BRPI0708486B1 - Métodos de alto rendimento para a análise de uma população de sementes haploides e para agrupar uma população de sementes duplo haploides - Google Patents

Abstract

MÉTODOS NÃO DESTRUTIVO DE ALTO RENDIMENTO PARA ANALISAR SEMENTES INDIVIDUAIS EM UMA POPULAÇÃO DE SEMENTES, DE ALTO RENDIMENTO PARA A ANÁLISE DE UMA POPULAÇÃO DE SEMENTES HAPLÓIDE, E DE ALTO RENDIMENTO PARA AGRUPAR UMA POPULAÇÃO DE SEMENTES DUPLO HAPLÕIDES A presente invenção refere-se a novos processos para facilitar as atividades de melhoria de germopíasma através do uso de amostragem de sementes não-destrutiva de alta circulação. Em uma modalidade, um processo não-destrutivo de alta circulação para a análise de sementes individuais em uma população de sementes compreende a remoção de uma amos- tra de um grande número de sementes na população enquanto a viabilidade de germinação da semente é preservada e a análise da amostra em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características de pelo menos uma característica genética ou química.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de cultivo de plantas. Mais especificamente, esta invenção fornece métodos para aumentar e economizar atividades de melhoria de germoplasma utilizando técnicas de amostragem de sementes de alta circulação e não-destrutivas.

Antecedentes da Invenção

As afirmações nesta seção fornecem meramente informação antecedente relacionada com a presente descrição e podem não constituir a técnica anterior.

No desenvolvimento e na melhoria de plantas, são feitas melhorias genéticas na planta, através do cruzamento seletivo ou da manipulação genética e quando uma melhoria desejável é atingida, uma quantidade comercial é desenvolvida através do plantio e da colheita de sementes ao longo de várias gerações. Para acelerar o processo de melhoria de plantas, amostras estatísticas são coletadas e testadas para melhorar sementes da população que herdou ou que exibe a característica desejada. Entretanto, esta amostragem estatística permite necessariamente que algumas sementes sem a característica desejada permaneçam na população e ainda pode excluir inadvertidamente algumas sementes com a característica desejável da população desejada. Nem todas as sementes herdam ou exibem as características desejadas e assim estas sementes ainda precisam ser separadas da população.

Foram descritos os aparelhos e os métodos para a amostragem de sementes não-destrutiva de alta circulação que superariam os obstáculos de amostras estatísticas permitindo a análise de sementes individuais. Por exemplo, o Pedido de Patente U.S. No de Série 11/213.430 (depositado em 26 de agosto de 2005); o Pedido de Patente U.S. No de Série 11/213.431 (depositado em 26 de agosto de 2005); o Pedido de Patente U.S. No de Série 11/213.432 (depositado em 26 de agosto de 2005); o Pedido de Patente U.S. N2 de Série 11/213.434 (depositado em 26 de agosto de 2005); e o Pedido de Patente U.S. N2 de Série 11/213.435 (depositado em 26 de agosto de 2005), que são incorporados aqui como referência em sua totalidade, descrevem aparelhos e sistemas para a amostragem automatizada de se- '5 mentes assim como métodos de amostragem, testagem e agrupamento de sementes.

A presente invenção dedica-se às necessidades na técnica para métodos de cruzamento melhorados utilizando sistemas de amostragem de sementes não-destrutivos de alta circulação.

Sumário da Invenção

A presente descrição refere-se a sistemas e métodos para facili-tar atividades de melhoria de germoplasmas através do uso de amostragem de sementes não-destrutiva de alta circulação. Com a amostragem não- destrutiva automatizada, é possível testar sementes individuais em uma po- 15 pulação e selecionar apenas as sementes que possuem uma ou mais características desejadas. Isto permite métodos novos e mais eficientes para a melhoria e manejo de germoplasmas, que levam a populações com cultivo melhorado.

Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método 20 não-destrutivo de alta circulação para a análise de sementes individuais em uma população de sementes. O método compreende a remoção de uma amostra de um grande número de sementes na população enquanto preserva a viabilidade de germinação da semente e a análise da amostra em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de 25 pelo menos um traço característico genético ou químico.

Em uma modalidade adicional, a presente descrição fornece um método de alta circulação para a análise de uma população de sementes haplóides. O método compreende a remoção de uma amostra de um grande número de sementes em uma população de sementes haplóides enquanto 30 preserva a viabilidade de germinação da semente e a análise das amostras em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico genético ou químico.

Ainda em uma modalidade adicional, a presente descrição for-nece um método de alta circulação para o agrupamento de uma população de sementes duplo haplóides. O método compreende o fornecimento de uma população de sementes que compreende sementes haplóides e a sele-ção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelo menos uma ca-racterística preferida da população de sementes. As sementes duplo haplóides são então produzidas partindo das sementes selecionadas e uma amostra é removida de cada semente duplo haplóide enquanto preserva a viabilidade de germinação das sementes. As amostras são analisadas em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico genético ou químico. Com base nos resultados da análise, uma ou mais sementes duplo haplóides individuais são selecionadas e plantas ou tecido vegetal é cultivado partindo da semente duplo haplóide selecionada.

Nas várias modalidades da presente invenção, as amostras po-dem ser analisadas em relação a uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico químico. Os exemplos de tais características podem incluir proteínas, óleos, carboidratos, ácidos graxos, aminoáci- dos, biopolímeros, agentes farmacêuticos, amido, amido fermentável, compostos secundários e metabolites

Em outras várias modalidades da presente invenção, as amos-tras podem ser analisadas em relação a uma ou mais características indica-tivas de pelo menos um traço característico genético. Os exemplos de tais características podem incluir um marcador genético, um polimorfismo de um único nucleotídeo, uma repetição de seqüência simples, um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, um haplotipo, SN Ps marcados, ale- los de um marcador genético, um gene, uma seqüência derivada de DNA, uma seqüência derivada de RNA, um promotor, uma região não-traduzida a 5’ de um gene, uma região não-traduzida a 3’ de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, dsmRNA, um perfil de transcrição e um padrão de metilação.

Áreas adicionais de aplicabilidade dos presentes ensinamentos se tornarão evidentes partindo da descrição fornecida aqui. Deve ser entendido que a descrição e os exemplos específicos são pretendidos apenas com a finalidade de ilustração e não é pretendido que limitem o âmbito dos presentes ensinamentos.

Breve Descrição das Figuras

As figuras descritas aqui têm apenas finalidade de ilustração e não é pretendido que limitem o âmbito da presente descrição de forma al-guma.

A figurai é um alelograma que representa amostras de tecido de 10 endosperma de milho que sofreram PCR para a detecção de um SNP parti-cular como descrito no Exemplo 3.

A figura2 é uma ilustração gráfica da eficiência da pré-seleção sobre o controle da freqüência de haplotipos favoráveis como descrito no Exemplo 6.

Descrição Detalhada

A descrição a seguir tem natureza meramente de exemplo e não é pretendido que limite a presente descrição, a aplicação ou os usos.

A presente invenção fornece novos métodos para facilitar as atividades de melhoria de germoplasma através do uso de amostragem de 20 sementes não-destrutiva de alta circulação. Os métodos são úteis na análise de sementes para identificar e selecionar sementes que compreendem uma ou mais características, marcadores e genótipos desejados. Em um aspecto da invenção, os métodos analíticos permitem que sementes individuais que estão presentes em uma batelada ou uma população em massa de semen- tes sejam analisadas de forma que as características químicas e/ou genéticas das sementes individuais possam ser determinadas.

