步骤(1)中得到的缓冲液，0.25μl RNA酶抑制剂(40U/μl)，1.0μl SMARTScribe逆转录酶(100U)，将以上试剂混匀；
(6)向步骤(3)中得到的3’RACE和步骤(4)中得到的5’RACE反应液中分别加入5.25μl步骤(5)中得到的反应液，轻柔混合，短暂离心收集液体；
(7)将制备好的反应液于42℃中孵育90分钟；
(8)70℃加热10分钟，完成Ready-cDNA的合成。
RACE引物的设计
(1)基因特异引物(Gene-Specific Primers，GSPs)满足以下条件：23-28bp；GC含量50％-70％；Tm值最好>70℃；与3’-端通用引物(Universal Primer Mix，试剂盒提供)不发生互补。
(2)需设计两个GSP引物，反向引物(GSP1)用于5’RACE，正向引物(GSP2)用于3’RACE。
根据以上原则，设计GSP1(5'-GGGAAGACGATTGAAGTGAAGCCAGAGT-3')和GSP2(5'-TTGAGAGTTGCGGAAGCAGAGCGG-3')两条引物。
cDNA末端的快速合成
(1)制备足够的PCR混合液(Master Mix):每50μl PCR反应体系中加入以下试剂：
34.5μl PCR用水，5.0μl 10×Advantage 2PCR缓冲液，1.0μl dNTP Mix(10mM)，1.0μl50×Advantage 2聚合酶Mix。轻轻混合液体，注意不要产生气泡，短暂离心收集液体；
(2)制备用于5’RACE的PCR反应液：2.5μl 5’RACE–ready cDNA，5.0μl UPM(10×)，1.0μl GSP1；41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液；
制备用于3’RACE的PCR反应：2.5μl 3’RACE–ready cDNA,5.0μl UPM(10×)，1.0μlGSP2；41.5μl的步骤(1)中制备的PCR混合液；
(3)RACE扩增：反应体系为：94℃30秒，72℃3分钟，共5个循环：94℃30秒，70℃3分钟，72℃3分钟,共5个循环；94℃30秒，68℃30秒，72℃3分钟，共20个循环。
取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，用T4DNA连接酶(Takara)连接回收产物于PMD18-T(Takara)载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
3、重组质粒的大肠杆菌转化
(1)DH5α感受态细胞在冰上融化，吸取50μl，加入5μl的DNA连接产物，混合均匀后冰浴30min。
(2)42℃热击60sec，立即冰浴3-5min。
(3)加入700μl LB液体培养基，37℃恒温振荡器(150r/min)上培养60min。
(4)5000rmp离心3min收集菌体。
(5)LB平板上(Amp)涂布X-gal(l5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，2％)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，50mg/ml)，使其均匀涂布平板表面，常温晾干。
(6)取100μl菌液均匀涂布于含抗生素Amp(100mg/L)的LB平板上，培养箱中37℃倒置培养过夜；次日将平板放入4℃放置使之充分显色。
(7)挑选白色单菌落于1ml LB液体培养基中(Amp终浓度100mg/L)，225r/min 37℃培养过夜。
对菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序。对结果进行序列拼接，结果显示该基因具有如序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列(1725bp)，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
实施例2农杆菌介导的MsDAM基因转化拟南芥植株
1.1、材料与试剂
1.1.1、植物材料
供试苜蓿品种为紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1，中苜一号)。
1.1.2、农杆菌菌株和质粒载体
所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌：LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)
农杆菌培养基：
试剂 含量(1L)
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1g/L
蛋白胨 10g/L
酵母提取物 1g/L
蔗糖 5g/L
琼脂(固体培养基) 15g/L
pH 7.0
121℃高压蒸汽灭菌20min；载体：PBI 121
1.2、实验方法
1.2.1将MsDAM基因插入到PBI121载体质粒DNA中，具体步骤为：设计5’端包含XbaI酶切位点的上游引物和BamHI酶切位点的下游引物(P1：5'-GCTCTAGAATGGTGATCGAGAACGACATTGAG-3'，P2：5'-CGGGATCCTCAGTGATGGCCACGCCTAAGTGATG-3')，其中，下划线部分为酶切位点；用该引物从紫花苜蓿cDNA模板中扩增MsDAM的全长阅读框，PBI载体和目的基因全长片段经XbaI和BamHI双酶切后回收产物，经T4DNA连接酶连接，得到插入有MsDAM基因的PBI121载体，其含有CaMV35s启动子、MsDAM基因(如序列表中SEQ ID NO:2所示)以及一个卡那霉素抗性筛选标记，进行遗传转化时可通过卡那霉素筛选初步鉴定获得的转基因植株。含有目的片段的质粒载体的结构如图1所示。
1.2.2将插入有MsDAM基因的PBI121载体导入到根癌农杆菌LBA4404中，具体步骤如下：
A.向100μl农杆菌感受态细胞LBA4404中加入约1μg质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；
B.于液氮中速冻1min，立即置于37℃水浴中温育5min；
C.加入800μl YEB液体培养基，28℃150rpm培养4-6h；