As amostras preparadas através da presente invenção podem ser utilizadas para a determinação de uma ampla variedade de traços carac-terísticos físicos, morfológicos, químicos e/ou genéticos. Geralmente, tais 30 traços característicos são determinados através da análise das amostras em relação a uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico genético ou químico. Os exemplos não-limitantes de caracte rísticas indicativas de traços característicos químicos incluem proteínas, ó- leos, carboidratos, ácidos graxos, aminoácidos, biopolímeros, agentes farmacêuticos, amido, amido fermentável, compostos secundários e metabolites. Conseqüentemente, os exemplos não-limitantes de traços característicos químicos incluem o teor de aminoácidos, o teor de proteínas, o teor de amido, o rendimento de fermentação, o rendimento de energia, o teor de óleos, a determinação de perfis de proteína, a determinação de perfis de ácidos graxos, a determinação de perfis de metabólitos etc.

Os exemplos não-limitantes de características indicativas de traços característicos genéticos podem incluir, por exemplo, marcadores genéticos, polimorfismos de um único nucleotídeo, repetições de séqüência simples, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição, haplotipos, SNPs marcados, alelos de marcadores genéticos, genes, seqüências derivadas de DNA, seqüências derivadas de RNA, promotores, regiões não- traduzidas a 5’ de genes, regiões não-traduzidas a 3’ de genes, microRNA, siRNA, loci de características quantitativas (QTL), marcadores satélite, transgenes, mRNA, dsmRNA, perfis de transcrição e padrões de metilação.

Em uma modalidade, a amostragem de tecido de endosperma possibilita a determinação de freqüências de alelos, sendo possível assim inferir a fase de ligação parental para um marcador particular. Ainda, a comparação de dados de freqüência de alelos entre dois ou mais conjuntos de germoplasma fornece discernimento aos alvos de seleção, aumentando assim os alelos em relação à freqüência em associação com uma alteração na distribuição de uma ou mais características que são presumidas como estando ligadas à dita ou às ditas características de interesse. Ainda, a avaliação dos dados de freqüência relativa de alelos entre linhagens pode contribuir para a construção de mapas de ligação genética.

Em uma outra modalidade, os métodos da presente invenção utilizam amostragem de sementes não-destrutiva de alta circulação com tecnologias de duplo haplóides para contribuir com as atividades de melhoria de germoplasma incluindo a economia de programas de duplo haplóides atra- ves da seleção apenas da semente preferida para duplicação, a análise de alta circulação de material haplóide e duplo haplóide em relação a características tanto genotípicas quanto químicas, a integração e a avaliação de características e o cruzamento auxiliado por marcadores.

Os métodos e os dispositivos da presente invenção podem ser '5 utilizados em um programa de cruzamento para selecionar plantas ou se-mentes que possuem uma característica genética ou química desejada, em que uma característica genética desejada compreende um genótipo, um ha- plotipo, um alelo, uma seqüência, um perfil de transcrição e um padrão de metilação. Os métodos da presente invenção podem ser utilizados em com- 10 binação com qualquer metodologia de cruzamento e podem ser utilizados para selecionar uma única geração ou para selecionar várias gerações. A escolha do método de cruzamento depende do modo de reprodução da planta, da capacidade de herdar a(s) característica(s) que será(ão) melhora- da(s) e do tipo de cultivar utilizado comercialmente (por exemplo, cultivar 15 híbrido F1( cultivar de linhagem pura etc). As abordagens não-limitantes selecionadas para o cruzamento das plantas da presente invenção são apresentadas abaixo. É ainda entendido que quaisquer cultivares comerciais e não-comerciais podem ser utilizados em um programa de cruzamento. Os fatores que incluem, por exemplo, sem limitação, vigor na emergência, tole- 20 rância ao estresse, resistência a doenças, ramificação, florescimento, produção de sementes, tamanho de sementes, densidade de sementes, capacidade de ficar em pé e capacidade de separação da casca irão geralmente determinar a escolha,

Em uma modalidade particular, os métodos da presente inven- 25 ção são utilizados para determinar as características genéticas das sementes em um programa de cruzamento auxiliado por marcadores. Tais métodos permitem programas de cruzamento auxiliados por marcadores melhorados em que a amostragem de sementes direta não-destrutiva pode ser realizada enquanto é mantida a identidade de sementes individuais partindo do apare- 30 lho de amostragem de sementes para o campo. Como um resultado, o programa de cruzamento auxiliado por marcadores resulta em uma plataforma de “alta circulação” e mais eficiente em que uma população de sementes que possui uma característica, um marcador ou um genótipo desejado pode ser eficientemente agrupada em um período de tempo mais curto, com menos recursos do campo e de trabalho necessárias. Tais vantagens serão mais completamente descritas abaixo.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para analisar sementes individuais dentro de uma população de sementes que possui diferenças genéticas. O método compreende a remoção de uma amostra que compreende células com ácidos nucléicos provenientes de se-mentes na população sem afetar a viabilidade de germinação das sementes; a análise dos ácidos nucléicos extraídos da amostra em relação à presença ou a ausência de pelo menos um marcador genético; a seleção de sementes da população baseada nos resultados das análises de ácidos nucléicos; e o cultivo de plantas partindo da semente selecionada.

Como descrito anteriormente, os sistemas e os métodos de a- mostragem desta invenção protegem a viabilidade de germinação das se-mentes de forma a serem não-destrutivos. A viabilidade de germinação significa que um número predominante de sementes que tiveram amostras retiradas, (isto é, mais de 50% das sementes que tiveram amostras retiradas) permanece viável após a amostragem. Em uma modalidade particular, pelo menos aproximadamente 75% das sementes que tiveram amostras retiradas e em algumas modalidades pelo menos aproximadamente 85% das sementes que tiveram amostras retiradas permanecem viáveis. Deve ser observado que taxas menores de viabilidade de germinação podem ser toleradas sob certas circunstâncias ou para certas aplicações, por exemplo, uma vez que os custos de genótipo diminuem com o tempo porque um número maior de sementes poderia ter amostras retiradas com o mesmo custo de genótipo. Também deve ser observado que a amostragem não precisa de forma alguma ter qualquer efeito sobre a viabilidade.

Em uma outra modalidade, a viabilidade de germinação é mantida durante pelo menos aproximadamente seis meses após a amostragem para garantir que a semente que teve amostras retiradas será viável até que chegue ao campo para o plantio. Em uma modalidade particular, os métodos da presente invenção compreendem ainda o tratamento das sementes que tiveram amostras retiradas para manter a viabilidade de germinação. Tal tra-tamento pode incluir geralmente quaisquer meios conhecidos na técnica para a proteção de uma semente das condições ambientais durante o armaze- '5 namento e o transporte. Por exemplo, em uma modalidade, as sementes que tiveram amostras retiradas podem ser tratadas com um polímero e/ou um fungicida para proteger a semente que teve amostras retiradas durante o armazenamento ou o transporte para o campo antes do plantio.

Em uma modalidade, as amostras da presente invenção são uti- 10 lizadas em um método não-destrutivo de alta circulação para a análise de sementes individuais em uma população de sementes. O método compreende a remoção de uma amostra da semente enquanto preserva a viabilidade de germinação da semente; e a análise da amostra em relação à presença ou à ausência de uma ou mais características indicativas de uma caracte- 15 rística genética ou química. O método pode compreender ainda a seleção de sementes da população com base nos resultados das análises; e o cultivo de plantas ou de tecido vegetal partindo da semente selecionada.

O DNA pode ser extraído da amostra utilizando quaisquer métodos de extração de DNA conhecidos pelos versados na técnica que fornece- rão rendimento de DNA, qualidade de DNA, resposta de PCR e resposta de métodos de seqüenciamento suficientes. Um exemplo não-limitante de métodos de extração de DNA é a extração baseada em SDS com centrifugação. Em adição, o DNA extraído pode ser amplificado utilizando qualquer método de amplificação conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, 25 um método de amplificação adequado é a GenomiPhi® DNA amplification prep da Amersham Biosciences.

Ainda, o RNA pode ser extraído da amostra utilizando quaisquer métodos de extração de RNA conhecidos pelos versados na técnica que fornecerão rendimento de RNA, qualidade de RNA, resposta de PCR e res- 30 posta de métodos de seqüenciamento suficientes. Um exemplo não-limitante de métodos de extração de RNA adequados é a extração baseada em SDS com centrifugação considerado reagentes e suprimentos isentos de RNase.

Em adição, o RNA extraído pode ser amplificado após a extração utilizando qualquer método de amplificação conhecido pelos versados na técnica. Por exemplo, um método de amplificação adequado é o Full Spectrum™ RNA Amplification da System Biosciences.

Os ácidos nucléicos extraídos são analisados em relação à pre-sença ou à ausência de um polimorfismo genético adequado. Uma ampla variedade de marcadores genéticos para a análise de polimorfismos genéti-cos está disponível e é conhecida pelos versados na técnica. Como utilizado aqui, os marcadores genéticos incluem, mas não estão limitados a repetições de seqüência simples (SSRs), polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs), inserções ou deleções (Indels), polimorfismos de uma única característica (SFPs, por exemplo, como descrito em Borevitz e outros 2003 Gen. Res. 13:513-523) ou perfis de transcrição e seqüências de ácidos nucléicos. Uma análise de ácido nucléico em relação à presença ou à ausência do marcador genético pode ser utilizada para a seleção de sementes em uma população para cruzamento. A análise pode ser utilizada para selecionar genes, QTL, alelos ou regiões genômicas (haplotipos) que compreendem ou estão ligadas a um marcador genético. Aqui, os métodos de análise são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a métodos de detecção baseados na PCR (por exemplo, ensaios de TaqMan), métodos de microarranjo e métodos de seqüenciamento de ácidos nucléicos. Os genes, os alelos, os QTL ou os haplotipos que serão selecionados podem ser identificados utilizando técnicas mais novas de biologia molecular com modificações de estratégias de cruzamento clássicas.

Qualquer semente pode ser utilizada em um método ou um dis-positivo da presente invenção. Em uma modalidade particular, a semente é selecionada do grupo que consiste em semente de alfafa, semente de maçã, semente de banana, semente de cevada, semente de feijão, semente de brócolis, semente de mamona, semente de fruta cítrica, semente de trevo, semente de coco, semente de café, semente de milho, semente de algodão, semente de pepino, semente de Pseudotsuga, semente de eucalipto, semente de Pinus taeda, semente de linhaça, semente de melão, semente de aveia, semente de oliva, semente de palma, semente de ervilha, semente de amendoim, semente de pimenta, semente de álamo, semente de Pinus radi- ata, semente de colza, semente de arroz, semente de centeio, semente de sorgo, semente de pinheiro do sul, semente de soja, semente de morango, '5 semente de beterraba, semente de cana de açúcar, semente de girassol, semente de Liquidambar, semente de chá, semente de tabaco, semente de tomate, semente de turfa, semente de trigo e semente de Arabidopsis thalia- na. Ainda, em uma modalidade mais particular, a semente é uma semente de milho ou uma semente de soja.

Em uma outra modalidade, as plantas de cultivo analisadas pe los métodos descritos aqui incluem plantas de cultivo de forragem, plantas de cultivo de semente oleosa, plantas de cultivo de grãos, plantas de cultivo de frutos, plantas ornamentais, plantas de cultivo vegetais, plantas de cultivo de fibras, plantas de cultivo de tempero, plantas de cultivo de noz, plantas de cultivo de turfa, plantas de cultivo de açúcar, plantas de cultivo de bebidas, plantas de cultivo de tubérculos, plantas de cultivo de raiz e plantas de cultivo de floresta.

Em uma modalidade, a semente é selecionada com base na presença ou ausência de uma ou mais características que estão ligadas ge- neticamente a um QTL. Os exemplos de QTLs que são freqüentemente de interesse incluem, mas não estão limitados a tolerância a herbicida, resis-tência à doenças, resistência a insetos ou a pragas, metabolismo alterado de ácidos graxos, proteínas ou carboidratos, maior rendimento de grãos, maior teor de óleo, maior teor nutricional, maiores taxas de crescimento, maior to- lerância a estresse, maturidade preferida, propriedades organolépticas me-lhoradas, características morfológicas alteradas, outras características agronômicas, características para usos industriais ou características para aumentar o interesse do consumidor ou uma combinação de características como um índice de várias características. Alternativamente, a semente pode ser selecionada com base na presença ou na ausência de uma ou mais caracte-rísticas que estão geralmente ligadas a um haplotipo associado com um Q- TL. Os exemplos de tal QTL podem novamente incluir, sem limitação, tole- rância a herbicida, resistência a doenças, resistência a insetos ou pragas, metabolismo alterado de ácidos graxos, proteínas ou carboidrato alterado, maior rendimento de grãos, maior teor de óleo, maior teor nutricional, maiores taxas de crescimento, maior tolerância a estresse, maturidade preferida, propriedades organolépticas melhoradas, características morfológicas alteradas, outras características agronômicas, características para usos industriais ou características para aumentar o interesse do consumidor ou uma combinação de características como um índice de várias características.

A seleção de uma população de cruzamento poderia ser iniciada tão logo quanto o nível de cruzamento F2, se parentais intracruzados homo- zigotos forem utilizados no cruzamento inicial. Uma geração F< também poderia ter amostras retiradas e ser levada à etapa seguinte se um ou mais dos parentais do cruzamento forem heterozigotos em relação aos alelos ou aos marcadores de interesse. O agricultor pode analisar uma população F2 para recuperar o genótipo marcador de cada indivíduo na população. Os tamanhos iniciais da população, limitados apenas pelo número de sementes disponíveis para análise, podem ser ajustados para satisfazer a probabilidade desejada de identificar de forma bem sucedida o número desejado de indivíduos. Vide Sedcole, J.R. “Number of plants necessary to recover a trait”. Crop Sei. 17:667-68 (1977). Conseqüentemente, a probabilidade de encontrar o genótipo desejado, o tamanho de população inicial e o tamanho de população resultante alvo pode ser modificada para várias metodologias de cruzamento e nível de intracruzamentos da população que teve amostras retiradas.

As sementes selecionadas podem ser agrupadas ou mantidas separadas dependendo da metodologia de cruzamento e do alvo. Por exemplo, quando um agricultor está analisando uma população F2 em relação à resistência a doenças, todos os indivíduos com o genótipo desejado podem ser agrupados e plantados na sementeira de cultivo. De forma inversa, se vários QTL com efeitos variáveis em relação a uma característica tal como o rendimento de grãos estiverem sendo selecionados de uma certa população, o agricultor pode manter a identidade individual preservada, levando para o capo para diferenciar os indivíduos com várias combinações do QTL alvo.

Vários métodos de preservação da identidade de uma única se-mente podem ser utilizados enquanto a semente é transferida da localização de amostragem para o campo. Os métodos incluem, mas não estão limita- '5 dos à transferência de indivíduos selecionados para "seed tape", "cassete tray" ou "indexing tray", transplantando com vasos de turfa e plantando manualmente partindo de embalagens individuais de sementes. Vários ciclos de seleção podem ser utilizados dependendo dos alvos de cruzamento e da complexidade genética.