D.菌体涂布于含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin Sulfate)和100mg/L链霉素(Streptomycin)的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。
E.挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中(含50mg/L Kan和100mg/L Str)，28℃震荡培养过夜。
提取导入有MsDAM基因的农杆菌的质粒并测序，结果显示导入基因的核苷酸序列与如序列表中SEQ ID NO:2所示的序列一致，表明含有目的基因MsDAM的表达载体构建成功。
1.2.3、农杆菌的培养
将导入有MsDAM基因的农杆菌于含有50mg/LKan和100mg/L Str的固体培养基上划平板，放于培养箱内，28℃培养。两天后，从平板上挑取单菌落，接种于含有50mg/L Kan和100mg/L Str的20ml YEB液体培养基中，180rpm，28℃培养。用摇好的菌液划平板，28℃培养，待长出单菌落后，将平板放于4℃保存。
在平板上挑取单菌落，接种于20ml含有50mg/L Kan和100mg/L Str的YEB液体培养基内，在恒温摇床上于28℃，180rpm培养。两天以后取少量菌液，以1:50-1:100的比例稀释到含50μg/m1Kan和100μg/m1Str的YEB液体培养基中，28℃培养6-12h至对数生长期。将菌体收集到离心管中，4,000rpm离心10min富集菌体，弃上清，再用约20ml不含抗生素的改良的SH液体培养基重悬菌体，使菌液的OD600值为0.6-0.8，待用。
1.2.4、拟南芥的准备：
Col生态型拟南芥种子灭菌后，将种子铺在1/2MS固体培养基的培养皿上，放在4℃下春化48小时。
将春化后的种子平板放在拟南芥培养箱(24℃16h/22℃8h)中培养，7天后，移到花盆中(蛭石：营养土：珍珠岩大约为1：1：1)。按上述方法培养拟南芥，约三星期左右，剪去已经开花的主茎，抑制顶端优势。约四星期左右，抽出的侧枝大量开花，此时是用浸润法转基因的最佳时机。
1.2.5、农杆菌培养
取原菌液20μl，加入5ml YEP(Yeast extract 10g/L，Tryptone10g/L，Nacl 5g/L，灭菌后，添加抗生素)，30℃恒温振摇过夜，将此5ml菌液倒入250ml YEP(添加抗生素)培养基，30℃恒温振摇过夜，此时，农杆菌的浓度应达到OD600＝1.8。4000rpm离心15分钟，弃去上清，加入浸润法培养基(1/2MS大量+1×MS微量+1×MS铁盐+1×MS肌醇+1×MS维生素+MES0.5g/L+Sucrose 5％，pH5.7高压灭菌)。使农杆菌以1：1的比例重悬于浸润培养基，并加入表面活性剂Silwet77，使其终浓度达到0.02％(每升加200μl)。
1.2.6、浸润法转基因
将拟南芥花盆蒙上纱布，用橡皮筋扎紧，以免花盆倒扣时培养基质下漏。将花盆倒扣于装有250ml菌悬液的浸润罐上，使植株的花序浸没在菌液中，浸润持续2min，转化后用吸水纸吸去过多的菌液，但不需要吸得很干。转化后的植株，用保鲜膜覆盖过夜后揭膜。正常生长，收取种子。
1.2.7转基因拟南芥植株的筛选
收获的拟南芥种子经70％酒精2min，5％次氯酸钠5min进行消毒。将拟南芥种子播到含50mg/L Kan的1/2MS固体培养基的培养皿中，放到4℃低温下春化2天。在抗性培养基上正常生长的拟南芥幼苗为转化成功拟南芥，转化失败拟南芥幼苗将不能正常生长。将能正常生长的拟南芥幼苗移栽到花盆，在人工气候室条件下生长。以转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板，以nptⅡ基因引物P3/P4(P3：5'-agagcagtga ttagactcgg tggca-3'，P4：5'-agaccctggcagaacaagaa gca-3')，gus基因引物P5/P6(P5：5'-gctctagaat gacctcctctttcttctctg acc-3'，P6：5'-cgggatcctc aagataggaa agattc-3')检测含pBI121-MsDAM载体转基因植株。阳性植株保留(共获得12株：L1-L12)，单独收种。T1代经同样抗生素筛选，其分离比(3：1)经卡方检验，共获得3个3：1分离的株系：L5，L29，L31。将这些株系保留收种得到T2代。从T2代中筛选纯合体，单独收种，获得T3代。
实施例3 MsDAM基因的PBI121载体转化拟南芥单荚种子数评价
用质粒PBI121转化农杆菌，获得重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体的对照植株，方法如实施例1，获得转空载体对照植物(CK)，作为对比例1。
评价对比例1中得到的转空载体的拟南芥和实施例1中得到的转化插入有MsDAM基因的PBI121载体拟南芥的单荚种子数，具体方法如下：
CK和转基因拟南芥L5，L29，L31种子灭菌后播种在1/2MS固体培养基上，春化2天后，放在光照培养箱中培养7天后，移到花盆中，于温室中培养。条件22℃16h/20℃8h，见干见湿浇水。待果荚成熟但未开裂时，每份材料随机取10个果荚，小心剖开统计单荚种子数。统计结果见图2。
MsDAM基因增强表达后，转基因拟南芥的结实率显著下降，表明DAM基因参与了植物的育性调控。序列比对结果显示，该序列目前在NCBI中没有同源序列，是一个新基因。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.权利要求1所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM在调控植物育性中的应用，其特征在于：所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM降低了拟南芥的结实率。
4.一种包括权利要求1所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM的载体。
5.一种包括权利要求1所述的紫花苜蓿单荚结实率相关基因MsDAM的宿主细胞。
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