As vantagens de utilizar os métodos desta invenção incluem, sem limitação, a redução de trabalho e de recursos do campo requeridos por população ou linhagem de cruzamento, maior capacidade de avaliar um número maior de populações de cruzamento por unidade de campo e maior capacidade de analisar populações de cruzamento em relação a caracterís- ticas desejadas antes do plantio. Os recursos do campo por população são reduzidos limitando o espaço no campo requerido para levar adiante os ge- nótipos desejados. Por exemplo, uma população de 1.000 indivíduos pode ser plantada a 25 sementes por fileira consumindo um total de 40 fileiras no campo. Utilizando a amostragem de tecido convencional, todas as 1.000 20 plantas seriam marcadas e teriam amostras retiradas manualmente através da atribuição de escores ao tecido foliar. Os resultados dos marcadores moleculares seriam necessários antes da polinização e apenas as plantas contendo a composição genética desejada seriam polinizadas. Assim, se fosse determinado que 50 sementes continham a composição genética desejada, 25 a metodologia de cruzamento convencional teria requerido o plantio de 1000 plantas para manter as 50 sementes desejadas. Em contraste, os métodos desta invenção permitem que o agricultor analise as 1.000 sementes no laboratório e que selecione as 50 sementes desejadas antes do plantio. Os 50 indivíduos podem então ser plantados no campo, consumindo duas fileiras de 25 sementes. Adicionalmente, os métodos desta invenção não requerem marcação ou amostragem no campo, reduzindo significativamente assim os recursos de trabalho manual requeridos.

Em adição à redução do número de fileiras no campo por popu-lação, os métodos desta invenção podem ainda aumentar o número de po-pulações que o agricultor pode avaliar em uma certa sementeira de cruza-mento. Utilizando o exemplo anterior em que 50 sementes de cada popula-ção de 1000 continham a composição genética desejada, um agricultor aplicando os métodos desta invenção poderia avaliar 20 populações de 50 sementes cada utilizando a mesma área do campo consumida por uma única população utilizando técnicas de amostragem de tecidos no campo convencional. Mesmo se as populações forem selecionadas para um único alelo, utilizando uma proporção de segregação esperada de 1:2:1 para uma população F2, O agricultor poderia avaliar 4 populações na mesma área do campo como uma única população com tecido que teve amostras retiradas no campo.

Uma vantagem potencial adicional para os métodos da presente invenção é a mitigação de riscos associados com as plantas que crescem em certas geografias em que plantas podem crescer fracamente ou passar por condições ambientais pobres ou podem ainda ser destruídas durante tempestades. Por exemplo, as sementes com o “melhor” genótipo ou com-posição de marcação poderiam ser plantadas na geografia 1 e as sementes com o genótipo “melhor seguinte” poderiam ser plantadas na geografia 2. Neste caso, a geografia 2 seria uma reserva no caso de qualquer problema ocorrer com as plantas cultivadas na geografia 1. Isto é muito difícil de fazer com o método tradicional de tirar amostras de tecido de plantas germinadas para genotipagem, porque estas plantas necessitariam então ser arrancadas pela raiz e transplantadas para a segunda geografia. A utilização dos métodos desta invenção evita o problema do transplante e ainda simplifica a logística do programa de cultivo.

Os métodos da invenção podem ainda ser utilizados em um programa de cruzamento para a introgressão uma característica em uma planta. Tais métodos compreendem a remoção de uma amostra que compreende células com ácidos nucléicos de sementes em uma população, a análise dos ácidos nucléicos extraídos de cada semente em relação à presença ou à ausência de pelo menos um marcador genético, a seleção de sementes da população com base nos resultados da análise de ácidos nucléicos; o cultivo de uma planta fértil partindo da semente; e a utilização da planta fértil como um parental do sexo feminino ou um parental do sexo masculino em um cru- '5 zamento com uma outra planta.

Os exemplos de análises genéticas para selecionar sementes em relação à integração de características incluem, sem limitação, a identificação de freqüências alélicas parentais de alta recorrência, o rastreamento de transgenes de interesse ou a verificação em relação à ausência de transit) genes indesejados, a seleção de semente de teste híbrida, a seleção de semente expressando um gene de interesse, a seleção de semente expressando um fenótipo que pode ser herdado, a identificação de semente com loci genéticos selecionados e o teste de zigosidade.

A identificação de freqüências alélicas de pares com alta recor- 15 rência através dos métodos da presente invenção novamente permite que um número reduzido de fileiras por população e um maior número de população ou linhagens intracruzadas, sejam plantados em uma certa unidade do campo. Assim, os métodos da presente invenção podem também reduzir eficientemente os recursos requeridos para completar a conversão de linha- 20 gens intracruzadas.

Os métodos da presente invenção fornecem ainda garantia de qualidade (QA) e controle de qualidade (QC) assegurando que transgenes regulados ou indesejados, traços característicos genéticos indesejados ou fenótipos herdados indesejados sejam identificados e descartados antes do 25 plantio. Este pedido de patente em uma capacidade de QA poderia eliminar eficientemente infrações de liberação não intencionais. Uma extensão adicional do método é verificar a presença de agentes infecciosos e remover a semente contaminada antes do envio.

Os métodos da presente invenção podem ainda ser aplicados 30 para identificar semente híbrida para testar um transgene. Por exemplo, em uma conversão de uma linhagem intracruzada no estágio BCnF-i, um agricultor poderia criar eficientemente um lote de sementes híbridas (excluindo a seleção de gametas) que são 50% hemizogotas em relação à característica de interesse e 50% homozigotas para a ausência da característica com a finalidade de gerar semente híbrida para teste. O agricultor poderia então analisar todas as sementes Fi produzidas no cruzamento de teste e identificar e selecionar as sementes que são hemizogotas. Tal método é vantajoso pelo fato de que inferências provenientes de testes de híbridos representariam uma genética híbrida comercial em relação à zigosidade da característica.

Outras aplicações dos métodos desta invenção para a identificação, o rastreamento e o acúmulo de características de interesse carregam as mesmas vantagens identificadas anteriormente em relação aos recursos do campo e de trabalho requeridos. Geralmente, os programas de conversão transgênica são executados em localizações em várias estações que carregam uma estrutura de custos de terra e de controle muito mais altos. Como tal, o impacto de reduzir as necessidades de fileiras por população ou de aumentar o número de populações dentro de uma certa unidade de campo é significativamente mais drástico sobre aplicações com base nos custos versus temperadas.

Os métodos desta invenção podem ser utilizados para sementes de plantas com dois ou mais transgenes, em que o acúmulo ou o agrupa-mento de regiões transgênicas em plantas ou linhagens é conseguido atra-vés da adição de transgenes através da transformação ou do cruzamento de plantas ou linhagens parentais contendo regiões transgênicas diferentes ou qualquer combinação dos mesmos. As análises podem ser realizadas para selecionar sementes individuais com base na presença de uma ou mais características associadas com pelo menos um transgene. Tais características incluem, mas não estão limitadas a um transgene per se, um marcador genético ligado a um transgene, um mRNA expresso partindo de um transgene e um produto de proteína de um transgene.

Ainda adicionalmente, os métodos desta invenção podem ser utilizados para aumentar a eficiência do programa de haploidia duplicada através da seleção de genótipos desejados no estágio haplóide e da identifi- cação do nível de ploidia para eliminar sementes não-haplóides de serem processadas e seguirem a diante para o campo. Ambas as aplicações resultam novamente na redução de recursos do campo por população e na capacidade de avaliar um número maior de populações dentro de uma certa uni- '5 dade do campo.

As plantas duplo haplóides (DH) fornecem uma ferramenta inestimável para os cultivadores de plantas, particularmente para gerar linhagens retrocruzadas. Uma grande quantidade de tempo é poupada uma vez que as linhagens homozigotas são essencialmente geradas instantaneamente, anu- 10 lando a necessidade de intracruzamentos convencionais multigerações.

Em particular, devido ao fato de que as plantas DH são inteira-mente homozigotas, são muito susceptíveis a estudos genéticos quantitativos. Tanto a variância aditiva quanto as variâncias aditivas x genéticas aditivas podem ser estimadas partindo das populações DH. Outras aplicações 15 incluem a identificação de epistasia e de efeitos de ligação. Para os agricul tores, as populações DH foram particularmente úteis no mapeamento de QTL, nas conversões citoplasmáticas e na introgressão de características. Além disso, há valor no teste e na avaliação de linhagens homozigotas para programas de cruzamento de plantas. Toda a variância genética fica entre a 20 progénie em um cruzamento para cultivo, que aumenta o ganho da seleção.

Entretanto, é bem sabido na técnica que o processo de produ-ção de DH é ineficiente e pode ser bastante trabalhoso. Embora plantas duplo haplóides possam ocorrer espontaneamente na natureza, isto é extremamente raro. A maior parte das aplicações de pesquisa e de cruzamento 25 se baseia em métodos artificiais de produção de DH. A etapa inicial envolve a haploidização da planta que resulta na produção de uma população que compreende semente haplóide. As linhagens não-homozigotas são cruzadas com um parental indutor, resultando na produção de semente haplóide. A semente que possui um embrião haplóide, mas endosperma triplóide normal, 30 segue adiante para o segundo estágio. Ou seja, a semente e as plantas haplóides são qualquer planta com um embrião haplóide, independente do nível de ploidia do endosperma.

Após a seleção de sementes haplóides da população, as semen-tes selecionadas sofrem duplicação cromossômica para produzir sementes duplo haplóides. Uma duplicação cromossômica espontânea em uma linhagem de células levará à produção de gametas normais ou à produção de gametas não reduzidos partindo de linhagens de células haplóides. A aplicação de um composto químico, tal como colchicina, pode ser utilizada para aumentar a taxa de diploidização. A colchicina se liga à tubulina e previne sua polimerização em microtúbulos, interrompendo assim a mitose na metá- fase e pode ser utilizada para aumentar a taxa de diploidização, isto é, a duplicação do número de cromossomos. Estas plantas quiméricas são autopo- linizadas para produzir semente diplóide (duplo haplóide). Esta semente DH é cultivada e subseqüentemente avaliada e utilizada na produção de cruzamento de teste híbrido.

Entretanto, os processos para a produção de semente DH so-frem geralmente de baixa eficiência muito embora os métodos tenham sido desenvolvidos em uma tentativa de aumentar a freqüência de produção de DH, incluindo o tratamento com colchicinas. Os resultados notáveis incluem a baixa produção de semente haplóide, a viabilidade reduzida de gametas resultando na autopolinização diminuída para a geração de plantas DH e o rendimento inadequado de sementes DH para aplicações de cultivo.

Os métodos da presente invenção representam um avanço nas aplicações de cruzamento facilitando o potencial para seleção no estágio de semente haplóide assim como diplóide. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção fornece a análise de alta circulação de uma população de sementes haplóides. O método compreende geralmente a remoção não-destrutiva de uma amostra de um grande número de sementes na população e a análise da amostra em relação à presença de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço característico genético ou químico como descrito aqui.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece o acúmulo de alta circulação de uma população de sementes duplo haplóides. O método compreende a seleção de uma ou mais sementes individuais que exibem pelo menos uma característica preferida partindo de uma população de sementes haplóides e a produção de uma população de sementes duplo haplóides. Cada semente duplo haplóide tem então amostras retiradas de forma não- destrutiva e as amostras são analisadas em relação à presença ou à ausên- '5 cia de uma ou mais características indicativas de pelo menos um traço ca-racterístico genético ou químico. Com base nos resultados da análise, uma ou mais sementes duplo haplóides individuais são selecionadas e as plantas ou o tecido vegetal é cultivado partindo das sementes duplo haplóides selecionadas.

Em várias modalidades, os métodos da invenção incluem a aná lise da semente em relação a uma ou mais características, tais como marca-dores genéticos, para determinar se a semente está em um estado haplóide ou diplóide. A presente invenção fornece ainda métodos para analisar a semente haplóide ou duplo haplóide em relação a uma ou mais características, 15 tais como transgenes ou marcadores ligados a ou diagnósticos de transge- nes, em relação a características relacionadas ao desempenho do evento, avaliação do evento e integração da característica. Ainda, a presente invenção fornece um método para analisar a semente haplóide com a finalidade de selecionar classes genotípicas e fenotípicas preferidas para sofrerem du- 20 plicação.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma base para a determinação da fase de ligação. Utilizando o tecido de endosperma da semente derivada de uma planta diplóide, os haplotipos marcadores parentais podem ser determinados utilizando um sistema de genotipa- 25 gem que possibilita a detecção de freqüências alélicas diferentes em amostras de DNA. Uma vez que o tecido é triplóide, com duas cópias derivadas do gameta feminino, a fase de ligação da linhagem parental pode ser investigada através da dissecção de genótipos de progénie heterozigotos (vide a figurai). A amostra de DNA do tecido de endosperma permite uma determi- 30 nação do nível de ploidia do marcador genético. Um nível de ploidia diplóide no marcador genético indica herança materna e um nível de ploidia haplóide no marcador genético indica herança paterna.

Ainda, dados de freqüências alélicas diferenciais também podem ser utilizados para inferir o mapa de ligação genética, mas, ao contrário dos métodos que requerem material haplóide (Gasbarra e outros 2006 Genetics 172:1325-1335), utilizando a classificação de freqüência alélica descrita anteriormente. A determinação do mapa de ligação genética possui utilidade tremenda no contexto da caracterização de haplotipo, mapeamentos das associações de marcador (ou haplotipo) - característica. Este método é particularmente vigoroso em uma base de sementes isoladas vs. agrupadas e é assim bem adequado para a presente invenção.

Em uma modalidade particular, a invenção fornece ainda um ensaio para prever a zigosidade do embrião para um gene de interesse particular (GOI). O ensaio prevê a zigosidade do embrião com base na proporção do número de cópias relativo de um GOI e de um gene de controle interno (IC) por célula ou por genoma. Geralmente, este ensaio utiliza um gene IC que tem zigosidade conhecida, por exemplo, homozigoto no lócus (duas cópias de IC por célula diplóide), para normalizar a medida do GOI. A proporção do número de cópias relativo do IC em relação ao GOI prevê o número de cópias de GOI na célula. Em uma célula homozigota, para qualquer gene fornecido (ou seqüência genética única), o número de cópias do gene é igual ao nível de ploidia da célula uma vez que a seqüência está presente no mesmo lócus em todos os cromossomos homólogos. Quando uma célula for heterozigota para um gene particular (ou hemizigota no caso de um transgene), o número de cópias do gene será menor que o nível de ploidia da célula. Se o GOI não for detectado, a célula é nula em relação ao lócus, como pode acontecer para um segregante negativo de um evento transgênico ou em uma população que sofreu mutagênese. A zigosidade de uma célula em qualquer lócus pode ser assim determinada através do número de cópias do gene na célula.

Em uma outra modalidade particular, a invenção fornece um ensaio para prever a zigosidade do embrião de milho. Na semente de milho, o tecido do endosperma é triplóide, enquanto que o tecido do embrião é diplóide. O número de cópias do endosperma reflete a zigosidade do embrião: um endosperma homozigoto (positivo ou negativo) acompanha um embrião ho- mozigoto, um endosperma heterozigoto (seja um número de cópias de GOI de 1 ou 2) reflete um embrião heterozigoto (número de cópias de GOI de 1). O endosperma que é homozigoto em relação ao IC conterá três cópias de '5 IC. O número de cópias de GOI do endosperma pode variar de 0 (embrião negativo homozigoto) até 3 (embrião positivo homozigoto); e o número de cópias de GOI do endosperma de 1 ou 2 é observado na semente em que o embrião é heterozigoto para o GOI (ou hemizigoto para o GOI se o GOI for um transgene). O número de cópias de GOI do endosperma (que pode vari- 10 ar de 0 até 3 cópias) pode ser determinado partindo da proporção do número de cópias de IC do endosperma em relação ao número de cópias de GOI do endosperma (que pode variar de 0/3 até to 3/3, ou seja, de 0 até 1), que pode então ser utilizado para prever a zigosidade do embrião.

Os números de cópias do GOI ou do IC podem ser determinados através de qualquer técnica de ensaio conveniente para a quantificação dos números de cópias, como é conhecido na técnica. Os exemplos de ensaios adequados incluem, mas não estão limitados a ensaios de PCR em Tempo Real (TaqMan®) (Applied Biosystems, Foster City, CA) e Invader® (Third Wave Technologies, Madison, Wl). Preferencialmente, tais ensaios são desenvolvi- 20 dos de tal maneira que a eficiência de amplificação de ambas as seqüências de IC e de GOI é igual ou muito similar. Por exemplo, em um ensaio de PCR em Tempo Real com TaqMan®, o sinal proveniente de um GOI em uma única cópia (a célula fonte é determinada como sendo heterozigota para o GOI) será detectado um ciclo de amplificação depois que o sinal proveniente de um IC em duas cópias, porque a quantidade do GOI é a metade daquela do IC. Para a mesma amostra heterozigota, um ensaio Invader® mediria uma proporção de GOI/IC de aproximadamente 1:2 ou 0,5. Para uma amostra que é homozigota tanto para GOI quanto para IC, o sinal de GOI seria detectado ao mesmo tempo que o sinal de IC (TaqMan®) e o ensaio Invader mediria uma proporção de GOI/IC de aproximadamente 2:2 ou 1.

Estas diretrizes se aplicam a qualquer célula poliplóide ou às células haplóides (tais como células de pólen), uma vez que o número de cópias do GOI ou do IC permanece proporcional ao número de cópias do genoma (ou nível de ploidia) da célula. Assim, estes ensaios de zigosidade podem ser realizados em tecidos triplóides tal como o endosperma do milho. Além disso, o número de cópias para um GOI pode ser medido além de 2 cópias ou em valores numericamente diferentes que a ploidia da célula. O método é ainda apropriado para a detecção de GOI em poliplóides, em alguns eventos transgênicos com > 2 cópias do transgene inserido, após a replicação do GOI por transposição, quando o GOI existe em cromossomos ou plasm ídeos que se replicam de forma autônoma e outras situações.

No cruzamento de plantas, é útil determinar a zigosidade em um ou mais loci com a finalidade de avaliar o nível de intracruzamento (ou seja, o grau de fixação gênica), a distorção da segregação (isto é, no germoplas- ma transgênico, o teste de herança materna ou para os loci que afetam a aptidão dos gametas) e o nível de cruzamento externo (isto é, a proporção relativa de homozigosidade e heterozigosidade). Similarmente, a extensão da zigosidade em um ou mais loci pode ser utilizada para estimar a hibridez e se um lote particular de sementes satisfaz um padrão comercial ou regulador para venda como semente híbrida certificada. Em adição, no germo- plasma transgênico, é útil conhecer a ploidia ou o número de cópias, com a finalidade de distinguir eventos de qualidade e para auxiliar as estratégias de integração de características.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma base para aumentar a capacidade de monitorar um ou mais conjuntos de germoplasma em relação a alterações nas freqüências de uma ou mais ca-racterísticas genéticas, em que as ditas características genéticas incluem marcadores, alelos e haplotipos. É conhecida na técnica a metodologia para comparar a freqüência do marcador genético entre populações originadas recentemente e suas linhagens ancestrais com a finalidade de identificar os loci genéticos que estão aumentando em relação à freqüência ao longo do tempo (Patentes U.S. N— 5.437.697 e 5.746.023). Tais loci com freqüências que excedem a freqüência alélica esperada são inferidos como tendo sido submetidos à seleção. Ainda, dado que o critério de seleção predominante nos programas de cruzamento é o rendimento, é esperado que aqueles ale-los que estão aumentando em relação à freqüência possam ser ligados ao rendimento.

Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um '5 método para possibilitar o cruzamento auxiliado pelo haplotipo. Comparando a freqüência dos haplotipos em linhagens de elite emergentes com a freqüência do haplotipo nas linhagens de elite ancestrais (como determinado através da análise do pedigree), é possível a identificação de haplotipos que estão se desviando da freqüência de haplotipo esperada. Ainda, através da 10 avaliação das estimativas do efeito do haplotipo para os ditos haplotipos, é também possível ligar os ditos haplotipos com freqüência crescente com os resultados fenotípicos para um conjunto de características agronômicas. A composição de haplotipo de sementes individuais que tiveram amostras retiradas de um grande número de sementes pode ser determinada utilizan- 15 do marcadores genéticos e as sementes com haplotipos preferidos são sele-cionadas e levadas à etapa seguinte. Assim, decisões de cruzamento mais informadas e o estabelecimento de programas de desenvolvimento de linhagens superiores são possibilitados através dessa tecnologia.

Exemplos

Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos e não- limitàntes desta descrição de forma alguma.

Exemplo 1

Este exemplo descreve um ensaio para prever a zigosidade de embriões de milho utilizando um gene de controle interno (IC) homozigoto no 25 lócus (isto é, duas cópias de IC no embrião diplóide e três cópias de IC no endosperma triplóide). Em uma linhagem intracruzada de um organismo di-plóide (ou com ploidia superior) tal como o milho, o controle interno endógeno é tipicamente homozigoto; os eventos transgênicos em tais organismos na primeira geração (denominada “RO” no milho) são tipicamente hemizigo- 30 tos (ou seja, o transgene está tipicamente presente em apenas um dos dois ou mais cromossomos homólogos). O milho (Zea mays) é um organismo diplóide, assim um evento RO “de uma única cópia” possui uma cópia do

GOI por célula, mas 0,5 cópia por genoma haplóide, um evento RO “de duas cópias” possui duas cópias do GOI por célula, mas 1 cópia por genoma haplóide e assim por diante.

Neste exemplo, a tubulina foi utilizada como o gene IC e o GOI era um transgene codificando a neomicina fosfotransferase II (NPT II), que é utilizada para a seleção por resistência à canamicina. O tecido do endos-perma (triplóide) foi tirado da semente (por amostragem manual ou por ras- pagem de uma semente com um aparelho de amostragem automatizado da presente invenção). A semente que teve uma amostra de endosperma retirada foi germinada e o tecido foliar (diplóide) de plantas germinadas de forma bem sucedida também teve amostras retiradas para análise genética. O tecido foliar se correlaciona diretamente com a zigosidade do embrião e foi assim utilizado para demonstrar que a zigosidade do endosperma geralmente prevê a zigosidade do embrião e para confirmar a classificação de homo- zigosidade do endosperma. O DNA genômico total foi extraído do tecido de endosperma e do tecido foliar e foi analisado quantitativamente utilizando um ensaio Invader® com sondas de oligonucleotídeo específicas para o gene de interesse, NPT II ou para o gene de controle interno, tubulina. A proporção do GOI em relação ao IC foi medida utilizando técnicas de biologia molecular convencionais. Vide a Tabela 1. Um resumo dos resultados de vários experimentos é mostrado na Tabela 2.

Os resultados indicaram que a zigosidade do endosperma ge-ralmente previa a zigosidade do embrião (como indicado pela zigosidade foliar) e era confiável na previsão da homozigosidade para todas as sementes que germinaram. Além disso, a análise de zigosidade do endosperma forneceu algumas previsões homozigotas falso negativas (especialmente quando tecido do endosperma foi obtido com o aparelho de amostragem automatizado). Estes resultados demonstram que para uma célula com um nível de ploidia conhecido, a proporção do número de cópias de um GOI em relação ao de um IC indica a zigosidade de tal célula. Além disso, o ensaio de zigosidade da presente invenção pode prever a zigosidade de um tecido com base na zigosidade de um outro, ou seja, o ensaio pode prever a zigo- sidade do embrião com base na zigosidade do endosperma. TABELA 1

Exemplo 2

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente invenção em um programa para a seleção auxiliada por marcador de sojas em 5 relação ao baixo teor de ácido linolênico.

A soja é a planta de cultivo leguminosa mais valiosa, com muitos usos nutricionais e industriais devido a sua composição química exclusiva. As sementes de soja são uma fonte importante de óleo vegetal, que é utilizado em produtos alimentícios por todo o mundo. O nível relativamente alto (geralmente aproximadamente 8%) de ácido linolênico (18:3) no óleo de soja reduz '5 sua estabilidade e sabor. A hidrogenação do óleo de soja é utilizada para di minuir o nível de ácido linolênico (18:3) e aumentar tanto a estabilidade quanto o sabor dos óleos de soja. Entretanto, a hidrogenação resulta na produção de ácidos graxos trans, que aumentam o risco de doença cardíaca coronaria- na quando consumidos. O desenvolvimento de soja com baixo teor de ácido 10 linolênico tem sido complicado devido à natureza quantitativa da característi ca. Foi observado que as variedades de soja com baixo teor de ácido linolêni-co que foram desenvolvidas têm rendimento baixo, limitando a sua utilização na maior parte das unidades comerciais. O desenvolvimento de um produto com rendimento de semente comercialmente significativo é uma prioridade 15 alta na maior parte dos programas de desenvolvimento de cultivares de soja.

Um exemplo da aplicação dos métodos da presente invenção é a seleção de plantas de soja tanto com alto rendimento quanto com menor teor de ácido linolênico. O desempenho da progénie da soja quando se refere ao baixo teor de ácido linolênico se baseia principalmente em dois loci de características quantitativas principais (QTL) em Fad3-1b e Fad3-1c. A aná-lise de plantas segregantes demonstrou que Fad3-1b e Fad3-1c controlam aditivamente o teor de ácido linolênico na soja. Portanto, utilizando uma combinação de marcadores para Fad3-1b è Fad3-1c, um agricultor que utiliza a invenção pode prever de forma acurada o teor de ácido linolênico em plantas de soja. Os marcadores podem ser utilizados para inferir o estado genotípico de uma semente em qualquer estágio no processo de cruzamento, por exemplo, no estágio de linhagem intracruzada final ou Fi, F2, F3 etc.

Um híbrido Fi seminal pode ser produzido através do cruzamento de duas linhagens de soja intracruzadas (por exemplo, o cruzamento de uma planta contendo os alelos Fad3-1b e/ou Fad3-1c associados com o conteúdo de ácido linolênico diminuído com uma planta que não possui estes alelos) seguido pela autopolinização natural. Uma vez que os marcadores podem ser utilizados para inferir o estado genotípico de uma semente isolada obtida de um intercruzamento de tais linhagens intracruzadas, pode ser realizado o cruzamento auxiliado por marcador da geração a seguir (isto é, F2).

A semente de soja à temperatura ambiente e umidade tipicamente equilibrada a 8% em uma base em peso seco. A semente de soja neste nível de umidade tende a se partir quando é retirada uma amostra. Para reduzir essa divisão, a semente deve ser umedecida até um nível de umidade de 12%. Quando pré-tratada desta maneira, a divisão é significativamente reduzida em <5%.

A semente F2 selecionada que possui o genótipo desejado pode ser agrupada ou mantida separada dependendo dos objetivos de cruzamento. Se vários QTLs com efeitos variáveis tiverem sendo selecionados de uma certa população, o agricultor poderia preservar a identidade da semente individual para diferenciar indivíduos com várias combinações do QTL de resistência alvo. Estas sementes poderiam ser plantadas no campo com identificação de campo apropriada. Vários métodos de preservação da identidade de semen-tes individuais podem ser utilizados enquanto a semente é transferida do laboratório de amostragem para o campo. Os métodos incluem a transferência de indivíduos selecionados para "horticultural seed tape" que poderia incluir ainda identificação por freqüência de rádio para auxiliar a identificação da semente genotipada individual. Outros métodos seriam o uso de um "indexing tray", sementes de plantas em vasos de turfa e então transplantá-las ou plantar manualmente partindo de embalagens individuais de sementes.

Exemplo 3

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente invenção em um programa para alelos parentais recorrentes em um programa de cultivo com retrocruzamento.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para a seleção de transgenes assim como para a identificação de alelos parentais recorrentes. A identificação de genótipos com freqüências alélicas parentais recorrentes desejadas antes do plantio permite que o número de fileiras por população seja reduzido ao longo de todo o programa de cruzamento junto com um aumento no número de populações incluídas no programa de con-versão dentro de uma certa unidade do campo. Isto resulta no uso melhorado da terra, em custos reduzidos de terra e de trabalho etc.

Um exemplo de análise do tecido de endosperma do milho em '5 relação a alelos parentais recorrentes em um programa de cultivo com retro- cruzamento é mostrado na figura 1.

Exemplo 4

Este exemplo demonstra o uso dos métodos da presente invenção para o uso no “fingerprinting” de linhagens de DNA e na determinação 10 da fase de ligação.

Combinado com o agrupamento do DNA de uma semente isolada, o “fingerprinting” de linhagens poderia ser realizado sem a necessidade de retirar amostras da linhagem no campo.

Utilizando o tecido de endosperma da semente (revestimento da 15 semente na soja) derivada de uma planta diplóide, os haplotipos marcadores parentais podem ser determinados utilizando um sistema de genotipagem que possibilita a detecção de freqüências alélicas diferentes nas amostras de DNA. Uma vez que o tecido de endosperma é triplóide, com duas cópias derivadas do gameta feminino, a fase de ligação da linhagem parental pode 20 ser investigada através da dissecção dos genótipos de progénie heterozigo- tos. A amostra de DNA do tecido de endosperma permite uma determinação do nível de ploidia do marcador genético. Um nível de ploidia diplóide no marcador genético indica herança materna e um nível de ploidia haplóide no marcador genético indica herança paterna.

Exemplo 5

Este exemplo demonstra os métodos da presente invenção para a avaliação da semente transgênica em relação à distorção da segregação. As sementes de um cruzamento FT entre a Linhagem A (Evento Homozigoto 1 e Evento 2) e a Linhagem B (Evento Homozigoto 1) foram induzidas em 30 um isolamento de indução haplóide materno. As sementes resultantes foram selecionadas utilizando a coloração da plúmula para a obtenção de uma po-pulação de supostas sementes haplóides.

As supostas sementes haplóides individuais provenientes da po-pulação de supostas sementes haplóides foram selecionadas e foram tiradas amostras de forma não-destrutiva utilizando um sistema de amostragem de sementes automatizado que é descrito de forma geral no Pedido de Patente 5 U.S. N2 de Série 11/213.435 (Publicação N2 US 2006/004624), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade. Os marcadores foram aplicados nas amostras para determinar a presença do gene do Evento 2 e do gene do Evento 1. O processo de amostragem corta parte do tecido do pericarpo e do endosperma e utiliza como a base para a análise. É importante citar que o 10 tecido do endosperma é triplóide e contém contribuição genética de ambos os parentais. Se o gene de interesse for detectado utilizando este método, prevê de forma acurada a presença do gene desejado no embrião haplóide. Para as finalidades deste estudo, amostras de 180 sementes foram analisadas e os dados foram obtidos em 175 devido a problemas de amostragem.

Como mostrado na Tabela 3 abaixo, cada uma das amostras de sementes tiveram testes positivos em relação ao gene do Evento 1 como esperado e aproximadamente 50% das amostras de sementes tiveram testes positivos em relação ao gene do Evento 2, confirmando nenhuma distorção da segregação. TABELA 3

Os resultados deste estudo indicam que características gênicas individuais podem ser selecionadas em uma base haplóide utilizando amos-tragem de sementes não-destrutiva de alta circulação como um mecanismo de seleção.

Exemplo 6

Este exemplo demonstra a utilidade da amostragem de alta cir-culação automatizada na pré-seleção de sementes haplóides de uma popu-lação de sementes.

O experimento compreendia a amostragem de 20 populações F2 10 utilizando um sistema de amostragem de sementes de alta circulação não- destrutivo e analisando as amostras para verificar a pré-seleção de sementes haplóides. Cada população de sementes F2 teve amostras retiradas de forma não-destrutiva ou as plantas F2 tiveram amostras retiradas de tecidos para análise do DNA. As amostras não-destrutivas de sementes foram cole- 15 tadas de sementes individuais na população de sementes utilizando um sistema de amostragem de sementes automatizado que é descrito de forma geral no Pedido de Patente U.S. N-de Série 11/213.435 (Publicação N2 US 2006/004624), que é incorporado aqui como referência em sua totalidade. A seleção de genótipos desejáveis se baseava na seleção de materiais com 20 as freqüências alélicas mais altas dos haplotipos desejados com base nos parâmetros de modelagem. As plantas F2 selecionadas foram polinizadas com polinizadores do sexo masculino indutores haplóides e a semente resultante foi colhida. Após a colheita, as sementes haplóides foram selecionadas das sementes não-haplóides e as haplóides tiveram amostras retiradas em 25 uma base de embrião utilizando amostragem de alta circulação não- destrutiva e foram genotipadas substancialmente. A semente haplóide prefe-rida foi selecionada e submetida a um procedimento de duplicação cromos- sômica para produzir duplo haplóides. Esta abordagem permite que genótipos não preferidos sejam separados antes da duplicação e aumenta a fre- 30 qüência de material preferido que é processado através do processo de duplicação intensiva de recursos.

Os resultados que comparam a semente haplóide selecionada e que ilustram a eficiência desta abordagem são mostrados na figura2.

Quando são introduzidos os elementos ou as características das modalidades contidas aqui, é pretendido que os artigos “um”, “uma”, “o”, “a”, “dito” e “dita” signifiquem que há um ou mais de tais elementos ou caracte- 5 rísticas. É pretendido que os termos “compreendendo”, “incluindo” e “possuindo” incluam e signifiquem que podem haver elementos ou características adicionais sem ser os citados especificamente. Deve ser ainda entendido que as etapas, processos e operações do método descrito aqui não devem ser interpretados como requerendo necessariamente seu desempenho na 10 ordem particular discutida ou ilustrada, a não ser que seja identificada espe- I cificamente como uma ordem de desempenho. Deve ainda ser entendido que etapas adicionais ou alternativas podem ser empregadas.

A descrição da descrição tem uma natureza meramente de e- xemplo e, assim, é pretendido que variações que não saem da essência da 15 descrição estejam dentro do âmbito da descrição. Tais variações não devem ser consideradas como um desvio do espírito e do âmbito da descrição.

Claims (23)

1. Método de alto rendimento para a análise de uma população de sementes haploides, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma população de sementes que compreendem se-mentes haploides; remover uma amostra de tecido de uma pluralidade das semen-tes na população enquanto a viabilidade de germinação da semente é pre-servada; analisar a amostra de tecido em relação à presença ou à ausên-cia de uma ou mais características indicativas de pelo menos uma caracte-rística genética ou química; genotipar o tecido removido para determinar a frequência de ale- los; e construir um mapa de ligação genética.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a determinação da característica genotípica da semente selecionada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma característica preferida é uma característica fenotípica.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é analisada em relação a uma ou mais ca-racterísticas selecionadas do grupo que consiste em um marcador genético, um polimorfismo de um único nucleotídeo, uma repetição de sequência sim-ples, um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, um hapló- tipo, uma marcação SNP, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada do DNA, uma sequência derivada do RNA, um promotor, uma região não-traduzida a 5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil de transcrição e um padrão de metilação.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes indivi- duais da população com base na presença de uma ou mais características associadas com um ou mais transgenes.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes indivi-duais que exibem uma ou mais características genéticas indesejáveis da população de sementes e o descarte das sementes selecionadas.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a análise da amostra de tecido inclui a análise a amostra de teci-do em relação à presença ou ausência de uma sequência derivada de DNA e/ou uma sequência derivada de RNA.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda quantificar uma ou mais características do tecido removido; e comparar as características quantificadas com caracterís-ticas de dois ou mais grupos de germoplasma conhecidos para identificar alterações de frequência.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais grupos de germoplasma representam uma plan-ta de cultivo selecionada do grupo consistindo em uma planta de cultivo de forragem, uma planta de cultivo de semente oleosa, uma planta de cultivo de grãos, uma planta de cultivo de frutos, plantas ornamentais, uma planta de cultivo vegetal, uma planta de cultivo de fibras, uma planta de cultivo de tempero, uma planta de cultivo de noz, uma planta de cultivo de turfa, uma planta de cultivo de açúcar, uma planta de cultivo para bebidas, uma planta de cultivo de tubérculo, uma planta de cultivo de raiz e uma planta de cultivo para floresta.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar um nível de ploidia de pelo menos um lócus.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o nível de ploidia é determinado através da análise da amostra de tecido removida em relação a um alelo derivado do ancestral materno da semente.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o nível de ploidia é determinado através da análise da amostra de tecido removida em relação a um alelo derivado do ancestral paterno da semente.

13. Método de alto rendimento para agrupar uma população de sementes duplo haploides, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma população de sementes que compreende semen-tes haploides; selecionar uma ou mais sementes individuais que exibem pelo menos uma característica preferida partindo da população de sementes; a produção de sementes duplo haploides partindo das sementes selecionadas; remover uma amostra de tecido de cada semente duplo haploi- des enquanto a viabilidade de germinação das sementes amostradas é pre-servada; analisar as amostras de tecido para a frequência de alelos de pelo menos dois alelos; construir um mapa de ligação genética para os pelo menos dois alelos; selecionar uma ou mais sementes duplo haploides individuais com base nos resultados da análise; e cultivar plantas ou tecido vegetal a partir das sementes duplo haploides selecionadas.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as amostras de tecido são analisadas em relação a uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em um marcador genético, um polimorfismo de um único nucleotídeo, uma repetição de se-quência simples, um polimorfismo de comprimento de fragmento de restri-ção, um haplótipo, uma marcação SNP, um alelo de um marcador genético, um gene, uma sequência derivada do DNA, uma sequência derivada do RNA, um promotor, uma região não-traduzida a 5' de um gene, uma região não-traduzida a 3' de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, dsmRNA, um perfil de transcrição e um pa-drão de metilação.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a seleção de uma ou mais sementes duplo haploides individuais com base na presença de uma ou mais características associadas com um ou mais transgenes.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a análise das amostras de tecido em relação à presença de um DNA indutor e o descarte das sementes duplo haploi- des que exibem a presença de um DNA indutor antes da seleção de sementes duplo haploides para o cultivo de plantas ou de tecido vegetal.

17. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda identificar níveis de ploidia numa população de sementes e a remoção de sementes não haploides da população, de modo a proporcionar a população de sementes que compreende sementes haploides.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar as características quantificadas com as características de dois ou mais grupos conhecidos de germoplasma para identificar mudanças de frequência.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda analisar as amostras de tecido em relação a um ou mais alelos; e determinar o nível de ploidia de pelo menos um lócus.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o nível de ploidia é determinado através da análise da amostra de tecido removida em relação a um alelo derivado do ancestral materno da semente.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o nível de ploidia é determinado através da análise da amostra de tecido removida em relação a um alelo derivado do ancestral paterno da semente.

22. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que a análise da amostra de tecido inclui a análise da amostra de tecido em relação à presença ou ausência de uma sequência derivada de DNA e/ou uma sequência derivada de RNA.

23. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- lo fato de que compreende ainda quantificar uma ou mais características do tecido removido; e comparar as características quantificadas com caracterís-ticas de dois ou mais grupos de germoplasma conhecidos para identificar mudanças de frequência.

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